KR101009501B1 - Composition for diagnosing cancer comprising anti-lysyl tRNA synthethase antibody and anti-laminin receptor antibody as an active ingredient - Google Patents

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KR101009501B1 KR1020080099783A KR20080099783A KR101009501B1 KR 101009501 B1 KR101009501 B1 KR 101009501B1 KR 1020080099783 A KR1020080099783 A KR 1020080099783A KR 20080099783 A KR20080099783 A KR 20080099783A KR 101009501 B1 KR101009501 B1 KR 101009501B1
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Abstract

본 발명은 항-라이실 tRNA 합성효소 항체 및 항-라미닌 수용체 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 항-라이실 tRNA 합성효소 항체 및 항-라미닌 수용체 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물 및 키트, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 라이실 tRNA 합성효소 및 67kDa 라미닌 수용체를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 KRS는 원형질막의 라미닌 수용체(67LR)와 함께 암의 전이에 관여하므로 이의 존재 여부 및 양을 측정함으로써 암의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a cancer diagnostic composition comprising an anti-lysyl tRNA synthetase antibody and an anti-laminin receptor antibody as an active ingredient. More specifically, the present invention is a composition and kit for cancer diagnosis comprising an anti-lysyl tRNA synthetase antibody and an anti-laminin receptor antibody as an active ingredient, the present invention provides a sample of a patient, in order to provide information necessary for cancer diagnosis From a lysyl tRNA synthetase and a 67kDa laminin receptor via antigen-antibody reactions. KRS of the present invention is involved in the metastasis of cancer together with the laminin receptor (67LR) of the plasma membrane, and thus can be usefully used for the diagnosis of cancer by measuring the presence and amount thereof.

라이실 tRNA 합성효소, 라미닌 수용체, 항체, 암, 진단, 키트 Lysyl tRNA synthetase, laminin receptor, antibody, cancer, diagnostic, kit

Description

항-라이실 티알엔에이 합성효소 항체 및 항-라미닌 수용체 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물{Composition for diagnosing cancer comprising anti-lysyl tRNA synthethase antibody and anti-laminin receptor antibody as an active ingredient}Composition for diagnosing cancer comprising anti-lysyl tRNA synthethase antibody and anti-laminin receptor antibody as an active ingredient}

본 발명은 항-라이실 tRNA 합성효소 항체 및 항-라미닌 수용체 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 항-라이실 tRNA 합성효소 항체 및 항-라미닌 수용체 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물 및 키트, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 라이실 tRNA 합성효소 및 67kDa 라미닌 수용체를 검출하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a cancer diagnostic composition comprising an anti-lysyl tRNA synthetase antibody and an anti-laminin receptor antibody as an active ingredient. More specifically, the present invention is a composition and kit for cancer diagnosis comprising an anti-lysyl tRNA synthetase antibody and an anti-laminin receptor antibody as an active ingredient, the present invention provides a sample of a patient, in order to provide information necessary for cancer diagnosis From a lysyl tRNA synthetase and a 67kDa laminin receptor via antigen-antibody reactions.

암(또는 종양)은 비정상적이고 비제어성이며 무질서한 세포증식의 산물이다. 특히, 파괴적인 성장성, 침투성 및 전이성이 있다면 악성으로 분류된다. 침투성이란 주위 조직을 침투 또는 파괴하는 성질로서, 일반적으로 조직의 경계를 이루는 기저층을 파괴시켜 종양이 국부적으로 전파되는 것을 의미하며, 종종 체내의 순환계로도 유입된다. 전이란 일반적으로 림프관(lymphotic) 또는 혈관에 의해 원발 위 치와는 다른 곳으로 종양 세포가 퍼지는 것을 의미한다. 전이는 또한 장액성 체강 또는 다른 공간을 통해 직접 신장하여 종양 세포를 이동시키는 것을 의미하기도 한다.Cancer (or tumors) are the product of abnormal, uncontrolled and disordered cell proliferation. In particular, if there is destructive growth, permeability and metastasis, it is classified as malignant. Permeability is the property of infiltrating or destroying surrounding tissues, which generally means that the tumor spreads locally by destroying the basal layer that forms the boundary of the tissues, and often enters the circulatory system of the body. Translocation generally refers to the spread of tumor cells to a location different from the original location by lymphatic or blood vessels. Metastasis also refers to the movement of tumor cells by stretching directly through serous body cavity or other spaces.

현재, 암은 주로 3가지 치료법, 즉 외과적인 수술, 방사선조사 및 화학요법 중 1가지 또는 이들의 조합을 통해 치료되고 있다. 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 것을 포함한다. 이러한 외과적 수술은 특정 부위, 예컨대 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제거하는 데에는 효과적이지만, 척추와 같이 일부 구역에 있는 종양을 치료하거나 백혈병과 같은 분산성 종양질환을 치료하는 데는 사용할 수 없다.Currently, cancer is treated mainly through three therapies: one or a combination of surgical, radiation and chemotherapy. Surgery involves removing most of the diseased tissue. Such surgical operations are effective in removing tumors located in certain areas, such as breasts, colons, and skin, but cannot be used to treat tumors in some areas, such as the spine, or to treat diffuse tumor diseases such as leukemia.

화학요법은 세포 복제 또는 세포 대사를 붕괴시키며, 흔히 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 많이 사용되는데, 종양 질병을 치료하는데 사용되는 전신성 화학요법의 부작용은 암 치료를 받는 환자들에게 가장 문제가 된다. 이러한 부작용 중에서 멀미와 구토는 가장 일반적이며 심각한 부작용이다. 화학요법에 의한 부작용은 환자의 생명에 큰 영향을 미치며 치료에 대한 환자의 순응성을 급격하게 변화시킬 수 있다. 또한, 화학치료제와 관련된 부작용으로는 일반적으로 이러한 약물의 투여시 주의해야 하는 용량 제한 독성(DLT, Dose Limiting Toxicity)이 있다. 예를 들어, 점막염은 여러 항암제, 예컨대 항 대사물질 세포독소제인 5-플루오로우라실, 메소트렉세이트 및 항종양 항생제(예, 독소루비신) 등에 대한 용량 제한 독성이 있 다. 이러한 화학요법 유래의 부작용 중 대부분은 심한 경우 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위해 진통제를 필요로 하기도 한다. 이와 같이 화학치료제 및 방사선 치료에 의한 부작용들은 암 환자의 임상적 처치시 주요 문제가 되고 있다.Chemotherapy disrupts cell replication or cell metabolism, and is often used to treat cancers of the breast, lungs, and testes. The side effects of systemic chemotherapy used to treat tumor disease are the most problematic for patients receiving cancer. do. Of these side effects, motion sickness and vomiting are the most common and serious side effects. Side effects from chemotherapy have a major impact on the patient's life and can drastically change the patient's compliance with the treatment. In addition, side effects associated with chemotherapeutic agents generally include Dose Limiting Toxicity (DLT), which should be noted when administering such drugs. For example, mucositis is dose limiting toxic to several anticancer agents, such as 5-fluorouracil, mesotrexate and antitumor antibiotics (eg doxorubicin), which are anti-metabolizer cytotoxins. Many of these chemotherapy-derived side effects can require hospitalization or painkillers to treat pain. As such, side effects caused by chemotherapeutic agents and radiation therapy are becoming a major problem in the clinical treatment of cancer patients.

유전자 치료란 DNA 재조합 방법을 이용하여 치료용 유전자를 환자의 세포 안으로 도입시켜 유전자 결함을 교정시키거나 세포에 새로운 기능을 추가시켜 인체 세포의 유전적 변형을 통해 각종 유전질환, 암, 심혈관질환, 감염성 질병, 그리고 자가면역질환 등과 같은 질환을 치료하거나 예방하는 방법이다. 즉, 치료 유전자를 체내의 원하는 장기로 전달하여 세포내에서 치료용 혹은 정상 단백질이 발현되도록 하여 질병을 치료하는 것을 유전자치료라고 한다. 유전자치료는 일반적인 약물에 의한 치료에 비해서 우수한 선택성을 가질 수 있고 다른 치료법으로는 조절하기 힘든 질병의 치료율 및 치료 속도를 개선하여 오랜 기간동안 적용할 수 있다. 유전자 치료는 단순히 질병의 증상을 치료하는 데에 그치지 않고 질병의 원인을 치료하고 제거하는 방식이다. 이러한 유전자 치료를 효과적으로 하기 위해서는 치료유전자를 원하는 표적세포로 전달하여 높은 발현 효율을 얻을 수 있도록 하는 유전자 전달기술이 필요하다.Gene therapy uses DNA recombination to introduce a gene into a patient's cell to correct genetic defects or to add new functions to the cell, resulting in genetic modification of human cells, resulting in various genetic diseases, cancers, cardiovascular diseases, and infectivity. It is a method of treating or preventing diseases such as diseases and autoimmune diseases. In other words, gene therapy is called gene therapy to deliver a therapeutic gene to a desired organ in the body and to treat a disease by expressing a therapeutic or normal protein in a cell. Gene therapy can be applied for a long time to improve the treatment rate and treatment rate of the disease that can be superior to the treatment with the general drug and difficult to control with other therapies. Gene therapy is more than just treating the symptoms of a disease, it is a way to treat and eliminate the cause of the disease. In order to effectively perform such gene therapy, a gene delivery technology is required to deliver a therapeutic gene to a desired target cell to obtain high expression efficiency.

유전자 전달체는 원하는 치료 유전자를 대상 세포에 도입하기 위해 필요한 매개체로써, 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량 생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있으며 지속적으로 유전자를 발현할 수 있어야 한다. 유전자 전달체 기술은 유전자 치료 기술의 핵심 요소로서, 현재 유전자 치료에 많이 이용되는 대표적 유전자 전달체로는 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 레트로 바이러스와 같은 바이러스성 전달체와 리포좀, 폴리에틸렌이민과 같은 비바이러스성 전달체가 있다.Gene carriers are a necessary medium for introducing a desired therapeutic gene into a target cell, and an ideal gene carrier should be harmless to the human body, easy to mass produce, efficiently transfer genes, and be able to continuously express genes. Gene delivery technology is a key component of gene therapy technology, and representative gene delivery systems that are widely used in gene therapy are viral delivery agents such as adenoviruses, adeno-associated viruses, and retroviruses, and non-viral delivery agents such as liposomes and polyethyleneimines. have.

유전자 치료의 전략 중 종양 세포를 제어하는 전략으로는 종양억제 유전자를 이용하는 방법, 종양 선택적 살상 바이러스를 이용하는 방법, 자살 유전자를 이용하는 방법, 면역조절 유전자를 도입하는 방법 등이 있다. 종양억제 유전자를 이용하는 방법은 상당수의 암환자에서 유전자가 결손 또는 변형되어 있는 p53과 같은 종양억제 유전자를 원형으로 인체에 전달하여 암을 치료하려는 방법이며, 종양선택적 살상바이러스를 이용하는 방법은 암조직에서 변형되어 있는 종양억제 유전자의 활성을 이용하여 종양세포에서만 선택적으로 증식할 수 있는 바이러스 유전자 전달체를 인체에 도입하여 치료효과를 거두려는 방법으로서 모두 종양세포를 직접 살상시키는 전략이다. 자살 유전자를 이용하는 방법도 HSV-TK와 같은 감수성 유전자를 도입하여 종양세포의 자살을 유도하는 방법도 이와 같은 범주에 속한다. 반면, 면역 조절 유전자를 도입하는 방법은 항종양 면역반응을 증강하게 하는 인터루킨 12, 인터루킨 4, 인터루킨 7, 감마 인터페론, 종양괴사인자 등의 유전자를 인체에 전달하여 T세포에게 종양을 인식하도록 유발하거나, 종양 유발 단백질을 차단하여 세포 자살을 유도하여 간접적으로 질병을 치료하는 전략이다. 안지오스타틴, 엔도스타틴과 같은 혈관생성억제인자를 발현시켜 종양으로의 영양공급을 차단하여 괴사시키는 방법도 이와 같은 간접적 질병치료 전략으로 널리 인식되고 있다.Strategies for controlling tumor cells among gene therapy strategies include using tumor suppressor genes, using a tumor selective killing virus, using suicide genes, and introducing immunoregulatory genes. Tumor suppressor genes are used to treat cancer by delivering tumor suppressor genes, such as p53, whose genes are missing or modified in a circle to the human body in a large number of cancer patients. By utilizing the activity of the modified tumor suppressor gene, the virus gene carrier that can selectively proliferate only in tumor cells is introduced into the human body to have a therapeutic effect. The method using suicide genes also introduces susceptibility genes such as HSV-TK to induce suicide of tumor cells. On the other hand, the method of introducing an immunomodulatory gene transfers genes such as interleukin 12, interleukin 4, interleukin 7, gamma interferon, and tumor necrosis factor to the human body to enhance the antitumor immune response, thereby causing T cells to recognize tumors. It is a strategy to indirectly treat diseases by inducing cell suicide by blocking tumor-induced proteins. The method of expressing angiogenesis inhibitors such as angiostatin and endostatin to block nutrient supply to tumors and necrosis is widely recognized as such an indirect disease treatment strategy.

종양의 전이는 암의 생존률에 있어서 결정적인 요소이다. 67 kDa의 라미닌 수용체(67LR)는 원형질막에 포매된(embedded) 비-인테그린형 수용체로서, 암의 침습(침윤) 및 전이와 연관이 있다(Nelson, J. et al. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008)). 67LR은 이들의 37kDa 전구체(37LRP)의 중합(dimerization)에 의해 생성되는데, 이러한 변화 과정에 대한 분자적인 세부기작은 잘 알려져 있지 않다. 37LRP는 폴리좀 형성에 관여하는 리보좀 서브유닛 p40과 동일하다(Auth, D. & Brawerman,G. A 33-kDa polypeptide with homology to the laminin receptor: component of translation machinery. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4368-4372 (1992)). 67LR은 종종 다양한 종류의 암에서 고농도로 관찰된다(Nelson, J. et al.The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28, 33-48 (2008); Menard, S., Castronovo, V., Tagliabue, E. & Sobel, M. E.New insights into the metastasis-associated 67 kD laminin receptor. J. Cell. Biochem. 67, 155-165 (1997)). 그러나, 67LR의 막내 존재에서의 조절자나 분자적 기작은 아직 밝혀지지 않았다. Tumor metastasis is a critical factor in cancer survival. The 67 kDa laminin receptor (67LR) is a non-integrin-type receptor embedded in the plasma membrane and is associated with cancer invasion (invasion) and metastasis (Nelson, J. et al. The 67 kDa laminin receptor: structure , function and role in disease.Biosci.Rep. 28 , 33-48 (2008)). 67LR is produced by the dimerization of their 37kDa precursor (37LRP), and the molecular details of this change process are not well known. 37 LRP is identical to the ribosomal subunit p40 involved in polysome formation (Auth, D. & Brawerman, G. A 33-kDa polypeptide with homology to the laminin receptor: component of translation machinery.Proc . Natl. Acad. Sci. USA 89, 4368-4372 (1992). 67LR is often observed at high concentrations in various types of cancer (Nelson, J. et al. The 67 kDa laminin receptor: structure, function and role in disease. Biosci. Rep. 28 , 33-48 (2008); Menard, S , Castronovo, V., Tagliabue, E. & Sobel, ME New insights into the metastasis-associated 67 kD laminin receptor.J. Cell.Biochem . 67 , 155-165 (1997)). However, the regulators and molecular mechanisms in the intracellular presence of 67LR are not yet known.

KRS는 단백질 합성을 위하여 동족의(cognate) 아미노산 및 tRNA를 접합시키는 aminoacyl-t-RNA synthetases(ARSs)에 속한다. 이들 원시 효소들은 촉매적 활성 외에도 다면적(pleiotropic) 특징을 갖는다(Park, S. G., Ewalt,K. L. & Kim, S. Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers. Trends Biochem. Sci . 30 , 569-574 (2005)). 이에 반해, KRS를 포함한 몇몇 포유류의 ARS는 구성 단백질의 다양한 기능을 조절하기 위하여, 분자 저장소(molecular reservoir)로서 작용하는(Ray, P. S., Arif, A. & Fox, P. Macromolecular complexes as depots for releasable regulatory proteins. Trends Biochem. Sci. 32, 158-164 (2007)) 거대분자 복합체를 형성한다(Lee, S. W., Cho, B. H.,Park, S. G. & Kim, S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes: beyond translation. J. Cell. Sci. 117, 3725-3734 (2004); Han, J. M., Kim, J. Y. & Kim, S. Molecular network and functional implications of macromolecular tRNA synthetase complex. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303, 985-993 (2003)). 인간 KRS는 RNA와 기타 단백질간의 상호작용에 관여하는 고유한 N말단 연장부위를 함유하고 있다(Rho, S. B. et al. Genetic dissection of protein-protein interactions in multi-tRNA synthetase complex. Proc. Natl. Sci. Acad. USA 96, 4488-4493 (1999); Francin, M., Kaminska, M., Kerjan,P. &Mirande. M. The N-terminal domain of mammalian Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain. J. Biol. Chem. 277, 1762-1769 (2002)). KRS belongs to aminoacyl-t-RNA synthetases (ARSs) that conjugate cognate amino acids and tRNAs for protein synthesis. These primitive enzymes have pleiotropic features in addition to catalytic activity (Park, SG, Ewalt, KL & Kim, S. Functional expansion of aminoacyl-tRNA synthetases and their interacting factors: new perspectives on housekeepers. Trends Biochem. Sci . 30 , 569-574 (2005)). In contrast, some mammalian ARSs, including KRS, act as molecular reservoirs (Ray, PS, Arif, A. & Fox, P. Macromolecular complexes as depots for releasable to regulate various functions of constituent proteins). ... regulatory proteins Trends Biochem Sci 32, 158-164 (2007)) to form a macromolecular complex (Lee, SW, Cho, BH , Park, SG & Kim, S. Aminoacyl-tRNA synthetase complexes:. beyond translation J . Cell Sci 117, 3725-3734 (2004 );....... Han, JM, Kim, JY & Kim, S. Molecular network and functional implications of macromolecular tRNA synthetase complex Biochem Biophys Res Commun 303, 985-993 (2003). Human KRS contains a unique N-terminal extension involved in the interaction between RNA and other proteins (Rho, SB et al. Genetic dissection of protein-protein interactions in multi-tRNA synthetase complex. Proc. Natl. Sci. Acad USA 96, 4488-4493 (1999) ;.... Francin, M., Kaminska, M., Kerjan, P & Mirande M. The N-terminal domain of mammalian Lysyl-tRNA synthetase is a functional tRNA-binding domain J Biol.Chem . 277 , 1762-1769 (2002)).

이에 본 발명자들은 인간 KRS의 기능적 다양성과 관련하여 이 펩티드의 유의성을 확인하고자, 본 발명자들은 인간 KRS의 N말단 116개 아미노산 펩티드를 분리하여 이스트 투 하이브리드를 이용한 HeLa 세포주 cDNA 라이브러리로부터 인간 KRS에 결합하는 단백질을 스크리닝하는 탐침(bait;미끼)용으로 사용하였다. 상기 스크리닝으로부터, 본 발명자들은 본 발명에서 결합 가능성이 있는 단백질의 하나로서 37LRP/p40을 확인하였고, KRS와 라미닌 수용체간의 상호작용에 있어서의 기능적 연관성을 조사하였다.In order to confirm the significance of this peptide in relation to the functional diversity of human KRS, the present inventors isolated 116 amino acid peptides from the N-terminus of human KRS to bind human KRS from HeLa cell line cDNA library using yeast to hybrid. Protein was used for screening bait (bait). From the above screening, we identified 37LRP / p40 as one of the proteins capable of binding in the present invention, and examined the functional association in the interaction between KRS and laminin receptors.

그 결과, 라이실 t-RNA 합성효소(lysyl-t-RNA synthetase, KRS)가 원형질 막에 있는 67LR을 안정화시킴으로써 세포 이동 및 암 전이를 촉진하는 등 KRS가 원형질 막의 라미닌 수용체를 통해서 암 전이 또는 암 세포 이동에 영향을 미친다는 것을 알아내어 본 발명을 완성하였다.As a result, KRS promotes cancer metastasis or cancer through laminin receptors on the plasma membrane, such as lysyl-t-RNA synthetase (KRS), which promotes cell migration and cancer metastasis by stabilizing 67LR on the plasma membrane. The present invention was completed by finding out that it affects cell migration.

따라서 본 발명의 목적은 항-KRS 항체 및 항-KRS 항체와 항-67LR 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a composition for diagnosing cancer comprising an anti-KRS antibody, an anti-KRS antibody, and an anti-67LR antibody as an active ingredient.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 항-KRS 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.In order to achieve the above object, it provides a cancer diagnostic composition comprising an anti-KRS antibody as an active ingredient.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항-KRS 항체 및 항-67LR 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a composition for diagnosing cancer comprising an anti-KRS antibody and an anti-67LR antibody as an active ingredient.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항-KRS 항체 및 항-67LR 항체를 포함하는 암 전이 진단키트를 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a cancer metastasis diagnostic kit comprising an anti-KRS antibody and an anti-67LR antibody.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 라이실 tRNA 합성효소 및 67kDa 라미닌 수용체를 검출하는 방법을 제공한다.In order to achieve another object of the present invention, the present invention provides a method for detecting lysyl tRNA synthase and 67kDa laminin receptor through antigen-antibody reaction from a patient's sample to provide information necessary for cancer diagnosis. .

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명자들은 KRS가 암 전이 또는 암 세포 이동에 미치는 영향을 처음으로 규명하였다. 즉, 본 발명은 KRS가 원형질 막의 라미닌 수용체를 통해서 암 전이 또는 암 세포 이동에 영향을 미친다는 것을 규명하였다. We first identified the effects of KRS on cancer metastasis or cancer cell migration. That is, the present invention has revealed that KRS affects cancer metastasis or cancer cell migration through laminin receptors of the plasma membrane.

따라서, KRS 및/또는 67kDa 라미닌 수용체(67LR)의 검출을 통해 암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 암의 진단 및 예후 평가는 생물학적 시료 중에서 KRS 및/또는 67LR 단백질을 검출함으로써 수행될 수 있다. 이에 본 발명은 항-KRS 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다. 아울러, 진단의 효과, 즉 진단의 정확성을 더 높이기 위하여, 여러 개의 마커를 사용하면 좋기 때문에, 본 발명의 KRS는 67LR과 더불어 암 진단용 마커로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 항-KRS 항체 및 항-67LR 항체를 유효성분으로 포함하는 암 진단용 조성물을 제공한다.Thus, detection of KRS and / or 67 kDa laminin receptor (67LR) can be used as diagnostic markers for diagnosis of cancer, progression of disease, and assessment of prognosis before and after treatment. Diagnosis and prognostic assessment of cancer according to the present invention can be performed by detecting KRS and / or 67LR proteins in biological samples. Accordingly, the present invention provides a cancer diagnostic composition comprising an anti-KRS antibody as an active ingredient. In addition, in order to increase the effectiveness of the diagnosis, that is, the accuracy of the diagnosis, since several markers may be used, the KRS of the present invention may be used as a cancer diagnosis marker together with 67LR. Therefore, the present invention provides a cancer diagnostic composition comprising an anti-KRS antibody and an anti-67LR antibody as an active ingredient.

본 발명에서 사용된 용어 “암 진단 마커”란 암 조직 및 세포에서 발현되고 이의 발현 여부를 확인함으로써 암의 발병을 확인할 수 있는 물질, 바람직하게는 정상 조직과 암 조직에서 유의한 차이를 보이는 단백질 또는 mRNA 등과 같은 유기 생체 분자를 의미한다. 본 발명에서 암 진단 마커는 KRS 및 67LR이며 시료에서 이의 유무 또는 양을 확인함으로써 암을 진단할 수 있다. As used herein, the term “cancer diagnostic marker” refers to a substance capable of confirming the onset of cancer by expressing it in cancer tissues and cells and confirming the expression thereof, preferably a protein showing a significant difference between normal tissue and cancer tissue, or organic molecules such as mRNA. Cancer diagnostic markers in the present invention are KRS and 67LR and cancer can be diagnosed by confirming the presence or absence thereof in the sample.

본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 질환은 암일 수 있다. 상기 암은 이에 제한되지는 않으나, 대장암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 융모암, 난소암, 유방암, 갑상선암, 뇌암, 두경부암, 악성흑색종, 림프종, 재생불량성 빈혈 등을 포함한다. The disease to which the composition of the present invention may be applied may be cancer. The cancer may include, but is not limited to, colon cancer, lung cancer, liver cancer, stomach cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, testicular cancer, cervical cancer, endometrial cancer, chorionic cancer, ovarian cancer, breast cancer, and thyroid cancer. Brain cancer, head and neck cancer, malignant melanoma, lymphoma, aplastic anemia, and the like.

아울러, 상기 암 진단은 암의 전이의 진단일 수 있다. 즉, KRS 및 67LR의 검출을 통해 암의 전이 여부의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후의 평가를 위한 진단 마커로 사용될 수 있다.In addition, the cancer diagnosis may be diagnosis of cancer metastasis. That is, the detection of KRS and 67LR can be used as a diagnostic marker for the diagnosis of cancer metastasis, the progression of disease and the evaluation of the prognosis before and after treatment.

본 발명에서 사용된 용어 “생물학적 시료” 또는 “시료”는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본, 조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물, 세포 용해물, 전혈, 혈장, 혈청, 침, 안구액, 뇌척수액, 땀, 뇨, 젖, 복수액, 활액, 복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어, 여과, 증류, 추출, 농축, 방해 성분의 불활성화, 시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료로부터 핵산 및 단백질을 분리하여 검출에 사용할 수 있다. As used herein, the term “biological sample” or “sample” includes solid tissue samples such as blood and other liquid samples of biological origin, biopsy samples, tissue cultures or cells derived therefrom. More specifically, for example, but not limited to, tissue, extract, cell lysate, whole blood, plasma, serum, saliva, ocular fluid, cerebrospinal fluid, sweat, urine, milk, ascites fluid, synovial fluid, peritoneal fluid, and the like. The sample can be obtained from an animal, preferably a mammal, most preferably a human. The sample may be pretreated before use for detection. For example, it can include filtration, distillation, extraction, concentration, inactivation of disturbing components, addition of reagents, and the like. In addition, nucleic acids and proteins can be separated from the sample and used for detection.

본 발명에서 사용된 용어 “검출”은 표적 KRS 또는 67LR 단백질, 그의 서브유닛의 존재 또는 부재를 분석, 영상화, 확인, 확립하는 것을 말한다.As used herein, the term “detection” refers to analyzing, imaging, identifying, and establishing the presence or absence of a target KRS or 67LR protein, a subunit thereof.

본 발명에서 "KRS 단백질 또는 “KRS 폴리펩티드"는 라이실 tRNA 합성효소로 알려져 있는 폴리펩티드를 말한다. 상기 KRS 폴리펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다(Genbank Accession No. NP_005539.1). 또한 본 발명의 KRS는 이의 기능적 동등물을 포함한다. In the present invention, "KRS protein or" KRS polypeptide "refers to a polypeptide known as lysyl tRNA synthetase. The KRS polypeptide may be a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Genbank Accession No. NP — 005539.1). KRS of the present invention also includes functional equivalents thereof.

상기 기능적 동등물이란 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 폴리펩티드를 말한다. 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, "실질적으로 동질의 생리활성"이란 원형질막의 라미닌 수용체와 상호작용하며, 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절하는 것을 의미한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 일부가 부가, 치환 또는 결실의 결과 생성될 것일 수 있다. 상기에서 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산(Asp, Glu), 염기성 아미노산(His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 또한 상기 기능적 동등물에는 본 발명의 KRS 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 아미노산의 일부가 결실된 변형체도 포함된다. 상기 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩티드의 생리활성에 직접적으로 관련되지 않은 영역에 위치해 있다. 또한 아미노산의 결실은 바람직하게는 KRS 폴리펩티드 의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 아울러 상기 KRS 폴리펩티드의 아미노산 서열의 양 말단 또는 서열 내에 몇몇의 아미노산이 부가된 변형체도 포함된다. 또한 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.The functional equivalent refers to a polypeptide having at least 70%, preferably at least 80%, more preferably at least 90% sequence homology (ie, identity) with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. For example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85 Sequence homology of%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% It includes a polypeptide having a, and refers to a polypeptide that exhibits substantially the same physiological activity as the polypeptide represented by SEQ ID NO: 1. Here, "substantially homogeneous physiological activity" means interacting with laminin receptors of the plasma membrane and regulating cancer metastasis or cancer cell migration. Such functional equivalents may result from the addition, substitution or deletion of some of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 1. Substitution of amino acids in the above is preferably a conservative substitution. Examples of conservative substitutions of naturally occurring amino acids include: aliphatic amino acids (Gly, Ala, Pro), hydrophobic amino acids (Ile, Leu, Val), aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (His, Lys, Arg, Gln, Asn) and sulfur-containing amino acids (Cys, Met). Such functional equivalents also include variants in which some of the amino acids are deleted on the amino acid sequence of the KRS polypeptide of the invention. Deletion or substitution of these amino acids is preferably located in a region not directly related to the physiological activity of the polypeptides of the invention. In addition, the deletion of the amino acid is preferably located at a portion not directly involved in the physiological activity of the KRS polypeptide. Also included are variants in which some amino acids are added to both ends or sequences of the amino acid sequence of the KRS polypeptide. The scope of functional equivalents of the present invention also includes polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide have been modified while maintaining the basic backbone of the polypeptide and its physiological activity. For example, this includes structural modifications for altering the stability, shelf life, volatility or solubility of the polypeptide of the present invention.

본 명세서에서 서열 상동성 및 동질성은 KRS의 아미노산 서열(서열번호 1)과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 KRS의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 또한, KRS의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서열 동질성 또는 상동성에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한, 상기 서열 동질성은 두 개의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 폴리펩티드를 각각의 아미노산이 최적으로 매칭되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 페널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM250(표준 스코링 매트릭스 Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다. 일치하는 서열(identical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(matched span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열 내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다.Sequence homology and identity herein are defined as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence relative to the amino acid sequence of KRS after aligning the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) and the candidate sequence of the KRS and introducing a gap. If necessary, conservative substitutions as part of sequence homogeneity are not considered in order to obtain maximum percentage sequence identity. In addition, the N-terminus, C-terminus or internal extension, deletion or insertion of the amino acid sequence of KRS is not to be construed as a sequence affecting sequence homology or homology. In addition, the sequence homogeneity can be determined by common standard methods used to compare similar portions of amino acid sequences of two polypeptides. Computer programs such as BLAST or FASTA align the two polypeptides so that their respective amino acids are optimally matched (along the full length of one or two sequences or along the predicted portions of one or two sequences). The program provides a default opening penalty and a default gap penalty and can be used in conjunction with a computer program (PAM250 (standard scoring matrix Dayhoff et al., In Atlas of Protein Sequence) and Structure, vol 5, supp 3, 1978). For example, percentage homogeneity can be calculated as follows. The total number of identical matches is multiplied by 100 and then the sum of the length of the longer sequence in the corresponding span and the number of gaps introduced into the longer sequence to align the two sequences. Divide.

본 발명에 따른 KRS 단백질은 천연에서 추출하거나 유전공학적 방법에 의해 작제될 수 있다. 예를 들면, 통상적인 방법에 따라 상기 KRS 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 핵산(예: 서열번호 2(Genbank Accession No. D32053))을 작제한다. 상기 핵산은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)을 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 핵산은 이에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 핵산의 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 핵산이 발현되기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 핵산에 의해 발현된, 실질적으로 순수한 폴리펩티드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 "실질적으로 순수한 폴리펩티드(substantially pure polypeptide)"라 함은 본 발명에 따른 폴리펩티드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y., Second(1998) and Third(2000) Editions Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink(eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.KRS protein according to the invention can be extracted from nature or constructed by genetic engineering methods. For example, nucleic acids encoding the KRS or functional equivalents thereof (eg, SEQ ID NO: 2 (Genbank Accession No. D32053)) are constructed according to conventional methods. The nucleic acid can be constructed by PCR amplification using appropriate primers. Alternatively, DNA sequences may be synthesized by standard methods known in the art, such as using automated DNA synthesizers (such as those sold by Biosearch or Applied Biosystems). The constructed nucleic acid is inserted into a vector comprising one or more expression control sequences (e.g., a promoter, enhancer, etc.) that is operatively linked to regulate expression of the nucleic acid, and the recombinant formed therefrom. The host cell is transformed with the expression vector. The resulting transformants are cultured under medium and conditions appropriate for the nucleic acid to be expressed to recover substantially pure polypeptides expressed by the nucleic acid from the culture. The recovery can be carried out using methods known in the art (eg chromatography). As used herein, "substantially pure polypeptide" means that the polypeptide according to the present invention is substantially free of any other protein derived from a host cell. For genetic engineering methods for polypeptide synthesis of the present invention, reference may be made to Maniatis et al ., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, Second (1998) and Third (2000) Editions Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink ( eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; And Hitzeman et al ., J. Biol. Chem., 255: 12073-12080, 1990.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989). In addition, polypeptides of the present invention can be readily prepared by chemical synthesis known in the art (Creighton, Proteins; Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., NY, 1983). Representative methods include, but are not limited to, liquid or solid phase synthesis, fragment condensation, F-MOC or T-BOC chemistry (Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al ., Eds., CRC Press) , Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).

발명에서 67 kDa의 라미닌 수용체(67LR)는 원형질막에 포매된(embedded) 비-인테그린형 수용체로서 예를 들어, Genbank Accession No. NM_002295, S37431, AF284768, S37431, AF284768, J03799, XP_370865, XP_001083023.에 기재된 염기서열 또는 아미노산 서열을 가질 수 있다.In the present invention, the 67 kDa laminin receptor (67LR) is a non-integrin-type receptor embedded in the plasma membrane, for example Genbank Accession No. It may have a nucleotide sequence or amino acid sequence described in NM_002295, S37431, AF284768, S37431, AF284768, J03799, XP_370865, XP_001083023.

본 발명에서 KRS 또는 67LR을 검출하는 방법으로는 당 업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 시료를 각각 KRS 및 67LR 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 즉 항-KRS 항체 또는 항-67LR 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정한다.As a method of detecting KRS or 67LR in the present invention, various analytical methods known in the art may be used. Preferably, the sample is contacted with an antibody that specifically binds KRS and 67LR proteins, ie, an anti-KRS antibody or an anti-67LR antibody, to determine the formation of the antigen-antibody complex.

본 발명에서 용어 “항원-항체 복합체”란 생물학적 시료 중의 KRS 또는 67LR 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.As used herein, the term “antigen-antibody complex” means a combination of a KRS or 67LR protein in a biological sample with an antibody that specifically recognizes it.

본 발명에서 “항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)2 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.As used herein, "antibody" refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site. Antibodies used in the present invention include monoclonal or polyclonal antibodies, immunologically active fragments (eg, Fab or (Fab) 2 fragments), antibody heavy chains, humanized antibodies, antibody light chains, genetically engineered single chain Fv molecules, Chimeric antibodies and the like.

KRS 또는 67LR 단백질은 각각 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 각각의 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 KRS 또는 67LR 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 KRS 또는 67LR 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전 환된 형질전환체에서 KRS 또는 67LR 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 KRS 또는 67LR 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.Since KRS or 67LR proteins are known proteins, the antibodies used in the present invention can be prepared by conventional methods well known in the field of immunology using each protein as an antigen. KRS or 67LR proteins used as antigens of the antibodies according to the invention can be extracted or synthesized in nature and can be prepared by recombinant methods based on DNA sequences. When using a recombinant technique, a nucleic acid encoding a KRS or 67LR protein is inserted into an appropriate expression vector, the host cell is cultured to express the KRS or 67LR protein in a transformant transformed with the recombinant expression vector, and then It can be obtained by recovering KRS or 67LR protein.

예를 들어, 다클론 항체는 KRS 또는 67LR 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다. For example, polyclonal antibodies can be produced by injecting KRS or 67LR protein antigens into an animal and collecting blood from the animal to obtain serum comprising the antibody. Such antibodies can be prepared using various warm-blooded animals such as horses, cattle, goats, sheep, dogs, chickens, turkeys, rabbits, mice or rats.

단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. Monoclonal antibodies are also known as fusion methods (Kohler and Milstein, European J. Immnunol . 6: 511-519 1976), recombinant DNA methods (US Pat. No. 4816567), and phage antibody libraries (Clackson et al., Nature) . , 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol . 222, 58: 1-597, 1991).

한편, 본 발명은 항-KRS 항체를 포함하는 암 진단용 키트 또는 항-KRS 항체 및 항-67LR 항체를 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.Meanwhile, the present invention provides a kit for diagnosing cancer comprising an anti-KRS antibody or a kit for diagnosing cancer comprising an anti-KRS antibody and an anti-67LR antibody.

본 발명의 키트는 항-KRS 항체 또는 항-67LR 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다.Kits of the present invention may further comprise tools and / or reagents known in the art for use in immunological assays other than anti-KRS antibodies or anti-67LR antibodies.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법 이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.Immunological analysis in the above may include any method that can measure the binding of the antigen and the antibody. Such methods are known in the art and include, for example, immunocytochemistry and immunohistochemistry, radioimmunoassays, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblotting, and PAR assays. Farr assay), immunoprecipitation, latex aggregation, erythrocyte aggregation, non-turbidity, immunodiffusion, counter-current electrophoresis, single radical immunodiffusion, protein chips and immunofluorescence.

면역학적 분석에 사용되는 도구 및/또는 시약으로는 적합한 담체 또는 지지체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다. Tools and / or reagents used in immunological assays include suitable carriers or supports, labels capable of producing detectable signals, solubilizers, detergents. In addition, when the labeling substance is an enzyme, it may include a substrate capable of measuring enzyme activity and a reaction terminator.

본 발명의 진단용 키트에 포함되는 항체는 바람직하게는 적합한 담체 또는 지지체에 문헌에 개시된 바와 같은 다양한 방법을 이용하여 고정될 수 있으며(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988), 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로 는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다. Antibodies included in the diagnostic kits of the present invention may preferably be immobilized on a suitable carrier or support using various methods as disclosed in the literature ( Antibodies : A Labotory Manual, Harlow &Lane; Cold Spring Harbor, 1988), suitable Examples of the carrier or support include agarose, cellulose, nitrocellulose, dextran, sephadex, sepharose, liposomes, carboxymethyl cellulose, polyacrylamide, polyester, pam, filter paper, ion exchange resins, plastic films, plastic tubes, Glass, polyamine-methyl vinyl-ether-maleic acid copolymers, amino acid copolymers, ethylene-maleic acid copolymers, nylons, cups, flat packs and the like. Other solid substrates include cell culture plates, ELISA plates, tubes and polymeric membranes. The support may have any possible form, for example spherical (bead), cylindrical (test tube or inner surface of the well), planar (sheet, test strip).

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.Labels capable of producing a detectable signal enable qualitatively or quantitatively to measure the formation of antigen-antibody complexes, examples of which include enzymes, fluorescent substances, ligands, luminants, microparticles, redox molecules and radioactive substances. Isotopes, etc. may be used. Enzymes include β-glucuronidase, β-D-glucosidase, urease, peroxidase, alkaline phosphatase, acetylcholinesterase, glycosidase, hexokinase, malate dehydrogenase, and glucose-6 Phosphate dehydrogenase, invertase and the like can be used. As the fluorescent substance, fluorescein, isothiocyanate, rhodamine, phycoerythrin, phycocyanin, allophycocyanin, fluorine isothiocyanate and the like can be used. Ligands include biotin derivatives, and luminescent materials include acridinium esters, luciferin, and luciferase. The microparticles include colloidal gold and colored latex, and the redox molecules include ferrocene, ruthenium complex, biologen, quinone, Ti ion, Cs ion, diimide, 1,4-benzoquinone and hydroquinone. Radioisotopes include 3 H, 14 C, 32 P, 35 S, 36 Cl, 51 Cr, 57 Co, 58 Co, 59 Fe, 90 Y, 125 I, 131 I, 186 Re, and the like. However, any of those that can be used in immunological assays other than those exemplified above may be used.

또한, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 항원-항체 반응을 통해 라이실 tRNA 합성효소(KRS) 및 67kDa 라미닌 수용체(67LR)를 검출하는 방법을 제공한다. 이 때, 시료, KRS 단백질, 67LR 단백질 및 항원-항체 반응에 대해서는 상기에서 기재한 바와 같다.The present invention also provides a method for detecting lysyl tRNA synthetase (KRS) and 67 kDa laminin receptor (67LR) via an antigen-antibody response from a patient's sample to provide information necessary for cancer diagnosis. At this time, the sample, KRS protein, 67LR protein and antigen-antibody reaction are as described above.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). For reference, reference may be made to the above-mentioned nucleotide and protein operations (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook et al. ., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA (1990). )).

본 발명에 기재된 도면에 대해서 다음과 같이 설명한다.The drawings described in the present invention will be described as follows.

도 1 내지 도 6은 인간 KRS와 라미닌 수용체의 특이적 상호작용을 확인한 것이다. 도 1에서, 전체 길이의 인간 KRS와 37LRP/p40간의 상호작용은 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 수행되었다. 다중-ARS 복합체의 두 구성요소인 AIMP1 및 AIMP2는 각각 양성 및 음성 대조군으로 사용되었다. 양성 상호작용은 x-gal을 함유한 효모배지에서 청색 콜로니의 형성에 의해 표지되었다. 도 2에서, 37LRP는 35S 메티오닌의 존재하에서 in vitro 번역에 의해 합성되었고, 이들을 GST-KRS 또는 GST와 반응하였다(pull-down). GST-KRS와 공침전된(co-precipitated) 37LRP은 자가방사촬영법을 이용하여 측정하였다. 도 3에서, KRS 및 37LRP의 상호작용에 연관된 펩티드 부위는 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 측정되었다. N말단의 세포내 부위(54 내지 113번째 아미노산) 및 C말단의 세포외 부위(137 내지 210번째 아미노산)를 가지고 있는 296개 아미노산을 가진 37LRP는 막간 도메인(113 내지 137번째 아미노산)에 의해 구분되어 진다. 인간 KRS(597개의 아미노산)의 N말단 특이적 확장(약 70개의 아미노산)부위 다음에OB-fold 안티코돈-결합성 도메인(약 70 내지 214 아미노산)과 촉매 도메인(약 220 내지 574 아미노산)이 위치해 있다. 도 4에서, Myc-KRS에 감염된 A549 세포를 용해하여 항-Myc 및 항-라미닌 수용체 항체로 면역블롯을 실시하였다. Myc-KRS를 항-Myc 항체와 면역침전시키고, 67LR 및37LRP로 공침전시켜 면역블롯을 수행하였다. 37LRP 및 67LR의 특이적 블롯을 위해, 다중항체인 H-141 및 F-18(Santacruz)이 각각 사용되었다.(WCL : whole cell lysate) 도 5에서, Myc-KRS로 감염된 A549 세포의 용해물을 지시한 항체로 웨스턴블롯을 시행하였다. 세포는 세포질(C) 및 막 분획(M)으로 분리되어 항-Myc 항체로 면역침전되었고, 37LRP 및 67LR로 공침전된 것은 웨스턴블롯으로 조사하였다. 대조군으로서 IgG를 사용하였다. 도 6에서 라미닌 (10ug/ml, 1h) 처리했을 경우, 67LR 과 KRS 간의 결합이 늘었음을 확인하였다. 이를 보기 위해, 67LR 를 인식하는 antibody(abcam, cat # ab2508)로 면역침전(immunoprecipitation)을 하였고, 왼쪽의 IgG 라벨은 토끼 으로부터 얻은 전체 IgG(total IgG)로서 음성대조군으로 사용 되었다. 10% SDS PAGE를 수행한 다음, PVDF 막 에 옮긴 뒤, KRS와 67LR을 인식하는 항체로 각각 면역블럿을 하였다.1 to 6 confirm the specific interaction of human KRS and laminin receptors. In FIG. 1, the interaction between full length human KRS and 37LRP / p40 was carried out via East to Hybrid analysis. Two components of the multi-ARS complex, AIMP1 and AIMP2, were used as positive and negative controls, respectively. Positive interactions were labeled by the formation of blue colonies in x-gal containing yeast media. In FIG. 2, 37LRP was synthesized by in vitro translation in the presence of 35S methionine, which were pulled down with GST-KRS or GST. 37LRP co-precipitated with GST-KRS was measured using autoradiography. In FIG. 3, peptide sites involved in the interaction of KRS and 37LRP were measured via east to hybrid analysis. 37LRP with 296 amino acids having an intracellular portion of the N terminus (54-113 amino acids) and an extracellular region of the C terminus (137-210 amino acids) is distinguished by an intermembrane domain (113-137 amino acids) Lose. Following the N-terminal specific extension (about 70 amino acids) of human KRS (597 amino acids) is the OB-fold anticodon-binding domain (about 70 to 214 amino acids) and the catalytic domain (about 220 to 574 amino acids) . In FIG. 4, A549 cells infected with Myc-KRS were lysed and immunoblotted with anti-Myc and anti-laminin receptor antibodies. Immunoblot was performed by immunoprecipitation of Myc-KRS with anti-Myc antibody and coprecipitation with 67LR and 37LRP. For specific blots of 37LRP and 67LR, multiple antibodies H-141 and F-18 (Santacruz) were used respectively (WCL: whole cell lysate). In Figure 5, lysates of A549 cells infected with Myc-KRS were isolated. Western blot was performed with the indicated antibodies. Cells were separated into cytoplasm (C) and membrane fraction (M) and immunoprecipitated with anti-Myc antibody, and coprecipitation with 37LRP and 67LR was examined by Western blot. IgG was used as a control. When laminin (10ug / ml, 1h) in Figure 6, it was confirmed that the binding between 67LR and KRS increased. To see this, immunoprecipitation was performed with 67LR-recognized antibody (abcam, cat # ab2508), and the IgG label on the left was used as a negative control as total IgG obtained from rabbits. 10% SDS PAGE was performed, followed by transfer onto PVDF membrane, and immunoblot with antibodies recognizing KRS and 67LR, respectively.

도 7 내지 도 12는 라미닌-유도성 막 전위(translocation) 및 KRS의 인산화에 대해서 확인한 것이다. 도 7에서, A549 세포를 라미닌(10ug/ml)으로 처리하여 웨스턴블롯을 이용하여 67LR, 37LRP 및 KRS의 양(level)을 시간대별로 관찰하였다. Hsp90 및 케드헤린(Cad)을 각각 세포질 및 막의 마커로 사용하였다. 도 8에서, A549 세포를 1시간동안 라미닌으로 처리, 또는 무처리하여 항-67 LR(MLuC5, Santacruz, sc-59732)(적색) 및 KRS 항체(녹색)을 사용하여 면역형광염색을 실시하였다. 도 9에서, A549 세포를 PLC-감마, PKC 및 PI3K를 각각 억제하는 U73122(U), 스타우로스포린(staurosporin, ST) 및 LY294002(LY)로 3시간동안 처리하고 라미닌으로 1시간동안 처리한 후, 이들 인산화효소 억제제가 67LR 및 KRS의 세포질 및 막에 어떠한 영향을 끼치는지를 확인하였다. 도 10에서, A549세포를 Myc-KRS로 감염시켜 24시간동안 배양하였다. 이후, 표시된(indicated) 약물로 처리하고, 상기와 같이 라미닌으로 처리하였다. Myc-KRS으로 면역침전하고, 항-p-Thr, -Ser, 및 -Tyr 항체로 면역블롯을 실시하였다. 도 11에서, A549 세포 세포를 Myc-KRS로 감염시켜 24시간동안 배양하였다. 감염된 세포를 LY294002로 3시간동안 전처리하고, 라미닌으로 1시간동안 처리하였다. Myc-KRS는 면역침전되었고, 67LR의 공침전은 웨스턴블롯으로 조사하였다. 면역침전법의 대조군으로서 IgG를 사용하였다. 도 12에서, 상기한 바와 같이 A549세포를 라미닌 및 LY294002의 존재 또는 부재 하에 배양하였 다. EPRS(glutamyl-prolyl-tRNA synthetase)는 이에 특이적인 항체(AbCam)와면역침전되었고, KRS의 공침전은 웨스턴블롯으로 확인하였다(상). 면역-소진 상층액(immune-depleted supernatant: ID)으로 항-KRS 및 EPRS 항체와 웨스턴블롯을 수행하였다. 7 to 12 confirm laminin-induced membrane translocation and phosphorylation of KRS. In FIG. 7, A549 cells were treated with laminin (10ug / ml), and the levels of 67LR, 37LRP, and KRS were observed by time zone using a Western blot. Hsp90 and Kedherin (Cad) were used as markers of cytoplasm and membrane, respectively. In FIG. 8, A549 cells were treated with or without laminin for 1 hour and subjected to immunofluorescence staining using anti-67 LR (MLuC5, Santacruz, sc-59732) (red) and KRS antibody (green). In FIG. 9, A549 cells were treated with U73122 (U), staurosporin (ST) and LY294002 (LY), which inhibit PLC-gamma, PKC and PI3K, respectively, for 3 hours and after treatment for 1 hour with laminin. The effects of these kinase inhibitors on the cytoplasm and membranes of 67LR and KRS were identified. In FIG. 10, A549 cells were infected with Myc-KRS and cultured for 24 hours. It was then treated with the indicated drug and treated with laminin as above. Immunoprecipitation with Myc-KRS and immunoblot with anti-p-Thr, -Ser, and -Tyr antibodies. In FIG. 11, A549 cell cells were infected with Myc-KRS and cultured for 24 hours. Infected cells were pretreated with LY294002 for 3 hours and treated with laminin for 1 hour. Myc-KRS was immunoprecipitated and 67LR coprecipitation was examined by Western blot. IgG was used as a control for immunoprecipitation. In Figure 12, A549 cells were cultured in the presence or absence of laminin and LY294002 as described above. EPRS (glutamyl-prolyl-tRNA synthetase) was immunoprecipitated with an antibody specific thereto (AbCam), and coprecipitation of KRS was confirmed by Western blot (up). Western-blotting with anti-KRS and EPRS antibodies was performed with immuno-depleted supernatant (ID).

도 13 내지 도 17은 KRS는 막-결합성 67LR을 안정화시킨다는 점을 확인한 것이다. 도 13에서, A549 세포를 si-대조군(si-cont) 또는 si-KRS로 감염시키고, 라미닌의 존재 또는 부존재 하에서 배양시켰다. 이후, 세포들을 세포질과 막 분획으로 분리하여 각각의 분획에서의 67LR 및 KRS의 양을 웨스턴블롯으로 확인하였다. 케드헤린(적색) 및hsp90을 각각 세포막 및 세포질의 마커로 사용하였다. 도 14에서, A549 세포에 있어서 막-결합성 67LR의 양은 항-LR 항체(MluC5)를 이용하여 유세포 분석기로 관찰되었다. 공벡터 또는 KRS 플라스미드로 감염된 세포들을 24시간동안 배양하였다.(상) 67LR의 양에 있어서 KRS 억제의 효과를 보기 위하여, 세포를 si-KRS 또는 si-대조군로 감염시키고 48시간동안 배양하였다.(하) 도 15에서, EV(공벡터) 또는 KRS로 감염시킨 A549 세포를 G418로 1주일간 선별하고 항-LR 항체(MluC5)를 이용한 면역형광 염색을 이용하여 67LR의 세포내 분포를 확인하였다. 막에 분포한 LR은 흰색 화살표로 강조하였다. 도 16에서, A549 세포를 시클로헥시미드로 처리하여 새로운(de novo) 단백질 합성을 억제하고 세포막과 세포질 내의 67LR 양에 있어서 KRS 양의 효과를 웨스턴블롯으로 조사하였다. 도 17에서, 67LR의 세포적 안정성에 있어서 KRS의 중요성은 펄스-체이스 실험을 통하여 조사되었다. 293 세포를 si-KRS 또는 si-대조군로 감염시키고 방사성 메티오닌을 1시간동안 반응시켰다. 67LR을 67LR에 특이적으로 반응하는 항체(F-18, Santacruz)와 면역침전 시키고, SDS-PAGE에 의해 분리시킨 후, 자가방사촬영법을 실시하였다. 특이성 siRNA에 의한 KRS의 억제는 웨스턴블롯에 의해 수행되었으며, 로딩 대조군으로서 튜불린을 사용하였다. 13 to 17 confirm that KRS stabilizes membrane-bound 67LR. In FIG. 13, A549 cells were infected with si-cont or si-KRS and cultured in the presence or absence of laminin. Cells were then separated into cytoplasm and membrane fractions to confirm the amount of 67LR and KRS in each fraction by Western blot. Khedherin (red) and hsp90 were used as markers of cell membrane and cytoplasm, respectively. In FIG. 14, the amount of membrane-bound 67LR in A549 cells was observed by flow cytometry using anti-LR antibody (MluC5). Cells infected with the covector or KRS plasmid were incubated for 24 hours. (Top) To see the effect of KRS inhibition on the amount of 67LR, cells were infected with si-KRS or si-control and incubated for 48 hours. In FIG. 15, A549 cells infected with EV (empty vector) or KRS were selected for 1 week with G418 and the intracellular distribution of 67LR was confirmed using immunofluorescence staining with anti-LR antibody (MluC5). LR distributed in the membrane is highlighted by a white arrow. In FIG. 16, A549 cells were treated with cycloheximide to inhibit de novo protein synthesis and the effect of KRS amount on 67LR amount in cell membrane and cytoplasm was examined by Western blot. In FIG. 17, the importance of KRS in the cellular stability of 67LR was investigated through pulse-chase experiments. 293 cells were infected with si-KRS or si-control and reacted with radioactive methionine for 1 hour. 67LR was immunoprecipitated with an antibody (F-18, Santacruz) that specifically reacts with 67LR, separated by SDS-PAGE, and then subjected to autoradiography. Inhibition of KRS by specific siRNA was performed by Western blot and tubulin was used as loading control.

도 18 내지 도 22는 KRS는 67LR을 통하여 세포 이동(cell migration) 및 암 전이를 촉진한다는 점을 확인한 것이다. 도 18에서, A549 세포를 표시된(indicated) 플라스미드로 감염시키고 라미닌의 부존재 또는 존재 하에서 배양하였고, 이들의 세포 이동에 대한 효과는 트렌스웰 챔버에서 이동한 세포를 측정하여 확인하였다. 막을 통과한 세포의 수를 계수하여 각 패널에 표시하였다. 실험은 3회 반복하였다. 도 19에서, 상기와 같이 처리한 세포들을 MMP-2의 활성 및 양 측정을 위하여 각각 자이모그래피 및 웨스턴블롯을 실시하는데 사용하였다. 도 20에서, 유방암 세포주인 4T-1 세포를 표시된(indicated) siRNA로 감염시키고, Balb/C 마우스의 등에 피하주사하였다. 21일 경과후, 마우스의 폐를 적출하여 직경 1mm 이상의 종양 결절을 계수하였다. 도 21에서, 외인성 KRS(KRS-1, 및 KRS-2)를 발현하는 2종의 서로 다른 4T-1 세포를 상기와 같이 접종하고 30일 경과후 계수하였다. 공벡터를 감염시킨 세포를 대조군으로 사용하였다. 도 22에서, 폐암(상) 및 유방암(하) 조직에서의 KRS 및 67LR의 발현량을 이들 각각의 항체를 이용한 면역조직화학 염색법을 사용하여 비교하였다. 39개의 폐암 및 40개의 유방암 조직을 이용하여 항-KRS 및 항-67LR 항체로 면역조직화학 염색을 실시하였고, 이들의 발현량은 정상조직의 그것과 비교되었다(각 조직당 9개의 시료). 여기에 보이는 동일 환자의 대표적인 쌍들은 KRS와 67LR의 과발현을 보여준다. KRS와 67LR의 통계학적 상관관계는 표 1에서 보여주고 있다. 18 to 22 confirm that KRS promotes cell migration and cancer metastasis through 67LR. In FIG. 18, A549 cells were infected with the indicated plasmids and cultured in the absence or presence of laminin, and their effect on cell migration was confirmed by measuring the migrated cells in the Transwell chamber. The number of cells that passed through the membrane was counted and displayed on each panel. The experiment was repeated three times. In FIG. 19, the cells treated as above were used to perform zymography and western blot, respectively, to measure the activity and amount of MMP-2. In FIG. 20, 4T-1 cells, a breast cancer cell line, were infected with indicated siRNA and injected subcutaneously in the back of Balb / C mice. After 21 days, the lungs of the mice were removed and the tumor nodules having a diameter of 1 mm or more were counted. In FIG. 21, two different 4T-1 cells expressing exogenous KRS (KRS-1, and KRS-2) were seeded as above and counted after 30 days. Cells infected with the empty vector were used as controls. In FIG. 22, expression levels of KRS and 67LR in lung cancer (upper) and breast cancer (lower) tissues were compared using immunohistochemical staining with their respective antibodies. 39 lung and 40 breast cancer tissues were used for immunohistochemical staining with anti-KRS and anti-67LR antibodies, and their expression levels were compared to that of normal tissues (9 samples per tissue). Representative pairs of the same patients shown here show overexpression of KRS and 67LR. The statistical correlation between KRS and 67LR is shown in Table 1.

도 23에서는 67LR의 막에서의 양은 KRS 발현에 의존한다는 점을 보여 준다. 도 23에서, 표시된(indicated) 플라스미드로 감염된 293 세포를 세포질 및 세포막 분획으로 분리하고, 각각의 분획에서 67LR, 37LRP 및 KRS의 양을 상응하는 항체를 이용한 웨스턴블롯을 수행하여 확인하였다. 23 shows that the amount at the membrane of 67LR is dependent on KRS expression. In FIG. 23, 293 cells infected with the indicated plasmid were separated into cytoplasmic and cell membrane fractions, and the amount of 67LR, 37LRP and KRS in each fraction was confirmed by performing a Western blot with the corresponding antibody.

도 24 내지 도 27은 세포이동, 단백질 합성 및 세포주기에 있어서 세포내 및 세포외 KRS의 효과를 확인한 것이다. 도 24에서, 라미닌 부존재 하에서 배양된 A549 세포의 이동은 트렌스웰 챔버에서 이동한 세포를 측정하여 확인하였다. 도 25에서, KRS의 화학주성적(chemotactic) 활성을 보고자, 표시된 농도로 KRS를 함유한 무혈청 배지를 트랜스웰 챔버의 아래 챔버에 넣고, A549 세포를 위 챔버에 넣어 배양하였다. 배양 6시간 경과후, 이동한 세포를 계수하였다. 도 26에서, A549 세포에서 KRS의 양은 siRNA와 외인성 KRS의 도입에 의해 하락 조절 또는 상승 조절되었다(도 26 및 도 27의 하단 패널). 감염된 세포는 각각 48시간 및 24시간 배양되고 무-메티오닌 배지에서 1시간동안 배양하여 영양결핍상태를 만든후 방사성 표지가 된 메티오닌으로 2시간동안 표지하였다. 세척후, 세포를 4시간동안 배양하고 0.5% 트리톤 X-100 용해액으로 용해시키고 방사성 활성을 액상 섬광 계수기(liquid scintillation counting)로 측정하였다. 도 27에서, A549 세포를 표시된 바와 같이 감염시키고, 고정시켜 프로피디움 아이오다이드(Propidium iodide)로 염색하여 유세포 분석기에서 분석하였다. 24 to 27 confirm the effects of intracellular and extracellular KRS on cell migration, protein synthesis and cell cycle. In FIG. 24, migration of A549 cells cultured in the absence of laminin was confirmed by measuring the cells migrated in the Transwell chamber. In FIG. 25, to see the chemotactic activity of KRS, serum-free medium containing KRS at the indicated concentrations was placed in the lower chamber of the transwell chamber and A549 cells were cultured in the upper chamber. After 6 hours of culture, the migrated cells were counted. In FIG. 26, the amount of KRS in A549 cells was down or up regulated by the introduction of siRNA and exogenous KRS (bottom panels in FIGS. 26 and 27). Infected cells were cultured for 48 hours and 24 hours, and cultured for 1 hour in methionine-free medium to form a deficient state, and then labeled with radiolabeled methionine for 2 hours. After washing, cells were incubated for 4 hours, lysed with 0.5% Triton X-100 lysate and radioactivity was measured by liquid scintillation counting. In FIG. 27, A549 cells were infected as indicated, fixed, stained with Propidium iodide and analyzed on a flow cytometer.

도 28 내지 도 30은 암 전이에 있어서 KRS 억제의 효과를 확인한 것이다. 도 28에서, 표적 단백질의 발현에 있어서 si-KRS 및 si-DRS의 효과는 웨스턴블롯에 의해 조사되었다. 로딩 대조군으로서는 튜불린을 사용하였다. 도 29에서, siRNA가 감염된 세포(1 x 106)을 상기의 방법과 같이 주사하였고, 21일 경과 후 종양의 크기 및 부피를 측정함으로써 1차 종양 증식에 있어서 KRS 및 DRS 억제의 효과를 조사하였다. 각각의 그룹은 5마리의 마우스를 사용하였다. 도 30에서, 상기의 마우스에서 적출된 폐는 10% 포르말린 용액에 고정되었다. 전이성 종양 결절 및 수는 보여지는 바와 같다. 28 to 30 confirm the effect of KRS inhibition in cancer metastasis. In Figure 28, the effect of si-KRS and si-DRS on the expression of the target protein was examined by Western blot. Tubulin was used as a loading control. In FIG. 29, siRNA-infected cells (1 × 10 6 ) were injected as described above, and the effects of KRS and DRS inhibition on primary tumor proliferation were examined by measuring tumor size and volume after 21 days. . Each group used 5 mice. In FIG. 30, the lungs extracted from the mice were fixed in 10% formalin solution. Metastatic tumor nodules and numbers are as shown.

도 31 내지 도 33은 암 전이에 있어서 KRS 과발현의 효과를 확인한 것이다. 도 31에서, KRS-1 및 KRS-2세포주의 과발현은 웨스턴블롯에 의해 관찰되었다. 도 32에서, 1차 종양 증식에 있어서의 KRS 과발현의 효과는 서로 비교되었다. 도 33에서, 종양 전이에 있어서의 KRS 과발현의 효과는 접종후 30일째에 조사되었다. 각각의 그룹은 4마리의 마우스를 사용하였다.31 to 33 confirm the effect of KRS overexpression in cancer metastasis. In FIG. 31, overexpression of KRS-1 and KRS-2 cell lines was observed by Western blot. In FIG. 32, the effects of KRS overexpression on primary tumor proliferation were compared with each other. In FIG. 33, the effect of KRS overexpression on tumor metastasis was examined 30 days after inoculation. Each group used 4 mice.

본 발명자들은 KRS가 원형질막으로 전좌(translocation)되어 67LR과 상호작용함으로써 종양(또는 암) 세포의 이동을 촉진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 것을 규명하였다. 또한, 마우스를 이용한 in vivo 실험을 통해서 KRS의 과발현 또는 발현 억제가 암의 전이를 조절할 수 있음을 규명하였다. 따라서, 본 발명의 KRS를 이용하여 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절할 수 있으며, 나아가 원형질막의 라미닌 수용체(67LR)과 관계된 세포 내 대사를 조절할 수 있다. 본 발명에서 규명한 KRS와 라미닌 수용체의 관계는 이와 관계된 다양한 질환 또는 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다. We have found that KRS translocates to the plasma membrane and interacts with 67LR to promote the migration of tumor (or cancer) cells, thus affecting metastasis of cancer. In addition, in vivo experiments using mice revealed that overexpression of KRS or inhibition of expression can regulate cancer metastasis. Therefore, the KRS of the present invention can be used to regulate cancer metastasis or cancer cell migration, and further, to regulate intracellular metabolism associated with laminin receptor (67LR) of the plasma membrane. The relationship between KRS and laminin receptors identified in the present invention can be very useful for the treatment, prevention and / or diagnosis of various diseases or diseases related thereto.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실험 방법>Experimental Method

1. 세포배양 및 재료들1. Cell Culture and Materials

A549 및 HEK293 세포는 ATCC로부터 구입하였다. 마우스 유방암(mammary carcinoma) 4T-1 세포주는 김성진 박사(가천의대)로부터 얻었다. 10% 우태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS) 및 1% 항체를 포함하는, RPMI(A549 세포 및 4T-1 세포에 대한) 및 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium, 다른 새포에 대한) 배지를 세포 배양에 사용하였다. 37LRP를 암호화하는 pcDNA3.1 벡터는 타치바나 히로푸미 박사(큐슈 대학)로부터 얻었다. Myc이 부착된(Myc-tagged) 인간 KRS 및 DRS는 pcDNA3 벡터의 EcoRI/XhoI 제한효소 부위에 클로닝하였다. 설치류 KRS cDNA는 RT-PCR로 확보하였으며, pcDNA3.1 벡터의 HindIII/XhoI 제한효소 부위에 클로닝하였다. 설치류 및 인간 KRS 및 DRS에 타겟팅(targeting)하는 siRNA는 Invitrogen사로부터 구입하였다. siRNA의 서열은 요청하면 제공될 것이다. 유전자 포터(Gene porter, GTS) 및 리포펙타민 2000(invitrogen)은 형질감염 시약으로 사용되었다. LY294002, U73122 및 스타우로스포린(staurosporin)은 Calbiochem으로부터 구입하였고, 싸이클로헥시마이드(cycloheximide) 및 라미닌(laminin, Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma)은 Sigma로부터 구입하였다. A549 and HEK293 cells were purchased from ATCC. Mouse breast carcinoma 4T-1 cell line was obtained from Dr. Sung-Jin Kim (Gachon University College of Medicine). RPMI (for A549 cells and 4T-1 cells) and DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, for different cells) medium containing 10% Fetal bovine serum (FBS) and 1% antibody were added to the cell culture. Used. The pcDNA3.1 vector encoding 37 LRP was obtained from Dr. Tachibana Hirofumi (Kyushu University). Myc-tagged human KRS and DRS were cloned into the EcoRI / XhoI restriction enzyme site of the pcDNA3 vector. Rodent KRS cDNA was obtained by RT-PCR and cloned into the HindIII / XhoI restriction site of the pcDNA3.1 vector. SiRNA targeting to rodent and human KRS and DRS was purchased from Invitrogen. The sequence of siRNA will be provided upon request. Gene porter (GTS) and lipofectamine 2000 (invitrogen) were used as transfection reagents. LY294002, U73122 and staurosporin were purchased from Calbiochem, and cycloheximide and laminin (Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma) were purchased from Sigma.

2. 면역침강 및 웨스턴 블럿 2. Immunoprecipitation and Western Blot

세포를 150mM NaCl, 0.5% 트리톤 X-100, 0.1% SDS 및 단백질 분해효소 저해제를 포함하는 20mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4, 용해버퍼)로 용해하였다. 단백질 추출물을 정상 IgG 및 단백질 G 아가로스와 2시간동안 배양한 다음(incubation), 비특이적으로 IgG에 결합한 단백질을 제거하기 위해 원심분리하였다. 상등액을 정제도니 67LR 항체(F-18, Santacruz)와 혼합한 다음, 흔들어 주면서 4℃에서 2시간 동안 배양하고, 단백질 A 아가로스를 혼합하였다. 얼음으로 차갑게 냉각한 용해버퍼를 이용하여 3회 세척한 다음, 침전물을 SDS-샘플 버퍼에 녹이고, SDS-PAGE로 분리하였다. 서로 다른 세포 분획에서 KRS 및 LR의 결합을 확인하기 위하여, pcDNA3.1- Myc-KRS로 형질감염을 하고, proteoextract 키트(Calbiochem)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 플라스마 멤브레인과 싸이토플라즘 분획을 분리한 다음, 상기와 같이 공동-면역침강을 수행하였다. 단백질 수준을 분석하기 위해, 단백질을 세포에서 추출한 다음 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 따로 언급하지 않는 한 항-LR 항체(Abcam, ab2508)을 37LRP 및 67LR의 동시 면역 블롯팅에 사용하였다. hsp90 및 팬-캐드헤린(Pan-cadherin)에 대한 항체는 Santacruz로부터 구입하였다. Cells were lysed with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, lysis buffer) containing 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 0.1% SDS and protease inhibitors. Protein extracts were incubated with normal IgG and protein G agarose for 2 hours and then centrifuged to remove non-specifically IgG bound proteins. The supernatant was mixed with purified donor 67LR antibody (F-18, Santacruz), incubated for 2 hours at 4 ° C with shaking, and protein A agarose was mixed. After washing three times with an ice cold cooling buffer, the precipitate was dissolved in SDS-sample buffer and separated by SDS-PAGE. To confirm the binding of KRS and LR in different cell fractions, transfect with pcDNA3.1- Myc-KRS and separate plasma membrane and cytoplasmic fractions using the proteoextract kit (Calbiochem) according to the manufacturer's instructions. Then, co-immunoprecipitation was performed as above. To analyze protein levels, proteins were extracted from cells and then separated by 10% SDS-PAGE. Anti-LR antibodies (Abcam, ab2508) were used for simultaneous immunoblotting of 37LRP and 67LR unless otherwise noted. Antibodies to hsp90 and Pan-cadherin were purchased from Santacruz.

3. 유세포 분석(flow cytometry)3. Flow cytometry

세포 싸이클을 address하기 위하여, 배양된 세포를 표시된 벡터 또는 화합물로 형질감염 또는 처리하고, 70% 에탄올로 4℃에서 1시간동안 고정한 다음 얼음으로 냉각한 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 세포를propidium iodide(50μg/ml), 0.1% sodium citrate, 0.3% NP40 및 RNaseA(50μg/ml)로 40분간 염색한 다음, 플로우 싸이토메트리(FACS Calibur, Beckton-Dickinson)를 수행하였다. 각각의 샘플에 대해서, Cell Quest Pro 소프트웨어를 사용하여20000 세포를 분석하였다. 세포 표면의 67kD LR의 양을 분석하기 위하여, 1 x 106 세포를 IgG 또는 67LR의 세포외 도메인을 인식하는 항-LR 항체(MLuC5, 1ug)와 배양한 다음, FITC 2차 항체와 배양하였다. PBS로 세척한 다음 샘플을 FACS로 스캔하였다. To address cell cycles, cultured cells were transfected or treated with the indicated vectors or compounds, fixed at 70 ° C. for 1 hour at 4 ° C. and washed twice with ice-cold PBS. Cells were then stained with propidium iodide (50 μg / ml), 0.1% sodium citrate, 0.3% NP40 and RNaseA (50 μg / ml) for 40 minutes, followed by flow cytometry (FACS Calibur, Beckton-Dickinson). For each sample, 20000 cells were analyzed using Cell Quest Pro software. To analyze the amount of 67kD LR on the cell surface, 1 × 10 6 cells were incubated with an anti-LR antibody (MLuC5, 1ug) that recognizes an extracellular domain of IgG or 67LR and then incubated with a FITC secondary antibody. After washing with PBS the samples were scanned with FACS.

4. 면역형광염색 또는 면역조직화학염색4. Immunofluorescence or immunohistochemical staining

9mm 커버 슬립(cover slip)위의 A549 세포를 70% 메틸알콜로 고정한 다음 찬 PBS로 간단히 세척하였다. 1% CAS, 3% BSA 및 0.5% triton X-100을 포함하는 블로킹 버퍼로 30분간 처리한(incubation) 다음, 세포를 KRS에 대한 항체(Abcam), 및 MLuC-5에 대한 항체(Santacruz)로 1시간 동안 배양하였다. 알렉사488 및 568(invitrogen)을 첨가한 다음 실온에서 30분간 처리하였다. 찬 PBS로 30분간 세척한 다음, 표본을 레이저 스캐닝 마이크로스코피로 관찰하였다. 유방암 및 폐암에 대한 조직 배열 슬라이드(tissue array slide)를 Super-Biochip(한국)으로부터 구입하였고, 67LR 및 KRS의 발현 수준을 확인하기 위하여 문헌(Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005))에 언급된 상응하는 항체와 면역조직화학염색을 수행하였다. 67LR 및 KRS의 발현간의 상관관계를 계산하기 위하여 피어슨 χ2 테스트 및 스튜던트 t 테스트를 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. P 값이 <0.05이면 의미있는 것으로 간주하였다. 모든 통계적 분석은 SPSS v11.5 소프트웨어(SPSS, Chicago, Ill)를 사용하여 수행되었다.A549 cells on a 9 mm cover slip were fixed with 70% methyl alcohol and then washed briefly with cold PBS. After 30 minutes incubation with blocking buffer containing 1% CAS, 3% BSA and 0.5% triton X-100, the cells were then treated with antibodies against KRS (Abcam), and against MLuC-5 (Santacruz). Incubated for 1 hour. Alexa 488 and 568 (invitrogen) were added and then treated at room temperature for 30 minutes. After washing for 30 minutes with cold PBS, the specimens were observed by laser scanning microscopy. Tissue array slides for breast and lung cancer were purchased from Super-Biochip (Korea), and Park, SG et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to confirm expression levels of 67LR and KRS . Immunohistochemical staining with the corresponding antibodies mentioned in trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 , 6356-6361 (2005)). Statistical analysis was performed using the Pearson χ 2 test and Student's t test to calculate the correlation between the expression of 67LR and KRS. P values of <0.05 were considered significant. All statistical analyzes were performed using SPSS v11.5 software (SPSS, Chicago, Ill).

5. 펄스-체이스 실험(Pulse-chase experiment) 5. Pulse-chase experiment

293세포를 리포펙타민 2000을 이용하여 si-KRS 또는 si-대조군(invitrogen)으로 형질감염시켰다. 이를 메티오닌이 들어 있지 않은 배지에서 1시간동안 배양한 다음, [35S] 메티오닌(50μCi/ml)을 철가하고 1시간동안 배양하였다. 신선한 배지로 방사선 메티오닌을 씻어낸 다음, 67LR을 이에 특이적인 항체(Santacruz)로 면역 침강시키고, 12% SDS-PAGE로 분리한 다음, BAS(FLA-3000, Fujifilm)을 이용하여 노출시켰다(autoradiography). 67LR의 양은Multi-gauge 프로그램(V3.0, Fujifilm)을 이용하여 측정하였다.293 cells were transfected with si-KRS or si-control (invitrogen) using Lipofectamine 2000. This was incubated for one hour in a medium containing no methionine, and then [ 35 S] methionine (50 µCi / ml) was removed and incubated for one hour. After washing the radiation methionine with fresh medium, 67LR was immunoprecipitated with its specific antibody (Santacruz), isolated by 12% SDS-PAGE, and exposed using autoradiography (BLA-3000, Fujifilm). . The amount of 67LR was measured using a multi-gauge program (V3.0, Fujifilm).

6. 이스트 투 하이브리드(yeast two hybrid) 분석6. East two hybrid analysis

인간 KRS의 여러 단편을 암호화하는 cDNA를 상응하는 프라이머를 이용하여 PCR로 얻었다. KRS에 대한 PCR 산물을 EcoRI 및 XhoI으로 절단하고, pEG202 벡터(LexA-융합 단백질의 제조를 위함) 및 pJG4-5 벡터(B42-융합 단백질의 제조를 위함)의 상응하는 위치에 연결하였다. 37LRP 단편을 암호화하는 cDNA는 Barbara J. Ballermann 박사(알버타 대학)로부터 얻었고, 이를 pJG4-5 벡터의 EcoRI 및 XhoI 부위에 삽입하였다. 두 융합 단백질간의 상호작용은 X-gal-함유 효모 배지상에서 파란색 콜로니의 형성여부로 분석하였다.CDNAs encoding several fragments of human KRS were obtained by PCR using the corresponding primers. PCR products for KRS were digested with EcoRI and XhoI and linked to the corresponding positions of the pEG202 vector (for the production of LexA-fusion protein) and the pJG4-5 vector (for the production of B42-fusion protein). The cDNA encoding the 37LRP fragment was obtained from Dr. Barbara J. Ballermann (University of Alberta) and inserted into the EcoRI and XhoI sites of the pJG4-5 vector. The interaction between the two fusion proteins was analyzed by the formation of blue colonies on X-gal-containing yeast medium.

7. In vitro 결합 분석 7. In vitro binding assay

GST-KRS 또는 GST를 대장균 로제타(DE3) 스트레인에서 발현시키고, 상기 단백질 추출물을 1% Triton X-100 및 0.5% N-라우릴사코신이 함유된 PBS 버퍼에서 4℃에서 2시간동안 글루타치온-세파로스와 혼합하였다. 인간 37LRP는 TNT Quick coupled Transcription/Translation system(Promega)를 사용하고, pcDNA3-37LRP를 주형으로 사용하며, [35S]메티오닌의 존재하에서 in vitro translation에 의해 합성하였다. 합성된 37LRP는 상기 GST 단백질 혼합물에 첨가하고, 1% Triton X-100, 0.5% N-라우릴사코신, 1mM DTT, 2mM EDTA 및 300μM 페닐메틸설포닐 플루오라이드가 함유된 PBS 버퍼에서 교반을 하면서 4℃에서 4시간 동안 배양한 다음, 0.5% Triton X-100을 함유하는 같은 버퍼로 6회 세척하였다. 그런 다음 세파로스 비드에 결합된 단백질을 SDS 샘플 버퍼로 용출하고, SDS-PAGE로 분리하고, 방사선을 측정하였다(autoradiograph). GST-KRS or GST is expressed in E. coli Rosetta (DE3) strain and the protein extract is glutathione-sepharose for 2 hours at 4 ° C. in PBS buffer containing 1% Triton X-100 and 0.5% N-laurylsacocine. Mixed with. Human 37LRP was synthesized by in vitro translation in the presence of [ 35 S] methionine, using the TNT Quick coupled Transcription / Translation system (Promega), pcDNA3-37LRP as a template. The synthesized 37 LRP was added to the GST protein mixture and stirred in PBS buffer containing 1% Triton X-100, 0.5% N-laurylsacocine, 1 mM DTT, 2 mM EDTA and 300 μM phenylmethylsulfonyl fluoride. Incubated at 4 ° C. for 4 hours and then washed six times with the same buffer containing 0.5% Triton X-100. The protein bound to Sepharose beads was then eluted with SDS sample buffer, separated by SDS-PAGE, and radiolabeled (autoradiograph).

8. 세포 이동(cell migration) 분석 8. Cell migration analysis

세포 이동은 선행 문헌(Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005))에 기재한 바와 같이 폴리카보네이트 막(8.0μm 공극 싸이즈, Costar)를 가진 24-웰 트랜스웰 챔버로 측정하였다. A549 세포를 무혈청(serum-free) RPMI 배지에 현탁한 다음 각 웰당 1 x 105 세포의 농도로 상위 챔버에 넣었다. 표시된 농도의 정제된 인간 KRS, 라미닌(10μg/ml) 또는 젤라틴(10μg/ml)을 하위 웰에 넣고, 세포가 CO2 배양기에서 37℃에서 6시간동안 이동하도록 하였다. 세포는 70% 메틸알콜을 포함하는 PBS로 30분간 고정한 다음 PBS로 3회 세척하였다. 세포를 헤마토실린(Sigma)로 10분간 염색한 다음, 증류수로 세척하였다. 면봉으로 막의 윗 부분에서 이동하지 않은 세포를 제거하였다. 막을 챔버로부터 분 리해 낸 다음 Gel Mount(Biomeda, 미국)에 올려 놓았다(mount). 이동한 세포(막의 하위 면에 부착된 것들)를 현미경 하에서(x20) 4곳을 임의로 선별하여 계측하는 방식으로 측정하였다. Cell migration is described in the literature by Park, SG et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 , 6356-6361 (2005). Measurements were made with a 24-well transwell chamber with a carbonate membrane (8.0 μm pore size, Costar). A549 cells were suspended in serum-free RPMI medium and placed in the upper chamber at a concentration of 1 × 10 5 cells per well. Purified human KRS, laminin (10 μg / ml) or gelatin (10 μg / ml) at the indicated concentrations were placed in the lower wells and the cells were allowed to migrate for 6 hours at 37 ° C. in a CO 2 incubator. Cells were fixed in PBS containing 70% methyl alcohol for 30 minutes and washed three times with PBS. The cells were stained with hematoxylin (Sigma) for 10 minutes and then washed with distilled water. Swabs remove unmoved cells from the top of the membrane. The membrane was removed from the chamber and mounted on Gel Mount (Biomeda, USA). The migrated cells (those attached to the lower side of the membrane) were measured in a manner that randomly selected four measurements under the microscope (x20).

9. 자이모그래피(zymography)9. Zymography

표시된 siRNA 및 재조합 KRS(또는 DRS)를 암호화하는 플라스미드로 형질감염된 A549 세포를 각각 48시간 및 24시간도안 배양한 다음 10% FBS를 함유하는RPMI 배지에 접종하였다(1 x 105 세포/웰). 세포를 무혈청 RPMI 배지에서 2시간 동안 기아처리(starving)한 다음, 라미닌을 첨가하여 10μg/ml로 24시간동안 배양하였다. 20μl의 배양 배지를 5x FOD 버퍼(4% SDS, 20% 글리세롤 및 0.01% 브로모페놀 블루를 함유하는 0.125M Tris-HCl, pH 6.8)와 혼합한 다음, 1mg/ml의 젤라틴을 함유하는 10% SDS-PAGE를 수행하였다. 젤을 2.5% 트리톤 X-100으로 각각 20분씩 2회 세척하고, 증류수로 각각 20분씩 2회 세척한 다음 반응버퍼(10mM CaCl2, 150mM NaCl, 1μM ZnCl2, 1% Triton X-100, 0.002% sodium azide를 함유하는 50mM Tris-HCl, pH 7.5)와 37℃에서 24시간동안 배양하였다. 젤을 증류수로 세척하고, 쿠마시 블루 R250으로 염색한 다음 35% 메탄올로 탈염(destain)하였다. A549 cells transfected with plasmids encoding the indicated siRNA and recombinant KRS (or DRS) were incubated for 48 hours and 24 hours, respectively, and then inoculated in RPMI medium containing 10% FBS (1 × 10 5 cells / well). Cells were starved for 2 hours in serum-free RPMI medium and then incubated for 24 hours at 10 μg / ml with the addition of laminin. 20 μl of culture medium is mixed with 5x FOD buffer (0.125M Tris-HCl, pH 6.8 containing 4% SDS, 20% glycerol and 0.01% bromophenol blue), followed by 10% containing 1 mg / ml gelatin SDS-PAGE was performed. The gel was washed twice with 2.5% Triton X-100 for 20 minutes each, twice with 20 minutes each with distilled water and then in a reaction buffer (10 mM CaCl 2 , 150 mM NaCl, 1 μM ZnCl 2 , 1% Triton X-100, 0.002%). 50 mM Tris-HCl, pH 7.5) containing sodium azide was incubated at 37 ° C for 24 hours. The gel was washed with distilled water, stained with Coomassie Blue R250 and then desalted with 35% methanol.

<실험 결과 및 고찰>Experimental Results and Discussion

전체 길이의 KRS와 37LRP와의 특이적 상호작용은 이스트 투 하이브리드 분석 에 의하여 확인되었다. LexA-KRS는 KRS의 파트너로 알려진(Kim, J.Y. et al. p38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tRNA synthetase complex: Implications for its physiological significance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 7912-7916 (2002)) AIMP2 뿐만 아니라, B42-37LRP와 결합(paired)하여 청색 콜로니를 형성하였으며, AIMP1에 대해서는 그러하지 않았다(도 1). 인비트로 바인딩 어세이에 대해서는, [35S]메티오닌으로 표지된 37LRP를 GST-KRS 또는 GST와 혼합하고, 글루타티온-세파로즈로 침전시킨후, 자가방사선촬영을 하였다. 37LRP는 GST-KRS와 함께 침전하였으나, GST와는 아니었다(도 2). 이스트 투 하이드리드 분석에 의한 소실 지도(deletion mapping)로 인간 KRS의 N말단 연장부위와 LR의 C-말단 세포외 도메인이 그들의 결합에 관여함을 확인하였다(도 3). The specific interaction of full-length KRS with 37 LRP was confirmed by east to hybrid analysis. LexA-KRS is known as a partner of KRS (Kim, JY et al. P38 is essential for the assembly and stability of macromolecular tRNA synthetase complex: Implications for its physiological significance, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 , 7912-7916 (2002)) As well as AIMP2, paired with B42-37LRP to form a blue colony, but not for AIMP1 (FIG. 1). For in vitro binding assays, 37 LRP labeled with [ 35 S] methionine was mixed with GST-KRS or GST, precipitated with glutathione-sepharose, followed by autoradiography. 37LRP precipitated with GST-KRS, but not with GST (FIG. 2). Deletion mapping by east to hydride analysis confirmed that the N-terminal extension of human KRS and the C-terminal extracellular domain of LR were involved in their binding (FIG. 3).

세포질내 37LRP는 막-포매성 67LR로 전환되므로, 본 발병자들은 KRS가 37LRP 및 67LR에 서로 다르게 결합하는지를 확인하였다. Myc-KRS를 폐암세포주 A549 세포에 도입하여 항-Myc 항체와 면역침전시켰다. 세포 용해물의 웨스턴블롯 결과, 67LR은 37LRP 보다 적은 양으로 존재하였다(도 4 우측). 하지만, Myc-KRS는 37LRP 보다 67LR에 더 우선적으로 결합하였다(도 4 좌측). 본 발명자들은 이후, A549세포를 세포질과 원형질 막 분획으로 분리하여 Myc-KRS와 37LRP 및 67LR의 상호작용을 확인하였다. 37LRP은 세포질에서 67LR은 원형질 막에서 각각 우세하게 관찰된 반면(도 5 우측), KRS는 세포질에서 더 많은 양이 관찰되었지만, 두 분획 모두에서 존재하 였다. 두 분획 모두를 항-Myc 항체와 면역침전 시켰을 때, 비록 세포질 내 소량의 37LRP도 침전되었지만, 막에 존재하는 67LR가 주로 KRS와 함께 침전되었는데(도 5 좌측), 이는 막에 존재하는 67LR 및 KRS 간의 선호적 상호작용을 시사하였다. Since 37LRP in the cytoplasm is converted to membrane-embedded 67LR, the present patients confirmed that KRS binds differently to 37LRP and 67LR. Myc-KRS was introduced into lung cancer cell line A549 cells to immunoprecipitate with anti-Myc antibodies. Western blot of cell lysates showed 67LR in an amount less than 37LRP (Figure 4 right). However, Myc-KRS bound more preferentially to 67LR than 37LRP (Figure 4 left). The inventors then separated the A549 cells into cytoplasmic and plasma membrane fractions to confirm the interaction of Myc-KRS with 37LRP and 67LR. 37 LRP was observed predominantly in the cytoplasm and 67LR in the plasma membrane respectively (right side of FIG. 5), while KRS was found in both fractions, although higher amounts were observed in the cytoplasm. When both fractions were immunoprecipitated with anti-Myc antibodies, although a small amount of 37LRP in the cytoplasm was precipitated, 67LR present in the membrane was predominantly precipitated with KRS (Figure 5 left), which is 67LR and KRS present in the membrane. Suggested a preferred interaction between them.

본 발명자들은 이후, KRS의 세포내 분포가 A549 세포의 라미닌 처리에 의해 변화하는지를 세포 분획과 면역형광염색법을 통하여 조사하였다. 라미닌 처리 후, KRS와 67LR의 막내 존재량은 세포질 내의 KRS 및 37LRP 양이나 이들의 발현에는 거의 변화없이 점차적으로 증가하였다(도 7 및 결과 미도시). 면역형광염색에서도 또한 67LR 및 KRS가 라미닌 처리에 의해 막 쪽으로 이동함을 설명해 주었다(도 8, 각각 적색 및 녹색). 발명자들은 이후 KRS의 막 전좌(translocation)가 번역후 변형(post-transcriptional modification)에 관여하는지를 조사하였다. 포스포이노시티드 3-OH 카이네이즈(phosphoinositide 3-OH kinase, PI3K)(Shaw, L. M., Rabinovitz, I., Wang, H. H., Toker, A. & Mericurio. A.M. Activation of phosphoinositide 3-OH kinase by the alpha6beta4 integrin promotes carcinoma invasion. Cell 91, 949-960 (1997)), 단백질 인산화효소 C(Protein kinase C, PKC)(Li, Y. Q. et al. Protein kinase C mediates the signal for interferon-gamma mRNA expression in cytotoxic T cells after their adhesion to laminin. Immunology 93, 455-461 (1998)), 및 포스포리페이즈 C-감마(phospholipase C-gamma, PLC-gamma)(Vossmeyer, D., Hofmann, W., Loster, K., Reutter, W. & Danker, K. Phospholipase C-gamma binds alpha1beta1 integrin and modulates alpha1beta1 integrin-specific adhesion. J. Biol. Chem. 277, 4636-4643 (2002); Kanner, S. B., Grosmaire, L. S., Ledbetter, J. A. & Damle, N. K. Beta 2-integrin LFA-1 signaling through phospholipase C-gamma 1 activation. Proc .Natl. Acad. Sci. USA 90, 7099-7103 (1993))와 같은 몇몇 서로 다른 인산화효소들이 라미닌에 의해 활성화된다고 알려져 있다. 이러한 인산화효소들 중 어떠한 것들이 KRS의 라미닌 의존성 막 전좌에 관여하는 지를 알아보고자, 본 발명자들은 각각의 카이네이즈에 특이적인 억제제로 각각의 인산화효소를 차단하고, 이 처리가 어떻게 KRS의 라미닌 의존성 막 전좌에 영향을 주는지를 확인하였다. 막 분획에서 KRS와 67LR의 라미닌 의존적 증가는 PI3K 억제제인 LY294002의 존재하에서 억제되는데 반해서, U73122 또는 스타우로스포린으로 처리한 세포들은 대조군 세포와 마찬가지로 67LRS의 라미닌 의존적 증가를 보였다(도 9 상 및 결과 미도시). 이들 인산화효소들 중 어떤 것도 세포내 KRS의 양에 영향을 준 것은 없었다(도 9 하). 이들 결과는 PI3K가 KPS의 라미닌 유도성 인산화에 연관된 것임을 암시한다. 사실, 티로신이 아닌 트레오닌과 세린에서 인산화된 KRS는 라미닌 처리에 의해 증가된 반면, LY294002의 존재하에서는 억제되었으며, 스타우로스포린은 어떠한 영향도 주지 못했다(도 10). 본 발명자들은 또한, KRS의 라미닌 유도성 인산화가 67LR과의 상호작용에 필요한지를 조사하였다. LY294002 처리는 KRS와 67LR의 라미닌 유도성 결합을 억제하였다(도 11) 세포질 KRS가 다중-ARS 복합체에 고정되어 있으므로, 본 발명자들은 또한 KRS의 라미닌 의존적 인산화가 KRS와 복합체의 다른 효소 구성성분인 글루타밀-프롤릴-tRNA 합성효소(glutamyl-prolyl-tRNA synthetase, EPRS)와 공- 면역침전함으로써 다중-ARS 복합체와의 결합에 영향을 주는지를 조사하였다. LY 화합물의 부재 하에서, 라미닌 처리는 KRS와 EPRS의 결합을 감소시켰고, 동시에 면역-소진된 용해성 분획(immuno-depleted soluble fraction)의 KRS를 증가시켰다(도 12 상,하 패널의 좌측 레인). 이에 반해, EPRS에 결합한 KRS는 세포가 LY294002로 전처리 되었을 때 라미닌 처리에 영향을 받지 않았는데(도 12 상,하 패널의 우측 레인) 이는 KRS의 인산화가 KRS와 복합체의 라미닌-의존적 결합에 필요함을 시사한다. The inventors then investigated whether the intracellular distribution of KRS changes by laminin treatment of A549 cells through cell fractionation and immunofluorescence staining. After laminin treatment, the intra-membrane abundance of KRS and 67LR gradually increased with little change in the amount of KRS and 37LRP in the cytoplasm or their expression (FIG. 7 and results not shown). Immunofluorescence also demonstrated that 67LR and KRS migrated to the membrane by laminin treatment (FIG. 8, red and green, respectively). The inventors then investigated whether the membrane translocation of KRS is involved in post-transcriptional modification. Phosphoinositide 3-OH kinase (PI3K) (Shaw, LM, Rabinovitz, I., Wang, HH, Toker, A. & Mericurio. AM Activation of phosphoinositide 3-OH kinase by the alpha6beta4 integrin promotes carcinoma invasion. Cell 91, 949-960 (1997)), protein kinase C (protein kinase C, PKC) (Li, YQ et al. protein kinase C mediates the signal for interferon-gamma mRNA expression in cytotoxic T cells after their adhesion to laminin. Immunology 93, 455-461 (1998)), and phospholipid phase C- gamma (phospholipase C-gamma, PLC- gamma) (Vossmeyer, D., Hofmann, W., Loster, K., Reutter , W. & Danker, K. Phospholipase C-gamma binds alpha1beta1 integrin and modulates alpha1beta1 integrin-specific adhesion.J. Biol. Chem. 277 , 4636-4643 (2002); Kanner, SB, Grosmaire, LS, Ledbetter, JA & Damle, NK Beta 2-integrin LFA -1 signaling through phospholipase C-gamma 1 activation. Proc .Natl. Acad. Sci. several different kinases, such as the USA 90, 7099-7103 (1993)) It is known that activated by a laminin. To determine which of these kinases are involved in laminin-dependent membrane translocation of KRS, we block each kinase with inhibitors specific to each kinase and how this treatment affects the laminin-dependent membrane translocation of KRS. It was confirmed to affect. Laminin-dependent increases in KRS and 67LR in the membrane fraction were inhibited in the presence of the PI3K inhibitor LY294002, whereas cells treated with U73122 or staurosporin showed a laminin-dependent increase in 67LRS as in control cells (Figure 9 and resulting results). city). None of these kinase enzymes affected the amount of intracellular KRS (Figure 9). These results suggest that PI3K is involved in laminin-induced phosphorylation of KPS. Indeed, phosphorylated KRS in non-tyrosine and threonine and serine was increased by laminin treatment, while inhibited in the presence of LY294002 and staurosporin had no effect (FIG. 10). We also investigated whether laminin-induced phosphorylation of KRS is required for interaction with 67LR. LY294002 treatment inhibited laminin-induced binding of KRS and 67LR (FIG. 11) Since cytoplasmic KRS is immobilized in the multi-ARS complex, we also found that laminin-dependent phosphorylation of KRS is another enzyme component of the KRS complex. Co-immunoprecipitation with glutamyl-prolyl-tRNA synthetase (EPRS) affects binding to multi-ARS complexes. In the absence of the LY compound, laminin treatment reduced the binding of KRS and EPRS and at the same time increased the KRS of the immuno-depleted soluble fraction (left lanes in the upper and lower panels of FIG. 12). In contrast, KRS bound to EPRS was not affected by laminin treatment when cells were pretreated with LY294002 (Fig. 12, upper right and lower panels), suggesting that phosphorylation of KRS is required for laminin-dependent binding of KRS and the complex. do.

본 발명자들은 이후, KRS가 A549 세포에 있어서 67LR의 막 내 존재량에 영향을 주는지 확인하였다. 67LR의 양은 라미닌에 의해 증가되나, 라미닌 효과는 KRS가 이에 대한 특이적 siRNA에 의해 억제될 때에는 사라지는데(도 13 좌측) 이는 67LR의 라미닌 의존적 촉진에 있어서 KRS의 중요성을 시사한다. 본 발명자들은 또한, 유세포 분석기를 통하여 막에 존재하는 67LR을 조사하였다. 막에 존재하는 67LR의 양은 세포를 KRS로 형질감염시키거나, si-KRS로 형질감염시켰을 때, 각각 증가 및 감소하였다(도 14). 라미닌 수용체의 세포내 분포는 공벡터(EV) 또는 KRS에 형질감염된 A549 세포간에서 면역형광염색을 통하여 비교되었다. 라미닌 수용체는 대조군과 비교하여 KRS 과발현 세포의 막 부위에 강하게 염색되었다(도 15). 이후, KRS와 67LR 간의 양성적 상관관계(positive correlation)는 다양한 KRS 양에 따른 막 및 세포질 내의 67LR 존재량을 측정함으로써 확인되었다(도 23).The inventors then confirmed whether KRS affected the intracellular membrane abundance of 67LR in A549 cells. The amount of 67LR is increased by laminin, but the laminin effect disappears when KRS is inhibited by a specific siRNA against it (left side of FIG. 13), suggesting the importance of KRS in laminin dependent promotion of 67LR. We also examined 67LR present in the membrane via flow cytometry. The amount of 67LR present in the membrane increased and decreased, respectively, when cells were transfected with KRS or transfected with si-KRS (FIG. 14). Intracellular distribution of laminin receptors was compared via immunofluorescence staining between A549 cells transfected with empty vector (EV) or KRS. Laminin receptors were strongly stained at the membrane site of KRS overexpressing cells as compared to the control (FIG. 15). Subsequently, a positive correlation between KRS and 67LR was confirmed by measuring the amount of 67LR present in the membrane and cytoplasm according to various KRS amounts (FIG. 23).

본 발명자들은, KRS가 어떻게 67LR의 막 내 존재량을 증가시키는지를 조사하였다. KRS는 37LRP로부터 전사 또는 전환(conversion) 을 통하여 67LR을 촉진할 수 있다. 그러나, KRS의 감염은 LR 전사 조절의 잠정적 역할을 제외하고는 LR 전사를 증가시키지 않았다(결과 미도시). 게다가, KRS는 세포질 내에서 37LRP와 잘 결합하지 않으므로(도 4, 도 5), KRS가 37LRP를 67LR로 전환하는 과정을 촉진하는 것 같다. 본 발명자들은 또한, 37LRP의 변형이37LRP가 67LR로 전환되는데 있어서 선행요건으로 알려져 있으므로(Landowski, T. H., Dratz, E.,A. & Starkey, J. R. Studies of the structure of the metastasis-associated 67 kDa laminin binding protein: fatty acid acylation and evidence supporting dimerization of the 32 kDa gene product to form the mature protein. Biochemistry 34, 11276-11287 (1995); Buto, S. et al. Formation of the 67-kDa laminin receptor by acylation of the precursor. J. Cell. Biochem. 69, 244-251 (1998)), KRS가 37LRP의 지방족 아실화(fatty acylation)를 매개하는지를 조사하였다. 본 발명에 있어서, KRS는 37LRP의 지방족 아실화에 전혀 영향을 주지 않았다(결과 미도시). KRS는 막에 존재하는 67LR의 세포내 안정성을 증진시킬 수 있으므로, 본 발명자들은 KRS가 막에 존재하는 67LR의 식세포작용(endocytosis)를 방해할 수 있는지를 조사하였다. 상기 가능성을 확인하고자, 본 발명자들은 시클로헥시미드(cyclohexamide)를 이용하여 근원적으로(de novo) 단백질 합성을 저지하여 KRS가 세포막과 세포질에서의 67LR의 존재량에 영향을 끼치는지를 실험하였다. KRS의 발현이 이에 특이적인 siRNA에 의하여 억제될 때에는 67LR의 막 내 존재량이 감소하면서 동시에 세포질 분획에서의 양은 증가하였다(도 16 좌측). 이와는 반대로, KRS의 과발현은 상기와 같이 막 내 67LR의 존재량을 증가시켰다(도 16 우측). 이러한 결과를 토대로, KRS는 67LR에 세포질 내로 다시 들어가는 것을 억제함으로써 막 내 67LR의 존재량을 증가시키는 것 같다. 본 발명자들은 또한, 펄스-체이스(pulse-chase) 실험을 통하여 67LR의 대사전환(turn over)에 있어서 KRS의 효과를 조사하였다. 초기 단백질 합성은 방사성 메티오닌으로 표지되었고, 이후 시클로헥시미드로 억제되었다. 이후, 67LR의 소멸(disappearance)는 시간적 간격을 두고 자가방사촬영에 의해 관찰되었다. 67LR은 KRS가 siRNA에 의해 억제될 때 급격하게 감소되었으나, 이 수치는 si-대조군에 있어서는 시간 간격에 따라 유지된 것과 대조적이다(도 17). 따라서, 67LR의 분해과정에 대해 추가적인 연구가 필요하지만, KRS는 원형질 막에서 67LR과 결합함으로써 67LR의 반감기를 증가시켜 67LR의 식세포작용을 억제하는 것 같다. We investigated how KRS increases the amount of 67LR present in the membrane. KRS can promote 67LR through transcription or conversion from 37LRP. However, infection with KRS did not increase LR transcription except for the tentative role of LR transcription regulation (results not shown). In addition, KRS does not bind well with 37LRP in the cytoplasm (FIGS. 4, 5), and therefore, KRS seems to promote the process of converting 37LRP to 67LR. We also know that the modification of 37LRP is a prerequisite for converting 37LRP to 67LR (Landowski, TH, Dratz, E., A. & Starkey, JR Studies of the structure of the metastasis-associated 67 kDa laminin binding protein:.. fatty acid acylation and evidence supporting dimerization of the 32 kDa gene product to form the mature protein Biochemistry 34, 11276-11287 (1995); Buto, S. et al Formation of the 67-kDa laminin receptor by acylation of the precursor, J. Cell.Biochem . 69 , 244-251 (1998), and examined whether KRS mediates fatty acylation of 37 LRP. In the present invention, KRS had no effect on the aliphatic acylation of 37LRP (result not shown). Since KRS can enhance the intracellular stability of 67LR present in the membrane, we investigated whether KRS could interfere with the endocytosis of 67LR present in the membrane. In order to confirm this possibility, the present inventors used cyclohexamide to inhibit de novo protein synthesis to test whether KRS influences the amount of 67LR in the cell membrane and cytoplasm. When expression of KRS was inhibited by siRNA specific to it, the amount of 67LR in the membrane was decreased while the amount in the cytosolic fraction was increased (FIG. 16 left). In contrast, overexpression of KRS increased the amount of 67LR present in the membrane as described above (right of FIG. 16). Based on these results, KRS seems to increase the amount of 67LR present in the membrane by inhibiting 67LR back into the cytoplasm. We also investigated the effect of KRS on the metabolic turnover of 67LR through pulse-chase experiments. Initial protein synthesis was labeled with radioactive methionine and then inhibited with cycloheximide. Thereafter, disappearance of 67LR was observed by autoradiography at timed intervals. 67LR sharply decreased when KRS was inhibited by siRNA, but this value is in contrast to that maintained over time for the si-control (FIG. 17). Thus, although further studies are needed on the degradation of 67LR, KRS seems to inhibit 67LR's phagocytosis by increasing the half-life of 67LR by binding to 67LR in the plasma membrane.

본 연구자들은 이후, KRS의 발현정도가 라미닌-의존적 A549 세포 이동에 영향을 주는지를 트랜스웰 맴브레인 분석을 통하여 조사하였다. 대조군 세포의 이동은 라미닌 처리에 의해 평균 6배 가량 촉진되었다(도 24 및 도 18) 그러나, 라미닌 의존적 세포 이동은 KRS가 si-RNA에 의해 억제되었을 때 감소하였다(도 18, si-대조군 및 si-KRS). 이와는 반대로, KRS 과발현은 라미닌 처리에 의해 촉진된 세포이동을 증가시켰다(도 18, EV 및 KRS). 그러나, 세포 이동에 있어서 KRS의 효과는 라미닌 수용체가 si-RNA에 의해 억제되면 사라진다(도 18, si-LR, 아래 패널). KRS는 몇몇 암세포에서 사이토카인으로 분비되므로(Park, S. G. et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 6356-6361 (2005)), 본 발명자들은 세포외인성 KRS가 세포 이동에 영향을 주는지를 조사하였다. A549 세포를 서로 다른 농도의 정제된 KRS로 처리하였을 때, 이 분석에서 KRS의 세포외인성 효과를 제외하면, 세포 이동은 거의 영향을 받지 않았다(도 25). 반면, 세포 단백질의 합성 및 세포 주기는 실험하는 동안 KRS의 억제 및 과발현에 영향을 받지 않았는데, 이는 KRS-의존적 세포 이동이 상기 과정의 효과에 기인하지 않음을 시사한다(도 26 및 도 27). 라미닌 처리가 MMP-2(matrix metllo-proteinase-2)의 활성화를 초래하므로(Givant-Horwitz, V., Davidson, B. & Reich, R. Laminin-induced signaling in tumor cells the role of the M(r) 67,000 laminin receptor. Cancer Res. 64, 3572-3579 (2004)), MMP-2의 라미닌 의존적 활성화에 있어서 KRS의 역할을 in vitro 자이모그래피 분석을 통하여 조사하였다. MMP-2 활성은 라미닌에 의해 활성화 되었고, 이는 si-KRS의 존재 하에서 억제되었다(도 19 우측). MMP-2의 발현량은 KRS에 영향을 받지 않았다(도 19 하). We then investigated whether expression of KRS influences laminin-dependent A549 cell migration by transwell membrane analysis. Migration of control cells was promoted by an average of 6-fold by laminin treatment (FIGS. 24 and 18) However, laminin dependent cell migration was reduced when KRS was inhibited by si-RNA (FIG. 18, si-control and si -KRS). In contrast, KRS overexpression increased cell migration promoted by laminin treatment (FIG. 18, EV and KRS). However, the effect of KRS on cell migration disappears when laminin receptors are inhibited by si-RNA (FIG. 18, si-LR, bottom panel). KRS is secreted by cytokines in some cancer cells (Park, SG et al. Human lysyl-tRNA synthetase is secreted to trigger pro-inflammatory response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 , 6356-6361 (2005)). We investigated whether extracellular KRS influences cell migration. When A549 cells were treated with different concentrations of purified KRS, cell migration was hardly affected except for the extracellular effects of KRS in this assay (FIG. 25). In contrast, the synthesis and cell cycle of cellular proteins were not affected by inhibition and overexpression of KRS during the experiment, suggesting that KRS-dependent cell migration was not due to the effect of this process (FIGS. 26 and 27). Laminin treatment results in activation of matrix metllo-proteinase-2 (MMP-2) (Givant-Horwitz, V., Davidson, B. & Reich, R. Laminin-induced signaling in tumor cells the role of the M (r) 67,000 laminin receptor. Cancer Res. 64 , 3572-3579 (2004)), the role of KRS in laminin-dependent activation of MMP-2 was investigated by in vitro zymography analysis. MMP-2 activity was activated by laminin, which was inhibited in the presence of si-KRS (Figure 19 right). The expression level of MMP-2 was not affected by KRS (FIG. 19).

KRS가 암 전이와 관련된 67LR을 통해 세포 이동을 촉진할 수 있기 때문에, 폐로 전이가 잘되는 마우스 유방암 4T-1 세포를 사용하여 KRS의 발현 수준에 의해 암 전이가 영향을 받을 수 있는지를 조사하였다. 이를 위하여 KRS 또는 다중-ARS 복합체의 다른 구성요소인 DRS(aspartyl-tRNA synthetase)를 그들에 특이적인 siRNA로 발현을 억제하고, 어떻게 KRS 및 DRS의 발현 감소가 암 전이에 영향을 미 치는지 비교하였다. si-KRS 및 si-DRS의 억제 효과를 웨스턴 블럿으로 확인한 다음에(도 28), 이들 세포 각각 및 si-대조군으로 처리한 세포를 Balb/c 마우스의 등 피부에 피하 주사로 주입하였다. 주입된 3종 모두 유사한 질량 및 부피의 종양을 발생시켜(도 29), KRS의 수준이 1차 종양의 성장에는 영향을 미치지 않음을 알려주었다. 폐를 주입 후 21일째 분리하였으며, 전이성 종양 결절(직경 1mm보다 큰 것)의 수를 3 그룹간에 비교하였다. 전이성 결절의 수는 대조군 및 DRS가 억제된 세포에서 얻은 것에 비해 KRS의 억제에 의해 크게 감소하였다(도 20 및 도 30). 역으로, 상기 방법에 따라 KRS의 과발현이 암 전이를 증진하는지를 조사하였다. 우리는 KRS를 암호화하는 플라스미드의 형질감염 및 G418 스크리닝에 의해 KRS를 안정적으로 과발현하는 4T-1 세포 주를 처음으로 구축하였다. 구축된 세포 주에서 KRS 과발현은 웨스턴 블럿으로 확인하였고, 공 벡터로 형질감염된 세포들에 비해서 많은 양으로 KRS를 발현하는 2개의 서로 다른 세포(KRS-1 및 KRS-2)를 선별하였다(도 31). 이들 세포도 유사한 질량과 크기의 1차 종양을 생성하였다(도 32). 이들 세포를 주입한 후 30일 째 폐를 검사하였을 때, KRS-과발현 세포 둘 다 대조군 세포에 비해서 더 많은 결절을 생성하였다(도 21 및 도 33). 이러한 결과는 KRS가 생체 내에서 암 전이를 유도한다는 것을 암시한다. Since KRS can promote cell migration through 67LR associated with cancer metastasis, mouse breast cancer 4T-1 cells with good metastasis to the lung were used to investigate whether cancer metastasis could be affected by the expression level of KRS. To this end, DRS (aspartyl-tRNA synthetase), another component of KRS or multi-ARS complexes, was suppressed with siRNA specific to them, and how decreased expression of KRS and DRS affected cancer metastasis. The inhibitory effects of si-KRS and si-DRS were confirmed by Western blot (FIG. 28), and then each of these cells and cells treated with the si-control were injected subcutaneously into the back skin of Balb / c mice. All three implants developed tumors of similar mass and volume (FIG. 29), indicating that the level of KRS did not affect the growth of primary tumors. Lungs were isolated 21 days after injection and the number of metastatic tumor nodules (larger than 1 mm in diameter) was compared between the three groups. The number of metastatic nodules was significantly reduced by inhibition of KRS compared to those obtained in control and DRS inhibited cells (FIGS. 20 and 30). Conversely, it was investigated whether overexpression of KRS promotes cancer metastasis according to the above method. We first constructed a 4T-1 cell line stably overexpressing KRS by transfection and G418 screening of a plasmid encoding KRS. KRS overexpression in the constructed cell lines was confirmed by Western blot, and two different cells (KRS-1 and KRS-2) expressing KRS in large amounts were selected as compared to cells transfected with the empty vector (FIG. 31). ). These cells also produced primary tumors of similar mass and size (FIG. 32). When lungs were examined 30 days after injecting these cells, both KRS-overexpressing cells produced more nodules compared to control cells (FIGS. 21 and 33). These results suggest that KRS induces cancer metastasis in vivo.

라미닌 수용체의 암 특이적 과발현은 자주 관찰되므로(Fontanini, G. et al.67-Kilodalton laminin receptor expression correlates with worse prognostic indicators in non-small cell lung carcinomas. Clin. Cancer Res. 3, 227-231 (1997); Viacava, P. et al.The spectrum of 67-kD laminin receptor expression in breast carcinoma progression. J. Pathol. 182, 36-44 (1997)), 67LR의 과발현이 또한 KRS의 과발현과 연관되어 있는지를 폐암 및 유방암을 예로서 67LR 및 KRS의 면역 조직화학 염색에 의해서 분석하였다. 39개의 검사한 폐암 조직 중에서 67LR 과발현은 21 사례(54%)에서 관찰되었으며, 그 가운데, KRS 수준은 19 사례(약 90%)에서 증가되어 있었다(표 1 및 도 22 상위). 마찬가지로, 40 개의 검사한 유방암 환자 중 21 사례에서 67LR 과발현이 관찰되었다. 이들 중 21 사례 모두 KRS의 수준이 증가되었다(표 1 및 도 22 하위). 그들의 동시-발현이 전이에 있어서 실제로 연관되어 있는지는 확인해 보아야 함에도 불구하고, 두 경우 모두 두 단백질의 발현간에 밀접한 연관이 나타났다. Cancer-specific overexpression of laminin receptors is frequently observed (Fontanini, G. et al. 67-Kilodalton laminin receptor expression correlates with worse prognostic indicators in non-small cell lung carcinomas. Clin. Cancer Res. 3 , 227-231 (1997) Viacava, P. et al.The spectrum of 67-kD laminin receptor expression in breast carcinoma progression.J. Pathol. 182 , 36-44 (1997)), and whether overexpression of 67LR is also associated with overexpression of KRS. Lung and breast cancers were analyzed by immunohistochemical staining of 67LR and KRS as an example. Of the 39 tested lung cancer tissues, 67LR overexpression was observed in 21 cases (54%), of which KRS levels were increased in 19 cases (about 90%) (Table 1 and Figure 22, top). Similarly, 67LR overexpression was observed in 21 of 40 tested breast cancer patients. All 21 of these cases increased the level of KRS (Table 1 and Figure 22 sub). In spite of the fact that their co-expression is indeed involved in metastasis, it was found that in both cases there was a close association between the expression of the two proteins.

Figure 112008070869440-pat00001
Figure 112008070869440-pat00001

이 때, 상기 표 1에 대해서는 다음의 기재를 참조할 수 있다: 표 1은 종양조직에 있어서 67LR 과 KRS 발현의 상관관계를 나타낸 것이다. 표 1에서는 67LR의 발현량이 KRS의 발현량과 관계가 있는지를 알아보고자, 폐암 및 유방암 환자의 조직 마이크로 어레이들을 이용하여 각각의 항체에 대한 면역염색을 실시하였고, 상기 두 단백질들의 상대적 발현량을 측정하였다. 67LR의 표지를 위하여 MluC5항체가 사용되었다. 발현량은 시료의 염색농도를 통하여 측정되었고, 4개의 그룹으로 분류되었다(0, 1, 2, 및 3점). 최종평가에서, 시료들은 정상그룹(0점 또는 1점)과 과발현 그룹(2점 또는 3점)로 분류되었다. 67LR 과 KRS 발현의 상관관계를 평가하기 위한 통계학적 분석은 피어슨 χ2 테스트 및 Student t 테스트를 통하여 수행되었다. 이때, P값이 0.05미만이면(P < 0.05) 유효한 수치로 간주하였다. 모든 통계학적 분석은 SPSS v11.5 소프트웨어(SPSS, Chicago, Ill)를 통하여 수행하였다.At this time, the following description about Table 1 can be referred to: Table 1 shows the correlation between 67LR and KRS expression in tumor tissue. In Table 1, to determine whether the expression level of 67LR is related to the expression level of KRS, immunostaining was performed for each antibody using tissue microarrays of lung and breast cancer patients, and the relative expression levels of the two proteins were measured. . MluC5 antibody was used for the labeling of 67LR. Expression levels were measured by staining concentration of the sample and classified into four groups (0, 1, 2, and 3 points). In the final evaluation, samples were divided into normal groups (zero or one point) and overexpression groups (two or three points). Statistical analysis to evaluate the correlation between 67LR and KRS expression was performed using the Pearson χ 2 test and Student t test. At this time, when the P value was less than 0.05 (P <0.05), it was regarded as a valid value. All statistical analyzes were performed via SPSS v11.5 software (SPSS, Chicago, Ill).

리보솜 구성인자를 포함하는 많은 번역 인자들이 다면적이며(Wool, I. G. Extraribosomal functions of ribosomal proteins Trends Biochem. Sci. 21, 164-165 (1996)), 여러 가지 종양 생성과정에 관여되어 있다(Lee, S. W., Kang, Y. S. & Kim, S.Multi-functional proteins in tumorigenesis: Aminoacyl-tRNA synthetases and translational components. Curr. Proteomics 3, 233-247 (2006)). 여기서 우리는 두 개의 번역 인자인 KRS 및 p40/37LRP가 생체 내에서 세포 이동 및 암 전이에 함께 작용한다는 것을 보였다(도 18 내지 도 22). 현 시점에서는 이 두 단백질의 잠재적인 연관이 진화적 우연인지 아니면 이후 밝혀질 필요가 있는 단백질 합성에 있어서 생리학적 이유를 가지고 있는지는 알 수는 없다. 다중 ARS-복합체의 구성요소 가운데, KRS는 가장 안정적인 단백질이며, 다른 구성요소의 안정성을 위하여 필요한데(Han, J. M. et al. Hierarchical Network between the components of the multi-tRNA synthetase complex: Implications for complex formation. J. Biol. Chem. 281, 38663-38667 (2006)), 이는 다른 관계되는 단백질을 안정화시키는 KRS의 잠재 능력을 암시하는 것이다. 여기서, 우리는 KRS 능력이 67LR에서의 세포 안정성으로도 확대됨을 보였다(도 17). Many translation factors, including ribosome constituents, are multifaceted (Wool, IG Extraribosomal functions of ribosomal proteins Trends Biochem. Sci. 21 , 164-165 (1996)) and are involved in various tumor formation processes (Lee, SW, Kang, YS & Kim, S. Multi-functional proteins in tumorigenesis: Aminoacyl-tRNA synthetases and translational components.Curr . Proteomics 3 , 233-247 (2006)). Here we showed that two translation factors, KRS and p40 / 37LRP, work together on cell migration and cancer metastasis in vivo (FIGS. 18-22). At this point, it is not known whether the potential association between these two proteins is an evolutionary coincidence or whether there is a physiological reason for protein synthesis that needs to be revealed later. Among the components of the complex multi-ARS-, KRS is the most stable proteins need for stability of other components (Han, JM et al Hierarchical Network between the components of the multi-tRNA synthetase complex:.. Implications for complex formation J Biol. Chem. 281 , 38663-38667 (2006)), suggesting the potential of KRS to stabilize other related proteins. Here, we showed that KRS ability also expanded to cellular stability at 67LR (FIG. 17).

KRS의 67LR과의 연관은 다른 기능적 암시를 가지고 있을 수 있다. 생리적 조건하에서, 세포질 KRS의 일 부분이 인산화되고, 여러 가지 성장 자극이나 생존 신호에 의해 라미닌 신호를 매개하는 67LR과 결합하기 위하여 원형질 막으로 이동된다. 암 세포에서는 과발현 또는 PI3K와 같은 과-활성화된 상위 인산화효소로 인한 결과로 구조적인(constitutive) 막 전이로 인하여 KRS의 막 수준이 비정상적으로 증가된다. 아마도, 이러한 과량의 KRS가 원형질막을 67LR를 모으거나 배출하도록 할 수 있다. 또한, PI3K의 활성화를 감소시키는 것이 자주 종양 성장 및 전이와 연관된다는 점(Wymann, M. P. & Marone, R. Phosphoinositide 3-kinase in disease: timing, location, and scaffolding. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 141-149 (2005)) 및 라미닌이 PI3K를 통해 암 침윤를 증진한다는 점(Baba, Y. et al.Laminin-332 promotes the invasion of oesophageal squamous cell carcinoma via PI3K activation . Br. J. Cancer 98, 974-980 (2008))을 염두에 둘 가치가 있다. PI3K의 구조적인 활성화는 막으로 이동시키는 KRS의 인산화를 리드할 수 있다. 이러한 조건들의 일부 또는 전부가 원형질막에서의 67LR의 증가에 기여할 수 있고, 암 전이에 대한 라미닌 신호전달을 증폭시킬 수 있다. 암의 전이성 확장을 조절하는 많은 연구가 진행되어 왔다. 이러한 점에서, 암 전이에 있어서 67LR을 통한 KRS의 활성은 암 진단 및 치료를 위한 종전에는 개척되지 않은 새로운 창을 제공해 줄 수 있다.KRS's association with 67LR may have other functional implications. Under physiological conditions, a portion of the cytoplasmic KRS is phosphorylated and transported to the plasma membrane to bind 67LR, which mediates laminin signaling by various growth stimuli or survival signals. In cancer cells, membrane levels of KRS are abnormally increased due to constitutive membrane metastasis as a result of overexpression or over-activated upper kinase such as PI3K. Perhaps this excess KRS can cause the plasma membrane to collect or excrete 67LR. In addition, reducing the activation of PI3K is often associated with tumor growth and metastasis (Wymann, MP & Marone, R. Phosphoinositide 3-kinase in disease: timing, location, and scaffolding. Curr. Opin. Cell Biol. 17 , 141-149 (2005)) and laminin promote cancer invasion through PI3K (Baba, Y. et al. Laminin-332 promotes the invasion of oesophageal squamous cell carcinoma via PI3K activation.Br . J. Cancer 98 , 974- 980 (2008)). Structural activation of PI3K can lead to phosphorylation of KRS, which migrates to the membrane. Some or all of these conditions can contribute to an increase in 67LR in the plasma membrane and can amplify laminin signaling against cancer metastasis. Many studies have been conducted to regulate metastatic expansion of cancer. In this regard, the activity of KRS through 67LR in cancer metastasis may provide a new window that has not been previously exploited for cancer diagnosis and treatment.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명자들은 KRS가 원형질막으로 전좌(translocation)되어 67LR과 상호작용함으로써 종양(또는 암) 세포의 이동을 촉 진하여 암의 전이(metastasis)에 영향을 미친다는 것을 규명하였다. 또한, 마우스를 이용한 in vivo 실험을 통해서 KRS의 과발현 또는 발현 억제가 암의 전이를 조절할 수 있음을 규명하였다. 따라서, 본 발명의 KRS를 이용하여 암 전이 또는 암 세포 이동을 조절할 수 있으며, 나아가 원형질막의 라미닌 수용체(67LR)과 관계된 세포 내 대사를 조절할 수 있다. 본 발명에서 규명한 KRS와 라미닌 수용체의 관계는 이와 관계된 다양한 질환 또는 질병의 치료, 예방 및/또는 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.As described above, the inventors have found that KRS is translocation into the plasma membrane and interacts with 67LR, thereby promoting the migration of tumor (or cancer) cells and thus affecting metastasis of cancer. In addition, in vivo experiments using mice revealed that overexpression of KRS or inhibition of expression can regulate cancer metastasis. Therefore, the KRS of the present invention can be used to regulate cancer metastasis or cancer cell migration, and further, to regulate intracellular metabolism associated with laminin receptor (67LR) of the plasma membrane. The relationship between KRS and laminin receptors identified in the present invention can be very useful for the treatment, prevention and / or diagnosis of various diseases or diseases related thereto.

도 1은 인간 KRS와 37LRP/p40간의 상호작용을 이스트 투 하이브리드 분석을 통하여 확인한 것이다.Figure 1 confirms the interaction between human KRS and 37LRP / p40 through the East to Hybrid analysis.

도 2는 인간 KRS와 37LRP의 상호작용을 풀 다운 분석을 통해서 확인한 것이다.Figure 2 confirms the interaction of human KRS and 37LRP through pull down analysis.

도 3은 인간 KRS와 37LRP의 상호작용 부위를 확인한 것이다.Figure 3 confirms the interaction site of human KRS and 37LRP.

도 4는 KRS의 67LR 및 37LRP와의 결합을 확인하기 위하여 Myc-KRS에 감염된 A549 세포에 대해서 항-Myc 및 항-라미닌 수용체 항체를 이용하여 면역블롯 분석을 한 결과이다.4 shows the results of immunoblot analysis using anti-Myc and anti-laminin receptor antibodies on A549 cells infected with Myc-KRS to confirm the binding of KRS to 67LR and 37LRP.

도 5는 KRS의 67LR 및 37LRP와의 결합을 확인하기 위하여 Myc-KRS로 감염된 A549 세포의 용해물에 대한 웨스턴블롯 분석을 한 결과이다.FIG. 5 shows Western blot analysis of lysates of A549 cells infected with Myc-KRS to confirm binding of KRS to 67LR and 37LRP.

도 6은 라미닌 서리에 따른 KRS 및 67LR의 결합을 면역 침전으로 확인한 것이다.Figure 6 confirms the binding of KRS and 67LR according to laminin frost by immunoprecipitation.

도 7은 A549 세포에 라미닌 처리시 67LR, 37LRP 및 KRS의 양(level)을 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.7 shows Western blot levels of 67LR, 37LRP, and KRS when laminin-treated A549 cells.

도 8은 A549 세포를 라미닌으로 처리 또는 무처리시 67 LR 및 KRS의 발현을 면역형광염색으로 확인한 것이다.8 confirms the expression of 67 LR and KRS by immunofluorescence staining when A549 cells were treated with or without laminin.

도 9는 인산화효소 억제제가 67LR 및 KRS의 세포질 및 막에서의 발현에 미치는 영향을 확인한 것이다.Figure 9 confirms the effect of kinase inhibitors on the expression in the cytoplasm and membranes of 67LR and KRS.

도 10은 KRS를 발현하는 A549세포에서 라미닌 및 인산화효소 억제제 처리시 인산화 정도를 p-Thr, -Ser, 및 -Tyr 항체로 면역블롯을 실시하여 확인한 것이다.10 shows the degree of phosphorylation when treated with laminin and kinase inhibitor in A549 cells expressing KRS by immunoblotting with p-Thr, -Ser, and -Tyr antibodies.

도 11은 KRS를 발현하는 A549세포에서 인산화된 KRS의 67LR과의 결합여부를 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.11 is confirmed by Western blot binding of the phosphorylated KRS with 67LR in A549 cells expressing KRS.

도 12는 KRS와 EPRS의 결합에 라미닌이 미치는 영향을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.Figure 12 confirms the effect of laminin on the binding of KRS and EPRS by Western blot.

도 13은 si-대조군 또는 si-KRS의 형질감염시 67L 및 KRS의 양을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.Figure 13 shows the Western blot the amount of 67L and KRS upon transfection of si-control or si-KRS.

도 14는 A549 세포에 있어서 막-결합성 67LR의 양을 유세포 분석기로 확인한 것이다.Figure 14 shows the amount of membrane-bound 67LR in A549 cells by flow cytometry.

도 15는 EV(공벡터) 또는 KRS로 감염시킨 A549 세포에 대해서 67LR의 세포내 분포를 면역형광 염색으로 확인한 것이다.Fig. 15 shows the intracellular distribution of 67LR by immunofluorescence staining for A549 cells infected with EV (empty vector) or KRS.

도 16은 새로운 단백질 합성이 억제된 A549 세포에서 세포막과 세포질 내의 67LR 양에 있어서 KRS 양의 효과를 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.16 is a Western blot confirming the effect of the KRS amount on the 67LR amount in the cell membrane and cytoplasm in A549 cells inhibited new protein synthesis.

도 17은 67LR의 세포적 안정성에 KRS이 미치는 영향을 펄스-체이스 실험으로 확인한 것이다.17 shows the effect of KRS on the cellular stability of 67LR by pulse-chase experiment.

도 18은 KRS 및/또는 67LR의 발현 억제시 세포 이동에 미치는 영향을 확인한 것이다.18 confirms the effect on cell migration upon expression of KRS and / or 67LR.

도 19는 KRS 및/또는 67LR의 발현 억제시 MMP-2 활성 및 양을 자이모그래피 및 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.19 confirms MMP-2 activity and amount upon inhibition of expression of KRS and / or 67LR by zymography and western blot.

도 20은 4T-1 세포주가 이식된 마우스에서 KRS발현 억제시 종양 결절의 수를 나타낸 것이다.Figure 20 shows the number of tumor nodules upon KRS expression inhibition in mice transplanted with 4T-1 cell line.

도 21은 4T-1 세포주가 이식된 마우스에서 KRS발현 증진시 종양 결절의 수를 나타낸 것이다.Figure 21 shows the number of tumor nodules upon enhanced KRS expression in mice transplanted with 4T-1 cell line.

도 22는 폐암 및 유방암 조직에서의 KRS 및 67LR의 발현량을 면역조직화학 염색법으로 확인한 것이다.22 shows the expression levels of KRS and 67LR in lung and breast cancer tissues by immunohistochemical staining.

도 23은 67LR의 막에서의 양에 KRS 발현이 미치는 영향을 웨스턴 블럿으로 확인한 것이다.Figure 23 confirms the effect of KRS expression on the amount in the membrane of 67LR by Western blot.

도 24는 라미닌 부존재 하에서 배양된 A549 세포의 이동을 측정한 것이다.Figure 24 measures the migration of A549 cells cultured in the absence of laminin.

도 25는 세포이동에 대한 KRS의 화학주성적(chemotactic) 활성을 측정한 것이다.Figure 25 measures the chemotactic activity of KRS on cell migration.

도 26은 A549 세포에서 siRNA와 외인성 KRS의 도입에 따른 KRS의 양 및 세포내 전체 단백질 합성량을 확인한 것이다.Figure 26 confirms the amount of KRS and the total protein synthesis in the cell according to the introduction of siRNA and exogenous KRS in A549 cells.

도 27은 A549 세포에서 siRNA와 외인성 KRS의 도입에 따른 KRS의 양 및 세포 주기를 확인한 것이다.Figure 27 confirms the amount and cell cycle of KRS according to the introduction of siRNA and exogenous KRS in A549 cells.

도 28은 표적 단백질의 발현에 있어서 si-KRS 및 si-DRS의 효과를 웨스턴블롯으로 확인한 것이다.Figure 28 confirms the effect of si-KRS and si-DRS on the expression of the target protein by Western blot.

도 29는 종양세포 이식에 따른 1차 종양 증식에 있어서 KRS 및 DRS 억제의 효과를 확인한 것이다.29 confirms the effects of KRS and DRS inhibition on primary tumor proliferation following tumor cell transplantation.

도 30은 종양세포 이식에 따른 전이성 종양 결절 및 수를 확인한 것이다.Figure 30 confirms the metastatic tumor nodules and number following tumor cell transplantation.

도 31은 KRS-1 및 KRS-2세포주의 KRS의 과발현을 웨스턴블롯으로 확인한 것 이다.Figure 31 shows the overexpression of KRS KRS-1 and KRS-2 cell lines by Western blot.

도 32는 종양세포 이식에 따른 1차 종양 증식에 있어서 KRS 과발현의 효과를 확인한 것이다.32 confirms the effect of KRS overexpression on primary tumor proliferation following tumor cell transplantation.

도 33은 종양세포 이식에 따른 전이성 종양 결절 및 수를 확인한 것이다.Figure 33 shows the number and metastatic tumor nodules following tumor cell transplantation.

<110> Seoul national university industry foundation <120> Composition for diagnosing cancer comprising anti-lysyl tRNA synthethase antibody and anti-laminin receptor antibody as an active ingredient <130> NP08-0080 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 597 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg 65 70 75 80 Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro 85 90 95 His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr 100 105 110 Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe 130 135 140 Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu 165 170 175 Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys 180 185 190 Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro 195 200 205 Cys Leu His Met Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu Lys Asp Lys Glu 210 215 220 Thr Arg Tyr Arg Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu Asn Asp Phe Val 225 230 235 240 Arg Gln Lys Phe Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Ser 245 250 255 Phe Leu Asp Glu Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Met Asn 260 265 270 Ile Ile Pro Gly Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile Thr Tyr His Asn 275 280 285 Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His 290 295 300 Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg 305 310 315 320 Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn Pro Glu Phe Thr 325 330 335 Thr Cys Glu Phe Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His Asp Leu Met Glu 340 345 350 Ile Thr Glu Lys Met Val Ser Gly Met Val Lys His Ile Thr Gly Ser 355 360 365 Tyr Lys Val Thr Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly Gln Ala Tyr Asp 370 375 380 Val Asp Phe Thr Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met Val Glu Glu Leu 385 390 395 400 Glu Lys Ala Leu Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn Leu Phe Glu Thr 405 410 415 Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val Ala Lys Ala Val 420 425 430 Glu Cys Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu Asp Lys Leu Val 435 440 445 Gly Glu Phe Leu Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr Phe Ile Cys Asp 450 455 460 His Pro Gln Ile Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His Arg Ser Lys Glu 465 470 475 480 Gly Leu Thr Glu Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys Lys Glu Ile Cys 485 490 495 Asn Ala Tyr Thr Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln Arg Gln Leu Phe 500 505 510 Glu Glu Gln Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ala Met Phe 515 520 525 Ile Asp Glu Asn Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly Leu Pro Pro Thr 530 535 540 Ala Gly Trp Gly Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met Phe Leu Thr Asp 545 550 555 560 Ser Asn Asn Ile Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Met Lys Pro Glu 565 570 575 Asp Lys Lys Glu Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu Glu Ser Thr Thr 580 585 590 Val Gly Thr Ser Val 595 <210> 2 <211> 1794 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggcggccg tgcaggcggc cgaggtgaaa gtggatggca gcgagccgaa actgagcaag 60 aatgagctga agagacgcct gaaagctgag aagaaagtag cagagaagga ggccaaacag 120 aaagagctca gtgagaaaca gctaagccaa gccactgctg ctgccaccaa ccacaccact 180 gataatggtg tgggtcctga ggaagagagc gtggacccaa atcaatacta caaaatccgc 240 agtcaagcaa ttcatcagct gaaggtcaat ggggaagacc catacccaca caagttccat 300 gtagacatct cactcactga cttcatccaa aaatatagtc acctgcagcc tggggatcac 360 ctgactgaca tcaccttaaa ggtggcaggt aggatccatg ccaaaagagc ttctggggga 420 aagctcatct tctatgatct tcgaggagag ggggtgaagt tgcaagtcat ggccaattcc 480 agaaattata aatcagaaga agaatttatt catattaata acaaactgcg tcggggagac 540 ataattggag ttcaggggaa tcctggtaaa accaagaagg gtgagctgag catcattccg 600 tatgagatca cactgctgtc tccctgtttg catatgttac ctcatcttca ctttgggctc 660 aaagacaagg aaacaaggta tcgccagaga tacttggact tgatcctgaa tgactttgtg 720 aggcagaaat ttatcatccg ctctaagatc atcacatata taagaagttt cttagatgag 780 ctgggattcc tagagattga aactcccatg atgaacatca tcccaggggg agccgtggcc 840 aagcctttca tcacttatca caacgagctg gacatgaact tatatatgag aattgctcca 900 gaactctatc ataagatgct tgtggttggt ggcatcgacc gggtttatga aattggacgc 960 cagttccgga atgaggggat tgatttgacg cacaatcctg agttcaccac ctgtgagttc 1020 tacatggcct atgcagacta tcacgatctc atggaaatca cggagaagat ggtttcaggg 1080 atggtgaagc atattacagg cagttacaag gtcacctacc acccagatgg cccagagggc 1140 caagcctacg atgttgactt caccccaccc ttccggcgaa tcaacatggt agaagagctt 1200 gagaaagccc tggggatgaa gctgccagaa acgaacctct ttgaaactga agaaactcgc 1260 aaaattcttg atgatatctg tgtggcaaaa gctgttgaat gccctccacc tcggaccaca 1320 gccaggctcc ttgacaagct tgttggggag ttcctggaag tgacttgcat caatcctaca 1380 ttcatctgtg atcacccaca gataatgagc cctttggcta aatggcaccg ctctaaagag 1440 ggtctgactg agcgctttga gctgtttgtc atgaagaaag agatatgcaa tgcgtatact 1500 gagctgaatg atcccatgcg gcagcggcag ctttttgaag aacaggccaa ggccaaggct 1560 gcaggtgatg atgaggccat gttcatagat gaaaacttct gtactgccct ggaatatggg 1620 ctgcccccca cagctggctg gggcatgggc attgatcgag tcgccatgtt tctcacggac 1680 tccaacaaca tcaaggaagt acttctgttt cctgccatga aacccgaaga caagaaggag 1740 aatgtagcaa ccactgatac actggaaagc acaacagttg gcacttctgt ctag 1794 <110> Seoul national university industry foundation <120> Composition for diagnosing cancer comprising anti-lysyl tRNA          synthethase antibody and anti-laminin receptor antibody as an          active ingredient <130> NP08-0080 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 597 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro   1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys              20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu          35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val      50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val Asp Pro Asn Gln Tyr Tyr Lys Ile Arg  65 70 75 80 Ser Gln Ala Ile His Gln Leu Lys Val Asn Gly Glu Asp Pro Tyr Pro                  85 90 95 His Lys Phe His Val Asp Ile Ser Leu Thr Asp Phe Ile Gln Lys Tyr             100 105 110 Ser His Leu Gln Pro Gly Asp His Leu Thr Asp Ile Thr Leu Lys Val         115 120 125 Ala Gly Arg Ile His Ala Lys Arg Ala Ser Gly Gly Lys Leu Ile Phe     130 135 140 Tyr Asp Leu Arg Gly Glu Gly Val Lys Leu Gln Val Met Ala Asn Ser 145 150 155 160 Arg Asn Tyr Lys Ser Glu Glu Glu Phe Ile His Ile Asn Asn Lys Leu                 165 170 175 Arg Arg Gly Asp Ile Ile Gly Val Gln Gly Asn Pro Gly Lys Thr Lys             180 185 190 Lys Gly Glu Leu Ser Ile Ile Pro Tyr Glu Ile Thr Leu Leu Ser Pro         195 200 205 Cys Leu His Met Leu Pro His Leu His Phe Gly Leu Lys Asp Lys Glu     210 215 220 Thr Arg Tyr Arg Gln Arg Tyr Leu Asp Leu Ile Leu Asn Asp Phe Val 225 230 235 240 Arg Gln Lys Phe Ile Ile Arg Ser Lys Ile Ile Thr Tyr Ile Arg Ser                 245 250 255 Phe Leu Asp Glu Leu Gly Phe Leu Glu Ile Glu Thr Pro Met Met Asn             260 265 270 Ile Ile Pro Gly Gly Ala Val Ala Lys Pro Phe Ile Thr Tyr His Asn         275 280 285 Glu Leu Asp Met Asn Leu Tyr Met Arg Ile Ala Pro Glu Leu Tyr His     290 295 300 Lys Met Leu Val Val Gly Gly Ile Asp Arg Val Tyr Glu Ile Gly Arg 305 310 315 320 Gln Phe Arg Asn Glu Gly Ile Asp Leu Thr His Asn Pro Glu Phe Thr                 325 330 335 Thr Cys Glu Phe Tyr Met Ala Tyr Ala Asp Tyr His Asp Leu Met Glu             340 345 350 Ile Thr Glu Lys Met Val Ser Gly Met Val Lys His Ile Thr Gly Ser         355 360 365 Tyr Lys Val Thr Tyr His Pro Asp Gly Pro Glu Gly Gln Ala Tyr Asp     370 375 380 Val Asp Phe Thr Pro Pro Phe Arg Arg Ile Asn Met Val Glu Glu Leu 385 390 395 400 Glu Lys Ala Leu Gly Met Lys Leu Pro Glu Thr Asn Leu Phe Glu Thr                 405 410 415 Glu Glu Thr Arg Lys Ile Leu Asp Asp Ile Cys Val Ala Lys Ala Val             420 425 430 Glu Cys Pro Pro Pro Arg Thr Thr Ala Arg Leu Leu Asp Lys Leu Val         435 440 445 Gly Glu Phe Leu Glu Val Thr Cys Ile Asn Pro Thr Phe Ile Cys Asp     450 455 460 His Pro Gln Ile Met Ser Pro Leu Ala Lys Trp His Arg Ser Lys Glu 465 470 475 480 Gly Leu Thr Glu Arg Phe Glu Leu Phe Val Met Lys Lys Glu Ile Cys                 485 490 495 Asn Ala Tyr Thr Glu Leu Asn Asp Pro Met Arg Gln Arg Gln Leu Phe             500 505 510 Glu Glu Gln Ala Lys Ala Lys Ala Ala Gly Asp Asp Glu Ala Met Phe         515 520 525 Ile Asp Glu Asn Phe Cys Thr Ala Leu Glu Tyr Gly Leu Pro Pro Thr     530 535 540 Ala Gly Trp Gly Met Gly Ile Asp Arg Val Ala Met Phe Leu Thr Asp 545 550 555 560 Ser Asn Asn Ile Lys Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Met Lys Pro Glu                 565 570 575 Asp Lys Lys Glu Asn Val Ala Thr Thr Asp Thr Leu Glu Ser Thr Thr             580 585 590 Val Gly Thr Ser Val         595 <210> 2 <211> 1794 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggcggccg tgcaggcggc cgaggtgaaa gtggatggca gcgagccgaa actgagcaag 60 aatgagctga agagacgcct gaaagctgag aagaaagtag cagagaagga ggccaaacag 120 aaagagctca gtgagaaaca gctaagccaa gccactgctg ctgccaccaa ccacaccact 180 gataatggtg tgggtcctga ggaagagagc gtggacccaa atcaatacta caaaatccgc 240 agtcaagcaa ttcatcagct gaaggtcaat ggggaagacc catacccaca caagttccat 300 gtagacatct cactcactga cttcatccaa aaatatagtc acctgcagcc tggggatcac 360 ctgactgaca tcaccttaaa ggtggcaggt aggatccatg ccaaaagagc ttctggggga 420 aagctcatct tctatgatct tcgaggagag ggggtgaagt tgcaagtcat ggccaattcc 480 agaaattata aatcagaaga agaatttatt catattaata acaaactgcg tcggggagac 540 ataattggag ttcaggggaa tcctggtaaa accaagaagg gtgagctgag catcattccg 600 tatgagatca cactgctgtc tccctgtttg catatgttac ctcatcttca ctttgggctc 660 aaagacaagg aaacaaggta tcgccagaga tacttggact tgatcctgaa tgactttgtg 720 aggcagaaat ttatcatccg ctctaagatc atcacatata taagaagttt cttagatgag 780 ctgggattcc tagagattga aactcccatg atgaacatca tcccaggggg agccgtggcc 840 aagcctttca tcacttatca caacgagctg gacatgaact tatatatgag aattgctcca 900 gaactctatc ataagatgct tgtggttggt ggcatcgacc gggtttatga aattggacgc 960 cagttccgga atgaggggat tgatttgacg cacaatcctg agttcaccac ctgtgagttc 1020 tacatggcct atgcagacta tcacgatctc atggaaatca cggagaagat ggtttcaggg 1080 atggtgaagc atattacagg cagttacaag gtcacctacc acccagatgg cccagagggc 1140 caagcctacg atgttgactt caccccaccc ttccggcgaa tcaacatggt agaagagctt 1200 gagaaagccc tggggatgaa gctgccagaa acgaacctct ttgaaactga agaaactcgc 1260 aaaattcttg atgatatctg tgtggcaaaa gctgttgaat gccctccacc tcggaccaca 1320 gccaggctcc ttgacaagct tgttggggag ttcctggaag tgacttgcat caatcctaca 1380 ttcatctgtg atcacccaca gataatgagc cctttggcta aatggcaccg ctctaaagag 1440 ggtctgactg agcgctttga gctgtttgtc atgaagaaag agatatgcaa tgcgtatact 1500 gagctgaatg atcccatgcg gcagcggcag ctttttgaag aacaggccaa ggccaaggct 1560 gcaggtgatg atgaggccat gttcatagat gaaaacttct gtactgccct ggaatatggg 1620 ctgcccccca cagctggctg gggcatgggc attgatcgag tcgccatgtt tctcacggac 1680 tccaacaaca tcaaggaagt acttctgttt cctgccatga aacccgaaga caagaaggag 1740 aatgtagcaa ccactgatac actggaaagc acaacagttg gcacttctgt ctag 1794  

Claims (7)

항-라이실 tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase, KRS) 항체를 유효성분으로 포함하는 유방암 또는 폐암 전이 진단용 조성물.A composition for diagnosing metastasis of breast cancer or lung cancer comprising an anti-lysyl tRNA synthetase (KRS) antibody as an active ingredient. 항-라이실 tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase, KRS) 항체 및 항-67kDa 라미닌 수용체(67kDa laminin receptor, 67LR) 항체를 유효성분으로 포함하는 유방암 또는 폐암 전이 진단용 조성물.A composition for diagnosing breast cancer or lung cancer metastasis comprising an anti-lysyl-tRNA synthetase (KRS) antibody and an anti-67kDa laminin receptor (67LR) antibody as an active ingredient. 삭제delete 삭제delete 항-라이실 tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase, KRS) 항체를 포함하는 유방암 또는 폐암 전이 진단키트.Diagnosis kit for breast cancer or lung cancer metastasis comprising an anti-lysyl tRNA synthetase (KRS) antibody. 항-라이실 tRNA 합성효소(lysyl-tRNA synthetase, KRS) 항체 및 항-67kDa 라미닌 수용체(67kDa laminin receptor, 67LR) 항체를 포함하는 유방암 또는 폐암 전이 진단키트.A breast or lung cancer metastasis diagnostic kit comprising an anti-lysyl-tRNA synthetase (KRS) antibody and an anti-67kDa laminin receptor (67LR) antibody. 삭제delete
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