KR101005967B1

KR101005967B1 - 우수한 재조합 단백질을 생산하기 위한 인간 숙주 세포

Info

Publication number: KR101005967B1
Application number: KR1020080033972A
Authority: KR
Inventors: 이현주; 김종묵; 장민석
Original assignee: (주)셀트리온
Priority date: 2008-04-12
Filing date: 2008-04-12
Publication date: 2011-01-05
Also published as: CN102057038B; US20110065184A1; WO2009125999A2; EP2274418A2; CN102057038A; JP2011517566A; EP2274418A4; WO2009125999A3; US8361790B2; KR20090108508A; JP5503636B2; WO2009125999A8; EP2274418B1

Abstract

본 발명은 유전공학 기술을 이용한 인간 배아 신장 유래의 세포 및 인간 B-세포 유래의 세포의 융합 방법으로부터 유도된 인간 숙주 세포에 관한 것이다. 이러한 인간 숙주 세포는 안정화된 특수 형질들이 잘 보존되어 이종 재조합 단백질 의약품의 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

인간 숙주 세포, 나말와, 293, 재조합 단백질

Description

우수한 재조합 단백질을 생산하기 위한 인간 숙주 세포 {HUMAN HOST CELL FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS WITH HIGH QUALITY AND QUANTITY}

본 발명은 우수한 재조합 단백질을 생산하기 위한 인간 숙주 세포에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 유전공학 기술을 이용한 인간 배아 신장 유래 세포 및 인간 B-세포 유래 세포의 융합으로부터 유도된 인간 숙주 세포에 관한 것으로 이들 인간 숙주 세포는 안정화된 특수 형질들이 잘 보존되어 이종 재조합 단백질 의약품의 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

최근까지도 인간을 치료하기 위한 대부분의 재조합 단백질 의약품은 인간이 아닌 포유동물의 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소(CHO, chinese hamster ovary), 마우스 흑색종(NSO), 마우스 골수종(SP2/0) 세포 등으로부터 생산되고 있다. 한편으로는 인간 세포주를 치료용 재조합 단백질의 생산에 사용하려는 시도가 있어 왔는데, 인간 배아 신장(human embryonic kidney) 293 세포에 의한 활성 단백질 C의 생산 (Eli Lylly, 2001), 나말와(Namalwa) 세포에 의한 인터페론-베타의 생산 (Wellcome Research Laboratory, 1999), HKB11 세포에 의한 절단된 형태의(truncated) 재조합 Factor VIII 및 여러 항체 등의 생산 (Cho et al., 2003, Biotech. Prog 19:229-232), PER.C6 세포 (Fallaux et al., 1998, Human Gene Therapy, 9:1909-1917)에 의한 다수의 항체 및 바이러스성 DNA의 생산 (Jones et al., 2003, Biotechnol. Prog. 19:163-168 및 Xie et al., 2003, Biotech. Bioeng. 83:45-52)등이 그 예이다.

대한민국 특허 제627,753호에는 CHO 세포 내에서 발현시키기 어려운 단백질을 생산하기 위한 대체 방안으로서 인간 숙주 세포인 HKB11 세포가 개시되어 있다 (Cho et al., 2003, Biotech. Prog 19:229-232) (Cho and Chan, 2002, Biomedical Science 9:631-638 및 미국 특허 제6,136,599호). 또 다른 대한민국 특허 제616,028호에는 HKB11 세포에 의하여 절단된 형태의(truncated) 재조합 Factor VIII을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 상기 HKB 세포는 HH514-16으로부터 유도된 세포주로서 B-세포 불멸화 능력과 바이러스 생성 능력에 결함이 있는 엡스타인 바르 바이러스(Epstein Barr virus, 이하 ‘EBV’라 한다) 게놈을 포함하고 있다 (Rabson et al., 1983, PNAS USA 87:3660-3664). 이러한 HKB 세포는 고밀도의 세포 성장, 높은 효율의 형질도입, 간편한 MTX-증폭, 목적 단백질의 다량 분비 및 IgM 발현의 소멸 등과 같은 특성을 나타내고 있는데, 이는 재조합 치료용 단백질을 생산하는데 있어서 바람직한 특성이라 할 수 있다. 그러나 HKB 세포의 증식 배양 과정에서 EBV가 세포로부터 분리되는 경향이 있음을 관찰하게 되었다 (Chang et al., 2002, J Virol. 76:3168-3178). 이러한 경향성은 HKB 세포가 EBV가 없는 세포가 될 수 있으며 그 결과 이종 유전자의 효과적인 발현에 유용한 여러 장점들을 더 이상 보유하지 못한다는 것을 의미한다. 다시 말하면, HKB 세포의 경우 장기간 배양하게 되면 EBV가 소실되어 재조합 치료용 단백질 생산을 위한 바람직한 특성을 발휘하지 못한다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고자 연구를 거듭하던 중, 나말와 세포의 경우 EBV 게놈이 에피솜(episome) 형태로 존재하지 않고 세포 염색체에 삽입되어 있다(Matsuo et al., Science 14 December 1984:1322-1325, Henderson et al., 1983, PNAS USA 80:1987-1991 및 Rose et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40:2533-2544)는 점에 착안하고 나말와 세포를 이용하여 바이러스가 생성되는 안전성에 대한 문제는 해결하면서 EBV의 정보는 계속 유지할 수 있는 새로운 인간 숙주 세포의 클론을 확립하였으며, 상기 인간 숙주 세포의 우수성을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 인간 배아 신장 유래 세포 및 EBV 게놈이 염색체 내에 삽입된 인간 B-세포 유래 세포의 융합으로부터 유도된 인간 숙주 세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 재조합 단백질을 생산하기 위한 용도의 상기 인간 숙주 세포를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 배아 신장 유래 세포 및 EBV 게놈이 염색체 내에 삽입된 인간 B-세포 유래 세포의 융합으로부터 유도된 인간 숙주 세포를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 모노클로날(monoclonal) 항체를 포함한 재조합 단백질을 생산하기 위한 용도의 상기 인간 숙주 세포를 제공한다.　

본 발명에서는 인간 배아 신장 유래의 세포 및 EBV 게놈이 염색체 내에 삽입된 인간 B-세포 유래 세포의 융합으로부터 유도된 새로운 인간 숙주 세포를 확립하였다. 본 발명에 따른 인간 숙주 세포를 이용하여 짧은 시간에 연구용 단백질을 공급할 수 있을 뿐만 아니라, 양적 및 질적인 측면에서 매우 뛰어난 인간 치료에 적합한 이종 재조합 단백질 의약품을 생산할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 인간 숙주 세포는 인간 배아 신장 유래 세포 및 EBV 게놈이 염색체 내에 삽입된 인간 B-세포 유래 세포의 융합으로부터 유도된 것을 특징으로 한다.

상기 인간 배아 신장 유래 세포는 인간 배아 신장 세포, 인간 배아 신장 세포로부터 유도한 세포, 또 다른 인간 배아 신장 유래의 세포로부터 유도한 세포, 또는 상기 임의의 체세포 분열로부터 얻은 세포를 포함한다. 여기서, “로부터 유도한”에는 정상적인 체세포 분열, 형질도입, 세포 융합, 또는 세포를 변형시키거나 새로운 특성을 갖는 세포를 제조하는 데 사용되는 다른 유전공학적인 기술이나 세포 생물학적인 기술과 같은 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 상기 인간 배아 신장 유래 세포는 293 유래 세포, 바람직하게는 293 세포일 수 있다. 이러한 293 세포는 높은 형질도입 효율성과 높은 수준의 단백질 생산능을 나타내는 반면 무혈청 부유(suspension) 배양시 응집 현상(aggregation)을 일으킨다.

상기 인간 B-세포 유래 세포는 EBV 게놈이 염색체 내에 삽입된 세포로서 인간 B-세포, 인간 B-세포로부터 유도한 세포, 또 다른 인간 B-세포 유래의 세포로부터 유도한 세포, 또는 상기 임의의 체세포 분열로부터 얻은 세포를 포함한다. 여기서, "로부터 유도한"에는 정상적인 체세포 분열, 형질도입, 세포 융합, 또는 세포를 변형시키거나 새로운 특성을 갖는 세포를 제조하는 데 사용되는 다른 유전공학적인 기술이나 세포 생물학적인 기술과 같은 방법이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 EBV 게놈이 세포 염색체 내에 삽입된 인간 B-세포 유래 세포는 나말와 세포일 수 있다. 이러한 나말와 세포는 형질도입 효율이 낮은 반면 부유 배양 조건에서 응집 없이 잘 성장하는 특징이 있다.

EBV 게놈은 앞서 언급한 대로 일반적인 B-세포 내에서 에피솜 형태로 존재하지만 예외적으로 나말와 세포와 같은 B-세포에서는 세포 염색체에 삽입된 형태로서 존재한다. 본 발명에서는 이러한 예외적이고 독특한 현상을 활용하여 바이러스 정보는 계속 유지하면서 바이러스가 생성되지 않는 안전한 새로운 인간 숙주 세포주를 제조하였다. 상기 EBV 게놈 유전자 중에서 oriP 발현 벡터에 필요한 엡스타인-바르 핵 항원 1(Epstein-Barr nuclear antigen 1, 이하 EBNA1라 한다) 유전자와 세포자멸억제(anti-apoptotic) 현상을 유지하는 BHRF1 및 BALF1 유전자 (Cabras et al., 2005, J Clinical Virology 34:26-34) 등은 나말와 세포에서 발현되기 때문에 숙주 세포에서도 바이러스 정보로서 유용하게 이용할 수 있는 것이다. 그리고 용균 사이클(lytic cycle) 유전자로서 초기 단백질 발현을 유도하는 BZLF1 유전자 (Countryman et al., 1987, J Virol, 61:3672-3679)와 에피솜 상태의 게놈에서만 발현되는 LMP2 유전자(Sample et al., J Virol 63:933-937) 등은 나말와 세포에서 발현되지 않기 때문에 바이러스가 생성되지 않는 (M. Bernasconi et al., Virology Journal, 2006, 3:43-57) 안전한 숙주 세포로 제조할 수 있는 것이다.

본 발명의 인간 숙주 세포는 인간 배아 신장 유래 세포와 EBV 게놈이 염색체 내에 삽입된 인간 B-세포 유래 세포와의 융합으로부터 유도되었기 때문에 인간 배아 신장 유래 세포, 예컨대 293 세포와 인간 B-세포 유래 세포, 예컨대 나말와 세포 각각의 바람직한 특성을 함께 보유하는 새로운 세포주이다. 덧붙이자면, 본 발명에 따른 인간 숙주 세포의 확립을 위한 세포 융합 파트너로서 293 세포를 선택함으로써 본 발명의 인간 숙주 세포는 형질도입 효율이 높고 보다 향상된 단백질 생산능을 가질 수 있다. 또한 나말와 세포를 또 다른 세포 융합 파트너로 선택함으로써 본 발명의 인간 숙주 세포는 부유 배양이 쉬울 뿐 아니라, 바이러스 생성의 문제점이 없어 안전하고, EBNA1 단백질이 지속적으로 발현되어 oriP 발현 벡터에 EBNA1 유전자가 필요 없고, 또는 BHRF1 및 BALF1과 같은 바이러스성 bcl-2 유사(homolog) 유전자로 인하여 세포자멸억제 활성을 가질 수 있다.

또한 상기 인간 B-세포 유래 세포, 바람직하게 나말와 세포는 HAT-민감성 및 G418-내성을 갖는 세포일 수 있다. 인간 배아 신장 유래 세포와 인간 B-세포 유래 세포의 바람직한 특성을 모두 보유하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 인간 숙주 세포의 확립을 위해서는 세포 융합 후 두 세포의 바람직한 특성을 모두 보유하는 클론을 선별하는 과정을 거쳐야 한다. 대부분의 세포와 마찬가지로 인간 배아 신장 유래 세포, 즉 293 세포는 HAT에 내성을 가지고 G418에 민감한 성질을 가지므로, 본 발명에서는 상기와 같은 선별을 위해서 HAT-민감성 및 G418-내성을 갖는 인간 B-세포 유래 세포, 바람직하게는 나말와 세포를 그 융합 파트너로서 선택하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 인간 배아 신장 유래 세포 및 인간 B-세포 유래 세포의 융합으로부터 유도된 새로운 인간 숙주 세포를 개발하기 위하여 293 세포 및 나말와 세포를 이용하였다. 먼저, 293 세포와의 세포 융합 파트너로서 HAT에 민감하고 G418에 내성이 있는 나말와 세포주를 유도하기 위하여, 나말와 세포주를 소태아 혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 6-티오구아닌이 첨가된 배지에서 배양하였다. 수개월에 걸친 선별 기간 동안 6-티오구아닌의 농도를 증가시키면서 처리한 후, HAT 함유 배지에 대한 상기 나말와 세포의 민감성을 확인하였다. 이어서 HAT에 민감한 나말와 세포군에 pSV2neo 플라스미드를 형질도입한 후 G418에 내성을 가지는 세포군을 선별하여 최종적으로 293 세포와의 융합 파트너로 사용하였다. 다음으로 문헌(Kennett RH. Cell fusion. Methods Enzymol 58:345-359; 1979)에 기재된 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용한 방법에 따라 293 세포와 HAT-민감성 나말와 세포와의 융합 반응을 수행하였다. 세포 융합 반응은 상기 방법에 제한되지 않고 당해 기술 분야의 통상적인 방법에 따라 수행할 수 있다.

본 발명자들은 상기 293 세포와 나말와 세포와의 융합 과정으로부터 유도된 본 발명에 따른 인간 숙주 세포를 F2N( F usion of 2 93 and N amalwa cells)이라고 명명하였다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 F2N 세포가 HKB 세포와 비슷한 특성을 가지지만 HKB 세포와는 달리 EBV 게놈이 F2N 세포의 염색체 내에 삽입되어 있기 때문에 장기간 세포 배양하더라도 EBV 게놈이 소실되지 않고 존재할 것이라고 예상하였다. 이를 증명하기 위하여 몇 개의 F2N 클론을 선별하여 무혈청 부유 배양 조건에서 1 년 이상 배양하였다. 그 결과 무혈청 부유 배양 조건 하에서 1 년 이상 배양시킨 세포 집단에서 거의 100 % 모두 EBNA1의 발현이 관찰되었으며(도 5 및 도 6 참조), 이러한 결과로부터 F2N 세포는 오랫동안 배양하더라도 EBV 게놈이 소실되지 않고 유지된다는 사실을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 F2N 세포 중에서 형질도입의 효율이 높은 클론을 선별하기 위하여, IgG를 발현하는 pCT132 벡터(도 3 참조)를 F2N 세포에 형질도입시킨 후 효소결합 면역흡수 분석(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 수행하여 세포의 항체 생산 효율을 비교하였다(도 4 참조). 일반적으로 F2N 세포의 형질도입 효율이 293 세포의 형질도입 효율보다 높았다. 나아가 이들 중에서 특히 형질도입 효율이 높고 무혈청 부유 배양 조건에서 잘 성장하는 1 개의 클론을 선택하여 F2N78이라 명명하고 이를 2008년 4월 11일자로 대전시 유성구 과학로 111번지에 소재하는 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁하였다(기탁번호: KCTC11309BP).

본 발명의 일 실시예에서는 293 세포와 나말와 세포의 융합으로부터 유도된 F2N 세포가 목적하는 바람직한 특성을 갖는지 확인하기 위하여, F2N78 세포에서 추 출한 mRNA로 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행하여 F2N78 클론의 EBNA1, Ig-mu, Ig-kappa 및 N-아세틸글루코사민 전이효소(N-acetylglucosaminyl transferase III, 이하 GnTIII라 한다)의 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, F2N78 클론이 EBNA1 및 GnTIII를 발현하고, IgM을 발현하지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 6 참조). 또한 본 발명의 일 실시예에서는 단백질 수준에서 EBNA1, IgM 및 α(2,6)-시알산 전이효소 (alpha(2,6)sialyl transferase, 이하 α(2,6)ST라 한다]의 발현 여부를 확인하기 위하여, 형광면역염색법(immunofluorescence, IF)을 수행하였고 그로부터 F2N78 세포가 EBNA1 및 α(2,6)ST을 발현하는 반면 IgM을 발현하지 않음을 확인하였다(도 5 참조). 여기서 EBNA1의 발현은 이들 F2N 클론들에 EBV 게놈이 존재함을 의미하며, GnTIII 및 α(2,6)ST의 발현은 인간과 유사한 글리코실화 프로파일이 지속적으로 나타난다는 것을 의미한다. 또한 IgM의 미발현은 나말와 세포에서 관찰되던 면역글로불린의 발현이 융합 세포인 F2N 세포에서는 억제되었음을 의미하는데, 이러한 특성은 F2N 클론, 특히 F2N78 세포로부터 재조합 치료용 모노클로날 항체 생산하는데 필수 요소에 해당한다.

따라서, 본 발명의 인간 숙주 세포는 EBNA1 단백질을 지속적으로 발현하고, 인간과 유사한 글리코실화 프로파일에 관여하는 효소를 발현하고, IgM 단백질을 발현하지 않는 인간 숙주 세포를 제공한다.

이와 같이 본 발명에 따른 인간 숙주 세포는 EBNA1의 안정적인 발현을 제공한다. EBNA1은 대략 3 kb 크기의 유전자로 세포 내 oriP 발현 벡터의 자율 복 제(autonomous replication)에 있어 필수불가결한 요소이다. EBNA1이 시스(cis) 형태든 또는 트랜스(trans) 형태든 세포 내에 oriP 발현 벡터와 함께 존재하는 경우라면 oriP 발현 벡터는 인간 세포 내에서 정상적으로 복제될 수 있다. 그러나 EBNA1이 oriP 발현 벡터와 별개로 존재(즉 트랜스 형태)하지 않고 oriP 발현 벡터 내에 위치하는 경우(즉 시스 형태)에는 그 발현 벡터의 크기가 너무 커서 벡터 DNA 조작이 용이하지 않고 또한 EBNA1 유전자를 포함한 모든 유전자들의 효율적인 발현에 어려움이 수반될 수 있다. 그러나 본 발명에 따른 F2N78 세포의 경우는 세포 염색체에 삽입된 EBV 게놈으로부터 EBNA1 단백질이 지속적으로 발현되기 때문에 oriP 플라스미드 내에 EBNA1 유전자가 존재할 필요가 없으므로 oriP 발현 벡터의 효율적인 조작과 이러한 벡터에 포함된 유전자의 발현이 보다 용이하다.

또한 본 발명에 따른 인간 숙주 세포는 인간과 유사한 글리코실화 프로파일에 관여하는 효소를 지속적으로 발현한다. 따라서 본 발명에 따른 인간 숙주 세포로부터 생산되는 단백질은 인간과 유사한 글리코실화 프로파일을 가지므로 CHO 세포와 같은 비인간 세포에서 생산된 단백질보다 생체내 면역원성(immunogenicity)이 낮고 생체내 반감기가 길 수 있으며 그 결과 단백질 의약품의 효율성을 증가시킬 수도 있다.

또한 본 발명에 따른 인간 숙주 세포는 나말와 세포에서 발현되는 IgM 단백질을 발현시키지 않는다. 따라서 본 발명에 따른 인간 숙주 세포는 재조합 치료용 모노클로날 항체의 생산에 필수적인 조건을 가지고 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 F2N78 세포의 세포자멸억제 활성을 확인하기 위 하여, 여러 농도의 소듐 뷰티레이트를 처리하였다. 일반적으로 소듐 뷰티레이트는 세포 배양시 CMV- 또는 SV40- 프로모터에 의한 유전자 발현 수준을 증가시키는 반면 (Lee et al., 1993, Cell 72:73-84, Cockett et al., 1990, Bio/technology 8:662-667, Chang et al., 1999, Free Rad Res 30:85-91, 및 Gorman et al., 1983, Nucl Acid Res 11:7631-7648) 세포 주기(cell cycle)를 정체(arrest)시키거나 세포 분화(differentiation)를 유도하여 세포자멸을 유도하기도 한다 (Cuisset et al., 1998, Biochem Biophy Res Commun 246:760_764, Cuisset et al., 1998, Biochem Biophy Res Commun 246:760_764). 그러나 본 발명에 따른 F2N78 세포는 소듐 뷰티레이트 처리시에도 세포자멸 현상이 억제되었고, 경우에 따라서는 세포 성장률이 동일 세포의 대조군(0 mM 소듐 뷰티레이트)보다 더 좋았다. 대조군 세포로서 나말와 세포에서는 소듐 뷰티레이트 처리 이후 실험한 모든 조건에서 세포 생존율(viability)이 저하되고 세포 성장이 더 이상 이루어지지 않는 현상이 현저히 나타났고, 293 세포에서는 높은 농도의 소듐 뷰티레이트 처리시에 세포자멸 현상이 나타났다(도 9 참조).

또한 본 발명의 일 실시예에서는 F2N78 세포의 세포자멸억제적 세포 성장을 설명하기 위해, 나말와 세포로부터 유래된 EBV 게놈 유전자에 속하는 바이러스성 bcl-2 유사 인자인 BHRF1과 BALF1의 발현 여부를 RT-PCR을 수행하여 확인하였다. 그 결과 도 10에서 보여주는 바와 같이, 나말와 세포의 경우 소듐 뷰티레이트 처리군과 미처리군 모두에서 BHRF1이 발현된 반면 F2N78 세포의 경우는 어느 쪽에서도 BHRF1이 발현되지 않았다. 그러나 BALF1은 소듐 뷰티레이트 처리 유무와 상관없이 나말와 세포 및 F2N78 세포 모두에서 발현되었다. 대조군으로 293 세포에서는 BHRF1과 BALF1이 모두 발현되지 않았다. 기존에 발표된 여러 논문 (Bellows et al., 2002, J Virol. 76:2469-2479, Marshall et al., 1999, J Virol. 73:5181-5185)에 따르면, BHRF1 및 BALF1 유전자가 동시에 발현되었을 때 BALF1은 BHRF1의 세포자멸억제 활성을 저해한다고 보고되고 있다. 이는 나말와 세포에서 볼 수 있는 현상이다. 그러므로, F2N78 세포 내에서 BALF1만 발현된다는 것을 보여주는 상기 실시예는 F2N78 세포가 갖는 세포자멸억제 활성에 대한 근거가 될 수 있을 것이다. 이러한 결과는 F2N78 외의 다른 클론에서도 관찰되었다. 이는 기대하지 못하였던 결과로서 구체적인 이유나 기작에 대해서는 아직 밝혀진 바가 없다.

따라서 본 발명의 인간 숙주 세포는 소듐 뷰티레이트 첨가 배양시 세포자멸억제 활성을 보이는 인간 숙주 세포를 제공한다. 이는 나아가 본 발명의 인간 숙주 세포가 소듐 뷰티레이트가 첨가되지 않은 경우라도 장기간 회분 배양(batch culture) 조건에서 자연적으로 발생하는 세포자멸 현상에 대한 저항성을 가질 수 있음을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서는 소듐 뷰티레이트 처리 하에서 F2N78 세포의 항체 생산성을 확인하기 위하여, 두 가지의 항체 생산 세포주인 CHO 세포와 F2N78 세포를 비교하였다. 소듐 뷰티레이트를 처리한 CHO 세포주의 경우 세포 성장은 대조군(0 mM 소듐 뷰티레이트)과 비교하여 50 %까지 감소하였고 생산성은 2 배 정도 증가하였다(도 11 참조). 반면, 소듐 뷰티레이트를 처리한 F2N78 세포주의 경우 세포 성장률은 대조군(0 mM 소듐 뷰티레이트)과 비교하여 최대 2 배 정도 증가하였고, 생산성도 대조군 세포(0 mM 소듐 뷰티레이트)와 비교하여 4 배 내지 5 배의 높은 증가율을 보였다(도 12 참조). 이러한 현상은 소듐 뷰티레이트에 의한 F2N78 세포주의 세포자멸억제 현상이 세포의 항체 생산성 증가에도 영향을 준 것이라 볼 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 F2N78 세포 내 oriP 발현 벡터의 항체 생산성을 확인하기 위하여, F2N78 세포에 pCT132 발현 벡터와 pCT125 발현 벡터를 각각 형질도입시킨 후 항체 생산성을 비교하였다. 여기서 상기 pCT125 발현 벡터는 플라스미드 내에 EBNA1 코딩 서열을 포함하는 반면 pCT132 발현벡터는 플라스미드 내에 EBNA1 코딩 서열이 없다는 차이가 있다. 도 7에서 보여주는 바와 같이, pCT132 벡터가 형질도입된 세포는 pCT125 벡터가 형질도입된 세포와 동등하거나 또는 다소 우위의 항체 생산성을 보였다. 일반적으로 신약 개발 과정에 필요한 소량의 단백질을 단기간에 생산하기 위해서는 일시적 형질도입(transient transfection)에 의한 생산 방법을 사용하는 것이 유익하다. 따라서 이러한 측면에서 볼 때, 본 발명에 따른 인간 숙주 세포는 EBNA1이 지속적으로 발현된다는 점에서 pCT132와 같은 EBNA1 유전자가 없는 발현 벡터를 사용한 일시적 형질도입에 의한 신약 개발에 특히 적합한 세포주라 할 수 있다.

또한, 본 발명은 재조합 단백질을 생산하기 위한 상기 인간 숙주 세포를 제공한다. 상기 인간 숙주 세포는 여러 종류의 재조합 단백질을 발현하도록 유전공학적으로 개조될 수 있다. 상기 재조합 단백질은 인간 치료용 재조합 단백질, 바람직하게는 치료용 모노클로날 항체를 포함하며, 모노클로날 항체 이외의 치료용 재조 합 단백질도 포함한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 세포 및 플라스미드

인간 배아 신장(293) 세포(ATCC CRL-1573) 및 나말와 세포(ATCC CRL-1432)는 미국 미생물 보존 센터(American Type Culture Collection, ATCC)로부터 각각 분양받았다.

본 발명에 사용된 발현 벡터의 개열 지도는 도 3에 기재되어 있다.

2. 형질도입(transfection)

세포 내 형질도입을 위하여 전기충격법(electrophoration) 및 양이온성 폴리머(cationic polymer)를 이용한 방법이 사용되었다.

전기충격법: 3x10⁶ 개의 세포를 플라스미드 12 ㎍[pSV2neo 벡터 2 ㎍ 및 MAR(matrix attached region) 서열을 포함하는 벡터 10 ㎍]이 첨가된 RPMI 1640 배지 300 ㎕에 현탁(resuspension)한 후, GenePulse II electroporator(Bio-Rad)를 이용하여 전기충격(220V/960 microfarads)을 주었다. 그런 다음 성장 배지로 현탁시키고 72 시간 경과 후, 1 mg/ml 농도의 G418과 10 % 소태아 혈청(FBS)을 함유하는 선별 배지에서 배양하였다. 약 14 일 후 관찰하였더니, 형질도입된 세포들은 활발한 성장을 보이는 반면 대조군 세포들은 더 이상 성장을 하지 않았다. 선별된 세 포들은 1 mg/ml 농도의 G418을 포함하는 선별 배지에서 계속 배양하였다. 네오마이신(neomycin) 유전자에 특이적인 프라이머로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 네오마이신 유전자의 존재를 확인하였다.

양이온성 폴리머를 이용한 방법: 양이온성 폴리머로는 Lipofectamine^TM LTX(Invitrogen, 15338-100)와 FreeStyle^TM Max(Invitrogen, 16447-100)를 사용하였으며, 제조사의 사용설명서에 따라 형질도입을 수행하였다. Lipofectamine^TM LTX 시약의 경우, 형질도입 당일 세포의 포화도가 6-웰 플레이트에서 웰의 50~80 %가 되도록 전날에 세포를 접종(seeding)한 후, 형질도입 당일 2.5 ㎍의 DNA와 6.25 ㎕의 LTX을 사용하여 형질도입을 진행하였다. FreeStyle^TM Max 시약의 경우, 부유 배양 상태에서의 형질도입에 사용하였으며, 무혈청 배지인 FreeStyle 293 Expression media(Invitrogen, 12338, 이하 FreeStyle 293 배지라 한다) 또는 EX-CELL 293 Serum free media(Sigma, 14571C, 이하 EX-CELL 293 배지라 한다)에서 자라는 세포는 형질도입 당일 1 ml 당 1x10⁶개의 세포가 되도록 전날 접종하였다. 형질도입은 OptiPRO SFM II(Invitrogen, 12309) 배지에 DNA와 FreeStyle^TM Max 시약을 1:1 비율로 사용하여 진행하였다.

3. 형광면역염색법(Immunofluorescence, IF)

EBNA1의 발현을 감지하기 위하여 형광물질과 간접적으로 결합하여 염색되는 방법인 염색형광물질이 접합된(conjugated) 항 혈청단백질(ACIF) (Reedman and Klein, 1973 및 Fresen and zur Hausen, 1976)과의 반응을 수행하였다. 먼저 슬라이드 글라스 위에 도말된 세포를 -20℃에서 5 분간 메탄올로 고정시켰다. 첫 번째 반응 항체로는 항 EBNA의 역가가 높은 인간 혈청을 사용하였다. 그 뒤로 EBNA1 염색의 시그널을 증가시키기 위해 인간 보체(혈청 단백질, complement)로 처리하였고, 형광물질이 접합된 항 인간 보체 C3 항체(FITC-conjugated anti human complement C3 antibody, USBiological, C7850-14C)로 감지하였다. 이렇게 처리된 슬라이드를 글리세롤과 포스페이트 버퍼(PBS)가 1:1로 혼합된 용액으로 덮어 마무리하였다.

Ig-mu와 Ig-kappa의 발현을 확인하기 위하여 각각 형광물질이 접합된 항 인간 IgM 항체(FITC-conjugated affinity-purified goat anti-human IgM, mu chain specific, Sigma, F5384)와 형광물질이 접합된 항 인간 kappa chain(Fluorescein anti-human kappa chain, affinity purified made in goat, Vector, FI-3060)을 사용하여 상기와 유사한 방법으로 세포 염색을 수행하였다.

또한 α(2,6)ST의 단백질 발현을 확인하기 위하여 형광물질이 접합된 삼부쿠스 니그라(Sambuicus nigra) 렉틴(FITC conjugated Sambucus nigra (Elderberry bark)-SNA-1, EY laboratories, F-2602)으로 상기와 유사한 방법으로 세포를 염색하였다.

4. EBNA1, GnTIII, Ig-mu, BALF1, BHRF1에 대한 RT-PCR

RNeasy®Plus Mini kit(Qiagen, 74134)을 사용하여 세포로부터 mRNA를 추출 후, OneStep RT-PCR Kit(Qiagen, 210212)을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 각각의 프라이머 서열은 하기 표 1에 표시하였다. RT-PCR 실험은 GeneAmp PCR system 9700(Applied Biosystems)를 사용하여 진행되었으며, RT-PCR 단계 및 조건은 다음과 같다: (i) 역전사 단계(50℃에서 30 분, 1 사이클); (ii) 역전사 효소 불활성화 및 cDNA 변성 단계(95℃에서 15 분, 1 사이클); (iii) PCR 증폭 단계(94℃에서 30 초, 52℃에서 1 분, 72℃에서 30 초, 35 사이클); 및 (iv) 신장 단계(72℃에서 10 분, 1 사이클). RT-PCR의 생성물은 전기영동으로 아가로스 젤 상에서 확인하였다.

RT-PCR에 사용된 프라이머의 서열

프라이머	프라이머 서열(5' to 3')	방향	길이 (bp)	Genebank No.
GnTIII-1	GACGTGGTGGACGCCTTTGT	센스	533	NM002409
	CGACCACTGCACCAGGATGT	안티센스
GnTIII-2	CAAGGTGCTCTATGTCTTCCTGGAC	센스	678
	CGGTCGTAGTTCTTCAGCAGGTAC	안티센스
Ig-mu	ACAAGGTGACCAGCACACTGAC	센스	879	BC020240
	GTGACGGTGGTACTGTAGAAGAGGC	안티센스
EBNA1-1	GTCCAAGTTGCATTGGCTGC	센스	788	AY825078
	CTCATCTCCATCACCTCCTTCA	안티센스
EBNA1-2	AGAAGGTGCCCAGATGGTG	센스	759	P207MnA5
	CTCATCTCCATCACCTCCTTCA	안티센스
BHRF1	TACGCATTAGAGACCACTTTGAGCC	센스	1000	V01555
	GTCAAGGTTTCGTCTGTGTG	안티센스
BALF1	GAGGCCAGCCAAGTCTACAGATTC	센스	550
	GAACTGACGTCTCAGCGATCTTG	안티센스

5. 효소결합 면역흡수 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

분비되는 항체의 농도는 효소결합 면역흡수 분석법에 의해 측정되었다. 먼저 염소의 항-인간 면역글로불린 G(Fcγ)(Jackson ImmunoReserarch, 109-006-098)를 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Nunc, 449824) 위에 흡착시켰다. 이 플레이트를 1 % 소혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA)이 함유된 포스페이트 버퍼로 처리하여 블로킹한 후, 2 배씩 연속적으로 희석한 샘플을 플레이트의 각 웰에 넣었다. 실온에서 2 시간 인큐베이션한 다음, 과산화효소가 붙은 염소의 항-인간 람다 항체(peroxidase-labeled goat anti-human λ antibody)(Sigma, A5175)로 감지하였다. 실온에서 1시간 인큐베이션한 후에 테트라메틸 벤즈이딘(TMB)과 반응시키고, 이 반응을 1 N HCl로 중지시켰다. 스탠더드(standard)로는 골수종 플라스마에서 정제된 인간 IgG1 람다 (Human IgG1 lambda purified myeloma plasma)(Sigma, I5029)를 250 ng/ml의 농도부터 사용하였다. 플레이트 리더(Spectramax plus 384, Molecular Device)를 사용해 450/570nm에서 흡광도를 읽어 농도를 측정하였다.

실시예

실시예 1: 세포 융합에 의한 인간 세포주의 확립

먼저, 세포 융합 파트너로서 HAT(Sigma, H0262)에 민감하고 G418(Calbiochem, 345810)에 내성이 있는 나말와 세포주를 유도하기 위하여, 나말와 세포주를 10 % FBS(Hyclone, SH30070.03) 및 6-티오구아닌(6-thioguanine; Sigma, A4660)이 첨가된 RPMI1640 배지에서 배양하였다. 4 개월의 선별 기간 동안, 6-티오구아닌의 농도를 5 ㎍/ml 에서 30 ㎍/ml까지 증가시켜 처리한 후, 1x HAT 함유 배지에 대한 상기 세포의 민감성을 확인하였다. HAT에 민감한 나말와 세포군에 pSV2neo 플라스미드를 형질도입한 후, 1.5 mg/ml 농도의 G418에 내성을 가지는 세포군을 선별하여 세포융합 파트너로 사용하였다.

세포 융합은 주로 문헌(Kennett RH. Cell fusion. Methods Enzymol 58:345-359; 1979)에 기재된 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 이용한 방법에 따라 진행되었다. 대수 증식기에 있는 4x10⁶ 개의 293 세포와 6x10⁶ 개의 나말와 세포를 칼슘(Ca² ⁺)과 마그네슘(Mg²⁺)이 없는 포스페이트 버퍼로 2 번 세척한 후, 5 ㎍/ml 농도의 땅콩 응집소(peanut agglutinin Sigma, L0881)로 전처리된 6-웰 플레이트에 접종하였다. 세포를 접종한 6-웰 플레이트를 Beckman Allegra^TM X-12R 원심분리기에서 6 분 동안 400 g로 원심분리하였다. 웰에서 포스페이트 버퍼를 제거한 후, 웰에 있는 세포에 2 ml의 40 % 폴리에틸렌글리콜(Sigma, P7777)을 2분 동안 처리하였다. 대조군으로서 이들 중 한 웰의 세포는 폴리에틸렌글리콜을 처리하지 않았다. 다음 단계로, 세포들을 5 % DMSO(dimethyl sulphoxide; Sigma, D2650)가 첨가된 5 ml의 포스페이트 버퍼로 3 회 세척한 후, 포스페이트 버퍼를 이용하여 다시 3 번 세척하였다. 15 % FBS가 첨가되어 있고 DMEM/F12 배지와 RPMI1640 배지를 동량으로 섞은 배지로 세포를 처리한 후 CO₂ 인큐베이터에 30분 동안 정치하였다. 그 후, 배지를 제거한 다음, 0.4 mg/ml 농도의 G418, 0.5x의 HAT 및 15 % FBS가 첨가되어 있고 DMEM/F12와 RPMI1640이 동량으로 혼합되어 있는 선별 배지로 세포를 처리한 후, 96-웰 플레이트의 각 웰 당 1x10⁴ 개의 세포를 접종하였다. 일주일 후, 세포 접종 시 사용했던 배지와 동일한 조성의 신선한 선별 배지로 갈아주었다. 접종 2 주일 후에는 G418과 HAT의 농도가 각각 0.8 mg/ml과 1x로 증가된 선별 배지를 세포에 공급하였다. 접종한 지 3 주 경과 후 관찰해 보았을 때 대조군 세포는 성장하지 않는 반면 융합 세포들은 성장하였다. 이들 중 성장이 빠르고 건강하게 자라는 9 개의 웰에 있는 세포들을 혼합하여, 이들 세포들로 96-웰 플레이트에서 제한 희석 클로닝(limiting dilution cloning, LDC)을 진행하여 단일 세포 클론(single cell clone, SSC)을 확보하였다. 제한 희석 클로닝 단계에서, 대수적으로 자라는 세포들을 96-웰 플레이트의 각 웰에 100 ㎕의 선별 배지와 함께 1 개의 세포를 접종하였으며, 0.8 mg/ml 농도의 G418과 1x HAT 그리고 15 % FBS가 첨가된 신선 배지를 선별 배지로 사용하였다. 매주 한 번씩 신선한 선별 배지를 세포에 공급하였으며, 하나의 세포가 접종되어 자라는지를 확인하기 위하여 현미경 하에서 각 웰을 관찰하였다. 이러한 과정을 통해서, 97 개의 단일 세포 클론들을 확보하였으며, 이를 F2N으로 명명하였다. F2N은 293 세포와 Namalwa 세포의 융합 세포를 의미한다. 이 단계에서, 각각의 F2N 클론의 성장 패턴은 바닥에 약간 흡착하면서도 부유 배양되는 성질을 가졌으며, 강하게 응집된 패치를 형성하는 것으로 볼 때 293 세포와 다소 유사하였다. 모든 클론들은 질소 탱크에 냉동 보관되었으며, 이들 모든 클론들에서 EBNA1 발현, IgM 발현 그리고 형질도입 효율을 조사하였다. 조사 결과, 모든 클론들이 EBNA1을 발현하는 것을 확인하였다. EBNA1이 발현된다는 것은 이들 클론들에 EBV가 존재함을 의미한다. 또한 모든 클론들은 IgM을 발현하지 않는 것을 확인하였으며, 이것은 나말와 세포의 면역글로불린 발현이 융합 세포에서는 억제되었음을 의미한다. 보다 체계적인 특징 분석을 위해, 우호적인(favorable) 성장 패턴을 보이며, 높은 형질도입 효율을 가지는 17 개의 클론을 선정하였다. IgG을 발현하는 pCT132 벡터를 사용하여 시험하였을 때, 선정된 17 개의 F2N 클론들의 형질도입 효율은 293 세포의 형질도입 효율보다 높았다. 17 개의 F2N 클론을 선정하는 과정에서 세포들이 응집되어 자라는 단일 세포 클론들은 제외하였다(도 2의 C 및 D 참조).

실시예 2: F2N78 클론의 특징 규명

F2N 클론들의 선별을 위해 일시적 형질도입(transient transfection)을 이용하여 1차적으로 IgG의 발현이 높은 17 개의 클론들을 선별하였고(도 4-A) 이들 클론을 대상으로 2차 스크리닝을 실시하였다(도 4-B). 이들 중 IgG의 발현이 가장 높은 F2N78 클론을 293 세포와 IgG의 생산성을 비교하기 위하여 pCT132 벡터를 이용하여 일시적 형질도입 시험을 반복적으로 수행하였고, 그 결과 F2N78 세포의 IgG 발현율이 293 세포보다 2~3 배 높다는 것을 확인하였다(도 4-C).

1차 선정된 17 개의 클론 모두는 EBNA1의 발현이 양성이었고 IgM의 발현은 음성이었다. 이들 17 개의 단일 세포 클론 중 IgG 발현이 높은 순으로 7 개의 단일 세포 클론을 선별하였고 무혈청 배지를 이용한 부유 배양 조건하에 적응시켰다. 무혈청 부유 배양 조건에서 적응된 7 개의 단일 세포 클론 내에 EBV 게놈이 존재하는지를 EBNA1의 지속적인 발현 여부를 통해 확인하였다. 도 5에서 보는 바와 같이, 무혈청 부유 배양 조건 하에서 1 년 이상 자라온 F2N78 세포 집단의 거의 100 %가 EBNA1 발현에 대해 양성을 나타내었다. 치료용 단백질의 제조에 있어서 마스터 세포 은행(master cell bank, MCB)와 마스터 제조용 세포 은행(master working cell bank, MWCB)을 만들고 생산하는 기간을 포함한 생산 세포 클론의 분열 기간은 1 년 정도면 충분하다.

또한 세포 내의 중요한 유전자의 지속적인 발현을 조사하기 위해 무혈청 배지를 사용하여 부유 배양으로 1년 이상 배양해 온 F2N78 클론을 대상으로 IF(도 5 참조)와 RT-PCR(도 6 참조)을 수행하였다. 결과를 정리하면 다음과 같다: (1) IF로 EBNA1의 발현을 확인하였으며, 또한 2 종류의 다른 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR을 통해 EBNA1이 발현된다는 것을 재차 확인하였고; (2) Ig-mu는 상기 IF 및 RT-PCR에 의해 발현이 소멸하였음을 확인하였고, 또한 IF로 Ig-kappa의 발현이 소멸하였음을 확인하였고; (3) 2 종류의 다른 프라이머 쌍을 이용한 RT-PCR을 통해 항체-의존성 세포 사멸 기작(antibody dependant cellular cytotoxicity)과 밀접한 관련이 있는 bisecting N-acetylglucosamine의 생성에 관여하는 GnTIII(Campbell and Stanley, 1984)의 발현을 확인하였고; 및 (4) CHO 세포에는 존재하지 않고 인간 세포에만 특수하게 존재하는 α(2,6)ST의 발현 또한 IF에 의해 증명되었다.

실시예 3: 일시적 형질도입

신약 개발 과정에 필요한 단백질을 짧은 시간 내에 생산하기 위해서는 일시적 형질도입에 의한 생산 방법이 사용되고 있다. 이를 위하여 FreeStyle 293 배지에서 부유 배양된 F2N78 세포와 293 세포를 두 개의 다른 구조의 oriP 발현 벡터(pCT132 및 pCT125)로 형질도입하여 항체 생산성을 비교하였다. 두 개의 벡터 중 pCT132는 플라스미드 내에 EBNA1 코딩 서열이 없고, pCT125는 EBNA1 코딩 서열이 플라스미드 내에 존재한다.

도 7에서 보여주는 바와 같이, pCT132와 pCT125를 F2N78 세포와 293 세포에 각각 형질도입한 반복 시험에서, F2N78 세포에서는 두 벡터가 비슷한 항체 생산성을 보인 반면, 293 세포에서는 pCT125가 pCT132보다 더 높은 IgG 생산을 보였다. 더욱이 pCT132 벡터로 형질도입된 F2N78 세포에서의 생산량(25 ㎍/ml 이상)은 pCT125 벡터로 형질도입된 293 세포의 생산량(15 ㎍/ml)보다 높았다. 이는 F2N78 세포에서 EBNA1 유전자가 없는 pCT132 발현벡터의 IgG 생산이 293 세포에서 EBNA1 유전자가 있는 pCT125 발현벡터의 IgG 생산보다 효율적인 면을 보여주고 있는 반면, EBNA1이 발현되지 않는 293 세포에서는 EBNA1이 있는 pCT125 발현벡터가 EBNA1이 없는 pCT132 발현벡터보다 그 효율성이 높음을 보여주고 있다.

이러한 pCT132 발현벡터의 효율성을 높이기 위해 F2N78 세포가 잘 성장할 수 있게 새로운 배지(EX-CELL 293 배지)에 적응시킨 후, FreeStyle Max 시약을 사용한 일시적 형질도입을 수행하였다. 그 결과 형질도입 후 6 일째에 100 ㎍/ml 정도의 높은 항체 생산성을 보임을 반복 시험을 통해 확인하였다(도 8 참조). 이는 본 발명에서 개발한 인간세포주가 이미 개발되어 있는 293 세포주보다 일시적 형질도입에서의 우월함을 의미한다.

실시예 4: F2N 세포에 대한 소듐 뷰티레이트 처리의 효과

소듐 뷰티레이트 처리는 생산 세포주에 두 가지 영향을 미친다. 여러 유전자 상의 과아세틸레이션(hyper-acetylation)을 통해 유전자 발현을 활성화시키는 반면, 세포자멸을 유도하여 세포 성장률을 저하시킨다. 이러한 현상을 확인하기 위해 EX-CELL 293 배지에 적응시킨 CHO, 293, 나말와, 및 F2N78 세포를 1 ml 당 3x10⁵ 개의 세포가 되도록 접종한 후 3 일째에 여러 농도(0, 1, 2, 및 4 mM)의 소듐 뷰티레이트로 처리하였다.

도 9에서 보는 바와 같이, CHO 세포는 소듐 뷰티레이트의 농도가 높을수록 세포수와 세포생존율이 급격히 떨어지는 현상이 보였다. 나말와 세포 역시 CHO 세포와 유사하게 처리한 모든 농도의 소듐 뷰티레이트에서 세포성장률과 생존율이 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 이에 반해 293 세포는 저농도(1 mM 및 2 mM)의 소듐 뷰티레이트에서는 세포성장률에 별 영향을 받지 않았으나, 고농도(4 mM)에서는 세포성장률과 생존율이 상당히 저하되었다. 그러나 F2N78 세포는 시험한 모든 조건에서 세포 성장률과 생존율이 모두 저하되지 않았으며, 오히려 높은 농도(4 mM)의 소듐 뷰티레이트에서는 그 성장률과 생존율이 증가하였다.

F2N78 세포의 세포자멸억제적 세포 성장을 설명하기 위해, 나말와 세포로부터 유래된 EBV 게놈 내에 존재하는 두 개의 바이러스성 bcl2 유사 인자인 BHRF1과 BALF1의 발현을 RT-PCR을 통해 확인하였다. 도 10에서 보여주는 바와 같이 F2N78 세포에서는 소듐 뷰티레이트 처리군과 미처리군 모두에서 BHRF1은 발현되지 않고 BALF1은 발현되는 것을 확인하였다. 반면에 나말와 세포에서는 두 가지 유전자가 모두 발현되는 것을 확인하였다. 대조군으로 사용한 293 세포에서는 BHRF1과 BALF1가 모두 발현되지 않았다. F2N78 세포가 나말와 세포로부터 유래됐음에도 불구하고 F2N78 세포 내에서는 BHRF1이 발현되지 않는다는 사실은 F2N78 세포의 세포자멸억제적 세포 성장을 설명할 수 있는 근거가 된다. 기존에 발표된 여러 보고들에 따르면, BHRF1과 BALF1 유전자가 같이 발현되었을 때 BALF1은 BHRF1의 세포자멸억제적 활성을 저해한다고 한다 (Marshall et al., 1999, J Virol. 73:5181-5185). 그러므로 F2N78 내에서 BALF1만 발현된다는 사실은 F2N78 세포가 세포자멸억제 활성을 갖는다는 것을 의미한다. 그러나 나말와 세포 내에서는 두 가지 인자 모두 발현하기 때문에 F2N78 세포와는 다르게 세포자멸억제 현상을 확인할 수 없는 것이라 생각된다.

다음으로 소듐 뷰티레이트가 세포의 항체 생산성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, CHO 세포와 F2N78 세포로부터 각각 항체 생산 세포주를 제조하여 비교하였다. CHO#247은 MTX 증폭 과정을 거쳐 제작된 항체 생산 단일 세포주이고, F2N78_Ig는 퓨로마이신(puromycin) 선별을 거쳐 제작된 항체 생산 세포집단이다. 두 세포주를 각각 접종한 후 3 일째에 여러 농도(0, 1, 2, 4 mM)의 소듐 뷰티레이트를 처리하였다. CHO#247의 경우 소듐 뷰티레이트를 처리하지 않은 군과 비교하였을 때, 소듐 뷰티레이트 처리군의 세포 성장은 50 %까지 감소하였으나, 생산성은 2 배 가까이 증가하였다(도 11 참조). 반면, F2N78_Ig의 경우 소듐 뷰티레이트 처리하지 않은 군에 비해 최대 2 배 정도의 세포성장률 증가를 보였고, 생산성 면에서도 4-5 배의 증가율을 보였다(도 12 참조). 도 12에서 보여지는 바와 같이 F2N78의 항체 생산 증가율은 CHO 세포주와 비교시 더 높은 증가율에 해당한다. 이러한 현상은 소듐 뷰티레이트에 대한 F2N78 세포주의 세포자멸억제 효과가 세포의 항체 생산성 증가에 더욱 영향을 주어 나타나는 것이라 보여진다.

토의

일반적으로 EBV 게놈이 바이러스 파티클을 생성하기 위해 EBV 라이프 사이클의 에피좀 상태에 있는 반면, 나말와 세포는 염색체에 삽입된 두 카피의 EBV 게놈 (Henderson et al., 1983, PNAS USA 80:1987-1991 및 Rose et al., 2002, J. Clin. Microbiol. 40:2533-2544)을 갖는다. 이러한 예외적인 염색체 내에 EBV 게놈이 삽입된 형태는 재조합 단백질을 생산하는 숙주 세포에게 두 가지 이점을 제공한다. 첫째는 염색체에 삽입된 EBV 게놈으로부터 바이러스 생성의 우려가 없다는 이점이 있으며, 둘째는 잠복기(latent)의 EBNA1 단백질과 BALF1 등의 초기 유전자들은 지속적으로 발현되는 반면 BHRF1의 발현은 소멸되는 EBV 유전자의 발현 양상에서 그 이점을 찾을 수 있다. 이와 관련해서 특히 바이러스성 bcl-2와 관련된 두 개의 유전자들 중 하나인 BHRF1 유전자의 소멸은 F2N78 클론의 세포자멸억제적 성장을 제시하는 예기치 않은 결과이다. 또한 EBNA1 유전자의 지속적인 발현은 EBNA1 유전자가 없는 oriP 발현벡터를 사용할 수 있다는 장점으로 작용한다. 이 외에도 GnTIII와 α(2,6)ST의 발현은 인간 세포로서의 특별한 이점을 제공할 것이다. 또한 Ig-mu chain과 Ig-kappa chain의 발현이 소멸되어 재조합 모노클로날 항체의 제조에 있어서도 본 발명에 따른 인간 숙주 세포는 유용하다.

세포치사율이 낮아지고 세포성장 기간이 연장된다는 것은 목적하는 단백질(protein of interest)의 생산량 증가를 뜻하기 때문에 세포자멸억제적 세포 성장은 재조합 단백질의 생산을 증가시키는 데 있어서 매우 중요하다. 이러한 가치는 F2N78 세포의 배양시에 소듐 뷰티레이트를 처리한 실험에서 확인할 수 있었으며, 경우에 따라 소듐 뷰티레이트를 F2N78 세포의 치료용 단백질 생산성을 높이는데 사용할 수도 있다는 데 있다.

도 1은 F2N 세포 융합 과정 및 F2N78 클론 선별 과정의 개괄도이다.

도 2는 초기 단계에서 F2N 클론의 여러 성장 패턴을 나타낸다. 덩어리를 형성하는 성장 패턴을 보이는 클론(C, D)은 선별 과정에서 제외하였다.

도 3은 본 발명에서 사용된 발현 벡터의 개열 지도를 나타낸다. 모든 벡터는 pCT 벡터를 기본 골격으로 구축하였다.

도 4는 IgG 발현이 높은 F2N 클론을 선별하기 위하여 일시적 형질도입을 행한 결과를 나타낸다. (A)는 1차 스크리닝한 결과이고, (B)는 1차 선별된 17개의 클론을 대상으로 2차 스크리닝한 결과이고, (C)는 최종 선별된 F2N78 세포의 IgG 생산성을 293 세포와 비교한 결과(3회 반복 실험 수행)이다.

도 5는 형광면역염색법을 이용하여 (A) Ig-mu와 Ig-kappa, 및 (B) EBNA1와 α(2,6)-ST의 발현 유무를 확인한 결과를 나타낸다.

도 6은 RT-PCR을 이용하여 F2N98 세포에서 GntIII, Ig-mu, 및 EBNA1의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸다. 나말와, 293, 및 CHO 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. GntIII, Ig-mu, 및 EBNA1 단백질의 특이적인 프라이머 쌍은 표 1로 정리하였다.

도 7은 F2N78과 293 세포를 비교하여 oriP 발현 벡터(pCT125 및 pCT132)의 항체 생산성을 확인한 결과를 나타낸다.

도 8는 F2N78 세포를 EBNA1 유전자가 없는 발현벡터인 pCT132로 일시적 형질도입하여 얻은 항체 생산성의 결과를 나타낸다. 4회 반복 실험을 수행하였다.

도 9은 CHO(A), 나말와(B), 293(C), 및 F2N78(D) 세포의 세포 성장에 대한 소듐 뷰티레이트의 효과를 나타낸다.

도 10은 소듐 뷰티레이트 처리에 따른 F2N78, 나말와 및 293 세포에서 BHRF1 및 BALF1의 발현 여부를 RT-PCR을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다. 여기서 0, 1, 및 4는 각각 세포 배양 배지에 첨가한 소듐 뷰티레이트의 농도(mM)이다.

도 11은 CHO#247 세포의 항체 생산성에 대한 소듐 뷰티레이트의 효과를 나타낸다.

도 12는 F2N78_Ig 세포의 항체 생산성에 대한 소듐 뷰티레이트의 효과를 나타낸다.

<110> Celltrion, Inc. <120> Human host cell for producing recombinant proteins with high quality and quantity <130> 08-001 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first primer for GnTIII gene (sense) <400> 1 gacgtggtgg acgcctttgt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first primer for GnTIII gene (antisense) <400> 2 cgaccactgc accaggatgt 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second primer for GnTIII gene (sense) <400> 3 caaggtgctc tatgtcttcc tggac 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second primer for GnTIII gene (antisense) <400> 4 cggtcgtagt tcttcagcag gtac 24 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Ig-mu gene (sense) <400> 5 acaaggtgac cagcacactg ac 22 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for Ig-mu gene (antisense) <400> 6 gtgacggtgg tactgtagaa gaggc 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first primer for EBNA1 gene (sense) <400> 7 gtccaagttg cattggctgc 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first primer for EBNA1 gene (antisense) <400> 8 ctcatctcca tcacctcctt ca 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second primer for EBNA1 gene (sense) <400> 9 agaaggtgcc cagatggtg 19 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second primer for EBNA1 gene (antisense) <400> 10 ctcatctcca tcacctcctt ca 22 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for BHRF1 gene (sense) <400> 11 tacgcattag agaccacttt gagcc 25 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for BHRF1 gene (antisense) <400> 12 gtcaaggttt cgtctgtgtg 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for BALF1 gene (sense) <400> 13 gaggccagcc aagtctacag attc 24 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for BALF1 gene (antisense) <400> 14 gaactgacgt ctcagcgatc ttg 23

Claims

(i) EBNA1(Epstein-Barr nuclear antigen 1) 단백질을 연속적으로 발현시키고, (ii) IgM 단백질을 발현시키지 않고, (iii) 인간과 유사한 글리코실화 프로파일을 지속하고, (iv) BALF1을 발현시키고, BHRF1을 발현시키지 않는 것을 특징으로 하는, 인간 배아 신장 유래 세포 및 엡스타인-바르 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV) 게놈이 염색체 내에 삽입된 인간 B-세포 유래 세포의 융합으로부터 유도된 인간 숙주 세포.
제1항에 있어서, 상기 인간 배아 신장 유래 세포가 293 세포인 것을 특징으로 하는 인간 숙주 세포.
제1항에 있어서, 상기 인간 B-세포 유래 세포가 HAT-민감성 및 G418-내성 세포인 것을 특징으로 하는 인간 숙주 세포.
제1항에 있어서, 상기 인간 B-세포 유래 세포가 나말와 세포인 것을 특징으로 하는 인간 숙주 세포.
제4항에 있어서, 상기 나말와 세포가 HAT-민감성 및 G418-내성 나말와 세포인 것을 특징으로 하는 인간 숙주 세포.
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제1항에 있어서, 상기 인간 숙주 세포가 기탁번호 KCTC11309BP의 F2N78인 것을 특징으로 하는 인간 숙주 세포.
재조합 단백질을 생산하기 위한 제1항에 따른 인간 숙주 세포.
제9항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는 인간 숙주 세포.
제9항에 있어서, 상기 재조합 단백질이 모노클로날 항체 이외의 치료용 단백질인 것을 특징으로 하는 인간 숙주 세포.