KR101016213B1 - A dark quenched fluorogenic sensor for protease imaging, its preparation method, and use thereof - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 및 체내의 조직에서 발현되는 단백질 분해효소를 선택적으로 영상화하는 신규의 단백질 분해효소 활성 측정 센서에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질 분해효소 영상화를 위한 센서는 세포 및 체내에서 다양하게 활성화되는 단백질 분해 효소에 특이적으로 분해되는 임의의 펩타이드 기질에 형광체와 소광체를 결합시킨 것으로서, 상기 펩타이드 기질의 분해시에 형광을 발광하게 된다. 본 발명의 센서는 단백질 분해효소의 정성 및 정량 분석, 실시간 세포 영상 및 비침습적 질병 진단에 이용될 수 있다.The present invention relates to a novel protease activity measuring sensor for selectively imaging protease expressed in cells and tissues in the body. The sensor for proteolytic enzyme imaging according to the present invention is a combination of a phosphor and a quencher to any peptide substrate that is specifically degraded to a variety of proteolytic enzymes that are activated in cells and the body. It will emit fluorescence. The sensor of the present invention can be used for qualitative and quantitative analysis of proteases, real-time cell imaging and non-invasive disease diagnosis.

펩타이드, 단백질 분해효소, 분자영상, 골 관절염, 질병 조기진단 Peptides, Protease, Molecular Imaging, Osteoarthritis, Early Diagnosis of Disease

Description

단백질 분해효소의 영상화를 위한 소광된 형광 센서, 그 제조 방법 및 용도 {A DARK QUENCHED FLUOROGENIC SENSOR FOR PROTEASE IMAGING, ITS PREPARATION METHOD, AND USE THEREOF}A quenched fluorescence sensor for imaging proteolytic enzymes, a method of manufacturing and use thereof {A DARK QUENCHED FLUOROGENIC SENSOR FOR PROTEASE IMAGING, ITS PREPARATION METHOD, AND USE THEREOF}

본 발명은 세포 및 체내의 조직에서 발현하는 단백질 분해효소를 선택적으로 영상화하는 신규의 단백질 분해효소 센서, 그의 제조 방법 및 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단백질 분해효소 센서는 형광체(fluorophore)와 소광체(quencher)가, 세포 및 체내에서 다양하게 활성화되는 단백질 분해 효소에 특이적으로 분해가 되는 다양한 펩타이드 기질에 결합된 것으로서, 단백질 분해효소의 정량, 세포 영상 및 비침습적 질병 진단에 이용될 수 있다. The present invention relates to a novel protease sensor for selectively imaging protease expressed in cells and tissues in the body, methods of making and uses thereof. The protease sensor according to the present invention is a phosphor (fluorophore) and quencher (quencher), which is bound to a variety of peptide substrates that are specifically degraded to proteolytic enzymes that are activated in a variety of cells, bodies, protease Can be used for quantification, cell imaging, and noninvasive disease diagnosis.

단백질 분해효소는 비가역적인 펩타이드 결합의 가수분해를 통하여 단백질의 활성이나 운명을 조절한다. 예컨대 단백질들의 세포내부나 외부위치 지정 조절 또는 세포 표면으로부터의 분리, 다양한 성장인자 호르몬, 사이토카인, 효소 단백질 분해효소의 활성화 또는 비활성화, 수용체의 작용제(agonist)의 길항제(antagonist)로의 전환 등이 있다. 단백질 분해 효소는 넓은 범위에서 다양한 세포기능을 조절하는 역할을 하고, 이는 생리활성 물질의 분해를 통하여 이루어지기 때문에, 모든 생명체의 생명현상에 대한 단백질 분해효소의 기능 및 역할은 매우 중요하다. 예를 들어, 특정 단백질 분해효소의 결핍이나 부족 또는 과다발현은 중대한 결과를 초래하는데, 이는 암, 관절염, 퇴행성 신경질환, 심혈관계 및 자가 면역 염증질환 등으로 나타날 수 있다. 따라서 제약업계에서 보면 단백질 분해효소와 그의 기질 단백질은 신약개발의 주요 표적이며 지대한 관심을 가지고 있는 실정이다. Proteases regulate protein activity or fate through hydrolysis of irreversible peptide bonds. For example, intracellular or external positioning of proteins or separation from the cell surface, activation or deactivation of various growth factor hormones, cytokines, enzyme proteases, and conversion of receptor agonists to antagonists. . Proteolytic enzymes play a role in controlling a variety of cellular functions in a wide range, and this is achieved through the degradation of bioactive substances, so the function and role of proteolytic enzymes for the life phenomenon of all living things is very important. For example, deficiency or lack or overexpression of certain proteolytic enzymes can lead to serious consequences, such as cancer, arthritis, neurodegenerative diseases, cardiovascular and autoimmune inflammatory diseases. Therefore, in the pharmaceutical industry, protease and its substrate protein are the main targets of drug development and are of great interest.

단백질 분해효소의 다양한 역할과 최근 다양한 게놈 프로젝트의 완결에 기인하여 단백질 분해효소의 세포 및 체내 역할 규명이 활발히 이루어지고 있으며 인간게놈 프로젝트에 따르면 인간의 유전자 중 약 500개 이상의 단백질 분해효소 관련 유전자가 파악되었다. 최근 단백질 분해효소는 암과 치매와 같은 다양한 인간 질병에 중추적인 역할을 하며 원인 제공을 하고 있음이 새로이 밝혀지고 있다. 예를 들어, 기질 금속단백분해효소(matrix metalloprotease, MMP)는 과거 세포 및 체내에서 세포외 기질(extracellular matrix)을 분해하는 인자로 인식되었지만, 다양한 연구를 통해 이들이 인테그린(integrin) 신호전달과 세포주위 기질(pericellular matrix)의 분해에 따른 세포 운동에 관련돼 있음이 밝혀졌다. 또한 MMP는 신규 혈관형성 현상, 암세포의 침윤, 전이 등 암 성장에 있어서 중요한 역할을 담당하고 있음이 밝혀져 MMP를 타깃으로 한 신약 개발이 선진국 거대 제약회사를 중심으로 다양하게 이루어지고 있다. Due to the diverse roles of proteases and the recent completion of various genome projects, cell and body roles of proteases are being actively investigated. According to the Human Genome Project, more than 500 genes related to proteases are identified. It became. Recently, proteases have been found to play a pivotal role in various human diseases such as cancer and dementia and to provide a cause. For example, matrix metalloprotease (MMP) has been recognized in the past as a factor that degrades extracellular matrix in cells and the body, but through various studies they have been involved in integrin signaling and cell periphery. It has been shown to be involved in cellular movement following degradation of the pericellular matrix. In addition, MMP has been found to play an important role in cancer growth, such as new angiogenesis, cancer cell infiltration, metastasis, and the development of new drugs targeting MMP has been made mainly by large pharmaceutical companies in developed countries.

새로운 기질 단백질들이 밝혀짐에 따라 앞으로 여러 가지 단백질 분해 효소군의 생리적 기능이 새롭게 조명될 것이며, 이에 따라 새로운 신약 표적 단백질들 이 발굴될 것으로 기대되고 있다. 하지만, 특이적인 단백질 분해효소의 활성 및 발현 양을 정량적으로 영상화하여 분석하거나, 생체 내에서 단백질 분해효소 발현 정도를 비침습적으로 영상화하는 기법이 전무하여 관련 기술개발이 시급한 실정이다.As new substrate proteins are identified, the physiological functions of various proteolytic enzyme families will be renewed and new drug target proteins will be discovered. However, there is no technique for quantitatively imaging and analyzing specific protease activity and expression or non-invasive imaging of protease expression in vivo.

현재 이용되고 있는 대표적인 단백질 분해효소의 측정 방법은 2-D 젤과 다단계 액체 크로마토그래피 방법, 효소면역측정법(The Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 또는 단백질 분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질에 형광체를 결합하여 분광법(spectroscopy)으로 피크 이동(peak shift) 정도를 측정하는 방법 등이 있다. 그러나 이러한 방법들은 다단계의 측정 프로토콜이 필요하여 신약개발과 같이 많은 약물을 스크리닝하는데 이용하기에는 경제적 시간적으로 효율적이지 못하다. 또한, 위와 같은 방법은 특정 단백질 분해효소의 발현을 체내에서 탐지하거나 발현 양을 정량적으로 분석하여 질병 조기진단에 이용하기는 불가능하다.Representative methods of proteolytic enzymes currently in use include 2-D gels, multi-step liquid chromatography, the enzyme immunoassay (The Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, or ELISA) or peptides on peptide substrates that are specifically degraded to proteolytic enzymes. And a method of measuring the degree of peak shift by spectroscopy. However, these methods require a multi-step measurement protocol and are not economically and time efficient for use in screening many drugs, such as drug development. In addition, the above method is impossible to detect the expression of a specific protease in the body or to quantitatively analyze the expression and use it for early diagnosis of disease.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 특정 단백질 분해효소를 생체 내에서 분자적 수준으로 실시간/비침습적으로 영상화하기 위한, 신규의 단백질 분해효소 센서 및 그의 제조 방법을 제공하는 것이다.SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made to solve the above problems, and provides a novel protease sensor and a method for producing the same, for real-time / non-invasive imaging of a specific protease at a molecular level in vivo.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 세포 및 체내에서 발현되는 단백질 분해 효소에 특이적으로 분해되는 임의의 펩타이드 기질에 형광체와 소광체를 결합시켜, 다양한 단백질 분해효소에 특이적으로 반응하여 표적으로 하는 특정 단백질 분해효소에만 형광이 발생하는 나노 센서를 개발하기에 이르렀다.In order to solve the above problems, the present inventors bind phosphors and quencher to any peptide substrate that is specifically degraded to proteolytic enzymes expressed in cells and the body, thereby specifically reacting to various proteolytic enzymes and targeting them. The company has developed a nanosensor that generates fluorescence only for specific proteases.

단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서Sensor for Imaging of Proteases

본 발명은 특정 단백질 분해효소와 반응하여 분해될 수 있는 형광체와 소광체를 함유한 펩타이드 기질을 포함하는 단백질 분해효소의 영상화 센서에 관한 것이다. The present invention relates to an imaging sensor of a protease comprising a peptide substrate containing a phosphor and a quencher that can be degraded by reaction with a specific protease.

펩타이드 기질에 화학적으로 결합된 소광체는 형광체가 발산하는 파장의 빛을 흡수하여 소광효과(quenching effect)를 이루어 펩타이드가 특정 단백질 분해효소에 의해 분해되지 않으면 형광이 발광되지 않는다. 하지만, 특정 단백질 분해효소와 반응하여 펩타이드 기질이 분해되면 형광체와 소광체가 서로 분리되어 멀어지면서 소광효과가 없어지고 이에 따라 형광체 고유의 형광을 발광하여 단백질 분해효소의 정성 및 정량적 분석이 가능하게 되는 것이다. 또한, 이에 따라 단백질 분 해효소의 활성 및 억제를 영상화를 통하여 빠르게 스크리닝할 수 있고, 세포 및 조직에 실시간 세포 영상화 및 비침습적 조직 영상화를 할 수 있게 된다. The quencher chemically bound to the peptide substrate absorbs light of the wavelength emitted by the phosphor and has a quenching effect, so that the fluorescence does not emit unless the peptide is degraded by a specific protease. However, when the peptide substrate is decomposed by reacting with a specific protease, the phosphor and the quencher are separated from each other, and the quenching effect is lost. Accordingly, the fluorescence inherent in the phosphor is emitted to enable qualitative and quantitative analysis of the protease. . In addition, the activity and inhibition of protein degrading enzymes can be rapidly screened through imaging, and real-time cell imaging and non-invasive tissue imaging can be performed on cells and tissues.

보다 구체적으로, 본 발명은 다음의 화학식 1로 이루어지는, 세포 또는 생체 조직 내에서 발현되는 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서에 관한 것이다. More specifically, the present invention relates to a sensor for imaging proteolytic enzymes expressed in cells or biological tissues, consisting of the following formula (1).

A-B-CA-B-C

식 중, In the formula,

- A는 형광체이며, A is a phosphor,

- B는 상기 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질 부분이고, B is a portion of a peptide substrate that is specifically degraded by said protease,

- C는 상기 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 소광체이며, C is a quencher that can absorb the luminescence of the phosphor and exhibit a quenching effect,

- 상기 형광체 (A)와 소광체 (C)는 B에 대한 결합 위치가 서로 바뀌어도 무방하고, The phosphor (A) and the quencher (C) may be interchanged with each other with respect to B;

- 상기 형광체 (A)와 소광체 (C)는 펩타이드 기질 (B)의 양 말단 외에도, 펩타이드 기질 내부의 아미노산 잔기 중 단백질 분해효소에 의해 잘려지는 아미노산 잔기부분을 제외한 나머지 아미노산 잔기의 측쇄 부분에도 결합이 가능하다. The phosphor (A) and the quencher (C), in addition to both ends of the peptide substrate (B), also bind to the side chain portion of the remaining amino acid residues except the amino acid residue portion that is cut by the protease among the amino acid residues inside the peptide substrate This is possible.

형광체 (A)는 펩타이드 기질에 결합된 형광체로서, 플루오레신(fluorescein), 보디피(BODIPY®, Invitrogen사 제품), 테트라메틸로드아 민(Trtramethylrhodamine), 알렉사(Alexa®, Molecular Probes사 제품), 시아닌(Cyanine), 알로피코시아닌(allopicocyanine), 기타의 형광을 발생시키는 형광체 또는 이들의 유도체가 사용될 수 있다. Phosphor (A) is a phosphor bound to a peptide substrate, and includes fluorescein, bodipy (BODIPY ® , Invitrogen), tetramethylrhodamine, Alexa (Alexa ® , Molecular Probes) Cyanine, allopicocyanine, phosphors that generate other fluorescence, or derivatives thereof may be used.

본 발명에 사용될 수 있는 기타의 형광체로는 Tavi's "FluoroTable": Common fluorophores (출처: Zeiss Corporation 웹사이트 및 http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/FISHdyes2.html)에 개시된 형광체를 사용할 수 있으며, 상기 문헌은 그 내용 전체가 본 명세서에 참조 통합된다. Other phosphors that may be used in the present invention include those disclosed in Tavi's "FluoroTable": Common fluorophores (Source: Zeiss Corporation website and http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/FISHdyes2.html). Phosphors can be used, which are incorporated herein by reference in their entirety.

사용되는 형광체는 적색이나 근적외선(near-infrared)의 형광을 발광하며, 양자 수득량(quantaum yield)이 높은 형광체를 사용하는 것이 바람직하다. 전술한 형광체 중 특히 시아닌계, 알렉사계는 근적외선 빛을 방출 및 흡수하므로 세포, 혈액 및 생체 조직 등과 간섭 또는 흡수가 최소화되므로 더욱 바람직하다. The phosphor used emits red or near-infrared fluorescence, and it is preferable to use a phosphor having a high quantum yield. Among the above-mentioned phosphors, in particular, the cyanine-based and Alexa-based emits and absorbs near-infrared light, which is more preferable since interference or absorption of cells, blood, and living tissues is minimized.

펩타이드 기질 (B)는 특정 단백질 분해효소에 의해서 특이적으로 분해가 되는 펩타이드 기질이다. 단백질 분해효소에 의해 특이적으로 분해가 되는 펩타이드 기질은, 예컨대 MMP (matrix metalloprotenase), 트롬빈, 세포사멸시 활성화되는 카스파제(caspase), 프로테아좀(proteasome) 등의 표적이 되는 펩타이드일 수 있다. 특정 단백질 분해효소에 따라 사용되는 펩타이드 기질이 달라진다. 다음의 표 1에서 다양한 단백질 분해 효소에 대한 펩타이드 기질 서열을 예시적으로 나타낸다. 그러나, 본 발명의 센서에 사용되는 펩타이드 기질이 이들 특정 서열의 펩타이드로 한정되는 것은 아니다. Peptide substrate (B) is a peptide substrate that is specifically degraded by a specific protease. Peptide substrates that are specifically degraded by proteolytic enzymes may be, for example, peptides that are targets such as matrix metalloprotenase (MMP), thrombin, caspases activated by apoptosis, proteasomes, and the like. . The peptide substrate used depends on the specific protease. The following table 1 exemplifies peptide substrate sequences for various proteolytic enzymes. However, the peptide substrates used in the sensors of the present invention are not limited to peptides of these specific sequences.

단백질 분해효소 종류 및 그들의 펩타이드 기질 서열Protease Types and Their Peptide Substrate Sequences 단백질 분해효소Protease 펩타이드 기질 서열Peptide substrate sequence MMP-1
MMP-1
PLALWAR
PLGCHAR
PLGCHAKPLALWAR
PLGCHAR
PLGCHAK MMP-1,-9MMP-1, -9 PGCHAKPGCHAK MMP-2MMP-2 PLGVRG
PLAARPLGVRG
PLAAR MMP-3MMP-3 PYAYWMRPYAYWMR MMP-2,-7MMP-2, -7 PLGLARPLGLAR MMP-9MMP-9 SGKGPRQITASGKGPRQITA MMP-2/-9MMP-2 / -9 GGPRQITAG
PLGMWSRGGPRQITAG
PLGMWSR MMP-7MMP-7 GVPLSLTMGC
RPLALWRSGVPLSLTMGC
RPLALWRS MMP-8MMP-8 PLAYWARPLAYWAR MMP-13MMP-13 GPMGLRGLK
GPLGMRGLGPMGLRGLK
GPLGMRGL MMP-14MMP-14 PLACWAR
QMHALLHQPLACWAR
QMHALLHQ MMP-26MMP-26 SPLLTQET
QLLQQFHRSPLLTQET
QLLQQFHR MMP-2,-7,-13MMP-2, -7, -13 RPKPLAWKRPKPLAWK MMP-1,-2,-3,-7,-8,-9 및 -12MMP-1, -2, -3, -7, -8, -9 and -12 PLAYWARKPLAYWARK MMP-1,-2,-7,-8,-12 및 -13MMP-1, -2, -7, -8, -12 and -13 RPLALWRKRPLALWRK MMP-3,-13MMP-3, -13 RPKPVEWRKRPKPVEWRK MMP-1,-2,-7,-8,-12 및 -13MMP-1, -2, -7, -8, -12 and -13 RPKPYAWMKRPKPYAWMK MMP-1,-2,-3,-9MMP-1, -2, -3, -9 PKPQQFFGLKG
RPKPVQWRKGPKPQQFFGLKG
RPKPVQWRKG MMP-1,-2,-7,-8,-9,-11,-12,-13,-14 및 -16MMP-1, -2, -7, -8, -9, -11, -12, -13, -14 and -16 KPLGLARKPLGLAR MMP-1,-2,-3,-7,-9,-11,-12,-13MMP-1, -2, -3, -7, -9, -11, -12, -13 PLGLWARK
PLALWARK
PLCHARK
PLGLAR
PLGMWSRK
PYAYWMRK
RPLALWRK
PLAYWARK
RPKPQQPWKPLGLWARK
PLALWARK
PLCHARK
PLGLAR
PLGMWSRK
PYAYWMRK
RPLALWRK
PLAYWARK
RPKPQQPWK ThrombinThrombin F(Pip)RS† F (Pip) RS † FXIIIaFXIIIa NQEQVSNQEQVS Caspase-1Caspase-1 WEHD
YVADWEHD
YVAD Caspase-2Caspase-2 VDVADVDVAD Caspase-3Caspase-3 DEVDDEVD Caspase-4Caspase-4 LEVDLEVD Caspase-6Caspase-6 VEIDVEID

Caspase-8Caspase-8 IETDIETD Caspase-8Caspase-8 LEHDLEHD Urokinase plasminogen activator(uPA)Urokinase plasminogen activator (uPA) GRSANAGRSANA HIV proteaseHIV protease GVSQNYPIVGGVSQNYPIVG DPP-IVDPP-IV GPGPGPGP †: Pipecolic acid†: Pipecolic acid

소광체 (C)는 형광체에서 나오는 빛의 파장을 흡수하여 소광효과를 최대화할 수 있는 소광체이다. 형광체의 발광 파장의 범위에 따라 사용되는 소광체의 종류가 달라지며, 이는 형광체의 발광파장과 같거나 거의 유사한 파장대의 소광체를 사용하여야 소광효과를 극대화할 수 있기 때문이다. 이러한 소광체의 예로는 블랙홀 소광체 (Black Hole QuencherTM Dyes, Biosearch Technologies사 제품; BHQ), 블랙베리 소광체 (BlackBerryTM Quencher 650, BERRY&ASSOCIATES사 제품; BBQ) 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다. The quencher (C) is a quencher that can absorb the wavelength of light emitted from the phosphor to maximize the quencher effect. The type of quencher used varies depending on the emission wavelength range of the phosphor, since the quencher effect can be maximized only when the quencher having the same or substantially similar wavelength as that of the phosphor is used. Examples of these small housing is a black hole cow housing (Black Hole Quencher TM Dyes, Biosearch Technologies Inc.; BHQ); and the like (BBQ BlackBerry TM Quencher 650, BERRY & ASSOCIATES Inc.), and derivatives thereof, Blackberry cattle housing.

본 발명에서 사용될 수 있는 형광체와 소광체의 짝을 표로 정리하면 다음과 같다. The following table summarizes the pair of phosphor and quencher that can be used in the present invention.

소광체Quencher ( ( QuencherQuencher )) 형광체 (Phosphor ( FluorophoresFluorophores )) 종류Kinds 소광범위 nm (Quenching range)Extinction range nm (Quenching range) 종류Kinds BHQ-1 Amine
BHQ-1 Carboxylic Acid
BHQ-1 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester BHQ-1 Amine
BHQ-1 Carboxylic Acid
BHQ-1 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester 480-580480-580 FITC, FAM, TET, JOE, HEX, Oregon Green®, Alexa Fluor® 500, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, BODIPY® 493/503, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568FITC, FAM, TET, JOE, HEX, Oregon Green ® , Alexa Fluor ® 500, Alexa Fluor ® 514, Alexa Fluor ® 532, Alexa Fluor ® 546, BODIPY ® 493/503, BODIPY ® 530/550, BODIPY ® 558 / 568 BHQ-2 Amine
BHQ-2 Carboxylic Acid
BHQ-2 Carboxylic Acid, Succinimidyl EsterBHQ-2 Amine
BHQ-2 Carboxylic Acid
BHQ-2 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester 550-650550-650 TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, CAL RedTM, Red 640, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, BODIPY® 581/591 TAMRA, ROX, Cy3, Cy3.5, CAL Red TM , Red 640, Alexa Fluor ® 568, Alexa Fluor ® 594, Alexa Fluor ® 610, BODIPY ® 581/591 BHQ-3 Amine
BHQ-3 Carboxylic Acid
BHQ-3 Carboxylic Acid, Succinimidyl EsterBHQ-3 Amine
BHQ-3 Carboxylic Acid
BHQ-3 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester 620-730620-730 Cy5, Cy5.5, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700.Cy5, Cy5.5, Alexa Fluor ® 647, Alexa Fluor ® 660, Alexa Fluor ® 680, Alexa Fluor ® 700. BHQ-10 Carboxylic AcidBHQ-10 Carboxylic Acid 480-580480-580 FITC, FAM, TET, JOE, HEX, Oregon Green®, Alexa Fluor® 500, Alexa Fluor® 514, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, BODIPY® 493/503, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568FITC, FAM, TET, JOE, HEX, Oregon Green ® , Alexa Fluor ® 500, Alexa Fluor ® 514, Alexa Fluor ® 532, Alexa Fluor ® 546, BODIPY ® 493/503, BODIPY ® 530/550, BODIPY ® 558 / 568 BBQ 650BBQ 650 530-750530-750 Cy3, TAMRA, Texas Red, ROX, Cy5, Cy5.5, Rhodamine, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 610, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, Alexa Fluor® 700, BODIPY® 493/503, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 581/591 Cy3, TAMRA, Texas Red, ROX, Cy5, Cy5.5, Rhodamine, Alexa Fluor ® 568, Alexa Fluor ® 594, Alexa Fluor ® 610, Alexa Fluor ® 647, Alexa Fluor ® 660, Alexa Fluor ® 680, Alexa Fluor ® 700, BODIPY ® 493/503, BODIPY ® 530/550, BODIPY ® 558/568, BODIPY ® 581/591

상기 형광체 (A)와 소광체 (C)는 서로 위치가 바뀌어도 무방하다.The said phosphor (A) and the quencher (C) may mutually change positions.

상기 형광체 (A)와 소광체 (C)는 펩타이드 기질 (B)의 양 말단 외에도, 펩타이드 기질 내부의 아미노산 잔기 중 단백질 분해효소에 의해 잘려지는 아미노산 잔기부분을 제외한 나머지 아미노산 잔기의 측쇄 부분에도 결합이 가능하다. 이와 같이 결합 가능한 내부 아미노산 잔기는, 예컨대 측쇄 말단에 아미노기를 가지는 Lys과 같은 반응성 측쇄를 가지는 아미노산이다. In addition to both ends of the peptide substrate (B), the phosphor (A) and the quencher (C) are also bonded to the side chain portion of the remaining amino acid residues except for the amino acid residue portion that is cut by the protease among the amino acid residues inside the peptide substrate. It is possible. The internal amino acid residue which can be bonded in this way is an amino acid which has a reactive side chain, such as Lys which has an amino group in a side chain terminal, for example.

상기 형광체 (A)와 소광체 (B)사이의 거리는 형광체와 소광체 사이에서 발생하는 소광효과를 최대화하여, 형광체의 형광이 최소화될 수 있게 조절한다. 형광체와 소광체 사이의 거리는 바람직하게는 20 nm 이내로 유지시킴으로써 발생하는 소광효과에 의해서 형광체의 형광 세기가 최소가 되게 합성하는 것이 바람직하다. The distance between the phosphor (A) and the quencher (B) maximizes the quenching effect occurring between the phosphor and the quencher, so that the fluorescence of the phosphor is minimized. The distance between the phosphor and the quencher is preferably synthesized to minimize the fluorescence intensity of the phosphor by the quenching effect generated by keeping it within 20 nm.

상기 형광체 (A)와 소광체 (B)가 결합하는 펩타이드 기질 (C)은 형광체와 소광체가 결합된 위치 사이의 거리가 20개 아미노산의 길이 이내인 것이 바람직하다. In the peptide substrate (C) to which the phosphor (A) and the quencher (B) bind, it is preferable that the distance between the position where the phosphor and the quencher are bonded is within a length of 20 amino acids.

본 발명의 구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명의 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서는 펩타이드 (B)는 골 관절염 부위에서 과다 발현되어 연골 조직을 분해하는데 중추적인 역할을 하는 다양한 MMP 중 MMP-13에 특징적으로 분해되는 펩타이드이고, 형광체 (A)는 상기 펩타이드의 아미노 말단에 결합되어 근적외선 형광을 나타내는 시아닌 형광체인 Cy5.5이며, 소광체 (C)는 상기 펩타이드의 카르복시 말단에 결합되어 상기 형광체의 형광을 흡수하여 소광효과를 극대화시킬 수 있는 BHQ-3(black hole quencher-3)인, MMP-13과 반응하여 근적외선 형광을 발생하는 영상화를 위한 센서이다. In a specific embodiment of the present invention, the sensor for imaging of the protease of the present invention is a peptide (B) is overexpressed at the osteoarthritis site and plays a pivotal role in the decomposition of cartilage tissue MMP-13 among various MMPs It is a peptide that is decomposed characteristically, Phosphor (A) is Cy5.5, a cyanine phosphor that binds to the amino terminus of the peptide to exhibit near-infrared fluorescence, and quencher (C) is bound to the carboxy terminus of the peptide to fluoresce the phosphor. It is a sensor for imaging that generates near-infrared fluorescence in response to MMP-13, which is a BHQ-3 (black hole quencher-3) that can absorb the light and maximize the quenching effect.

단백질 분해효소 영상화를 위한 센서의 제조 방법Sensor manufacturing method for protease imaging

본 발명의 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서는, 특정 단백질 분해효소에 특이적인 펩타이드 기질에 형광체와 소광체를 결합시킴으로써 제조할 수 있다.Sensors for imaging of proteases of the present invention can be prepared by binding a phosphor and a quencher to a peptide substrate specific for a particular protease.

보다 구체적으로, 본 발명은 다음의 단계를 포함하여 이루어지는 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서를 제조하는 방법에 관한 것이다. More specifically, the present invention relates to a method for manufacturing a sensor for imaging a protease comprising the following steps.

- 특정 단백질 분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질을 제공하는 단계, Providing a peptide substrate that is specifically degraded to a specific protease,

- 상기 펩타이드 기질에 소광체를 결합시키는 단계 및 Binding a quencher to said peptide substrate and

- 상기 펩타이드 기질에 형광체를 결합시키는 단계. Binding a phosphor to said peptide substrate.

상기 제조 방법에 있어서, 소광체를 결합시키는 단계와 형광체를 결합시키는 단계는 순서가 서로 바뀌어도 무방하며, 또한 필요에 따라 상기 방법으로 제조된 형광체-펩타이드-소광체를 정제 또는 확인하는 단계를 추가할 수 있다.In the above production method, the step of binding the quencher and the step of bonding the phosphor may be reversed, and may further include the step of purifying or identifying the phosphor-peptide-quencher prepared by the above method if necessary. Can be.

펩타이드와 소광체 및 형광체를 결합시키는 방법은 당업자에게 잘 알려진 다양한 기술을 사용할 수 있다. The method of combining the peptide with the quencher and the phosphor can use various techniques well known to those skilled in the art.

하나의 실시 상태에 있어서, 본 발명은, In one embodiment, the present invention,

- 당업자에게 공지인 다양한 펩타이드 합성 방법을 이용하여 특정 단백질 분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질 (표 1 참조)을 합성하는 단계, -Synthesizing a peptide substrate (see Table 1) that is specifically degraded to a specific protease using various peptide synthesis methods known to those skilled in the art,

- 제공된 펩타이드 기질의 N 말단 또는 C 말단에 있는 보호기를 제거하고, 펩타이드의 말단 작용기와 결합할 수 있는 소광체 또는 그 유도체를 반응시켜 결합시키는 단계, Removing the protecting group at the N or C terminus of the provided peptide substrate and reacting and binding the quencher or derivative thereof capable of binding to the terminal functional group of the peptide,

- 형광체가 펩타이드의 한쪽 말단에 결합된 펩타이드 유도체의 나머지 말단에 있는 보호기를 제거하고, 이 말단 작용기와 결합할 수 있는 형광체 또는 그 유도체를 반응시켜 결합시키는 단계Removing the protecting group at the other end of the peptide derivative in which the phosphor is bound to one end of the peptide, and reacting and binding the phosphor or derivative thereof capable of binding to this terminal functional group

를 포함하는 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서의 제조 방법에 관한 것이다. It relates to a method for manufacturing a sensor for imaging a protease comprising a.

더욱 구체적인 실시 상태에 있어서, 본 발명은 In a more specific embodiment, the present invention

- 특정 단백질 분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질을 고체상 합성법(solid phase synthesis)을 따라 에프목 방법(Fmoc strategy)으로 합성하는 단계, -Synthesizing the peptide substrate that is specifically degraded to a specific protease by the Fmoc strategy following solid phase synthesis,

- 합성된 펩타이드 기질의 C 말단을 탈보호(deprotection)시킨 후, 소광체의 에스테르 유도체를 넣고 반응시켜 소광체를 결합시키는 단계, Deprotecting the C terminus of the synthesized peptide substrate, and then adding an ester derivative of the quencher to react to bind the quencher,

- 상기 펩타이드 기질의 N 말단을 탈보호시킨 후, 형광체의 에스테르 유도체를 넣고 반응시켜 형광체를 결합시키는 단계 및 -Deprotecting the N terminus of the peptide substrate, and then reacting the phosphor by binding an ester derivative of the phosphor and reacting

- 제조된 형광체-펩타이드 기질-소광체를 정제하는 단계-Purifying the prepared phosphor-peptide substrate-quencher

를 포함하는 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서의 제조 방법에 관한 것이다. It relates to a method for manufacturing a sensor for imaging a protease comprising a.

상기의 단백질 분해효소 센서인 형광체-펩타이드-소광체 유도체는, 형광체의 발하는 빛을 소광체가 흡수하여 일어나는 소광효과에 의해 형광이 최소화된 상태로 제조한다. 제조된 단백질 분해효소 센서인 형광체-펩타이드-소광체 유도체는, 형광체, 소광체, 및 펩타이드 기질을 쉽게 변경하고 제어 가능하기 때문에, 원하는 특정 단백질 분해효소 센서 및 원하는 파장대의 다양한 센서를 쉽게 제어할 수 있으므로, 다양한 단백질 분해효소에 대한 센서를 설계할 수 있다. The phosphor-peptide-quencher derivative, which is a protease sensor, is prepared in a state in which fluorescence is minimized by the quenching effect caused by absorption of the light emitted from the phosphor. Phosphor-peptide-quencher derivatives, which are protease sensors manufactured, can easily control and control phosphors, quencher, and peptide substrates, and thus can easily control a specific protease sensor and various sensors of a desired wavelength range. Thus, sensors for various proteases can be designed.

단백질 분해효소 영상화를 위한 센서의 용도Use of Sensors for Protease Imaging

제조된 단백질 분해효소 센서인 형광체-펩타이드-소광체 유도체는 생체 내 특정 조직 또는 세포에 존재하는 단백질 분해효소의 존재 유무, 활성, 및 활성 억제 등을 쉽게 판별해 낼 수 있어서 세포 영상, 특정 조직 영상, 약물전달체 등의 다양한 목적으로 사용될 수 있다. 상기 조성물은 생체 내(in vivo) 및 생체 외(in vitro) 모두 적용이 가능하여, 신약 개발에 필요한 고성능 스크리닝(high-throughput screening) 방법 및 조기 질병 진단 등의 다양한 용도로 사용이 가능하다. Phosphor-peptide-quencher derivative, a manufactured protease sensor, can easily determine the presence, activity, and inhibition of protease present in specific tissues or cells in vivo. It can be used for various purposes, such as drug delivery system. The composition is in vivo ( in vivo) and in vitro (in In vitro ), it can be applied to various applications such as high-throughput screening method and early disease diagnosis necessary for new drug development.

본 발명의 하나의 실시 상태에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서는 단백질 분해효소 정량 분석 방법 및 단백질 분해효소 과다발현을 억제하는 약물의 효능을 스크리닝하는 방법에 이용될 수 있다.In one embodiment of the present invention, the sensor for imaging of the protease can be used in a method for quantitating protease and screening the efficacy of the drug to inhibit protease overexpression.

본 발명의 또 다른 실시 상태에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서는 세포 및 생체 조직에서 단백질 분해효소를 영상화하는 방법에 이용될 수 있다.In another embodiment of the present invention, the sensor for imaging of the protease may be used in a method for imaging the protease in cells and biological tissues.

본 발명의 구체적인 실시 상태에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서는 골 관절염, 류마티스 관절염 및 그 외 자가 면역질환 질병에서의 단백질 분해효소를 영상화하는 방법에 이용될 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the sensor for imaging of the protease can be used in the method for imaging the protease in osteoarthritis, rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases.

본 발명의 구체적인 실시 상태에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암, 담낭암 등을 포함하는 암에서의 단백질 분해효소를 영상화하는 방법에 이용될 수 있다.In a specific embodiment of the present invention, the sensor for the imaging of the protease is squamous cell carcinoma, uterine cancer, cervical cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, brain tumor, breast cancer, liver cancer, skin cancer, esophageal cancer, testicular cancer, kidney It can be used in a method for imaging proteolytic enzymes in cancer, including cancer, colon cancer, rectal cancer, stomach cancer, kidney cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cholangiocarcinoma, gallbladder cancer and the like.

본 발명의 또 다른 구체적인 실시 상태에 있어서, 상기 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서는 치매, 뇌졸중 등을 포함하는 난치성 질환에서의 단백질 분해효소를 영상화하는 방법에 이용될 수 있다. In another specific embodiment of the present invention, the sensor for imaging the protease may be used in the method for imaging the protease in intractable diseases including dementia, stroke and the like.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 의해 특정 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 활성화 되어 강한 형광을 나타내는 형광체-펩타이드-소광체 유도체가 제조될 수 있다. 본 발명에서 제조된 센서는 형광물질에 대한 높은 소광 능력으로 형광이 발광하지 않은 상태로 있다가 특정 단백질 분해효소에 의하여 분해가 되어야만 강한 형광을 특이적으로 발광하는 특징을 갖는다. 특히, 본 발명에서 제조된 센서는 단백질 분해효소가 과다 발현될 때 근적외선 형광을 나타냄으로써, 단백질 분해효소 과다 발현을 억제하는 억제제와 같은 신약을 스크리닝하는 방법에 사용이 가능하다. 또한, 실험동물 모델이나 인체에 제조된 입자를 주입하여 골관절염과 같은 특정 단백질 분해효소를 과다 발현하는 다양한 조직을 비침습적 방법으로 영상이 가능함으로써 골 관절염, 류마티스 관절염, 암, 치매 등 자가면역질환 등의 다양한 질병 및 난치병의 조기 진단에 유용하게 사용될 수가 있다. As described above, the phosphor-peptide-quencher derivative which is specifically activated by a specific protease and exhibits strong fluorescence can be prepared by the present invention. The sensor manufactured in the present invention has a characteristic of emitting a strong fluorescence specifically only when it is decomposed by a specific protease while the fluorescence does not emit light due to high quenching ability of the fluorescent material. In particular, the sensor manufactured in the present invention exhibits near-infrared fluorescence when the protease is overexpressed, and thus can be used in a method for screening a new drug such as an inhibitor that inhibits protease overexpression. In addition, it is possible to image various tissues overexpressing specific proteolytic enzymes such as osteoarthritis by injecting particles manufactured in experimental animal models or human bodies by non-invasive methods such as autoimmune diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, cancer and dementia. It can be useful for the early diagnosis of various diseases and incurable diseases.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명의 범위가 이에 의하여 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. However, the following examples are only examples of the present invention, and the scope of the present invention is not limited thereto.

실시예 1. 형광체-펩타이드-소광체 유도체 제조 Example 1 Preparation of Phosphor-peptide-quencher Derivatives

펩타이드에 근적외선 형광체와 소광체를 결합시키는 반응은 반응식 1과 같으며, 펩타이드는 고체상 합성법(solid phase synthesis)을 따라 에프목 방법(Fmoc strategy)으로 Fmoc-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Arg(Pbf)-Gly-Leu-Lys(Dde)-Resin 순서로 제조하였다. 제조된 펩타이드 서열중 보호(protection)된 라이신 그룹을 히드라진을 이용하여 탈보호(deprodection)시킨 후, 소광체인 BHQ3-NHS 에스테르 20 mg을 넣고 실온에서 반응을 진행시켰다. 4~6 시간 후, 에프목을 탈보호시킨 후 근적외선 시아닌 형광체 Cy5.5-NHS 에스테르 20 mg을 넣고 반응을 진행시켰다. 4~6 시간 후에 트리플루오르산(trifluoronic acid)을 처리하여 Arg 그룹을 탈보호시키고 펩타이드를 레진에서 분리시켰다. 얻어진 물질은 반분취 HPLC(semipreparative HPLC)를 통하여 정제하였고, 제조된 형광체-펩타이드-소광체는 분석용 HPLC와 질량분석기를 통하여 확인하였고, 형광체와 소광체가 결합된 펩타이드를 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 이라고 명명하였다.The reaction of coupling the near-infrared phosphor and the quencher to the peptide is shown in Scheme 1, and the peptide is subjected to Fmoc-Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Arg by Fmoc strategy following solid phase synthesis. Prepared in the order (Pbf) -Gly-Leu-Lys (Dde) -Resin. After deprotection of the protected lysine group in the prepared peptide sequence using hydrazine, 20 mg of BHQ3-NHS ester, a quencher, was added and the reaction was performed at room temperature. After 4-6 hours, the f-mok was deprotected, and then 20 mg of the near-infrared cyanine phosphor Cy5.5-NHS ester was added to proceed with the reaction. After 4-6 hours, the Arg group was deprotected by treatment with trifluoronic acid and the peptide was separated from the resin. The obtained material was purified by semipreparative HPLC, and the prepared phosphor-peptide-quencher was confirmed by analytical HPLC and mass spectrometry, and the peptides combined with the phosphor and the quencher were Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3. It was named.

Figure 112007083504887-pat00001
Figure 112007083504887-pat00001

실시예 2-1. 제조된 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서의 MMP-13 효소 특이적 분해에 의한 광학 특성 변화 Example 2-1. Changes in Optical Properties by MMP-13 Enzyme-specific Degradation of the Prepared Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 Sensor

상기한 바와 같이 제조된 MMP-13 특이적 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서의 MMP-13 효소에 대한 선택 특이성을 관찰하였다. 센서를 각각 96 웰(well)에 활성화된 MMP-13, MMP-7, 스크램블 펩타이드 (아미노산 함유 구조는 같으나 서열이 틀려서 특정 효소에 기질로서 작용을 하지 못함)를 함유한 센서 및 MMP-13/MMP-13 억제제(inhibitor)와 같이 37℃에서 40분 동안 반응시킨 후, 효소 분해반응에 의한 형광 발현을 관찰하였다. 먼저 MMP-13 및 MMP-7을 활성화하기 위하여 MMP들을 2.5 mmol/L 의 The select specificity for the MMP-13 enzyme of the MMP-13 specific Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor prepared as described above was observed. The sensor contains MMP-13, MMP-7, and scrambled peptides, each of which has the same amino acid structure but different sequences, which do not act as a substrate for specific enzymes, in 96 wells, and MMP-13 / MMP. After reacting with -13 inhibitor at 37 ° C. for 40 minutes, fluorescence expression by enzyme digestion was observed. First, to activate MMP-13 and MMP-7, MMPs were added at 2.5 mmol / L.

p-아미노페닐수은산(p-aminophenyl mercuric acid)이 첨가된 TCNB 반응액 (0.1 M Tris, 5 mM 염화칼슘, 200 mM NaCL, 0.1% 브리즈(Brij))에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 활성화된 MMP-13와 MMP-7을 각 웰에 200 μL 반응액 상에서 센서와 37℃도에서 40분 동안 반응시킨 후 형광 발광 정도를 형광분석기와 CCD (Charge Coupled Device) 카메라가 장착된 Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System으로 관찰하였다. It was added to a TCNB reaction solution (0.1 M Tris, 5 mM calcium chloride, 200 mM NaCL, 0.1% Brij) to which p-aminophenyl mercuric acid was added, and reacted at 37 ° C for 1 hour. . Activated MMP-13 and MMP-7 were reacted in each well for 40 minutes at 37 ° C with a sensor on a 200 μL reaction solution, and the degree of fluorescence was measured using a Kodak Image Station equipped with a fluorometer and a Charge Coupled Device camera Observed with a 4000MM Digital Imaging System.

도 2a와 2b에 나타낸 바와 같이, MMP-13이 첨가되지 않은 상태 (1)에서는 형광이 소광된 상태이지만, MMP-13가 첨가된 (2) 상태에서는 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서에 결합 되어 있던 펩타이드가 MMP-13에 선택적으로 분해되어 밝은 고유의 형광을 나타냄을 관찰할 수 있었다. 같은 조건에서 MMP-13 선택적 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서는 MMP-7 (3)에 대하여서는 형광 발현이 거의 되지 않았고, MMP-13의 활성을 선택적으로 막아주는 MMP-13 억제제 (4)와의 반응에서 형광 발현이 되지 않았음을 관찰할 수 있었다. 한편, 대조군으로 사용된 스크램블 펩타이드를 함유한 센서는 (5) MMP-13 첨가 상태에서 기질 분해가 이루어지지 않으므로 형광이 발현되지 않음을 확인하였다. MMP-13이 없는 조건인 경우와 비교하여 MMP-13이 첨가된 경우에는 세기가 약 32배 정도로 높은 형광을 관찰할 수 있었다. As shown in Figures 2a and 2b, the fluorescence is quenched in the state (1) without the addition of MMP-13, but coupled to the Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor in the (2) state with the addition of the MMP-13 It was observed that the peptide was selectively degraded by MMP-13 and showed bright inherent fluorescence. Under the same conditions, the MMP-13 selective Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor exhibited little fluorescence expression for MMP-7 (3), and was associated with an MMP-13 inhibitor (4) that selectively blocked MMP-13 activity. It was observed that fluorescence was not expressed in the reaction. On the other hand, the sensor containing the scrambled peptide used as a control was confirmed that the fluorescence was not expressed because (5) substrate degradation does not occur in the state of MMP-13 addition. When MMP-13 was added as compared to the condition without MMP-13, fluorescence of about 32 times higher intensity could be observed.

결론적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 MMP-13 선택적 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3는 MMP-13 효소에 선택적으로 반응하여 높은 형광을 발광함을 관찰할 수 있었다. In conclusion, it could be observed that the MMP-13 selective Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 prepared in Example 1 selectively reacts with the MMP-13 enzyme to emit high fluorescence.

실시예 2-2. Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서를 이용한 분해효소의 시간별 분석Example 2-2. Hourly Analysis of Degrading Enzyme Using Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 Sensor

MMP Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서를 이용하여 MMP-13 분해효소 활성을 시간에 따라 정량적으로 분석하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 2-1에서와 동일한 실험 방식으로 MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3에 농도가 11 nmol/L의 활성화된 MMP-13를 첨가하고 37도에서 0, 5분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분 동안에 형광 발광 정도를 형광분석기를 통하여 관찰하였다. MMP-13 degrading enzyme activity was quantitatively analyzed over time using the MMP Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor. Specifically, in the same experimental manner as in Example 2-1, MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 was added with 11 nmol / L of activated MMP-13 at a concentration of 0, 5 minutes, For 10 minutes, 15 minutes, 20 minutes, 25 minutes, 30 minutes, 35 minutes, 40 minutes, the degree of fluorescence was observed through a fluorometer.

도 3에 나타낸 바와 같이, MMP-13이 첨가되지 않은 상태에서는 시간에 따라 형광이 증가하지 않았으며, MMP-13이 첨가된 상태에서는 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서에 결합 되어 있던 펩타이드가 MMP-13에 선택적으로 분해되어 밝은 고유의 형광 나타내며, 시간에 따라 형광 세기가 크게 복원이 됨을 관찰할 수 있었다. 같은 조건에서 MMP-13 선택적 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서는 MMP-7에 대하여서는 형광 세기가 점차적으로 증가하나 그 세기는 매우 약하며, MMP-13의 활성을 선택적으로 막아주는 MMP-13 억제제와의 반응에서도 매우 약한 형광이 복원이 됨을 관찰할 수 있었다. 한편, 대조군으로 사용된 스크램블 펩타이드를 함유한 센서는 MMP-13 첨가 상태에서 기질 분해가 이루어지지 않으므로 시간에 따라 형광이 복원되지 않음을 확인하였다.As shown in FIG. 3, the fluorescence did not increase with time when MMP-13 was not added, and when the MMP-13 was added, the peptide bound to the Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor was MMP-13. It was selectively decomposed at 13 to show bright inherent fluorescence, and it was observed that the fluorescence intensity was greatly restored with time. Under the same conditions, the MMP-13 selective Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor gradually increases in fluorescence intensity with respect to MMP-7 but is very weak, with MMP-13 inhibitors that selectively block MMP-13 activity. In the reaction of, very weak fluorescence was observed to be restored. On the other hand, the sensor containing the scrambled peptide used as a control was confirmed that the fluorescence was not restored over time because the substrate degradation does not occur in the state of MMP-13 addition.

실시예 2-3. Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서를 이용한 분해효소의 농도별 분석Example 2-3. Concentration Analysis of Degrading Enzyme Using Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 Sensor

MMP Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서를 이용하여 MMP-13 분해효소의 농도를 정량 적으로 분석하였다. 구체적으로는, 상기 실시예 2-1에서와 동일한 실험방식으로, MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서에 농도가 각각 0, 0.55, 1.1, 2.2, 5.5, 11 nmol/L의 활성화된 MMP-13를 첨가하고 37℃에서 40분간 반응시킨 후 형광 발광 정도를 형광분석기와 Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System으로 관찰하였다. The concentration of MMP-13 degrading enzyme was quantitatively analyzed using the MMP Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor. Specifically, in the same experimental manner as in Example 2-1, the MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor has an active MMP of 0, 0.55, 1.1, 2.2, 5.5, and 11 nmol / L, respectively. After -13 was added and reacted at 37 ° C. for 40 minutes, the degree of fluorescence was observed with a fluorescence analyzer and a Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System.

도 4a와 4b에 나타낸 바와 같이, Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서의 형광 발광이 첨가된 MMP-13 효소의 농도에 따라 비례적으로 증가하므로 실험군의 발광도를 측정하는 것에 의해 검체 내의 특정 효소농도를 정략적으로 검출할 수 있음을 증명하였다. As shown in Figures 4a and 4b, since the fluorescence of the Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor increases proportionally with the concentration of the MMP-13 enzyme added, the specific enzyme concentration in the sample by measuring the luminescence of the experimental group It was proved that can be detected regularly.

실시예Example 3.  3. Cy5Cy5 .5-.5- GPMGLRGLKGPMGLRGLK -- BHQ3BHQ3 센서를 이용한 골관절염 질환 동물모델에서의  Sensor Using Osteoarthritis in Animal Model MMP13MMP13 발현 영상화 Expression Imaging

Sprague-Dawley 쥐 (250~300 g)를 마취를 시킨 후, 오른쪽 무릎 관절을 돌출시켜, 힘줄(tendon)을 잘라내어 골관절염 질환 동물모델을 만든다. 6주 내지 8주 이후에, MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서를 관절 조직에 직접 투여하여 골관절염의 영상 및 MMP-13의 활성도의 영상화 가능성을 평가하였다. 골관절염 모델은 관절 부위에서 다량의 MMP-13을 발현하는 것으로 알려져 있다. 실험은 정상 관절 조직과 골관절염 관절 조직에 MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서를 (10 ug/100 ul, 4 nM) 투여하고 Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System과 eXplore OptixTM system을 이용하여 실험을 진행하였다. Sprague-Dawley rats (250-300 g) are anesthetized, and the right knee joint is extruded to cut out the tendon to produce an animal model of osteoarthritis disease. After 6-8 weeks, MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor was administered directly to the joint tissue to assess the possibility of imaging of osteoarthritis and the activity of MMP-13. Osteoarthritis models are known to express large amounts of MMP-13 at the joint site. Experiments administered to normal joint tissue and joint tissue osteoarthritis MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 the sensor (10 ug / 100 ul, 4 nM) and tested using a Kodak Image Station 4000MM Digital Imaging System and eXplore Optix TM system Proceeded.

도 5a 와 5b에 나타낸 바와 같이 정상 관절 조직에 투여한 MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서는 형광이 발광하지 않았지만, 골 관절염 관절조직에서는 강한 형광이 발광함을 관찰 할 수 있었다. 즉, 골 관절염 조직에서는 연골조직이 단백질 분해효소에 의해 닳아져 있음을 알 수 있었다. 또한, 5b의 영상을 Z축 방향으로 하여 절단면을 얻은 영상 (5d)에서도 골 관절염 조직에서 강한 세기로 형광 발광함을 알 수 있었다. 5A and 5B, the MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor, which was administered to normal joint tissues, did not emit fluorescence, but strong fluorescence was observed in osteoarthritis joint tissues. In other words, it was found that cartilage tissue was worn down by proteolytic enzymes in osteoarthritis tissue. In addition, it was found that the image 5d obtained by cutting the image of 5b in the Z-axis direction also fluoresces with strong intensity in the osteoarthritis tissue.

결론적으로, MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 센서는 생체 내 MMP-13이 과다 발현된 골 관절염 조직에서 특이적으로 반응하여 강한 형광 발광을 나타내었고, 따라서 골 관절염을 특이적으로 영상화할 수 있음을 증명하였다. In conclusion, the MMP-13 Cy5.5-GPMGLRGLK-BHQ3 sensor showed strong fluorescence due to the specific response of MMP-13 in vivo to the overexpressed osteoarthritis tissue, thus enabling the specific imaging of osteoarthritis. Proved that there is.

도 1은 단백질 분해효소에 특이적으로 분해되는 펩타이드, 근적외선 형광체 및 소광체를 갖는 본 발명의 단백질 분해효소 활성 측정 센서의 소광 상태와 발광 상태를 도시한 것이다.Figure 1 shows the quenched state and luminescent state of the protease activity measuring sensor of the present invention having a peptide, a near-infrared phosphor, and a quencher specifically cleaved to a protease.

도 2a는 단백질 분해효소 센서가 단백질 분해효소인 MMP-13에 특이적으로 분해되어 형광을 발광하는 형광특이성을 보여주는 것이다.Figure 2a shows the fluorescence specificity of the protease sensor specifically cleaved to the protease MMP-13 to fluoresce fluorescence.

도 2b는 형광 영상 장비를 통하여 단백질 분해효소 센서가 단백질 분해효소인 MMP-13에 특이적으로 분해되어 형광을 발광하는 형광특이성을 보여주는 것이다.Figure 2b shows the fluorescence specificity of the protease sensor is specifically cleaved to MMP-13, a protease through fluorescence imaging equipment to emit fluorescence.

도 3은 시간이 증가됨에 따라 MMP-13에 의해 분해되어 형광 발광 정도가 증가 되는 것을 보여주는 것이다.FIG. 3 shows that the degree of fluorescence is increased by decomposition by MMP-13 as time increases.

도 4a는 단백질 분해효소 MMP-13의 농도가 증가함에 따라 형광 발광 정도가 일정하게 증가하여 단백질 분해효소를 정량적으로 분석 가능함을 보여주는 것이다. 4a shows that as the concentration of protease MMP-13 increases, the degree of fluorescence is constantly increased to quantitatively analyze proteolytic enzymes.

도 4b는 형광 영상 장비를 통하여 단백질 분해효소 MMP-13의 농도가 증가함에 따라 형광 발광 정도가 일정하게 증가하는 것을 보여주는 것이다.4b shows that the degree of fluorescence is constantly increased as the concentration of protease MMP-13 is increased through fluorescence imaging equipment.

도 5a는 골 관절염을 유도한 관절과 정상인 관절에 단백질 분해요소 센서를 투여한 후 1시간 후에 얻은 각 관절 부위의 근적외선 이미지를 나타낸 것이다.Figure 5a shows a near-infrared image of each joint area obtained 1 hour after administration of the proteolytic element sensor to the joints and normal joints that induced osteoarthritis.

그림 5b는 토모그래피(Tomography)를 이용하여 골 관절염을 유도한 관절과 정상인 관절에 단백질 분해요소 센서를 투여한 후 1시간 후에 얻은 각 관절 부위의 근적외선 이미지를 나타낸 것이다.Figure 5b shows a near-infrared image of each joint area obtained one hour after the proteolytic element sensor was applied to osteoarthritis-induced and normal joints using tomography.

도 5c는 골관절염이 유도된 관절과 정상 관절의 조직검사를 통하여 연골의 분해 정도를 나타낸 해부학적인 사진을 나타낸 것이다.Figure 5c shows an anatomical picture showing the degree of cartilage decomposition through histology of osteoarthritis-induced joints and normal joints.

도 5d는 토모그래피(Tomography)를 이용하여 얻은 근적외선 이미지의 깊이에 따른 z축 단면 근적외선 영상을 나타낸 것이다. FIG. 5D illustrates a z-axis cross-sectional near-infrared image according to the depth of the near-infrared image obtained using tomography.

Claims (10)

다음의 화학식 1로 이루어지는, 세포 또는 생체 조직 내에서 발현되는 단백질 분해효소 MMP-13의 영상화를 위한 센서; A sensor for imaging of protease MMP-13 expressed in cells or living tissues, comprising: A-B-C (1) ABC (1) 식 중, In the formula, - A는 근적외선 형광을 발광하는 시아닌계 또는 알렉사계 형광체이며, A is a cyanine or Alexa phosphor that emits near infrared fluorescence, - B는 상기 단백질 분해효소에 의하여 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질로서 Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Arg-Gly-Leu-Lys이고, B is a Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Arg-Gly-Leu-Lys as peptide substrate specifically degraded by the protease, - C는 상기 시아닌계 또는 알렉사계 형광체의 발광을 흡수하여 소광 효과를 나타낼 수 있는 블랙홀 소광체 (blackhole quencher, BHQ) 또는 블랙베리 소광체 (blackberry quencher, BBQ)이며, C is a black hole quencher (BHQ) or a blackberry quencher (BBQ) that can absorb the light emission of the cyanine- or Alexa-based phosphor and exhibit a quenching effect, - A와 C의 위치는 서로 교환적이고, The positions of A and C are interchangeable, - A는 상기 펩타이드의 아미노 말단에 결합되고 C는 상기 펩타이드의 카르복시 말단에 결합되는데, 상기 A와 C는 B의 양 말단뿐만 아니라 펩타이드 기질 (B) 내부의 아미노산 잔기 중 단백질 분해효소에 의해 잘려지는 아미노산 잔기 부분을 제외한 나머지 아미노산 잔기 중 측쇄 말단에 아미노기를 가지는 라이신(Lys)에도 결합할 수 있는 것임A is attached to the amino terminus of the peptide and C is attached to the carboxy terminus of the peptide, wherein A and C are cleaved by proteases in amino acid residues within the peptide substrate (B) as well as at both ends of B Able to bind to lysine (Lys) having amino group at the side of chain end of amino acid residue except amino acid residue part 제1항에 있어서, 상기 센서는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 신장암, 방광암, 난소암, 담관암 또는 담낭암을 포함하는 암; 치매, 뇌졸증; 골관절염, 류마티스 관절염과 같은 자가 면역질환의 진단을 위한 것인 센서.According to claim 1, wherein the sensor is squamous cell carcinoma, uterine cancer, cervical cancer, prostate cancer, head and neck cancer, pancreatic cancer, brain tumor, breast cancer, liver cancer, skin cancer, esophageal cancer, testicular cancer, kidney cancer, colon cancer, rectal cancer, stomach cancer, kidney Cancers including cancer, bladder cancer, ovarian cancer, cholangiocarcinoma, or gallbladder cancer; Dementia, stroke; Sensor for the diagnosis of autoimmune diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis. 제1항에 따른 센서를 유효성분으로서 함유하는, 세포 및 조직에서 발현되는 상기 단백질 분해효소 MMP-13을 정량분석하기 위한 조성물.A composition for quantitating the protease MMP-13 expressed in cells and tissues, comprising the sensor according to claim 1 as an active ingredient. 제1항에 따른 센서를 유효성분으로서 함유하는, 상기 단백질 분해효소 MMP-13의 과다발현을 억제하는 약물 또는 약물의 효능을 스크리닝하기 위한 조성물.A composition for screening the efficacy of a drug or drug that inhibits overexpression of the protease MMP-13, comprising the sensor according to claim 1 as an active ingredient. - 단백질 분해효소 MMP-13에 특이적으로 분해되는 펩타이드 기질인 Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Arg-Gly-Leu-Lys을 제공하는 단계, Providing Gly-Pro-Met-Gly-Leu-Arg-Gly-Leu-Lys, a peptide substrate that is specifically degraded to protease MMP-13, - 상기 펩타이드 기질의 N 말단 또는 C 말단에 있는 보호기를 제거하고, 펩타이드의 말단 작용기와 결합하는 블랙홀 소광체 (blackhole quencher, BHQ) 또는 블랙베리 소광체 (blackberry quencher, BBQ)와 시아닌계 또는 알렉사계 형광체를 결합시키는 단계-Black hole quencher (BHQ) or blackberry quencher (BBQ) and cyanine-based or Alexa-based which remove the protecting group at the N- or C-terminus of the peptide substrate and bind to the terminal functional group of the peptide Combining phosphors 를 포함하는 것인, 제1항 기재의 단백질 분해효소의 영상화를 위한 센서를 제조하는 방법.Comprising a method for producing a sensor for imaging of the protease of claim 1. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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