KR101023171B1

KR101023171B1 - 허혈성 뇌질환 예방 및 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101023171B1
Application number: KR1020090023760A
Authority: KR
Inventors: 박주연; 김재구
Original assignee: (주)뉴메드
Priority date: 2009-03-20
Filing date: 2009-03-20
Publication date: 2011-03-18
Also published as: KR20100104988A

Abstract

본 발명은 클레마티스 치넨시스(Clematis chinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌질환 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물은 뇌허혈에 의한 신경세포사를 효과적으로 억제하고 허혈성 뇌질환 특히 허혈성 뇌졸중의 예방 또는 치료에 유효하다는 장점을 갖는다.

클레마티스 치넨시스 추출물, 허혈성 뇌졸중, 허혈성 뇌질환

Description

허혈성 뇌질환 예방 및 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for prevention and treatment of ischemic brain disease}

본 발명은 허혈성 뇌질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 클레마티스 치넨시스(Clematis chinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

허혈성 뇌질환은 주로 혈전과 색전 등에 의해 뇌에 혈류를 공급하는 혈관에 병리학적 이상이 생긴 질환의 총칭이며, 허혈성 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병, 파킨슨병 등이 포함된다.{Yi Wen et al. Transient cerebral ischemia induces abrrant neuronal cell cycle re-entry and Alzheimer's disease-like tauopathy in female rats. JBC. 2004 279(21): 22684-22692, John T O'Brien et al. Vascular cognitive impairment. Lancet Neurology 2003. 2: 89-98}

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP감소, 부종(edema)이 발생되며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippocampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol., 62, pp201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, pp57-69, 1982).

허혈성 뇌졸중은 목 부분에 있는 경동맥, 추골뇌저동맥으로부터 뇌 안의 가느다란 동맥 중 어느 혈관이라도 막히면 발병하게 되며, 이로 인해 그 혈관이 지배하던 뇌조직이 죽는 현상, 즉 '뇌경색(infarction)'이 나타나게 된다. 뇌경색은 뇌연화증이라고도 하며, 뇌혈전증과 뇌색전증이 있다.

허혈성 뇌졸중 이외에 뇌출혈에 의한 '출혈성 뇌졸중'을 포괄하여 뇌졸중이라하며, 뇌졸중을 흔히 중풍이라고도 한다.

뇌허혈 치료제로는 FDA공인 시판 중인 조직플라즈미노겐 활성자(tissue plasminogen activator)로, 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도한다. 따라서, 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니므로 조기 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량의 사용이나 자주 사용시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발하게 된다.

한편, 클레마티스 치넨시스(C. Chinensis)는 중국에서 그 뿌리를 위령선이라불리는 약재로 사용하고 있으며, ranunclin, anemol, steroids, saponin, 아미노산, 페놀 등을 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 약리효과로는 이질균에 대해 상 당히 강력한 억제작용이 있고, 또한 항곰팡이작용이 있는 것으로도 알려져 있다. 또한, 항이뇨작용, 항암 및 진통효과도 갖는 것으로 알려져 있다.(Seo BI et al. A philological study on poisoning of Clematidis Radix. J. East-West Medicine 2008. 33(4): 25-35) 그러나, 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료작용에 대해서는 알려져 있지 않다.

본 발명자들은 클레마티스 치넨시스가 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적임을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적과제는 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 클레마티스 치넨시스(Clematis chinensis) 추출물의 허혈성 뇌질환 예방 및 치료용도를 제공한다.

본 발명에서 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료는 클레마티스 치넨시스 추출물의 신경세포보호작용 바람직하게는 뇌신경세포보호작용에 기인한 것일 수 있으며, 상기 허혈성 뇌질환은 뇌허혈로 인한 질병을 의미한다. 허혈성 뇌질환의 구체적인 예로는 허혈성 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병, 또는/및 파킨슨병 등으로, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중이다.

상기 클레마티스 치넨시스 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

1) 클레마티스 치넨시스에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축한 후 건조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 클레마티스 치넨시스는 재배한 것 또는 시판 되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 상기 클레마티스 치넨시스의 뿌리를 추출하는 것이 바람직하다.

상기 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있으며, 상기 알코올로는 C1 내지 C4 저급 알코올일 수 있으며, 상기 추출용매는 에탄올, 메탄올, 70%에탄올수용액이 바람직하며, 70%에탄올수용액이 더욱 바람직하다. 즉, 상기 추출물은 70%에탄올수용액추출물일 수 있다.

추출방법으로는 진탕추출, 속슬렛(Soxhlet)추출 또는 환류추출에 의할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 클레마티스 치넨시스의 5 내지 15배 분량으로 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 10배 첨가하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 40 내지 100℃인것이 바람직하며, 60 내지 80℃인 것이 더욱 바람직하다. 또한 추출시간은 4 내지 24시간인 것이 바람직하며, 8 내지 15시간이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 아울러 추출횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 추출물은 본 발명의 조성물 총중량 중 0.1 ~ 50중량%일 수 있으며, 0.1중량% 미만에서는 원하는 약효를 얻기 어려울 수 있고, 50중량%초과에서는 사용량의 증가와 관계없이 약효는 일정하여 치료효과 증대를 기대하기 어려울 수 있다.

상기 추출물은 뇌허혈에 의한 뇌신경세포 손상에 대하여 뇌신경세포보호효과를 나타내어 허혈성 뇌질환을 예방 및 치료하는 효과를 나타내고, 바람직하게는 허혈성 뇌질환 중 허혈성 뇌졸중에서 발생하는 뇌경색을 예방 및 치료하는 효과를 나타낸다.

따라서, 본 발명은 상기 추출물의 허혈성 뇌질환 치료제 제조를 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 추출물을 필요로 하는 포유류(인간을 포함함)에게 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.

별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 조성물에 관한 내용은 본 발명의 추출물의 용도, 허혈성 뇌질환 치료제 제조 용도, 허혈성 뇌질환 예방방법 또는 치료방법에도 동일하게 적용된다.

상기 추출물은 인간을 포함한 포유류에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 유효성분을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 배합하여 제제화하여 투여할 수 있다. 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 및 젤라틴 등을 첨가하여 제조한다. 또한, 마그네슘, 탈크 등 윤활제도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해 당되며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 주사가능한 액제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 비강세척제 및 좌제가 포함된다. 주사가능한 액제, 현탁제, 유제는 물, 비수성용제나 현탁용제와 유효성분을 혼합하여 제조할 수 있으며, 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등일 수 있다.

좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등의 사용될 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사로 투여가능하다.

추가적으로 제제화에 관한 내용은 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA 등의 문헌을 참조할 수 있다.

투약단위는 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 1/2, 1/3 또는 1/4배를 포함할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하게는 유효성분이 1회에 투여되는 양을 의미하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당된다. 본 발명 조성물의 개별투약량은 유효성분 기준으로 0.0001 ~ 10g/kg이고, 바람직하게는 0.0001 ~ 5g/kg이며, 하루 1~4회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 허혈성 뇌질환 예방 및 치료를 위하여 단독으로 또는 수술, 호르몬 치료, 화학치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학조성물은 허혈성 뇌질환 특히 허혈성 뇌졸중의 예방 및 치료에 유효하다는 장점을 갖는다.

본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 제조예를 제시한다. 하기의 실시예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 클레마티스 치넨시스 추출물의 제조

<1-1> 클레마티스 치넨시스 70%에탄올수용액 추출물의 제조

클레마티스 치넨시스의 뿌리(옴니허브, 길림, 중국) 100.06g을 추출자루에 넣고 1리터의 70%에탄올 수용액에 침지하여 80℃에서 3시간 동안 1번 진탕 추출한 후 여과지로 여과하였다. 상기 추출액을 진공감압농축기(선일 EYELA, 일본)로 감압하에 농축하여 건조한 상태의 클레마티스 치넨시스 70%에탄올수용액 추출물 17.77g을 제조하였다.

<1-2> 클레마티스 치넨시스 열수 추출물의 제조

추출용매로 70%에탄올 수용액 대신 100℃의 물을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 <1-1>과 동일하게 실시하여 클레마티스 치넨시스 열수추출물 20.79g을 제조하였다.

<1-3> 클레마티스 치넨시스 메탄올 추출물의 제조

추출용매로 70%에탄올 수용액 대신 100%메탄올을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 <1-1>과 동일하게 실시하여 클레마티스 치넨시스 메탄올추출물 17.09g을 제조하였다.

<실시예 2> 클레마티스 치넨시스 추출물의 허혈성 뇌질환 예방 및 치료 효과 확인-4-혈관폐색모델(4-VO)

<2-1> 실험동물의 준비

실험동물로 170g 내외의 5주령 위스터계 수컷 랫트(Wister, 샘타코, 대한민국)와 270g 내외의 7주령 스프라그-다울리계 수컷 랫트(sprague-dawly, 샘타코, 대한민국)를 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 실험환경에 적응하도록 하였다. 1주일의 적응기간을 준 후, 동물실험을 수행하였다.

<2-2> 뇌허혈에 의한 뇌신경세포손상에 대한 보호효과 확인

클레마티스 치넨시스 추출물의 뇌허혈에 의한 뇌신경세포손상에 대한 뇌신경세포보호효과를 측정하기 위하여, 1979년 펄시넬리(Pulsinelli)가 개발한 4-혈관폐색(4-Vessel Occlusion)모델을 사용하였다(Pulsinelli WA, Brierley JP, Stroke, 10, 267-272, 1979).

랫트를 질소와 산소의 혼합가스(질소 70%, 산소 30%)에 포함된 5% 이소플루란으로 마취시킨 다음 정외고정장치(stereotaxic apparatus)에 수평면으로 머리를 기준으로 하여 꼬리를 아래로 30도 경사지게 고정시켰다. 코와 입 주위는 플라스틱 원추흡입기(cone)로 마취기에 연결하고 1.5% 이소플루란으로 마취상태를 유지시켰 다. 꼬리를 수술대에 고정하고 경추를 신전시킨 상태로 실험하였다.

먼저, 목 정중선 절개를 하여 후두골 하단의 1번 경추부를 수술확대경을 이용하여 근육이 다치지 않게 주의하면서, 1mm 이하의 미세한 전기소작침을 1번 경추의 우상공(alar foramina)을 통하여 밑으로 척추동맥이 통과하고 있는 터널로 집어넣어, 간헐적인 전류를 통전시켜 척추동맥을 소작하였다. 수술현미경을 이용하여 뼈 속으로 지나가는 터널에 존재하는 척추동맥이 완전히 소작되어서 폐쇄되었다는 것을 확인한 다음 수술용 클립으로 봉합하였다. 그 후, 랫트를 돌려서 인후부위의 총경동맥에 봉합사로 고리를 만들어 허혈을 유발하고 재관류할 수 있도록 장치하였다. 그리고 허혈 유발시 미세혈관의 순환을 봉쇄하기 위하여 실로 뒤쪽으로는 기관(trachea), 식도(esophagus), 외부경정맥(external jugular vein), 총경동맥(common carotid arteries)이 위치하며, 앞쪽으로는 경부(cervical), 척추주위(paravertebral) 근육들이 지나가도록 꿰뚫은 다음 수술용 클립으로 상처를 봉합하였다.

봉합 후 24시간이 지난 다음 수술용 클립을 제거한 다음 총경동맥을 동맥류(動脈瘤, aneurysm)클립으로 10분간 조여서 허혈을 유발하였다. 1분 이내에 대광반사(對光反射, 눈에 빛을 비추었을 때의 반사작용)가 소실되지 않으면 경부봉합을 단단하게 하였고, 이 때 대광반사가 소실되지 않은 랫트들은 완전한 양측 평행적인 해마의 CA1 신경손상이 유발되지 않았기 때문에 제외시켰으며, 경련을 일으키는 랫트들도 제외시켰다. 허혈 유발 10분 후 총경동맥에서 동맥류클립을 떼어내어 허혈을 중지시키고 재관류시켰다.

랫트를 세개의 군으로 나누어, 재관류 직후와 90분 후 각각 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물을 10, 30, 100mg/kg 복강주사하였다.

허혈유발 1주일 후에 랫트를 우레탄 1.2g/kg 복강내 투여로 마취시켜 개흉한 후 심장 우심방을 절개하고 좌심실에 바늘을 주입한 후 헤파린 처리한 5% 질산나트륨 생리식염수를 10분 동안 심장에 관류시킨 다음 4.0% 포르말린 고정액으로 관류시켰다. 그 후 랫트의 뇌를 떼어내어 2시간 동안 0.1M 인산 완충된 포르말린 고정액에 후-고정한 다음, 30% 수크로오즈 용액에 담가 하룻밤 동안 방치하였다. 고정된 뇌에서 정수리점(bregma) -2.5 mm와 -4.0 mm 사이의 등쪽 해마(dorsal hippocampus) 부위에 있는 관상조각(coronal block)을 절개하고 -20℃에서 동결한 후 슬라이딩 마이크로톰을 이용하여 30 um 간격으로 절단하여 해마를 포함하는 조직 절편을 준비하였다.

상기 방법으로 준비된 절편을 크레실 바이올렛(cresyl violet)으로 염색하여 고정한 다음 등쪽 해마(dorsal hippocampus) CA1 중 지연성 신경원세포 사망(delayed neuronal death)에 의해 가장 손상되기 쉬운 부분인 중간대(miiddle zone) 1000um 부분(Crain BJ et al., Neuroscience, 27, 387-402, 1988) 내에 존재하는 손상된 신경세포 수를 관찰하였다. 세포수의 관찰은 고배율(X400)에서 정상적인 형태를 보이는 추체세포(ptramidal cell)의 수를 3인의 관찰자가 한 개의 뇌조직에서 3개의 다른 조직 절편의 좌우 양측 2개, 총 6부위에서 관찰한 값을 평균하였다. 음성대조군으로 클레마티스 치넨시스 추출물 대신 5% DMSO(Dimethyl Sulfoxide)만을 투여한 랫트의 뇌 해마조직을 사용하였으며, 정상군(sham operated, 샴군)으로 척추동맥만 소작한 랫트의 뇌 해마조직을 사용하였다.

그 결과를 도 1과 도 2에 나타내었다.

도 1은 크레실 바이올렛 염색법으로 염색한 랫트의 뇌조직절편을 촬영한 사진으로 왼쪽부터 정상군(A, a), 음성대조군(B, b), 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물 10mg/kg 투여군(C, c), 30mg/kg 투여군(D, d), 100mg/kg 투여군(E, e)에 대한 것이다. 도 1의 상단은 해마조직 사진(A, B, C, D, E)이고 하단은 해마의 CA1 영역(도 1 상단 사진의 박스 표시 부분) 확대사진(a, b, c, d, e)이다.

도 1에서 보는 바와 같이, 음성대조군 신경세포의 경우 정상 신경세포와는 다르게 조직이 이완되면서 세포들이 주변 세포로부터 유리되는 현상을 관찰할 수 있었으며, 세포체(cell body) 역시 본래의 추체상(pyramidal) 형태를 잃고 응축되어 단일 세포의 형태로 되어있음을 확인할 수 있었다. 또한, 핵 염색질이 농축되고 핵막이 붕괴하는 현상이 관찰됨으로써 세포사멸(apoptosis)이 이루어졌음을 확인할 수 있었다. 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물을 10, 30, 100mg/kg 투여군의 신경세포는 정상세포와 유사한 형태를 나타내었으며, 잘 뻗어나가는 핵주위질(perikaryon)과 중앙에 위치하는 둥근 핵으로 인하여 쉽게 구별되었다. 또한, 대다수의 세포들이 세포고사로부터 방어되어 정상적인 추체 형태를 이루었으며, 주변세포들과의 연결(junction)을 계속하여 유지하고 있음을 확인하였다.

도 2는 정상군(Sham), 음성대조군(control), 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물 10, 30, 100mg/kg 투여군에서 정상 뇌신경세포수/mm²(neuronal cell density)를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2에서 보는 바와 같이 음성대조군에서는 가로X세로 1mm²당 세포수 평균이 69.1±4.3으로 나타나 신경세포 고사가 많이 일어났음을 확인할 수 있었다. 그러나 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물 10, 30, 100mg/kg 투여군에서는 세포수 평균이 390.6±2.7, 385.6±10.2, 354.7±17.3의 세포수/mm²로 음성대조군에 비하여 정상 세포수가 5배 이상 높은 값을 나타내며, 정상군과 비교하여서는 92.78%, 91.34%, 82.44%를 나타낸 것으로 보아, 우수한 신경세포 보호 효과를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 클레마티스 치넨시스 추출물이 뇌허혈로 인한 신경세포 손상을 방어하는 효과가 뛰어나므로, 허혈성 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병, 파킨슨병 등의 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적임을 알 수 있다.

<실시예 3> 클레마티스 치넨시스 추출물의 허혈성 뇌질환 예방 및 치료 효과 확인-중대뇌동맥폐색모델(MCAo)

<3-1> 실험동물의 준비

실험동물은 상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로 준비하였다.

<3-2> 국소뇌허혈에 의한 뇌신경세포손상에 대한 보호효과 확인

클레마티스 치넨시스 추출물의 국소뇌허혈에 의한 뇌신경세포손상에 대한 뇌신경세포보호효과를 측정하기 위하여, 응용된 혈관내 봉합사 삽입법(intraluminal suture method)을 사용하였다(Zea Longa, et al., Stroke, 20: 84-91, 1989).

구체적으로 먼저 22mm의 4-0 나이론 봉합사의 끝부분에서 약 5-8mm 길이를 실리콘으로 코팅하되 지름이 0.36mm가 되도록 제작한 프로브를 실험에 사용하였다. 랫트를 70% N₂O와 30% O₂가 섞인 혼합가스에 5%의 이소플루란(isoflurane)으로 전신마취를 한 후, 목 전방 부위 중앙의 피부를 절개하고 오른쪽 경동맥과 외경동맥(ECA)을 주위조직과 신경들로부터 조심스럽게 분리하였다. 외경동맥 분지인 상부갑상선동맥과 후두동맥을 전기소작기로 소작하고 내경동맥의 분지인 익돌근구개동맥을 전기소작하고 외경동맥을 자르고 프로브를 외경동맥에서 내경동맥으로 삽입하되 총경동맥분지에서 약 18 ~ 19mm 정도 삽입한 후 실로 고정하여 뇌허혈이 유발되도록 하였다. 피부절개부위를 다시 봉합한 후 마취에서 자연회복시켰다.

뇌허혈 유발직후 및 그로부터 120분 후에 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물을 세 개의 실험군 각각에 대해 랫트 체중 1kg당 30, 100, 300 mg을 랫트 체중 270 g당 0.6 mL 씩의 부피가 되도록 5% DMSO(Dimethyl Sulfoxide)로 희석하여 복강 내 주사하였다. 또한, 음성대조군은 클레마티스 치넨시스 추출물 대신 실험군과 동일 부피의 5% DMSO를 투여한 것을 제외하고는 실험군과 동일하게 처리하였고, 양성대조군은 클레마티스 치넨시스 추출물 대신 30 mg/kg의 에다라본(edaravone; 3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one; 미쯔비시; 일본)을 투여한 것을 제외하고는 실험군과 동일하게 처리하였다.

모든 실험군은 같은 날 같은 조건으로 실험하였으며, 수술은 체온이 37±0.5 ℃가 되게 유지하면서 관찰하였다. 수술 120분 후 상기와 같은 방법으로 재마취하여 프로브를 후퇴시켜 재관류시켰다. 재관류 후 24시간 후에 경추탈골시키고, 2분 이내에 뇌를 적출하여 2mm 두께로 6개의 절편을 얻었다. 2% TTC(triphenyltetrazolium chloride)용액이 들어 있는 12웰 플레이트(well plate)에 조직을 충분히 담그고 37℃에서 30분 동안 방치한 후, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시켜 조직을 관찰하였다. 모든 수술과정은 수술현미경 하에서 시행하였으며, 마취는 이소플루란을 2%로 유지하면서 체온이 37℃ 이하로 떨어지지 않도록 램프를 이용하여 체온을 유지시킨 상태에서 하였다. 염색된 뇌조직은 디지털 카메라로 하나씩 촬영한 후 컴퓨터로 옮겼고, 이미지 분석프로그램인 옵티마스 6.5(Optimas 6.5, Bioscan)를 이용하여 뇌경색비율(%)을 하기 수학식 1로 계산하였다.

(수학식 1)

뇌경색 비율(%)={(A-(B-C)}/AX100

A: 정상 반구의 전체 부피(mm³)

B: 손상된 반구의 전체 부피(mm³)

C: 손상된 반구의 손상부위 부피(mm³)

결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3은 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물 투여량에 따른 랫트 뇌조 직에서 뇌신경세포손상 보호효과를 관찰하기 위해 랫트의 뇌조직 절편을 TTC염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 사진으로, 왼쪽부터 음성대조군(A), 양성대조군(B), 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물 30mg/kg투여군(C), 100mg/kg투여군(D), 300 mg/kg 투여군(E)에 대한 것이다.

또한, 도 4는 5% DMSO를 투여한 음성대조군과 클레마티스 치넨시스 추출물 투여군에서의 뇌경색 비율(infarct volume; %)을 나타낸 그래프이다. 도 4의 vehicle는 음성대조군을 의미한다.

도 3에서 보는 바와 같이 대조군에 비하여 클레마티스 치넨시스 추출물을 투여한 군들은 신경세포가 손상되지 않아 TTC로 염색된 흑적색 부위의 면적이 넓은 것을 알 수 있었다. 참고로, TTC로 뇌조직을 염색하면 손상으로 인해 조직이 사멸한 부위는 염색이 되지 않아 흰색으로 나타나며, 정상부위의 조직은 염색이 되어 흑적색으로 나타난다.

또한, 도 4에서 보는 바와 같이 5% DMSO를 투여한 대조군은 뇌경색 비율(%)이 약 31.05%로 나타났고, 실시예 1-1의 클레마티스 치넨시스 추출물 30, 100, 300 mg/kg 투여군은 뇌경색 비율이 각각 35.87±4.06, 21.20±4.19, 17.12±3.05로 나타나 농도의존적인 신경보호효과를 나타내었다. 클레마티스 치넨시스 추출물 30mg/kg 투여군을 제외한 실험군에서 대조군에 비하여 각각 54.6%와 45.9%의 신경보호효과를 보인 것으로 나타났으며 300mg/kg의 용량에서 최고 효능을 나타냄을 알 수 있었다.

이러한 결과는 특히 허혈성 뇌졸중의 주증상인 뇌경색을 클레마티스 치넨시 스 추출물이 효과적으로 방어하는 것을 나타낸다.

따라서, 클레마티스 치넨시스 추출물이 뇌허혈로 인한 신경세포 손상을 방어하는 효과가 뛰어나므로, 허혈성 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병, 파킨슨병 등 허혈성 뇌질환의 예방 및 치료에 효과적이며, 특히 허혈성 뇌졸중의 예방 및 치료에 효과적임을 알 수 있다.

하기에 본 발명의 클레마티스 치넨시스 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

<제제예 1> 산제의 제조

실시예 <1-1>의 추출물 300 ㎎

유당 100 ㎎

탈크 10 ㎎

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

<제제예 2> 정제의 제조

실시예 <1-1>의 추출물 50 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제 를 제조한다.

<제제예 3> 캡슐제의 제조

실시예 <1-1>의 추출물 50 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

<제제예 4> 주사제의 제조

실시예 <1-1>의 추출물 50 ㎎

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

<제제예 5> 액제의 제조

실시예 <1-1>의 추출물 1,000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

도 1은 4-혈관폐색(4-vessel Occlusion)방법을 이용한 전뇌허혈모델에서 클레마티스 치넨시스(Clematis chinensis) 추출물의 방어효과를 나타낸 결과를 나타낸 사진이다.

도 2는 정상군, 음성대조군, 클레마티스 치넨시스 추출물 투여군에서 정상 뇌신경세포수를 비교한 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 중대뇌동맥폐색(Middle Cerebral Artery occlusion)방법을 이용한 국소뇌허혈모델에서 클레마티스 치넨시스 추출물 투여농도에 따른 랫트 뇌조직에서 뇌신경세포손상 보호효과를 관찰하기 위해 랫트의 뇌조직 절편을 TTC염색법으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.

도 4는 중대뇌동맥폐색(Middle Cerebral Artery occlusion)방법을 이용한 국소뇌허혈모델에서 음성대조군과 클레마티스 치넨시스 추출물 투여군에서의 뇌경색 비율(%)을 나타낸 그래프이다.

Claims

클레마티스 치넨시스(Clematis chinensis) 추출물을 유효성분으로 함유하는 허혈성 뇌질환 예방 및 치료용 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환 예방 및 치료는 신경세포보호작용에 기인한 것인 약학조성물.
제1항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은 허혈성 뇌졸중, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매, 헌팅턴병, 및 파킨슨병 중에서 선택된 하나 이상인 약학조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 허혈성 뇌질환은 허혈성 뇌졸중인 약학조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 클레마티스 치넨시스 뿌리를 추출한 것인 약학조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 70%에탄올수용액추출물인 약학조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총중량 중 0.1 내지 50중량%인 약학조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 제형은 산제, 정제, 캡슐제, 주사제, 또는 액제인 약학조성물.