KR101056541B1 - Composition for improving skin barrier and atopy containing PPA alpha activator - Google Patents
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Abstract
본 발명은 PPAR 알파 활성화제를 유효성분으로 함유하는 피부 건조증상 완화, 피부 장벽기능 회복, 아토피의 예방 또는 치료 등에 유용한 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 PPAR 알파 활성화제는 3-리노레오일-글리세롤이다. 3-리노레오일-글리세롤은 각질형성세포의 분화 촉진 및 피부장벽 항상성 조절 등에 관여하는 PPAR 알파를 활성화시킨다. 따라서, 3-리노레오일-글리세롤을 유효성분으로 함유하는 화장료 등의 조성물은 피부 분화를 촉진하고, 피부 장벽 기능을 강화시켜 궁극적으로는 아토피의 치료 또는 예방에 유용하다.The present invention relates to a composition useful for alleviating dry skin symptoms, restoring skin barrier function, preventing or treating atopic dermatitis, comprising a PPAR alpha activator as an active ingredient, and the PPAR alpha activator of the present invention is 3-linoreoyl-glycerol. to be. 3-linoleyl-glycerol activates PPAR alpha involved in promoting differentiation of keratinocytes and regulating skin barrier homeostasis. Therefore, compositions such as cosmetics containing 3-linoleoyl-glycerol as an active ingredient promote skin differentiation, enhance skin barrier function and ultimately are useful for the treatment or prevention of atopy.
3-리노레오일(linoleoyl)-글리세롤, 천초목, PPAR, 피부장벽, 아토피 3-linoleoyl-glycerol, vinegar, PPAR, skin barrier, atopy
Description
본 발명은 피부 건조증상 완화, 피부 장벽기능 회복, 아토피의 예방 또는 치료 등에 효과가 있는 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 PPAR 알파 활성화제를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 피부 각질형성세포(keratinocyte) 내에서 PPAR 알파를 활성화시킴으로써 피부 각질형성세포의 분화를 촉진하여, 표피 분화가 불완전함으로 해서 발생하는 여러 가지 피부 부작용을 해소하는데 효과가 있는 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition that is effective in alleviating dry skin symptoms, restoring skin barrier function, preventing or treating atopy. More specifically, the present invention relates to a composition containing a PPAR alpha activator as an active ingredient, by activating PPAR alpha in skin keratinocytes to promote differentiation of the skin keratinocytes, epidermal differentiation is incomplete It relates to a composition that is effective in eliminating various skin side effects that occur by.
사람의 피부는 진피(dermis)와 표피(epidermis)로 구성되어 있다. 진피는 콜라겐과 기타 단백질을 주로 합성하며, 소량의 지질을 생산하는 섬유아세포(fibroblast)로 주로 구성되어 있다. 이와는 대조적으로, 표피는 지질을 주로 생성하고, 콜라겐은 실질적으로 합성하지 않는 각질형성세포(keratinocyte)로 주로 구성되어 있다. 특히, 피부의 최외각에 위치하고 있는 표피는 외부의 다양한 물리적, 화학적 및 기계적 자극에 대한 방어와 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능을 수행하고 있다. 이러한 보호 기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되고 유지됨으로써 가능하다. 각질형성세포는 표피최하층(stratum basale)에서 지속적으로 증식하던 기저세포(basal cell)가 각질층(stratum corneum)으로 이동하면서, 단계적으로 형태 및 기능상의 변화를 거치며 형성된 세포이며, 일정 기간이 지나면 오래된 각질형성세포는 피부에서 탈락되고, 표피 최하층으로부터 올라온 새로운 각질형성세포가 그 기능을 대신하는 표피 분화(epidermis differentiation) 또는 각화(keratinization)의 과정을 반복하게 된다. 이러한 각화과정에서 각질형성세포는 천연보습인자(Natural Moisturizing Factor; NMF)와 세라마이드, 콜레스테롤 및 지방산과 같은 세포 간 지질을 생성하여, 각질층이 외부와의 차단층 역할을 하게 됨으로써 피부장벽(skin barrier)로서의 기능을 보유하게 된다.Human skin is composed of the dermis and epidermis. The dermis is primarily composed of fibroblasts, which synthesize collagen and other proteins, and produce small amounts of lipids. In contrast, the epidermis is mainly composed of keratinocytes, which produce lipids and collagen is virtually unsynthesized. In particular, the epidermis located at the outermost part of the skin performs protection against various physical, chemical and mechanical stimuli from the outside and prevents excessive release of moisture in the body through the skin. This protective function is possible by the normal formation and maintenance of the stratum corneum consisting of keratinocytes. Keratinocytes are cells formed by gradual changes in morphology and function as basal cells, which have been continuously proliferating in the stratum basale, migrate to the stratum corneum. The forming cells are detached from the skin, and the new keratinocytes from the lower epidermal layer repeat the process of epidermis differentiation or keratinization, which takes over the function. In this keratinization process, keratinocytes produce natural moisturizing factor (NMF) and intercellular lipids such as ceramides, cholesterol, and fatty acids, and the stratum corneum acts as a barrier to the outside, resulting in a skin barrier. It has a function as.
현대사회의 주요 질환의 하나로 여겨지는 피부 건조증은 피부 장벽기능 이상이 가장 중요한 원인임이 밝혀지고 있다. 이러한 건조피부는 최근 환경오염, 아파트, 고층 건물 등과 같은 건조한 환경의 증가, 사회적 스트레스의 증가, 우리나라 특유의 과도한 목욕 문화, 아토피나 노화 등의 여러 가지 요인에 의해 증가하고 있으며, 치료를 필요로 하는 경우가 증가하고 있다.Dry skin, which is considered to be one of the major diseases in modern society, has been found to be the most important cause of abnormal skin barrier function. Such dry skin has recently increased due to various factors such as environmental pollution, increase of dry environment such as apartments and high-rise buildings, increase of social stress, excessive bathing culture unique to Korea, atopy and aging, etc. The case is increasing.
최근 소아의 10%에서 발병하는 아토피 피부염에 있어 피부 장벽기능의 이상이 중요한 원인으로 알려져 있다. 따라서, 적절한 피부 수분을 유지하기 위해서 외부로부터 수분을 공급하거나, 체내로부터의 수분 손실을 최소화하기 위한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 실제로 수분보유 능력이 있는 세라마이드 또는 그 유도체와 같은 보습제가 개발되어 화장품 영역에서 많이 사용되고 있다.Recently, abnormality of skin barrier function is known as an important cause in atopic dermatitis, which occurs in 10% of children. Therefore, a lot of researches have been conducted to supply moisture from the outside or to minimize moisture loss from the body in order to maintain proper skin moisture, and a moisturizing agent such as ceramide or a derivative thereof, which has a water retention ability, has been developed and the cosmetic field has been developed. It is used a lot in.
그러나, 대부분이 근본적인 치료이기보다는 일시적인 증상의 완화로 충분한 효과를 나타내지 못하고 있다. 따라서, 손상된 장벽을 근원적으로 재생시켜주는 물질의 개발이 시급한 실정이다.However, most of them do not show sufficient effect by temporary relief of symptoms rather than fundamental treatment. Therefore, it is urgent to develop a material that fundamentally regenerates a damaged barrier.
최근 들어, 각질형성세포에 존재하는 PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor)가 그 리간드(ligand)와 결합하여 활성화되면, 각질형성세포의 분화를 촉진시켜 손상된 피부 장벽을 재구성하는 효과가 있다고 알려져 있다. 실제로 이미 알려진 PPAR 알파의 작용제(agonist)인 클로파이브레이트(clofibrate)[Feingold et al., J. Invest. Dermatol., 110, pp368-375, 1998], WY14643[Feingold et al., J. Invest. Dermatol., 115, pp353-360, 2000] 등을 피부장벽이 손상된 피부에 도포하였을 때, 각질형성세포의 분화가 촉진되며, 피부장벽의 회복이 촉진됨이 확인된 바 있다.Recently, when a PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) present in keratinocytes is activated by binding to a ligand, it is known to promote the differentiation of keratinocytes and reconstruct the damaged skin barrier. In fact, clofibrate, an agonist of PPAR alpha, is already known [Feingold et al ., J. Invest. Dermatol., 110, pp 368-375, 1998, WY14643 [Feingold et al ., J. Invest. Dermatol., 115, pp353-360, 2000] has been confirmed that the application of keratinocytes to the damaged skin barrier is promoted, the recovery of the skin barrier when the skin barrier is applied.
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 피부 건조증상 완화, 피부 장벽기능 개선, 아토피의 치료 또는 예방 등의 효과가 있는 조성물을 제공하는 것이다. 즉, PPAR 알파 활성화제 기능을 가지는 천연물 유래의 물질을 개발하여, 피부장벽 손상 시 각질형성세포의 분화를 촉진함으로써 근원적으로 피부 장벽을 회복시켜 줄 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.Therefore, the technical problem to be achieved by the present invention is to provide a composition that is effective in alleviating skin dryness symptoms, improving skin barrier function, treatment or prevention of atopy. That is, by developing a substance derived from a natural product having a PPAR alpha activator function, to provide a composition that can restore the skin barrier by promoting the differentiation of keratinocytes in the skin barrier damage.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 3-리노레오일(linoleoyl)-글리세롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor) 알파 활성화용 조성물, 즉, 3-리노레오일-글리세롤의 PPAR 알파 활성화 용도를 제공한다.In order to achieve the above technical problem, the present invention is a composition for activating PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) alpha, characterized in that it contains 3-linoleoyl-glycerol represented by the formula (1) as an active ingredient, , PPAR alpha activation of 3-linoreyl-glycerol.
또한 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 3-리노레오일-글리세롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 아토피 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a composition for treating or preventing atopic dermatitis, comprising 3-linoleoyl-glycerol represented by the formula (1) as an active ingredient.
또한 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 3-리노레오일-글리세롤을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부 건조증상 완화 또는 피부 장벽기능 회복용 조성물을 제공한다.The present invention also provides a composition for relieving dry skin symptoms or restoring skin barrier function, comprising 3-linoleoyl-glycerol represented by Formula 1 as an active ingredient.
본 발명자들은 각질형성세포 내에서 발현되는 PPAR 알파를 활성화함으로써, 피부각질세포의 분화를 촉진시켜 피부장벽의 손상을 빠르게 회복시키고, 피부 건조의 문제점을 해결하고자 여러 천연물 중에서 PPAR 알파 활성화 기능을 갖는 물질을 스크리닝한 결과, 천초목(Zanthoxylum bungeanum Maxim) 유래의 3-리노레오일-글리세롤이 매우 우수한 PPAR 알파 활성화 기능이 있을 뿐만 아니라, 각질형성 세포의 분화를 촉진하고, 피부에 직접 도포한 실험 결과에서도 뚜렷한 피부장벽 회복 속도를 증가시킴을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.By activating PPAR alpha expressed in keratinocytes, the present inventors promote the differentiation of keratinocytes to quickly repair damage to the skin barrier, and have a PPAR alpha activation function among various natural products to solve the problem of dry skin. As a result of screening, 3-linoleoyl-glycerol derived from Zanthoxylum bungeanum Maxim has not only excellent PPAR alpha activation, but also promotes the differentiation of keratinocytes and directly applied to the skin. The present invention has been completed to increase the apparent skin barrier recovery rate.
이러한 3-리노레오일-글리세롤은 천초목으로부터, 예를 들어, 아래와 같은 추출 및 분리 방법을 통하여 획득할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 화학적 합성법을 통하여서도 제조될 수 있다.Such 3-linoleoyl-glycerol can be obtained from the herbaceous tree, for example, through the following extraction and separation method, but is not limited thereto, and is well known to those skilled in the art. It can also be prepared via known chemical synthesis.
생약재로 시판되는 천초목을 구입하고, 그 이외의 재료들은 Merk사 및 Sigma사에서 구입하였다. 천초목은 잘게 분쇄하고, 분쇄물 건조 중량에 대하여 5-20부피의 메탄올로 상온에서 추출 후 감압 농축하여 메탄올 엑스를 얻었다. 제조된 천초목의 메탄올 추출물로부터 유효성분을 확인하기 위해 메탄올 엑스를 10배의 물에 현탁시킨 후 동량의 디클로로메탄(DM), 부탄올(BuOH) 등으로 용매 분획하여 천초목 디클로로메탄 분액을 얻었다. 제조된 천초목의 디클로로메탄 분액은 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 용리액으로서 헥세인(Hex)/에틸아세테이트(EtOAc)를 혼합 용매로 수행하여 유효 성분을 분리하고, 얻은 유효성분은 분취용 HPLC를 사용하여 동일 조건으로 수행하여 순수하게 정제하였다. 정제된 유효성분은 핵자기공명스펙트럼(NMR) 및 질량분석(Mass)을 통하여 3-리노레오일-글리세롤로 확인하였다.The medicinal herb was purchased as a herbal medicine, and other materials were purchased from Merk and Sigma. The vinegar was finely pulverized, extracted with 5-20 volumes of methanol with respect to the dry weight of the ground powder at room temperature, and concentrated under reduced pressure to obtain methanol X. In order to confirm the active ingredient from the methanol extract of the prepared medicinal herb, methanol X was suspended in 10 times of water, and then solvent fractionation was performed with the same amount of dichloromethane (DM), butanol (BuOH), and the medicinal herb dichloromethane was obtained. Dichloromethane aliquots of the prepared medicinal herb were separated by hexane (Hex) / ethyl acetate (EtOAc) as a mixed solvent using silica gel column chromatography as an eluent to separate the active ingredients, and the obtained active ingredient was prepared using preparative HPLC. Purification was carried out under conditions. The purified active ingredient was identified as 3-linoreyl-glycerol through nuclear magnetic resonance spectra (NMR) and mass spectrometry (Mass).
상기 3-리노레오일-글리세롤의 효과의 경제성을 고려할 때, 3-리노레오일-글리세롤의 첨가량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.000001 내지 10중량%인 것이 바람직한데, 더욱 바람직하게는 0.0001 내지 1.0 중량%이다. Considering the economics of the effect of the 3-linoleoyl-glycerol, the amount of 3-linoleoyl-glycerol added is preferably 0.000001 to 10% by weight based on the total weight of the composition, more preferably 0.0001 to 1.0 weight %to be.
본 발명의 조성물은 의약품 또는 화장료로 제조될 수 있다. 이러한 의약품 및 화장료는 약학적 또는 화장학적으로 허용되는 부형제 또는 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 또는 약학 조성물은 단독으로 혹은 어떤 편리한 운반체, 부형제 등과 함께 혼합하여 투여될 수 있고, 그러한 투여 제형은 단회투여 또는 반복투여 제형일 수 있다.The composition of the present invention may be prepared as a pharmaceutical or cosmetic. Such medicines and cosmetics may include pharmaceutically or cosmetically acceptable excipients or additives. The cosmetic or pharmaceutical compositions of the invention may be administered alone or in admixture with any convenient vehicle, excipient, etc., and such dosage forms may be single or repeated dose formulations.
본 발명의 목적이 피부와 관련된 것임을 고려할 때, 본 발명에 따른 3-리노레오일-글리세롤은 추출물의 형태로 또는 정제한 순수화합물의 형태로 스킨, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 젤, 팩, 폼 클렌징, 비누 등의 화장료나 연고와 같은 다양한 조성물에 유효량 첨가되어 피부 건조증상 완화, 피부장벽 개선 및 아토피의 개선 및 치료에 사용되는 것이 바람직하다.Given that the object of the present invention relates to the skin, the 3-linoleoyl-glycerol according to the present invention can be used as a skin, lotion, cream, foundation, essence, gel, pack, It is preferably added to various compositions such as cosmetics and ointments such as foam cleansing and soap, and used for alleviating skin dryness, improving skin barrier and improving and treating atopy.
이와 같이, 본 발명의 3-리노레오일(linoleoyl)-글리세롤을 함유하는 피부 장벽 개선 조성물은 PPAR 알파의 활성을 현저히 증가시키고, 각질형성세포의 분화 를 촉진하며, 피부장벽의 회복률을 높일 뿐만 아니라 아토피 증상을 개선할 수 있다.As such, the skin barrier improving composition containing 3-linoleoyl-glycerol of the present invention significantly increases the activity of PPAR alpha, promotes the differentiation of keratinocytes, and increases the recovery rate of the skin barrier. May improve atopic symptoms.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, examples and the like will be described in detail to help understand the present invention. However, embodiments according to the present invention can be modified in many different forms, the scope of the invention should not be construed as limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
<실시예 1>≪ Example 1 >
천초목을 구입하여 잘게 분쇄하고, 분쇄물 10kg(건조 중량)에 대하여 150L 부피의 메탄올로 상온에서 24시간 추출하고 여과포로 여과한 후, 잔사를 같은 방법으로 1회 이상 더 추출하였다. 추출액을 합하고 감압 농축하여 메탄올 엑스 1.1kg를 얻었다.Cheonchowood was purchased and finely pulverized, extracted with 150 L volume of methanol for 24 hours at room temperature with respect to 10 kg (dry weight) of the pulverized product, filtered through a filter cloth, and the residue was further extracted one or more times in the same manner. The extracts were combined and concentrated under reduced pressure to obtain 1.1 kg of methanol.
<실시예 2><Example 2>
상기 실시예 1에서 제조된 천초목 메탄올 엑스 1kg을 10배의 물에 현탁시킨 후 동량의 디클로로메탄(DM)과 부탄올(BuOH)로 순서대로 3회 반복 추출한 후 부탄올 분획을 제거하고, 디클로로메탄 분액을 감압 농축하여 겔(gel) 상태의 추출물 115g을 얻었다.Suspension methanol 1 kg prepared in Example 1 was suspended in 10 times of water and then extracted three times in the same order in the same amount of dichloromethane (DM) and butanol (BuOH) and then the butanol fraction was removed, dichloromethane fractions The mixture was concentrated under reduced pressure to obtain 115 g of an extract in a gel state.
<실시예 3><Example 3>
상기 실시예 2에서 제조된 천초목 디클로로메탄 분액 100g을 용리액으로서 헥세인(Hex)/에틸아세테이트(EtOAc)를 혼합 용매를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하여 유효 분획을 얻었다. 즉, 실리카겔(Merck. Silica gel 60, 230-460 mesh)을 칼럼에 패킹하고, 여기에 디클로로메탄 추출물을 로딩(loading)하였다. 이동상으로 Hex/EtOAc의 100/0(v/v)에서 0/100(v/v)으로 단계적으로 용출하여 8개의 분액을 얻었고, 루시퍼래이즈 활성측정을 통해서 활성을 나타내는 분액들을 모아 감압 농축하였다. 100 g of ethanol dichloromethane aliquots prepared in Example 2 were separated by hexane (Hex) / ethyl acetate (EtOAc) as silica gel column chromatography using a mixed solvent to obtain an effective fraction. That is, silica gel (Merck. Silica gel 60, 230-460 mesh) was packed in a column and loaded with dichloromethane extract. The mobile phase was eluted stepwise from 100/0 (v / v) to 0/100 (v / v) of Hex / EtOAc to obtain 8 aliquots, and the concentrated aliquots were collected and concentrated under reduced pressure through luciferase activity measurement. .
<실시예 4><Example 4>
상기 실시예 3에서 얻은 활성 분액을 다시 실리카 겔(Merck. Silica gel 60, 70-230 mesh)을 이용하여 컬럼 크로마토그래피를 시행하였다. 이동상으로 Hex/EtOAc의 100/0에서 0/100까지 사용하였고, TLC 및 활성 측정을 통해 활성을 나타내는 유사 분액들을 모아 감압 농축하여 6개의 분액을 얻었고, 그 중에서 루시퍼래이즈 활성측정을 통해서 활성을 나타내는 분액을 다시 실리카겔을 이용하여 디클로로메탄과 헥세인을 1:1로 섞은 용액에서 점차적으로 에틸아세테이트의 비율을 100%까지 늘려주면서 컬럼 크로마토그래피를 시행하였다.The active fraction obtained in Example 3 was subjected to column chromatography again using silica gel (Merck. Silica gel 60, 70-230 mesh). The mobile phase was used from 100/0 to 0/100 of Hex / EtOAc, and 6 aliquots were obtained by concentrating under reduced pressure by collecting similar aliquots showing activity through TLC and activity measurement. Among them, activity was measured through luciferase activity measurement. The column was separated again using silica gel, and column chromatography was performed gradually increasing the ratio of ethyl acetate to 100% in a solution of 1: 1 dichloromethane and hexane.
이상의 과정으로 유효 성분을 추출 및 정제하고, 분리한 유효 성분은 핵자기공명스펙트럼(NMR) 및 질량분석(Mass)을 통하여 하기 화학식 1로 나타낸 PPAR 알파 활성화제 활성을 갖는 3-linoleoyl-rac-glycerol임을 확인하였다. The active ingredient is extracted and purified by the above process, and the separated active ingredient is 3-linoleoyl- rac -glycerol having PPAR alpha activator activity represented by the following Chemical Formula 1 through nuclear magnetic resonance spectrum (NMR) and mass spectrometry (Mass). It was confirmed that.
<화학식 1><Formula 1>
1H-NMR (CDCl3) : δ 5.35(4H, m), 4.21(1H, dd, J=11.6, 4.6), 4.15(1H, dd, J=11.6, 6.1), 3.93(1H, qn, J=~5.0), 3.70(1H, dd, J=11.6, 3.6), 3.60(1H, dd, J=11.6, 5.7), 2.77(2H, t, J=6.7), 2.35(2H, t, J=7.5), 2.05(4H, q, J=7.0), 1.63(2H, qn, J=7.5), 1.2~1.4(8H), 1.2~1.4(6H), 0.89(3H, t, J=6.8)1 H-NMR (CDCl 3 ): δ 5.35 (4H, m), 4.21 (1H, dd, J = 11.6, 4.6), 4.15 (1H, dd, J = 11.6, 6.1), 3.93 (1H, qn, J = ~ 5.0), 3.70 (1H, dd, J = 11.6, 3.6), 3.60 (1H, dd, J = 11.6, 5.7), 2.77 (2H, t, J = 6.7), 2.35 (2H, t, J = 7.5 ), 2.05 (4H, q, J = 7.0), 1.63 (2H, qn, J = 7.5), 1.2 to 1.4 (8H), 1.2 to 1.4 (6H), 0.89 (3H, t, J = 6.8)
13C-NMR (CDCl3) : δ 63.34 (C-1), 70.29 (C-2), 65.21 (C-3), 174.33 (C-1'), 34.17 (C-2'), 24.90 (C-3'), 22.0~32.0 (C-4'~7'), 27.19 (C-8'), 130.02 (C-9'), 127.90 (C-10'), 25.66 (C-11'), 128.09 (C-12'), 130.25 (C-13'), 27.21 (C-14'), 22.0~32.0 (C-15'~17'), 14.09 (C-18')13 C-NMR (CDCl 3 ): δ 63.34 (C-1), 70.29 (C-2), 65.21 (C-3), 174.33 (C-1 '), 34.17 (C-2'), 24.90 (C- 3 '), 22.0-32.0 (C-4'-7'), 27.19 (C-8 '), 130.02 (C-9'), 127.90 (C-10 '), 25.66 (C-11'), 128.09 (C-12 '), 130.25 (C-13'), 27.21 (C-14 '), 22.0-32.0 (C-15'-17'), 14.09 (C-18 ')
<실험예 1> PPAR 알파 활성화 실험Experimental Example 1 PPAR Alpha Activation Experiment
상기 실시예 3(디클로로메탄 분획)과 실시예 4(3-linoleoyl-rac-glycerol)의 PPAR 알파 활성능을 평가하였다.PPAR alpha activity of Example 3 (dichloromethane fraction) and Example 4 (3-linoleoyl- rac -glycerol) were evaluated.
마우스 myoblast 세포주인 C2C12 세포(ATCC CRL-1772)를 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 계대 배양하였다. 벡터는 3가지를 사용하였는데 1) pZEO 벡 터(Invitrogen)의 SV40 프로모터에 효모의 전사인자인 GAL4-DBD(DNA Binding Domain)과 인간 PPAR 알파 LBD(Ligand Binding Domain)에서 Ser167에서 Tyr468을 암호화하는 DNA단편(유전자 은행정보, NM 005036)을 포함하는 벡터, 2) GAL4 응답 서열을 루시퍼라이제를 발현하는 pGL3 벡터(Promega)의 다중제한 효소 인지 부위에 삽입된 벡터, 및 3) 트랜스팩션 대조군(transfection internal control)로 beta-galactodisase을 발현하는 벡터를 사용하였다. Mouse myoblast cell line C2C12 cells (ATCC CRL-1772) were passaged in DMEM medium containing 10% fetal calf serum. Vectors encoding the Tyr 468 at Ser 167 in 3 gaji were used to 1) pZEO vectors (Invitrogen) SV40 transcription factor GAL4-DBD (DNA Binding Domain of the yeast promoter of) and human PPAR alpha-LBD (Ligand Binding Domain) A vector containing a DNA fragment (gene bank information, NM 005036), 2) a vector in which the GAL4 response sequence is inserted at the multiple restriction enzyme recognition site of pGL3 vector (Promega) expressing luciferase, and 3) a transfection control As a transfection internal control, a vector expressing beta-galactodisase was used.
세포를 4×104의 농도로 24웰 플레이트에 깐 후, 12시간 배양하고, 상기 세 종류의 플라스미드 유전자를 일시적인 리포팩타민(Invitrogen)을 이용하여 트랜스팩션(transient transfection)하였다. 8시간 후, 시료를 처리하고, 12시간 배양한 후, 1×PBS로 세척하고, 1×reporter lysis 완충액으로 세포를 깬 후, 루시퍼래이즈 분석 키트(Promega)와 beta-galactodisase 분석 키트(Promega)를 사용하여, 루시퍼래이즈의 활성을 측정하였다. 즉, PPAR 알파 활성도는 '루시퍼래이즈 활성/beta-galactosiase 활성'으로 측정하였다.Cells were plated in a 24-well plate at a concentration of 4 × 10 4 , incubated for 12 hours, and the three kinds of plasmid genes were transfected using transient lipofactoramine (Invitrogen). After 8 hours, the samples were treated, incubated for 12 hours, washed with 1 × PBS, cells were crushed with 1 × reporter lysis buffer, and then luciferase assay kit (Promega) and beta-galactodisase assay kit (Promega). Was used to measure the activity of luciferase. That is, PPAR alpha activity was measured by 'luciferase activity / beta-galactosiase activity'.
본 실험에서 양성 대조군은 PPAR 알파의 리간드 중 가장 강력한 것으로 알려진 Wy-14,643(Calbiochem)을 사용하였고, 음성대조군으로는 시료를 녹일 때 사용한 DMSO 0.05%을 사용하였다. 3번 반복하여, 그 평균값을 하기 표 1에 나타내었다.In this experiment, the positive control group used Wy-14,643 (Calbiochem), which is known to be the strongest of PPAR alpha ligands, and the DMSO 0.05% used to dissolve the sample was used as the negative control group. Repeated three times, the average value is shown in Table 1 below.
상기 표 1에 나타나는 바와 같이, 3-linoleoyl-rac-glycerol을 함유하는 디클로로부탄 분획과 비교했을 때, 정제된 3-linoleoyl-rac-glycerol이 더 높은 PPAR 알파 활성을 나타냄을 알 수 있었다.As shown in Table 1 above, was found when compared to the 3-linoleoyl- dichloro butane fractions containing rac -glycerol, it represents the purified 3-linoleoyl- rac -glycerol higher PPAR alpha activity.
<실험예 2> 각질형성세포의 분화촉진능 평가Experimental Example 2 Evaluation of Differentiation Promoting Capacity of Keratinocytes
사람의 각질형성세포주인 HaCaT을 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM에서 계대 배양한 후, T75 플라스크에 1×106개를 넣고 24시간 부착시켰다. 세포가 플라스크의 30% 정도로 찼을 때, 1×PBS로 씻어낸 후, Ca2+ free-KGM(Clonetics)으로 24시간 처리하여, Ca2+을 고갈시켰다. 그 후, 3-linoleoyl-rac-glycerol이 포함된 0.03mM Ca2+-KGM(Clonetics) 처리한 후, 72시간 배양하였다. 이 세포를 수확한 후, RNA easy mini kit(Qiagen)으로 RNA을 분리하여, 각질형성세포의 분화 마커 중의 하나인 트랜스글루타미네이즈(transglutaminse)의 발현을 RT-PCR의 방법을 사용하여 측정하였다. 음성대조군으로는 0.03mM의 Ca2+을 포함하는 KGM을 사용하였고, 양성 대조군으로는 KGM에 Ca2+ 1.2 mM을 첨가하여 사용하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.HaCaT, a human keratinocyte cell line, was passaged in DMEM containing 10% fetal bovine serum, and then 1 × 10 6 were placed in a T75 flask and attached for 24 hours. When the cells are about 30% full of the flasks, they are washed with 1 × PBS and treated with Ca 2+ free-KGM (Clonetics) for 24 hours to remove Ca 2+ . Exhausted. Thereafter, 0.03mM Ca 2+ -KGM (Clonetics) containing 3-linoleoyl- rac -glycerol was incubated for 72 hours. After harvesting the cells, RNA was isolated by RNA easy mini kit (Qiagen), and the expression of transglutaminase, one of the differentiation markers of keratinocytes, was measured using the method of RT-PCR. Negative controls include Ca 2+ of 0.03 mM KGM was used and Ca 2+ 1.2 mM was added to KGM as a positive control. The results are shown in Table 2 below.
(음성대조군대비%)Transglutase expression level
(% Of voice control)
상기 표 2에 나타난 바와 같이, 3-linoleoyl-rac-glycerol은 음성 대조군에 비해 20ug/ml 농도에서 트랜스글루타이제이즈의 발현량을 1.4배 증가시켰는데, 이는 강력한 양성대조군인 Ca2+ 1.2 mM와 유사한 수준이었다.As shown in Table 2, 3-linoleoyl- rac -glycerol increased the expression of transglutase by 1.4-fold at a concentration of 20 ug / ml compared to the negative control, which is a strong positive control group Ca 2+ 1.2 mM It was at a similar level.
<실험예 3> 피부 장벽 회복력 측정Experimental Example 3 Measurement of Skin Barrier Recovery
피부 장벽 회복력 측정하기 위하여 3-linoleoyl-rac-glycerol을 함유하는 화장료 조성물을 하기 표 3에 기재된 성분과 함량의 크림으로 제조하였다.In order to measure skin barrier resilience, a cosmetic composition containing 3-linoleoyl- rac -glycerol was prepared as a cream having the ingredients and contents shown in Table 3 below.
상기 제조예 1 및 비교예 1을 이용하여 피부 장벽 회복력을 측정하였다. 피실험자를 대상으로 이들을 처방하여 장기간의 피부 손상으로 인한 피부장벽의 회복에 미치는 효과를 평가하였다. 건강한 남 여 20명씩을 선정하여 양팔의 하박부에 각각 두 개씩 2×2 cm2 크기로 아세톤을 1일 2회씩 4일 동안 도포하여 피부 장벽을 손상시켰다. 그 후, 5 및 6일째에는 아세톤으로 피부 장벽 손상시킨 후, 피부 면적 4 cm2 당 300ul 씩, 제조예 1 및 비교예 1의 시료를 추가로 도포하고 5일 및 6일째에 경피 수분 손실의 회복도(Recovery Rate of Transepidermal Water Loss(TEWL))를 측정하였다. 경피 수분손실회복도는 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.Skin barrier recovery was measured using Preparation Example 1 and Comparative Example 1. Subjects were prescribed this study to evaluate the effect on the recovery of skin barrier caused by long-term skin damage. Twenty healthy men and women were selected and acetone was applied twice a day for 4 days, 2 × 2 cm 2, two at the lower part of both arms to damage the skin barrier. Thereafter, the skin barrier was damaged with acetone on the 5th and 6th days, and then 300 μl per 4 cm 2 of the skin was further coated with the samples of Preparation Example 1 and Comparative Example 1 and the transdermal water loss was recovered on the 5th and 6th days. (Recovery Rate of Transepidermal Water Loss (TEWL)) was measured. Percutaneous moisture loss recovery was calculated according to the following equation (1).
상기 표 4에 나타나는 바와 같이, 3-linoleoyl-rac-glycerol을 포함한 조성물의 경우, 대조군인 비교예 1과 비교하여 계속적인 아세톤 처리로 인해 야기된 피부 장벽의 회복률을 높이는 것을 알 수 있었다.As shown in Table 4, in the case of the composition containing 3-linoleoyl- rac -glycerol, it was found that the recovery rate of the skin barrier caused by the continuous acetone treatment compared to the comparative example 1 as a control.
<실험예 3> 아토피성 피부염 개선 효과Experimental Example 3 Atopic Dermatitis Improvement Effect
아토피성 피부염 증상의 개선 효과 측정을 하기 위해, 심한 건조증, 진무름, 가려움 등의 아토피 증상으로 진단받았던 10-50대 사이의 20명을 대상으로 하여, 2 그룹으로 나누고, 비교예 1 및 제조예 1의 조성물을 각 그룹에게 제공한 후, 아토피 증상을 보이는 부위에 4주 동안 도포하게 하였다. 아토피성 피부염의 개선효과는 4주 후, 개선 정도를 자가 설문을 통해 판정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.In order to measure the improvement effect of atopic dermatitis symptoms, 20 patients in their 10-50s who were diagnosed with atopic symptoms such as severe dryness, erosion and itching were divided into 2 groups, Comparative Example 1 and Preparation Example 1 The composition of was given to each group and then applied to the site showing symptoms of atopy for 4 weeks. After 4 weeks, the improvement of atopic dermatitis was evaluated by self-question. The results are shown in Table 5 below.
상기 표 5에 나타나는 바와 같이, 3-linoleoyl-rac-glycerol을 포함한 조성물의 경우 대조군인 비교예 1에 비해서 전반적인 아토피 증상의 개선효과가 있음을 알 수 있었다.As shown in Table 5, the composition containing 3-linoleoyl- rac -glycerol was found to have an improvement in the overall atopic symptoms compared to Comparative Example 1 as a control.
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