KR101017710B1 - 세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포 스페로이드(cell spheroid) 형태로 배양된 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제공한다. 또한, 본 발명은 세포 부착용 지지체를 제공하지 않고 성체 줄기세포를 배양함으로써 세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체를 대량으로 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 이식용 성체 줄기세포 집합체는 일반적인 단일 세포(single cell) 형태의 성체 줄기세포보다 체내에 이식 후세포 생존율이 높아 세포이식이 필요한 질환 부위에서 줄기세포 치료제의 치료효능을 제고할 수 있다.

줄기세포 이식, 세포 스페로이드

Description

세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체 및 그 제조방법{ADULT STEM CELL POPULATION OF CELL SPHEROID FORM FOR TRANSPLANTATION AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME}

본 발명은 줄기세포치료에 사용되는 줄기세포 집합체 및 그 대량 제조방법에 관한 것이며, 더 구체적으로는 체내 이식 후 생존율이 개선되어 줄기세포 치료제의 치료 효능의 향상 효과를 가지는 이식용 성체 줄기세포 집합체에 관한 것이다.

줄기세포 치료제를 포함한 세포치료제 (Cell therapy product)는 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가(autologous), 동종(allogeneic) 또는 이종(xenogeneic) 세포를 체외에서 증식 또는 선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위(최소한 이상의 조작: more-than-minimal manipulation)를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용하는 의약품으로 정의된다. 줄기세포 치료제는 이 중 특히 줄기세포를 사용하는 경우를 의미하며, 현재 대표적인 응용 분야는 신경질환, 심질환, 폐질환, 간질환, 암과 같이 손실된 세포의 회복과 재생이 필수적이면서도 자연스럽게는 잘 이루어지지 않는 경우에서 활발하게 개발이 진행되고 있다.

줄기세포는 다분화 잠재능을 가지고 있어서 손상된 조직에서 필요한 세포로의 분화를 유도할 수 있다는 점에서 세포치료에서 잠재력이 크지만, 현재 개발수준에서는 체내 이식 후 생존율이 높지 않아서 실제로 임상 적용에서 광범위하고 안정적으로 성공한 예를 찾기 어렵다.

지방, 골수 또는 제대혈 유래 줄기세포치료제가 허혈성 질환 치료에 사용될 수 있고, 혈관을 재생시킬 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이 경우 줄기세포를 2차원 배양접시에서 배양하고, 부착되어 있는 배양한 세포를 트립신 처리에 의해 수거한 후 수거된 세포를 단일 세포(single cell)의 형태로 환자의 허혈성 병변부위에 이식하는 방법이 일반적으로 사용된다. Stamm C, Westphal B, et al., Lancet (2003년)에는 골수 유래 줄기세포를 배양하지 않고 또는 2차원적 배양접시에서 배양하여 단일 세포 형태로 허혈성 심근 질환 부위에 이식함으로써 심장 기능 회복 및 조직 재생의 효율을 높이는 내용을 보고하였다.

그러나, 허혈부위에 이식된 줄기세포의 대부분은 사멸되어 세포치료제의 치료효능이 크지 않은 문제점이 있어 왔다. 특히 트립신 처리를 통해 수거된 세포들은 트립신에 의해 세포가 해를 받거나, 세포에 붙어있는 세포외기질(extracellular matrix)가 트립신 효소에 의해 세포로부터 이탈되어, 세포외기질에 포함된 성분들이 소실되어 환자에 이식 후 세포 생존율이 낮아진다. 또한, 2차원 배양접시를 이용한 세포 배양은 대량 배양이 어려워 많은 수의 세포가 요구되는 임상 치료에 적합하지 않기 때문에 세포치료제의 임상 적용에 어려움이 있다.

Rehman J 등(Circulation 2004; 109(10): 1292-8)은 지방 유래 줄기세포에서 혈관 재생에 관련된 인자가 분비된다는 것을 보고한다. 그러나, 이 방법에서도 역시 줄기세포는 단일 세포 형태로 허혈 부위에 이식되어 이식된 세포의 생존율이 극히 낮았다.

Nakagami H 등(Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2005; 25(12): 2542-7)은 지방유래 줄기세포를 VEGF와 HGF로 처리한 후 마우스 하지 허혈 부위에 이식하는 내용을 보고하였다. 그 결과 VEGF와 HGF로 처리하지 않고 이식된 지방 유래 줄기세포보다 혈관 재생 효과가 높았다. 그러나, VEGF, HGF 등의 성장인자는 농도에 따라서는 암을 유발할 가능성이 높아 임상 허가도 주어지지 않을 정도이므로 임상 적용에는 위험이 있다.

최근 보고(Rehman et al., 2004년)에 따르면 지방조직에서 추출한 지방 줄기 세포(adipose-derived stromal cells)는 혈관 재생에 직접적으로 참여하지는 않으나, 혈관 재생 인자를 분비하여 혈관 재생을 유도하는 가능성이 높은 것으로 확인되었다. 하지만 허혈성 질환 부위에 이식된 줄기세포들은 생존율이 매우 낮아, 이식된 줄기세포에서 허혈성 질환 부위로 분비되는 혈관 생성 인자의 양이 감소하여 치료 효율이 낮았다.

따라서, 이식 후에도 세포 생존율이 높고 대량의 세포 배양이 가능하여 높은 세포치료 효능을 나타내면서도 안전성이 담보되는 이식용 줄기세포 치료제의 개발 필요성이 있다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 줄기세포치료제의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 종래 사용되던 방법인 2차원적인 세포 배양 결과물을 이식하는 방법 대신 3차원적 배양을 통하여 세포 스페로이드 형태을 제조하면 시험관 내 세포 생존율이 유의하게 증가하는 것을 발견하여 시험관 내 생존율 및 세포 내 이식의 치료효과가 유의하게 개선된 본 발명의 이식용 성체 줄기세포 집합체 및 그 제조방법을 완성하였다.

본 발명의 한 구체예에서는 3차원 스피너 플라스크 (spinner flask) 생물 반응기 배양 방식을 이용하여 줄기세포를 세포 스페로이드 형태로 대량으로 제조한 후 허혈 질환부위 등 치료가 필요한 부위에 이식함으로써 종래 사용되던 2차원 배양에 의한 단일 형태의 세포이식 방법보다 허혈성 질환 부위에 이식된 줄기세포의 생존율을 높이며, 세포 한 개당 혈관 재생 인자의 분비량을 보다 높게 분비하도록 유도하여 줄기세포치료제의 허혈 질환 치료효능을 높일 수 있다. 세포를 세포 스페로이드 형태로 배양하면 이식을 위해 세포를 수거할 때 트립신 효소처리가 필요없으므로 효소에 의하여 세포에 가해질 수 있는 피해를 줄일 수 있고 세포외기질도 손상됨 없이 세포에 붙은 채로 이식되어 이식 후 세포의 생존율이 높아진다. 게다가, 종래에 사용되던 2차원 배양법들과는 달리 3차원 배양방법은 대량 배양 공정에 적합한 방법이기 때문에 임상 적용하기에 필수적인 공정요소인 세포양의 증대까지 달성할 수 있는 추가적 이점이 있다.

따라서, 본 발명의 한 양태에서는 세포 스페로이드(cell spheroid) 형태로 세포 외 배양된 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제공한다. 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 바람직하게 선택될 수 있다.

본 발명의 성체 줄기세포 집합체가 사용될 수 있는 질환은 제한되지 않는다. 줄기세포 이식이 필요한 어떠한 질환에 대하여도 적용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 성체 줄기세포 집합체는 당뇨, 각종 심장질환을 포함하는 허혈성 질환의 허혈조직 부위 이식될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에서는 저산소 조건 하에서 세포 부착 지지체를 제공하지 않고 성체 줄기세포를 배양함으로써 세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기 세포 집합체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 구체예에서 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 선택될 수 있다. 본 구체예의 방법에 따라 제조되는 성체 줄기세포 집합체는 줄기세포 이식이 필요한 어떠한 질환에 대하여도 적용될 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 저산소 조건 하에서 세포 부착 지지체를 제공하지 않고 성체 줄기세포를 배양함으로써 세포 스페로이드 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제공하는 단계 및 상기 성체 줄기세포 집합체를 환자의 필요 부위에 이식하는 단계를 포함하는 성체 줄기세포의 이식 방법을 제공한다. 줄기세포 집합체의 환부 이식은 당업계에 알려진 어떠한 세포 이식방법에 의하여 수행될 수 있으며, 줄기세포 치료제의 이식 방법은 당업자에게 주지이다.

상기 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 이식이 필요한 질환에 따른 필요에 따라 선택될 수 있다. 한 구체예에서 상기 줄기세포 집합체는 허혈성 질환 환자의 허혈 조직 부위에 이식될 수 있다. 허혈 조직 부위에 이식된 본 발명에 따르는 세포 스페로이드 형태의 줄기세포 집합체는 이식된 세포 생존율이 종래 방법에 의한 이식에서 보다 높고, 세포단 혈관 재생인자 등의 필요한 단백질 분비가 더 높으며 허혈 조직에서 혈관 재생 효과가 더 커서 줄기세포 치료제의 허혈질환 치료 효과가 뛰어나다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르는 이식용 성체 줄기세포 집합체는 단일 세포 형태로 배양된 성체 줄기 세포보다 체내 이식 후 이식된 부위 에서 세포 생존율이 높으므로, 예를 들어 허혈 조직에 이식되는 경우 혈관 재생 촉진효과가 개선되어 줄기세포 치료제의 허혈 질환 치료효능을 제고할 수 있다. 본 발명에 따르는 이식용 성체 줄기세포 집합체의 제조방법은 세포를 2차원 배양 접시 등에서 배양하는 종래의 방법과는 달리 3차원 배양방법을 사용하므로 세포를 이식용으로 수거하는 과정에서 트립신 등의 효소처리가 필요하지 않아 효소로 인한 세포 손상이 없고 세포외기질도 그대로 유지되는 효과가 있다. 이로 인하여 이식 후 세포부착이 용이하여 세포 사멸이 줄어들어 세포치료제의 치료 효능이 증대된다. 또한 본 발명의 이식용 성체 줄기세포 집합체의 제조방법은 종래의 세포 부착방식의 배양방법과는 달리 대량 배양 공정에 적합한 형태이기 때문에 다량의 수를 확보하여 이식해야 하는 임상 적용에 더 유리한 추가적 효과가 있다.

본 발명의 이식용 성체 줄기세포 집합체 및 그 제조방법은 허혈성 혈관 질환의 혈관 재생 치료를 위한 세포치료제의 개발에 유용하게 사용될 뿐 아니라 당뇨, 심장 질환 등 허혈성 혈관 질환의 혈관 재생 치료제로서의 잠재성이 매우 높다.

이하의 실시예를 통하여 본 발명의 특정 구체예를 설명한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 일반적, 사전적 의미로 한정하여 해석되어서는 안되며 본 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위하여 특정 용어의 개념을 적절한 범위 내에서 정의할 수 있다. 본 명세서 또는 당업계 종래 기술을 고려하면 여기에서 개시하는 본 발명의 범위 내에 있는 다양한 균등 또는 변형된 구체예들 또한 당업자에게 자명하다. 이하에 기재하는 구체예는 예시적인 목적으로 기술된 것 일 뿐이며, 본 발명의 범위는 오직 특허청구범위에 의하여만 한정된다.

실시예1: 세포 스페로이드의 제조

1.1.지방 유래 줄기 세포의 배양

인간 지방 조직을 추출하여, 포스페이트-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)로 세척 후에 잘게 조각을 내었다. 지방 조직의 조각을 콜라게나아제 타입 1 용액에서 37 ℃, 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 조직에서 분리된 세포를 α-최소 필수 배지(minimal essential medium)에서 배양하였다.

1.2. 지방 유래 줄기 세포의 3차원 배양

지방 유래 줄기 세포의 3차원 배양을 위해 3 일간 3차원 스피너 플라스크(spinner flask)에서 다른 성장인자를 첨가하지 않고 배양하여 주사전자현미경(SEM) 및 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin) (H & E) 염색의 광학 현미경 사진을 통해 세포 스페로이드(cell spheroid) 생성 유도를 관찰하였다.

3차원 배양법을 이용하여 3 일간 지방 유래 줄기 세포를 배양한 결과, 세포 스페로이드가 형성되었음을 확인하였다. H&E 염색법 (도 1의 A,B)과 주사전자현미경 이미지(도 1의 C)를 확인한 결과, 세포 스페로이드가 내부 괴사 없이 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 제조된 세포 스페로이드의 시험관 내 특성 확인

2.1. 세포 스페로이드 내 세포의 사멸 및 증식 특성

저산소(hypoxia)(허혈 조건 조성: 1% O₂, 0% 혈청, 다른 언급이 없는 경우 이하 같음) 조건에서 3 일간 배양한 세포들을 TUNEL 염색과 RT-PCR을 통해 세포사 분석을 실시하였다. TUNEL 염색은 세포사 세포의 특성인 단편화된(fragmented) DNA를 검출함으로써 세포사의 정도를 측정하는 염색법이다. 3차원 배양법을 사용하여 제조된 세포 스페로이드(도 2의 A)가 2차원 배양 (도 2의 B)에 비해 통계학적으로 유의한 수준의 감소된 세포사를 보였으며(도 2의 C) 이러한 경향은 RT-PCR을 통해서도 일치함(도 2의 D)을 확인하였다.

RT-PCR을 위해서 수거된 세포와 조직들은 세포 용해 용액 (Trizol solution)을 처리하거나 잘게 부순 후 분쇄기를 이용해 완전히 용액 상태로 제작한다. 클로로포름 0.2ml 을 처리하여 15초간 뒤섞은 뒤 15분 동안 상온에서 방치하였다. 12,000rpm 으로 15분간 4도씨에 원심분리한 뒤 투명한 층만 뽑아 80% 이소프로판올을 동량 처리하고 4도씨에서 10분 동안 방치후 다시 원심분리하였다. 상등액 제거 후 1ml 75% 에탄올에 넣어 4℃ 3분 정도 방치 후 다시 원심분리하고 상등액을 제거한 뒤 공기 중에 10분간 건조하였다.

RNA 1㎕에 RNA 완충용액 7㎕와 이차 증류수 2㎕를 넣고 1% 아가로스젤에 적재하여 비특이 결합용 프라이머 1㎕ 처리 후 Super Script Ⅱ Reverse Transcriptase 등의 처리를 거쳐 RNA 를 정량하여 cDNA 를 제작였다. 이후 프라이머 센스 0.5㎕, 프라이머 안티센스 0.5㎕, 2x 완충용액 I 12.5㎕, 증류수 6.75㎕, dNTP 혼합용액 4㎕ 와 표지인자텍 0.25㎕를 혼합하여 제작된 샘플들의 cDNA 0.5㎕ 씩 사용하여 RT-PCR을 94℃ 5분간 / 94℃ 30초간 / 60℃ 45초간 / 72℃ 45초간 과정을 거쳐 실시하였다.

프라이머 이름	프라이머 구성 (sense)	프라이머 구성 (anti-sense)
bcl-XL	5'-CGG GCA TTC AGT GAC CTG AC -3'	5'-TCA GGA ACC AGC GGT TGA AG-3'
bcl-2	5'-AGA TGT CCA GCC AGC TGC ACC TGA-3'	5'-AGA TAG GCA CCA GGG TGA GCA AGC T-3'
bax	5'- GTG CAC CAA GGT GCC GGA AC-3'	5'-TCA GCC CAT CTT CTT CCA GA-3'
p53	5'-CGG GAT CCA TGG AGG AGC CGC AGT CAG AT-3'	5'- CCG CTC GAG TTT CTG GGA AGG GAC AGA AGA -3'
VEGF	5'-GCA GAA GGA GGA GGG CAG AAT-3'	5'-ACA CTC CAG GCC CTC GTC ATT-3'
bFGF	5'-CTT TGG CTG CTA CTT GGA GG-3'	5'-GAA GCT TTC CAG CAA AGT GG-3'
HGF	5'-GTT ATC GTG GGA ATG GCA A-3'	5'-ATG ATC CTC CGC AGA TAT-3'
β-액틴	5'-GCA CTC TTC CAG CCT TCC TTC C-3'	5'-TCA CCT TCA CCG TTC CAG TTT TT-3'

또한, 저산소 조건에서 3 일간 배양한 세포들의 DNA 정량을 통해, 세포 증식도의 차이를 확인한 결과 3차원 배양법을 이용해 만들어진 세포 스페로이드가 2차원 배양법 배양된 세포에 비해 통계학적으로 유의한 수준의 증가된 세포 증식도를 모든 배양 시점에서 나타내었다(도 3).

2.2. 세포 스페로이드의 생존 관련 물질의 분비 특성

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 배양에 사용한 배지를 수거하여 (저산소 조건이 아닌) 정상산소 배양 조건에서 새로운 지방 유래 줄기 세포를 배양한 후 세포사 정도를 분석하였다. 3차원 배양법을 이용해 만들어진 세포 스페로이드의 배양액을 사용한 경우에서 2차원 배양법을 이용한 세포 배양액을 사용한 경우보다 세포사가 감소하였다(도 4). 이와 같은 결과는 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양 조건에서 배양된 세포보다 많은 양의 세포 생존 관련 물질을 분비한다는 것을 시사한다.

2.3. 세포 생존율 분석

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 배양된 세포를 대상으로 MTT 조사법 (도 5의 A)와 뉴트럴 레드 조사법(neutral red assay)(도 5의 B)을 실시하여 세포생존율을 분석하였다. 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양시보다 높은 세포 생존율을 나타내는 것을 확인하였다(도 5).

2.4. 혈관생성인자 및 세포 생존율 향상인자 분비 특성

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양 세포에 비해 많은 양의 bFGF(basic Fibroblast Growth Factor:섬유아세포 기본 성장인자)(세포 생존율 향상 및 혈관 재생에 관여), VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor: 혈관내피 성장인자)(세포사 감소 및 혈관 재생에 관여), HGF(간세포 성장인자: hepatocyte growth factor)(세포사 감소 및 혈관 재생에 관여)의 분비량이 증진되는 것을 확인하였다(도 6).

또한, 저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 면역염색을 통해 정성적으로 확인한 결과 3차원 세포 스페로이드는 HGF, VEGF, bFGF가 활성도가 유지된 단백질 형태로 분비되고 있음을 확인하였다(도 7의 A, B, C). 게다가, 혈관 생성 인자와 세포 생존율 향상 인자의 분비량이 2차원 배양에 비해 증진되는 것 역시 확인하였다(도 7 하단).

2.5. 세포 부착 특성

저산소 조건에서 3 일간 세포를 배양한 후, 2차원 배양된 세포와 3차원 세포스페로이드의 세포외기질에 존재하는 세포부착 단백질인 라미닌(laminin), 피브로 넥틴(fibronectin)과 비부착성 세포사멸(ANOIKIS: 아노이키스) 관련 단백질(AKT)을 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 확인하였다. 3차원 세포 스페로이드에서 세포 표면 부착 단백질과 항-세포사 관련 인자의 발현이 2차원 배양에 비해 높게 나타났다(도 8a).

3차원 세포 스페로이드를 제작한 후 배양용 접시에 옮긴 후 시간대별로 부착특성 및 형태를 관찰하였다. 3차원 세포 스페로이드는 36시간 내에 2차원 배양과 같은 형태로 세포가 퍼져나갈 수 있음을 확인하였다(도 8b). 이와 같은 결과는 3차원 배양에 의하여 생성된 세포 스페로이드를 생체 내로 이식할 경우에도 세포가 이식 부위에서 부착 및 이식될 수 있다는 가능성을 시사하는 것이다.

실시예 3: 세포 스페로이드의 생체 내 이식 및 특성 확인

3.1. 세포 스페로이드의 생체 내 이식

마우스 하지 허혈 모델을 유도하였다. 마우스 하지 허혈 모델은 Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation. 2007116:2409-2419.에서 밝힌 바와 같이 실시되었다. 마우스 하지 허혈 모델 유도에 사용된 마우스는 4 주령, 암컷 면역 결핍 마우스를 사용하였으며, 시술 당시 20 g의 평균 체중을 유지하고 있었다. 하지 허혈 모델 유도에 사용된 마우스들은 럼푼 (10mg/kg) 과 케타민 (100mg/kg)을 1:9의 비율로 혼합하여 마취되었다. 고동맥과와 이하 지류 혈관들은 피부 절개 후 6-0 수술용 봉합사를 사용하여 상단과 하단의 혈관을 묶은 후 제거되었다. 외부 장 골 동맥의 시작 지점을 6-0 수술용 봉합사을 이용하여 묶고, 복재와 슬와 동맥으로로 분리되는 하단 혈관 역시 6-0 수술용 봉합사를 이용하여 묶었다. 상하단의 묶음으로 혈류의 흐름을 차단한 후 사이에 존재하는 고동맥을 모두 제거하였다. 실험에 사용된 마우스들은 모두 "the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (published by the National Institutes of Health, NIH publication No. 85-23, revised 1996) 에 따라 관리되었다.

3차원 배양을 통하여 제조된, 배양 중의 지방 유래 줄기 세포의 스페로이드를 수거하여, 다른 세포 이식용 지지체를 사용하지 않고 세포 스페로이드만 마우스 하지 허혈 부위에 이식하였다.

지방 유래 줄기세포를 2차원 배양한 후 트립신 처리하여 이식한 실험군(2D ADSC)과 3차원 배양하여 생성된 세포 스페로이드(3D ADSC)를 이식한 실험군의 이식 28일 후 H&E 염색을 수행하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 정상에 더 가까운 조직 형태를 나타내었다(도 9a).

한편, 지방 유래 줄기세포를 2차원 배양 후 트립신 처리하여 이식한 실험군 (2D ADSC)과 3차원 배양하여 생성된 세포 스페로이드(3D ADSC)를 이식한 실험군의 이식 28일 후에 massion's trichome 염색을 수행하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 정상에 더 가까운 조직 형태를 나타내었다. 게다가, 2D ADSC 실험군에서는 하지 허혈 모델 유도에 의한 근육의 섬유화가 다량 발견되었다(도 9b).

3.2. 생체 내 이식된 세포의 생존율

세포 이식 3일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 이식된 세포의 세포사 진행을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 인간 특이적 프라이머(human specific primer) 중 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 항-세포사 인자(bcl-2)가 많이 발현되고 있었으며, 세포사 촉진 인자(pro-apoptotic factor: bax)의 발현이 감소하고 있음을 확인하였다. 이로부터 세포 이식 시 3차원 세포 스페로이드가 2차원 배양 후 트립신 처리 후 이식된 세포에 비해 세포 생존율이 높음을 확인할 수 있었다(도 10 a). 한편, 세포 이식 3일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 이식된 세포의 세포사 진행을 캐스파아제-3 면역염색을 통해 확인하였다.

마우스 하지 허혈 모델 유도 후 3일과 28일째 허혈이 유도된 하지 근육 조직을 수거하여 동결박절용 고정 용액에 담근 후 동결 박절을 위해 냉동 보관하였다. 동결 박절은 10 ㎛로 영하 20도에서 제작되었다. 동결 박절된 조직들은 4% 파라포름알데히드 용액에서 10분간 상온 고정되었으며, 이후 영하 20도에서 에탄올과 아세트산 (2:1) 혼합 용액에서 2차 고정되었다. 실험에 사용된 모든 형광 면역 염색에서 이식한 인간 세포를 염색하기 위해서 인간 세포 핵과 반응하는 항체를 사용하였으며 모세혈관과 세동맥을 염색하기 위해서 vWF 항체와 평활근 알파 액틴 (smooth muscle (SM) -actin) 항체를 각각 사용하였다. 혈관생성인자 분비효과를 보기 위해서는 혈관내피 형성 인자, 간세포성장인자, 그리고 섬유아세포성장인자의 항체가 각각 사용되었다. 위에서 사용된 항체들은 적색(rhodamine) 과 녹색(FITC) 이차 항체를 사용하여 형광표지하였다. 면역 염색이 종료된 후에는 모든 샘플들은 DAPI 용액을 사용하여 덮었다. 실험에 사용된 염색 방법과 염색용 시료들은 Cho SW, Moon SH, Lee SH et al. Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endothelial-like cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia. Circulation. 2007116:2409-2419.에서 밝힌 바에 기초하여 실시되었다.3D ADSC 실험군이 2D ADSC 에 비해 이식된 세포(DiI 표지-적색)가 다량 존재하고 있음을 확인하였고, 세포사(녹색)가 진행 중인 이식된 세포가 2차원 배양 후 트립신 처리 후 이식된 세포에 비해 현저히 적은 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 통계학적으로도 두 실험군 간에 유의한 차이를 보였다(도 10b).
3.3. 생체 내 혈관생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비

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세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 각 인자들에 대한 항체를 사용한 면역염색을 통해 확인하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비해 HGF, VEGF, bFGF를 더 많이 분비하고 있음을 확인하였다(도 11a).

또한, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 인자 및 세포 생존율 향상 인자의 분비를 RT-PCR을 통해 확인하였고, 면역 염색 실험과 유사하게 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비해 HGF, VEGF, bFGF를 유의하게 더 많이 분비하고 있음을 확인하였다(도 11b).

3.4. 생체 내 혈관 재생

세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 정도를 평활근 알파 액틴(smooth muscle alpha actin) 면역염색을 통해 확인 하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비하여 유의하게 높은 세동맥(arteriole)의 분포를 보임을 확인하였다(도 12a).

또한, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 혈관 생성 정도를 vWF 면역염색을 통해 확인하였다. 유사하게, 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비하여 유의하게 높은 모세혈관(capillaries)의 분포율을 보임을 확인하였다(도 12b).

3.5. 생체 내 이식 후의 동물의 외형적 변화

세포 이식 후 주기적으로 하지 허혈 부위의 외형적 변화를 관찰하였다. 3D ADSC 실험군이 2D ADSC 실험군에 비해 현저히 높은 수준의 형태 유지를 보이고 있었다. 특히 사지 손실(limb loss)이나 발 괴사(foot necrosis)의 정도가 유의하게 감소한 것을 확인하였다(도 13).

도 1은 3차원 배양 방법에 따라 지방 유래 줄기 세포를 배양하여 형성된 세포 스페로이드의 H&E 염색법에 의한 사진(도 1의 A,B) 및 주사전자현미경 이미지(도 1의 C)를 나타낸다.

도 2는 3차원 배양법을 사용하여 제조된 세포 스페로이드(도 2의 A) 및 2차원 배양에 의한 세포(도 2의 B)의 사진 및 TUNEL 염색과 RT-PCR을 통한 세포사 분석 그래프 및 PCR 신호 사진이다.

도 3은 3차원 배양 및 2차원 배양에 의한 세포의 세포 증식도를 배양 시간에 따라 측정한 그래프이다.

도 4는 여러 조건(3차원, 2차원 배양 및 신선한 배지)에서 세포 배양 후 사용 배지를 사용하여 새로운 지방 유래 줄기 세포를 배양한 후 세포사 정도를 분석한 결과이다.

도 5는 저산소 조건 배양 후 배양된 세포에 대한 MTT 조사법 (도 5의 A)와 뉴트럴 레드 조사법(도 5의 B) 결과이다.

도 6은 저산소 조건 세포 배양한 후, bFGF, VEGF, 및 HGF의 분비량를 RT-PCR을 통해 확인한 데이터이다.

도 7은 저산소 조건 세포 배양한 후 분비된 bFGF, VEGF, 및 HGF 단백질의 활성도(도 7의 A, B, C) 유지 여부 및 그 분비량을 기록한 그래프이다(도 7 하단).

도 8은 저산소 조건 세포 배양한 후 세포외기질에 존재하는 세포부착 단백질인 라미닌(laminin), 피브로넥틴(fibronectin)과 비부착성 세포사멸(ANOIKIS: 아노 이키스) 관련 단백질(AKT)에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과(도 8a), 및 3차원 세포 스페로이드를 제작한 후 배양용 시쉬에 옮긴 후 시간대별로 촬영한 현미경 사진(도 8b)이다.

도 9는 마우스 하지 허혈 모델에서, 지방 유래 줄기세포를 2차원 배양한 후 트립신 처리하여 이식한 실험군(2D ADSC)과 3차원 배양하여 생성된 세포 스페로이드(3D ADSC)를 이식한 실험군의 이식 28일 후 H&E 염색 결과(도 9a) 및 massion's trichome 염색 결과(도 9b) 사진이다.

도 10은 마우스 하지 허혈 모델에서, 세포 이식 3일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 항-세포사 인자(bcl-2) 및 세포사 촉진 인자(pro-apoptotic factor: bax) 발현에 대한 RT-PCR 결과(도 10 a) 및 세포사 진행 확인을 위한 캐스파아제-3 면역염색 결과이다(도 10b). 이식된 세포(DiI 표지-적색), 세포사(녹색)가 진행 중인 이식된 세포.

도 11은 마우스 하지 허혈 모델에서, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위에서 HGF, VEGF, bFGF에 대한 항체를 사용한 면역염색 사진(도 11a) 및 발현 확인을 위한 RT-PCR 결과(도 11b)이다.

도 12는 마우스 하지 허혈 모델에서, 세포 이식 28일 후 2D ADSC 실험군과 3D ADSC 실험군의 허헐 부위의 평활근 알파 액틴(smooth muscle alpha actin) 면역염색 결과(도 12a) 및 vWF 면역염색 결과이다(도 12b).

도 13은 세포 이식 후 주기적으로 촬영한 하지 허혈 부위의 외형적 변화를 나타내는 사진 및 사지 회복, 발 괴사 및 사지 손실의 비율을 나타내는 표와 그래 프이다.

Claims (8)

1. 세포 부착 지지체 및 성장인자를 제공하지 않고 3차원 생물 반응기에서 성체 줄기세포를 3차원적으로 배양하는 것을 포함하는, 세포 스페로이드(cell spheroid) 형태의 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제조하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제조하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 성체 줄기세포 집합체는 허혈성 질환의 허혈조직 부위 이식용인 것을 특징으로 하는 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제조하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 저산소 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 이식용 성체 줄기세포 집합체를 제조하는 방법.
5. 세포 부착 지지체 및 성장인자를 제공하지 않고 3차원 생물 반응기에서 성체 줄기세포를 3차원적으로 배양하여 세포 스페로이드(cell spheroid) 형태의 줄기세포 집합체를 만드는 단계; 및 상기 세포 스페로이드(cell spheroid) 형태의 줄기세포 집합체로부터 분비되는 성장인자 단백질을 수득하는 단계를 포함하는, 성장인자 단백질 생산 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 성체 줄기세포는 지방 유래 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포 및 골수 유래 줄기세포로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 성장인자 단백질 생산 방법.
7. 제 5 항에 있어서, 상기 성체 줄기세포는 저산소 조건에서 배양되는 것을 특징으로 하는 성장인자 단백질 생산 방법.
8. 제 5 항에 있어서, 상기 성장인자는 혈관내피성장인자(VEGF), 염기섬유아세포성장인자(bFGF) 또는 간세포 성장인자(HGF)인 것을 특징으로 하는 성장인자 단백질 생산 방법.

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