KR101018304B1 - Composition Containing Bioavailable Fucoidan for Preventing or Treating Inflammatory Diseases - Google Patents
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Abstract
본 발명은 (a) 20-40%의 황산기 함량, (b) 500-5,000 Da의 중량 평균분자량, (c) 1-6의 다분산지수 및 (d) 0-200 센티푸아즈(centi-poise)의 점성도를 가지는 생체이용성(bioavailable) 저분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 친염증사이토카인인 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 매트릭스 메탈프로테아제-9(MMP-9)의 발현을 억제하여 염증성 질환의 발병을 저해하므로 염증성 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.The present invention comprises (a) 20-40% sulfuric acid group content, (b) a weight average molecular weight of 500-5,000 Da, (c) a polydispersity index of 1-6 and (d) 0-200 centipoise It relates to a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising a bioavailable low-molecular fucoidan having an viscosity of) as an active ingredient. The composition of the present invention inhibits the expression of the proinflammatory cytokines TNF-α (tumor necrosis factor-α) and matrix metal protease-9 (MMP-9), thereby inhibiting the development of inflammatory diseases, thereby preventing and treating inflammatory diseases. It can be used as medicine and health functional food.
생체이용성, 저분자, 후코이단, 관절염, 염증성 질환, TNF-α, MMP-9 Bioavailability, low molecular weight, fucoidan, arthritis, inflammatory disease, TNF-α, MMP-9
Description
본 발명은 생체이용성 저분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising bioavailable low molecular weight fucoidan as an active ingredient.
염증은 외상, 감염, 허혈(post-ischemic), 독성 또는 자가면역 반응에 의한 손상에 반응하는, 조직에서 발생하는 염증관련 요소와 세포들 사이의 매우 복잡한 현상이다(Nathan, C., Nature 420:846-852(2002)). 보통 이 과정은 감염후의 회복 및 치료를 유도하지만, 만약 이런 과정들이 제대로 이루어지지 않을 경우 염증은 염증세포 또는 콜라겐 등에 의한 지속적인 조직 손상을 야기 시킬 수도 있다. Inflammation is a very complex phenomenon between cells and inflammation-related components that occur in tissues in response to injury caused by trauma, infection, post-ischemic, toxic or autoimmune reactions (Nathan, C., Nature 420: 846-852 (2002). Usually this process leads to recovery and treatment after infection, but if these processes are not done properly, inflammation can cause persistent tissue damage by inflammatory cells or collagen.
류마티스 관절염은 비교적 흔한 만성 염증성 질환으로 항류마티스제제, 면역억제제 및 부신피질호르몬 등을 이용한 치료에도 불구하고 관절파괴가 진행될 수 있어 관절변형으로 인한 장애를 유발한다(Cunnane, G., K. M., Arch Immunol Ther Exp 46:1-7(1998)). 기존 치료제의 한계를 극복하기 위해서는 류마티스 관절염의 병인기전을 좀 더 정확히 이해하고 새로운 치료법 개발이 필요하다. 최근에는 류 마티스 관절염의 병인기전에 중요한 것으로 밝혀진 종양괴사인자-α(TNF-α) 및 인너루킨-1β(IL-1β)를 차단하는 생물학적 제재를 개발하여 치료에 이용한 결과 매우 효과적인 것으로 보고 되었다(Cutolo, M., S., Ann Rheum Dis 65:728-35 (2006)). 하지만 이런 생물학적 제재에 반응하지 않는 환자들이 아직 많고 반응이 불완전한 경우도 많아 좀 더 효과적이거나 보완작용이 있는 약제의 개발이 필요하다. 류마티스 관절염은 자가면역 질환으로써 유전적 요인과 외부 인자에 의해 자가반응성 T 세포 및 류마티스 인자와 같은 자가항체가 발생하고 이들이 활막조직에 염증을 유발하면서 시작된다. 자가반응성 T세포는 활막조직의 염증에 있어 핵심적인 역할을 담당하며 활막조직에 있는 대식세포, 활막세포, 수지상세포 및 B세포 등과 상호작용을 통하여 염증과정을 조절하는 것으로 알려져 있다(Sweeney, S. E., Int J Biochem Cell Biol 36:372-8(2004)). 이들 세포간의 상호작용에는 여러 가지 세포표면 분자들이나 분비단백들이 관여하는데 그 중에서 특히 TNF 리간드 슈퍼패밀리와 TNF 수용체 슈퍼패밀리에 속하는 TRANCE/RANK, CD40/CD40L, GITR/GITRL, 및 LTβ/LTβR 의 상호작용은 중요한 역할을 하는 것으로 보고 되었다(Cuzzocrea, S., E., Faseb J 19:1253-65(2005); Eissner, G., W., Cytokine Growth Factor Rev 15:353-66(2004)). T세포에 의해 활성화된 활막세포 및 대식세포는 여러 가지 염증 촉진 사이토카인과 세포외 기질을 분해하는 메트릭스 메탈로프로테아제(MMP)들을 분비하여 활막염 및 골-연골파괴를 일으키는데 이 과정은 만성 관절염의 의한 관절 파괴기전으로 매우 중요하다(Yanni, G., A., Ann Rheum Dis 53:39-44(1994)).Rheumatoid arthritis is a relatively common chronic inflammatory disease that can lead to joint destruction despite treatment with antirheumatic agents, immunosuppressants and corticosteroids (Cunnane, G., KM, Arch). Immunol Ther Exp 46: 1-7 (1998). Overcoming the limitations of existing therapies requires a more accurate understanding of the pathogenesis of rheumatoid arthritis and the development of new therapies. Recently, biological agents that block tumor necrosis factor-α (TNF-α) and innerleukin-1β (IL-1β), which have been shown to be important for the pathogenesis of rheumatoid arthritis, have been reported to be very effective as a result of treatment. Cutolo, M., S., Ann Rheum Dis 65: 728-35 (2006). However, many patients who do not respond to these biological agents are still incomplete and require more effective or complementary drugs. Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease, which is caused by the development of autoantibodies such as autoreactive T cells and rheumatoid factors by genetic and external factors, which induce inflammation in synovial tissue. Autoreactive T cells play a key role in inflammation of synovial tissue and are known to regulate inflammatory processes through interactions with macrophages, synovial cells, dendritic cells, and B cells in synovial tissue (Sweeney, SE, Int J Biochem Cell Biol 36: 372-8 (2004). Various cell surface molecules or secretory proteins are involved in the interaction between these cells, in particular the interactions of TRANCE / RANK, CD40 / CD40L, GITR / GITRL, and LTβ / LTβR belonging to the TNF ligand superfamily and the TNF receptor superfamily. Has been reported to play an important role (Cuzzocrea, S., E., Faseb J 19: 1253-65 (2005); Eissner, G., W., Cytokine). Growth Factor Rev 15: 353-66 (2004). Synovial cells and macrophages activated by T cells secrete a variety of inflammation-promoting cytokines and matrix metalloproteases (MMPs) that degrade the extracellular matrix, leading to synovitis and bone-cartilage destruction. Very important as a joint destruction mechanism (Yanni, G., A., Ann) Rheum Dis 53: 39-44 (1994).
현재 관절염의 치료는 근본적인 치료보다는 증상을 약화시키는데 주력하고 있다. 이러한 치료의 대부분은 발병에 관련된 면역현상과 감염에 대항하는 면역현상을 구분하지 못하는 비특이적(nonspecific) 면역제어로 류마티스 관절염의 치료와 함께 면역기능의 저하라는 부작용(side-effect)을 동반할 가능성이 크다고 할 수 있다. 현재 국내 및 외국에서 사용되어지고 있거나 개발 중에 있는 류마티스 관절염의 치료 방법으로는 1) 비스테로이드성 항염증약물(NSAIDs) 또는 스테로이드를 이용한 소염제, 2) 항 류마티스 약물 (antirheumatic drugs or disease modifying antirheumatic drugs: DMARD), 3) 생물학적 매체(Biologic agents): 사이토카인의 하나인 TNF-α의 기능을 저해하는 항체 또는 가용성 수용체 (ENBREL 등), 4) 유전자 치료: IL-1 및 TNF-α의 길항제(antagonist) 또는 IL-10, TGF-β1과 같은 항염증성 사이토카인을 발현하는 유전자 치료, 및 5) 경구용 타입 II 콜라켄 면역치료 등을 들 수 있다(Sweeney, S. E., Int J Biochem Cell Biol 36:372-8(2004), Sweeney, S. E., Curr Opin Rheumatol 16:231-7(2004)). 그러나 이들 방법은 류마티스 관절염의 증상을 완화하는데 머물 뿐 근본적인 치료가 되지 않기 때문에 류마티스 관절염의 근원적인 치료를 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.Currently, the treatment of arthritis is focused on attenuating symptoms rather than radical treatment. Most of these treatments are nonspecific immune controls that do not distinguish between immune and disease-related immune phenomena and are likely to have side-effects of decreased immune function along with treatment of rheumatoid arthritis. It can be said to be large. Treatment methods for rheumatoid arthritis that are currently used or developed in Korea and abroad include 1) anti-inflammatory drugs using nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) or steroids, and 2) antirheumatic drugs or disease modifying antirheumatic drugs: DMARD), 3) Biologic agents: antibodies or soluble receptors (ENBREL, etc.) that inhibit the function of TNF-α, one of cytokines, 4) Gene therapy: Antagonists of IL-1 and TNF-α ) Or gene therapy expressing anti-inflammatory cytokines such as IL-10, TGF-β1, and 5) oral type II collagen immunotherapy (Sweeney, SE, Int J Biochem). Cell Biol 36: 372-8 (2004), Sweeney, SE, Curr Opin Rheumatol 16: 231-7 (2004). However, these methods remain only to alleviate the symptoms of rheumatoid arthritis and are not a fundamental treatment, so further research is needed for the fundamental treatment of rheumatoid arthritis.
태고로부터 지난 수천년 동안, 동양 여러 국가에서 한약재 및 식물 추출물들이 의료 분야에서 널리 이용되어져 왔고, 건강관리를 위한 자원으로 인식되어 왔으며, 이들 한약재 및 식물 추출물들로부터 특정질병을 치료 및 예방하기 위한 목적으로 이에 대한 성분 및 약효 연구가 최근 들어 활발하게 진행되어 왔다.For thousands of years since ancient times, herbal medicines and plant extracts have been widely used in the medical field and have been recognized as a resource for health care in many Asian countries, and for the purpose of treating and preventing certain diseases from these herbs and plant extracts. Ingredient and drug efficacy studies have been actively conducted in recent years.
후코이단은 중량 평균분자량이 30,000-2,000,000 달톤의 점성이 있는 고분자 형태의 당류로서, 전복, 오징어와 같은 연체동물의 점액 또는 미역이나 다시마와 같은 갈조류에 주로 포함되어 있으며, 특히 미역 포자엽에서 추출된 후코이단은 중량 평균분자량이 약 170,000 달톤이다.Fucoidan is a viscous polymer in the form of viscous polymer with a weight average molecular weight of 30,000-2,000,000 Daltons, and is mainly contained in mucus of mollusks such as abalone and squid, or brown algae such as seaweed and kelp, especially fucoidan extracted from seaweed spores. The weight average molecular weight is about 170,000 Daltons.
갈조류 유래의 후코이단의 기능성에 대해서 1990년대 이후 일본을 중심으로 연구되고 있으며, 면역증강 및 항종양 작용, 혈당상승 억제 및 혈액응고 저지작용, 중성지방 및 콜레스테롤 저하작용, 그리고 항산화 작용 및 위궤양 치유 촉진작용 등에 관한 연구가 진행된 바 있다. (Scand . J. Urol . Nephrol ., 40(1)(2006); Am . J. Hematol., 78(1)(2005); Journal of the Korean Chemical Society, 46(2)(2002); 월간 식품산업 11월호 특집기사(2005))The function of fucoidan derived from brown algae has been studied in Japan since the 1990s, and has been shown to enhance immune and anti-tumor effects, inhibit blood sugar rise and inhibit blood coagulation, lower triglycerides and cholesterol, and promote antioxidant and gastric ulcer healing. Research has been conducted on the back. ( Scand . J. Urol . Nephrol . , 40 (1) (2006); Am . J. Hematol ., 78 (1) (2005); Journal of the Korean Chemical Society , 46 (2) (2002); Monthly food industry November issue (2005)
그러나 후코이단 및 이로부터 생체이용에 보다 유리하게 가공된 물질들에 대한 지속적인 연구에도 불구하고, 후코이단의 염증질환 특히 관절염 치료효과에 대한 보고는 없었다. However, despite the continuous study of fucoidan and its processed materials more advantageous for bioavailability, there have been no reports on the effects of fucoidan on inflammatory diseases, especially arthritis.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.
본 발명자들은 염증 질환 특히 관절염의 예방 및 치료용 조성물을 개발하고자 노력한 결과 고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 관절염 모델생쥐에 식이하여 관절염의 진행상황을 분석한 결과 고분자 후코이단이 관절염의 발병을 촉진시키는데 반해 생체이용성 저분자 후코이단은 관절염의 진행을 저해함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. The present inventors have tried to develop a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases, in particular arthritis, as a result of analyzing the progress of arthritis by feeding a high-molecular, medium-molecular and low-molecular fucoidan in arthritis model mice, whereas the polymer fucoidan promotes the development of arthritis. The bioavailable low molecular weight fucoidan has completed the present invention by confirming that it inhibits the progression of arthritis.
따라서 본 발명의 목적은 생체이용성 저분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising bioavailable low molecular weight fucoidan as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 20-40%의 황산기 함량, (b) 500-5,000 Da의 중량 평균분자량, (c) 1-6의 다분산지수 및 (d) 0-200 센티푸아즈(centi-poise)의 점성도를 가지는 생체이용성(bioavailable) 저분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. According to an aspect of the present invention, the present invention provides a composition comprising (a) 20-40% sulfuric acid group content, (b) a weight average molecular weight of 500-5,000 Da, (c) a polydispersity index of 1-6 and (d) 0-200 It provides a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases comprising a bioavailable low-molecular fucoidan having a viscosity of centi-poise as an active ingredient.
본 발명자들은 염증 질환 특히 관절염의 예방 및 치료용 조성물을 개발하고자 노력한 결과, 고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 관절염 모델생쥐에 식이하 여 관절염의 진행상황을 분석한 결과 고분자 후코이단이 관절염의 발병을 촉진시키는데 반해 저분자 후코이단은 관절염의 진행을 저해함을 확인하였다.The present inventors have tried to develop a composition for the prevention and treatment of inflammatory diseases, in particular arthritis, as a result of analyzing the progress of arthritis by dieting high-molecular, mid-molecular and low-molecular fucoidan in arthritis model mice, the polymer fucoidan promotes the development of arthritis On the other hand, the low molecular weight fucoidan was confirmed to inhibit the progression of arthritis.
본 발명의 염증 질환 예방 및 치료용 조성물에서 유효성분으로 이용되는 저분자 후코이단은 천연-유래 고분자량 후코이단(대체적으로, 170,000 Da 이상)과 비교하여, 매우 작은 분자량을 갖는다.The low molecular weight fucoidan used as an active ingredient in the composition for preventing and treating inflammatory diseases of the present invention has a very small molecular weight as compared with the naturally-derived high molecular weight fucoidan (typically 170,000 Da or more).
본 발명의 조성물은 물성 및 생리활성이 우수한 생체이용성 후코이단을 유효성분으로 포함한다. 본 명세서에서 후코이단과 관련하여 사용되는 용어 “생체이용성(bioavailability)”은 생체 내에서의 흡수율이 우수하고 수용성이 높으며 생리활성이 천연(natural-occurring)의 후코이단 보다 높은 저분자량의 후코이단을 의미한다.The composition of the present invention comprises bioavailable fucoidan excellent in physical properties and physiological activity as an active ingredient. As used herein, the term “bioavailability” as used in connection with fucoidan means a low molecular weight fucoidan having excellent absorption rate in water, high water solubility and higher physiological activity than natural fucoidan of natural (occurring).
본 명세서에서 용어 “저분자 후코이단”또는 “저분자량 후코이단”은 황산기를 포함하는 당, 바람직하게는 황산기를 포함하는 후코스, 갈락토오스, 크실로오스 및/또는 굴쿠론산을 포함하는 후코이단 올리고머를 의미하며, 전형적으로 중량 평균분자량 500-5,000 Da의 후코이단 올리고머를 의미한다.As used herein, the term “low molecular weight fucoidan” or “low molecular weight fucoidan” means a sugar containing a sulfate group, preferably a fucoidan oligomer comprising a fucose, galactose, xylose and / or gulcuronic acid, including a sulfate group, Typically refers to fucoidan oligomers having a weight average molecular weight of 500-5,000 Da.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 유효성분으로 이용되는 생체이용성 저분자 후코이단은 500-2,000 Da의 중량 평균분자량, 보다 바람직하게는 500-1,800 Da 중량 평균 분자량, 가장 바람직하게는 700-1,400 Da의 중량 평균분자량을 갖는다.According to a preferred embodiment of the present invention, the bioavailable low molecular weight fucoidan used as the active ingredient has a weight average molecular weight of 500-2,000 Da, more preferably 500-1,800 Da weight average molecular weight, most preferably 700-1,400 Da It has an average molecular weight.
본 명세서에서 용어 “중량 평균분자량”은 본 발명의 후코이단에 존재할 수 있는 다양한 분자량을 가지는 후코이단 분자의 중량 평균분자량을 의미한다. 예 를 들어, 본 발명의 염증 질환 예방 및 치료용 후코이단을 고분자량의 후코이단에 유기산을 처리하여 얻은 경우에는, 처리 결과물에 다양한 분자량을 가지는 후코이단 분자들이 있을 수 있는 데, 상기 유기산 처리 결과물에 존재하는 후코이단 분자들의 중량 평균분자량이 본 명세서에 기재된 중량 평균분자량이 된다. 예를 들어, 본 발명의 후코이단의 중량 평균분자량이 1,500-3,000 Da인 경우, 바람직하게는 중량 평균분자량 3000-5000 Da:1250-1500 Da:600-750 Da:140-210 Da = 30-60:12-35:5-20:15-25를 가지는 후코이단의 혼합물일 수 있다.As used herein, the term “weight average molecular weight” refers to the weight average molecular weight of fucoidan molecules having various molecular weights that may be present in the fucoidan of the present invention. For example, when the fucoidan for preventing and treating inflammatory diseases of the present invention is obtained by treating an organic acid with a high molecular weight fucoidan, there may be fucoidan molecules having various molecular weights in the treatment result, which are present in the organic acid treatment result. The weight average molecular weight of the fucoidan molecules is the weight average molecular weight described herein. For example, when the weight average molecular weight of the fucoidan of the present invention is 1,500-3,000 Da, preferably the weight average molecular weight 3000-5000 Da: 1250-1500 Da: 600-750 Da: 140-210 Da = 30-60: It may be a mixture of fucoidan having 12-35: 5-20: 15-25.
따라서 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 생체이용성 저분자후코이단은 중량평균분자량 1,300-1,700Da:300-500Da:100-200Da:0-100Da = 35-55:10-30:20-40:1-10를 가지는 후코이단의 혼합물이고, 보다 바람직하게는 1,300-1,700Da: 300-500Da:100-200Da:0-100Da = 40-50:15-25:25-35:3-8를 가지는 후코이단의 혼합물이다.Therefore, according to a preferred embodiment of the present invention, the bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention has a weight average molecular weight of 1,300-1,700 Da: 300-500 Da: 100-200 Da: 0-100 Da = 35-55: 10-30: 20-40: Fucoidan mixture having 1-10, more preferably 1,300-1,700 Da: 300-500 Da: 100-200 Da: 0-100 Da = 40-50: 15-25: 25-35: 3-8 Mixture.
본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단은 고분자의 후코이단을 가수분해 및 그 산물을 수득하여 제조될 수 있다. 본 명세서에서, 용어 “고분자 후코이단”미역, 다시마, 톳 및 대황 등과 같은 해조류 그리고 전복, 오징어 및 불가사리 등 다양한 해양생물에서 추출된 고분자 후코이단이다. 본 발명의 저분자 후코이단은 다양한 방법을 이용하여 고분자 후코이단으로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 고분자 후코이단을 산(acids), 예컨대 피루브산, 구연산, 아세트산 또는 이의 혼합물을 이용하여 제조할 수 있다. 식용 유기산으로 이용되는 피루브산, 구연산, 아세트산 또는 이의 혼합물은 후코이단 다당체를 가수분해하는데 매우 효율적이다. 피루브산 및 구연산은 후코이단의 가수분해물을 식품으로 개발하는 경우에도 문제가 되지 않으면서도, 고분자량의 후코이단에 작용하여 효율적으로 가수분해하여 소망하는 저분자량의 후코이단을 제공하며, 이러한 후코이단의 분자량을 조절할 수 있는 산이라는 것을 확인하였다. 한편, 가수분해에 이용되는 아세트산으로는, 양조식초, 합성식초, 주정식초 및 기타식초와 같은 식용 식초의 형태의 것을 이용할 수 있다. 상기 식초는 아세트산이 주성분인 식용 식초로서, 양조식초는 아세트산 이외에 구연산, 젖산 및 숙신산등을 포함하며, 그 외 식초들은 아세트산이 대부분을 구성한다.The bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention can be prepared by hydrolyzing the fucoidan of the polymer and obtaining a product thereof. As used herein, the term “polymer fucoidan” is a polymeric fucoidan extracted from various marine organisms such as seaweeds such as seaweed, kelp, shellfish and rhubarb and abalone, squid and starfish. The low molecular fucoidan of the present invention can be prepared from the polymer fucoidan using various methods. For example, polymeric fucoidans can be prepared using acids, such as pyruvic acid, citric acid, acetic acid or mixtures thereof. Pyruvic acid, citric acid, acetic acid or mixtures thereof used as edible organic acids are very efficient for hydrolyzing fucoidan polysaccharides. Although pyruvic acid and citric acid are not a problem even when developing a hydrolyzate of fucoidan as a food, it acts on high molecular weight fucoidan and efficiently hydrolyzes it to provide a desired low molecular weight fucoidan, and can control the molecular weight of such fucoidan. I confirmed that it was a mountain. In addition, as acetic acid used for hydrolysis, the thing of the form of edible vinegar, such as vinegar, synthetic vinegar, spirit vinegar, and other vinegar, can be used. The vinegar is an edible vinegar, the main component of acetic acid, brewed vinegar includes citric acid, lactic acid and succinic acid in addition to acetic acid, the other vinegar is composed of acetic acid.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 생체이용성 저분자량 후코이단의 황산기 함량은 20-35%, 가장 바람직하게는 20-30%이다. 황산기는 후코이단이 생리적 활성을 나타내는 데 매우 중요한 부분이다(Biochem Pharmacol, 65, 2003). 따라서, 높은 황산기 함량은 나타내는 본 발명의 생체이용성 저분자량 후코이단의 염증 질환 치료능을 향상시킨다.According to a preferred embodiment of the present invention, the sulfuric acid group content of the bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention is 20-35%, most preferably 20-30%. Sulfate is a very important part of fucoidan represents the physiological activity (Biochem Pharmacol , 65, 2003). Thus, high sulfate content improves the ability of the bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention to treat inflammatory diseases.
본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단은 1-6의 다분산지수(polydispersity)를 갖으며, 바람직하게는 1-5, 보다 바람직하게는 1-4, 가장 바람직하게는 1-3의 다분산지수를 나타낸다. 이러한 작은 다분산지수는 본 발명의 저분자 후코이단의 크기 분포가 좁다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명의 저분자 후코이단은 물리적 특성 또는 생리학적 특성이 균일한 후코이단이며, 이를 제품화 하는 경우에는 균일한 품질의 저분자 후코이단 제품을 얻을 수 있다.The bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention has a polydispersity of 1-6, preferably 1-5, more preferably 1-4, and most preferably 1-3. . This small polydispersity index shows that the size distribution of the low molecular fucoidan of the present invention is narrow. Accordingly, the low molecular fucoidan of the present invention is a fucoidan with uniform physical or physiological properties, and when it is commercialized, a low molecular fucoidan product of uniform quality can be obtained.
본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단은 매우 낮은 점성도를 나타낸다. 바람직하게는, 0-100 센티푸아즈, 가장 바람직하게는 0-50 센티푸아즈를 나타낸다. 저분자 후코이단의 상기 낮은 점성도는, 저분자 후코이단의 물에 대한 용해도가 거의 100이라는 것을 의미한다.The bioavailable low molecular fucoidan of the present invention exhibits very low viscosity. Preferably, 0-100 centipoise, most preferably 0-50 centipoise. The low viscosity of low molecular fucoidan means that the low solubility of fucoidan in water is nearly 100.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 생체이용성 저분자 후코이단의 구성원소 비율은 탄소:수소:산소:질소:황 = 20-30:3-7:45-60:0.1-1.0:5.7-20이며, 보다 바람직하게는 탄소:수소:산소:질소:황은 23-25:4.3-5.1:52-58:0.1-0.6:6.0-10이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the component ratio of the bioavailable low molecular fucoidan is carbon: hydrogen: oxygen: nitrogen: sulfur = 20-30: 3-7: 45-60: 0.1-1.0: 5.7-20, and more. Preferably the carbon: hydrogen: oxygen: nitrogen: sulfur is 23-25: 4.3-5.1: 52-58: 0.1-0.6: 6.0-10.
본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단은 하기 실시예에 나타난 것처럼 염증 질환의 예방 및 치료에 있어 탁월한 효능을 발휘한다. The bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention exhibits excellent efficacy in the prevention and treatment of inflammatory diseases as shown in the following examples.
본 명세서에서, 용어 “염증 질환”은 일반적인 염증 질환을 포함하며, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 염증 질환은 동맥경화성 관상동맥질환, 관절염, 특발성폐섬유증, 만성폐색성폐질환 또는 사구체신염 질환이고, 보다 바람직하게는 관절염이다.In the present specification, the term “inflammatory disease” includes a general inflammatory disease, and according to a preferred embodiment of the present invention, the inflammatory disease is atherosclerotic coronary artery disease, arthritis, idiopathic pulmonary fibrosis, chronic obstructive pulmonary disease or glomerulonephritis disease More preferably arthritis.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단은 친염증사이토카인인 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 매트릭스 메탈프로테아제-9(MMP-9)의 발현을 억제하여, 염증 질환의 치료 효능을 나타낸다.According to a preferred embodiment of the present invention, the bioavailable low-molecular fucoidan of the present invention inhibits the expression of the proinflammatory cytokine, TNF-α (tumor necrosis factor-α) and matrix metal protease-9 (MMP-9), so that inflammation It shows the therapeutic efficacy of the disease.
본 발명의 조성물은 약제학적 조성물 및 식품 조성물로 제조될 수 있다.The compositions of the present invention may be prepared from pharmaceutical compositions and food compositions.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 (a) 저분자 후코이단의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.When the composition of the present invention is prepared as a pharmaceutical composition, the composition of the present invention comprises (a) a therapeutically effective amount of low molecular fucoidan; And (b) a pharmaceutically acceptable carrier.
생체이용성 저분자 후코이단은 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 약 학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.Bioavailable low molecular fucoidans can be prepared with pharmaceutically acceptable salts according to methods conventional in the art.
약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산 및 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid ), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산 및 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.As the pharmaceutically acceptable salt, acid addition salts formed by free acid are useful. Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered. In this case, organic acids and inorganic acids may be used as the free acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid and tartaric acid may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p -toluenesulfonic acid, acetic acid, trifluoroacetic acid, Citric acid, maleic acid, succinic acid, oxalic acid, benzoic acid, tartaric acid, fumaric acid, manderic acid, propionic acid, citric acid, lactic acid, glycolic acid, gluconic acid ( gluconic acid), galacturonic acid, glutamic acid, glutaric acid, glucuronic acid, glucuronic acid, aspartic acid, ascorbic acid, carbonic acid, vanic acid, and hydroiodic acid.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.In addition, bases can be used to make pharmaceutically acceptable metal salts. An alkali metal or alkaline earth metal salt is obtained by, for example, dissolving a compound in an excess alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate. At this time, as the metal salt, it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, and the corresponding silver salt is obtained by reacting an alkali metal or alkaline earth metal salt with a suitable silver salt (for example, silver nitrate).
저분자 후코이단의 약제학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 후코이단에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.Pharmaceutically acceptable salts of small molecule fucoidans include salts of acidic or basic groups that may be present in fucoidan, unless otherwise indicated. For example, pharmaceutically acceptable salts include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group, and other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, hydrogen phosphate, dihydrogen Phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p -toluenesulfonate (tosylate) salts, and methods or processes for preparing salts known in the art It can be prepared through.
생체이용성 저분자 후코이단을 포함하는 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며 이러한 물질로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.Pharmaceutical compositions comprising bioavailable low molecular fucoidans may further comprise suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions, and such materials include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol Xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate , Talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like, but are not limited thereto. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
본 발명에 따른 생체이용성 후코이단을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토오스 (lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.The pharmaceutical composition comprising the bioavailable fucoidan according to the present invention may be prepared in the form of powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to conventional methods. It can be formulated and used in the form. When formulated, diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants are usually used. Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, and capsules, and the like may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like in the extract or compound. It is prepared by mixing sucrose, lactose or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate or talc are also used. Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents, water and liquid paraffin. . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories. As the non-aqueous solvent and suspending agent, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used. As the base of the suppository, witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약제학적 조성물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.The preferred dosage of the composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for the desired effect, the pharmaceutical composition of the present invention is preferably administered at 0.0001 to 100 mg / kg, preferably at 0.001 to 10 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
본 발명의 조성물은 인간 등의 포유동물에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 및 관절내 주입 등으로 투여할 수 있다. The composition of the present invention can be administered orally or parenterally to mammals such as humans, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intraarticular injection, etc. Can be administered.
본 발명의 약제학적 조성물에서, 저분자 후코이단은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.In the pharmaceutical composition of the present invention, the low molecular weight fucoidan is included at 0.1 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 식품 조성물이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the composition of the present invention is a food composition.
즉, 본 발명은 염증에 의해 유발되는 질환의 치료 또는 예방 효과를 나타내는 상기 저분자 후코이단 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. That is, the present invention provides a health functional food comprising the low molecular fucoidan and food acceptable food additives exhibiting a therapeutic or prophylactic effect of a disease caused by inflammation. Examples of the food to which the bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention can be added include various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes, and health functional foods. At this time, the amount of the extract or compound in the food or beverage may be added at 0.01 to 15% by weight of the total food weight, the health beverage composition is 0.02 to 5 g, preferably 0.3 to 1 g based on 100 ml Can be added.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 저분자 후코이단을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있 다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드(예, 포도당 또는 과당 등), 디사카라이드(예, 말토스 또는 슈크로스 등), 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린 또는 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당; 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물) 및 합성 향미제(예,사카린 또는 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.The health functional beverage composition of the present invention is not particularly limited to other ingredients except low molecular weight fucoidan as an essential ingredient in the indicated ratio, and may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients, such as ordinary drinks. . Examples of the natural carbohydrates described above include conventional saccharides such as monosaccharides (e.g. glucose or fructose, etc.), disaccharides (e.g. maltose or sucrose, etc.), and polysaccharides (e.g., dextrin or cyclodextrins, etc.). Party; And sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol. As flavoring agents other than those mentioned above, natural flavoring agents (tauumatin, stevia extract) and synthetic flavoring agents (e.g., saccharin or aspartame, etc.) can be advantageously used. The proportion of said natural carbohydrates is generally about 1-20 g, preferably about 5-12 g per 100 ml of the composition of the present invention.
상기 외에 본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 및 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. In addition to the bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention, a variety of nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic flavors and natural flavors, such as flavoring agents, coloring and neutralizing agents (such as cheese, chocolate), pectic acid and salts thereof, Alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated beverages, and the like. In addition, the food composition of the present invention may contain fruit flesh for the production of natural fruit juice and fruit juice beverage and vegetable beverage.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다: The features and advantages of the present invention are summarized as follows:
(a) 본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단은 친염증사이토카인인 TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 매트릭스 메탈프로테아제-9(MMP-9)의 발현을 억제하여 염증성 반응의 유발을 간접적으로 차단시킴으로써 염증성 질환의 예방 또는 치료에 탁원한 효과가 있다.(a) The bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention inhibits the expression of the proinflammatory cytokines TNF-α (tumor necrosis factor-α) and matrix metalprotease-9 (MMP-9) to indirectly block the induction of inflammatory responses. By doing so, there is a terrible effect on the prevention or treatment of inflammatory diseases.
(b) 본 발명의 생체이용성 저분자 후코이단을 유효성분으로 포함하는 조성물은 동맥경화증 또는 관절염과 같은 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.(b) The composition containing the bioavailable low molecular weight fucoidan of the present invention as an active ingredient can be usefully used as a pharmaceutical and health functional food for the prevention and treatment of inflammatory diseases such as arteriosclerosis or arthritis.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .
실시예Example
제조예Production Example 1: One: 후코이단의Fucoidan 유기산 가수분해에 따른 Due to hydrolysis of organic acid 중분자Middle molecule 및 And 저분자Low molecular weight 후코이단Fucoidan 제조 Produce
식용 유기산인 2 N 농도의 피루브산과 아세트산 혼합액 (60/40, v/v)에 중량 평균 분자량 약 170,000 Da의 고분자 후코이단 1 %(w/v) 첨가시켜 100℃에서 4시간 동안 가열하면서 가수분해하였다. 그 결과 얻어진 혼합액을 분자량 3,000 Da의 멤브레인 필터로 거른 여액을 6시간 감압 농축시킨 후 이를 열풍 건조시켜 분말을 얻었다. 이는 실험에서 저분자 후코이단으로 이용한 것이다. 한편, 상기 가수분해 하여 얻은 가수분해물을 분자량 10,000 Da의 멤브레인 필터로 거른 여액을 다시 3,000 Da의 멤브레인 필터로 거른후 남은 상등액을 6시간 감압 농축시킨 후 이를 열풍 건조시켜 분말을 얻었다. 이는 실험에서 중분자 후코이단으로 이용한 것이다.1% (w / v) of polymer fucoidan having a weight average molecular weight of about 170,000 Da was added to pyruvic acid and acetic acid mixture (60/40, v / v) of edible organic acid, which was hydrolyzed at 100 ° C. for 4 hours. . The resulting mixture was concentrated under reduced pressure for 6 hours, filtered through a membrane filter having a molecular weight of 3,000 Da, followed by hot air drying to obtain a powder. This was used as a low molecular fucoidan in the experiment. Meanwhile, the hydrolyzate obtained by hydrolysis was filtered through a membrane filter having a molecular weight of 10,000 Da, and then filtered through a membrane filter of 3,000 Da, and the remaining supernatant was concentrated under reduced pressure for 6 hours, followed by hot air drying to obtain a powder. This was used as the middle molecule fucoidan in the experiment.
제조예Production Example 2: 유기산 가수분해로 생성된 2: produced by organic acid hydrolysis 저분자Low molecular weight 후코이단의Fucoidan 중량 평균분자량 Weight average molecular weight
제조예 1에서 수득한 유기산 처리 가수분해 산물의 분자량을 컬럼(PL aquagel,OH30*2, Waters Co. Ltd.), RI 검출기 (waters 410 Differential Refractometer, Waters Co. Ltd.), 펌프(waters 515 HPLC pump, Waters Co. Ltd.), 그리고 오토샘플러(waters 717 plus Autosampler, Waters Co. Ltd.)를 갖춘 겔 투과 크로마토그래피(Waters Co. Ltd.)로, pH 7 버퍼용액, 35℃에서, 분당 1 ml의 유속으로, 폴리에틸렌글리콜(Poly ethylene glycol; PEG)를 표준시료로 하여 분석하였다.The molecular weight of the organic acid treated hydrolyzate obtained in Preparation Example 1 was determined using a column (PL aquagel, OH30 * 2, Waters Co. Ltd.), RI detector (waters 410 Differential Refractometer, Waters Co. Ltd.), and pump (waters 515 HPLC). pump, Waters Co. Ltd., and gel permeation chromatography (Waters Co. Ltd.) with an autosampler (waters 717 plus Autosampler, Waters Co. Ltd.),
분석 결과, 가수분해 전에는 후코이단이 약 170,000 Da의 분자량을 나타내지만, 2 N 농도의 피루브산과 아세트산 혼합액 (60/40, v/v)을 이용하여 가수분해 한 경우에는 분자량 3,000 Da 멤브레인 필터로 여과시킴에 따라 1,300-1,700Da: 300-500Da:100-200Da: 0-100Da = 35-55: 10-30:20-40:1-10의 비율로 구성된 혼합분자량 형태로 전체를 평균한 중량 평균분자량이 700-1,400 Da의 분자량을 나타내었다. 이는 생체이용성 저분자 후코이단으로 본 실험에서 이용된다.As a result of analysis, fucoidan has a molecular weight of about 170,000 Da, but when hydrolyzed using a mixture of pyruvic acid and acetic acid (60/40, v / v) at a concentration of 2 N, it is filtered through a molecular weight of 3,000 Da membrane filter. Weight average molecular weight averaged in the form of mixed molecular weight in the ratio of 1,300-1,700 Da: 300-500 Da: 100-200 Da: 0-100 Da = 35-55: 10-30: 20-40: 1-10 The molecular weight of 700-1,400 Da is shown. It is a bioavailable low molecular fucoidan used in this experiment.
한편, 상기 제조예에서 얻은 중분자 후코이단은 2,500-4,000Da: 800-1,500Da:550-750Da: 100-200Da = 50-70: 5-20:1-10:15-25의 비율로 구성된 혼합분자량 형태로 전체를 평균한 중량 평균분자량이 2,500-5,000 Da의 분자량을 나타내었다.On the other hand, the molecular weight fucoidan obtained in the preparation example is a mixed molecular weight of 2,500-4,000 Da: 800-1,500 Da: 550-750 Da: 100-200 Da = 50-70: 5-20: 1-10: 15-25 The weight average molecular weight averaged in the form showed a molecular weight of 2,500-5,000 Da.
제조예Production Example 3: 유기산 3: organic acid 가수분해 시킨Hydrolyzed 후코이단의Fucoidan 황산기Sulfate 함량 content
제조예 1에서 제조한 생체이용성 저분자 후코이단 및 중분자 후코이단의 황산기 함량을 측정하였다.The sulfuric acid group contents of the bioavailable low molecular weight fucoidan and the medium molecular fucoidan prepared in Preparation Example 1 were measured.
황산기 함량은 0.5-2 N 염산용액을 사용하여 본 발명의 생체이용성 후코이단을 110℃에서 4시간 가수분해한 후, 가수분해물을 0.2 ml 취하여 4% TCA 용액 3.8 ml과 BaCl2-젤라틴 시약(Difco사, USA) 1 ml을 첨가하고 20분 동안 실온에 방치한 후 360 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다. K2SO4를 표준시료로 사용하였다.Sulfuric acid content is 0.5-2 N hydrochloric acid solution and hydrolyzed the bioavailable fucoidan of the present invention at 110 ° C. for 4 hours, 0.2 ml of hydrolyzate was added to 3.8 ml of 4% TCA solution and BaCl 2 -gelatin reagent (Difco Co., Ltd.). , USA) was added and allowed to stand at room temperature for 20 minutes and analyzed by measuring absorbance at 360 nm. K 2 SO 4 was used as the standard sample.
실험 결과, 본 발명에 이용되는 저분자 후코이단 및 중분자 후코이단은 가수분해전의 고분자량 후코이단 보다 생리활성에 중요한 역할을 하는 황산기 함량이 높게 나타났다. 예를 들어, 21% 황산기 함량을 나타내는 고분자량 후코이단을 이용하여 가수분해를 한 경우, 27%의 황산기 함량을 저분자 후코이단을 얻을 수 있었다. 한편, 21% 황산기 함량을 나타내는 고분자량 후코이단을 이용하여 가수분해를 한 경우, 24%의 황산기 함량을 중분자 후코이단을 얻을 수 있었다.As a result of the experiment, the low molecular weight fucoidan and the high molecular weight fucoidan used in the present invention showed higher sulfate content, which plays an important role in physiological activity than high molecular weight fucoidan before hydrolysis. For example, when hydrolysis was performed using a high molecular weight fucoidan having 21% sulfuric acid group content, a low molecular weight fucoidan was obtained with a sulfuric acid group content of 27%. On the other hand, when hydrolyzed using a high molecular weight fucoidan having a 21% sulfuric acid group content, it was possible to obtain a medium molecule fucoidan with a sulfuric acid group content of 24%.
제조예Production Example 4: 유기산 4: organic acid 가수분해 시킨Hydrolyzed 후코이단의Fucoidan 주요 원소분석 Major Elemental Analysis
제조예 1에서 제조한 저분자 후코이단 및 중분자 후코이단을 구성하는 주요 원소인 탄소, 수소, 산소, 질소 및 황 원소를 원소분석기(Elemental Analyzer, EA1108, Fisons instrument, Italy)를 이용하여 함량분석을 하였다. 결과는 표 2a 및 2b에 정리되어 있다.Contents of the elements of carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen and sulfur, which constitute the low molecular fucoidan and the medium molecule fucoidan prepared in Preparation Example 1, were analyzed using an elemental analyzer (EA1108, Fisons instrument, Italy). The results are summarized in Tables 2a and 2b.
표 2a에서 보듯이, 가수분해 전과 비교할 때 본 발명의 저분자량 후코이단은 주요 원소 함량이 다소 다른 양상이 보였으며, 특히 산소와 황원소의 함량이 증가됨을 알 수 있었다. 이 실험 결과는, 저분자 후코이단의 황산기의 함량이 증가한 분석 결과와 일치되는 것이다.As shown in Table 2a, the low-molecular-weight fucoidan of the present invention showed a slightly different aspect of the main element content, and in particular, the content of oxygen and sulfur element was increased compared to before hydrolysis. This experimental result is consistent with the analysis result in which the content of sulfuric acid group of low molecular fucoidan is increased.
제조예Production Example 5: 유기산 5: organic acid 가수분해 시킨Hydrolyzed 후코이단의Fucoidan 수용성 및 점성도 Water solubility and viscosity
제조예 1에서 제조된 저분자 후코이단을 각각 증류수를 사용하여 1-10% (w/v) 농도로 제조한 후, 농도에 따른 점성도를 점도계(Viscometer, LVT, Brookfield사, USA)를 이용하여 분석하였다.The low molecular weight fucoidan prepared in Preparation Example 1 was each prepared at a concentration of 1-10% (w / v) using distilled water, and the viscosity according to the concentration was analyzed using a viscometer (Viscometer, LVT, Brookfield, USA). .
실험 결과, 본 발명에서 이용되는 저분자 후코이단의 용액은 투명하여 수용성이 현저히 증가하였음을 알 수 있으나, 고분자 후코이단의 용액은 현탁도가 매우 크다. 또한, 본 발명에서 이용되는 후코이단은 고분자 후코이단과 비교하여 현저히 낮은 점성을 보였고, 이는 본 발명의 저분자 후코이단의 수용성이 우수함을 보여주는 것이다. 고분자 후코이단의 경우, 농도 2 w/v%, 4 w/v%, 6 w/v%, 8 w/v% 및 10 w/v%에서 각각 180, 300, 420, 510 및 580 센티푸아즈의 점성도를 나타내었고, 저분자 후코이단은 농도 2 w/v%, 4 w/v%, 6 w/v%, 8 w/v% 및 10 w/v%에서 각각 20, 50, 60, 70 및 100 센티푸아즈의 점성도를 나타내었다.As a result of the experiment, the solution of the low molecular fucoidan used in the present invention can be seen that the water solubility is remarkably increased, the solution of the polymer fucoidan is very high suspension. In addition, the fucoidan used in the present invention showed a significantly lower viscosity compared to the polymer fucoidan, which shows that the low molecular weight fucoidan of the present invention is excellent in water solubility. For polymeric fucoidans, concentrations of 180, 300, 420, 510, and 580 centipoise at concentrations of 2 w / v%, 4 w / v%, 6 w / v%, 8 w / v% and 10 w / v%, respectively Viscosity was shown, and low molecular weight fucoidan was 20, 50, 60, 70 and 100 centimeters at concentrations of 2 w / v%, 4 w / v%, 6 w / v%, 8 w / v% and 10 w / v%, respectively. The viscosity of Poise is shown.
실험예Experimental Example 1: One: 저분자Low molecular weight 후코이단의Fucoidan 관절염 치료 효과 및 대식세포 실험 Arthritis Treatment Effect and Macrophage Experiment
상기 실시예 1에서 얻은 저분자 후코이단을 콜라겐을 면역주사하여 관절염을 유발시킨 쥐에 식이하여 관절염의 치료효과를 측정하고, 마우스 대식세포주인 RAW264.7 세포에 처리하여 MMP-9 및 TNF-α의 발현에 대한 효과를 하기와 같은 방법으로 실험 하였다.The low-molecular fucoidan obtained in Example 1 was immunized with collagen to mice that induced arthritis to measure the therapeutic effect of arthritis, and treated with RAW264.7 cells, which are mouse macrophage lines, to express MMP-9 and TNF-α. The effect on the experiment was as follows.
1-1. 시료 준비1-1. Sample Preparation
제조예 1에서 얻은 저분자 후코이단 및 중분자 후코이단을 에탄올에 재현탁시켜 사용하였다.The low molecular weight fucoidan and the heavy molecule fucoidan obtained in Preparation Example 1 were resuspended in ethanol and used.
1-2. 관절염 모델 1-2. Arthritis model 생쥐에서In mice 후코이단의Fucoidan 치료효과 측정 Treatment effect measurement
40마리의 DBA 마우스(8-10 주령, Japan SLC, Inc, 일본)를 5개 그룹으로 분리하였다 (A, 관절염 유발이 없으며 무처리 그룹; B, 관절염을 유발하고 무처리 그룹; C, 관절염을 유발하고 고분자 후코이단 처리 그룹; D, 관절염을 유발하고 중분자 후코이단 처리 그룹; E, 관절염을 유발하고 저분자 후코이단 처리 그룹). 관절염 유발을 위해 DBA 마우스의 꼬리에 100 ㎍(0.05M 아세트산, 50 ㎕)의 2형 콜라겐을 50 ㎕의 보강제(Feund's complete adjuvant, Sigma., 미국)와 섞어 면역주사하고 2주후 왼쪽 발에 50 ㎍(0.05M 아세트산, 25 ㎕)의 콜라겐을 25 ㎕의 보강제와 섞어 2차 면역주사를 하였다. 2차 면역주사 후부터 후코이단을 5회/1주일 (300 mg/kg/회) 존대(zonde)를 이용하여 경구 투여하였다. 2차 면역주사 후부터 실험군의 구분을 알지 못하는 두 사람이 5일 간격으로 5주 동안 관절염의 발병정도를 측정하였다. 측정치는 2차 면역주사를 한 왼쪽 발을 제외한 나머지 3개의 발을 관찰하여 그 합을 얻었으며 총점은 12점이 만점이다. 관절염 발병정도를 측정하는 척도로 다음의 기준을 이용하였다: 0 점, 부종이나 종창이 없다; 1 점, 발 또는 발목관절에 국한된 경한 부종과 발적; 2 점, 발목관절에서 족근골에 걸친 경한 부종과 발적; 3 점, 발목관절에서 족근골에 걸친 중등도의 부종과 발적; 4 점, 발목에서 다리전체에 걸쳐 부종과 발적이 있고 관절경직이 나타는 경우.40 DBA mice (8-10 weeks old, Japan SLC, Inc, Japan) were divided into 5 groups (A, no arthritis-free group; B, arthritis-free group; C, arthritis) Induced, polymer fucoidan treatment group; D, induced arthritis and medium molecule fucoidan treatment group; E, induced arthritis and low molecule fucoidan treatment group). To induce arthritis, 100 μg (0.05M acetic acid, 50 μl) of
1-3 효소결합 면역흡착 분석법을 이용한 혈청에서 항-콜라겐 항체의 농도 측정1-3 Determination of Anti-Collagen Antibody Concentrations in Serum Using Enzyme Linked Immunosorbent Assay
면역주사에 쓰인 2형 콜라겐을 4 ㎍/㎕의 농도로 0.05M 소듐 카보네이트 코팅 완충용액 (pH9.6)에 녹여 96-웰 플레이트에 분주 (50 ㎕/웰)하고 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. 각 웰은 TBS에 0.05% 용해된 트윈 20으로 3회 세척 후, 1% 우태 혈청 알부민, 5% 자당 및 TBS 혼합물을 첨가한 뒤 30분 동안 실온에서 보관하였다. 세척용액으로 3회 세척 후 혈청을 50000배 또는 100000배 희석하여 웰에 분주하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 각 웰은 세척 완충 용액으로 3회 세척하고, HRP가 붙은 항-마우스 IgG 항체를 웰당 50 ㎕ 처리하여 1 시간 동안 직사광선이 미치지 않는 곳에서 반응시켰다.
각 웰은 세척 완충 용액으로 세척하고, 과산화수소수와 테트라메틸벤조다인 혼합물을 처리하여 20분 동안 직사광선이 미치지 않는 곳에서 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 2 N 황산을 각 웰에 첨가하고 흡광도(450 nm-540 nm)를 측정하였다. Each well was washed with a wash buffer solution and treated with a mixture of hydrogen peroxide and tetramethylbenzodine for 20 minutes under direct sunlight. 2 N sulfuric acid was added to each well to stop the reaction and absorbance (450 nm-540 nm) was measured.
1-4. 세포 배양 및 처리 과정1-4. Cell culture and treatment process
쥐의 대식세포주인 RAW 264.7는 미국세포주은행(American Type Culture Collection)에서, 구입하여 사용하였다. RAW 264.7 세포는 액상의 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM))에 10% 우태혈청(FBS), 10ml/L 페니실린-스트렙토마이신(10,000unit/ml 페니실린; 10,000mg/ml 스트렙토마이신, Sigma., 미국), 1.5 g/L 탄산수소나트륨, 및 4.5 g/L 글루코스를 첨가하여 조성된 배지가 공급되었으며, 5% 이산화탄소, 37℃로 조정된 이산화탄소 세포배양기 내에서 습한 상태를 유지하며 배양하였다.RAW 264.7, a mouse macrophage, was purchased from the American Type Cell Collection (American Type Culture Collection). RAW 264.7 cells were prepared in 10% fetal calf serum (FBS), 10 ml / L penicillin-streptomycin (10,000 units / ml penicillin; 10,000 mg / ml streptomycin, Sigma., USA) in liquid medium (Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)). ), Medium supplemented with 1.5 g / L sodium bicarbonate, and 4.5 g / L glucose was supplied, 5% carbon dioxide, Culture was maintained in a humid state in a carbon dioxide cell incubator adjusted to 37 ℃.
RAW 264.7 세포주로부터 후코이단에 의한 MMP-9 및 TNF-alpha의 발현 유무를 확인하고자 96-플레이트의 각 웰 당 5×104 세포를 분주하였다. 이때 배지는 0.1% 우태혈청을 함유한 DMEM을 사용하였다. 다음날 고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 10-100 ㎍/ml 농도로 세포배양 배지에 처리하고 24시간 뒤 세포를 제외한 상층액을 수집하였다.In order to confirm the expression of MMP-9 and TNF-alpha by fucoidan from RAW 264.7 cell line, 5 × 10 4 cells were dispensed per well of 96-plate. At this time, DMEM containing 0.1% fetal calf serum was used. The next day, polymer, medium and low molecular weight fucoidan were treated in cell culture medium at a concentration of 10-100 μg / ml, and the supernatants except cells were collected after 24 hours.
1-5. 매트릭스 1-5. matrix 메탈프로테아제(Matrix Metalloprotease)의Of Matrix Metalloprotease 활성 측정 Active measurement
세포 배양 상층액에서 매트릭스 메탈로프로테나제-9 및 -2의 활성을 측정하기 위하여 겔라틴을 첨가한 겔 전기영동을 실시하였다. 겔은 0.1% 겔라틴을 함유한 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔을 사용하였다. 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.01% 브로모페놀 및 0.125 M 트리스-염소의 혼합물과 상층액을 혼합하여 10% 아크릴아마이드 겔 상에서 전기영동을 실시하였다. Gel electrophoresis with gelatin was performed to measure the activity of matrix metalloproteinase-9 and -2 in cell culture supernatants. Gel was used sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel containing 0.1% gelatin. Electrophoresis was performed on a 10% acrylamide gel by mixing the supernatant with a mixture of 4% SDS, 20% glycerol, 0.01% bromophenol and 0.125 M tris-chlorine.
전기영동 후 겔은 소듐 도데실 설페이트를 제거하기 위하여 2.5% 트리톤 엑스-100으로 40분간 세척하고 트리톤 엑스-100을 제거하기 위하여 증류수로 40분간 세척하였다. 세척이 끝나면 효소와 기질을 반응시키기 위하여 37℃에서 반응 완충 용액(50 mM 트리스-HCl, pH7.6, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.02% NaN3)에 겔을 담가 14시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 겔은 0.1% 쿠마시 브릴리언트 블루 알250으로 염색시키고, 30% 메탄올, 10% 아세트산 및 60% 증류수의 혼합물로 탈색시켰다. After electrophoresis, the gel was washed with 2.5% Triton X-100 for 40 minutes to remove sodium dodecyl sulfate and 40 minutes with distilled water to remove Triton X-100. After washing, the gel was immersed in the reaction buffer solution (50 mM Tris-HCl, pH7.6, 0.15 M NaCl, 10 mM CaCl 2 , 0.02% NaN 3 ) at 37 ° C. for 14 hours to react the enzyme with the substrate. . The reaction gel was dyed with 0.1% Coomassie Brilliant Blue Egg 250 and decolorized with a mixture of 30% methanol, 10% acetic acid and 60% distilled water.
탈색시킨 겔은 건조시킨 뒤 밀도계(Image J software 1.37v, NIH, 미국)를 이용하여 결과를 확인하였다.The decolorized gel was dried and the result was confirmed using a density meter (Image J software 1.37v, NIH, USA).
1-6. 효소결합 면역흡착 분석법을 이용한 1-6. Enzyme-linked immunosorbent assay TNFTNF -α 측정-α measurement
세포배양 상층액에서 TNF-α의 농도를 측정하기 위하여, 상층액을 항-TNF-α항체(720 mg/ml in PBS, R&D systems)로 코팅된 96-웰 플레이트에 분주하고 4℃에서 16시간 동안 배양하였다. 각 웰은 PBS에 0.05% 용해된 트윈 20으로 3회 세척 후, 1% 우태 혈청 알부민, 5% 자당 및 PBS 혼합물을 첨가한 뒤 1시간 동안 실온에서 보관하였다. 세척용액으로 3회 세척 후 측정하고자 하는 상층액을 웰에 분주하고 실온에서 2시간동안 배양하였다.To determine the concentration of TNF-α in cell culture supernatants, supernatants were dispensed into 96-well plates coated with anti-TNF-α antibodies (720 mg / ml in PBS, R & D systems) and 16 hours at 4 ° C. Incubated for Each well was washed three times with Tween 20, 0.05% dissolved in PBS, and then stored at room temperature for 1 hour after the addition of 1% fetal bovine albumin, 5% sucrose and PBS mixture. After washing three times with the washing solution, the supernatant to be measured was dispensed into the wells and incubated at room temperature for 2 hours.
재조합 TNF-α(R&D systems)를 10-125 pg/ml의 농도로 기준치를 설정하였다. 각 웰은 세척 완충 용액으로 3회 세척하고, 바이오틴이 부착된 이차 항체(R&D, 미국)를 20 ng/ml의 농도로 처리해서 실온에서 2시간동안 배양하였다. 각 웰은 세척 완충 용액으로 3회 세척하고, 스트렙타비딘-HRP를 처리하여 20분 동안 직사광선이 미치지 않는 곳에서 반응시켰다. 각 웰은 세척 완충 용액으로 세척하고, 과산화수소수와 테트라메틸벤조다인 혼합물을 처리하여 20분 동안 직사광선이 미치지 않는 곳에서 반응시켰다. 반응을 중지시키기 위해 2 N 황산을 각 웰에 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Recombinant TNF-α (R & D systems) were set as baseline at a concentration of 10-125 pg / ml. Each well was washed three times with wash buffer solution and incubated for 2 hours at room temperature with biotin attached secondary antibody (R & D, USA) at a concentration of 20 ng / ml. Each well was washed three times with wash buffer solution and treated with streptavidin-HRP and allowed to react in direct sunlight for 20 minutes. Each well was washed with a wash buffer solution and treated with a mixture of hydrogen peroxide and tetramethylbenzodine for 20 minutes under direct sunlight. 2 N sulfuric acid was added to each well to stop the reaction, and the absorbance was measured at 450 nm.
실험 결과Experiment result
고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 관절염 모델 마우스에 식이시키고 관절염의 발병을 분석한 결과 고분자 후코이단은 관절염의 발병 정도를 심화시킨 반면, 중분자 후코이단과 저분자 후코이단은 발병정도를 낮추었다. 특히 저분자 후코이단의 발병저해효과가 더 높았으며 콜라겐 면역주사 후 43일 째의 측정치를 B 그룹(관절염을 유발하고 무처리, 양성대조군)과 비교한 결과 통계적으로 유의하게 발병정도가 감소하였음을 확인하였다 (도 1 참조).The high-molecular, low-molecular and low-molecular fucoidan were fed to arthritis model mice and analyzed for the onset of arthritis, while the high-molecular fucoidan and low-molecular fucoidan reduced the incidence of arthritis. In particular, the low-molecular fucoidan was more effective in inhibiting the onset of disease, and compared with the B group (arthritis-induced arthritis, no treatment, positive control group) at 43 days after collagen immunization, the incidence was significantly decreased. (See Figure 1).
관절염의 유발을 위해 콜라겐을 면역주사 하였는데, 이 경우 마우스의 혈청에서 항-콜라겐 항체의 농도가 증가하며 이 항체의 증가와 발병이 연관되어 있음은 공지된 사실이다. 이에 면역주사 후 49일 째에 각 실험군의 혈청을 얻어 50,000배 또는 100,000배 희석한 후 항-콜라겐 항체의 농도를 측정하였다. 그 결과 고분자 후코이단을 처리한 경우 항-콜라겐 항체의 혈청 농도가 통계적으로 유의하게 증가하였으며 저분자 후코이단을 처리한 경우 항-콜라겐 항체의 농도가 통계적으로 유의하게 감소함을 확인하였다. 중분자 후코이단의 경우 유의한 변화를 관찰하지 못하였다 (도 2 참조). 이러한 결과는 도 1의 실험에서 관찰한 결과와 일치하는 결과로 저분자 후코이단이 콜라겐에 대한 면역반응을 저해하여 항-콜라겐 항체의 생산을 막고 이로 인해 관절염의 발병이 저해됨을 시사한다.Collagen was immunized to induce arthritis, which is known to increase the concentration of anti-collagen antibodies in the serum of mice and is associated with an increase in the onset of these antibodies. Thus, 49 days after vaccination, the serum of each experimental group was obtained, diluted 50,000-fold or 100,000-fold, and the concentration of anti-collagen antibody was measured. As a result, it was confirmed that the serum concentration of anti-collagen antibody was significantly increased when the polymer fucoidan was treated and the concentration of the anti-collagen antibody was significantly decreased when the low molecular fucoidan was treated. No significant change was observed in the middle molecule fucoidan (see FIG. 2). These results are consistent with the results observed in the experiment of Figure 1 suggests that low-molecular fucoidan inhibits the immune response to collagen, thereby preventing the production of anti-collagen antibodies, thereby inhibiting the development of arthritis.
고분자 후코이단의 경우 저분자 후코이단과는 다르게 관절염의 발병정도를 심화시켰는데 그 원인을 확인하기 위해 고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 대식세포에 처리하고 세포의 반응을 관찰하였다. 그 결과 고분자 후코이단의 경우 대식세포의 염증반응을 일으키는 효과가 있어 TNF-α와 같은 친염증사이토카인과 MMP-9과 같은 매트릭스 분해효소의 발현을 유도함을 알게 되었다 (도 3a 및 3b 참조). 이러한 결과는 고분자 후코이단의 경우 체내 면역시스템을 자극하여 결과적으로 관절염의 발병을 심화 시킨다는 것을 시사하며 저분자 후코이단은 면역시스템을 자극하는 기능은 없고 반면에 항-콜라겐 항체 생산을 위한 면역반응을 저해하는 기능이 있어 이상의 결과를 얻었음을 알 수 있다. In the case of high molecular fucoidan, unlike the low molecular fucoidan, the incidence of arthritis was intensified. To determine the cause, macromolecules were treated with macromolecules, low molecular fucoidan, and cell responses were observed. As a result, it was found that the polymer fucoidan has an effect of causing an inflammatory response of macrophages to induce the expression of proinflammatory cytokines such as TNF-α and matrix degrading enzymes such as MMP-9 (see FIGS. 3A and 3B). These results suggest that the polymer fucoidan stimulates the body's immune system and consequently exacerbates the onset of arthritis. The low molecular fucoidan has no function of stimulating the immune system, while inhibiting the immune response for anti-collagen antibody production. It can be seen that this result was obtained.
본 발명의 추출물 및 화합물들을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.It describes an example of the formulation of a pharmaceutical composition comprising the extract and the compounds of the present invention, the present invention is not intended to limit this but only to explain in detail.
제제예Formulation example 1. One. 산제의Powder 제조 Produce
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.The above ingredients are mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
제제예Formulation example 2. 정제의 제조 2. Preparation of Tablets
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.After mixing the above components, tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
제제예Formulation example 3. 3. 캠슐제의Encapsulated 제조 Produce
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.According to a conventional capsule preparation method, the above ingredients are mixed and filled into gelatin capsules to prepare capsules.
제제예Formulation example 4. 주사제의 제조 4. Preparation of injections
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.According to the conventional method for preparing an injection, the amount of the above ingredient is prepared per ampoule (2 ml).
제제예Formulation example 5. 5. 액제의Liquid 제조 Produce
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.According to the conventional method for preparing a liquid, each component is added and dissolved in purified water, lemon flavor is added, the above components are mixed, purified water is added, the whole is adjusted to 100 ml by adding purified water, and then filled in a brown bottle. The solution is prepared by sterilization.
제제예Formulation example 6. 건강 음료의 제조 6. Manufacture of health drinks
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤, 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. After mixing the above components according to the conventional healthy beverage manufacturing method, and stirred and heated at 85 ℃ for about 1 hour, the resulting solution is filtered and obtained in a sterilized 2 L container, sealed sterilization, and then refrigerated It is used to prepare a healthy beverage composition of the present invention.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.Although the compositional ratio is relatively mixed with a component suitable for a favorite drink, it is also possible to arbitrarily modify the compounding ratio according to the regional or national preference such as the demand class, the demanding country, and the use purpose.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Therefore, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
도 1은 고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 관절염 모델동물에 식이 시킨 경우 관절염의 발병정도를 비교 측정한 그래프로 고분자 후코이단이 관절염의 발병을 촉진한 반면 저분자 후코이단은 관절염의 발병을 감소시킴을 확인할 수 있다.1 is a graph comparing the incidence of arthritis when the high-molecular, low-molecular and low-molecular fucoidan is fed to arthritis model animals. have.
도 2는 고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 관절염 모델동물에 식이 시킨 경우 항-콜라겐 항체의 발현정도를 비교 측정한 그래프로 고분자 후코이단은 항체의 발현을 증가시킨 반면 저분자 후코이단은 항체의 발현을 감소시킴을 확인할 수 있다.2 is a graph comparing the expression level of anti-collagen antibody when macromolecule, medium molecule and low molecule fucoidan were fed to arthritis model animals. High molecular fucoidan increased antibody expression while low molecule fucoidan reduced antibody expression. can confirm.
도 3a 및 3b는 고분자, 중분자 및 저분자 후코이단을 대식세포에 처리할 경우 고분자와 중분자 후코이단은 대식세포의 염증반응을 촉진하여 세포외 기질분해제인 MMP(matrix metalloproteinase)-9 및 TNF-αa의 발현을 유도한 반면 저분자 후코이단은 염증반응을 유도하지 않음을 확인한 결과이다.Figures 3a and 3b shows that when the macromolecules, macromolecules and low-molecule fucoidan is treated with macrophages, the macromolecules and the medium-molecule fucoidan promote the inflammatory response of macrophages to the extracellular matrix degrading agents MMP (matrix metalloproteinase) -9 and TNF-αa. While inducing expression, low molecular fucoidan did not induce an inflammatory response.
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