KR101001767B1 - 항 인플루엔자 바이러스 효능을 갖는 락토바실러스 루테리 에이취와이7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 - Google Patents
항 인플루엔자 바이러스 효능을 갖는 락토바실러스 루테리 에이취와이7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 제품 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인플루엔자 바이러스에 대한 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제에 관한 것으로서, 본 발명의 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501은 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 및 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스의 증식을 억제하는 효능을 통하여 인플루엔자 바이러스 감염 예방을 목적으로 하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제로 이용될 수 있다.
락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 유산균, 인플루엔자바이러스
Description
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 및 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스의 증식을 억제하는 효능을 통하여 인플루엔자 및 조류독감 바이러스의 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제에 관한 것이다.
매년 전세계 인구의 10~20%에 해당하는 6억명이 넘는 사람들이 인플루엔자에 감염된다. 인플루엔자 바이러스(influenza virus)는 오르쏘믹소비리데(orthomyxoviridae)에 속하는 단일가닥 RNA(single stranded RNA) 바이러스로서 두 가지의 당단백질 표면 항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin; HA)과 뉴라미니다아제(neuraminidase; NA)를 가지고 있으며, 항원성에 따라 인플루엔자 A, B, C형으로 분류된다. A형과 B형이 주로 유행을 일으키는데, A형은 HA(H1~H15)와 NA(N1~N9)의 특성에 따라 몇가지 아형(예 H1N1, H3N2, H5N1 등)으로 분류되며, C형은 산발적으로 급성상기도 감염을 유발할 수 있다. 현재 전 세계적으로 인플루엔자 A형 중 아형 H1N1, H3N2와 인플루엔자 B형이 유행하고 있다.
최근 문제시되고 있는 H5N1 고병원성 조류 인플루엔자(highly pathogenic avian influenza; HPAI) 바이러스의 인체 감염 사례에서 제시된 인플루엔자 바이러스 인체 감염의 병리기전은 HAPI 바이러스 감염시 T 세포의 현저한 감소와 인터페론 감마의 감소로 인하여 바이러스의 체내 증식이 조기에 억제되지 못하여 바이러스 감염이 전신으로 이어지고 그 결과 기관, 폐 등 호흡기 장기 이외의 혈액과 직장에서 바이러스가 증식됨이 확인되었으며, 이들 바이러스 증식부위에서 세포의 아폽토시스(apoptosis)로 인한 세포의 사멸과 염증성 사이토카인의 대량 방출로 인한 비화농성 페렴과 다발성장기 기능부전(multiorgan dysfunction) 유발로 인하여 사망에 이르게 된다고 보고되고 있다.
유산균은 사람 및 동물의 장내에 분포하여 장내 유해 미생물 생장 억제, 이상 발효의 치료, 혈중 콜레스테롤 저하, 면역 기능의 증진 등의 효과를 나타내며, 항암 작용도 있는 것으로 보고되고 있다. 이러한 유산균을 사람이 섭취하여 건강을 증진할 수 있도록 유산균 함유 발효 유제품 및 정장제가 상용화되어 널리 음용 또는 식용되고 있다. 최근에 유산균에 의한 바이러스 감염억제에 관한 연구결과들이 보고되었다. 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum)과 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)를 보충한 분유를 섭취함으로써 로타바이러스에 의한 유아 설사증을 예방하는 데 효과가 있는 것으로 보고되었으며, 조류인플루엔자 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 식물유래 유산균(대한민국 특허등록 제0808910호)도 보고되었다. 그러나 유산균에 의한 인플루엔자 바이러스 감염 억제, 특히 조류 인플루엔자 바이러스 증식 억제에 관한 효능 검증이 시험관내의 동물세포 및 발육란을 이용하는 수준에서 이루어지고 있어 실제 동물에서 바이러스 감염을 억제하는지에 대한 시험 결과는 찾아보기 어렵다.
이에 본 발명자들은 유산균의 인플루엔자 바이러스 증식 억제를 시험한 후 마우스 및 닭에서 실제 유산균이 인플루엔자 바이러스 감염 억제 효능을 시험하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 및 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스의 증식을 억제하 는 효능을 통하여 인플루엔자 바이러스의 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 및 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스의 증식을 억제하는 효능을 통하여 인플루엔자 및 조류독감 바이러스의 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501 및 이를 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제를 제공하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 신균주를 분리하기 위하여 건강한 성인 분변을 0.02% 소디움 아지드(sodium azide)가 포함된 엠알에스(MRS) 액체 배지에 넣고 37℃에서 24시간 배양하였다. 배양 후 10㎕ 백금이를 사용하여 배양액을 취하여 다시 0.02% 소디움 아지드가 포함된 엠알에스 한천 평판배지에 도말하고 37℃에서 48시간동안 배양하였다. 형성된 균락 중에서 MDCK 세포를 이용한 시험관내 인플루엔자 바이러스 세포변성 억제, SPC BALB/c 마우스를 이용한 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 임상증상 발현 억제, 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 농도 별 폐내 바이러스 증식 억제, 인플루엔자 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스 공격접종 후 바이러스 배출억제를 시험하여 본 발명의 신균주를 분리하였다.
이하, 본 발명에 따른 신균주의 특성은 다음과 같다.
1)균의 형태
엠알에스 한천평판배지에서 37℃, 3일간 호기 배양했을 때 균의 특성
① 세포의 형태: 간균
② 운동성: 없음
③ 포자형성능: 없음
④ 그람(Gram) 염색: 양성
2)균락의 형태
엠알에스 한천평판배지에서 37℃, 3일간 호기 배양했을 때 균락의 형태
① 형상: 원형
② 융기: 볼록
③ 표면: 매끄러움(Smooth)
3)생리적 성질
① 최적 생육온도: 36~38℃
② 최적 생육 pH: 6.0~6.5
③ 산소에 대한 영향: 통성혐기성
4)카탈라제: -
5)가스형성여부: +
6)15℃에서 생육: -
7)45℃에서 생육: +
8)인돌생산: -
9)젖산생산: +
10) Bergey's manual의 당 발효 시험
아미그달린: -
L-아라비노스: +
셀로비오스: -
에스큘린: -
과당: -
갈락토스: +
포도당: +
글루코네이트: -
유당: +
말토스: +
만니톨: -
만노스: -
멜레지토스: -
멜리비오스: +
라피노스: +
리보스: +
람노스: -
살리신: -
소르비톨: -
자당: +
트레할로스: -
크실로스: -
이와 같은 균의 형태학적, 생리적 및 생장 특성에 근거하여 본 발명의 균주는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)로 동정하였고, 본 발명자들은 본 발명의 신균주를 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501로 명명하였다. 그리고 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2008년 8월 22일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 11379BP).
한편, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물은 단독 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 약제학적으로 통상으로 사용되는 방법에 따라 정제, 캡술제 등과 같은 제재형태로 제제화하여 사용될 수 있다.
사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1~30㎎/kg 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 실제 투여량은 투여경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
물론, 상기 항 인플루엔자 바이러스용 약학조성물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 발효유는 유산균 배양액과 락토바실러스 루테리 HY7501 및 혼합과즙시럽을 일정비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 용기에 포장하여 발효유를 제조한다.
또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 음료는 혼합과즙시럽, 락토바실러스 루테리 HY7501 및 물을 일정한 비율로 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 기능성 음료를 제조한다.
또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품은 상기 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함하는 것 이외에 영양보조성분으로서 비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드, 올리고당 등이 첨가될 수 있으며 여타의 식품 첨가물이 첨가되어도 무방하다.
또한, 본 발명의 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 동물용 생균제는 락토바실러스 루테리 HY7501의 동결건조분말과 덱스트린을 일정비율로 혼합하여 용기에 포장하여 제조한다.
이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 새로운 락토바실러스 루테리 HY7501을 이용하여 인플루엔자 바이러스 감염 예방을 목적으로 하는 항 인플루엔자 바이러스용 약학 조성물, 발효유, 음료, 건강기능식품 및 동물용 생균제로 이용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 당업자에 의한 통상적인 변화가 가능하다.
<실시예 1>
락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 제조
본 발명의 락토바실러스 루테리 HY7501은 식품원료용 Proteose peptone #3, Yeast Extract, Beef Extract 및 포도당을 첨가한 액체배지를 제조하여 37℃에서 약 20시간 배양한 후 배양액을 원심분리하고 멸균된 생리식염수로 세척한 다음 멸균유에 분산하였다. 그런 다음, 다시 동결 건조하여 동결건조 분말 그램(g)당 약 1011cfu 균수를 얻었다. 이 동결건조 분말을 인플루엔자 바이러스 감염억제용 소재로 사용하였다.
한편, 본 발명의 락토바실러스 루테리 HY7501은 상기와 같이 동결건조된 분말 형태 또는 배양물 형태로 제공될 수 있다.
<실시예 2>
락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제조
본 발명의 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
정제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎, 폴리비닐피롤리돈 97㎎의 원료를 균질하게 혼합하 여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 3㎎을 가하여 혼합한 후 1정이 400㎎이 되도록 타정하였다.
캡슐제의 제조
상기 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 100㎎, 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎, 스테아린산 마그네슘 2㎎을 완전히 혼합한 후 통상의 캡슐제의 제조 방법에 따라서 경질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<실시예 3>
락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 발효유의 제조
유산균 배양액과 상기 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 및 혼합과즙시럽으로 구성된 발효유를 제조하는 방법은 다음과 같다.
유산균 배양액은 원유 95.36중량%와 탈지분유(또는 혼합분유) 4.6중량%를 교반하여 15℃에서의 비중은 1.0473~1.0475, 적정산도는 0.200~0.220%, pH는 6.65~6.70, 20℃에서의 브릭스(Brixo)는 16.3~16.5% 정도가 되도록 혼합하였다. 그런 다음, 이를 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)하고 40℃로 냉각한 뒤, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)균과 유당분해효소(Valley laboratory, USA)를 각기 0.02중량%씩 첨가하고 6시간 동안 배양하여, BCP 배지에 서의 총 유산균수가 1.0 × 109 cfu/㎖ 이상, 적정산도가 0.89~0.91%, pH는 4.55~4.65가 되도록 하여 제조하였다.
혼합과즙시럽은 액상과당 10중량%, 백설탕 3중량%, 갈색설탕 3중량%, 혼합과즙농축액(56 Brixo) 10중량%, 펙틴 0.1중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.05중량% 및 정제수 73.85중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
상기의 방법으로 제조된 유산균 배양액 75중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 상기 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 24.9중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각하여 인플루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 발효유를 제조하였다.
<실시예 4>
락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 하는 음료
상기 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말과 혼합과즙시럽으로 구성된 기능성 음료를 제조하는 방법은 다음과 같다.
혼합과즙시럽은 액상과당 10중량%, 백설탕 3중량%, 갈색설탕 3중량%, 혼합과즙농축액(56 Brixo) 10중량%, 펙틴 0.1중량%, 후레쉬 후르츠 믹스 에센스 0.05중량% 및 정제수 73.85중량%를 30~35℃에서 교반하여 혼합한 후 UHT 열처리(135℃에서 2 초간 살균)한 후 냉각하여 제조하였다.
상기의 방법으로 제조된 혼합과즙시럽 29.9중량%와 상기 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 0.1중량% 및 멸균 정제수 70중량%를 조합하여 150bar에서 균질한 후 10℃ 이하로 냉각한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 인풀루엔자 바이러스 감염억제 효능을 갖는 락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 기능성 음료를 제조하였다.
<실시예 5>
락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품
상기 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 0.1중량%에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드) 및 올리고당을 상기의 실시예 1의 락토바실러스 루테리 HY7501을 포함한 동결건조분말 100중량부에 대하여 10중량부가 되도록 첨가하여 고속회전 혼합기에서 혼합하였다. 상기 혼합물에 멸균 정제수 10중량%를 첨가, 혼합하고 직경 1~2mm의 과립상으로 성형하였다. 상기 성형된 과립은 40~50℃의 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하였다. 상기와 같이 제조된 과립은 적당량씩 압출 성형되어 정제 또는 분말로 되거나 경질캡슐에 충전되어 경질캡슐제품으로 제조하였다.
<실시예 6>
락토바실러스 루테리 HY7501을 유효성분으로 함유하는 동물용 생균제
락토바실러스 루테리 HY7501을 엠알에스(MRS, Difco) 액체배지에 1% 접종하고 37℃에서 20시간 배양하였다. 그런 다음, 시에스엘(C.S.L, 옥수수 침지 농축액, pH 4.5 이하) 7.0중량％, 효모 추출물 0.5중량％, 탄산칼슘 0.05중량％, 포도당 2.0중량％, 인산제1칼륨(KH2PO4) 0.1중량％, 인산제2칼륨(K2HPO4) 0.2중량％ 및 수산화나트륨 0.1중량％의 조성으로 이루어진 멸균 액체배지에 상기에서 얻은 락토바실러스 루테리 HY7501 1%를 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였다. 그런 다음 상기 배양액을 원심분리하고 멸균된 생리식염수로 세척한 다음, 동결 건조하여 동결건조 분말 그램(g)당 약 1011 cfu 균수를 얻었다. 이렇게 얻어진 락토바실러스 루테리 HY7501 동결건조분말 5중량%와 덱스트린 95중량%를 혼합하여 본 발명의 동물용 생균제를 제조하였다.
<시험예 1>
락토바실러스 루테리 HY7501의 MDCK 세포를 이용한 시험관내 인플루엔자 바이러스 세포변성 억제 효능 시험
세포 배양
FBS(Fetal Boveine Serum)가 함유된 MEM 배지(GIBCO)를 96 well microplate에 분주한 후 MDCK(Mardine Darbine Canine Kidndy) 세포를 1.5 × 105 cells/㎖의 농 도로 접종하고 37℃, 5% CO2의 배양기에서 24시간 배양하였다.
락토바실러스 루테리 HY7501의 인플루엔자 바이러스의 세포변성 억제 효능
(1)엠알에스(MRS) 액체배지에서 24시간 동안 37℃에서 배양한 생균수 109 cfu/㎖ 이상의 락토바실러스 루테리 HY7501 배양액(이하 'HY7501원액'이라함), 상기 락토바실러스 루테리 HY7501 배양원액을 멸균 증류수로 1/2로 희석시킨 락토바실러스 루테리 HY7501 배양액(이하, 'HY7501희석액' 이라 함) 및 생리식염수로 1/50으로 희석시킨 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스액(이하, '바이러스액' 이라 함)을 각각 준비 하였다.
상기 HY7501원액과 HY7501희석액이 각각 2.5㎖씩 들어있는 각각의 시험관에 바이러스액 2.5㎖을 넣고 혼합한 다음 4℃에서 30분간 반응시키면서 매 10분마다 흔들어 주었다. 상기 각각의 혼합액(HY7501원액과 바이러스액의 혼합액 및 HY7501희석액과 바이러스액의 혼합액)을 상기 MEM 배지를 사용하여 원액, 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6의 희석배수로 희석하였다. 상기 96 well microplate에 배양한 MDCK 세포에 위의 단계별로 희석된 각각의 혼합액을 well 당 25μl씩 접종한 뒤, 30분 동안 흡착시킨 다음 배지를 갈아주었다. 이 때 인플루엔자 바이러스의 세포변성효과(CPE, cytophatic effect)를 유발하기 위하여 5μg/㎖ 농도의 트립신이 함유된 배지를 사용하였다. MDCK 세포는 37℃의 CO2 배양기에서 4일 동안 배양하며, 매일 현미경으로 세포변성효과(CPE) 여부를 관찰하고 최종적으로 접종 3~4일 후 세포변성효과를 관찰하여 상기 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스의 증식 여부를 판단하였다.
(2)대조군으로는 본 발명의 락토바실러스 루테리 HY7501 대신 증류수를 사용하는 것을 제외하고는 상기 (1)과 동일한 방법으로 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스의 세포변성 억제 효능을 측정하였다.
그 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, HY7501원액 또는 HY7501희석액 각각에 바이러스액을 혼합하여 MDCK 세포에 처리하였을 때, 락토바실러스 루테리 HY7501이 첨가되지 않은 대조군과 비교하여 MDCK 세포변성이 나타나지 않아, 락토바실러스 루테리 HY7501이 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스의 세포변성을 억제하는 효능이 있음을 알 수 있었다.
<시험예 2>
SPF BALB/c 마우스를 이용한 락토바실러스 루테리 HY7501의 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 임상증상 발현 억제 효과
(1)락토바실러스 루테리 HY7501의 인플루엔자 감염 마우스에 대한 예방효과를 시험하기 위하여 상기 시험예 1의 (1)과 같이 HY7501원액을 준비하였다. 시험군은 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여한 실험군, 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여하지 않은 양성 대조군 및 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종을 실시하지 않은 음성대조군으로 구분하였다.
그룹 당 10수의 6주령 자성 BALB/c 마우스(오리엔트, 한국)를 사용하였으며, 케타민 마취(100㎎/kg) 후 LD100에 해당하는 역가 105.5TCID50/㎖의 인플루엔자 A/NWS/33(N1H1) 바이러스액을 비강으로 마리 당 90μl 용량으로 공격접종 하였다. 락토바실러스 루테리 HY7501의 예방적 투여는 공격접종 7일 전부터 투여하기 시작하여 공격접종 후 20일간 존데로 0.3㎖ 용량의 HY7501원액을 1일 1회 투여하였다. 공격접종 후 상기 실험군은 20일간 임상증상 및 폐사 마리 수 등을 매일 관찰하여 예방 효과를 산출하였다.
(2)양성 대조군은 HY7501원액 대신 멸균한 10% 스킴 밀크 용액을 사용하여 HY7501원액과 동일한 용량으로 1일 1회 존데로 투여한 후 상기 (1)과 동일한 방법으로 인플루엔자 A/NWS/33(N1H1) 바이러스의 감염 예방 효능을 측정하였다. 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종을 실시하지 않은 음성 대조군에 사용한 마우스가 80% 이상 살아남지 못할 경우 재시험을 실시하였다.
그 결과를 표 2에 나타내었다.
*임상증상: 임상증상두수/접종두수
*폐사: 폐사두수/접종두수
*PI21(Pathogenicity index 21): the mean score per mouse per observation over a 21 day period when each day, mouse are scored 0 if normal, 1 if sick, 2 if dead
*MTO(Mean time of onset clinical signs): 평균 임상 증상 발현 시간
*MDT(Mean death time): 평균 치사 시간
표 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여한 실험군의 페사율이 40%로 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여하지 않은 양성 대조군의 폐사율 90%와 비교하여 유의성 있게 감소하여 락토바실러스 루테리 HY7501의 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스감염 예방효과가 있음을 확인 할 수 있었다(P<0.05).
<시험예 3>
락토바실러스 루테리 HY7501의 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 농도별 폐내 바이러스 증식 억제 효과
(1)락토바실러스 루테리 HY7501의 항 인플루엔자 예방효능을 확인하기 위하여 락토바실러스 루테리 HY7501의 투여에 따른 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스의 폐내 증식 억제 효능시험을 실시하였다. 시험군은 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 상기 시험예 1의 (1)과 같이 HY7501원액을 투여한 실험군, 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여하지 않은 양성대조군 및 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종을 실시하지 않은 음성대조군으로 구분하였다.
그룹 당 10마리의 6주령 자성 BALB/c 마우스(오리엔즈, 한국)를 사용하였으며, 케타민 마취(100㎎/kg, 복강 주사) 후 역가 104.0, 103.0, 102.0 TCID50/㎖의 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스액을 각각 비강으로 마리당 90μl 용량으로 공격접종 하였다. 상기 시험예 1의 (1)과 같이 준비한 HY7501원액을 공격접종 7일 전부터 공격접종 후 6일간 존데로 109 cfu/㎖ 이상을 0.3㎖ 용량이 되도록 1일 1회 투여하였다. 공격접종 3일과 6일 후에 각 그룹 당 5마리의 마우스로부터 폐를 적출하여 폐 경화도, 폐 무게 및 폐내 바이러스 함량을 측정하였다(Sidwell RW 등, Antiviral Research, 51:179-187, 2001).
(2)양성대조군은 HY7501원액 대신 멸균한 10% 스킴밀크 용액을 동일한 용량으로 1일 1회 존데로 투여한 후 상기 (1)과 동일한 방법으로 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스의 폐내 바이러스 증식 억제 효능을 측정하였다.
그 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여한 실험군에서 104.0TCID50/㎖ 역가로 공격접종 시 공격접종 후 3일에, 103.0TCID50/㎖의 역가로 공격접종 시 공격접종 후 3일과 6일에, 그리고 102.0TCID50/㎖의 역가로 공격접종 시 공격접종 후 6일에, 양성대조군에 비하여 유의성 있는 폐내 바이러스 증식 억제 효능이 있음을 확인할 수 있었다(P<0.05)
<시험예 4>
락토바실러스 루테리 HY7501의 인플루엔자 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스 공격접종 후 바이러스 배출억제 효능
락토바실러스 루테리 HY7501의 조류 인플루엔자 감염 닭에서의 바이러스 배출억제 효과를 시험하였다. 시험군은 인플루엔자 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스 공격접종 후 상기 시험예 1의 (1)과 같이 HY7501원액을 투여한 실험군과 인플루엔자 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여하지 않은 양성 대조군으로 구분하였다.
실험동물은 6주령의 SPF 닭(양성, 한국)을 사용하였으며 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 국내 분리주인 인플루엔자 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스를 1.07.0EID50/㎖의 역가로 100μl씩 비강으로 공격접종 하였다. HY7501원액의 투여는 공격접종 7일전부터 공격접종 5일 후까지 HY7501원액을 1일 1회 3㎖의 용량으로 경구투여 하였다. 공격접종 5일 후 실험군과 대조군에서 기도와 맹장 편도를 채취하여 유제액을 10일령의 SPF 종란에 접종하는 방법으로 바이러스를 재분리하고 그 역가를 다음과 같이 산정하였다. 10일령 SPF 종란에 유제액을 103, 104, 105, 106, 107, 108의 희석배수로 단계별 희석하여 희석 농도별로 5개의 종란에 종란 당 0.1㎖씩 장요막강내에 접종하고, 접종 후 48시간에 장요막강액을 채취하여 10% 닭 적혈구를 이용한 혈구응집반응을 실시하였다(Mahy BWJ와 Kangro HO, Guantitation of virus in Virology methods manual. San Diego:Academic press, 1999, 35-46).
그 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 인플루엔자 A/HS/K5/01(H9N2) 바이러스 공격접종 후 HY7501원액을 투여한 실험군에서 조류인플루엔자 감염 닭의 맹장편도에서 바이러스 재분리율이 100배 감소하였음을 알 수 있어 본 발명의 락토바실러스 루테리 HY7501은 인플루엔자 바이러스 배출억제 효능이 우수함을 확인할 수 있었다.
Claims (10)
- 항 인플루엔자 바이러스(influenza virus) 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501(기탁번호: KCTC 11379BP).
- 제1항에 있어서,상기 락토바실러스 루테리 HY7501은 인플루엔자 바이러스에 의한 세포변성을 억제하는 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501.
- 제1항에 있어서,상기 락토바실러스 루테리 HY7501은 SPF BALB/c 마우스에서 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스 공격접종 후 임상증상 발현 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501.
- 제1항에 있어서,상기 락토바실러스 루테리 HY7501은 SPF BALB/c 마우스에서 공격접종 농도별 로 공격 접종된 인플루엔자 A/NWS/33(H1N1) 바이러스에 대한 증식 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501.
- 제1항에 있어서,상기 락토바실러스 루테리 HY7501은 닭에서 인플루엔자 A/HS/K501(H9N2) 바이러스 공격접종 후 바이러스 배출억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501.
- 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항 인플루엔자바이러스용 약학적 조성물.
- 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 발효유.
- 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 음료.
- 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
- 상기 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) HY7501을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 동물용 생균제.
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