KR101048475B1

KR101048475B1 - 박테리아 사이토크롬 피450을 이용한 피세아타놀의 신규한 생산방법 및 이를 위한 조성물

Info

Publication number: KR101048475B1
Application number: KR1020080122029A
Authority: KR
Inventors: 윤철호; 김동현
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2008-12-03
Filing date: 2008-12-03
Publication date: 2011-07-11
Also published as: EP2352836B1; CN102300995B; US20110236940A1; US9109237B2; EP2352836A4; DK2352836T3; EP2352836A1; CN102300995A; KR20100063486A; US20140106423A1; WO2010064764A1

Abstract

본 발명은 피세아타놀(piceatannol)의 신규한 생산방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 박테리아 시토크롬 P450 BM3(CYP102A1) 또는 그의 돌연변이체를 이용하여 레스베라트롤로부터 고가의 피세아타놀을 제조하는 방법 및 이를 위한 조성물 및 키트를 제공한다.

피세아타놀, piceatannol, 레스베라트롤, resveratrol, CYP102A1, 돌연변이체

Description

박테리아 사이토크롬 피450을 이용한 피세아타놀의 신규한 생산방법 및 이를 위한 조성물 {Novel preparation method of piceatannol using bacterial cytochrome P450 and composition therefor}

본 발명은 박테리아 시토크롬 P450 BM3(CYP102A1) 또는 그의 돌연변이체(mutant)를 이용하여 레스베라트롤로부터 고가의 피세아타놀을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 위한 연구는 교육과학부 21세기 프론티어 미생물 유전체 활용기술 개발사업 [과제고유번호: MG08-0306-2-0 과제명: 미생물 Cytochrome P450 Enzyme Genomics를 활용한 정밀화학소재용 Humanized Bacterial Monooxygenase 개발 ] 에 의하여 일부 지원되었다.

레스베라트롤(resveratrol; 3,4',5-trihydroxystilene)은 포도, 자두(plum), 땅콩 등 다양한 종류의 식물에서 발견되는 파이토알렉신 (외부의 독성에 대하여 식물조직이 산출하는 항독성물질)으로, 항산화작용, 항염증작용, 심장보호활성, 항암 활성 등을 갖는 것으로 알려져 있다 (Kundu 및 Surh, 2008; Pirola 및 Frojdo,2008; Athar 등, 2007). 레스베라트롤은 배양액 내 또는 생체 내에 이식된 다양한 종류의 암세포의 성장을 저해 또는 지연시키는 등의 효과를 가져 암의 예방 및 치료를 위한 천연의 병기로 사용될 수 있는 가능성이 있다는 것을 보여주는 실험결과들이 발표되고 있다. 이와 같은 레스베라트롤의 생물학적 활성은 다양한 타겟(target) 및 신호경로(signaling pathway)를 조절하는 능력과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다.

피세아타놀(piceatannol; 3,5,3´,4´-tetrahydroxystilbene)은 포도 등의 식물에서 발견되는 폴리페놀으로서, 다수의 세포주에서 면역억제 및 항발암성 활성을 발휘하는 단백질키나제 저해제로 알려져 있다. 피세아타놀은 면역세포 및 암세포에서 다양한 약물학적 효과를 발휘한다 (Kim 등, 2008b). 피세아타놀은 사람에서 CYP1B1 및 CYP1A2에 의한 레스베라트롤의 주요 대사산물로써 만들어진다 (Potter 등, 2002; Piver 등, 2004). 트랜스-레스베라트롤이 두 가지의 주요 대사산물 즉, 피세아타놀 및 다른 테트라히드록시스틸벤 (tetrahydroxy stilbene) 으로 대사될 때 재조합 사람 CYP1A1, CYP1A2 및 CYP1B1이 촉매역할을 한다는 것이 보고되었다 (Piver 등, 2004).

시토크롬 P450 효소 (P450s 또는 CYPs)는 고세균(archaea)에서부터 사람에 이르기까지 자연 전반에 걸쳐 매우 다양한 산화반응의 촉매로써 역할을 하는 효소들로 구성되는 대형 패밀리이다 (http://drnelson.utmen.edu/CytochromeP450. html). 이들의 촉매작용의 다양성과 광범위한 기질로 인해 P450s은 의약품 등을 포함하는 정밀화학물질의 생산에 생물학적 촉매로써의 유용성이 크다 (Guengerich 2002; Urlacher 등, 2006; Yun 등, 2007; Lamb 등, 2007). 그러나 이와 같은 다양한 생물공학 분야에서의 포유동물의 시토크롬 P450 효소들의 잠재적인 유용성에도 불구하고, 안정성, 촉매활성 및 입수가능성이 낮아 생물학적 촉매로써 적합하지 않은 면이 있다.

피세아타놀과 같이 대사산물 자체가 생리활성을 가질 경우, 그 대사산물을 직접 생체 내에 투여하는 것이 큰 이점을 가져 올 수 있으며, 따라서 이를 대량으로 제조하는 것이 중요하다. 또한 전구약물(pro-drug)이 약물개발과정 동안 사람 간의 P450s에 의하여 생물학적으로 '활성대사산물'로 전환될 경우 (Johnson 등, 2004), 그 약물의 효능, 독성, 약물동력학 등에 대한 연구를 하기 위해서는 대량의 순수한 대사산물이 필요하게 된다.

그러나 대사산물을 화학적으로 합성하는 것에 여러 가지 문제점이 있을 수 있으며, 대사산물의 화학합성의 대안은 약물이나 약물 후보의 대사산물을 만들기 위하여 P450을 이용하는 것이다. 간의 마이크로좀이 사람 P450의 소스가 될 수 있다. 그러나 이들의 입수가 용이하기 않으므로 대량생산 규모로 대사산물을 합성하기 위하여 이들을 이용한다는 것은 비현실적이다. 몇몇 사람 효소들은 재조합 숙주에서 발현시켜 얻을 수도 있다. 대장균 및 곤충세포에서 발현시킨 사람 P450s을 사용하여 대사산물을 생산한 예가 보도된 바 있다 (Parikh 등, 1997; Rushmore 등, 2000; Vail 등, 2005). 그러나 이러한 시스템은 비용이 많이 들고, 제한된 안정성과 느린 반응속도 (보통 5 min^-1 이하임; Guengerich 등, 1996) 로 인하여 생산성이 낮다. 이의 대안으로서 적절한 선택성을 갖도록 조작된 박테리아 P450을 사용하는 방법이 있다.

바실러스 메가테리움 (Bacillus megaterium)으로부터 유래한 P450MB3 (CYP102A1)은 CYP4A (지방산 히드록시라제) 패밀리의 진핵세포 멤버와 아주 유사하다. CYP102A1 돌연변이체들은 몇몇 사람 P450의 기질을 산화하여 더 활성이 높은 대사산물로 만든다는 것이 보고되었다 (Kim 등, 2008; Otey 등, 2005; Yun 등, 2007). 더욱이, CYP102A1은 다양한 기질에 작용할 수 있는 다목적 모노옥시게나제이다 (Bernhardt 등, 2006; Di Nardo 등, 2007).

최근, 야생형 CYP102A1이 본래 작용하는 기질인 지방산과는 구조적인 유사성 이 적거나 없는 화합물을 산화하도록 CYP102A1를 변형되었다 (Lamb 등, 2007). 이러한 화합물로는 사람 P450 효소의 기질로 알려진 테스토스테론, 몇몇 약물유사 분자(drug-like molecules), 폴리시클릭 방향족 탄화수소 (PAHs; Polycyclic Aromatic Hydrocarbons)을 예로 들 수 있다 (Carmichael 등, 2001; van Vugt-Lusssenburg 등, 2006). 그러나 레스베라트롤을 기질로 사용할 수 있는지는 전혀 연구된 바 없다. 또한 최근, CYP102A1 돌연변이들이 합성하기 어려운 화합물인 사람에서의 약물대사산물을 대량생산할 수 있다는 것이 보고되었다 (Otey 등, 2005). 따라서 대사산물을 제조하는 대체 방법으로서 목적하는 성질을 갖도록 변형된 CYP102A1을 사용하는 것을 생각해 볼 수 있다.

본 발명의 발명자 등에 의하여 CYP102A1의 아미노산 잔기들을 돌연변이시켜 사람 P450 기질에 대한 활성이 증가된 돌연변이 효소가 제작된 바 있으며(Yun 등, 2007), 그 중 특정 돌연변이는 CYP102A1로 하여금 7-ethoxycoumarin의 O-deethylation 및 3-hydroxylation의 촉매로 작용할 수 있도록 하는 것이 확인되었다 (Kim 등, 2008a).

피세아타놀과 관련된 특허출원으로서는 국내에서는 대황추출물, 피세아타놀 등을 유효성분으로 함유하는 혈압 강하용 조성물에 대한 특허 (10-2005-0126879), 피세아타놀 및 비타민Ａ류를 함유하는 화장품 조성물　에 대한 특허 (10-2007-0025087)가 출원된 바 있었으나, 피세아타놀을 제조하는 방법에 대한 특허출원은 없었으며, 국제특허WO2008012321로 레스베라트롤 및 피세아타놀을 화학적으로 합성하는 방법에 관한 특허출원이 있었으나, 생물학적 방법에 의한 제조방법 에 대한 특허는 출원된 바 없다.

본 발명의 명세서에 인용되는 선행문헌의 내용은 모두 본 명세서에 도입된다. 또한 이곳에 기재된 정보들은 단지 본 발명의 기술적 배경에 대한 이해를 돕고자 하는 것으로서, 본 발명에 대한 선행기술로써 작용할 수 없음은 당연하다.

레스베라트롤을 산화시켜 피세아타놀로 전환시키는 반응의 촉매역할을 보다 안정적이고 효율적으로 수행할 수 있는 효소를 찾고 이를 이용하여 피세아타놀을 제조하는 방법을 제공하고자 하는 것이 본 발명에서 해결하고자 하는 과제이다.

본 발명의 발명자들은 상기 과제를 해결고자 연구한 결과, 박테리아 P450 효소인 CYP102A1 및 이의 돌연변이체들이 레스베라트롤의 사람에서의 대사산물, 특히 피세아타놀을 선택적으로 생산하는데 이용될 수 있다는 것을 밝히고, 이를 기초로 본 발명에 이르게 되었다.

본 발명은 동량의 레스베라트롤에 비하여 약 60배 이상 고가인 피세아타놀을 레스베라트롤로부터 대량 생산하는 방법 및 이를 위한 조성물과 키트를 제공한다.

사람 CYP1A2를 촉매로 사용하는 경우 생산되는 레스베라트롤의 대사산물은 피세아타놀과 다른 히드록실화 대사산물을 포함하는 반면, 본 발명과 같이 CYP102A1 또는 이의 돌연변이체들을 촉매로 사용하는 경우 피세아타놀을 선택적으로 생산할 수 있어 공정상의 장점이 있다.

또한 시험관 내 시스템에서 사람 CYP1A2를 사용할 경우 대사산물에 의하여 불활성화되는 문제점이 있으나, 본 발명에서와 같이 CYP102A1 야생형이나 돌연변이체를 사용할 경우 이러한 문제점을 극복할 수 있다는 장점이 있다.

피세아타놀의 화학적 합성이 보고된 바 있으나, 화이트바이오텍의 관점에서 볼 때, 효소를 이용하여 생물학적으로 생산하는 것이 더 효과적이며 환경친화적이라는 장점도 있다.

본 발명은 피세아타놀(piceatannol)의 신규한 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 박테리아 시토크롬 P450 BM3(CYP102A1) 또는 그의 돌연변이체를 이용하여 레스베라트롤로부터 피세아타놀을 제조하는 방법 및 이를 위한 조성물과 키트를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 실험을 통하여 박테리아 CYP102A1 및 그의 돌연변이체가 사람 P450의 기질로서 알려진 레스베라트롤을 기질로 사용한 산화반응에 촉매로 사용될 수 있다는 것을 밝혔다. 특히 사람 CYP1A2를 촉매로 사용하는 경우 생산되는 레스베라트롤의 대사산물은 피세아타놀과 다른 히드록실화 대사산물을 포함하는 반면, 본 발명과 같이 CYP102A1 또는 이의 돌연변이체들을 촉매로 사용하는 경우 피세아타놀을 선택적으로 생산할 수 있다는 것과, 시험관 내 시스템에서 사람 CYP1A2를 사용할 경우 대사산물에 의하여 불활성화되는 문제점이 있으나, 본 발명에서와 같이 CYP102A1 야생형이나 돌연변이체를 사용할 경우 이러한 문제점을 극복할 수 있다는 것을 밝혔다.

구체적으로, 본 발명의 발명자들은 야생형CYP102A1와 이의 점돌연변이체들을 대장균에서 대량 발현시켜 (표1 및 표2), 트랜스-레스베라트롤과 NADPH-생성시스템과 함께 반응시킬 경우 트랜스-레스베라트롤이 히드록실화된 대사산물로 전환되는 것을 HPLC (도1) 및 GC-MS 스펙트럼 (도2 내지 도5)으로 확인하였다. 사람 CYP1A2의 경우는 레스베라트롤을 산화시켜 두 종의 주요 대사산물 즉, 피세아타놀 및 다른 히드록실화된 화합물을 생성하지만, 야생형 CYP102A1 및 그의 돌연변이체들은 하나의 주요 생성물을 선택적으로 생산하였으며, 이는 피세아타놀이라는 것을 확인하였다.

CYP102A1 돌연변이체의 트랜스-레스베라트롤 산화 (피세아타놀 생성)의 turnover number를 측정한 결과 Mutant#8-17의 경우 야생형 CYP102A1 보다도 더 높은 촉매활성을 보였으며, Mutant#13의 경우는 야생형보다 약 18배 이상의 높은 활성을 보였다 (표3). CYP102A1 돌연변이체로 레스베라트롤을 히드록실화 시킬 때 1시간 또는 2시간 동안 반응을 시킨 후의 피세아타놀 생성의 total turnover number (TTN; mol product/mol catalyst)를 결정한 결과, Mutant #13이 가장 큰 활성을 보였으며, 사람 CYP1A1와 비교하여 약 10배 이상 활성이 높았다. 사람 CYP1A2의 경우 1시간 동안 반응을 시켰을 때 보다 오히려 2시간 동안 반응을 시켰을 때 생성물의 양이 적었는데, 이는 효소가 불안정하거나 대사산물에 활성이 저해되기 때문인 것으로 추측된다.

YP102A1 야생형 및 그의 돌연변이체들에 의한 레스베라트롤의 3´-히드록실 화 반응의 동력학적 파라메타를 구한 결과, Mutant #13의 경우 k _cat 및 K _m 값이 가장 컸으며 따라서 촉매효율 (k _cat/K _m) 이 가장 좋았다(표4). 사람 CYP1A2의 경우 동력학적 파라메타를 측정할 수 없었는데, 이는 보고된 바와 같이 반응을 시키는 동안 P450이 자신의 대사산물에 의하여 불활성화되기 때문인 것으로 추측된다. 따라서 시험관 내 시스템에서 사람 CYP1A2를 사용하는 것에는 문제가 있으며, CYP102A1 야생형이나 돌연변이체를 사용할 경우 이러한 문제점을 극복할 수 있다는 장점이 있다.

레스베라트롤은 사람 CYP1A2에 대하여 기질로서 뿐만 아니라 동시에 저해제로 작용하며, 레스베라트롤의 주요 대사산물인 피세아타놀 역시 CYP1A2에 대하여 강력한 저해제로 작용한다는 것이 알려져 있다. 따라서 본 발명의 발명자들은 NADPH 존재 하의 P450에 의한 레스베라트롤의 산화 반응 동안, P450 효소들의 안정성을 반응물의 CO-difference spectra를 측정하여 조사하였으며, Mutant #10, 11, 14, 15가 가장 높은 안정성을 보인다는 것을 밝혔다 (도6).

이와 같은 실험결과를 바탕으로 본 발명은 야생형 CYP102A1 및/또는 CYP102A1의 돌연변이체(들)을 포함하는 레스베라트롤로부터 피세아타놀을 제조하기 위한 반응의 촉매작용을 위하여 사용하기 위한 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 야생형 CYP102A1 및 CYP102A1의 돌연변이체들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 레스베라트롤과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피세아타놀의 제조 방법을 제공한다. 상기 제조 방법은 NADPH- 생성 시스템을 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 야생형 CYP102A1 및 CYP10212의 돌연변이체들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소 및 NADPH-생성 시스템을 포함하는 레스베라트롤로부터 피세아타놀을 제조하기 위하여 사용되는 키트를 제공한다. 본 발명이 키트는 또한 그 외에 반응을 진행시키는데 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기 피세아타놀의 제조방법 및 이를 위한 키트의 NADPH-생성 시스템은 이 기술 분야에 알려진 공지의 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 NADPH-생성 시스템은 glucose 6-phosphate, NADP+ 및 yeast glucose 6-phosphate를 포함할 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 피세아타놀의 제조반응은 0 ^oC 내지 40 ^oC, 바람직하게는 30 ^oC 내지 40 ^oC 에서 진행한다.

CYP102A1의 돌연변이체의 제조는 공지의 돌연변이 방법, 예를 들어 결실-돌연변이 방법 (Kowalski D. et al., J. Biochem., 15, 4457), PCT 법, 쿤켈법 (Kunkel method), 점돌연변이법, DNA shuffling, StEP (staggered extension process), error-prone PCR 등 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.

본 발명의 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형의 CYP102A1 단백질의 아미노산이 자연적인 또는 인위적인 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의하여 변화된 서열을 갖는다. 바람직하기로는, 치환되는 아미노산은 아래 분류된 바와 같이 치환될 아미노산과 유사한 성질을 갖는 것으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 알라닌, 발린, 류 신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판은 모두 비극성 아미노산으로 분류되며, 이들은 서로 비슷한 성질을 갖는다. 전하를 띄지 않는 아미노산으로는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민을 들 수 있으며, 산성 아미노산으로는 아스파르산, 글루타민산을, 염기성 아미노산으로는 리신, 아르기닌, 히스티딘을 들 수 있다.

본 발명의 CYP102A1의 돌연변이체는 또한 CYP102A1 단백질 서열과 50% 이상의 동일성, 바람직하게는 75% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 바람직한 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 47번째 아미노산 아르기닌(R)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 51번째 아미노산 티로신이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 74번째 아미노산 알라닌(A)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 81번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 86번째 아미노산 류신(L)이 알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 87번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 143번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 188번째 아미노산 류신(L)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 267번째 아미노산 글루타민산(E)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되는 것으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 것이다.

본 발명의 더욱 바람직한 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 47번째 아미노산 아르기닌(R)이 류신(L)으로, 51번째 아미노산 티로신(Y)이 페닐알라닌(F)으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신(G)으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신(G)으로, 74번째 아미노산 알라닌(A)이 글리신(G)으로, 81번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 이소류신(I)으로, 86번째 아미노산 류신(L)이 이소류신(I)으로, 87번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 발린(V) 또는 알라닌(A)으로, 143번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신(G)으로, 188번째 아미노산 류신(L)이 글루타민(Q)으로, 267번째 아미노산 글루타민산(E)이 발린(V)으로 치환되는 것으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 것이다.

본 발명의 가장 바람직한 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 아미노산의 치환위치와 치환되는 아미노산이 F87A, R47/L/Y51F, A74G/F87V/L188Q, R47L/L86I/L188Q, R47L/F87V/L188Q, R47L/F87V/L188Q/E267V, R47L/L86I/L188Q/E267V, R47L/L86I/F87V/L188Q, R47L/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V인 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이다.

본 발명의 단백질은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 유전공학적 기법, 고체상기술(solid-phase technique)을 사용하는 펩티드 합성 방법(Merrifield, J. Am. Chem.Soc., 85 : 2149-2154 (1963)) 또는 본 발명의 단백질을 적당한 펩티다제로 절단하는 등의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 단백질은 천연 단백질로서 제조할 수도 있고, CYP102A1 또는 이의 변이체를 암호화하는 DNA로 형질전환시킨 세포를 배양하여 회수하는 재조합 방법에 의하여 제조할 수도 있다. 본 발명의 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 적절한 발현벡터로 삽입하고, 상기 벡터를 적절한 세포로 전달하여 만든 형질전환체를 배양하고, 상기 형질전환체에 의하여 발현된 단백질을 정제함으로써, 본 발명의 단백질을 생산할 수 있다.

상기 벡터는, 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, 바이러스입자 또는 파아지의 형태일 수 있다. 상기 벡터 내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키기 위한 숙주세포에는 원핵세포, 효모, 고등진핵세포가 포함된다. 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 이 기술 분야의 당업자에 의하여 과도한 실험없이도 적절하게 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포배양의 생산성을 최대한으로 하기 위한 원리, 프로토콜, 테크닉은 Mammalian Cell Biotechnology : a Practical Approach, M. Butler, ed.(IRL Press, 1991)에서 참조할 수 있다.

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA 합성을 유도하는 CYP102A2 또는 이의 돌연변이체를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 숙주세포에 의해 인식되는 다양한 프로모터가 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터가 포함된다. 또한, 세균 시스템에서 사용되는 프로모터는 SISP-1을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노(S.D.) 서열을 함유할 수 있다. 효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예에는 3-포스포글리세레이트 키나아제 또는 다른 당분해 효소들이 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

본 발명에 사용된 트랜스-레스베라트롤, 트랜스-피세아타놀 및 NADPH는 시그마-알드리치(Milwaukee, WI, USA)로 구입하였다. 그 외 다른 화합물들은 상업적으로 구입이 가능한 최상등급을 사용하였다. 사람 CYP1A2는 Kim 등(2008c) 에 기재된 방법으로 제조하였다.

<실시예1> 점돌연변이 유발에 의한 P450 BM3 돌연변이체의 구축

CYP102A1의 점돌연변이체들(site-directed mutants)을 Kim 등이 제조한 방법 과 같은 방법 (Drug Metab Dispos 제35호 제2166-2170면, 2008)으로 제조하였다. BanHI/SacI 인식부위 (restriction sites)를 도입하기 위하여 사용된 프라이머 및 돌연변이를 일으키기 위한 PCR 프라이머는 표1과 같다. 아미노산 치환을 위한 코돈은 이태릭체 및 밑줄로 표시하였다. PCR 프라이머들은 제노텍 (대전, 한국)으로 구입하였다. CYP102A1 돌연변이체를 코딩하는 유전자를 발현벡터 pCWori (입수처: Dr. F.W. Dahlquist, University of California, Santa Barbara, CA) 또는 pSE420 (Invitrogen)로의 클로닝을 촉진할 수 있도록 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 pCWBM3로부터 증폭시켰다 (Farinas 등, 2001). 표1에 기재된 14 set의 설계된 프라이머를 사용하여 올리고뉴클레오티드 어셈블리를 실시하였다. 증폭된 유전자를 PCWBM3 BamHI/SacI 벡터의 BamHI/SacI 인식부위로 클로닝하였다. 이러한 플라스미드로 Escherichia coli DH5α F´IQ(Invitrogen)을 형질전환시켰으며, 이는 CYP102A1 돌연변이 단백질을 발현시키는 데도 사용하였다. 돌연변이 유발 후, 목적하는 돌연변이가 일어났는지의 여부를 제노텍 (대전)사에 DNA sequencing을 의뢰하여 확인하였다.

<실시예2> 야생형 CYP102A1 및 그의 돌연변이체의 발현 및 정제

야생형 CYP102A1(pCWBM3)과 CYP102A1 돌연변이체의 유전자를 포함하는 플라스미드로 Escherichia coli DH5α F´-IQ을 형질전환시켰다. 하나의 콜로니로부터 적정량을 암피실린 (100ug/ml)이 추가된 5ml Luria-Bertani medium 에 접종하여 37^oC에서 배양하고, 이 배양물을 암피실린 (100ug/ml)이 추가된 250ml Terrific Broth medium에 접종하여 37^oC에서 250rpm으로 흔들어 주며 OD₆₀₀ ~0.8 정도 될 때까지 배양하고, isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside를 최종 농도 0.5mM이 되도록 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. δ-Aminolevulinic acid (0.1mM)을 첨가하였다. 발현이 유도된 후, 30^oC에서 추가로 36시간 더 배양하고 원심분리(15분, 5000g, 4^oC)하여 세포를 수확하였다. 세포 펠렛을 TES 완충액 (100mM Tris-HCL, pH7.6, 500mM sucrose, 0.5 mM EDTA)에 재현탁시키고 초음파분해로 세포를 용해시켰다 (sonicator; Misonix, Inc., Farmingdale, NY). 세포용해물을 100,000g, 90분, 4^oC 에서 원심분리한 후, 가용성 시토졸 분액 (soluble cytosolic fraction)을 모아 활성을 측정하였다. 시토졸 분액을 50mM potassium phosphate 완충액 (pH 7.4)에서 투석하여 -80^oC에서 보관하였으며, 제조 후 1개월 이내의 것을 실험에 사용하였다. CYP102A1의 농도는 CO-difference 스펙트럼으로부터 결정하였으며, 이때 사용한 ε는 91mM/cm 이었다 (Omura 및 Sato, 1964). 야생형 및 돌연변이체 모두 통상적으로 300-700 nM P450을 얻을 수 있었다. 야생형 및 돌연변이 CYP102A1의 발현정도는 1.0~2.0 nmole P450/mg cytosolic protein 의 범위였다.

제조된 돌연변이체들 중에서 사람에 있어서의 몇몇 기질(substrates)에 대한 촉매 활성이 큰 것들을 선택하였으며, 각 돌연변이체에서 아미노산이 치환된 부위는 표2와 같다.

<실시예 3> 야생형 P450 BM3 또는 이의 돌연변이체에 의한 트랜스-레스베라트롤의 히드록실화

CYP102A1 이 사람 CYP1A2의 기질인 트랜스-레스베라트롤을 산화할 수 있는지 확인하였다. 100mM potassium phosphate 완충액 (pH 7.4) 0.25ml 에 P450 BM3 50pmol과 기질을 넣어 전형적인 steady-state 반응을 시켰다. CYP102A1 돌연변이체들의 동력학적 파라메타를 결정하기 위하여 2-100μM 트랜스-레스베라트롤을 사용하였다. 반응을 시작하기 위하여 NADPH-생성 시스템 (최종 농도: 1ml 당10mM glucose 6-phosphate, 0.5mM NADP+ 및 1 IU yeast glucose 6-phosphate)을 첨가하였다. DMSO로 트랜스-레스베라트롤 20mM 용액을 제조하고 효소 반응액으로 희석하여 최종 유기용매 농도가 1%(v/v) 이하가 되도록 하였다. 반응액을 37^oC에서 10분간 반응시키고 105 ul의 얼음으로 차갑게 한 아세트산/메탄올 (95/5, v/v) 로 반응을 종결시켰다.

실시예 3-1 HPLC 분석

반응혼합물을 원심분리하여 상등액을 HPLC로 분석하였다 (Piver 등, 2004). 시료(30 ul)를 Gemini C₁₈ 컬럼 (4.6mm x 150mm, 5um, Phenomenex, Torrance, CA)에 주입하였다. 이동상A는 0.5% 아세트산/아세토니트릴 (95/5, v/v)을 87mM함유하는 물, 이동상B는 아세토니트릴/0.5% 아세트산 (95/5, v/v)을 사용하였다. 이동상 A/B(75/25, v/v)를 그래디언트 펌프 (LC-20AD, Shimadzu, Kyoto, Japan)을 사용하여 1ml·in^-1 의 속도로 흘려주었다. 용출액을 320 nm의 UV로 측정하였다.

도1은 사람 CYP1A2 및 박테리아 CYP102A1 돌연변이체에 의하여 생성된 레스베라트롤의 대사산물의 HPLC 크로마토그램이다. (A: 레스베라트롤 및 피세아타놀 표준품, B: human CYP1A2, C: Mutant #10, D: Mutant #13, E: Mutant #14, F: Mutant #15) 기질인 레스베라트롤 및 두 종의 주요 대사산물의 피크를 나타내었으며, 320nm에서의 UV 흡광도를 측정하였다.

사람 CYP1A2의 경우는 레스베라트롤을 산화시켜 두 종의 주요 대사산물 즉, 피세아타놀 및 다른 히드록실화된 화합물을 생성하였다(B). 반면, 야생형 CYP102A1 및 그의 돌연변이체들은 하나의 주요 생성물을 생산하였으며, 이의 피크의 retention time은 표준 피세아타놀 피크의 retention time과 정확히 일치하였다. 즉, 야생형 CYP102A1 및 그의 돌연변이체들은 레스베라트롤을 산화시킬 때 선택적으로 피세아타놀을 생성하였다. 이는 다른 히드록실화 대사산물과 피세아타놀을 분리하는 공정을 필요로 하지 않기 때문에 제조 공정상 큰 이점을 가져다 준다.

실시예 3-2 GC-MS 분석

P450 BM3 돌연변이체가 생산하는 레스베라트롤 대사산물을 동정하기 위하여, 피세아타놀과 레스베라트롤의 GC 프로파일과 fragmentation 패턴을 비교하여 GC-MS 분석을 하였다. P450 BM3 돌연변이체에 의하여 트랜스-레스베라트롤의 산화반응이 되었음을 확인하였다. 수용액 시료를 에틸아세테이트로 추출하고, 원심분리후, 유기층을 질소하에 건조하였으며, 표준 트랜스-레스베라트롤 및 피세아타놀의 DMSO 중의 10mM 용액도 동일하게 건조하였다. 트리메틸실릴 (TMS) 유도체를 다음과 같이 준비하였다. BSTFA/TMCS (99/1, v/v) 용액 100μl (Supelco)를 건조시킨 시료 또는 표준 트랜스-레스베라트롤 및 피세아타놀에 첨가하고 60^oC에서 60분간 방치하였다. GC-2010 가스크로마토그래프 (Shimadzu, Kyoto, Japan)를 사용하여 Rtx-5 (5% diphenyl/95% dimethyl polysiloxane capillary column)(30m x0.32 mm i.d. x 0.25 ㎛ 필름 두께)로 GC-MS 분석을 수행하였다. 인젝터 온도는 250^oC 이었다. 레스베라트롤의 유도체와 피세아타놀은 GC에 의하여 분리되었다. GC 오븐의 조건은 60^oC에서 5분, 그 후 1분당 50^oC 씩 200^oC까지 증가시키고, 다음 1분당 2^oC 씩 300^oC 까지 증가시켰다. 가스 크로마토그래피는 electron ionization mode로 작동되는GCMS-QP2010 Schimazu mass spectrometer와 결합하여 수행하였다.

도2는 CYP102A1 또는 그의 돌연변이체에 의한 레스베라트롤의 대사산물의 유도체의 GC 분석 결과이다. (A: 표준 트랜스-레스베라트롤 및 피세아타놀 유도체, B: human CYP1A2, C: Mutant #10, D: Mutant #13, E: Mutant #14, F: Mutant #15) 반응시료의 mass spectra는 28.09 min (resveratrol) 및 32.98 min (piceatannol)에서 피크를 나타냈다.

GC-MS 분석결과 CYP102A1 돌연변이체들에 의한 대사산물의 피크의 retention time과 fragmentation pattern이 표준 피세아타놀의 그것과 정확하에 일치하는 것으로부터, CYP102A1 돌연변이체들에 의해 생성되는 대사산물이 피세아타놀이라는 것을 확인하였다. 사람 간 마이크로좀에 의한 레스베라트롤의 대사산물은 두 종, 즉 피세아타놀 및 다른 히드록실화된 생성물의 피크가 나타났으나, CYP102A1 야생형 및 그의 돌연변이체들에서는 모두 하나의 히드록실화 생성물 즉, 피세아타놀의 피크만이 관찰되었다. 사람 간에서 레스베라트롤의 히드록실화 반응의 주요 효소인 사람 P4501A2도 레스베라트롤의 3´위치의 히드록실화 반응을 보이기는 하나 (도2B, 도4), CYP102A1 야생형 및 그의 돌연변이체들의 경우는 다른 히드록실화 생성물은 생성하지 않으며 오직 피세아타놀 만을 생성한다는 것이 특징이다.

도3은 사람 CYP1A2에 의해 생성된 트랜스-레스베라트롤 대사산물의 유도체의 GC 용출 프로파일(A) 및 MS 스펙트라이다 (B 레스베라트롤, C 및 D 레스베라트롤 대사산물).

도4는 각각 29.08min 및 32.98 min 에서의 표준품 트랜스-레스베라트롤(A) 및 피세아타놀(B) 유도체 (Res-TMS; m/z=444, Pic-TMS; m/z=532), 29.08min 및 32.98 min 에서 용출된 사람 CYP1A2 대사산물 피크 (C: Res-TMS; m/z=444, D: Pic-TMS; m/z=532), 32.98 min 에서 용출된 CYP102A1 돌연변이체들에 의한 대사산물 피크 (Pic-TMS; m/z=532) (E: Mutant #10, F: Mutant #13, G: Mutant #14, and H: Mutant #15) 의 MS spectra이다.

실시예 3-3 Total turnover number 의 결정

CYP102A1 돌연변이체의 total turnover number를 결정하기 위하여 100uM 트랜스-레스베라트롤을 사용하였다. 반응은 NADPH-생성 시스템을 첨가하여 시작하였으며, 30^oC에서 각각 1시간, 2시간 반응시켰다. 피세아타놀의 생성속도를 위에 기재한 바와 같이 HPLC로 결정하였다.

표3은 실험에 사용된 17종의 돌연변이체들의 트랜스-레스베라트롤 산화 (피세아타놀 생성)의 turnover number이다. 기질인 트랜스-레스베라트롤의 농도를 100μM로 고정하고, 야생형 P450 BM3 및 그의 돌연변이체들의 트랜스-레스베라트롤 산화능을 측정하였다.

^a 100 μM trans-resveratrol을 사용하였으며, 각 데이터는 3번의 실험결과로부터 구한 평균±SD 임.

^bNot detectable. 생성속도가 0.001 nmol product/min/nmol P450 이하인 경우임.

Mutant#8-17의 경우 야생형 CYP102A1 보다도 더 높은 촉매활성을 보였으며, Mutant#13의 경우는 야생형 보다 약 18배 이상의 높은 활성을 보였다.

도5는 CYP102A1 돌연변이체로 레스베라트롤을 히드록실화 시킬 때 피세아타놀 생성의 total turnover number (TTN; mol product/mol catalyst)를 결정한 결과이다. 100 μM트랜스-레스베라트롤을 사용하였으며, NADPH-생성 시스템을 첨가함으로써 반응을 개시하였고 30 ^oC 에서 1시간 또는 2시간 동안 반응을 시켰다. 피세아타놀 생성 속도는 HPLC로 결정하였다.

Mutant #13이 가장 큰 활성을 보였으며, 사람 CYP1A1와 비교하여 약 10배 이상 활성이 높았다. 사람 CYP1A2의 경우 1시간 동안 반응을 시켰을 때보다 오히려 2시간 동안 반응을 시켰을 때 생성물의 양이 적었는데, 이는 효소가 불안정하거나 대사산물에 활성이 저해되기 때문인 것으로 추측된다.

실시예 3-4 동력학적 파라메타의 결정

동력학적 파라메타 (K _m 및 k _cat) 를 GraphPad PRISM 소프트웨어 (Graph Pad, San Diego, CA, USA)를 사용하여 비선형회귀분석을 하여 결정하였다. 데이터 분석은 표준 Michaelis-Menten equation υ=k _cat[E][S]/([S]+K _m)을 사용하였다. 상기 식에서 반응속도는 turnover의 rate-limiting step (k _cat), 효소농도([E]), 기질농도([S]) 및 미카엘리스 상수(K _m) 의 함수이다.

표4는 CYP102A1 야생형 및 그의 돌연변이체들에 의한 레스베라트롤의 3´-히드록실화 반응의 동력학적 파라메타를 구한 결과이다.

Mutant #13의 경우 k _cat 및 K _m 값이 가장 컸으며 따라서 촉매효율 (k _cat/K _m) 이 가장 좋았다.

사람 CYP1A2의 경우 동력학적 파라메타를 측정할 수 없었는데, 이는 보고된 바와 같이 반응을 시키는 동안 P450이 자신의 대사산물에 의하여 불활성화되기 때문인 것으로 추측된다 (Chun 등, 1999, 2001). 따라서 시험관 내 시스템에서 사람 CYP1A2를 사용하는 것에는 문제가 있으며, CYP102A1 야생형이나 돌연변이체를 사용할 경우 이러한 문제점을 극복할 수 있다는 장점이 있다.

<실시예 4> CYP102A1 돌연변이체들의 안정성

레스베라트롤의 대사산물은 사람 CYP들, 즉 CYP1A1, 1A2, 1B1에 대하여 강력한 저해제라는 것이 알려져 있다 (Chun 등, 1999, 2001). 레스베라트롤은 사람 CYP1A2에 대하여 기질로서 뿐만 아니라 동시에 저해제로 작용한다 (Fairman 등, 2007; Piver 등, 2004). 레스베라트롤의 주요 대사산물인 피세아타놀 역시 CYP1A2에 대하여 강력한 저해제로 작용한다 (Mikstacka 등, 2006).

도6은 NADPH 존재 하의 P450에 의한 레스베라트롤의 산화 반응 동안, P450 효소들의 안정성을 반응물의 CO-difference spectra를 측정하여 조사한 결과이다. 그래프에서 100%는 반응혼합물을 반응시키기 전의 P450의 농도이다. Mutant #10, 11, 14, 15가 가장 높은 안정성을 보였다.

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도1은 레스베라트롤의 사람 CYP1A2 및 박테리아 CYP102A1 돌연변이체에 의하여 생성된 레스베라트롤의 대사산물의 HPLC 크로마토그램이다. (A: 레스베라트롤 및 피세아타놀 표준품, B: human CYP1A2, C: Mutant #10, D: Mutant #13, E: Mutant #14, F: Mutant #15) 기질인 레스베라트롤 및 두 종의 주요 대사산물의 피크를 나타내었으며, 320nm에서의 UV 흡광도를 측정하였다.

도2는 CYP102A1 또는 그의 돌연변이체에 의한 레스베라트롤의 대사산물의 유도체의 GC 분석 결과이다. (A: 표준 레스베라트롤 및 피세아타놀 유도체, B: human CYP1A2, C: Mutant #10, D: Mutant #13, E: Mutant #14, F: Mutant #15) 반응시료의 mass spectra는 28.09 min (resveratrol) 및 32.98 min (piceatannol)에서 피크를 나타냈다.

도3은 사람 CYP1A2에 의해 생성된 레스베라트롤 대사산물의 유도체의 GC 용출 프로파일(A) 및 MS 스펙트라이다 (B 레스베라트롤, C 및 D 레스베라트롤 대사산물).

도4는 각각 29.08 및 32.98 min 에서의 표준품 레스베라트롤(A) 및 피세아타놀(B) 유도체 (Res-TMS; m/z=444, Pic-TMS; m/z=532), 29.08 및 32.98 min 에서 용출된 사람 CYP1A2 대사산물 피크 (C: Res-TMS; m/z=444, D: Pic-TMS; m/z=532), 32.98 min 에서 용출된 CYP102A1 돌연변이체들에 의한 대사산물 피크 (Pic-TMS; m/z=532) (E: Mutant #10, F: Mutant #13, G: Mutant #14, and H: Mutant #15) 의 MS spectra이다.

도5는 CYP102A1 돌연변이체로 레스베라트롤을 히드록실화 시킬 때 피세아타놀 생성의 total turnover number (TTN; mol product/mol catalyst)를 결정한 결과이다. 100 μM 트랜스-레스베라트롤을 사용하였으며, NADPH-생성 시스템을 첨가함으로써 반응을 개시하였고 30 ^oC 에서 1시간 또는 2시간 동안 반응을 시켰다. 피세아타놀 생성 속도는 HPLC로 결정하였다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> METHOD OF PREPARING PICEATANNOL USING BACTERIAL CYTOCHROME P450 AND COMPOSITION THEREFOR <140> 10-2008-0122029 <141> 2008-12-03 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 1 agcggatcca tgacaattaa agaaatgcct c 31 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 2 atcgagctcg tagtttgtat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 3 gcgcctggtc tggtaacgcg 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 4 gtaacgcgct tcttatcaag t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 5 gcatgcgatg gctcacgctt t 21 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 6 taagtcaagg ccttaaattt gtacg 25 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 7 gtacgtgata ttgcaggaga c 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 8 ggagacggga tttttacaag ct 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 9 gacgggttag cgacaagctg g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 10 gacgggttag tgacaagctg g 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 11 gaagtaccgg gcgacatgac a 21 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 12 atgaacaagc agcagcgagc aa 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 13 ttcttaattg ggggacacgt g 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 14 tgcgggacac gtgacaacaa gt 22 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer used for the generation of mutants <400> 15 ggagacggga ttgtgacaag ctg 23

Claims

야생형 CYP102A1 및 CYP102A1의 돌연변이체들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 포함하는, 레스베라트롤로부터 피세아타놀을 제조하기 위한 반응의 촉매작용을 위하여 사용하기 위한 조성물로서, 상기 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 47번째 아미노산 아르기닌(R)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 51번째 아미노산 티로신이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 74번째 아미노산 알라닌(A)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 81번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 86번째 아미노산 류신(L)이 알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 87번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 143번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 188번째 아미노산 류신(L)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 267번째 아미노산 글루타민산(E)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되는 것으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 치환에 의해 변화된 서열을 갖는 것인 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 47번째 아미노산 아르기닌(R)이 류신(L)으로, 51번째 아미노산 티로신(Y)이 페닐알라닌(F)으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신(G)으로, 74번째 아미노산 알라닌(A)이 글리신(G)으로, 81번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 이소류신(I)으로, 86번째 아미노산 류신(L)이 이소류신(I)으로, 87번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 발린(V) 또는 알라닌(A)으로, 143번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신(G)으로, 188번째 아미노산 류신(L)이 글루타민(Q)으로, 267번째 아미노산 글루타민산(E)이 발린(V)으로 치환되는 것으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 치환에 의해 변화된 서열을 갖는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 아미노산의 치환위치와 치환되는 아미노산이 F87A, R47L/Y51F, A74G/F87V/L188Q, R47L/L86I/L188Q, R47L/F87V/L188Q, R47L/F87V/L188Q/E267V, R47L/L86I/L188Q/E267V, R47L/L86I/F87V/L188Q, R47L/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V인 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 레스베라트롤이 트랜스-레스베라트롤인 것인 조성물.
야생형 CYP102A1 및 CYP102A1의 돌연변이체들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 레스베라트롤과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 피세아타놀의 제조 방법으로서, 상기 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 47번째 아미노산 아르기닌(R)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 51번째 아미노산 티로신이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 74번째 아미노산 알라닌(A)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 81번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 86번째 아미노산 류신(L)이 알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 87번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 143번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 188번째 아미노산 류신(L)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 267번째 아미노산 글루타민산(E)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되는 것으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 치환에 의해 변화된 서열을 갖는 것인 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 제조 방법은 NADPH-생성 시스템을 추가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 피세아타놀의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 NADPH-생성 시스템은 glucose 6-phosphate, NADP+ 및 yeast glucose 6-phosphate를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 레스베라트롤이 트랜스-레스베라트롤인 것인 제조방법.
삭제
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 47번째 아미노산 아르기닌(R)이 류신(L)으로, 51번째 아미노산 티로신(Y)이 페닐알라닌(F)으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신(G)으로, 74번째 아미노산 알라닌(A)이 글리신(G)으로, 81번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 이소류신(I)으로, 86번째 아미노산 류신(L)이 이소류신(I)으로, 87번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 발린(V) 또는 알라닌(A)으로, 143번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신(G)으로, 188번째 아미노산 류신(L)이 글루타민(Q)으로, 267번째 아미노산 글루타민산(E)이 발린(V)으로 치환되는 것으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 치환에 의해 변화된 서열을 갖는 것인 제조 방법.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 아미노산의 치환위치와 치환되는 아미노산이 F87A, R47L/Y51F, A74G/F87V/L188Q, R47L/L86I/L188Q, R47L/F87V/L188Q, R47L/F87V/L188Q/E267V, R47L/L86I/L188Q/E267V, R47L/L86I/F87V/L188Q, R47L/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V, R47L/E64G/F81I/F87V/E143G/L188Q/E267V인 것으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
야생형 CYP102A1 및 CYP102A1의 돌연변이체들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소 및 NADPH-생성 시스템을 포함하는 레스베라트롤로부터 피세아타놀을 제조하기 위하여 사용되는 키트로서, 상기 CYP102A1의 돌연변이체는 야생형 CYP102A1의 47번째 아미노산 아르기닌(R)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 51번째 아미노산 티로신이 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 64번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 74번째 아미노산 알라닌(A)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 81번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 86번째 아미노산 류신(L)이 알라닌, 발린, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 87번째 아미노산 페닐알라닌(F)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 143번째 아미노산 글루타민산(E)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 188번째 아미노산 류신(L)이 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라진, 글루타민으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로, 267번째 아미노산 글루타민산(E)이 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 페닐알라닌 및 트립토판으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산으로 치환되는 것으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 치환에 의해 변화된 서열을 갖는 것인 키트.
제13항에 있어서, 상기 NADPH-생성 시스템은 glucose 6-phosphate, NADP+ 및 yeast glucose 6-phosphate를 포함하는 것인 키트.