KR101022809B1 - Therapy of Candidaalbicans?caused Infectious Diseases by Immunoregulation - Google Patents

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Abstract

본 발명은 18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)을 함유하는 면역조절제, 면역보조제, 또는 관절염 예방 및 치료제에 관한 것으로, 구체적으로 감초로부터 분리한 18β-GA는 농도에 따라 T-림프구 및 B-림프구 증식을 조절하는 면역조절효과가 있고, 항원인 캔디다 알비칸스 세포벽물질(Candida albicans cell wall, CACW)과의 혼합물(CACW/18β-GA)은 항-캔디다 알비칸스 항체(anti-C. albicans antibody) 생성을 증진시키고, Th1 면역반응 우세성을 유도하며, 전신성 캔디다증(disseminated candidiasis) 동물모델에서 상기 백신제형으로 면역된 생쥐의 생존률을 증진시킴으로써 진균 백신에 "좋은 항체(good antibody)"를 유도하는 면역보조제 효능을 가지며, 관절염 부위에 유입된 대식세포로부터 산화 질소(Nitric Oxide, NO) 생성을 억제하고 CD4+ T-림프구를 억제함으로써 관절염의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to an immunomodulator, an adjuvant, or an arthritis preventive and therapeutic agent containing 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA). Therefore, it has an immunomodulatory effect of regulating T-lymphocyte and B-lymphocyte proliferation, and is an antigen of Candida albicans cell wall material ( Candida The mixture with albicans cell wall (CACW) (CACW / 18β-GA) enhances the production of anti- C. albicans antibodies, induces the predominance of Th1 immune response, and systemic candidiasis. It has the effect of adjuvant inducing "good antibody" to fungal vaccines by enhancing the survival rate of mice immunized with the vaccine formulation in animal models, and nitric oxide (NO) from macrophages introduced into arthritis sites. ) Can be usefully used as a prophylactic and therapeutic agent for arthritis by inhibiting production and inhibiting CD4 + T-lymphocytes.

18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA), 면역조절, 면역보조제, 관절염 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA), immunomodulatory, adjuvant, arthritis

Description

면역조절에 의한 캔디다알비칸스 기인성 질환의 치료{Therapy of Candidaalbicans―caused Infectious Diseases by Immunoregulation} Treatment of Candidaalbicans-caused Infectious Diseases by Immunoregulation

본 발명은 18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)을 함유하는 면역조절제, 면역보조제, 또는 관절염 예방 및 치료제에 관한 것이다.The present invention relates to an immunomodulatory agent, an adjuvant, or an arthritis prevention and treatment containing 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA).

현재 국내외적으로 면역강화 또는 면역조절 등의 개념을 이용한 다양한 천연물질이 주로 한약재추출물의 형태로 상품화되고 있다. 이 제품들은 복합추출물인 경우가 대부분이며 체계적인 작용기전의 규명이 미흡한 경우가 많다. 대부분의 경우가 단일성분이 아닌 추출물이기 때문에 어떠한 특정성분 또는 복합성분이 면역조절기능에 효과가 있는지에 대해서는 그 근거가 불분명한 것으로 추정된다. 현재 면역강화나 조절을 위한 제품으로 사용되는 천연물질들은 다음과 같은 것이 있다. Currently, various natural substances using concepts such as immune fortification or immunoregulation are being commercialized mainly in the form of herbal extracts. Most of these products are complex extracts, and the systematic mechanism of action is often insufficient. Since most of the cases are extracts rather than single components, it is presumed that the basis for which specific components or complex components are effective for immunomodulatory function is unclear. Natural substances that are currently used as products for immune enhancement or regulation include:

에키나세아(Echinacea)는 세계적으로 가장 많이 상품화된 약용식물로 면역증강 효과로서, 면역세포 증강과 체액성면역반응 증진의 효과가 있고(Freier, D.O., et al., Immunopharmacol . Immunotoxicol ., 25, 551, 2003), 면역 보조제적 효과에 의한 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Currier, N.L. and Miller, S.C., J. Altern . Complement . Med., 8, 49. 2002). 피나무(linden tree; lime tree)는 면역기능 항진효과로서 정상적인 T-림프구의 증식을 향상시키나 암적인 림프구의 증식에 대해서는 억제 또는 사멸시키는 이중효과가 있다(Manuele, M.G., et al., Life Sci., 79, 2043, 2006). 버섯에 관한 제품 또한 면역증강 효능이 많이 알려져 있으며, 주로 자실체와 균사체제품이 주종을 이루고 있다. 면역기능 효과에 대해서는 베타-글루칸(b-glucan) 다당류가 Th1/Th2 면역조절 전환에 의한 항염증 효과와 면역보조제 효과 및 면역증강 효과가 있는 것으로 보고되었다(Dong, S.F., et al., Int . Immunopharmacol ., 7, 725, 2007; Tao, Y., et al., Carbohydr . Res ., 341, 2261, 2006). 알로에를 사용한 제품도 다양하게 있으며, B- 및 T-림프구에 대한 면역자극 및 대식세포(macrophage) 활성화와 패턴인식수용체(pattern recognition receptor)에 대한 면역반응를 증진시켜 감염성질환에 대한 방어력을 증진시킨다는 보고가 있다(Leung, M.Y., et al ., Immunol . Lett., 105, 101, 2006; Liu, C., et al., Int . Immunopharmacol ., 6, 1634. 2006). 키토산 함유제품(Chitosan-containing Products)도 면역증강 식품으로 주종을 이루고 있다. 키토산은 뇌수막염 접합백신(Baudner, B.C., et al., J. Drug Target., 13, 489, 2005)과 인플루엔자(Influenza) 백신 제조시 면역보조제로 사용하여 체액성 면역과 세포매개성 면역반응을 증강시키는 것으로 보고되었다(Read, R.C., et al., Vaccine . 23, 4367, 2005). 그리고 당귀(Angelica gigas), 천궁(Cnidium officinale), 백작약(Paeoniae lactiflora) 등의 3종의 생약을 혼합 제조한 순수 생약 복합물인 헤모 힘(HemoHim)이 있는데, 헤모힘에 함유된 당귀의 다당류 성분은 CD14, CR3 및 p38 MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성화를 통해 NFkB/Rel를 활성화와 면역세포 회복 증진에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Jeon, Y.J., et al., Int . Immunopharmacol ., 1, 1331. 2001; Han, S.B., et al., Immunopharmacology , 40, 39, 1988). Echinacea is the most commercially available medicinal plant in the world. It has the effect of boosting immune cells and enhancing humoral immune response (Freier, DO, et. al ., Immunopharmacol . Immunotoxicol ., 25, 551, 2003), known to have an anticancer effect by adjuvant effects (Currier, NL and Miller, SC, J. Altern . Complement . Med ., 8, 49. 2002). The linden tree (limden tree) has a dual effect of improving immune T-lymphocyte proliferation but suppressing or killing cancerous lymphocyte proliferation as an immune enhancing effect (Manuele, MG, et. al ., Life Sci., 79, 2043, 2006). Mushroom-related products are also known for their immune-boosting effects, mainly fruiting and mycelium products. In regard to immune function effects, beta-glucan polysaccharides have been reported to have an anti-inflammatory effect, an adjuvant effect, and an immune enhancing effect by Th1 / Th2 immunomodulatory conversion (Dong, SF, et. al ., Int . Immunopharmacol ., 7, 725, 2007; Tao, Y., et al ., Carbohydr . Res ., 341, 2261, 2006). There are also a variety of products that use aloe and are reported to enhance defense against infectious diseases by enhancing immune stimulation and macrophage activation against B- and T-lymphocytes and immune responses to pattern recognition receptors. (Leung, MY, et al ., Immunol . Lett ., 105, 101, 2006; Liu, C., et al., Int . Immunopharmacol ., 6, 1634. 2006). Chitosan-containing products are also predominantly immune-enhancing foods. Chitosan is a meningitis conjugate vaccine (Baudner, BC, et. al ., J. Drug Target ., 13, 489, 2005) and have been reported to enhance humoral and cell-mediated immune responses as an adjuvant in the manufacture of influenza and influenza vaccines (Read, RC, et. al ., Vaccine . 23, 4367, 2005). And Angelica gigas ), Cnidium HemoHim , a pure herbal compound made from a mixture of three kinds of herbs, including officinale and Paeoniae lactiflora , is a polysaccharide component of the worms contained in hemohim CD14, CR3 and p38 mitogen-activated protein. Activation of kinase is known to be effective in activating NFkB / Rel and enhancing immune cell recovery (Jeon, YJ, et. al ., Int . Immunopharmacol ., 1, 1331. 2001; Han, SB, et al ., Immunopharmacology , 40, 39, 1988).

상기에 예로 제시한 것과 같이 면역학적 방법에 의한 질환치료에 관해서 새로운 개념의 연구가 전 세계적으로 시도되고 있으며, 기존에는 감염성치료를 위한 면역학적 방법은 주로 항체요법이나 면역생물제제 등이 적용되었으나 최근에는 감염성 질환치료를 위해서 새로운 면역학적 방법의 시도가 이루어지고 있는 추세이다. 이에 대한 구체적인 예로, 특이성 항체생성 증진을 위한 면역보조제의 개발을 들 수 있는데, 복잡한 과정을 거쳐 개발되는 감염성 질환 및 암치료를 위한 백신개발을 할 때 항체생성이 발현되지 못하면 그 의미가 없다. 이에 착안하여 특이성 항체생성을 증진 유도하는 비특이성 물질의 발견과 더 나가서 그 물질 자체의 면역력증진 효과에 의한 질환치료법은 획기적일 것으로 생각된다.As shown in the examples above, a new concept of disease treatment has been attempted around the world in the treatment of diseases by immunological methods. In the past, immunological methods for the treatment of infectious diseases were mainly applied to antibody therapy or immunobiological agents. Attempts have been made to attempt new immunological methods to treat infectious diseases. As a specific example of this, the development of an adjuvant for enhancing specific antibody production, there is no meaning if the antibody production is not expressed when developing a vaccine for the treatment of infectious diseases and cancers developed through a complex process. With this in mind, the discovery of non-specific substances that induce specific antibody production and further, the treatment of diseases caused by the immunity enhancing effect of the substance itself is considered to be innovative.

본 발명자들은 면역증진물질의 발견 및 개발에 관한 기초연구에서 한약재 성분에 면역특이성을 유발하는 성분을 발견하여 이러한 가능성을 관찰한 바 있다. 인삼배당체 성분인 진세노사이드(Ginsenoside) Rg1의 면역증진에 의한 항균효과(Lee, J.H. and Han, Y., Int . Immunopharm ., 6, 1424, 2006)와 황기의 베타-사이토스테롤(b-sitosterol) 배당체인 다우코스테롤(daucosterol)의 면역기능 강화에 의한 치료(Lee, J.H., et al ., Vaccine. 25, 3834, 2007) 연구에서 그 가능성을 추 정해 볼 수가 있었다. 이러한 면역조절에 대한 구체적인 기전은 현재 2000년대 초부터 국외에서 연구가 활발하게 진행 중에 있다. The present inventors have observed this possibility by finding a component that induces immunospecificity in the herbal medicine component in the basic research on the discovery and development of immunostimulating substances. Antimicrobial Effect of Ginsenoside Rg1, a Ginseng Glycoside Component, by Immunization (Lee, JH and Han, Y., Int . Immunopharm ., 6, 1424, 2006) and Beta-Cysterol of Astragalus Treatment by enhancing immune function of the glycoside daucosterol (Lee, JH, et al . , Vaccine . 25, 3834, 2007). The possibility of this can be estimated from the study. The specific mechanism of this immunomodulation is currently being actively studied abroad.

현재까지 면역 기전에 관한 연구결과를 보면, 면역계에서 CD4+ T-림프구는 면역반응유도에 있어서 중추적 역할을 담당하는 세포로서, 면역반응 유도에는 신호전달(signal transduction)이 필요하며 적절한 신호의 발생에 따라 유효세포(effector cells)가 되는 과정에서 여러 경로가 관여한다. 특히, CD4+ T-림프구는 주요 조직적합성 복합체(Major Histocompatability Complex, MHC)에 의해 제공되는 항원의 자극에 의한 반복된 증식과정을 통해서 Th1과 Th2 유효 세포로 분화된다(Swain, S.L., Res . Immunol ., 142, 14, 1991; Swain, S.L., Immunol . Rev ., 74, 129, 1983). 이 과정에서 분화된 CD4+ T-림프구는 여러 종류의 사이토카인(cytokine)을 분비하고 다양한 면역기능을 갖추게 된다. 이렇게 분비된 사이토카인은 주변의 면역세포에 영향을 주며, 파급적으로 이 면역세포가 신호물질인 또 다른 종류의 사이토카인을 분비시키도록 한다. 그래서 사이토카인의 종류에 따라 유효기능들(effective functions)을 예측해 볼 수 있는 사이토카인 프로파일(cytokine profile)의 개념이 설정되었고, 면역 발현의 초기단계로서 염증반응 유도에 관여하는 기능에 따라 CD4+ 조력 T-세포는 Th1형 CD4+ T-세포(이하 Th1로 표기)와 Th2형 CD4+ T-세포(이하 Th2로 표기)로 구분되기도 한다(Mosmann, T.R., et al ., Immunol . Rev ., 123, 209, 1991). 그러므로 이와 같은 분화를 위해서는 T-세포의 초기 활성이 매우 중요한데, T-세포 수용체(T-cell receptor, TCR)와 항원결합 이외의 보조적 결합으로 T-세포 표면의 CD28이 항원제시세포(Antigen Presenting Cell, APC) 표면의 B7-분자와 결합해야 활성화되고 위와 같은 분화가 이루어진다. 그러나 CD28-B7의 결합 대신에 CTLA4-B7 결합이 형성되면 T-세포 활성이 억제되어 결과적으로 분화는 일어나지 못하게 된다(Nasta, F., et al., Immunology., 121, 62, 2007; Stockinger, B., et al., Immunol . Rev., 211, 39, 2006). 분화 결과로 분비된 사이토카인의 종류에 따라 Th1과 Th2 면역반응의 균형(balance)에 차이가 생기게 되고 이러한 항원에 대한 숙주의 면역반응을 통해 체액성 면역(humoral immunity) 또는 세포매개성 면역(cell-mediated immunity) 관여 여부를 유추할 수 있다(Weaver, C.T., et al., Annu . Rev . Immunol., 25, 821, 2007; Corthay, A., Scand . J. Immunol., 64, 93, 2006). 염증 반응에서는 주로 세포매개성 면역이 관여하기 때문에 숙주 내 면역반응은 항원의 종류와 특성 및 질환의 종류와 특성에 따라 Th1/Th2 불균형이 생기게 된다. 예를 들어 관절염에서 염증반응에 대한 CD4+ T-세포 역할의 억제를 위해 CD4+ T-세포를 제거하는 anti-CD4 mAb(monoclonal antibody)가 임상적으로 시도된 바 있으나(Pelegri, C., et al., Clin . Exp . Immunol., 125, 470. 2001; Schulze-Koops, H., and Lipsky, P.E., Curr . Dir . Autoimmun., 2, 24, 2000), CD4+ T-세포의 제거로 인해 다른 정상적인 기능이 억제됨으로서 생기는 여러 부작용 때문에 임상적 사용이 중단된 상태이다. 한편, 사이토카인의 영향을 고려해 볼 때, 보조제 유도성 관절염(Adjuvant-induced arthritis) 동물모델에서 Th2형 사이토카인인 인터루킨-4(IL-4)가 증진되면 활막세포(synoviocyte) 증식과 PGE2(prostaglandin E2)등의 생성이 억제되어 관절염이 억제된다는 것이 보고된 바 있다(Stamp, L.K., et al., J. Rheumatol., 31, 1246, 2004). 그러므로 관절염의 경우에는 Th2-우세반응이 효과가 있음을 알 수 있다. 따라서 각 질환에 따라 발현되는 Th1과 Th2의 균형을 역으로 전환(conversion)하여 조절하는 것이 가능하다면 특정질환의 치료에 도움이 될 것으로 예상된다. To date, studies on immune mechanisms show that CD4 + T-lymphocytes play a pivotal role in inducing immune responses. Signal transduction is required for the induction of immune responses. Several pathways are involved in the process of becoming effector cells. In particular, CD4 + T-lymphocytes differentiate into Th1 and Th2 effective cells through repeated proliferation by stimulation of antigens provided by the Major Histocompatability Complex (MHC) (Swain, SL, Res . Immunol . , 142, 14, 1991;. . Swain, SL, Immunol Rev, 74, 129, 1983). In this process, differentiated CD4 + T-lymphocytes secrete several types of cytokines and have various immune functions. This secreted cytokine affects the surrounding immune cells, causing them to secrete another type of cytokine that is a signal. Therefore, the concept of cytokine profile was established to predict effective functions according to the types of cytokines, and CD4 + helper T according to the function involved in inducing inflammatory response as an early stage of immune expression. Cells are also divided into Th1-type CD4 + T-cells (hereinafter referred to as Th1) and Th2-type CD4 + T-cells (hereinafter referred to as Th2) (Mosmann, TR, et. al . , Immunol . Rev. , 123, 209, 1991). Therefore, the initial activity of T-cells is very important for such differentiation. As an auxiliary binding other than T-cell receptor (TCR) and antigen binding, CD28 on the surface of T-cells is an Antigen Presenting Cell. , APC) must be combined with the B7-molecule on the surface to activate and achieve the above differentiation. However, if CTLA4-B7 binding is formed instead of CD28-B7, T-cell activity is inhibited, resulting in no differentiation (Nasta, F., et. al ., Immunology ., 121, 62, 2007; Stockinger, B., et al ., Immunol . Rev. , 211, 39, 2006). As a result of differentiation, there is a difference in the balance of Th1 and Th2 immune responses according to the type of cytokines secreted, and humoral or cell-mediated immunity through the host's immune response to these antigens. -mediated immunity) can be inferred from involvement (Weaver, CT, et. al ., Annu . Rev. Immunol ., 25, 821, 2007; Corthay, A., Scand . J. Immunol ., 64, 93, 2006). In the inflammatory response, cell-mediated immunity is mainly involved, resulting in Th1 / Th2 imbalance depending on the type and nature of the antigen and the type and nature of the disease. For example, anti-CD4 monoclonal antibodies (mAb) that remove CD4 + T-cells have been clinically tried to inhibit the CD4 + T-cell role in inflammatory responses in arthritis (Pelegri, C., et. al ., Clin . Exp . Immunol ., 125, 470. 2001; Schulze-Koops, H., and Lipsky, PE, Curr . Dir . Autoimmun ., 2, 24, 2000), clinical use has been discontinued due to a number of side effects caused by the inhibition of other normal functions due to the removal of CD4 + T-cells. On the other hand, considering the effects of cytokines, the development of Th2 cytokine interleukin-4 (IL-4) in adjuvant-induced arthritis animal models promotes synoviocyte proliferation and PGE 2 ( It has been reported that the production of prostaglandin E 2 ) is suppressed and arthritis is suppressed (Stamp, LK, et. al ., J. Rheumatol. , 31, 1246, 2004). Therefore, it can be seen that Th2-dominant response is effective in arthritis. Therefore, if it is possible to reverse the control (conversion) and control the balance of Th1 and Th2 expressed according to each disease is expected to help in the treatment of specific diseases.

본 발명을 위한 다양한 한약재 성분을 사용한 기초 평가실험에서 이소프레노이드(isoprenoid) 성분(예: 테르페노이드(terpenoids), 스테로이드(steroid)는 함량조절에 따라 T-세포의 면역반응에 영향을 주는 것으로 검색된 바 있다. 일례로, 캔디다 알비칸스(C. albicans)에 의한 파종성 캔디다증에서는 Th2 면역반응을 선호하여 질환을 악화시키는데, 다우코스테롤(daucosterol)은 이러한 Th2 면역반응을 Th1 면역반응으로 전환하여 감염된 생쥐의 생존율을 증가시켰다. 즉, 동물에 파종성 캔디다증을 유발했을 경우에는 Th2 면역반응이 형성되었으나, 다우코스테롤(daucosterol)을 투여받았을 때는 Th1의 면역반응이 유도되었다. 이러한 면역반응은 면역글로불린G(IgG) 아이소타이핑(isotyping)과 사이토카인 프로파일(cytokine profile) 방법을 사용하여 검색하였을 때, IgG1/IgG2a 또는 IgG1/IgG2b의 비율이 낮아지고 Th1 우세성 사이토카인의 일종인 인터페론감마(IFNg; Inteferon gamma)의 생성이 우세해지는 것으로 나타났다. 이 결과를 확인하기 위해 다우코스테롤(daucosterol)과 항-인터페론감마(anti-IFNg)를 생쥐에 투여하였을 때, 캔디다 알비칸스(C. albicans)로 감염된 생쥐그룹의 생존율은 현저하게 떨어져서 보호 효과가 없었고, Th 면역 유도성을 검색에서는 Th2 면역반응으 로 유지되는 것을 확인하였다. 결과적으로 다우코스테롤(daucosterol)이 Th2 면역반응을 Th1 면역반응으로 전환유도시킨다는 것이 알 수 있었다. 인삼 배당체인 진세노사이드(ginsenoside) Rg1에서도 거의 유사한 면역반응이 유도된다는 것을 확인할 수 있었다(Lee, J.H. and Han, Y., Int . Immunopharm ., 6, 1424, 2006). 진세노사이드(ginsenoside) Rg1 성분을 투여받은 생쥐의 사이토카인을 분석해 보았을 때 IFNg가 IL-4보다 우세하게 분비되어서 감염성 관절염의 경우에도 Rg1의 Th1/Th2 면역유도 전환에 의해서 증세를 약화시킨다는 것을 관찰한 바 있다(Lee, J.H. and Han, Y., Int . Immunopharm ., 6, 1424, 2006; Han, Y., Int . Immunopharmacol., 5, 1049, 2005). 위와 같은 실험결과로 테르펜(terpene) 계열의 배당체 성분들이 이러한 효능이 있음을 유추해볼 수 있다. In the basic evaluation experiment using various herbal ingredients for the present invention, isoprenoid (isoprenoid) components (eg, terpenoids, steroids) affect the immune response of T-cells according to the content control For example, disseminated candidiasis caused by C. albicans exacerbates the disease by favoring a Th2 immune response, and daucosterol converts this Th2 immune response into a Th1 immune response. The survival rate of infected mice was increased, ie Th2 immune responses were formed when the animals induced disseminated candidiasis, but the immune response of Th1 was induced when daucosterol was administered. IgG1 / IgG2a or IgG1 when searched using globulin G (IgG) isotyping and cytokine profile methods The ratio of / IgG2b was lowered and the production of interferon gamma (IFNg), a type of Th1 dominant cytokine, was predominant.Ducosterol and anti-interferon gamma (anti- When IFNg) was administered to the mice, the survival rate of the mice group infected with C. albicans was remarkably dropped and there was no protective effect, and the Th immunoinducibility was confirmed to be maintained in the Th2 immune response. As a result, it was found that daucosterol induces a Th2 immune response to be converted into a Th1 immune response, and that ginseng glycoside, ginsenoside Rg1, induced an almost similar immune response (Lee, JH and Han, Y., Int. Immunopharm., 6, 1424, 2006). ginsenosides (ginsenoside) viewed to analyze the cytokines in mice treated with Rg1 ingredient There was observed that sikindaneun IFNg weaken the symptoms by IL-4 predominantly Th1 in Rg1 / Th2 immune induction in the case of infectious arthritis be converted secretion than bar (Lee, JH and Han, Y. , Int. Immunopharm ., 6, 1424, 2006; Han, Y., Int . Immunopharmacol ., 5, 1049, 2005). As a result of the above experiment, it can be inferred that terpene-based glycosides have such efficacy.

감초(Glycyrrhizae Radix, Leguminosae)는 유라시아 대륙에 널리 자생 또는 널리 재배되는 초본으로(Blumenthal, M., et al., American Botanical Council , Newton, 233, 2000), 고대 이집트 파라오의 무덤에서 발견되었고, 고대 그리스와 로마제국에서 주로 강장제나 감기 치료에 사용되었으며, 중국 의학에서 오랜 기간 동안 주요한 약재로 사용되어 왔다(Davis, E.A. and Morris, D.J., Mol . Cell . Endo., 78, 1, 1991). 감초는 건선(psoriasis)이나 습진(eczema)과 같은 피부질환, 천식, 소화성 궤양, 류마티스성 관절염 같은 염증성 질환의 치료에 오랫동안 사용되어 왔는데, 감초의 구체적 효능에 대한 문헌을 살펴보면, 천식, 인두염, 복통에 효과가 있는 것으로 알려져 있고(Leung, A., Wiley , New York, 220, 1980), 거담제, 진해제, 해독제로서의 효능을 가지며(Moon, A. and Kim, S.H., Planta 　 Med., 63, 115, 1997), 항염효과(Tangri, K.K., et al., Biochem. Pharm., 14, 1277, 1965), 항산화 활성(Kiso, Y., et al., Planta Med., 50, 298, 1984; Voya, J., et al ., Free Rev . Immunol., 25, 821, 1997) 및 간보호 효과(Haraguchi, H., et al., Bioorg . Med . Chem., 6, 339, 1998) 등이 있는 것으로 알려져 있다. Licorice (Glycyrrhizae Radix, Leguminosae) is a herb that is widely grown or widely grown on the Eurasian continent (Blumenthal, M., et. al ., American Botanical Council , Newton , 233, (2000), found in the tombs of ancient Egyptian pharaohs, used primarily in the treatment of tonics and colds in ancient Greek and Roman empires, and has long been used as a major medicinal herb in Chinese medicine (Davis, EA and Morris, DJ, Mol . Cell . Endo ., 78, 1, 1991). Licorice has long been used to treat skin diseases such as psoriasis and eczema, asthma, peptic ulcers, and inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis. It is known to be effective (Leung, A., Wiley , New York , 220, 1980), as an expectorant, antitussive, and antidote (Moon, A. and Kim, SH, Planta) 　 Med ., 63, 115, 1997), anti-inflammatory effects (Tangri, KK, et. al ., Biochem. Pharm ., 14, 1277, 1965), antioxidant activity (Kiso, Y., et al ., Planta Med ., 50, 298, 1984; Voya, J., et al . , Free Rev. Immunol ., 25, 821, 1997) and hepatoprotective effects (Haraguchi, H., et al ., Bioorg . Med . Chem ., 6, 339, 1998).

감초의 지표성분인 글리시리진(Glycyrrhizin. GL)은 다양한 면역조절 활성들(immunomodulating activities)이 있으며 임상에서는 알러지(allergy)와 간염(hepatitis) 치료제로 오랫동안 사용되어 왔다(Matsui, S., et al., Int . Immunopharmacol. 4, 1633, 2004). 글리시리진의 항바이러스 효과에 대해 많은 연구결과가 보고되어 왔는데, 인간면역결핍바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)에 대한 글리시리진의 항바이러스 활성이 보고된 바 있는데, 시험관(in vitro) 실험에서 플라그(plaque) 형성과 HIV 특이성 항원의 발현을 억제하고(Ito, M. and Nakashima, H., Antiviral Res., 7, 127, 1987), HIV 역전사효소를 억제(Nakashima, H. and Matsui, T., Jpn . J. Cancer Res., 78, 767, 1987)하며, 임상실험에서는 HIV-1 항원을 감소시켜 HIV-1 복제를 억제하는 것으로 보고되었다(Hattori, T. and Kematsu, S., Antiviral Res. 11, 255, 1989). 또한 세포배양 실험에서 A형 간염바이러스(hepatitis type A virus) 복제를 농도의존적으로 억제(Crance, J.M., et al., Antiviral Res. 23, 63, 1994)하고, B형 간염바이러스(hepatitis type B virus) 표면 항원 분비를 억제(Takahara, T. and Watanabe, A., J. Hepatol., 21, 601, 1994)하는 것으로 보고되었다. 임상연구에서는 글리시리진과 인터페론을 병용투여 하면 C형 간염바이러스(hepatitis type C virus)에 감 염된 환자의 간기능을 개선시키며, 장기 투여 시에는 만성 C형 간염바이러스 환자의 간암(hepatocellular carcinoma)에 대한 예방효과가 있었다(Arase, Y. and Ikeda, U., Cancer. 79, 1494, 1997). 이 밖에도 인플루엔자 바이러스에 대한 효과(Utsunomiya, T., et al ., Antimicrob . Agents Chemother ., 41, 551, 1997) 항종양 효과(Abe, H., Eur . J. Cancer Clin . Oncol ., 23, 1549, 1987; Suzuki, F., et al., In Vivo., 6, 589, 1992; Agarwal, R. et al., Nutr . Cancer., 15, 187, 1991)가 있는 것으로 보고되었다. Glycyrrhizin (GL), an indicator of licorice, has a variety of immunomodulating activities and has long been used in the treatment of allergy and hepatitis in clinical practice (Matsui, S., et. al ., Int . Immunopharmacol. 4, 1633, 2004). Got a lot of findings about the antiviral effect of geulrisirijin been reported, there are anti-viral activity of geulrisirijin been reported for HIV (Human Immunodeficiency Virus, HIV), a test tube (in in vitro ) inhibits plaque formation and expression of HIV specific antigens (Ito, M. and Nakashima, H., Antiviral) Res ., 7, 127, 1987), inhibiting HIV reverse transcriptase (Nakashima, H. and Matsui, T., Jpn . J. Cancer Res ., 78, 767, 1987), and clinical trials have shown that reducing HIV-1 antigen inhibits HIV-1 replication (Hattori, T. and Kematsu, S., Antiviral). Res . 11, 255, 1989). In addition, in cell culture experiments, hepatitis type A virus replication was inhibited in a concentration-dependent manner (Crance, JM, et. al ., Antiviral Res . 23, 63, 1994) and inhibits hepatitis type B virus surface antigen secretion (Takahara, T. and Watanabe, A., J. Hepatol ., 21, 601, 1994). Clinical studies have shown that co-administration of glycyrrhizin and interferon improves liver function in patients infected with hepatitis type C virus and prevents hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis C virus during long-term administration. Effective (Arase, Y. and Ikeda, U., Cancer . 79, 1494, 1997). In addition, effects on influenza viruses (Utsunomiya, T., et al . , Antimicrob . Agents Chemother . , 41, 551, 1997) antitumor effect (Abe, H., Eur . J. Cancer Clin . Oncol ., 23, 1549, 1987; Suzuki, F., et al ., In Vivo ., 6, 589, 1992; Agarwal, R. et al ., Nutr . Cancer ., 15, 187, 1991).

18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)는 염증성 피부질환(cutaneous disorders)에 2%로 국소적용을 했을 때 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 최근에는 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)로 유도한 생쥐의 귀부종 실험에서 항염증효과가 있는 것으로 보고되었다(Inoue, H. and Mori, T., B. J. Pharmacol., 96, 204. 1989). 또한, 카라기난(carrageenan) 기인성 흰쥐 족부종 실험에서 단핵백혈구(mononuclear leukocyte)의 이동(migration)을 방지하고(Capasso, F. et al., J. Pharm . Pharmacol ., 35, 332, 1983), 인체의 보체활성화 단계(complement activation cascades)를 억제하며(Kroes, B.H., et al., Immunology, 90, 115, 1997), 간 손상시 cytochrome P450 2EI 발현을 억제하여 간보호 효과를 가지는 것으로 보고되었다. 그리고 18β-GA는코르티솔(cortisol)의 불활성화 촉매작용을 하는 11-베타-하이드록시스테로이드 디하이드로제나제(11-b-hydroxysteroid dehydrogenase) 효소를 억제하고(Teelucksingh, S., et al., Lancet, 335, 1060, 1990; Marandici, A. and Monder, C., Steroids, 58, 153, 1993), 항산화 활성으로 담즙산(bile acid) 유도성 세포사멸 억제효과가 있는 것으로 최근 보고된 바 있다(Gumpricht, E., et al, J. Biol . Chem., 280, 10556, 2005). 또한, 동물실험에서 위궤양에서 항궤양 효과가 있음이 보고되었는데(Yano, S. and Harada, M., Chem . Pharm . Bull ., 37, 2500, 1989), 이 효과는 위점막 보호작용을 하는 프로스타글라딘(prostaglandins, PG)를 불활성화시키는 15-하이드록시프로스타글란딘 디하이드로제나제(15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase)와 D-13-프로스타글란딘 리덕타제(D-13-prostaglandin reductase) 효소의 작용억제에 의한 것으로 규명된 바 있다(Baker, M., Steroids. 59, 136. 1994). 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA) is known to be effective when topically applied at 2% to cutaneous disorders, and recently TPA (12-O-tetradecanoylphorbol) -13-acetate) has been reported to have anti-inflammatory effects in ear edema experiments of mice (Inoue, H. and Mori, T., BJ Pharmacol ., 96, 204. 1989). It also prevents migration of mononuclear leukocytes in carrageenan-induced rat foot edema experiments (Capasso, F. et. al ., J. Pharm . Pharmacol . , 35, 332, 1983), inhibiting the body's complement activation cascades (Kroes, BH, et. al ., Immunology , 90, 115, 1997), have been reported to have hepatoprotective effect by inhibiting the expression of cytochrome P450 2EI upon liver injury. And 18β-GA inhibits the 11-b-hydroxysteroid dehydrogenase enzyme that catalyzes the inactivation of cortisol (Teelucksingh, S., et. al ., Lancet , 335, 1060, 1990; Marandici, A. and Monder, C., Steroids , 58, 153, 1993), have recently been reported to inhibit bile acid-induced apoptosis due to antioxidant activity (Gumpricht, E., et. al , J. Biol . Chem ., 280, 10556, 2005). In addition, animal studies have reported an anti-ulcer effect in gastric ulcers (Yano, S. and Harada, M., Chem . Pharm . Bull . , 37, 2500, 1989). 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase and D-13-prostaglandin reductase, which inactivates prostaglandins (PG) (Baker, M., Steroids . 59, 136. 1994).

화학구조적으로는 글리시리진은 트리테르펜(triterpene) 배당체로서 펜타사이클릭 트리테르펜(pentacyclic triterpene)으로 베타-아미린(β-amyrin) 계열에 속하며 18베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)과 2분자의 글루쿠론산(glucuronic acid)으로 구성되어 있다.Chemically, glycyrrhizin is a triterpene glycoside, a pentacyclic triterpene, belonging to the beta-amyrin family and 18beta-glycyrrhetinic acid, 18β- GA) and two molecules of glucuronic acid.

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캔디다 알비칸스(C. albicans)는 다형태성 진균(polymorphic fungus)으로 숙주 내 감염부위에서 효모형태(yeast form), 균사(hyphae)와 가균사(pseudohyphae) 등의 형태로 성장하며, 영양분이 열악한 환경에서는 클리미디아(Chlamydia)를 형성하여 잠복하는 경우도 있다. 그리고 캔디다 종 중에서 가장 감염률이 높은 진균으로 당뇨병 환자나 결핵환자 같은 소모성 질환자, 암환자, 후천성면역결핍(AIDS) 환자처럼 면역기능이 감소되었거나 결핍된 환자에게 특히 치명적이다(Edwards, J.E., N. Engl . Med., 324, 1060. 1991; Bodey, G.P., J. Hosp . Infect . 11: 411, 1998; Anttila, V.J., et al., Clin . Infect . Dis ., 18, 979, 1994; Komshian, S.V., et al., Rev . Infect . Dis., 11, 379, 1989). 또한 면역기능이 정상인 건강한 여성의 경우에도 캔디다 알비칸스 기인성 질염으로 많은 문제가 야기되며(Sobel, J.D., Am . J. Obstet . Gynecol ., 152, 924, 1985), 이 중 캔디다 질염은 전체 여성의 75% 이상이 일생에 최소 한 번씩 감염을 경험하는 것으로 보고되었고 이 중 약 50%는 완치된 후에 재발되기도 한다(Sobel, J.D., Ann. N. Y. Acad. Sci., 544, 547, 1988). 치료약물로는 폴리엔(polyene) 계열의 암포테리신(amphotericin) B와 아졸(azole) 계열의 플루코나졸(fluconazole), 케토코나졸(ketoconazole) 등이 사용되나 완치율이 낮고 내성이 높아서 치료 후에도 재발률이 높고 신독성과 같은 부작용 때문에 새로운 약물의 발견과 새로운 치료방법의 개발이 요구되고 있다. 캔디다증(candidiasis)에 대한 면역기전은 아직까지 확실하게 규명되지 않았으나, 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis)의 치료에 있어 체액성 면역에 의한 항체요법에 대해서는 찬반 양론이 있으나, 1990년 중반부터 항체에 대한 찬성 이론이 구 체화된 바 있다(Han, Y. and Cutler, J.E., Infect. Immun., 63, 2714, 2005; Cutler, J.E., Curr. Mol. Med., 5, 383, 2005). 그러나, 이와 같은 결론이 모든 항체가 효과가 있는 것을 의미하지는 않으며, 기존의 항체요법이 효능이 없다는 학술적 견해도 타당성이 있는 것으로 생각된다. 그 이유는 모든 항캔디다 항체가 효과가 있는 것은 아니며 오직 특정항원으로 유도된 좋은 항체(good antibody)만이 효과가 있다고 생각할 수 있기 때문이다. Candida albicans ( C. albicans ) is a polymorphic fungus that grows in the form of yeast, hyphae and pseudohyphae at the site of infection in the host, and has a poor nutrient environment. In some cases, Chlamydia is formed and latent. It is the most infectious fungus of the Candida species, and is particularly fatal for patients with reduced or deficient immune functions, such as consumable diseases such as diabetics, tuberculosis patients, cancer patients, and AIDS patients (Edwards, JE, N. Engl). .. Med, 324, 1060. 1991 ; Bodey, GP, J. Hosp Infect 11:.. 411, 1998; Anttila, VJ, et al ., Clin . Infect . Dis . , 18, 979, 1994; Komshian, SV, et al., Rev. Infect . Dis ., 11, 379, 1989). In addition, Candida albicans-induced vaginitis causes many problems in healthy women with normal immune function (Sobel, JD, Am . J. Obstet . Gynecol ., 152, 924, 1985). More than 75% have been reported to experience infection at least once in their lifetime, with about 50% recurring after complete recovery (Sobel, JD, Ann. NY Acad. Sci., 544, 547, 1988). Therapeutic drugs include polyene-type amphotericin B and azole-type fluconazole and ketoconazole, but they have low cure rate and high resistance, resulting in high recurrence rate and high toxicity. Adverse events such as performance require the discovery of new drugs and the development of new treatments. The mechanism of immunity to candidiasis has not been elucidated so far, but there are pros and cons for antibody therapy by humoral immunity in the treatment of disseminated candidiasis , but it has been in favor of antibodies since mid-1990. Theories have been embodied (Han, Y. and Cutler, JE, Infect. Immun ., 63, 2714, 2005; Cutler, JE, Curr. Mol. Med., 5, 383, 2005). However, this conclusion does not mean that all antibodies are effective, and the scientific view that existing antibody therapies are ineffective seems to be valid. The reason is that not all anti-candida antibodies are effective; only good antibodies derived from specific antigens can be considered effective.

캔디다 질염에서는 체액성 면역과 세포매개성 면역이 모두 관여하는 것으로 추정된다. 생쥐 질속에 약화 캔디다 알비칸스(C. albicans)를 면역시킨 후 동일균으로 감염시켰을 때 체액성 면역 및 국소적 세포성 면역 효과가 있으며(Fidel, P.L., et al., Infect. Immun., 63, 547., 1995; Fidel, P.L., et al., Infect. Immun., 61, 1990, 1993), 난소를 제거하고 에스트로겐(estrogen)으로 처리한 흰쥐(rat)에 항-캔디다 만난 항체(anti-Candida mannan antibody)를 수동면역 방법으로 투여했을 경우에도 캔디다성 질감염에 효과가 있다는 것이 보고되었다(Cassone, A., et al., Infect. Immun., 63, 2619, 1995). 캔디다 알비칸스(C. albicans)의 세포벽 물질인 포스포만난 복합체(phosphomannan complex; PMC)를 리포솜(liposome)에 삽입한 백신제형으로 생쥐를 면역시키고 캔디다 알비칸스(C. albicans)로 전신 또는 질속에 감염시켰을 때 효과가 있으며(Han, Y. and Cutler, J.E., Infect. Immun., 63, 2714. 1995; Han, Y. et al., J. Infect. Dis., 179, 1477, 1999), 리포솜 백신으로 면역된 생쥐로부터 B6.1 단항체(monoclonal antibody)를 분리하여 수동면역 방법으로 그 효과를 측정하였을 때 파종성 캔디다 증과 캔디다 질염에도 효과가 있다는 것이 보고된 바 있다(Han, Y., et al., Infect. Immun. 66, 5771, 1998). 기전규명에서는 파종성 캔디다증의 경우는 B6.1 단항체가 옵소닌 효과에 의한 호중구(neutrophil)의 탐식작용을 증진시키고(Caesar-TonThat, T.C. and Cutler, J.E., Infect. Immun., 65, 5354, 1997), 보체계(complement system)가 관여한다는 것이 규명되었다(Han, Y., et al., J. Immunol., 167, 1550, 2001). 캔디다 질염에 대한 B6.1 단항체의 이러한 예방효과 작용기전은 구체화 되지는 못했으나 보체계가 관여하는 것으로 추정되고 있다. 이와 같이 항체 예방 및 치료 효과가 있는 B6.1 단항체는 PMC의 구조(도 2)에서 산성에 불안정한(acid-labile) 부위의 베타-1,2-트리만노스(b-1,2-trimannose)에 항원 특이성이 있는 반면, 효과가 없는 항캔디다 알비칸스(anti-C. albicans) 단항체는 PMC의 산성안정(acid-stable) 부위에 항원성이 있는 것으로 규명되어 진균에 대한 항체효과에 관해서 이른바, "좋은 및 나쁜 항체(good and bad antibody)"의 이론이 정립되었다. Candida vaginitis is thought to be involved in both humoral and cell-mediated immunity. After weakening the immune Candida albicans (C. albicans) in the rat vagina when sikyeoteul infection with the same strain that humoral immunity and local cellular immune effect and (Fidel, PL, et al. , Infect. Immun., 63, 547., 1995; Fidel, PL, et al., Infect. Immun ., 61, 1990, 1993), candida vagina, even when passively administered anti- Candyda mannan antibody to rats treated with ovaries and treated with estrogen. It has been reported to be effective against infections (Cassone, A., et al. , Infect. Immun., 63, 2619, 1995). The body or vagina to immunize mice with a vaccine formulation insert; (PMC phosphomannan complex) to the liposome (liposome) and Candida albicans (C. albicans) Candida albicans cell wall substance is a complex of phospholipase met (C. albicans) Effective when infected (Han, Y. and Cutler, JE, Infect. Immun ., 63, 2714. 1995; Han, Y. et al. , J. Infect. Dis., 179, 1477, 1999), liposomes It has been reported that B6.1 monoclonal antibodies from vaccine-immunized mice were also effective in disseminated candidiasis and candida vaginitis when measured by passive immunoassay (Han, Y., et al. , Infect. Immun. 66, 5771, 1998). According to the mechanism, in case of disseminated candidiasis, B6.1 monoclonal antibody enhances the phagocytosis of neutrophils by opsonin effect (Caesar-TonThat, TC and Cutler, JE, Infect. Immun ., 65, 5354, 1997), it has been identified that the complement system is involved (Han, Y., et al. , J. Immunol., 167, 1550, 2001). The mechanism of this prophylactic effect of B6.1 monoantibodies against candida vaginitis has not been specified, but the complement system is believed to be involved. As described above, the B6.1 monoantibody having an antibody prophylactic and therapeutic effect is beta-1,2-trimannose at an acid-labile site in the structure of PMC (FIG. 2). Anti- C. Albican s monoantibodies , while having antigen specificity, have been shown to be antigenic at the acid-stable site of PMC, and thus have an effect on the antibody effect against fungi. So-called "good and bad antibodies" have been established.

관절염 질환은 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 주로 노화에 의한 퇴행성관절염인 골관절염(osteoarthritis)으로 구분된다. 류마티스 관절염 경우에는 감염이 진행되는 동안 야기되는 일시적 관절염과 항생제요법으로 감염균 제거 후에도 관절염이 지속되는 만성적 경우가 있다. 이런 형태의 관절염을 감염성 관절염(Septic arthritis 또는 Infectious arthritis)이라고 한다. 이와 같은 감염성 관절염은 최근 증가추세에 있으며, 이는 암환자, 당뇨병환자, 간 질환자, 신부전 환자, 저체중 신생아, 장기이식 수술시 면역억제제 사용환자, 후천성 면역결 핍(AIDS) 환자 등의 증가에 기인하는 것으로 알려져 있다(Han, Y., Int. Immunopharmacol., 5, 1049, 2005; Cuende, E., et al., Semin. Arthritis Rheum., 22, 224, 1993). 감염성 관절염의 원인균으로는 세균 중에서는 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)이 가장 대표적이며 진균 중에서는 캔디다 알비칸스(C. albicans)가 주요 원인균으로 보고되고 있다. 특히, 캔디다 알비칸스(C. abicans)로 의한 관절염은 최근 점차 증가하고 있는 추세이다(Lerch, K., et al., Mycoses . 46, 462, 2003; Azaceta, G. et al ., Rev . Rhum . Engl ., 66, 434, 1999). 관절염 치료제로 세균의 경우에는 항생제요법과 항류마티스 약물을 병용하며 진균의 경우에는 아졸(Azole) 계열 약품과 폴리엔(polyene) 계열의 암포테리신(amphotericin) B 등의 항진균제를 단독 또는 병용하여 사용하지만(Choi, I.S., et al ., Transplant Proc ., 32, 1963, 2003), 감염으로 수반되는 관절염의 원인이 아닌 경우에는 류마티스 관절염용 약물만이 사용된다(Lee, D.M. and Weinblatt, M.E., Lancet., 358, 903, 2001; Felson, D.T., et al., Arthritis Rheum., 35, 1117, 1992). Arthritis diseases are divided into rheumatoid arthritis and osteoarthritis, which is mainly degenerative arthritis due to aging. Rheumatoid arthritis is a chronic case of arthritis that persists after the infection is removed due to temporary arthritis and antibiotic therapy that occurs during the course of infection. This form of arthritis is called Septic arthritis or Infectious arthritis. Infectious arthritis has recently been on the rise, due to an increase in cancer patients, diabetics, liver disease, renal failure patients, underweight newborns, immunosuppressive patients during organ transplantation, and AIDS patients. (Han, Y., Int. Immunopharmacol ., 5, 1049, 2005; Cuende, E., et al. , Semin.Arthritis Rheum., 22, 224, 1993). Staphylococcus aureus is the most common causative agent of infectious arthritis, and Candida albicans is the major causative agent among fungi. In particular, arthritis caused by Candida albicans ( C. abicans ) has been increasing recently (Lerch, K., et al. , Mycoses . 46, 462, 2003; Azaceta, G. et al . , Rev. Rhum . Engl ., 66, 434, 1999). In the case of bacteria, antibiotics and anti-rheumatic drugs are used in the case of bacteria, and in the case of fungi, antifungal agents such as azole drugs and polyene-based amphotericin B are used alone or in combination. But (Choi, IS, et al . , Transplant Proc ., 32, 1963, 2003), only drugs for rheumatoid arthritis are used unless the cause of arthritis accompanying infection (Lee, DM and Weinblatt, ME, Lancet., 358, 903, 2001; Felson , DT, et al ., Arthritis Rheum ., 35, 1117, 1992).

DMARD(disease-modifying anti-rheumatic drug)의 사용은 완치율이 낮고, 약물투여 중단시에는 재발과 함께 악화될 위험이 높으며, 신독성 및 간독성 등의 부작용 발생과 장기 복용 시 약물에 대한 내성 및 기회감염의 증가로 사용이 제한적이다(Lee, D.M. and Weinblatt, M.E., Lancet ., 358, 903, 2001; Felson, D.T., et al., Arthritis Rheum., 35, 1117, 1992; Bauer, H. and Marker-Hermann, E., Orthopade., 32, 1088, 2003). 또한, 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti- inflammatory drug, NSAID)들의 약물사용에도 관절염 진행 병변인 통증과 경직성 감소효과 이외에는 연골조직보호와 같은 근본적인 치료는 기대할 수 없고, Cyclooxygenase-1(COX-1) 효소까지 함께 억제하기 때문에 위장관 장애, 간기능과 신장기능의 감소, 고혈압 발생 등의 부작용이 발생할 수 있다(Bauer, H. and Marker-Hermann, E., Orthopade ., 32, 1088, 2003). 따라서, 이러한 기존 치료제의 부작용과 단점 때문에 감염성 또는 퇴행성관절염 같은 난치성 염증치료에 부작용이 적고 효과가 높은 새로운 물질 발견의 필요성이 요구되고 있다.Use of DMase (disease-modifying anti-rheumatic drug) has a low cure rate, high risk of recurrence with relapse when drug is discontinued, side effects such as nephrotoxicity and hepatotoxicity, and drug resistance and opportunistic infections for long-term use. The use is limited due to the increase in (Lee, DM and Weinblatt, ME, Lancet ., 358, 903, 2001; Felson, DT, et. al ., Arthritis Rheum ., 35, 1117, 1992; Bauer, H. and Marker-Hermann, E., Orthopade., 32, 1088, 2003). In addition, the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), in addition to the pain and stiffness-reducing effects of arthritis progression, can not be expected to treat fundamental treatments such as cartilage tissue protection. Cyclooxygenase-1 (COX-1) Inhibition of enzymes may also cause side effects such as gastrointestinal disorders, decreased liver and kidney function, and hypertension (Bauer, H. and Marker-Hermann, E., Orthopade ., 32, 1088, 2003). Therefore, the side effects and disadvantages of these existing therapeutic agents, there is a need for the discovery of a new material having a low side effect and high effectiveness in the treatment of refractory inflammation such as infectious or degenerative arthritis.

이에, 본 발명자들은 다양한 종류의 배당체에 대한 면역반응 유도성을 평가하던 중에서 감초의 지표성분으로 알려진 글리시린진(glycyrrhizin)의 아글리콘(aglycone)인 18β-GA는 저농도에서는 T-세포 및 B-세포의 증식을 증가시키고, 캔디다 알비칸스 세포벽 성분(C. albicans cell wall, CACW)과 함께 제조된 백신제형(CACW/18β-GA)은 항-캔디다 알비칸스(anti-C. albicans antibody) 생성을 증진시키고, Th1 면역반응 우세성을 유도하며, 파종성 캔디다증 동물모델에서 상기 백신제형으로 면역된 생쥐의 생존률을 증진시켜 면역보조제로 사용할 수 있고, 비교적 높은 농도에서는 관절염 부위에 유입된 대식세포로부터 산화 질소(Nitric Oxide, NO) 생성을 억제하고 CD4+ T-림프구를 제거함으로써 관절염 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors, while evaluating the induction of immune response to various types of glycosides, 18β-GA, which is an glyc glycerin (aglycone) known as an index component of licorice, is low in T-cells and B- Increases cell proliferation and enhances Candida albicans cell wall component ( C. albicans) Vaccine formulations (CACW / 18β-GA) prepared with cell wall (CACW) are anti-candida albicans (anti-C. albicans antibody), and can be used as an adjuvant by increasing the survival rate of mice immunized with the vaccine formulation in the disseminated candidiasis animal model, and at high concentrations. The present invention was completed by recognizing that nitric oxide (NO) production from phagocytes and removing CD4 + T-lymphocytes can be usefully used as an agent for preventing and treating arthritis.

본 발명의 목적은 18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)을 함유하는 면역조절제, 면역보조제, 또는 관절염 예방 및 치료제를 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide an immunomodulator, an adjuvant, or an arthritis prevention and treatment containing 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA).

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)을 함유하는 면역조절제를 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides an immunomodulator containing 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA).

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 조절방법을 제공한다.The present invention also provides a method of immunomodulation comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of 18β-GA.

또한, 본 발명은 18β-GA를 함유하는 면역보조제를 제공한다.The present invention also provides an adjuvant containing 18β-GA.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA 및 CACW의 혼합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 보조방법을 제공한다.The present invention also provides an immunoadjuvant method comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a mixture of 18β-GA and CACW.

또한, 본 발명은 18β-GA를 함유하는 관절염 예방 및 치료제를 제공한다.The present invention also provides an agent for preventing and treating arthritis containing 18β-GA.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA를 관절염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method for treating arthritis comprising administering a pharmaceutically effective amount of 18β-GA to a subject having arthritis.

아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA를 관절염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염 예방방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing arthritis, comprising administering a pharmaceutically effective amount of 18β-GA to a subject having arthritis.

본 발명의 감초로부터 분리한 18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)는 적용되는 농도에 따라 T-림프구 및 B-림프구 증식을 조절하여 면역조절제로서 사용될 수 있고, 항원인 캔디다 알비칸스 세포벽(Candida albicans cell wall, CACW)과의 혼합물(CACW/18β-GA)은 항-캔디다 알비칸스 항체(anti-C. albicans antibody) 생성을 증진시키고, Th1 면역반응 우세성을 유도하며, 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis) 동물모델에서 상기 백신제형으로 면역된 생쥐의 생존률을 증진시킴으로써 진균 백신에 "좋은 항체(good antibody)"를 유도하는 면역보조제로 사용될 수 있으며, 관절염 부위에 유입된 대식세포로부터 일산화 질소(Nitric Oxide, NO) 생성을 억제하고 CD4+ T-림프구를 억제함으로써 관절염 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA) isolated from licorice of the present invention can be used as an immunomodulator by regulating T-lymphocyte and B-lymphocyte proliferation according to the applied concentration. Mixture with Candida albicans cell wall (CACW) (CACW / 18β-GA) enhances production of anti- C. Albicans antibodies, induces Th1 immune response predominance, It can be used as an adjuvant to induce "good antibodies" in fungal vaccines by enhancing the survival rate of mice immunized with the vaccine formulation in a disseminated candidiasis animal model, and macrophages introduced into arthritis sites. By inhibiting the production of nitric oxide (Nitric Oxide, NO) from CD4 + T-lymphocytes can be usefully used as a preventive and therapeutic agent for arthritis.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA)을 함유하는 면역조절제를 제공한다.The present invention provides an immunomodulatory agent containing 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA).

본 발명의 18β-GA는 감초의 성분인 글리시린진(glycyrrhizin)으로부터 당을 제거한 아글리콘(aglycone)인 것을 특징으로 하고, 이는 직접 제조한 것 또는 구입한 것 모두 이용가능하다.18β-GA of the present invention is characterized by being aglycone from which sugar is removed from glycyrrhizin, which is a component of licorice, which is either directly manufactured or purchased.

본 발명자들은 18β-GA가 T-림프구 및 B-림프구의 증식에 대한 효과를 알아보기 위해, 상기 림프구들의 증식을 유도하는 Con A(Concanavaline A) 또는 LPS(Lipopolysaccharide)로 처리된 생쥐의 비장세포(splenocyte)에 다양한 농도의 18β-GA를 첨가한 후 세포 정량 키트를 이용하여 세포증식 정도를 측정하였다. 그 결과, 세포증식의 정도는 Con A로 증식된 T-림프구 및 LPS로 증식된 B-림프구에서 모두 18β-GA의 농도의존적으로 감소하였다. 18β-GA를 비당부로 함유하고 있는 글리시리진(glycyrrhizin)은 상기와 같은 방법의 실험에서 18β-GA와 동일한 효과가 없음을 확인함으로써 화학적 구조가 유사하더라도 당의 결합이 상기 효과에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있었다. 따라서 18β-GA은 고농도에서 비장 림프구에 독성이 있으나 20 mM 이하의 농도에서는 T-림프구 및 B-림프구의 증식 효과가 있음을 확인함으로써 면역조절제로 사용될 수 있음을 알 수 있다(도 3, 도 4 및 도 5 참조). In order to determine the effect of 18β-GA on the proliferation of T-lymphocytes and B-lymphocytes, the present inventors have found that splenocytes of mice treated with Con A (Concanavaline A) or LPS (Lipopolysaccharide), which induce proliferation of the lymphocytes ( Splenocytes were added to various concentrations of 18β-GA, and then cell proliferation was measured using a cell quantitative kit. As a result, the degree of cell proliferation decreased in a concentration-dependent manner of 18β-GA in both T-lymphocytes grown with Con A and B-lymphocytes grown with LPS. Glycyrrhizin, which contains 18β-GA as a non-sugar, confirmed that the same effect as 18β-GA was not found in the experiments of the method described above, indicating that sugar binding plays an important role in the effect even though the chemical structure is similar. Could. Therefore, it can be seen that 18β-GA may be used as an immunomodulator by confirming that it is toxic to splenic lymphocytes at high concentrations but has a proliferative effect of T-lymphocytes and B-lymphocytes at concentrations below 20 mM (FIGS. 3 and 4). And FIG. 5).

또한, 본 발명은 18β-GA를 함유하는 면역보조제를 제공한다.The present invention also provides an adjuvant containing 18β-GA.

상기 18β-GA는 캔디다 알비칸스 세포벽(Candida albicans cell wall, CACW)과 혼합한 백신 제형으로 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.The 18β-GA is a Candida albicans cell wall (Candida albicans cell wall, CACW) preferably used in the vaccine formulation were mixed, but not always limited thereto.

본 발명의 면역보조제는 항-캔디다 알비칸스 항체(anti-Candida albicans antibody) 생성을 증진시키는 것을 특징으로 한다.The adjuvant of the present invention is an anti-Candida albicans antibody (anti- Candida) albicans antibody).

본 발명자들은 18β-GA와 항원 성분으로 CACW를 섞은 혼합액을 유화제 형태로 백신 제형을 제조하여 생쥐에 면역접종을 한 후 재접종을 하였고, 양성대조군으 로 CFA(Complete Freund's Adjuvant)를 사용하였다. 면역된 생쥐의 꼬리동맥에서 피를 수집하여 혈청만을 분리하여 혈청에 대한 항-CACW 항체의 증진 여부를 ELISA 방법으로 검색하였다. 그 결과, 상기 혼합물은 항-캔디다 알비칸스 항체(anti-C. albicans antibody)생성증진 효과가 있으며, 양성대조군인 CFA보다 항체생성증진 효과가 높음을 확인하였다. 18β-GA만을 투여한 대조군에서 수집된 혈청에서는 상기 항체가 유도되지 않았고, 18β-GA 첨가 없이 CACW 단독으로 면역된 생쥐에서 생성된 항체생성보다 혼합물의 항체생성이 2배 이상 높아서 18β-GA가 면역보조제 효능이 있음을 알 수 있다(도 6, 도 7 및 도 8 참조). The present inventors prepared a vaccine formulation in the form of an emulsifier using a mixture solution of 18β-GA and CACW as an antigen component, and immunized mice, and then re-inoculated them, and used CFA (Complete Freund's Adjuvant) as a positive control. Blood was collected from the tail artery of the immunized mice and serum was isolated to check for enhancement of anti-CACW antibody against serum by ELISA method. As a result, the mixture has an anti- C. Albicans antibody (producing anti- C. Albicans antibody) generating effect, it was confirmed that the antibody generating effect is higher than the positive control CFA. In the serum collected from the control group treated with only 18β-GA, the antibody was not induced, and the antibody production of the mixture was more than two times higher than that produced in mice immunized with CACW alone without addition of 18β-GA. It can be seen that there is an adjuvant efficacy (see FIGS. 6, 7 and 8).

본 발명의 면역보조제는 Th1 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 한다.The adjuvant of the present invention is characterized by inducing a Th1 immune response.

본 발명자들은 상기 백신제형으로 처리한 생쥐의 혈액을 수집하여 항원 CACW에 대한 항체(anti-CACW)의 종류를 ELISA 키트를 사용하여 IgG 아이소타입핑(isotyping)을 하였다. 또한, 대표적인 Th1 사이토카인 IFNg와 대표적인 Th2 사이토카인 IL-4의 생성 유무를 ELISA 방법을 사용하여 사이토카인 프로파일을 검색하여 18β-GA 관여에 따른 생성 정도를 비교하였다. 평가방법은 IgG 아이소타입핑에서는 IgG1 : IgG2a 또는 IgG1 : IgG2b의 비율을 비교하고, 상기 결과를 사이토카인 프로파일의 결과와 상호 비교하여 평가하였다. 그 결과, 18β-GA를 CACW와 함께 첨가한 경우에는 18β-GA를 첨가하지 않은 경우에 비해서 IFNg의 생성이 70% 이상 생성되는 반면에 IL-4의 생성은 오히려 대략 25% 정도 감소하였다. 따라서 18β-GA는 면역보조제로서 항체생성을 증진하는 동시에 Th1 면역반응을 유도함을 알 수 있었다. 그리고, IgG 아이소타이핑으로 T-세포의 면역유도성을 평가했을 때, 18β-GA의 Th1으로의 면역 유도성이 확인되었다. 또한, CACW를 항원으로 이용한 실험에서 대조군으로 CACW만으로 면역시킨 군 또는, 기존의 면역보조제인 Alum 또는 CFA로 면역시킨 군에 비해 18β-GA를 넣어 면역시킨 군에서 상대적으로 Th1 면역반응을 더 많이 유도하였고, 18β-GA를 넣어 면역시킨 군은 대조군 또는 다른 군과 비교하였을 때 IgG2a 또는 IgG2b 항체 생성도 증가한 결과를 보여주었다(도 9, 도 10, 표 1 및 표 2 참조). 따라서 CACW/18βb-GA 백신제형은 항체 생성의 증가효과와 함께 숙주 내 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis) 발병시 유도되는 Th2 면역반응을 전환시켜 Th1 면역반응을 유도하는 것을 알 수 있다. The present inventors collected the blood of the mice treated with the vaccine formulation and subjected to IgG isotyping using the ELISA kit for the type of antibody (anti-CACW) against the antigen CACW. In addition, the presence or absence of representative Th1 cytokine IFNg and representative Th2 cytokine IL-4 were detected by using an ELISA method to compare cytokine profiles. The evaluation method was evaluated by comparing the ratio of IgG1: IgG2a or IgG1: IgG2b in the IgG isotype, and comparing the results with those of the cytokine profile. As a result, when 18β-GA was added together with CACW, the production of IFNg was 70% or more while the production of IL-4 was decreased by approximately 25% compared to the case where 18β-GA was not added. Therefore, it can be seen that 18β-GA enhances antibody production as an adjuvant and induces Th1 immune response. And when immuno-induction of T-cells was evaluated by IgG isotyping, the induction of 18β-GA to Th1 was confirmed. In addition, in the experiment using CACW as an antigen, the group immunized with CACW alone or the group immunized with 18β-GA compared to the group immunized with Alum or CFA, which is a conventional adjuvant, induce more Th1 immune response. In addition, the group immunized with 18β-GA showed an increase in IgG2a or IgG2b antibody production as compared with the control group or other groups (see FIGS. 9, 10, Table 1 and Table 2). Therefore, it can be seen that CACW / 18βb-GA vaccine formulation induces Th1 immune response by switching Th2 immune response induced in the onset of disseminated candidiasis along with an increase in antibody production.

본 발명의 면역보조제는 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis)을 감염시킨 동물모델의 생존률을 증진시키는 것을 특징으로 한다.The adjuvant of the present invention is characterized by enhancing the survival rate of an animal model infected with disseminated candidiasis.

본 발명자들은 CACW/18β-GA 백신 제형이 생쥐에서 항-캔디다 항체 생성을 많이 유도한다고 하더라고 보호효과가 없으면 그 의미가 없기 때문에 설정된 파종성 캔디다증 동물모델에서의 효과를 검증하였다. 실험에 사용된 동물(BAL/c mice)을 네 그룹으로 분류하여 18β-GA 단독 또는 CACW와 혼합한 제형인 CACW/18β-GA, CACW 단독을 각각 면역접종을 한 후 캔디다 알비칸스(C. albicans)로 감염시키고 각 그룹 생쥐의 생존시간을 측정하였다. 그 결과, 희석액(DPBS: 음성대조군), 18β-GA, CACW, 또는 CACW/18β-GA 등으로 면역된 각 생쥐그룹의 생존시간은 CACW/18β-GA로 면역된 생쥐그룹이 가장 높았으며 그 생존률은 50%를 나타냈다(도 11 참조). 상기 실험결과를 확인하기 위해 기존의 상업적으로 사용되는 면역보조제인 CFA와 Alum를 사용하여 CACW/18β-GA의 결과와 비교한 결과, CACW/18β-GA 제형만 파종성 캔디다증에 보호효과가 있었으며, CFA 또는 Alum을 보조제로 사용한 경우에는 항원으로 CACW 단독으로 사용한 경우의 생존율과 거의 동일하여 효과가 없는 것으로 판정되었다(도 12 참조). 따라서 18β-GA는 항캔디다 알비칸스 백신 제조시에 보조제로서의 효능이 있는 것을 알 수 있다.The present inventors have verified that the CACW / 18β-GA vaccine formulation induces a lot of anti-candida antibody production in mice, but the effect in the established disseminated candidiasis animal model is meaningless without the protective effect. Animals used in the experiment (BAL / c mice) were classified into four groups and immunized with CACW / 18β-GA and CACW alone, which were either 18β-GA alone or CACW, and then Candida albicans ( C. albicans). ) And the survival time of each group of mice was measured. As a result, the survival time of each group of mice immunized with diluent (DPBS: negative control), 18β-GA, CACW, or CACW / 18β-GA was the highest in the mice group immunized with CACW / 18β-GA and their survival rate. Represents 50% (see FIG. 11). As a result of comparing the results of CACW / 18β-GA using the conventional commercially available immunoadjuvant CFA and Alum to confirm the experimental results, only CACW / 18β-GA formulations had a protective effect on disseminated candidiasis. In the case of using CFA or Alum as an adjuvant, it was determined that the effect was almost the same as the survival rate when using CACW alone as an antigen (see FIG. 12). Therefore, it can be seen that 18β-GA is effective as an adjuvant in the preparation of anti-Candida albicans vaccine.

또한, 본 발명은 18β-GA을 함유하는 관절염 예방 및 치료제를 제공한다.The present invention also provides an agent for preventing and treating arthritis containing 18β-GA.

본 발명자들은 정립된 관절염 동물모델(Han, Y., Int. Immunopharmacol. 5, 1049, 2005)을 사용하여 18β-GA의 캔디다 알비칸스(C. albicans) 기인성 관절염 효과를 검색하였다. 예방효과 검색에서는 18β-GA를 먼저 투여한 후 족부종을 유발을 위해 CACW와 CFA 혼합물(CACW/CFA)을 생쥐 뒷발바닥에 피하주사하였고, 치료효과 검색에서는 CACW/CFA을 접종한 후에 18β-GA를 투여하였다. 족부종 정도는 3일에 한 번씩 다이알 캘리퍼 게이지(dial caliper gage)로 측정하였다. 예방효과를 조사한 결과, 18β-GA로 투여받은 생쥐는 성분 대신에 DPBS를 투여받은 대조군에 비해서 족부종이 감소되었고, 항관절염 효과는 30일 관찰기간 종료 때까지 음성대조군 생쥐의 족부종에 비해 억제 정도가 전반적으로 지속적으로 유지됨을 알 수 있었다. 치료효과를 조사한 결과, 역시 항관절염 효과가 검색되었고, 족부종 염증이 가장 높게 나타나는 6일부터 18일까지의 기간 동안에 음성대조군에 비해 대략 20% 정도의 감소가 유지된다는 것을 알 수 있었다(도 13 참조). We used an established arthritis animal model (Han, Y., Int. Immunopharmacol . 5, 1049, 2005) to search for the effect of C. albicans attributable arthritis of 18β-GA. In the prophylactic effect test, 18β-GA was administered first, and then CACW and CFA mixture (CACW / CFA) was injected subcutaneously in the back of the mouse to induce foot edema. Was administered. The degree of foot edema was measured every three days with a dial caliper gage. As a result of prophylaxis, mice treated with 18β-GA had reduced foot edema compared to the control group treated with DPBS instead of the components, and the antiarthritis effect was less inhibited than the foot edema of the negative control group until the end of the 30-day observation period. It is found that is maintained continuously throughout. As a result of examining the therapeutic effect, the anti-arthritis effect was also detected, and it was found that the reduction of about 20% was maintained compared to the negative control group during the period of 6 to 18 days when the foot edema inflammation was the highest (Fig. 13). Reference).

관절염 형성과정에서는 대식세포, B-림프구, 비만세포 및 섬유아세포-유사 활막세포(fibroblast-like synoviocyte) 등의 과다 활성으로 인해 분비되는 염증유 발물질이 관여하고(Kinne, R.W., et al., Arthritis Res ., 2, 189, 2000; Nissler, K., et al., Ann. Rheum. Dis., 63, 1470, 2004; Paniagua, R.T., et al., J. Clin. Invest., 116, 2633, 2006), CD4+ T-림프구 증식에서 발생되는 염증성 사이토카인 분비에 기인하는 것으로 보고되고 있다(Colic, M., et al., Phytomedicine. 9, 117, 2002; Gao, X., et al ., Biochem . Pharmacol., 66, 2427, 2003).Arthritis formation involves inflammatory mediators secreted by excessive activity of macrophages, B-lymphocytes, mast cells and fibroblast-like synoviocytes (Kinne, RW, et. al ., Arthritis Res ., 2, 189, 2000; Nissler, K., et al ., Ann. Rheum. Dis., 63, 1470, 2004; Paniagua, RT, et al ., J. Clin. Invest., 116, 2633, 2006), reported to be due to inflammatory cytokine secretion resulting from CD4 + T-lymphocyte proliferation (Colic, M., et. al ., Phytomedicine . 9, 117, 2002; Gao, X., et al . , Biochem . Pharmacol ., 66, 2427, 2003).

본 발명의 관절염 예방 및 치료제는 T-림프구를 억제하는 것을 특징으로 한다.Arthritis prevention and treatment agent of the present invention is characterized by inhibiting T-lymphocytes.

최근에는 CD4+ T-림프구가 관절염 유발에 관여하는 것으로 보고되어서, 임상실험에서는 항-CD4+ 단항체(monoclonal antibody)를 관절염 치료제로 적용하고자 하는 추세이다(Pohlers, D., et al., Clin. Exp. Immunol., 135, 409, 2004; Nissler, K., et al., Ann. Rheum. Dis., 63, 1470, 2004). 이를 근거로 해서 본 발명자들은 18β-GA의 T-림프구에 대한 효과를 항-CD4+ 단항체(monoclonal antibody)를 사용하여 검색하였다. 그 결과, 항-CD4+ 단항체를 투여받은 생쥐의 족부종이 단항체를 처리하지 않은 음성대조군의 족부종 결과에 비교할 때, 현저하게 족부종 감소가 관찰되었다(도 15 참조). 항-CD4+ 단항체의 예방 및 치료효과는 통계적으로 거의 유사하지만 18β-GA와는 다소 차이점이 있었다. 항-CD4+ 단항체의 효과와 18β-GA의 효과의 절대비교는 어렵지만 효과의 패턴(pattern) 상으로 비교할 때 의미가 있다(도 16 및 도 17 참조). 따라서 18β-GA는 면역세포인 CD4+ T-림프구의 증식의 억제에 의해서 항관절염 효과가 있음을 알 수 있다. Recently, CD4 + T-lymphocytes have been reported to be involved in the induction of arthritis, and clinical trials have tended to apply anti-CD4 + monoclonal antibodies as a therapeutic agent for arthritis (Pohlers, D., et al ., Clin.Exp . Immunol ., 135, 409, 2004; Nissler, K., et al ., Ann. Rheum. Dis., 63, 1470, 2004). Based on this, we searched for the effect of 18β-GA on T-lymphocytes using anti-CD4 + monoclonal antibody. As a result, a significant reduction in foot edema was observed in the foot edema of mice receiving anti-CD4 + monoantibody compared to the foot edema result of the negative control group not treated with the monoantibody (see FIG. 15). The prophylactic and therapeutic effects of anti-CD4 + monoantibodies were statistically similar but somewhat different from 18β-GA. The absolute comparison of the effect of the anti-CD4 + monoantibody and the effect of 18β-GA is difficult but meaningful when compared in terms of the pattern of the effect (see FIGS. 16 and 17). Therefore, it can be seen that 18β-GA has an antiarthritis effect by suppressing the proliferation of CD4 + T-lymphocytes, which are immune cells.

본 발명의 관절염 예방 및 치료제는 관절염 부위에 유입된 대식세포로부터 산화 질소(Nitric Oxide, NO) 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다.Arthritis prevention and treatment agent of the present invention is characterized by inhibiting the production of nitric oxide (Nitric Oxide, NO) from macrophages introduced into the arthritis site.

본 발명자들은 18β-GA의 항관절염 효과의 작용기전을 알아보기 위해 관절염 염증부위로 이동되어 부종을 유발하는 대식세포의 활성에 따른 NO 생성에 대한 18β-GA의 억제효과를 조사하였다. 그 결과, LPS만으로 처리된 대식세포(양성대조군)에 비교할 때 18β-GA로 처리된 대식세포에서의 50 mM 이하의 농도에서는 NO의 생성이 증가하였지만 100 mM 이상의 농도에서 NO의 생성이 억제되는 효과가 있었다. 따라서 관절염부위에 유입된 대식세포들로부터 NO 생성을 억제하여 C. albicans로 인한 관절성 염증을 감소하는 것을 알 수 있다(도 14 참조).The present inventors investigated the inhibitory effect of 18β-GA on the NO production according to the activity of macrophages inducing edema caused by arthritis inflammation site to investigate the mechanism of the anti-arthritis effect of 18β-GA. As a result, compared to LPS-treated macrophages (positive control), NO production was increased at concentrations below 50 mM in macrophages treated with 18β-GA, but NO production was inhibited at concentrations above 100 mM. There was. Therefore, it can be seen that by suppressing NO production from macrophages introduced into the arthritis site, arthritis caused by C. albicans is reduced (see FIG. 14).

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 조절방법을 제공한다.The present invention also provides a method of immunomodulation comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of 18β-GA.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA 및 CACW의 혼합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역 보조방법을 제공한다.The present invention also provides an immunoadjuvant method comprising administering to a subject a pharmaceutically effective amount of a mixture of 18β-GA and CACW.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA를 관절염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염 치료방법을 제공한다.The present invention also provides a method for treating arthritis comprising administering a pharmaceutically effective amount of 18β-GA to a subject having arthritis.

아울러, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 18β-GA를 관절염에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 관절염 예방방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for preventing arthritis, comprising administering a pharmaceutically effective amount of 18β-GA to a subject having arthritis.

본 발명의 면역조절제, 면역보조제 또는 관절염 예방 및 치료제는 18β-GA 또는 CACW/18β-GA에 약학적으로 허용가능한 염을 첨가할 수 있다. 상기 약학적으 로 허용가능한 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 부가염이 유용하다. 적합한 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 나아가, 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 조제될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.The immunomodulator, adjuvant or arthritis prophylactic and therapeutic agent can add pharmaceutically acceptable salts to 18β-GA or CACW / 18β-GA. As the pharmaceutically acceptable salt, addition salts formed by free acid are useful. Suitable free acids can be used organic and inorganic acids, inorganic acids can be hydrochloric acid, bromic acid, sulfuric acid and phosphoric acid and the like, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, Trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, methanesulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, galluxuronic acid, embonic acid, glutamic acid or aspartic acid, and the like. Furthermore, not only pharmaceutically acceptable salts, but also all salts, hydrates and solvates that can be prepared by conventional methods may be included.

본 발명의 면역조절제, 면역보조제 또는 관절염 예방 및 치료제는 임상 투여 시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 치료제는 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여시 주사제, 분무제, 흡입제 및 비강 투여용 조성물 등을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.The immunomodulator, adjuvant or arthritis prevention and treatment agent of the present invention can be administered parenterally during clinical administration and can be used in the form of general pharmaceutical preparations. That is, the therapeutic agent of the present invention may be administered in various parenteral formulations for clinical administration, and when formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants that are commonly used, may be used. It is prepared. Formulations include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories. As the non-aqueous solvent and the suspension solvent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol and gelatin may be used. In parenteral administration, injections, sprays, inhalants, and compositions for nasal administration may be used, but are not limited thereto.

본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 양에 영향을 미치는 인자들로 는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할수록 이 제제를 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.In practicing the methods of the present invention, factors affecting the amount to be administered include, but are not limited to, the mode of administration, frequency of administration, the particular disease being treated, the severity of the disease, the history of the disease, the individual Whether the cooperative treatment is in progress with the therapeutic agent, and the age, height, weight, health, and physical condition of the individual in whom the treatment is in progress. In general, it is desirable to administer this agent in larger amounts as the body weight of the patient undergoing treatment increases.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다. 본 발명의 유효용량은 0.0001 ~ 10 g/㎏이고, 바람직하기로는 0.0001 g ~ 5 g/kg이며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.Dosage units may contain, for example, one, two, three or four times the individual dosage, or they may contain 1/2, 1/3 or 1/4 times. The individual dosage preferably contains an amount in which the effective drug is administered at one time, which usually corresponds to all, 1/2, 1/3 or 1/4 times the daily dose. The effective dose of the present invention is 0.0001 to 10 g / kg, preferably 0.0001 g to 5 g / kg, may be administered 1 to 6 times a day.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by Examples and Experimental Examples.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples and Experimental Examples specifically illustrate the present invention, and the content of the present invention is not limited by the Examples and Experimental Examples.

<< 실시예Example 1> 시약 및 동물의 준비 1> Preparation of reagents and animals

<1-1> 시약의 준비<1-1> Preparation of Reagent

희석액으로 사용된 인산완충용액(DPBS; Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7.4)은 Sigma(St. Louis, USA)에서 구입하여 고압멸균한 후에 사용하였 다. 균 배양에 사용된 글루코오즈(glucose), 효모 추출물(yeast extract), 펩톤(peptone)과 면역보조제와 관절염증 발현을 위해 사용된 CFA(Complete Freund's Adjuvant)와 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant) 모두 Difco에서 구입하여 사용하였으며, BCA protein assay reagent와 면역보조제인 Alum은 Pierce에서 구입하였다. 캔디다 알비칸스(C. albicans) 세포벽의 추출 및 분리에 사용된 투석막(dialysis tubing, membrane cut-off = 12,400 Da), disodium EDTA, trisodium EDTA, b-메르캅토에타놀(mercaptoethanol)과 세포배양에 사용된 RPMI 1640, 우태아 혈청(FBS; fetal bovine serum), 항균 항진균 용액(antibiotic antimycotic solution), 트립신(trypsin)-EDTA, HEPES, 트리판 블루(trypan blue), Con A(concanavaline A), LPS(lipopolysaccharide)와 ELISA에 사용된 peroxidase conjugate-goat anti-mouse polyvalent, Tween 20, OPD(O-phenylenediamine), 탄산완충용액, 황산, 과산화수소, 소혈청 알부민(BSA; bovine serum albumin)과 IgG 아이소타이핑(isotyping)을 위한 생쥐 단항체 아이소타이핑 시약(mouse monoclonal antibody isotyping reagents, ISO-2)와 anti-goat IgG(whole molecule) peroxidase conjugate antibody, 엔도톡신 테스트(endotoxin test)를 위한 LAL(Limulus amebocyte lysate) 테스트 키트, 그리고 그리스 시약(Griess reagent)은 모두 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 사이토카인 프로파일(Cytokine profile)을 위해 DuoSet mouse IL-4와 DuoSet mouse IFNg를 R&D system에서 구입하였으며, 세포독성실험을 위한 Cell counting Kit-8(CCK-8)은 Dojindo Lab(Japan)에서 구입하여 사용하였다. Phosphate buffer solution (DPBS; Dulbecco's phosphate buffered saline, pH 7.4) used as diluent was purchased from Sigma (St. Louis, USA) and used after autoclaving. Glucose, yeast extract, peptone and adjuvant and CFA (Complete Freund's Adjuvant) and Incomplete Freund's Adjuvant (IFA) used to express arthritis are all purchased from Difco. BCA protein assay reagent and Alum, an adjuvant, were purchased from Pierce. Dialysis tubing (membrane cut-off = 12,400 Da), disodium EDTA, trisodium EDTA, b-mercaptoethanol and cell culture used to extract and isolate C. albicans cell walls RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS), antibiotic antimycotic solution, trypsin-EDTA, HEPES, trypan blue, Con A (concanavaline A), LPS (lipopolysaccharide) ) And peroxidase conjugate-goat anti-mouse polyvalent, Tween 20, OPD (O-phenylenediamine), carbonic acid buffer solution, sulfuric acid, hydrogen peroxide, bovine serum albumin (BSA) and IgG isotyping Mouse monoclonal antibody isotyping reagents (ISO-2) and anti-goat whole molecule peroxidase conjugate antibodies, limulus amebocyte lysate (LAL) test kits for endotoxin test, and Greases reagent reagents were all purchased from Sigma. DuoSet mouse IL-4 and DuoSet mouse IFNg were purchased from the R & D system for cytokine profile, and Cell counting Kit-8 (CCK-8) for cytotoxicity test was purchased from Dojindo Lab (Japan). It was.

<1-2> 실험동물의 준비<1-2> Preparation of experimental animals

모든 실험에 사용된 생쥐는 6∼7 주령의 BALB/c 암컷생쥐(Orient Inc.-Charles River Lab, Seoul)를 사용하였고, 구입된 생쥐는 실험실 환경에서 1주일간 적응시킨 후 실험하였으며, 멸균된 필터 장착 케이지(fiter-top cage)에서 사료 및 물을 자유롭게 먹게 하였다. 동물실의 환경은 온도 20±2℃, 습도 50±10%로 유지하였으며, 조명은 12시간 간격으로 밤과 낮을 조절하였다. 모든 동물관리는 동덕여자대학교 동물관리규정에 따라 취급하였다. Mice used in all experiments were BALB / c female mice (Orient Inc.-Charles River Lab, Seoul), 6-7 weeks old, and the mice purchased were acclimated for 1 week in a laboratory environment. Feed and water were fed freely in a fitter-top cage. The environment of the animal room was maintained at a temperature of 20 ± 2 ℃, a humidity of 50 ± 10%, the illumination was controlled day and night at 12 hour intervals. All animal care was handled in accordance with Dongduk Women's University animal care regulation.

<< 실시예Example 2> 균주 및 시료의 준비 2> Strain and Sample Preparation

<2-1> 균주의 배양<2-1> Strain Culture

캔디다 알비칸스(C. albicans) 균주는 이전의 많은 실험에서 특성이 규명된 CA-1 strain, A-9 strain(Han, Y. and Cutler, J.E., J. Infect. Dis., 175, 1169, 1997; Han, Y., et al., Infect. Immun., 66, 5771, 1998; Han, Y., et al., J. Infect. Dis., 179, 1477, 1999; Han, Y., et al., J. Immunol., 167, 1550, 2001)을 사용하였고, 실험 전에 37℃에서 GYEP(Glucose-Yeast Extract-Peptone) 액체배지에서 24시간 간격으로 3회 배양한 후 효모형태(blastoconidial form)의 세포를 원심분리법으로 수집하여 멸균된 인산완충용액(DPBS; pH 7.4; 4℃)으로 3회 이상 세척하여 사용하였다. 생균 세포수 측정(cell counting)은 혈구계수기(hemocytometer, Marienfeld, Germany)를 사용하여 측정하였다. Candida albicans strains were characterized by many CA-1 strains and A-9 strains (Han, Y. and Cutler, JE, J. Infect. Dis., 175, 1169, 1997). Han, Y., et al ., Infect. Immun., 66, 5771, 1998; Han, Y., et al ., J. Infect. Dis., 179, 1477, 1999; Han, Y., et al. ., J. Immunol., 167, 1550, 2001) was used, GYEP (Glucose-yeast Extract-Peptone) was cultured 3 times every 24 hours in a liquid medium of yeast type (blastoconidial form) prior to the experiment at 37 ℃ Cells were collected by centrifugation and washed three more times with sterile phosphate buffer (DPBS; pH 7.4; 4 ° C.). Cell counting was measured using a hemocytometer (hemocytometer, Marienfeld, Germany).

<2-2> 18β-<2-2> 18β- GAGA 의 준비Preparation

18β-GA는 Sigma에서 구입하였으며, 실험에 사용하기 전에 엔도톡신(endotoxin) 오염여부를 상업용 엔도톡신 키트(endotoxin kit)(Sigma)를 사용하여 엔도톡신 혼재유무를 확인한 후 본 실험에 사용하였다. 18β-GA was purchased from Sigma, and was used in this experiment after confirming whether endotoxin was contaminated using a commercial endotoxin kit (Sigma) before using it in the experiment.

<2-3> <2-3> 캔디다알비칸스Candida Albicans 세포벽( Cell wall ( C. C. albiansalbians cellcell wallwall , , CACWCACW )의 추출분리) Extraction Separation

캔디다 알비칸스(C. albians)의 세포벽 분리는 본 연구실에서 보고한 방법을 사용하였다(Han, Y. and Cutler, J.E., J. Infect. Dis., 175, 1169, 1997; Han, Y., et al., Infect. Immun., 66, 5771, 1998; Han, Y., et al., J. Infect. Dis., 179, 1477, 1999; Han, Y., et al., J. Immunol., 167, 1550, 2001). 상기 방법은 GYEP(glucose-yeast extract peptone) 액체배지에 배양한 캔디다 알비칸스(C. albians) 균을 원심분리 방법으로 수집하여 DPBS(4℃)로 세척한 다음에 disodium EDTA(0.1 M; pH 7.5)와 trisodium EDTA(0.1M; pH 9.0)로 연속 처리하고 0.3 M 베타-메르캅토에탄올(b-mercaptoethanol)로 30분 동안 실온에서 처리한 후 상등액을 수집하였다. 수집된 상등액을 투석막(dialysis tubing)에 넣고 멸균된 탈이온수를 사용하여 3일 동안 투석하였다. 투석이 완료된 후 투석막 내부물질을 동결건조(Eyela FD-1000, Tokyo, Japan)하여 분말화시켰다. 분말화된 세포벽은 데시케이터(desiccator)안에 저장보관하고 사용하였다.Cell wall separation of C. albians (Han, Y. and Cutler, JE, J. Infect. Dis., 175, 1169, 1997; Han, Y., et. al ., Infect. Immun., 66, 5771, 1998; Han, Y., et al ., J. Infect. Dis., 179, 1477, 1999; Han, Y., et al. , J. Immunol., 167, 1550, 2001). The method was collected by centrifugation of Candida albicans ( C. albians ) bacteria cultured in a GYEP (glucose-yeast extract peptone) liquid medium and washed with DPBS (4 ℃) and then disodium EDTA (0.1 M; pH 7.5) ) And trisodium EDTA (0.1M; pH 9.0), followed by treatment with 0.3 M beta-mercaptoethanol for 30 minutes at room temperature, and the supernatant was collected. The collected supernatant was placed in dialysis tubing and dialyzed for 3 days using sterile deionized water. After the dialysis was completed, the inside of the dialysis membrane was lyophilized (Eyela FD-1000, Tokyo, Japan) and powdered. The powdered cell walls were stored and used in desiccators.

<< 실험예Experimental Example 1> 18β- 1> 18β- GAGA 의 T-림프구 및 B-림프구 증식 억제효과Inhibitory Effects of T-lymphocytes and B-lymphocytes on Growth

시험성분의 면역조절효과의 일차적 검색을 위해서 T-림프구 및 B-림프구의 증식에 대한 효과를 검색하였다. 6주령의 BALB/c 암컷생쥐에서 비장(spleen)을 적출하고 적혈구 세포용해 완충용액(RBC lysis buffer)로 적혈구를 제거한 후, 비장세포(splenocyte)를 무균조작으로 채취하여 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배양 배지에 현탁하고 96-웰 플레이트(well plate)에 5x106/ml로 분주하였다. Con A(Concanavalin A; 5 mg/ml)와 LPS(lipopolysaccharide; 10 mg/ml)를 처리한 다음에 시험성분(18β-GA, Glycyrrhizin)을 다양한 농도로 처리하고(최종 부피 = 200 ml), 37℃-5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양한 후에 CCK-8을 이용하여 세포증식 정도를 측정하였다. Con A는 T-림프구 증식효과를 검색하기 위한 T-세포 미토겐(mitogen)이며, LPS는 B-림프구에 대한 관여도를 측정하기 위한 B-세포 미토겐이다(Coutinho, A,, Eur. J. Immunol. 7, 325, 1977). CD4+ T-세포 분리는 단일 세포 현탁(single cell suspension) 방법을 사용하였고 세포성장촉진을 위해 항-CD4+ 단항체(PharMingen)를 투여한 후 37℃-5% CO2 배양기에서 48시간 배양하여 사용하였다(Lee, J.H., et al., Vaccine. 25, 3834, 2007). 또한, 글리시리진(Glycyrrhizin, GL)의 T-세포 억제효과를 상기와 동일한 방법으로 검색하였다. 글리시리진은 서울대학교 약학대학 천연물과학연구소로부터 기증받았다.For the primary screening of immunomodulatory effects of test components, the effects on the proliferation of T-lymphocytes and B-lymphocytes were searched. Spleens were extracted from 6-week-old BALB / c female mice, erythrocytes were removed with RBC lysis buffer, and splenocytes were collected aseptically and RPMI containing 10% FBS. It was suspended in 1640 culture medium and aliquoted at 5 × 10 6 / ml in a 96-well plate. Treatment of Con A (Concanavalin A; 5 mg / ml) and LPS (lipopolysaccharide; 10 mg / ml) followed by treatment of test components (18β-GA, Glycyrrhizin) at various concentrations (final volume = 200 ml), 37 After culturing for 72 hours in a C-5% C0 2 incubator, the degree of cell proliferation was measured using CCK-8. Con A is a T-cell mitogen for detecting T-lymphocyte proliferative effects, and LPS is a B-cell mitogen for measuring involvement with B-lymphocytes (Coutinho, A, Eur. J. Immunol . 7, 325, 1977). CD4 + T-cell separation was performed using a single cell suspension method and 48 hours of incubation in a 37 ° C.-5% CO 2 incubator after administration of anti-CD4 + monoantibody (PharMingen) to promote cell growth. (Lee, JH, et al ., Vaccine . 25, 3834, 2007). In addition, the T-cell inhibitory effect of glycyrrhizin (GL) was searched in the same manner as above. Glysirizine was donated by the Institute of Natural Products, College of Pharmacy, Seoul National University.

모든 실험결과는 평균 ± 표준오차(Mean ± S.E.)로 계산하였다. 각 군 간의 유의성 검증은 Student's t-test를 사용하였고 값이 5% 미만일 때에 유의성이 있는 것으로 판정하였다. 또한, 생존률의 유의성은 Kaplan-Meier 방법(New Statics for Windows; SPSS, Chicago, USA)을 사용하여 판정하였다. 모든 실험은 상기와 같은 통계처리 방법을 이용하였다.All experimental results were calculated as mean ± standard error (Mean ± SE). Student's t- test was used to test significance between the groups. The significance of survival was also determined using the Kaplan-Meier method (New Statics for Windows; SPSS, Chicago, USA). All experiments used the same statistical method.

BALB/c 생쥐로부터 비장세포를 분리하여 T-세포 미토겐으로서 Con A를 넣고 다양한 농도의 18β-GA(0, 20, 40, 80, 160 mM)로 처리하였을 때, Con A로 증식(proliferation)된 T-세포들은 저농도에서는 증식이 다소 증가하는 경향을 보이는 반면, 고농도에서는 증식이 농도의존적으로 현저히 감소하였다(도 3). 또한, 비장세포에 B-세포 미토겐으로서 LPS를 넣고 18β-GA를 처리했을 때에도 T-세포 증식과 비슷한 경향으로 20 mM에서는 B-세포가 약간 증식되었고 그 이상의 농도에서는 농도의존적으로 증식이 감소되었으며, 대조군과의 차이는 통계학적으로 유의성이 있었다(P < 0.05)(도 4). 18β-GA은 고농도에서 비장세포에 독성이 있는 것으로 추정되었다. 따라서 18β-GA의 면역보조제 효과를 조사하기 위해서 세포에 독성을 미치지 않기 위해 비교적 낮은 농도를 선택하였다. 한편, 18β-GA를 비당부로 함유하고 있는 글리시리진(glycyrrhizin, GL)의 T-세포 증식에 대한 효과를 조사한 결과 160 mM까지의 다양한 농도에서 T-세포의 증식에 별로 변화가 없었다(도 5). 대조군과 비교해서, 낮은 농도에서는 오히려 다소의 증식이 있었으며 고농도에서는 증식이 다소 감소되는 경향이 있지만 통계학적으로 유의성은 없었다.Splenocytes were isolated from BALB / c mice and added to Con A as T-cell mitogen and treated with Con A at various concentrations of 18β-GA (0, 20, 40, 80, 160 mM) to proliferation. The T-cells showed a tendency to increase slightly at low concentrations, whereas at high concentrations, proliferation was significantly reduced (FIG. 3). In addition, when LPS as B-cell mitogen was added to splenocytes and treated with 18β-GA, B-cell proliferation was slightly increased at 20 mM and concentration-dependently decreased at higher concentrations. , The difference from the control group was statistically significant ( P <0.05) (Fig. 4). 18β-GA was believed to be toxic to splenocytes at high concentrations. Therefore, in order to investigate the effect of 18β-GA adjuvant, a relatively low concentration was chosen to not be toxic to cells. On the other hand, as a result of examining the effect on the T-cell proliferation of glycyrrhizin (GL) containing 18β-GA as a non-sugar, there was no change in the proliferation of T-cells at various concentrations up to 160 mM (Fig. 5). . Compared with the control group, there was a rather slight growth at low concentrations and a tendency to decrease somewhat at high concentrations, but there was no statistical significance.

<< 실험예Experimental Example 2> 항- 2> anti- C. C. albicansalbicans 항체생성 증진효과 Antibody-producing effect

18β-GA의 면역보조제적 효과를 검색하기 위한 백신제형을 제조하기 위해 18 β-GA(1 mg/ml)와 항원성분으로 CACW(1 mg/ml)를 섞은 혼합액 1 ml에 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant; 1 ml)를 첨가하고 유화제 형태로 백신제형을 제조하였다. 양성대조군으로 IFA 대신에 Alum으로 흡착시킨 백신제형을 제조하여 면역보조제 효과를 비교검색하였다. Alum은 미국 FDA에서 승인한 보조제로 현재 보조제 중에서 유일하게 인체에 사용이 승인된 보조제이다(Schmidt, C.S., et al., Expert Rev, Vaccines , 6, 391, 2007). 또 다른 양성대조군으로는 CFA(Complete Freund's Adjuvant)를 사용하였다. 백신제형을 BALB/c 생쥐에 복강으로 1차 면역접종을 한 후, 21일 후에 같은 방법으로 2차 면역접종(booster)을 하였다. 18β-GA 투여량은 100 mg/mouse로 하였고, 2차 면역접종 7일 후에 면역된 생쥐의 꼬리동맥에서 혈액을 수집하여 혈청만을 분리하고 수집한 혈청에 대한 항-CACW 항체의 생성여부를 ELISA 방법으로 검색하였다. ELISA 방법은 본 연구실에서 사용되는 indirect ELISA를 사용하였으며(Lee, J.H. and Han, Y., Int . Immunopharm ., 6, 1424, 2006; Lee, J.H., et al., Vaccine, 25, 3834, 2007), 그 과정은 다음과 같다. 96-웰 플레이트에 항원으로 CACW를 2 mg/well로 코팅한 후, 1% BSA 용액으로 블로킹(blocking)하고 4℃에서 하루동안 방치했다. 그리고 수집한 혈청을 1:100으로 희석하여 항원으로 코팅된 웰(well)에 넣고 37°C 5%-CO2 배양기에서 1시간 동안 배양한 후에 DPBS/0.05% Tween 20 용액과 DPBS 용액으로 세 번씩 세척하였다. 2차 항체로(secondary antibody) peroxidase conjugate-goat anti-mouse polyvalent를 넣어 30분 동안 실온에서 방치하고 같은 방법으로 세척한 후 기질 용액으로 OPD 용 액을 첨가하여 15-30분 동안 반응시켰다. 황산을 투여하여 반응을 정지시키고 ELISA microplate reader(Bio-Lab, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하여 항체 생성정도를 평가하였다. 그리고 항체역가를 측정하기 위해 같은 방법을 사용하였고, 수집한 혈청은 다양한 농도로 계대희석하여 실험을 수행하였다.Incomplete Freund's Adjuvant in 1 ml of a mixture of 18 β-GA (1 mg / ml) and CACW (1 mg / ml) as an antigenic component to prepare a vaccine formulation to detect the adjuvant effect of 18β-GA. 1 ml) was added and the vaccine formulation was prepared in the form of an emulsifier. As a positive control, a vaccine formulation prepared by adsorbing with Alum instead of IFA was prepared and compared with the effect of adjuvant. Alum is a US FDA-approved supplement that is currently the only supplement approved for human use (Schmidt, CS, et. al ., Expert Rev, Vaccines , 6, 391, 2007). Another positive control group was CFA (Complete Freund's Adjuvant). Vaccine formulations were first immunized intraperitoneally to BALB / c mice, followed by secondary immunization (booster) 21 days later. The 18β-GA dose was 100 mg / mouse, and 7 days after the second immunization, blood was collected from the tail artery of the immunized mice and serum was isolated. ELISA method for anti-CACW antibody production against the collected serum was performed. Search by. ELISA method was used indirect ELISA used in the laboratory (Lee, JH and Han, Y., Int . Immunopharm ., 6, 1424, 2006; Lee, JH, et. al ., Vaccine , 25, 3834, 2007). The 96-well plate was coated with 2 mg / well of CACW with antigen, then blocked with 1% BSA solution and left at 4 ° C. for one day. The collected serum was diluted 1: 100 in an antigen-coated well and incubated for 1 hour in a 37 ° C 5% -CO 2 incubator, followed by three times with DPBS / 0.05% Tween 20 solution and DPBS solution. Washed. Secondary antibody (secondary antibody) was added to the peroxidase conjugate-goat anti-mouse polyvalent and left at room temperature for 30 minutes, washed in the same manner and then reacted for 15-30 minutes by adding OPD solution to the substrate solution. The reaction was stopped by sulfuric acid administration and the degree of antibody production was evaluated by measuring the absorbance using an ELISA microplate reader (Bio-Lab, USA). And the same method was used to measure antibody titers, and the collected serum was subjected to passage dilution at various concentrations.

CACW는 거의 탄수화물로 조성되어 있기 때문에 항원성이 단백질인 BSA에 비해 면역유도성(immunogenicity)이 현저하게 떨어지므로 CACW를 항원으로 사용하여 실험하기 전에 선행실험으로서 일종의 양성대조군인 BSA(bovine serum albumin)를 항원으로 사용하여 면역유도성을 검색하였다. Since CACW is composed of almost carbohydrates, immunogenicity is significantly lower than that of BSA, which is antigenic. Therefore, BSA (bovine serum albumin), a positive control group, is a prior experiment before using CACW as an antigen. Was used as an antigen to search for immunogenicity.

먼저, BSA를 항원으로 면역된 BALB/c 생쥐로부터 혈청을 수집하여 항체인 항-BSA 항혈청 생성의 증가 여부를 조사하였다. 그 결과, 18β-GA를 함유한 백신제형은 CFA를 보조제로 사용된 경우인 BSA/CFA에 비해서 약 30% 더 많은 항체생성이 있었고, BSA를 IFA에 혼합한 제형인 BSA/IFA의 경우와 비교하면 무려 1.4배 이상의 항체생성이 유도되었다(도 6). 따라서 18β-GA는 CFA보다 월등한 보조제효과가 있음을 알 수 있었다. IFA는 오직 현탁화(emulsification)에 필요한 기름(oil)만 함유되어 있기 때문에 BSA 단독으로도 항체생성을 유도함을 알 수 있었다. 참고로 CFA는 IFA에 T-세포 증진효과가 있는 마이콜린산(mycolic acid)이 첨가되어 있는 점이 IFA와 다르다.First, serum was collected from BALB / c mice immunized with BSA antigen to investigate whether the production of anti-BSA antiserum, an antibody, was increased. As a result, the vaccine formulation containing 18β-GA produced about 30% more antibodies than BSA / CFA, which was used as a CFA adjuvant, compared with BSA / IFA, which was a formulation of BSA mixed with IFA. As a result, 1.4 times or more antibody production was induced (FIG. 6). Therefore, 18β-GA was found to have a superior adjuvant effect than CFA. Since IFA contains only the oil necessary for emulsification, BSA alone induces antibody production. For reference, CFA differs from IFA in that mycolic acid, which has a T-cell enhancing effect, is added to IFA.

한편, CACW를 항원으로 사용하여 항체생성을 측정하는 경우 BSA를 항원으로 사용한 결과와 비슷한 결과가 산출되었다. 즉, 18β-GA를 첨가한 경우에는 CFA 보조제를 사용한 경우와 거의 유사한 정도의 항체가 생성됨을 알 수 있다(도 7). On the other hand, when measuring antibody production using CACW as an antigen, results similar to those of using BSA as an antigen were calculated. In other words, it can be seen that when 18β-GA is added, antibodies are produced at almost the same level as when using CFA adjuvant (FIG. 7).

한편, 항-CACW 항혈청이 유도생성된 항체의 역가(antibody titer)를 정량한 결과를 볼 때, 18β-GA/CACW으로 면역된 생쥐에서 유도된 항체역가를 1/100, 1/200, 1/400 및 1/800으로 희석하여 CACW 항원으로 하여 ELISA 방법으로 검색하였을 때 1/800까지 희석된 혈청에서도 양성반응이 검색되어서 이 항체의 역가는 최대 800 이상으로 평가되었다. 따라서 18β-GA만을 투여받은 대조군 생쥐그룹에서 수집된 혈청에서는 항-CACW 항체가 유도되지 않으므로, 18β-GA가 면역보조제 효능이 있음을 알 수 있었다(도 8). On the other hand, the results of quantifying the antibody titer of the anti-CACW antiserum-induced antibody, the antibody titers induced in the mice immunized with 18β-GA / CACW 1/100, 1/200, 1 / When diluted to 400 and 1/800 and searched by the ELC method for the CACW antigen, positive reactions were also detected in serum diluted to 1/800, and the titer of the antibody was evaluated to be at least 800. Therefore, since the anti-CACW antibody was not induced in the serum collected from the control mouse group that received only 18β-GA, it was found that 18β-GA has an adjuvant efficacy (FIG. 8).

<< 실험예Experimental Example 3>  3> IgGIgG 이소타입핑(Isotyping)과Isotyping and 사이토카인 프로파일( Cytokine profile ( CytokineCytokine profileprofile ) )

상기 <실험예 2>에서 처리한 생쥐의 혈액을 수집하여 CACW 항원에 대한 항체(anti-CACW)의 종류를 IgG 아이소타입핑(isotyping) ELISA 키트를 사용하여 IgG 아이소타입핑(isotyping)을 하였다. 또한, 대표적인 Th1 사이토카인 IFNg외 대표적인 Th2 사이토카인 IL-4의 생성유무를 ELISA 방법을 사용하여 사이토카인 프로파일을 검색하여 18β-GA 관여에 따른 생성정도를 비교하였다. 평가방법은 IgG 아이소타입핑에서는 IgG1 : IgG2a 또는 IgG1 : IgG2b의 비율을 비교하고, 상기 결과를 사이토카인 프로파일(IFNg 및 IL-4)의 결과와 상호 비교하여 평가하는데, 평가결과에서 IgG1 : IgG2a 또는 IgG1 : IgG2b의 비율이 높으면 Th2 면역반응우세로 판정하고, 이 비율이 낮으면 Th1의 면역반응우세로 평가하였다. 사이토카인 프로파일에서는 Th1 사이토카인인 IFNg의 분비와 Th2 사이토카인인 IL-4의 분비 정도를 비교하여 IgG 아이소타입핑의 결과를 비교하여 평가하였다.     Blood of the mice treated in Experimental Example 2 was collected, and IgG isotyping was performed using an IgG isotyping ELISA kit for the type of antibody (anti-CACW) to the CACW antigen. In addition, the presence or absence of representative Th1 cytokine IFNg and representative Th2 cytokine IL-4 were detected by using an ELISA method to compare cytokine profiles. The evaluation method is to compare the ratio of IgG1: IgG2a or IgG1: IgG2b in IgG isotyping and compare the results with those of cytokine profiles (IFNg and IL-4). When the ratio of IgG1: IgG2b was high, it was determined as the Th2 immune response predominance, and when this ratio was low, the immune response prevalence of Th1 was evaluated. The cytokine profile was evaluated by comparing the secretion of Th1 cytokine IFNg and the Th2 cytokine IL-4.

ELISA 키트를 사용하여 IFNg와 IL-4의 생성정도를 측정한 결과, 18β-GA를 CACW와 함께 첨가한 경우에는 18β-GA를 첨가하지 않은 경우에 비해서 IFNg의 생성이 70% 이상 월등하게 생성되는 반면에 IL-4의 생성은 오히려 대략 25% 정도 감소하였다(도 9). 따라서 18β-GA는 면역보조제로서 항체생성을 증진하는 동시에 Th1 우세성 면역반응을 유도함을 알 수 있었다.When the production of IFNg and IL-4 was measured using an ELISA kit, the addition of 18β-GA with CACW produced more than 70% of IFNg production compared to the absence of 18β-GA. In contrast, the production of IL-4 was rather reduced by approximately 25% (FIG. 9). Therefore, it can be seen that 18β-GA enhances antibody production as an adjuvant and induces a Th1 dominant immune response.

또한, IgG 아이소타이핑으로 T-세포의 면역유도성을 평가했을 때, 18β-GA의 Th1으로의 면역 유도성이 확인되었다. BSA를 항원으로 사용하여 다양하게 면역시킨 후 그 혈청을 분석한 결과 IgG1/[(IgG2a+IgG2b)/2]의 비율은 대조군인 BSA/IFA로 면역시킨 그룹이나, 면역보조제로 사용되는 CFA를 사용하여 면역시킨 그룹보다 18β-GA를 넣어 면역시킨 그룹의 비율이 상대적으로 적은 수치의 결과가 나왔다(표 1). In addition, when immuno-induction of T-cells was evaluated by IgG isotyping, immuno-induction of 18β-GA to Th1 was confirmed. After various immunizations using BSA as an antigen and serum analysis, the ratio of IgG1 / [(IgG2a + IgG2b) / 2] is the group immunized with BSA / IFA as a control group or CFA used as an adjuvant. As a result, the proportion of the group immunized with 18β-GA than the group immunized was relatively low (Table 1).

BSABSA 면역 마우스에서  In immune mice Th1Th1 면역반응의 유도 Induction of immune response 공식Formula IgG1/(IgG2a+IgG2b)/2 비율
(Mean ± S.E.)IgG1 / (IgG2a + IgG2b) / 2 ratio
(Mean ± SE) BSA/IFABSA / IFA 1.212 ± 0.1181.212 ± 0.118 BSA/18β-GA/IFABSA / 18β-GA / IFA 0.886 ± 0.1050.886 ± 0.105 BSA/CFABSA / CFA 1.084 ± 0.0461.084 ± 0.046

또한, CACW를 항원으로 이용한 실험에서 대조군으로 CACW만으로 면역시킨 그룹 또는, Alum 또는 CFA로 면역시킨 그룹보다 18β-GA를 넣어 면역시킨 그룹에서 상기 비율이 상대적으로 낮았다(표 2). 또한, 18β-GA를 넣어 면역시킨 실험군은 대조군 또는 다른 실험군과 비교하였을 때 IgG2a 또는 IgG2b 항체 생성도 증가한 결과를 보여주었다(도 10). 따라서 18β-GA는 면역보조제로서 기존의 보조제인 Alum 또는 CFA에 비해 상대적으로 Th1 우세성 면역반응을 유도함을 알 수 있었다.In addition, in the experiment using CACW as an antigen, the ratio was relatively low in the group immunized with CACW alone or the group immunized with 18β-GA than the group immunized with Alum or CFA (Table 2). In addition, the experimental group immunized with 18β-GA showed an increase in the production of IgG2a or IgG2b antibody compared to the control group or other experimental groups (FIG. 10). Therefore, 18β-GA was found to induce Th1 dominant immune response relative to the conventional adjuvant Alum or CFA as an adjuvant.

CACWCACW 면역 마우스에서  In immune mice Th1Th1 면역반응의 유도 Induction of immune response 공식Formula IgG1/(IgG2a+IgG2b)/2 비율
(Mean ± S.E.)IgG1 / (IgG2a + IgG2b) / 2 ratio
(Mean ± SE) CACW/IFACACW / IFA 1.298 ± 0.045 1.298 ± 0.045 CACW/18β-GA/IFACACW / 18β-GA / IFA 0.608 ± 0.009 0.608 ± 0.009 CACW/AlumCACW / Alum 0.942 ± 0.11 0.942 ± 0.11 CACW/CFACACW / CFA 0.858 ± 0.042 0.858 ± 0.042

<< 실험예Experimental Example 4> 동물모델을 사용한 면역보조제의 효능 평가 4> Evaluation of efficacy of immunoadjuvant using animal model

<4-1> 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis) 동물모델 설정<4-1> Animal model of disseminated candidiasis

BALB/c 생쥐에 18β-GA를 다양한 농도로 전 처리한 후, 일정 시간 후에 캔디다 알비칸스(C. albicans)를 5 x 105 yeast cells/mouse 농도로 꼬리정맥으로 투여하여 감염시킨 후 생존률을 측정하였다. 대조군은 18β-GA 대신에 성분을 희석하기 위해 사용한 DPBS를 투여하고 상기 방법과 동일하게 전신감염시킨 생쥐그룹의 생존률과 비교하여 평가하였다. 상기 과정은 단순히 18β-GA의 항균효과를 평가하기 위한 것으로 면역조절효과와는 무관하지만, 18β-GA의 면역조절에 따른 효과를 평가하기 위한 파종성 캔디다증 동물모델설정을 위함이었다. BALB / c mice and then the 18β-GA before treatment with various concentrations of, for Candida albicans (C. albicans), after a certain period of time Survival was measured after infection with tail vein at a concentration of 5 x 10 5 yeast cells / mouse. The control group was evaluated by comparing the survival rate of the group of mice infected with DPBS used to dilute the components instead of 18β-GA and in the same manner as the above method. The procedure is merely to evaluate the antimicrobial effect of 18β-GA, irrespective of the immunomodulatory effect, but to establish an animal model of disseminated candidiasis to evaluate the effects of 18β-GA on immunomodulation.

<4-2> 18β-GA의 면역보조제적 효과<4-2> Adjuvant Effect of 18β-GA

18β-GA(1 mg/ml)과 항원성분으로 CACW(1 mg/ml)을 섞은 혼합액 1 ml에 IFA(Incomplete Freund's Adjuvant1) 1 ml를 첨가하고 유화제 형태로 백신제형을 제조하여 BALB/c 생쥐에 면역접종을 한 후, 21일 후에 재접종을 복강 내로 투여하였다. 접종량은 18β-GA이 100 mg/mouse 되도록 조절하여 사용하였다. 2차 면역접종 7일 후에 이 생쥐들에게 캔디다 알비칸스(C. albicans)를 5 x 105 yeast cell/mouse 농도로 꼬리정맥을 통해서 전신감염을 유발시킨 후 면역접종을 받지 못하고 감염된 생쥐그룹(음성대조군)의 생존률을 관찰하였다. 평가는 생존곡선으로 도표화하여 평가 비교하였다. 상기 실험과정에서 수집된 혈청의 항체 생성정도를 ELISA 방법으로 검색하여 항체 역가를 측정하였다. 1 ml of Incomplete Freund's Adjuvant (IFA) was added to 1 ml of 18β-GA (1 mg / ml) mixed with CACW (1 mg / ml) as the antigenic component, and a vaccine formulation was prepared in the form of an emulsifier in BALB / c mice. After immunization, 21 days later, re-inoculation was administered intraperitoneally. The inoculum was used to adjust 18β-GA to 100 mg / mouse. Seven days after the second immunization, the mice were infected with C. albicans at a concentration of 5 x 10 5 yeast cell / mouse through the tail vein. Survival rate of the control group) was observed. The evaluations were compared by evaluating the survival curves. Antibody titer was measured by detecting the degree of antibody production of the serum collected during the experiment by ELISA method.

BALB/c mice를 네 그룹으로 분류하여 18β-GA 단독 또는 CACW와 혼합한 제형인 CACW/18β-GA, CACW 단독을 각각 IFA에 혼합한 제형으로 각각 면역접종을 한 후 캔디다 알비칸스(C. albicans)로 감염시킨 다음에 각 그룹 생쥐의 생존시간(Survival times)을 측정하였다. 실험 결과, 희석액(DPBS: 음성대조군), 18β-GA, CACW, 또는 CACW/18β-GA 등으로 면역된 생쥐그룹의 각 생존시간[평균(일) ± SE(일)]은 CACW/18β-GA로 면역된 생쥐그룹의 생존시간이 가장 높았으며 생존률은 50%를 나타냈다(도 11). 상기 실험결과를 확인하기 위해 기존의 상업적으로 사용되는 보조제를 사용하여 CACW/18β-GA의 결과와 비교하였다. 이때 사용된 보조제는 CFA와 Alum이며 실험방법은 상기 시험에서 사용된 방법과 동일하게 수행하였다. 그 결과, CACW/18β-GA 제형만 파종성 캔디다증에 보호효과가 있었으며, CFA 또는 Alum을 보조제로 사용한 경우에는 항원으로 CACW 단독으로 사용한 경우의 생존율과 거의 동일하여 효과가 없는 것으로 판정되었다(도 12). 따라서 18β-GA는 항캔디다 알비칸스(anti-C. albicans) 백신 제조시에 보조제로서의 효능이 있는 것으로 평가된다. BALB / c mice were categorized into four groups and immunized with the formulations of CACW / 18β-GA and CACW alone, which were mixed with 18β-GA alone or CACW, respectively, in IFA, followed by Candida albicans ( C. albicans). ) And the survival times of each group of mice were measured. As a result, the survival time [mean (day) ± SE (day)] of the group of mice immunized with diluent (DPBS: negative control), 18β-GA, CACW, or CACW / 18β-GA, was CACW / 18β-GA. Survival time was the highest in the group of mice immunized with a survival rate of 50% (Fig. 11). In order to confirm the experimental results, conventional commercially available auxiliaries were used and compared with the results of CACW / 18β-GA. The adjuvant used at this time was CFA and Alum, and the experimental method was performed in the same manner as used in the test. As a result, only the CACW / 18β-GA formulation had a protective effect on disseminated candidiasis, and when CFA or Alum was used as an adjuvant, it was judged to be ineffective because it was almost the same as the survival rate when CACW alone was used as an antigen (FIG. 12). ). Therefore, 18β-GA is estimated to be effective as an adjuvant, in the manufacture anti Candida albicans (C. albicans anti-) vaccine.

<< 실험예Experimental Example 5> 18β- 5> 18β- GAGA 의 캔디다 Candida 알비칸스Albicans (( C. C. albicansalbicans )) 기인성Attribution 관절염 예방 및 치료 효과 Arthritis prevention and treatment effect

정립된 관절염 동물모델(Han, Y., Int . Immunopharmacol., 5, 1049, 2005)을 사용하여 18β-GA의 캔디다 알비칸스(C. albicans) 기인성 관절염 효과를 검색하였다. 즉, 1 ml CFA(Complete Freund's Adjuvant)와 1 ml DPBS에 용해한 CACW 1 mg을 혼합하여 초음파 세척기(sonicator, Sonics & Materials Inc, CT, USA)로 유화시킨 후 주사기(syringe)로 생쥐의 오른쪽 뒷발바닥에 50 ml/mouse 용량으로 피하주사하여 족부종을 유발시킨 후, 18β-GA를 1 mg/mouse 농도로 3일에 한 번씩 3회 복강으로 투여하였다. 음성대조군 생쥐에게는 희석액으로 사용한 DPBS를 투여하였다. 예방효과 검색의 경우에는 족부종 유발을 시작한 날짜(0일)를 기점으로 하여 9, 6, 3일 전에 18β-GA를 먼저 투여하고 마지막 약물투여 3일 후에 상기 방법에 따라 족부종을 유발을 위해 CACW와 CFA 현탁액(CACW/CFA)을 접종하였다. 치료효과 검색에서는 CACW/CFA을 상기 방법처럼 생쥐에 접종하고 3, 6, 9일 후에 18β-GA를 투여하였다. 족부종 정도는 3일에 한 번씩 다이얼 캘리퍼 게이지(dial caliper gage, Mitutoyo Co., IL, USA)로 측정하였다. 각 그룹의 생쥐는 5마리씩 나누었으며, 부종억제정도는 족부종의 두께를 센티미터(cm)로 나타내어 비교하였다. C. albicans of 18β-GA using an established arthritis animal model (Han, Y., Int . Immunopharmacol ., 5, 1049, 2005). The effect of causative arthritis was searched. In other words, 1 ml CFA (Complete Freund's Adjuvant) and 1 mg of CACW dissolved in 1 ml DPBS were mixed, emulsified with an ultrasonic cleaner (sonicator, Sonics & Materials Inc, CT, USA), and then syringes (syringe) to the right hind paw of the mouse. Induced foot edema by subcutaneous injection at a dose of 50 ml / mouse, followed by intraperitoneal administration of 18β-GA three times every three days at a concentration of 1 mg / mouse. Negative control mice received DPBS used as a diluent. In the case of prophylactic effect detection, 18β-GA was administered 9, 6, and 3 days before the start of the day of inducing foot edema (day 0), and 3 days after the last drug administration. CACW and CFA suspensions (CACW / CFA) were inoculated. In the therapeutic effect screening, mice were inoculated with CACW / CFA in the same manner as above, and 18β-GA was administered 3, 6, and 9 days later. The degree of foot edema was measured every three days with a dial caliper gage (Mitutoyo Co., IL, USA). The mice of each group were divided into 5 rats, and the degree of edema inhibition was compared by expressing the thickness of the foot edema in centimeters (cm).

먼저 생쥐에 18β-GA로 투여하고 캔디다 알비칸스(C. albicans) 세포벽으로 족부종을 유발시킨 예방효과를 조사한 결과, 18β-GA로 투여받은 생쥐는 성분 대신에 DPBS를 투여받은 대조군에 비해서 족부종이 감소되었다. 관측 6일째는 음성대조군에 비교할 때 대략 15% 정도의 족부종 감소가 있었으며 12일 및 15일에는 각각 35% 및 38% 정도의 족부종이 억제되어 18β-GA는 캔디다 알비칸스(C. albicans)로 유발된 감염성 관절염에 효과가 있음을 알 수 있었다(P <0.05). 상기 18β-GA의 항관절염 효과는 30일 관찰기간 종료 때까지 음성대조군 생쥐의 족부종과 비교시 억제 정도가 전반적으로 지속적으로 유지됨을 알 수 있었으며, 반복실험에서도 유사한 결과가 관찰되었다(도 13).First, the mice were administered with 18β-GA and injected into the C. albicans cell wall. As a result of examining the prophylactic effect of inducing foot edema, mice treated with 18β-GA had reduced foot edema compared to the control group receiving DPBS instead of the component. On day 6, there was a reduction of approximately 15% of foot edema compared to the negative control, and on day 12 and 15, 35% and 38% of foot edema were suppressed, resulting in 18β-GA to C. albicans . It was found to be effective for the induced infectious arthritis ( P <0.05). The anti-arthritis effect of the 18β-GA was found to be generally maintained in the degree of inhibition compared to the foot edema of the negative control mice until the end of the 30-day observation period, similar results were observed in repeated experiments (Fig. 13) .

또한, 생쥐에 족부종을 먼저 유발시킨 후 18β-GA을 투여하여 치료효과를 조사한 결과, 항관절염 효과가 검색되었으며 예방효과의 결과와 비교하였을 때 그 효과는 다소 낮았다. 족부종 염증이 가장 절정에 이르는 6일째부터 18일째 기간 동안에 음성대조군에 비교할 때 대략 20% 정도의 감소가 유지된다는 것을 알 수 있었다(P < 0.05)(도 13). In addition, the mice were first induced with foot edema and then treated with 18β-GA. The anti-arthritis effect was detected, and the effect was somewhat lower than that of the preventive effect. It was found that a reduction of approximately 20% was maintained as compared to the negative control during the period from day 6 to day 18, when the foot edema inflammation reached its peak ( P <0.05) (Fig. 13).

<< 실험예Experimental Example 6> 18β- 6> 18β- GAGA 의 T-림프구의 억제 효과Inhibitory Effect of T-lymphocytes in Rats

CD4+ T-림프구 억제와 관절염은 상관성이 있으므로 18β-GA의 T-림프구에 대한 효과를 항-CD4+ 단항체(monoclonal antibody)를 사용하여 검색하였다. 검색방법은 상기 방법과 동일하며, 항-CD4+ 단항체(monoclonal antibody)는 300 mg/mouse의 농도로 생쥐에 복강 투여하였다.Since CD4 + T-lymphocyte inhibition and arthritis correlate, the effect of 18β-GA on T-lymphocytes was investigated using anti-CD4 + monoclonal antibody. The detection method was the same as the above method, and anti-CD4 + monoclonal antibody (monoclonal antibody) was administered intraperitoneally to the mouse at a concentration of 300 mg / mouse.

18β-GA의 항관절염 효과의 작용기전의 일부분으로서 T-림프구의 억제에 의한 것임을 확인하기 위해 항-CD4+ 단항체의 효과를 상기 <실험예 5>에 사용된 방법으로 조사하였다. 족부종 유발 전 후에 항-CD4+ 단항체를 300 mg/mouse의 용량으로 3일 간격으로 총 3회 생쥐에 투여하였다. 그 결과, 단항체를 투여받은 생쥐의 족부종이 단항체로 처리되지 않은 음성대조군의 족부종에 비해 현저한 족부종 감소가 관찰되었다. 항-CD4+ 단항체의 캔디다 알비칸스 기인성 관절염에 대한 예방효과 및 치료효과는 통계적으로 거의 유사하여서 예방효과가 치료효과에 비해서 현저하였던 18β-GA와는 차이가 있었다(도 15). 이 효과는 18β-GA의 항관절염 효과와의 절대적인 비교는 어렵지만 패턴(pattern) 상으로 비교할 수 있다(도 16 및 도 17). 따라서 18β-GA는 면역세포인 CD4+ T-림프구의 증식의 억제에 의해서 항-관절염 효과가 있음을 알 수 있었다. In order to confirm that the anti-arthritis effect of 18β-GA is due to the inhibition of T-lymphocytes, the effect of the anti-CD4 + monoantibody was investigated by the method used in Experimental Example 5 above. Anti-CD4 + monoantibodies were administered to the mice three times at three-day intervals before and after foot edema induction. As a result, a significant reduction in foot edema was observed in the foot edema of mice receiving monoantibody compared to the foot edema of the negative control group that was not treated with monoantibody. The prophylactic and therapeutic effects of the anti-CD4 + monoantibody against Candida albicans-induced arthritis were statistically similar to that of 18β-GA in which the prophylactic effect was remarkable compared to the therapeutic effect (FIG. 15). This effect is difficult to compare with the anti-arthritis effect of 18β-GA, but can be compared in a pattern (Figs. 16 and 17). Therefore, it can be seen that 18β-GA has an anti-arthritis effect by inhibiting the proliferation of CD4 + T-lymphocytes, which are immune cells.

<< 실험예Experimental Example 7> 18β- 7> 18β- GAGA 의 산화 질소(Of nitric oxide ( nitiricnitiric oxideoxide , , NONO ) 생성억제 효과Generation suppression effect

18β-GA의 항관절염 효과의 작용기전을 알아보기 위해 관절염 염증부위로 이동되어 부종을 유발하는 대식세포의 활성에 따른 NO 생성에 대한 18β-GA의 억제 효과를 조사하였다. RPMI 1640 배지에 배양한 RAW 264.7 단핵세포/대식세포주(monocyte/ macrophage cell line)를 96-웰 플레이트(well plate)에 2 x 106/ml로 분주하고 다양한 농도의 18β-GA을 첨가하였다. 5%-37℃, CO2 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 상등액에 Griess 시약[5% 인산(phosphoric acid)에 1% 설파닐아미드(sulfanilamide), 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아민디하이드로클로라이드{N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride)}]을 넣고 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 550nm에서 흡광도를 측정하여 NO 생성억제 유무를 검색하였다. 대조군은 다양한 농도의 LPS를 사용하였다.To investigate the mechanism of the anti-arthritis effect of 18β-GA, we investigated the inhibitory effect of 18β-GA on the production of NO according to the activity of macrophages that induce edema. RAW 264.7 monocyte / macrophage cell lines cultured in RPMI 1640 medium were dispensed at 96 × well plates at 2 × 10 6 / ml and 18β-GA at various concentrations was added. After incubating for 24 hours in a CO 2 incubator at 5% -37 ° C, Griess reagent [1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid, 0.1% N- (1-naphthyl) ethylenediamine in supernatant Dihydrochloride {N- (1-Naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride)} was added and the absorbance was measured at 550 nm using a microplate reader to detect NO production inhibition. The control group used various concentrations of LPS.

실험 결과, LPS만으로 처리된 대식세포(양성대조군)에 비교할 때 18β-GA로 처리된 대식세포에서 50 mM 이하의 비교적 낮은 농도에서는 NO의 생성이 증가하였지만 100 mM 이상의 높은 농도에서 NO의 생성이 억제되는 효과가 있었다. 100 mM에서는 대조군에 비해 약 35% 정도가 억제되었고, 200 mM에서는 약 75% 정도의 NO 생성이 억제되는 효과가 있었다(P <0.05)(도 14).Experimental results showed that the production of NO increased at relatively low concentrations below 50 mM compared to LPS-treated macrophages (positive control) but inhibited NO production at higher concentrations above 100 mM. There was an effect. At 100 mM, about 35% was inhibited compared to the control, and at 200 mM, about 75% of NO production was inhibited ( P <0.05) (FIG. 14).

도 1은 캔디다 알비칸스(C. albicans)의 다양한 형태를 나타내는 그림이다:1 is an illustration showing the various types of Candida albicans (C. albicans):

a: 효모(yeast) 형태;    a: yeast form;

b 및 c: 가균사(pseudohyphae) 형태;    b and c: pseudohyphae form;

d: 균사(hyphae) 형태; 및    d: hyphae form; And

e: 가균사 및 균사의 조합.    e: combination of pseudohyphae and hyphae.

도 2는 캔디다 알비칸스 세포벽(C. albicans cell wall)의 구조를 나타내는 그림이다.2 shows Candida albicans cell wall ( C. albicans) Figure shows the structure of the cell wall).

도 3은 Con A에 의해 활성된 T-세포들의 증식에 대한 18β-GA의 효과를 나타내는 그래프이다.3 is a graph showing the effect of 18β-GA on proliferation of T-cells activated by Con A.

도 4는 LPS에 의해 활성된 B-세포들의 증식에 대한 18β-GA의 효과를 나타내는 그래프이다.4 is a graph showing the effect of 18β-GA on proliferation of B-cells activated by LPS.

도 5는 T-세포 증식에 대한 18β-GA의 글리시리진(glycyrrhizin)의 효과를 나타내는 그래프이다.FIG. 5 is a graph showing the effect of glycyrrhizin of 18β-GA on T-cell proliferation. FIG.

도 6은 항-BSA 항체를 유도하는 보조제로서 18β-GA의 효과를 나타내는 그래프이다.6 is a graph showing the effect of 18β-GA as adjuvant to induce anti-BSA antibodies.

도 7은 항캔디다 알비칸스(anti-C. albicans) 항체를 유도를 증진시키는 18β-GA의 효과를 나타내는 그래프이다.FIG. 7 is a graph showing the effect of 18β-GA on enhancing induction of anti- C. Albicans antibodies.

도 8은 CACW/18β-GA로 면역된 마우스로부터 수집한 항-CACW 항체의 역가를 나타내는 그래프이다.8 is a graph showing the titers of anti-CACW antibodies collected from mice immunized with CACW / 18β-GA.

도 9는 18β-GA의 첨가가 Th1-우세 면역반응을 유도하는 것을 사이토카인 프로파일에 의해 측정된 결과를 나타내는 그래프이다.9 is a graph showing the results measured by the cytokine profile that addition of 18β-GA induces a Th1-dominant immune response.

도 10은 18β-GA의 첨가가 Th1-우세 면역반응을 유도하는 것을 IgG 아이소타이핑(isotyping)에 의해 측정된 결과를 나타내는 그래프이다.10 is a graph showing the results measured by IgG isotyping that addition of 18β-GA induces a Th1-dominant immune response.

도 11은 CACW/18β-GA의 면역이 전신감염성 캔디다증에 대한 마우스의 저항을 증진시키는 결과를 나타내는 그래프이다.11 is a graph showing the immunity of CACW / 18β-GA enhances the resistance of mice to systemic candidiasis.

도 12는 상업적 면역보조제인 CFA 및 Alum은 보호적인 항캔디다 알비칸스(anti-C. albicans)를 유도하지 않음을 나타내는 그래프이다.Figure 12 is a graph showing a commercial adjuvant of CFA and Alum does not induce protective anti-Candida albicans (anti- C. albicans).

도 13은 고용량의 18β-GA의 투여가 캔디다 알비칸스 세포벽(C. albicans cell wall) 유도성 관절염에 대해 예방효과 및 치료효과가 있음을 나타내는 그래프이다.FIG. 13 is a graph showing that administration of a high dose of 18β-GA has a prophylactic and therapeutic effect on C. albicans cell wall induced arthritis.

도 14는 18β-GA가 LPS로 처리한 대식세포로부터 NO 생성을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.14 is a graph showing that 18β-GA inhibits NO production from macrophages treated with LPS.

도 15은 CD4+ T 림프구의 억제에 의한 족부종의 억제가 18β-GA의 항관절염 활성의 기전임을 유추할 수 있는 그래프이다.15 is a graph that can be inferred that inhibition of foot edema by inhibition of CD4 + T lymphocytes is a mechanism of anti-arthritis activity of 18β-GA.

도 16은 캔디다 알비칸스(C. albicans) 기인성 관절염에 대한 18β-GA 및 항-CD4+ 단항체의 예방효과의 비교를 나타내는 그래프이다.16 is Candida albicans ( C. albicans ) attributed A graph showing a comparison of the prophylactic effects of 18β-GA and anti-CD4 + monoantibodies on arthritis.

도 17은 캔디다 알비칸스(C. albicans) 기인성 관절염에 대한 18β-GA 및 항-CD4+ 단항체의 치료효과의 비교를 나타내는 그래프이다.Figure 17 is Candida albicans ( C. albicans ) attributed A graph showing the comparison of the therapeutic effects of 18β-GA and anti-CD4 + monoantibodies on arthritis.

Claims (16)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 18 베타-글리시르레틴산(18β-glycyrrhetinic acid, 18β-GA) 및 캔디다 알비칸스 세포벽(C. albicans cell wall, CACW)을 함유하는 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis)에 대한 면역보조제.An adjuvant against disseminated candidiasis containing 18 beta-glycyrrhetinic acid (18β-GA) and C. albicans cell wall (CACW). 삭제delete 제 6항에 있어서, 파종성 캔디다증에 효과가 있는 항-캔디다 알비칸스 항체(anti-C. albicans antibody) 생성을 유도하는 것을 특징으로 하는 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis)에 대한 면역보조제.7. The adjuvant for disseminated candidiasis according to claim 6, which induces the production of anti- C. Albicans antibodies effective for disseminated candidiasis. 제 6항에 있어서, Th1 면역반응을 유도하는 것을 특징으로 하는 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis)에 대한 면역보조제.7. The adjuvant for disseminated candidiasis according to claim 6, which induces a Th1 immune response. 제 6항에 있어서, 상기 면역보조제를 투여한 후 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis)을 감염시킨 동물모델의 생존률을 증진시키는 것을 특징으로 하는 파종성 캔디다증(disseminated candidiasis)에 대한 면역보조제.7. The adjuvant for disseminated candidiasis according to claim 6, wherein the adjuvant for disseminated candidiasis is improved after the administration of the adjuvant. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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