KR101048315B1

KR101048315B1 - Pine Red Nematode Histone Deacetylase

Info

Publication number: KR101048315B1
Application number: KR1020080095605A
Authority: KR
Inventors: 권호정; 김유선; 김범석
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2008-09-29
Filing date: 2008-09-29
Publication date: 2011-07-13
Also published as: KR20100036141A

Abstract

본 발명은 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone Deactylase, HDA) 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 서열은 모델동물인 예쁜 꼬마선충의 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 서열에 기초한 이와 상동성이 높은 서열이며, 본 발명의 히스톤 탈아세틸화 효소의 유전자 발현을 억제함으로써, 소나무 재선충의 성장과 생식을 억제하여 소나무 재선충병 방제에 이용될 수 있다.The present invention relates to Bursaphelenchus xylophilus Histone Deactylase (HDA) and nucleic acid molecules encoding the same. The sequence of the present invention is a sequence highly homologous to the sequence based on the sequence of the first histone deacetylase of a beautiful little nematode, which is a model animal, and grows pine re-nematodes by inhibiting the gene expression of the histone deacetylase of the present invention. It can be used to control pine nematode disease by inhibiting overgrowing.

소나무 재선충, 예쁜 꼬마선충, 히스톤, 탈아세틸화 효소 Pine re-nematodes, pretty nematodes, histones, deacetylase

Description

소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소{Histone Deactylase of Bursaphelenchus xylophilus}Histone Deactylase of Bursaphelenchus xylophilus

본 발명은 소나무 재선충의 히스톤 탈아세틸화 효소 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.The present invention relates to histone deacetylase of pineal re nematodes and nucleic acid molecules encoding them.

히스톤 탈아세틸화 효소는 생물체의 유전자 발현을 조절하는 기능을 하는 단백질로서, 핵내 유전물질을 감싸고 있는 히스톤의 라이신 잔기에 결합된 아세틸기를 제거하는 역할을 한다(Gallinari et al., 2007). 아세틸기가 제거된 라이신기는 본래의 양전하를 회복하여 DNA의 음전하와 이온결합을 재개함으로써 염색질 구조를 수축시켜 유전자의 전사 발현을 저해하는 결과를 낳는다. 따라서 히스톤 탈아세틸화 효소의 활성이 증가하게 되면 히스톤의 저아세틸화가 이루어져 비정상적인 유전자의 발현 변화가 일어나게 된다(Szulakowski et al., 2006).Histone deacetylase is a protein that functions to regulate gene expression in organisms and removes acetyl groups bound to the lysine residues of histones surrounding the genetic material in the nucleus (Gallinari et al., 2007). The lysine group from which the acetyl group was removed restores the original positive charge and resumes the negative charge and ionic bond of DNA, resulting in contraction of the chromatin structure, resulting in inhibition of gene transcription. Therefore, when the activity of histone deacetylase increases, histone hypoacetylation occurs, resulting in abnormal gene expression changes (Szulakowski et al., 2006).

많은 생물학적인 현상이 히스톤 탈아세틸화 효소와 직 간접적으로 연결되어 있으며 현재 가장 많이 연구되고 있는 분야는 종양생물학분야이다. 히스톤 탈아세틸화 효소에 의한 히스톤의 부적절한 저아세틸화 현상은 비정상적인 과성장 및 변형된 세포 사멸을 촉진시켜서 결과적으로 형질 전환을 일으켜 종양에 이르게 하 는 것으로 보고 되고 있다. 따라서 히스톤 탈아세틸화 효소 활성의 제어는 종양의 발생과 진행을 억제하는데 효과적인 것으로 받아들여지고 있다(Carey et al., 2006). 실제로, 특정한 억제제에 의한 히스톤 탈아세틸화 효소의 억제는 분자 및 세포 수준에서 증식과 관련된 특정 유전자의 발현 및 세포의 형태를 변화시켜 종양 성장을 방해하는 능력이 있음이 밝혀졌고 이를 통해 여러 가지 히스톤 탈아세틸화 효소 억제제가 개발되고 있다(Tsuji et al., 1976; Yoo et al., 2006; Yoshida et al., 1990; Shute et al., 1987; Han et al., 2000; Ueda et al., 1994; Kruh et al., 1982; Richon et al., 1998; Suzuki et al., 1999).Many biological phenomena are directly or indirectly linked to histone deacetylase, and the most studied area is tumor biology. Inadequate hypoacetylation of histones by histone deacetylases has been reported to promote abnormal overgrowth and modified cell death resulting in transformation leading to tumors. Therefore, control of histone deacetylase activity has been accepted as effective in suppressing tumor development and progression (Carey et al., 2006). Indeed, inhibition of histone deacetylase by specific inhibitors has been shown to have the ability to interfere with tumor growth by altering the expression and specific cell morphology of specific genes involved in proliferation at the molecular and cellular levels. Acetase inhibitors are being developed (Tsuji et al., 1976; Yoo et al., 2006; Yoshida et al., 1990; Shute et al., 1987; Han et al., 2000; Ueda et al., 1994 Kruh et al., 1982; Richon et al., 1998; Suzuki et al., 1999).

소나무 재선충과 같은 선형동물에서도 히스톤 탈아세틸화 효소는 성장과 생식에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 보고 되고 있다. 모델동물인 예쁜 꼬마선충의 히스톤 탈아세틸화 효소는 예쁜 꼬마선충의 생식선과 음문의 발달에 필수적인 역할을 한다고 알려졌다(Dufourcq et al., 2002). 또한 선충의 노화에도 직접적인 영향을 미치는 것으로 알려지고 있다(Lee et al., 2006). siRNA 실험에 의해서 히스톤 탈아세틸화 효소의 유전자 발현이 억제 되었을 때는 선충의 성장과 생식이 억제되는 것이 확인되기도 하였다(Rual et al., 2004; Kamath et al., 2003).Histone deacetylase has also been reported to play an important role in growth and reproduction in linear animals such as pine worms. It is known that histone deacetylase of the model nematode, a nematode, plays an essential role in the development of the gonads and vulva of the pretty nematode (Dufourcq et al., 2002). It is also known to directly affect nematode aging (Lee et al., 2006). In siRNA experiments, the expression of histone deacetylase inhibited the growth and reproduction of nematodes (Rual et al., 2004; Kamath et al., 2003).

이러한 일련의 증거들은 히스톤 탈아세틸화 효소가 선형동물의 생장 조절에 깊숙이 관여한다는 것을 보여준다.This series of evidence shows that histone deacetylase is deeply involved in the regulation of growth in linear animals.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification many patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of the cited patent documents are incorporated by reference herein in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly described.

본 발명자들은 소나무 재선충의 히스톤 탈아세틸화 효소를 동정해내고자 예의 노력한 결과, 선형동물문에 속하는 모델동물인 예쁜 꼬마선충의 제 1 HDA의 서열에 기초하여 소나무 재선충의 HDA 서열을 분리 및 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.The present inventors have made efforts to identify histone deacetylase of pine re-nematode, and as a result, by separating and identifying the HDA sequence of pine re-nematode based on the sequence of the first HDA of a pretty little nematode, a model animal belonging to a linear animal sentence, The invention was completed.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 소나무 재선충 탈아세틸화 효소를 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a novel pine re-nematode deacetylase.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 소나무 재선충 탈아세틸화 효소를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a nucleic acid molecule encoding the pine re-nematode deacetylase of the present invention.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 소나무 재선충 탈아세틸화 효소를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a vector comprising a nucleic acid molecule encoding the pine re-nematode deacetylase of the present invention.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 소나무 재선충 탈아세틸화 효소를 코딩하는 핵산 분자를 갖는 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a transformant comprising a vector having a nucleic acid molecule encoding a pine re-nematode deacetylase of the present invention.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명은 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone Deactylase, HDA) 및 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.The present invention relates to Bursaphelenchus xylophilus Histone Deactylase (HDA) and nucleotide sequences encoding the same.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone Deactylase, HDA)를 제공한다.According to one aspect of the invention, the present invention provides a Bursaphelenchus xylophilus histone deacetylase (HDA) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 sequence.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소-인코딩 핵산 분자를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a pine re- nematode histone deacetylase-encoding nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the pine re- nematode histone deacetylase.

본 발명자들은 소나무 재선충의 히스톤 탈아세틸화 효소를 동정해내고자 예의 노력한 결과, 선형동물문에 속하는 모델동물인 예쁜 꼬마선충의 제 1 HDA의 서열에 기초하여 소나무 재선충의 HDA 서열을 분리 및 규명하였다.As a result of our efforts to identify the histone deacetylase of pine re nematodes, the present inventors have isolated and identified the HDA sequence of pine re nematodes based on the sequence of the first HDA of a pretty little nematode, a model animal belonging to the linear animal portal.

본 명세서에서 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 히스톤 탈아세틸화 효소를 언급하면서 사용되는 용어 “단백질 또는 효소”는 소나무 재선충으로 부터 분리 및 정제된 단백질뿐만 아니라, 소나무 재선충을 코딩하는 유전자를 이용하여 제조된 재조합 단백질도 포함한다.The term “protein or enzyme” as used herein referring to Bursaphelenchus xylophilus histone deacetylase is a recombinant protein produced using genes encoding pine re-nematodes as well as proteins isolated and purified from pine re- nematodes . It also contains proteins.

본 발명의 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소는 상기한 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 98%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.The pine re-nematode histone deacetylase of the present invention is also interpreted to include an amino acid sequence that exhibits substantial identity to the amino acid sequence described above. The substantial identity above aligns the amino acid sequence of the present invention with any other sequence as closely as possible, and the algorithm commonly used in the art (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) ); Needleman and Wunsch, J. Mol Bio 48:.. 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol Biol 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:.. 237-44 (1988 Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc.Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp.Appl. BioSci. 8: 155- 65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994)), when analyzing the aligned sequence at least 90% homology, more preferably minimum By amino acid sequence, it shows 95% homology, most preferably at least 98% homology.

또한, 본 발명의 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소는 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체를 포함한다. 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 변이체란 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 및 파네실화(farnesylation) 등으로 수식 (modification)될 수도 있다. In addition, the pine re nematode histone deacetylase of the present invention includes not only proteins having their natural amino acid sequence, but also amino acid sequence variants thereof. Variants of pine re nematode histone deacetylases refer to proteins in which the natural amino acid sequence of pine red nematode histone deacetylase and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof. do. Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole are known in the art (H. Neurode, RL Hill, The Proteins , Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation and farnesylation.

본 명세서에서 용어 “핵산 분자”는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).As used herein, the term “nucleic acid molecule” is meant to encompass DNA (gDNA and cDNA) and RNA molecules inclusively, and the nucleotides, which are the basic building blocks of nucleic acid molecules, are modified from sugar or base sites, as well as natural nucleotides. Analogs are also included (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York (1980); Uhlman and Peyman, Chemical Reviews , 90: 543-584 (1990)).

본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1-1,410을 포함한다. 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1-1,410은 코딩 서열에 해당하며, 이 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1,411-1,726의 3’-비해독 부위 (untranslated region: UTR)를 추가적으로 포함할 수 있다.According to the most preferred embodiment of the present invention, the nucleic acid molecule of the present invention comprises nucleotides 1-1,410 of SEQ ID NO: 1. The nucleotides 1-1,410 of SEQ ID NO: 1 correspond to the coding sequence, and the sequence may further include the 3′-untranslated region (UTR) of nucleotides 1,411-1,726 of SEQ ID NO: 1.

소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 상기한 뉴클레오타이드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘 (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol. Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol. Biol. 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc. Acids Res. 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155- 65(1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994))을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 98%의 상동성을 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.Nucleic acid molecules of the present invention encoding pine re- nematode histone deacetylase are also construed to include nucleotide sequences that show substantial identity to the nucleotide sequences described above. The substantial identity above aligns the nucleotide sequence of the present invention with any other sequence to the maximum correspondence, and the algorithm commonly used in the art (Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981) ); Needleman and Wunsch, J. Mol Bio 48:.. 443 (1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol Biol 24: 307-31 (1988); Higgins and Sharp, Gene 73:.. 237-44 (1988 Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-3 (1989); Corpet et al., Nuc.Acids Res. 16: 10881-90 (1988); Huang et al., Comp.Appl. BioSci. 8: 155- 65 (1992) and Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24: 307-31 (1994)), when analyzing the aligned sequence at least 90% homology, more preferably minimum A nucleotide sequence that exhibits 95% homology, most preferably at least 98% homology.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소를 코딩하는 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a vector comprising the nucleic acid molecule of the present invention as described above encoding pine re-nematode histone deacetylase.

본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 이에 대한 구체적인 방법은 Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. The vector system of the present invention may be constructed through various methods known in the art, and specific methods thereof are disclosed in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001), This document is incorporated herein by reference.

본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.Vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression. In addition, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts. It is preferable that the nucleic acid molecule of the present invention is derived from a prokaryotic cell, and the prokaryotic cell is used as a host in consideration of the convenience of culture. Vectors of the present invention can typically be constructed as vectors for cloning or vectors for expression.

예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, p_L ^λ프로모터, p_R ^λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (p_L ^λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.For example, when the vector of the present invention is an expression vector and the prokaryotic cell is a host, powerful promoters capable of promoting transcription (e.g., tac promoter, lac promoter, lac UV5 promoter, lpp promoter, p _L ^lambda promoter , p _R ^λ promoters, rac 5 promoters, amp promoters, recA promoters, SP6 promoters, trp promoters and T7 promoters, etc.), ribosome binding sites for initiation of translation and transcription / detox termination sequences. When E. coli is used as the host cell, the promoter and operator site of the E. coli tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol. , 158: 1018-1024 (1984)) and the leftward promoter of phage λ (p _L ^λ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet. , 14: 399-445 (1980)) can be used as regulatory sites.

한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. On the other hand, vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), phages (eg, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 which are often used in the art). And M13, etc.) or viruses (eg, SV40, etc.).

한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.On the other hand, when the vector of the present invention is an expression vector and the eukaryotic cell is a host, a promoter derived from the genome of the mammalian cell (e.g., a metallothionine promoter) or a promoter derived from a mammalian virus (e.g., adeno) Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV) can be used and generally have a polyadenylation sequence as a transcription termination sequence.

본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열 은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질 (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있고, 가장 바람직하게는 6x His이다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.The vector of the present invention may be fused with other sequences to facilitate purification of the pine re-nematode histone deacetylase. Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA), 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA), and most preferably Is 6 × His. Because of the additional sequence for this purification, the protein expressed in the host is purified quickly and easily through affinity chromatography.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼 (Novagen, USA)을 이용하여 소망하는 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소를 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the fusion protein expressed by the vector containing the fusion sequence is purified by affinity chromatography. For example, if glutathione-S-transferase is fused, glutathione, which is the substrate of this enzyme, can be used, and if 6x His is used, Ni-NTA His-binding resin column (Novagen, USA) can be used for desired pine trees. Re nematode histone deacetylase can be obtained quickly and easily.

한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.On the other hand, the expression vector of the present invention as an optional marker, and includes antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo There are genes resistant to mycin and tetracycline.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a transformant comprising the vector of the present invention described above.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.Host cells capable of stable and continuous cloning and expression of the vectors of the present invention are known in the art and can be used with any host cell, for example E. coli JM109, E. coli BL21 (DE3), E. coli RR1. , Bacillus genus strains, such as E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium, Serratia marcensons, and various Pseudomonas Enterobacteria such as species and strains.

또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.In addition, when transforming a vector of the present invention to eukaryotic cells, as host cells, yeast ( Saccharomyce cerevisiae ), insect cells and human cells (e.g., CHO cell line (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293 , HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines) and the like can be used.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol. Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic. Acids Res., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 등에 의 해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.The method of carrying a vector of the present invention into a host cell is performed by the CaCl ₂ method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA , 9: 2110-2114 (1973), when the host cell is a prokaryotic cell). ), One method (Cohen, SN et al., Proc. Natl. Acac. Sci. USA , 9: 2110-2114 (1973); and Hanahan, D., J. Mol. Biol. , 166: 557-580 (1983)) and electroporation methods (Dower, WJ et al., Nucleic. Acids Res. , 16: 6127-6145 (1988)) and the like. In addition, when the host cell is a eukaryotic cell, fine injection method (Capecchi, MR, Cell , 22: 479 (1980)), calcium phosphate precipitation method (Graham, FL et al., Virology , 52: 456 (1973)), Electroporation (Neumann, E. et al., EMBO J. , 1: 841 (1982)), liposome-mediated transfection (Wong, TK et al., Gene , 10:87 (1980)), DEAE- Dextran treatment (Gopal, Mol. Cell Biol. , 5: 1188-1190 (1985)), and gene balm (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. , 87: 9568-9572 (1990)) Can be injected into the host cell.

숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소를 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.The vector injected into the host cell can be expressed in the host cell, in which case a large amount of pine re nematode histone deacetylase is obtained. For example, when the expression vector contains a lac promoter, the host cell may be treated with IPTG to induce gene expression.

본 발명의 소나무 재선충 HDA는 다양한 용도 및 산업상 이용 가능성을 갖는다. Pine red nematode HDA of the present invention has various uses and industrial applicability.

예를 들어, 본 발명의 소나무 재선충 HDA는 (ⅰ) 소나무 재선충 HDA 타겟 항체를 개발하는데 이용될 수 있다. 소나무 재선충 HDA-특이 항체는 소나무 재선충를 방제하거나 소나무 재선충 HDA를 검출하는 데 이용될 수 있다.For example, the pine re-nematode HDA of the present invention can be used to develop (i) pine re-nematode HDA target antibodies. Pine re-nematode HDA-specific antibodies can be used to control pine re-nematodes or to detect pine re-nematode HDA.

구체적으로, 소나무 재선충 HDA 단백질에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 소나무 재선충 HDA 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 소나무 재선충 HDA 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.In particular, the antibody against the pine re-nematode HDA protein is a polyclonal or monoclonal antibody, preferably a monoclonal antibody. Antibodies against the pine re-nematode HDA protein can be prepared by methods commonly practiced in the art, such as fusion methods (Kohler and Milstein, European Journal of Immunology , 6: 511-519 (1976)), recombinant DNA methods (US patents). 4,816,56) or phage antibody library methods (Clackson et al, Nature , 352: 624-628 (1991) and Marks et al, J. Mol. Biol. , 222: 58, 1-597 (1991)). Can be prepared by General procedures for antibody preparation are described in Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques , CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; And Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY , Wiley / Greene, NY, 1991. For example, the preparation of hybridoma cells producing monoclonal antibodies is accomplished by fusing an immortalized cell line with an antibody-producing lymphocyte, and the techniques necessary for this process are well known and readily practicable by those skilled in the art. Polyclonal antibodies can be obtained by injecting pine re-nematode HDA protein antigens into suitable animals, collecting antisera from the animals, and then separating the antibodies from the antisera using known affinity techniques.

(ⅱ) 또한, 소나무 재선충 HDA를 이용하여 소나무 재선충 방제용 농약 후보물질을 스크리닝 하는 데에 이용될 수 있다. 구체적으로, (a) 소나무 재선충 HDA 유전자 또는 단백질을 포함하는 세포에 스크리닝 대상의 물질을 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 소나무 재선충 HDA 유전자의 발현량, 소나무 재선충 HDA 단백질의 양 또는 소나무 재선충 HDA 단백질의 활성을 측정하는 단계, 상기 소나무 재선충 HDA 유전자의 발현량, 소나무 재선충 HDA 단백질의 양 또는 소나무 재선충 HDA 단백질의 활성이 감소-조절(down-regulation)되는 것으로 측정되는 경우에는 상기 물질은 소나무 재선충 병 방제용 농약 후보물질로 판정된다. (Ii) It can also be used to screen pesticide candidates for pine re-nematode control using pine re-nematode HDA. Specifically, (a) contacting a substance to be screened with a cell comprising a pine re-nematode HDA gene or protein; And (b) measuring the expression level of the pine re-nematode HDA gene, the amount of pine re-nematode HDA protein or the activity of the pine re-nematode HDA protein, the expression level of the pine re-nematode HDA gene, the amount of pine re-nematode HDA protein or the pine re-nematode HDA If the activity of the protein is determined to be down-regulation, the substance is determined to be a pesticide candidate for pine re-nematode disease control.

(ⅲ) 또한 상기 스크리닝 시스템을 통하여 판정된 농약 후보물질을 이용하여 소나무 재선충 HDA 타겟 농약을 개발 할 수 있다.(Iii) It is also possible to develop pine re-nematode HDA target pesticides using the pesticide candidates determined through the screening system.

(ⅳ) 소나무 재선충 HDA의 mRNA에 특이적으로 결합하여 소나무 재선충의 성장 및 증식의 억제 또는 살충에 유용한 RNAi를 개발할 수 있다. 구체적으로, 이중-가닥 간섭 RNA(RNAi) 또는 RNA-매개 간섭(RNAi)을 이용하여 소나무 재선충 HDA 의 발현을 억제하는 물질 또는 방법에 적용될 수 있다. RNAi 분자는 소나무 재선충 HDA mRNA에 상보적인 서열을 포함하는데, 용어 “상보적”은 100% 상보적인 경우뿐만 아니라, RNA 방해 (interference) 기전을 통해 소나무 재선충 HDA 유전자의 발현을 억제할 수 있을 정도의 불완전한 상보성도 포괄하는 의미이며, 바람직하게는 90%의 상보성, 보다 바람직하게는 98%의 상보성, 가장 바람직하게는 100%의 상보성을 의미한다. RNAi 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, RNAi 분자를 코딩하는 일반적인 서열과 같이, 센스 가닥 (소나무 재선충 HDA mRNA 서열에 상응하는 (corresponding) 서열)과 안티센스 가닥 (소나무 재선충 HDA mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있다. 또한, RNAi 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 자기-상보성 (self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 한편, RNAi 분자를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은, 자기-상보성 (self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오타이드 서열 (예컨대, 약 5-15 nt)이 삽입된 형태를 가지며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 RNAi 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 RNAi 분자를 생성한다.(Iii) It can specifically bind to the mRNA of pine re-nematodes HDA to develop RNAi useful for inhibiting or killing the growth and proliferation of pine re-nematodes. Specifically, it can be applied to a material or a method for inhibiting the expression of pine re-nematode HDA using double-stranded interfering RNA (RNAi) or RNA-mediated interference (RNAi). RNAi molecules contain sequences complementary to pine re-nematode HDA mRNA, the term “complementary” being 100% complementary, as well as sufficient to inhibit the expression of the pine re-nematode HDA gene through RNA interference mechanisms. Incomplete complementarity is also meant to encompass, preferably 90% complementarity, more preferably 98% complementarity, and most preferably 100% complementarity. The nucleotide sequence encoding the RNAi molecule, like the normal sequence encoding the RNAi molecule, has a sense strand (corresponding sequence corresponding to the pine re-nematode HDA mRNA sequence) and an antisense strand (complementary to the pine re-nematode HDA mRNA sequence). Located opposite to each other may have a structure forming a double chain. In addition, the nucleotide sequence encoding the RNAi molecule may have a single chain structure with self-complementary sense and antisense strands. On the other hand, the nucleotide sequence encoding the RNAi molecule has a form in which a short nucleotide sequence (eg, about 5-15 nt) is inserted between a self-complementary sense and an antisense strand, in which case the expression of the nucleotide sequence The RNAi molecule formed by is formed into a hairpin structure by intramolecular hybridization, and forms a stem-and-loop structure as a whole. This stem-and-loop structure is processed in vitro or in vivo to produce an active RNAi molecule capable of mediating RNAi.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone Deactylase, HDA) 및 이를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명은 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone Deactylase, HDA) 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명의 서열은 모델동물인 예쁜 꼬마선충의 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 서열에 기초한 이와 상동성이 높은 서열이며, 본 발명의 히스톤 탈아세틸화 효소의 유전자 발현을 억제함으로써, 소나무 재선충의 성장과 생식을 억제하여 소나무 재선충병 방제에 이용될 수 있다.As described in detail above, the present invention provides a Bursaphelenchus xylophilus histone deacetylase (HDA) and a nucleic acid molecule encoding the same. The present invention relates to Bursaphelenchus xylophilus Histone Deactylase (HDA) and nucleic acid molecules encoding the same. The sequence of the present invention is a sequence highly homologous to the sequence based on the sequence of the first histone deacetylase of a beautiful little nematode, which is a model animal, and grows pine re-nematodes by inhibiting the gene expression of the histone deacetylase of the present invention. It can be used to control pine nematode disease by inhibiting overgrowing.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예Example

1. 실험 재료1. Experimental Materials

3’-RACE 는 씨젠(대한민국, 서울)의 Capfishing^TM Kit 을 구입하여 제조사의 프로토콜에 따라 실시하였다. PCR 반응은 BIO-RAD(미국, 캘리포니아)의 DNAEngine을 이용하여 수행하였다. TA 클로닝은 RBC 클로닝 시스템(대만, 타이페 이 카운티)의 T&A 클로닝 키트를 이용하여 실시하였다. DNA 시퀀싱은 제노텍(대한민국, 대전)에 의뢰하였다. 대장균 발현 벡터 pET-28a와 발현 대장균 BL21(DE3)는 Novagen(독일, Darmstadt)에서 구입하였고, IPTG(isopropyl b-D-thiogalactopyranoside)와 앰피실린은 DUCHEFA(네덜란드, Haarlem)에서 구입하였다. 니켈 레진은 Qiagen(미국, 캘리포니아)의 Ni-NTA Agarose를 이용하였다. 3'-RACE was purchased according to manufacturer's protocol by purchasing Capzening ^TM Kit of Seegene (Seoul, Korea). PCR reactions were performed using DNAEngine of BIO-RAD (California, USA). TA cloning was performed using a T & A cloning kit from RBC Cloning System (Taipei County, Taiwan). DNA sequencing was commissioned by Genotech (Korea, Daejeon). E. coli expression vectors pET-28a and E. coli BL21 (DE3) were purchased from Novagen (Darmstadt, Germany), and IPTG (isopropyl bD-thiogalactopyranoside) and ampicillin were purchased from DUCHEFA (Haarlem, Netherlands). Nickel resin was used Ni-NTA Agarose of Qiagen (California, USA).

2. 소나무 재선충의 히스톤 탈아세틸화 효소의 규명2. Identification of histone deacetylase in pine re-nematodes

단계 1: 근계통적 상동성 검색Step 1: Search for systemic homology

소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 서열을 규명하기 위하여, 소나무 재선충과 계통적으로 가까운 예쁜 꼬마 선충의 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 단백질 아미노산 서열을 이용하였다. 미 국립생물정보센터(NCBI)가 제공하는 검색 프로그램인 NCBI tblastn(단백질 쿼리를 이용하여 번역된 뉴클레오티드 데이터베이스 검색)을 이용하여 아미노산 서열로 번역된 소나무 재선충 EST 데이타베이스 서열 중에서 예쁜 꼬마 선충의 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 단백질 아미노산 서열(표 1)과 가장 상동성이 높은 서열 2가지를 선택하였다. 그 클론 번호는 Bx_K1_82C06 5'와 Bx_K1_04D07 5'이며 그 상동성은 각각 87% 및 96% 이다(참조: 도 1a-b).In order to identify the sequence of pine re nematode histone deacetylase, the protein amino acid sequence of the first histone deacetylase of the pretty little nematode systematically close to pine re nematode was used. Pretty little nematode's first histone among pine re-nematode EST database sequences translated into amino acid sequence using NCBI tblastn (search for translated nucleotide database using protein query), a search program provided by the National Institute of Biological Information (NCBI) Two sequences with the highest homology with the protein amino acid sequence of the deacetylation enzyme (Table 1) were selected. The clone numbers are Bx_K1_82C06 5 'and Bx_K1_04D07 5' and their homology is 87% and 96%, respectively (see FIGS. 1A-B).

도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 두 가지 클론 모두는 예쁜 꼬마 선충의 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 단백질 아미노산 서열의 아미노 말단 부위 서열과 상동성이 높은 특징을 가지고 있었다. 따라서 두 가지 클론 모두가 소나무 재선 충 히스톤 탈아세틸화 효소의 아미노 말단 부위 서열일 것이라 예측하였다. 그 중에서 두 번째 클론인 Bx_K1_04D07 5'은 예쁜 꼬마 선충의 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 단백질 아미노 말단에 근접한 서열부터 상동성이 높아서 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 아미노 말단의 서열을 알아내기에 용이할 것이라 판단하여 이 클론을 가지고 실험을 진행하였다. 또한 이 클론은 예쁜 꼬마 선충의 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 단백질과의 상동성이 첫 번째 클론보다 높기 때문에 선택하기에 더 적합하였다.As can be seen in Figure 1, both clones were characterized by high homology with the amino terminal region sequence of the protein amino acid sequence of the first histone deacetylase of the pretty little nematode. Therefore, it was predicted that both clones would be the amino terminal region sequence of the pine re-neutral histone deacetylase. Among them, the second clone, Bx_K1_04D07 5 ', has high homology from the sequence close to the protein amino terminus of the first histone deacetylase of the beautiful nematode, so it is easy to determine the amino terminal sequence of the pine re-nematode histone deacetylase. We decided to do this experiment with this clone. This clone was also more suitable for selection because the homology of the pretty histium nematode with the protein of the first histone deacetylase was higher than that of the first clone.

예쁜 꼬마 선충 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 단백질 아미노산 서열(461아미노산)Protein amino acid sequence (461 amino acids) of pretty little nematode first histone deacetylase MNSNGPLMEHGKRRVAYYYDSNIGNYYYGQGHVMKPHRIRMTHHLVLNYGLYRNLEIFRPFPASFEDMTRFHSDEYMTFLKSANPDNLKSFNKQMLKFNVGEDCPLFDGLYEFCQLSSGGSLAAATKLNKQKVDIAINWMGGLHHAKKSEASGFCYTNDIVLGILELLKYHKRVLYVDIDVHHGDGVEEAFYTTDRVMTVSFHKYGDFFPGTGDLKDIGAGKGKLYSVNVPLRDGITDVSYQSIFKPIMTKVMERFDPCAVVLQCGADSLNGDRLGPFNLTLKGHGECARFFRSYNVPLMMVGGGGYTPRNVARCWTYETSIAVDKEVPNELPYNDYFEYFGPNYRLHIESSNAANENSSDMLAKLQTDVIANLEQLTFVPSVQMRPIPEDALSALNDDSLIADQANPDKRLPPQITDGMIQDDGDFYDGEREGDDRRNESDAKRAAQFESEGGEKRQKTE MNSNGPLMEHGKRRVAYYYDSNIGNYYYGQGHVMKPHRIRMTHHLVLNYGLYRNLEIFRPFPASFEDMTRFHSDEYMTFLKSANPDNLKSFNKQMLKFNVGEDCPLFDGLYEFCQLSSGGSLAAATKLNKQKVDIAINWMGGLHHAKKSEASGFCYTNDIVLGILELLKYHKRVLYVDIDVHHGDGVEEAFYTTDRVMTVSFHKYGDFFPGTGDLKDIGAGKGKLYSVNVPLRDGITDVSYQSIFKPIMTKVMERFDPCAVVLQCGADSLNGDRLGPFNLTLKGHGECARFFRSYNVPLMMVGGGGYTPRNVARCWTYETSIAVDKEVPNELPYNDYFEYFGPNYRLHIESSNAANENSSDMLAKLQTDVIANLEQLTFVPSVQMRPIPEDALSALNDDSLIADQANPDKRLPPQITDGMIQDDGDFYDGEREGDDRRNESDAKRAAQFESEGGEKRQKTE

단계 2: 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 일부 서열 동정 Step 2: Identification of Some Sequences of Pine Re-nematode Histone Deacetylase

도 1에서 볼 수 있는 것처럼, 예쁜 꼬마 선충 제 1 히스톤 탈아세틸화 효소의 9번 아미노산인 글루탐산이 Bx_K1_04D07 5' 클론의 27-29번 뉴클레오티드에서 번역된 아미노산인 아스파르트산에 해당하기 때문에, 그 앞부분의 DNA 염기 서열을 알기 위하여 Bx_K1_04D07 5' 클론의 1번부터 26번에 해당하는 뉴클레오티드를 아미노산 서열로 번역하였다.As can be seen in Figure 1, since glutamic acid, the amino acid number 9 of the cute little nematode first histone deacetylase, corresponds to the aspartic acid amino acid translated from nucleotides 27-29 of the Bx_K1_04D07 5 'clone, In order to know the DNA base sequence, nucleotides corresponding to Nos. 1 to 26 of the Bx_K1_04D07 5 'clone were translated into amino acid sequences.

번역된 아미노산 서열은 “TFPKMTVT” 이었고 5번째 아미노산이 단백질 개시코돈일 가능성이 있는 메티오닌임을 확인하였다. 이 가정을 확인하기 위하여 검색된 아미노산 156개와 위의 MTVT를 포함한 160개의 아미노산을 가지고 다시 단백질 검색 프로그램인 NCBI blastp를 사용하여 전체 단백질 아미노산 서열에 대하여 검색하였다. 그 결과 인간(Homo sapiens), 생쥐(Mus musculus), 집쥐(rattus norvegicus), 개(canis familiaris), 소(bos taurus), 침팬지(pan troglodytes), 닭(gallus gallus) 및 개구리(xenopus laevis) 유래의 20개 이상의 히스톤 탈아세틸화 효소가 얻어낸 서열과 1번부터 함께 시작한 것을 확인하였다. 또한 검색한 서열은 히스톤 탈아세틸화 효소의 활성부위를 포함하고 있었다. 이로써 소나무 재선충의 히스톤 탈아세틸화 효소의 아미노 말단 부위 160개의 아미노산 서열을 얻을 수 있었고 이로부터 다시 480개의 DNA 염기 서열도 얻어내었다(참조: 도 2a-b).The translated amino acid sequence was “TFPKMTVT” and it was confirmed that the fifth amino acid was methionine, possibly a protein initiation codon. In order to confirm this assumption, the entire protein amino acid sequence was searched using NCBI blastp, a protein search program, with 156 amino acids searched and 160 amino acids including MTVT. The result is human (Homo sapiens), mouse (Mus musculus), rat (rattus norvegicus), dog (canis familiaris), bos (bos taurus), chimpanzee (pan troglodytes), chicken (gallus gallus) and frog (xenopus laevis). It was confirmed that 20 or more histone deacetylases started with the sequence obtained. The searched sequence contained an active site of histone deacetylase. This yielded 160 amino acid sequences of histone deacetylase of the pine re-nematode enzyme, and again 480 DNA sequences (see FIGS. 2A-B).

단계 3: 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 전체 서열 동정Step 3: Identification of the Whole Sequence of Pine Red Nematode Histone Deacetylase

소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 전체 서열을 얻어내기 위하여 위에서 얻어진 480개의 DNA서열을 가지고 3’-RACE 법((주)씨젠)을 실시하였다. 우선, 소나무 재선충의 총 RNA를 인비트로젠에서 제공한 Trizol방법을 이용하여 얻었다. 이어, (주)씨젠의 3’-RACE 키트를 이용하여 어댑터 서열이 붙어있는 올리고 dT 프라이머를 소나무 재선충의 mRNA의 폴리(A)테일에 결합시키고 인 비트로(in vitro) 역전사를 실시하였다. 이렇게 얻어진 어댑터 도입 cDNA에서 480개의 DNA 염기 서열의 맨 앞을 인식하는 프라이머와 어댑터 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 그 결과 약 1,800 bp 부근에서 단백질 코딩서열과 3’비암호화 염기서열 (3’-UTR)을 포함하는 뚜렷한 DNA 밴드를 얻을 수 있었다(참조: 도 3).The 3'-RACE method (Cigen) was performed with the 480 DNA sequences obtained above to obtain the entire sequence of pine re-nematode histone deacetylase. First, total RNA of pine re-nematodes was obtained using Trizol method provided by Invitrogen. Next, Ltd. Seegene the poly (A) tail and the binding in vitro (in vitro) reverse transcription of the mRNA of the Bursaphelenchus xylophilus the oligo dT primer with an adapter sequence attached using a 3'-RACE kit was performed on. The adapter-introduced cDNA was amplified by PCR using a primer and an adapter primer that recognize the beginning of 480 DNA sequences. As a result, a clear DNA band including a protein coding sequence and a 3 'uncoding sequence (3'-UTR) was obtained at about 1,800 bp (see FIG. 3).

이 서열을 결정하기 위하여 이 밴드를 TA 클로닝 벡터에 재조합한 뒤 서열을 분석한 결과 1,726 개의 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있었고 이로부터 다시 1,410 개의 단백질 코딩 DNA 염기서열과 469개의 아미노산 서열도 결정하였다(참조: 서열목록 제 2 서열 및 제 1 서열).To determine this sequence, the band was recombined into a TA cloning vector and sequenced to obtain 1,726 nucleotide sequences, from which 1,410 protein-coding DNA sequences and 469 amino acid sequences were determined. SEQ ID NO: 2nd sequence and 1st sequence).

단계 4: 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소 정제Step 4: Purification of Pine Red Nematode Histone Deacetylase

이 단백질을 발현시키기 위하여 단백질 코딩 DNA 염기서열만을 PCR로 증폭한 뒤 이것을 6 개의 히스티딘이 삽입된 pET-28a 플라스미드에 재조합하여 BL21(DE3) 대장균에 형질전환하였다. 단백질 발현은 O.D(광학밀도) 값 0.6에서 1 mM IPTG의 농도로 37℃에서 4시간동안 유도하였다. 그 후 대장균을 파쇄하고 용해된 단백질만을 원심분리기로 수득한 다음 니켈 레진에서 2시간 반응하였다. 단백질의 정제는 이미다졸 농도의 변화 차이로 수행하였으며 250 mM 농도에서 용리하였다. 이를 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분석한 결과 약 50 kDa에서 뚜렷한 단백질 밴드를 확인하였다(참조: 도 4).In order to express the protein, only the protein-coding DNA sequence was amplified by PCR, and it was recombined into 6 histidine-inserted pET-28a plasmids to transform BL21 (DE3) Escherichia coli. Protein expression was induced at 37 ° C. for 4 hours at a concentration of 1 mM IPTG at an O.D (optical density) value of 0.6. Thereafter, E. coli was crushed and only the dissolved protein was obtained by centrifugation, followed by reaction for 2 hours in nickel resin. Purification of the protein was performed with varying changes in imidazole concentration and eluted at 250 mM concentration. This was analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and found a distinct protein band at about 50 kDa (see FIG. 4).

단계 5 : 클로닝한 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소 검증Step 5: Validated Cloned Pine Re-nematode Histone Deacetylase

발현된 단백질과 3'-RACE를 통해 발견해낸 재선충 히스톤 탈아세틸화효소의 서열을 검증하기 위해서 LC-MS 질량분석 방법을 이용하여 단백질 서열을 비교분석하였다. 분석장비는 LTQ (Thermo Finnigan사)이고 클로닝한 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 단백질 서열을 데이터베이스에서 질량분석 결과를 검색한 결과, 일치한 서열의 범위가 87%로 매우 높게 나왔으며, 신뢰도를 평가하는 스코어 값도 매우 높게 측정되었다. 각 단백질서열 쿼리에 스코어가 37이상이면 상동성이 있는 서열이고 40이상이면 분석하는 쿼리와 일치하는 서열이라고 보면 된다. 통상 스코어 37이상의 서열이 펩티드서열에 2개 이상 맞으면 단백질 동정이 잘 되었다고 볼 수 있다(참조 : 도면 5a-b).Protein sequences were analyzed using LC-MS mass spectrometry to verify the sequence of the expressed protein and the re-nematode histone deacetylase found through 3'-RACE. The analysis equipment was LTQ (Thermo Finnigan), and the protein sequence of the cloned re-neutral histone deacetylase was searched in the database, and the range of the matched sequence was very high (87%). Score values were also measured very high. If the protein sequence query has a score of 37 or more, the sequence is homologous, and if it is 40 or more, the sequence matches the query to be analyzed. In general, when a sequence of score 37 or more is matched to two or more peptide sequences, it can be seen that protein identification is good (see FIGS. 5A-B).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

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도 1a는 예쁜 꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 제1 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone Deactylase) 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.1A shows the amino acid sequence of the first Histone Deactylase protein of pretty Caenorhabditis elegans .

도 1b는 도 1a에 나타낸 단백질 아미노산 서열로부터 검색된 소나무 재선충 EST tag 서열 후보군을 나타낸다. 클론 번호는 Bx_K1_82C06 5'와 Bx_K1_04D07 5'이며 그 상동성은 각각 87% 및 96% 이다.FIG. 1B shows a pine re-nematode EST tag sequence candidate group searched from the protein amino acid sequence shown in FIG. 1A. The clone numbers are Bx_K1_82C06 5 'and Bx_K1_04D07 5' and their homology is 87% and 96%, respectively.

도 2a는 Bx_K1_04D07 5' 클론으로부터 소나무 재선충 탈아세틸화 효소의 아미노 말단서열을 유추하는 과정을 보여준다.Figure 2a shows the process of inducing the amino terminal sequence of the pine re-nematode deacetylase from the Bx_K1_04D07 5 'clone.

도 2b는 번역된 아미노산 서열로부터 단백질 검색 프로그램인 NCBI blastp를 이용하여 검색된 소나무 재선충의 히스톤 탈아세틸화 효소의 아미노 말단 부위의 아미노산 서열 및 DNA 염기 서열을 나타낸다.Figure 2b shows the amino acid sequence and the DNA nucleotide sequence of the amino terminal region of histone deacetylase of pine re nematode retrieved from the translated amino acid sequence using NCBI blastp, a protein search program.

도 3은 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 전체 서열을 얻어내기 위하여 도 2b에서 얻어진 DNA서열을 가지고 3’-RACE 법을 실시한 결과를 보여주는 겔 사진이다. 약 1,800 bp 부근에서 단백질 코딩서열과 3’비암호화 염기서열 (3’-UTR)을 포함하는 뚜렷한 DNA 밴드를 얻을 수 있었다.Figure 3 is a gel photograph showing the results of the 3'-RACE method with the DNA sequence obtained in Figure 2b to obtain the entire sequence of pine re-nematode histone deacetylase. At around 1,800 bp, a clear DNA band was obtained, including the protein coding sequence and the 3 ′ unencoded sequence (3′-UTR).

도 4는 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(PAGE)으로 분석한 결과를 보여주는 겔 사진이다. 약 50 kDa에서 뚜렷한 단백질 밴드를 확인하였다. 1은 대장균 전체 파쇄액, 2는 용해된 단백질층, 3은 레인 미부착 단백질, 4 와 5는 불특정 레진 부착 단백질, 및 6 과 7은 용리된 소나무 재선충의 히스톤 탈아세틸화 효소 단백질을 나타낸다.Figure 4 is a gel photograph showing the results of analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) of pine re-nematode histone deacetylase. A distinct protein band was identified at about 50 kDa. 1 represents E. coli total lysate, 2 represents a dissolved protein layer, 3 represents a non-lane protein, 4 and 5 an unspecified resin attached protein, and 6 and 7 represents an histone deacetylase enzyme protein of an eluted pine re-nematode.

도 5a-5b는 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소의 질량분석 결과를 나타낸다. 클로닝한 대장균 파쇄액에서 전기영동으로 확인된 밴드의 절편을 이용한 것으로, 트립신을 이용하여 이 단백질을 절편으로 자른 후 펩티드 서열을 분석하여 전체 쿼리 단백질 서열과 비교한 결과 스코어가 매우 높게 나타났고 일치 단백질 서열 범위가 87%로 높게 나타났다(보통 겔상의 절편을 질량분석할 때 60퍼센트 이상의 일치단백질 서열 범위가 나타나면 단백질 검증 실험을 신뢰할 수 있다). 도면 5a의 적색 사각형 부분은 각각 쿼리 단백질, 분자량, 등전점 및 일치 단백질 서열 범위를 나타내고, 도면 5b의 적색 사각형 부분은 펩티드들의 스코어를 나타낸다.5A-5B show the results of mass spectrometry of pine re-nematode histone deacetylase. A fragment of the band identified by electrophoresis in the cloned Escherichia coli lysate was used. The protein was cut into fragments using trypsin, and the peptide sequence was analyzed and compared with the entire query protein sequence. The sequence range was as high as 87% (typically, if mass spectrometry of gel sections revealed more than 60 percent of the consensus protein sequence range, protein validation experiments were reliable). The red square portions in FIG. 5A represent the query protein, molecular weight, isoelectric point and coincident protein sequence ranges, respectively, and the red square portions in FIG. 5B represent the scores of the peptides.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Histone Deacetylase of Bursaphelenchus xylophilus <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1726 <212> DNA <213> Bursaphelenchus xylophilus <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <400> 1 atg act gta acg gac cat tcg aaa cgt cga gtt tcc tat tac tat gat 48 Met Thr Val Thr Asp His Ser Lys Arg Arg Val Ser Tyr Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 cct aac att gga aat tat tat tat ggc caa ggt cac gtg atg aag cct 96 Pro Asn Ile Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Val Met Lys Pro 20 25 30 cat cgt atc cgg atg tgt cat cac ctt ctt cta aat tac ggt ctc tac 144 His Arg Ile Arg Met Cys His His Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr 35 40 45 cgt cat ctt gag gtt tat cgt ccg ttt cca gcc agt ttc gag gag atg 192 Arg His Leu Glu Val Tyr Arg Pro Phe Pro Ala Ser Phe Glu Glu Met 50 55 60 acc cgc ttc cat act aac gat tat atg caa ttc cta cag tcc gct aac 240 Thr Arg Phe His Thr Asn Asp Tyr Met Gln Phe Leu Gln Ser Ala Asn 65 70 75 80 cct gat aat ttg agg gca ttc agc aag cag atg ctc aag ttc aat gtt 288 Pro Asp Asn Leu Arg Ala Phe Ser Lys Gln Met Leu Lys Phe Asn Val 85 90 95 gga gaa gat tgt ccc gtt ttc gat gga ttg tat gaa ttc tgc caa ctc 336 Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Glu Phe Cys Gln Leu 100 105 110 tcc agt gga gga tca cta gct gct gcg gta aaa ttg aac aaa caa aag 384 Ser Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln Lys 115 120 125 gct gat att gct gta aac tgg atg ggt gga tta cat cac gcc aag aag 432 Ala Asp Ile Ala Val Asn Trp Met Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys 130 135 140 gct gag gct tct gga ttc tgc tac aca aac gat att gtt ttg ggt att 480 Ala Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Thr Asn Asp Ile Val Leu Gly Ile 145 150 155 160 ttg gaa ctg ctg aaa tat cat caa aga gtg ttg tat gtg gac att gat 528 Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg Val Leu Tyr Val Asp Ile Asp 165 170 175 gtt cat cac gga gat gga gtc gaa gaa gct ttt tat acc act gat cgt 576 Val His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg 180 185 190 gtt atg acc gtc tcc ttc cat 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gct aga tgt tgg acg tac gag act tcg att gct gtg 960 Pro Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Ile Ala Val 305 310 315 320 gat atg caa atc aat gat gaa tta ccc tat aat gat tat ttc gaa tac 1008 Asp Met Gln Ile Asn Asp Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr 325 330 335 ttc gga cct aac tac cgc ctt cat att gag cca tcg cag gca gcc gat 1056 Phe Gly Pro Asn Tyr Arg Leu His Ile Glu Pro Ser Gln Ala Ala Asp 340 345 350 gag aat gat caa gtt tac ctt cag aaa atc cag gag gcc gtc tgt gag 1104 Glu Asn Asp Gln Val Tyr Leu Gln Lys Ile Gln Glu Ala Val Cys Glu 355 360 365 aat ctg aga aaa ttg cag gga cct tcg agt gtc caa atg cat gcg gtg 1152 Asn Leu Arg Lys Leu Gln Gly Pro Ser Ser Val Gln Met His Ala Val 370 375 380 gaa aaa gac ata atg gag att gat gag acc agg ctg atc gac gcc gcc 1200 Glu Lys Asp Ile Met Glu Ile Asp Glu Thr Arg Leu Ile Asp Ala Ala 385 390 395 400 aat cca gac gaa cgt ctc cct gat ccg att gta gac aag atg gtg gaa 1248 Asn Pro Asp Glu Arg Leu Pro Asp Pro Ile Val Asp Lys Met Val Glu 405 410 415 gat gcc gga gag ttg tat gat aac gaa aag gaa gga ggt gat ctg aga 1296 Asp Ala Gly Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Lys Glu Gly Gly Asp Leu Arg 420 425 430 aac gaa caa tct cac aaa agg cca cat gaa gaa gga gat tcc cct gtc 1344 Asn Glu Gln Ser His Lys Arg Pro His Glu Glu Gly Asp Ser Pro Val 435 440 445 tcc aag aaa ccg cga gac gaa ggg ggc gag cct ccg gcc gag cca gct 1392 Ser Lys Lys Pro Arg Asp Glu Gly Gly Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ala 450 455 460 gag ccc acg gaa agc taa agaaatctat ggacatacga ttgagtctga 1440 Glu Pro Thr Glu Ser 465 gcattggaca ataaacaccg ccctccactt caattgagta gtcctcgatc tccgttatct 1500 ataatattta tttcttaatc ctccctcact cgctcccttt actctcccca tcaattttat 1560 accactttca tacagtcgat tacaagttta aagcagtttg aatacccacc ctccctcctt 1620 ttccctccgg cgttaaaacc ggatcgtagt cacttccagt tattttattt cctcttcgta 1680 tattgtttta tcttttctgg aggaaaataa aggtgacagt aatatc 1726 <210> 2 <211> 469 <212> PRT <213> Bursaphelenchus xylophilus <400> 2 Met Thr Val Thr Asp His Ser Lys Arg Arg Val Ser Tyr Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 Pro Asn Ile Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Val Met Lys Pro 20 25 30 His Arg Ile Arg Met Cys His His Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr 35 40 45 Arg His Leu Glu Val Tyr Arg Pro Phe Pro Ala Ser Phe Glu Glu Met 50 55 60 Thr Arg Phe His Thr Asn Asp Tyr Met Gln Phe Leu Gln Ser Ala Asn 65 70 75 80 Pro Asp Asn Leu Arg Ala Phe Ser Lys Gln Met Leu Lys Phe Asn Val 85 90 95 Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Glu Phe Cys Gln Leu 100 105 110 Ser Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln Lys 115 120 125 Ala Asp Ile Ala Val Asn Trp Met Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys 130 135 140 Ala Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Thr Asn Asp Ile Val Leu Gly Ile 145 150 155 160 Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg Val Leu Tyr Val Asp Ile Asp 165 170 175 Val His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Asp Phe Phe Pro Gly Thr 195 200 205 Gly Asp Ile His Asp Ile Gly Ala Gly Lys Gly Arg Asn Tyr Ser Val 210 215 220 Asn Val Pro Leu Arg Asp Gly Ile Ser Asp Asn Asn Tyr Gln Ser Ile 225 230 235 240 Phe Lys Pro Val Met Thr Lys Val Met Glu Thr Phe Asn Pro Asn Ala 245 250 255 Val Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Asn Gly Asp Arg Leu Gly 260 265 270 Pro Phe Asn Leu Thr Leu Lys Gly His Gly Glu Cys Val Lys Phe Phe 275 280 285 Arg Asp Tyr Asn Val Pro Leu Met Leu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr 290 295 300 Pro Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Ile Ala Val 305 310 315 320 Asp Met Gln Ile Asn Asp Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr 325 330 335 Phe Gly Pro Asn Tyr Arg Leu His Ile Glu Pro Ser Gln Ala Ala Asp 340 345 350 Glu Asn Asp Gln Val Tyr Leu Gln Lys Ile Gln Glu Ala Val Cys Glu 355 360 365 Asn Leu Arg Lys Leu Gln Gly Pro Ser Ser Val Gln Met His Ala Val 370 375 380 Glu Lys Asp Ile Met Glu Ile Asp Glu Thr Arg Leu Ile Asp Ala Ala 385 390 395 400 Asn Pro Asp Glu Arg Leu Pro Asp Pro Ile Val Asp Lys Met Val Glu 405 410 415 Asp Ala Gly Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Lys Glu Gly Gly Asp Leu Arg 420 425 430 Asn Glu Gln Ser His Lys Arg Pro His Glu Glu Gly Asp Ser Pro Val 435 440 445 Ser Lys Lys Pro Arg Asp Glu Gly Gly Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ala 450 455 460 Glu Pro Thr Glu Ser 465 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Histone Deacetylase of Bursaphelenchus xylophilus <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1726 <212> DNA <213> Bursaphelenchus xylophilus <220> <221> CDS (222) (1) .. (1407) <400> 1 atg act gta acg gac cat tcg aaa cgt cga gtt tcc tat tac tat gat 48 Met Thr Val Thr Asp His Ser Lys Arg Arg Val Ser Tyr Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 cct aac att gga aat tat tat tat ggc caa ggt cac gtg atg aag cct 96 Pro Asn Ile Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Val Met Lys Pro 20 25 30 cat cgt atc cgg atg tgt cat cac ctt ctt cta aat tac ggt ctc tac 144 His Arg Ile Arg Met Cys His His Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr 35 40 45 cgt cat ctt gag gtt tat cgt ccg ttt cca gcc agt ttc gag gag atg 192 Arg His Leu Glu Val Tyr Arg Pro Phe Pro Ala Ser Phe Glu Glu Met 50 55 60 acc cgc ttc cat act aac gat tat atg caa ttc cta cag tcc gct aac 240 Thr Arg Phe His Thr Asn Asp Tyr Met Gln Phe Leu Gln Ser Ala Asn 65 70 75 80 cct gat aat ttg agg gca ttc agc aag cag atg ctc aag ttc aat gtt 288 Pro Asp Asn Leu Arg Ala Phe Ser Lys Gln Met Leu Lys Phe Asn Val 85 90 95 gga gaa gat tgt ccc gtt ttc gat gga ttg tat gaa ttc tgc caa ctc 336 Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Glu Phe Cys Gln Leu 100 105 110 tcc agt gga gga tca cta gct gct gcg gta aaa ttg aac aaa caa aag 384 Ser Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln Lys 115 120 125 gct gat att gct gta aac tgg atg ggt gga tta cat cac gcc aag aag 432 Ala Asp Ile Ala Val Asn Trp Met Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys 130 135 140 gct gag gct tct gga ttc tgc tac aca aac gat att gtt ttg ggt att 480 Ala Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Thr Asn Asp Ile Val Leu Gly Ile 145 150 155 160 ttg gaa ctg ctg aaa tat cat caa aga gtg ttg tat gtg gac att gat 528 Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg Val Leu Tyr Val Asp Ile Asp 165 170 175 gtt cat cac gga gat gga gtc gaa gaa gct ttt tat acc act gat cgt 576 Val His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg 180 185 190 gtt atg acc gtc tcc ttc cat aag tat gga gac ttc ttc ccg gga act 624 Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Asp Phe Phe Pro Gly Thr 195 200 205 gga gat atc cat gac atc gga gct ggc aag gga cgt aac tac tct gtg 672 Gly Asp Ile His Asp Ile Gly Ala Gly Lys Gly Arg Asn Tyr Ser Val 210 215 220 aat gtg ccg ttg cgc gat gga atc agc gac aat aac tac caa agc atc 720 Asn Val Pro Leu Arg Asp Gly Ile Ser Asp Asn Asn Tyr Gln Ser Ile 225 230 235 240 ttc aag cca gtg atg acc aag gtt atg gag acc ttc aat cca aac gcc 768 Phe Lys Pro Val Met Thr Lys Val Met Glu Thr Phe Asn Pro Asn Ala 245 250 255 gta gtc ctc caa tgt gga gct gac tct tta aac ggc gat cga ttg gga 816 Val Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Asn Gly Asp Arg Leu Gly 260 265 270 cca ttc aat ctg acc ttg aag ggc cat ggg gaa tgt gtt aag ttc ttc 864 Pro Phe Asn Leu Thr Leu Lys Gly His Gly Glu Cys Val Lys Phe Phe 275 280 285 agg gat tac aat gtt cct ttg atg ctg tta ggt gga ggt gga tat act 912 Arg Asp Tyr Asn Val Pro Leu Met Leu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr 290 295 300 cca aga aat gta gct aga tgt tgg acg tac gag act tcg att gct gtg 960 Pro Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Ile Ala Val 305 310 315 320 gat atg caa atc aat gat gaa tta ccc tat aat gat tat ttc gaa tac 1008 Asp Met Gln Ile Asn Asp Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr 325 330 335 ttc gga cct aac tac cgc ctt cat att gag cca tcg cag gca gcc gat 1056 Phe Gly Pro Asn Tyr Arg Leu His Ile Glu Pro Ser Gln Ala Ala Asp 340 345 350 gag aat gat caa gtt tac ctt cag aaa atc cag gag gcc gtc tgt gag 1104 Glu Asn Asp Gln Val Tyr Leu Gln Lys Ile Gln Glu Ala Val Cys Glu 355 360 365 aat ctg aga aaa ttg cag gga cct tcg agt gtc caa atg cat gcg gtg 1152 Asn Leu Arg Lys Leu Gln Gly Pro Ser Ser Val Gln Met His Ala Val 370 375 380 gaa aaa gac ata atg gag att gat gag acc agg ctg atc gac gcc gcc 1200 Glu Lys Asp Ile Met Glu Ile Asp Glu Thr Arg Leu Ile Asp Ala Ala 385 390 395 400 aat cca gac gaa cgt ctc cct gat ccg att gta gac aag atg gtg gaa 1248 Asn Pro Asp Glu Arg Leu Pro Asp Pro Ile Val Asp Lys Met Val Glu 405 410 415 gat gcc gga gag ttg tat gat aac gaa aag gaa gga ggt gat ctg aga 1296 Asp Ala Gly Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Lys Glu Gly Gly Asp Leu Arg 420 425 430 aac gaa caa tct cac aaa agg cca cat gaa gaa gga gat tcc cct gtc 1344 Asn Glu Gln Ser His Lys Arg Pro His Glu Glu Gly Asp Ser Pro Val 435 440 445 tcc aag aaa ccg cga gac gaa ggg ggc gag cct ccg gcc gag cca gct 1392 Ser Lys Lys Pro Arg Asp Glu Gly Gly Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ala 450 455 460 gag ccc acg gaa agc taa agaaatctat ggacatacga ttgagtctga 1440 Glu Pro Thr Glu Ser 465 gcattggaca ataaacaccg ccctccactt caattgagta gtcctcgatc tccgttatct 1500 ataatattta tttcttaatc ctccctcact cgctcccttt actctcccca tcaattttat 1560 accactttca tacagtcgat tacaagttta aagcagtttg aatacccacc ctccctcctt 1620 ttccctccgg cgttaaaacc ggatcgtagt cacttccagt tattttattt cctcttcgta 1680 tattgtttta tcttttctgg aggaaaataa aggtgacagt aatatc 1726 <210> 2 <211> 469 <212> PRT <213> Bursaphelenchus xylophilus <400> 2 Met Thr Val Thr Asp His Ser Lys Arg Arg Val Ser Tyr Tyr Tyr Asp 1 5 10 15 Pro Asn Ile Gly Asn Tyr Tyr Tyr Gly Gln Gly His Val Met Lys Pro 20 25 30 His Arg Ile Arg Met Cys His His Leu Leu Leu Asn Tyr Gly Leu Tyr 35 40 45 Arg His Leu Glu Val Tyr Arg Pro Phe Pro Ala Ser Phe Glu Glu Met 50 55 60 Thr Arg Phe His Thr Asn Asp Tyr Met Gln Phe Leu Gln Ser Ala Asn 65 70 75 80 Pro Asp Asn Leu Arg Ala Phe Ser Lys Gln Met Leu Lys Phe Asn Val 85 90 95 Gly Glu Asp Cys Pro Val Phe Asp Gly Leu Tyr Glu Phe Cys Gln Leu 100 105 110 Ser Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ala Ala Val Lys Leu Asn Lys Gln Lys 115 120 125 Ala Asp Ile Ala Val Asn Trp Met Gly Gly Leu His His Ala Lys Lys 130 135 140 Ala Glu Ala Ser Gly Phe Cys Tyr Thr Asn Asp Ile Val Leu Gly Ile 145 150 155 160 Leu Glu Leu Leu Lys Tyr His Gln Arg Val Leu Tyr Val Asp Ile Asp 165 170 175 Val His His Gly Asp Gly Val Glu Glu Ala Phe Tyr Thr Thr Asp Arg 180 185 190 Val Met Thr Val Ser Phe His Lys Tyr Gly Asp Phe Phe Pro Gly Thr 195 200 205 Gly Asp Ile His Asp Ile Gly Ala Gly Lys Gly Arg Asn Tyr Ser Val 210 215 220 Asn Val Pro Leu Arg Asp Gly Ile Ser Asp Asn Asn Tyr Gln Ser Ile 225 230 235 240 Phe Lys Pro Val Met Thr Lys Val Met Glu Thr Phe Asn Pro Asn Ala 245 250 255 Val Val Leu Gln Cys Gly Ala Asp Ser Leu Asn Gly Asp Arg Leu Gly 260 265 270 Pro Phe Asn Leu Thr Leu Lys Gly His Gly Glu Cys Val Lys Phe Phe 275 280 285 Arg Asp Tyr Asn Val Pro Leu Met Leu Leu Gly Gly Gly Gly Tyr Thr 290 295 300 Pro Arg Asn Val Ala Arg Cys Trp Thr Tyr Glu Thr Ser Ile Ala Val 305 310 315 320 Asp Met Gln Ile Asn Asp Glu Leu Pro Tyr Asn Asp Tyr Phe Glu Tyr 325 330 335 Phe Gly Pro Asn Tyr Arg Leu His Ile Glu Pro Ser Gln Ala Ala Asp 340 345 350 Glu Asn Asp Gln Val Tyr Leu Gln Lys Ile Gln Glu Ala Val Cys Glu 355 360 365 Asn Leu Arg Lys Leu Gln Gly Pro Ser Ser Val Gln Met His Ala Val 370 375 380 Glu Lys Asp Ile Met Glu Ile Asp Glu Thr Arg Leu Ile Asp Ala Ala 385 390 395 400 Asn Pro Asp Glu Arg Leu Pro Asp Pro Ile Val Asp Lys Met Val Glu 405 410 415 Asp Ala Gly Glu Leu Tyr Asp Asn Glu Lys Glu Gly Gly Asp Leu Arg 420 425 430 Asn Glu Gln Ser His Lys Arg Pro His Glu Glu Gly Asp Ser Pro Val 435 440 445 Ser Lys Lys Pro Arg Asp Glu Gly Gly Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ala 450 455 460 Glu Pro Thr Glu Ser 465

Claims

서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 히스톤 탈아세틸화 효소(Histone deactylase: HDA). Bursaphelenchus xylophilus histone deacetylase (HDA) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.

상기 제 1 항의 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소-인코딩 핵산 분자.The pine re nematode histone deacetylase-encoding nucleic acid molecule of claim 1.

제 2 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1-1,410을 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소-인코딩 핵산 분자.3. The pine re-nematode histone deacetylase-encoding nucleic acid molecule according to claim 2, wherein the nucleic acid molecule comprises nucleotides 1-1,410 of SEQ ID NO: 1.

제 3 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 1,411-1,726의 3’-비해독 부위(untranslated region: UTR)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 히스톤 탈아세틸화 효소-인코딩 핵산 분자.4. The pine re-nematode histone deacetylase-encoding according to claim 3, wherein the nucleic acid molecule further comprises a 3'-untranslated region (UTR) of nucleotides 1,411-1,726 of SEQ ID NO: 1. Nucleic Acid Molecules.

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