KR100999831B1 - Oligopeptide having improved osteoblastic differentiation ability - Google Patents
Oligopeptide having improved osteoblastic differentiation ability Download PDFInfo
- Publication number
- KR100999831B1 KR100999831B1 KR1020100018148A KR20100018148A KR100999831B1 KR 100999831 B1 KR100999831 B1 KR 100999831B1 KR 1020100018148 A KR1020100018148 A KR 1020100018148A KR 20100018148 A KR20100018148 A KR 20100018148A KR 100999831 B1 KR100999831 B1 KR 100999831B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- oligopeptide
- present
- bmp
- bone
- seq
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0654—Osteocytes, Osteoblasts, Odontocytes; Bones, Teeth
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
본 발명은 조골세포 분화능이 획기적으로 증진되는 올리고펩타이드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치과용 임플란트에서 골유착 및 골형성 증진을 목적으로 사용되는 올리고펩타이드에 관한 것이다.
The present invention relates to oligopeptides in which osteoblast differentiation is greatly enhanced. In particular, the present invention relates to oligopeptides used for the purpose of promoting bone adhesion and bone formation in dental implants.
치과 임플란트의 중요 성능지표 중의 하나는 골유착 기간을 단축시키는 것이다. 즉, 짧은 기간 내에 골유착이 되지 않을 경우에는 치료기간이 길어지고 초기 골유착 실패로 인한 임플란트 시술 성공률이 저하된다. 따라서 골유착 및 골형성 성능을 증진시키는 것이 절대적으로 요구되고 있다. One of the key performance indicators of dental implants is to shorten the period of bone adhesion. In other words, if bone adhesion does not occur within a short period of time, the treatment period is long and the success rate of implant procedures due to initial bone adhesion failure is reduced. Therefore, there is an absolute demand for improving osteoadhesion and bone formation performance.
조골세포의 증식과 분화를 촉진시키는 TGF-β(transforming growth factor-β), IGF-1(Insulin-like growth factor-1) 등의 성장인자(growth factor) 또는 BMP(bone morphogenetic protein) 같은 생리활성물질을 임플란트 식립시 임플란트 표면에 직접 도포하거나 수술 부위 주변에 유포시키는 방법이 사용되고 있다. 그러나 시술 전에 생체물질을 임플란트 표면에 도포하는 방법은 과량이 요구되고 식립시 효과적으로 잔류하지 못하므로 적용이 어렵고 또한 시술 부위에 생체물질을 도포하는 것은 도포된 영역이 극히 제한적이기 때문에 임플란트 표면 전역에서 효과적인 골재생과 골유착이 이루어지지 않을 뿐만 아니라 시술비용이 가중되는 단점이 있다. 더욱이 시술의 표준화가 이루어지지 않아 시술방법과 환자의 관리가 효율적이지 못하여 표준화된 시술 방법으로 채택되는 것은 어려운 실정이다.
Physiological activities such as growth factor (TGF-β), Insulin-like growth factor-1 (IGF-1), or bone morphogenetic protein (BMP) to promote osteoblast proliferation and differentiation The method of applying the material directly to the surface of the implant during implant placement or to spread around the surgical site is used. However, the method of applying the biomaterial to the implant surface before the procedure is difficult because it requires an excessive amount and does not remain effectively during implantation, and the application of the biomaterial to the treatment site is effective throughout the implant surface because the applied area is extremely limited. Not only bone regeneration and bone adhesion is not made but there is a disadvantage that the cost of the procedure is increased. In addition, since the standardization of the procedure is not made, it is difficult to adopt the standardized procedure because the procedure and the management of the patient are not efficient.
BMPs는 세포막에 위치한 BMP 수용체 (BMP receptors, BMPRs)와 결합하여 세포내 신호전달을 개시하며 치조골 형성에 중요한 역할을 한다. 이 수용체들은 TGF-β transmembrane serine-threonine kinase receptor family로 효율적인 리간드 결합에 의한 세포 내 신호전달은 I형 수용체와 II형 수용체가 이형 수용체 복합체(heteromeric receptor complex)를 형성하면서 II형 수용체로부터 I형 수용체로 교차-인산화 (cross-phosphorylation)가 일어나고 이는 Smad cascade를 활성화시키면서 목적 유전자의 단백발현이 이루어지게 된다. BMP 수용체로 현재까지 세 종류의 I형 수용체 (ActR-I, BMPR-IA, BMPR-IB)와 세 종류의 II형 수용체 (ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II)가 발견되었다. BMPR-IA 또는 BMPR-IB와 결합된 BMPR-II에 모든 TGF-β superfamily의 BMPs가 결합하는 것으로 알려져 있으며, ActR-II, ActR-IIB 및 ActRI은 BMP-4가 결합하지 않아 BMPR-IA 또는 BMPR-IB와 BMPR-II가 BMP-특이적 수용체 (BMP-specific receptor)라 생각되고 있다. 따라서 세포막에 존재하는 BMP-특이적 수용체와 보다 친화도가 높은 올리고펩타이드 서열을 개발함으로써 조골세포의 증식과 분화를 보다 효과적으로 유도할 수 있을 것이다.BMPs bind to BMP receptors (BMPRs) located in the cell membrane to initiate intracellular signaling and play an important role in alveolar bone formation. These receptors are the TGF-β transmembrane serine-threonine kinase receptor family. Intracellular signal transduction by efficient ligand binding results in the formation of a heteromeric receptor complex between type I and type II receptors. Cross-phosphorylation occurs, which activates the Smad cascade, leading to protein expression of the target gene. As the BMP receptor, three types of type I receptors (ActR-I, BMPR-IA, BMPR-IB) and three types of type II receptors (ActR-II, ActR-IIB, BMPR-II) have been discovered. It is known that BMPs of all TGF-β superfamily bind to BMPR-II coupled with BMPR-IA or BMPR-IB, and ActR-II, ActR-IIB and ActRI do not bind BMP-4 because BMPR-IA or BMPR -IB and BMPR-II are thought to be BMP-specific receptors. Therefore, by developing oligopeptide sequences having higher affinity with BMP-specific receptors present in the cell membrane, it is possible to induce proliferation and differentiation of osteoblasts more effectively.
한편, 조골세포의 분화와 증식을 촉진하기 위한 BMP 유래 펩타이드의 개발과임플란트 표면에 BMP 유래 펩타이드를 도입시키는 것과 관련하여 아래와 같은 특허들이 출원되었다. On the other hand, the following patents have been applied for the development of BMP-derived peptides for promoting the differentiation and proliferation of osteoblasts and the introduction of BMP-derived peptides on the implant surface.
한국특허출원공개번호 2006-0110189(치과용 임플란트 표면처리용 올리고펩타이드)에는 R1-(A-B-C)n-R2-(A-B-C)m-L 구조식(여기서, R1은 H, 아미노산잔기, 지방산잔기 혹은 생분해 특성을 가진 공중합 폴리머 주쇄이고, R2는 스페이서이며, L은 링크기이다)을 갖는, 치과용 임플란트 표면에 직접 처리되어 골성장을 증진하여 골유착기간을 단축할 수 있는 올리고펩타이드가 기재되어 있다. Korean Patent Application Publication No. 2006-0110189 (Optide for surface treatment of dental implants) includes R1- (ABC) n-R2- (ABC) mL structural formula (where R1 is H, amino acid residue, fatty acid residue or biodegradation characteristics). Oligopeptides are described that have a copolymeric polymer backbone, R2 is a spacer, and L is a linking group, which can be directly treated on the dental implant surface to promote bone growth and shorten bone adhesion.
한국특허출원공개번호 2006-0101019(등록번호 0676945, 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 코팅된 골이식재 및 조직공학용 지지체)은 세포부착 유도 펩타이드 및/또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 표면에 코팅된 골이식재 및 조직공학용 지지체에 관한 것으로서, 특히 골형성 단백질(BMP-2, 4, 6) 유래의 펩타이드를 개시하고 있다. 한국특허출원공개번호 2006-0082060(등록번호 0630903, 표면에 골조직 형성 증진 펩타이드가 코팅된 차폐막 및 임플란트)는 가교제가 결합된 표면에 세포부착유도 펩타이드 또는 조직성장인자 유래 펩타이드가 코팅된 차폐막 및 임플란트에 관한 것으로서 골형성 단백질(BMP-2) 유래의 펩타이드를 개시하고 있다. Korean Patent Application Publication No. 2006-0101019 (Registration No. 0676945, bone graft material coated with a tissue-enhancing peptide on the surface and support for tissue engineering) is a bone graft material coated with a cell-derived peptide and / or tissue growth factor-derived peptide on the surface and The present invention relates to a support for tissue engineering, and particularly discloses peptides derived from bone morphogenetic proteins (BMP-2, 4, 6). Korean Patent Application Publication No. 2006-0082060 (Registration No. 0630903, Bone Membrane Enhancement-coated Penetration Membrane and Implant) is applied to the membrane-induced peptide or tissue growth factor-derived peptide coated membrane and implant on the surface to which the crosslinking agent is bound. A peptide derived from bone morphogenetic protein (BMP-2) is disclosed.
그러나, 상기 문헌들에 기재된 펩타이드는 여전히 초기 골유착 기간의 획기적인 단축에 이르지 못하였다. However, the peptides described in these documents still have not reached a dramatic shortening of the initial osteoadhesion period.
또한, 한국 특허 출원 제2008-0054730호는 초기 골유착 기간을 단축시키고 골 형성을 증진시키는 특정 서열로 이루어진 올리고펩타이드(가장 바람직한 펩타이드로 R1-CKIPKPSSAPTELSAISMLYL-R2('PEP111'이라 함)를 개시하고 있다(본원에서 언급된 상기 모든 특허문헌들은 참조에 의해 이의 전체가 본원에 혼입된다).In addition, Korean Patent Application No. 2008-0054730 discloses oligopeptides (R1-CKIPKPSSAPTELSAISMLYL-R2 as the most preferred peptides, referred to as 'PEP111'), which consist of specific sequences that shorten the initial osteoadhesion period and promote bone formation. (All the above-mentioned patent documents mentioned herein are incorporated herein in their entirety by reference).
그러나 위 특허 출원에 기재된 올리고펩타이드는 BMP-특이적 수용체에 대한 결합 특이성이 매우 낮아 이의 골유착 및 골형성능은 그리 만족할만한 수준이 아니었으며, 따라서, BMP-특이적 수용체(예: BMPR-IA 및 BMPR-II)에 대한 결합 특이성이 높아 초기 골유착 및 골형성능이 우수한 올리고펩타이드의 개발이 여전히 요구되고 있다.However, the oligopeptides described in the above patent applications have very low binding specificities for BMP-specific receptors, so that their osteoadhesion and osteogenic capacity were not satisfactory. Therefore, BMP-specific receptors (eg, BMPR-IA and There is still a need for the development of oligopeptides having high binding specificity to BMPR-II) and excellent initial osteoadhesion and osteogenic ability.
이에 본 발명은 선행 특허인 한국 특허 출원 제2008-0054730호의 올리고뉴클레오티드의 불충분한 BMP-특이적 수용체에 대한 낮은 결합 특이성을 개선시키고자 안출된 것으로 특히 BMPR-IA 및 BMPR-II의 BMP-특이적 수용체에 대한 반응 특이성이 매우 높은 올리고펩타이드를 개발하는 것을 기술적 과제로 한다. Accordingly, the present invention was devised to improve low binding specificity of the oligonucleotide of Korean Patent Application No. 2008-0054730, which is a prior patent, to insufficient BMP-specific receptor, and in particular, BMP-specific of BMPR-IA and BMPR-II. It is a technical task to develop an oligopeptide having a very high reaction specificity for a receptor.
본 발명의 목적은 또한 BMP-특이적 수용체에 대한 반응 특이성이 매우 높은 올리고펩타이드를 개발함으로써 조골세포 증식과 분화도 및 석회화도가 개선되고 골형성도를 증진시키는 새로운 올리고펩타이드를 제공하는 것이다.It is also an object of the present invention to provide new oligopeptides that improve osteoblast proliferation, differentiation and calcification and enhance bone formation by developing oligopeptides with very high response specificity for BMP-specific receptors.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 올리고펩타이드를 치과용 임플란트 표면에 화학적으로 도입시킴으로써 초기 골유착을 증진시켜 임플란트 시술기간을 단축시키는 방법을 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide a method for shortening the implant procedure by enhancing initial bone adhesion by chemically introducing the oligopeptide of the present invention on the dental implant surface.
상기 목적을 달성하기 위하여 예의 실험을 거듭한 결과, 본 발명자들은 특정 서열의 올리고펩타이드가 BMP-특이적 수용체에 대한 반응성이 현저히 높아 조골세포 분화능 및 석회화능을 증진시킴을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.As a result of repeated experiments in order to achieve the above object, the present inventors found that oligopeptide of a specific sequence significantly increased responsiveness to BMP-specific receptors, thereby enhancing osteoblast differentiation and calcification, and completing the present invention. It became.
특히 본 발명은 한국 특허 출원 제2008-0054730호의 대표적 올리고펩타이드인 PEP111에서 특정 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환함으로써 BMP-특이적 수용체에 대한 반응성을 매우 현저하게 개선시킬 수 있었다.In particular, the present invention was able to significantly improve the reactivity to the BMP-specific receptor by substituting an amino acid at a specific position with another amino acid in PEP111, the representative oligopeptide of Korean Patent Application No. 2008-0054730.
본 발명에 따른 올리고펩타이드는 아래 서열번호 1 내지 7의 아미노산 서열로 이루어진 그룹으로 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하며, 생체 내, 바람직하게는 골유착 기간을 단축시키는 임플란트 코팅용으로 사용된다.Oligopeptide according to the invention is characterized in that at least one selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 7, and is used for implant coating in vivo, preferably shortening the bone adhesion period.
서열번호 1 : PEP7 KIPKPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: PEP7 KIPKPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 2 : PEP71 IPKPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: 2 PEP71 IPKPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 3 : PEP72 PKPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: PEP72 PKPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 4 : PEP73 KPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: 4 PEP73 KPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 5 : PEP74 KIPKPSSVPTELSAISMLYSEQ ID NO: 5 PEP74 KIPKPSSVPTELSAISMLY
서열번호 6 : PEP75 KIPKPSSVPTELSAISMLSEQ ID NO: 6 PEP75 KIPKPSSVPTELSAISML
서열번호 7 : PEP76 KIPKPSSVPTELSAISM
SEQ ID NO: 7 PEP76 KIPKPSSVPTELSAISM
또한, 본 발명에 따른 올리고펩타이드는 임플란트, 특히 치과용 임플란트에 적용가능하며, PEP7(서열번호 1), PEP71(서열번호 2), PEP72(서열번호 3), PEP73(서열번호 4), PEP74(서열번호 5), PEP75(서열번호 6) 및 PEP76(서열번호 7)로 이루어진 군중에서 선택된 올리고펩타이드이며, PEP7, PEP71 및 PEP74로 이루어진 군중에서 선택된 올리고펩타이드인 것이 보다 바람직하고, PEP7 또는 PEP71인 것이 더더욱 바람직하며 PEP7인 것이 가장 바람직하다.In addition, the oligopeptide according to the present invention is applicable to implants, in particular dental implants, PEP7 (SEQ ID NO: 1), PEP71 (SEQ ID NO: 2), PEP72 (SEQ ID NO: 3), PEP73 (SEQ ID NO: 4), PEP74 ( More preferably, the oligopeptide is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 5), PEP75 (SEQ ID NO: 6), and PEP76 (SEQ ID NO: 7), and the oligopeptide selected from the group consisting of PEP7, PEP71, and PEP74, and preferably PEP7 or PEP71. Even more preferred is PEP7.
본 발명의 올리고펩타이드는 올리고펩타이드간의 거리를 조골세포의 크기에 따라 제어하고, 상대적 배향을 조절할 수 있도록 담체(matrix)를 함께 도입하는 것이 바람직하다. 또한, 임플란트의 재질인 티타늄 표면에 링커가 전처리되어 있고, 상기 올리고펩타이드는 링커(linker)의 기능기와 결합을 위하여, N 또는 C 말단에 -SH기를 가지는 아미노산, 바람직하게는 시스테인 잔기가 도입될 수 있다.In the oligopeptide of the present invention, it is preferable to control the distance between the oligopeptides according to the size of osteoblasts and to introduce a matrix together to control the relative orientation. In addition, the linker is pretreated on the titanium surface, which is a material of the implant, and the oligopeptide may be introduced with an amino acid, preferably a cysteine residue, having a -SH group at the N or C terminus to bind the functional group of the linker. have.
예컨대, 링커와 관련하여 본 발명의 올리고펩타이드는 각각 그 올리고펩타이드의 N-말단에 시스테인을 지니고 있어서 링커에 의한 임플란트로의 도입이 용이하다. 또한, 본 발명에서는 상기 올리고펩타이드가 임플란트 표면의 티타늄(Ti)과 안정한 상태로 도입되도록 하기 위하여 임플란트 표면에 silane-linker-peptide의 연결 관계로 도입되는 것이 바람직하다.For example, in connection with a linker, the oligopeptides of the present invention each have a cysteine at the N-terminus of the oligopeptide, so that the linker can be easily introduced into the implant. In addition, in the present invention, in order to introduce the oligopeptide into a stable state with titanium (Ti) on the surface of the implant, it is preferable that the oligopeptide is introduced in a silane-linker-peptide linkage relationship.
또한, 본 발명에 따른 올리고펩타이드의 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation) 함으로써 물질의 안정성을 향상시킬 수 있다.In addition, the stability of the substance can be improved by acetylating the N-terminus and / or amidating the C-terminus of the oligopeptide according to the present invention.
본 발명에 따른 올리고펩타이드는 이 기술분야에서 당업자들에게 알려진 제조방법에 따라 쉽게 합성이 가능하다.
Oligopeptides according to the invention can be easily synthesized according to the preparation methods known to those skilled in the art.
본 발명에 따른 올리고펩타이드는 종래 PEP111에 비해 BMP-특이적 수용체에 대한 반응성이 현저히 개선됨으로써 임플란트 표면에 적용시킬 경우 조골세포의 초기 부착, 증식 및 분화에 중요한 역할을 수행하게 될 것이며 최종적으로 골유착 기간을 획기적으로 단축시키고 특히 현재까지 임플란트 시술이 어려운 저골질 환자를 대상으로 시술 영역을 확대시키는데 대단히 유용할 것으로 예측한다.The oligopeptide according to the present invention has a remarkably improved reactivity to BMP-specific receptors compared to the conventional PEP111, and thus will play an important role in the initial attachment, proliferation and differentiation of osteoblasts when applied to the implant surface. It is expected to be very useful for significantly shortening the period and expanding the treatment area, especially in patients with low bone marrow who have difficulty implantation to date.
또한 본 발명은 상기 올리고펩타이드를 차폐막 및 임플란트의 표면에 적용시킬 경우, 표면에 단위면적당 0.1~5.0 mg이 도입되도록 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 올리고펩타이드는 10~21개의 아미노산 함량을 지니며 이들은 임플란트의 표면단위 면적당 0.1~3.0 mg 적용이 적당하다.In addition, when the oligopeptide is applied to the surface of the shielding membrane and the implant, the present invention preferably introduces 0.1 to 5.0 mg per unit area on the surface, and more preferably the oligopeptide has a content of 10 to 21 amino acids. It is appropriate to apply 0.1 ~ 3.0 mg per surface unit area of implant.
본 발명에 따른 올리고펩타이드는 종래에 공지된 방법(예컨대 상기 언급한 관련 특허출원) 또는 본 발명의 방법에 따라 임플란트 표면에 적용할 수 있다. 이때, 매트릭스나 링커의 사용이 가능하다. 상기 종래 출원에는 임플란트 표면의 개질방법, 가교제의 이용방법, 매트릭스의 이용방법, silane-linker-peptide 연결 방법, 올리고펩타이드의 코팅방법 등이 기재되어 있다.
The oligopeptides according to the invention can be applied to the implant surface according to methods known in the art (such as the related patent applications mentioned above) or the methods of the invention. At this time, it is possible to use a matrix or a linker. The conventional application describes a method of modifying the implant surface, a method of using a crosslinking agent, a method of using a matrix, a silane-linker-peptide linking method, a coating method of an oligopeptide, and the like.
본 발명에서 사용하는 상기 1문자 코드는 이 기술분야에서 통용되는 문자코드이며, 그 내용은 아래와 같다.The one-character code used in the present invention is a character code commonly used in the art, the contents of which are as follows.
본 발명의 올리고펩타이드는 BMP-특이적 수용체에 대한 반응 특이성이 매우 높은 물질이므로, 조골세포 분화도 및 석회화도가 증가되어 골충진제 없이도 골형성 효과를 얻을 수 있다. 본 발명을 이용한 임플란트는 임플란트 표면에 박막 처리된 올리고펩타이드의 지속적인 작용으로 인한 조골세포의 유인, 기능 증가를 유발시킴으로써 초기 골유착 기간 단축, 저골질 환자의 시술 성공률 증대, 골량이 부족한 경우 골충진제 없이 골형성 가능, 시술 비용 절감을 가져올 수 있다.Since the oligopeptide of the present invention has a very high response specificity for BMP-specific receptors, osteoblast differentiation and calcification are increased, and thus, bone formation effects can be obtained without a bone filler. Implants using the present invention induced osteoblasts due to the continuous action of the oligopeptides on the surface of the implant, causing the osteoblasts to increase the function, shorten the initial bone adhesion period, increase the success rate of low bone patients, without bone filler Possible bone formation, it can bring down the cost of the procedure.
도 1은 올리고펩타이드 물질에 대한 BMP 특이 수용체 (BMPR-1A, BMP-II)에 대한 결합능을 나타낸 그래프이다. 도 1에서 흰색 막대는 BMPR-1A에 대한 결합능을 나타내고, 검정색 막대는 BMPR-II에 대한 결합능을 나타낸다.
도 2는 올리고펩타이드 물질에 대한 조골세포의 초기 세포분화능 지표인 알칼라인포스파타아제 활성도 (Alkaline phosphatase activity)를 비교한 그래프이다.
도 3은 올리고펩타이드 물질에 대한 조골세포의 후기 세포분화능 지표인 오스테오칼신 생성능 (osteocalcin production)을 비교한 그래프이다.
도 4는 올리고펩타이드 물질에 대한 조골세포의 후기 세포분화능 지표인 오스테오폰틴 생성능 (osteopontin production)을 비교한 그래프이다.
도 5는 올리고펩타이드 물질에 대한 조골세포의 골분화에 의한 세포외기질의 석회화능 (Mineralization)을 도시한 도면이다.1 is a graph showing the binding capacity for BMP specific receptors (BMPR-1A, BMP-II) to the oligopeptide material. In FIG. 1, white bars show binding to BMPR-1A, and black bars show binding to BMPR-II.
2 is a graph comparing alkaline phosphatase activity, which is an early cell differentiation index of osteoblasts to oligopeptide material.
FIG. 3 is a graph comparing osteocalcin production, which is an indicator of late cell differentiation ability of osteoblasts against oligopeptide material.
4 is a graph comparing osteopontin production, which is an indicator of late cell differentiation ability of osteoblasts against oligopeptide material.
Figure 5 is a diagram showing the calcification (Mineralization) of the extracellular matrix by osteoblast differentiation of osteoblasts to the oligopeptide material.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 치환 및 균등한 타 실시예로 변경할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on the following examples. However, the following examples are only for illustrating the present invention, and the present invention is not limited to the following examples and may be changed to other embodiments equivalent to substitutions and equivalents without departing from the technical spirit of the present invention. Will be apparent to those of ordinary skill in the art.
<실시예 1> 올리고펩타이드의 제작Example 1 Preparation of Oligopeptides
올리고펩타이드의 합성은 Fmoc/tBu 방법에 의하며, 합성 종결 후 HPLC를 수행하여 95% 이상의 순도로 정제하였다. 최종 정제된 물질의 분자량은 NMR로 확인하였다.Synthesis of the oligopeptide was performed by Fmoc / tBu method, and purified by 95% or more purity by performing HPLC after completion of synthesis. The molecular weight of the final purified material was confirmed by NMR.
구체적으로, 선정된 올리고펩타이드 서열은 다음과 같다.Specifically, the selected oligopeptide sequence is as follows.
서열번호 1 : PEP7 KIPKPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: PEP7 KIPKPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 2 : PEP71 IPKPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: 2 PEP71 IPKPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 3 : PEP72 PKPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: PEP72 PKPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 4 : PEP73 KPSSVPTELSAISMLYLSEQ ID NO: 4 PEP73 KPSSVPTELSAISMLYL
서열번호 5 : PEP74 KIPKPSSVPTELSAISMLYSEQ ID NO: 5 PEP74 KIPKPSSVPTELSAISMLY
서열번호 6 : PEP75 KIPKPSSVPTELSAISMLSEQ ID NO: 6 PEP75 KIPKPSSVPTELSAISML
서열번호 7 : PEP76 KIPKPSSVPTELSAISM
SEQ ID NO: 7 PEP76 KIPKPSSVPTELSAISM
아래에서는 상기 펩타이드들 중 서열번호 1의 PEP7에 대하여 활성의 우수성을 측정하였다.
Below was measured the excellence of activity for PEP7 of SEQ ID NO: 1 of the peptides.
실험예 1. BMP 특이 수용체 결합능 (BMP specific binding assay) 평가Experimental Example 1. Evaluation of BMP specific binding assay
PEP7 (1mg/well)을 ELISA용 Plate에 넣고 4℃에서 12시간 PEP7을 코팅시킨 후 BMPR-1A 혹은 BMPR-II (1mg/well)를 넣고 상온에서 2시간 반응하여 PEP7-BMP 수용체 결합시켰다. BMP 수용체 (0.5mg BMPR-1A, BMPR-11)를 인식하는 1차 항체를 넣고 상온에서 1시간 반응 후 2차 항체 (BMPR-1A- 혹은 BMPRII-Fc Ab-HRP)를 넣고 상온에서 1시간 반응시켰다. ABTS를 넣고 상온에서 30분 반응 시킨 후 595nm에서 흡광도를 측정하였다. (도 1 참조). 도 1에서 PEP111(A)은 PEP111의 9번째 아미노산이 alanine인 경우이며 PEP111(P)는 alanine 대신 proline으로 치환한 경우이고 PEP111(T)는 alanine 대신 threonine으로 치환한 서열을 의미한다. 실험 결과 본 발명의 올리고펩타이드의 BMP 특이수용체 결합능이 PEP111에 비해 약 23% 정도 더 높았다. 이 결과로부터 본 발명에 따른 올리고펩타이드가 PEP111에 비해 BMP 특이수용체 결합능이 훨씬 월등함을 확인할 수 있다.
PEP7 (1mg / well) was placed in an ELISA plate and coated with PEP7 at 4 ° C. for 12 hours, then BMPR-1A or BMPR-II (1mg / well) was added and reacted at room temperature for 2 hours to bind PEP7-BMP receptor. Add a primary antibody that recognizes BMP receptors (0.5mg BMPR-1A, BMPR-11) and react at room temperature for 1 hour, and then add a secondary antibody (BMPR-1A- or BMPRII-Fc Ab-HRP) for 1 hour at room temperature I was. After ABTS was added and reacted at room temperature for 30 minutes, absorbance was measured at 595 nm. (See Figure 1). In FIG. 1, PEP111 (A) is the case where the 9th amino acid of PEP111 is alanine, PEP111 (P) is substituted by proline instead of alanine, and PEP111 (T) means a sequence substituted by threonine instead of alanine. As a result, the BMP specific receptor binding capacity of the oligopeptide of the present invention was about 23% higher than that of PEP111. From this result, it can be seen that the oligopeptide according to the present invention is far superior to BMP specific receptor binding capacity compared to PEP111.
실험예 2.Experimental Example 2. 초기 세포분화능 평가Early cell differentiation evaluation
조골세포의 초기 분화 마커인 ALP (alkaline phosphatase) 활성을 비교하여 올리고펩타이드가 조골세포의 분화에 미치는 영향을 관찰하였다. 조골세포의 분화능을 비교하기 위하여 MG63을 24well plate에 1x105 cells씩 분주하여 1일간 배양한 후 분화용 배지에 본 발명의 올리고펩타이드 PEP7, 양성대조군인 BMP-2 및 PEP111을 각각 처리하여 37℃, CO2 배양기에 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였으며 배양 3일째, 8일째 ALP 활성을 측정하였다.(도 2 참조) 이 실험에서 본 발명의 올리고펩타이드는 종래 PEP111에 비해 약 20% 증가된 ALP 활성을 나타냄으로써 조골세포의 분화능이 본 발명에서 현저히 개선되었음을 확인할 수 있다.
The effect of oligopeptide on osteoblast differentiation was compared by comparing ALP (alkaline phosphatase) activity, an early differentiation marker of osteoblasts. In order to compare the differentiation capacity of osteoblasts, MG63 was incubated for 1 day by dispensing 1x10 5 cells in a 24well plate, and then treated with the oligopeptide PEP7, BMP-2 and PEP111 of the present invention in differentiation medium, respectively, at 37 ° C. Cultured in a
실험예 3 및 4. 후기 세포분화능 평가 Experimental Example 3 and 4. Evaluation of late cell differentiation capacity
조골세포의 분화 후기 마커인 oteocalcin 및 osteopontin의 생성량을 비교하여 본 발명에 따른 올리고펩타이드 PEP7이 조골세포에 미치는 영향을 관찰하였다. 배양 조건은 상기와 동일하며 배양 14일째 배양액을 회수하여 배양액 내에 존재하는 oteocalcin 및 osteopontin의 양을 human ELISA kit를 사용하여 측정하였다. (도 3 및 도 4 참조) 이 실험에서 본 발명의 올리고펩타이드는 종래 PEP111에 비해 oteocalcin 생성량은 약 14% 개선되었고, osteopontin의 생성량은 약 21% 개선되어 후기 세포분화능에 대해 본 발명에 따른 올리고펩타이드가 PEP111에 비해 훨씬 높음을 확인할 수 있다.
The effects of oligopeptide PEP7 on osteoblasts according to the present invention were observed by comparing the production of oteocalcin and osteopontin, which are late markers of osteoblast differentiation. The culture conditions were the same as above, and the amount of oteocalcin and osteopontin present in the culture medium was collected using the human ELISA kit at 14 days of culture. (See FIG. 3 and FIG. 4) In this experiment, the oligopeptide of the present invention improved about 14% oteocalcin production compared to the conventional PEP111, and about 21% improved osteopontin production, resulting in oligopeptide according to the present invention for late cell differentiation ability. Is much higher than PEP111.
실험예 5. 석회화능 평가Experimental Example 5. Evaluation of Calcification Capability
올리고펩타이드에 의한 조골세포의 골분화가 잘 진행되었는지를 확인하기 위하여 세포외 기질의 석회화 정도를 관찰하였다. 배양 조건은 상기와 동일하며 배양 14일째, 21일째 Alzarin red S 염색법으로 석회화 정도를 비교 평가하였다. (도 5 참조) 실험 결과 배양 14일째에서 본 발명의 올리고펩타이드의 석회화능은 PEP111에 비해 약 19% 더 높았다. 이로써 본 발명에 따른 올리고펩타이드에 의한 골분화가 개선된 양태로 진행되었음을 확인할 수 있다.
The degree of calcification of the extracellular matrix was observed to determine whether osteoblast differentiation was well progressed by the oligopeptide. Culture conditions were the same as above, and the degree of calcification was evaluated by Alzarin red S staining at 14 days and 21 days of culture. Experimental results The calcification capacity of the oligopeptide of the present invention on
앞에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 올리고펩타이드는 종래 PEP111보다 BMP-특이적 수용체에 대한 반응 특이성이 매우 높은 올리고펩타이드로써 조골세포 분화도 및 석회화도가 증가되어 이로써 골충진제 대체 효과 및 골형성 효과가 향상될 것으로 예상된다.As described above, the oligopeptide of the present invention is an oligopeptide having a higher response specificity to a BMP-specific receptor than the conventional PEP111, and thus, osteoblast differentiation and calcification are increased, thereby improving bone filler replacement effect and bone formation effect. It is expected.
본 발명의 올리고펩타이드는 우수한 BMP 특이수용체 결합능을 가지므로 조골세포의 분화를 증대시킨다. 따라서, 본 발명의 올리고펩타이드를 임플란트 표면에 박막 코팅할 경우 초기 골유착 기간 단축, 골질이 나쁜 환자의 시술 성공률 증대 및 골량이 부족한 경우 골충진제 없이 골형성이 가능하다.
The oligopeptide of the present invention has excellent BMP specific receptor binding ability and thus increases osteoblast differentiation. Therefore, when the oligopeptide of the present invention is coated with a thin film on the implant surface, it is possible to shorten the initial osteoadhesion period, increase the success rate of patients with poor bone quality, and bone formation without bone filler when the amount of bone is insufficient.
서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100018148A KR100999831B1 (en) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | Oligopeptide having improved osteoblastic differentiation ability |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020100018148A KR100999831B1 (en) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | Oligopeptide having improved osteoblastic differentiation ability |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR100999831B1 true KR100999831B1 (en) | 2010-12-09 |
Family
ID=43512618
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020100018148A KR100999831B1 (en) | 2010-02-26 | 2010-02-26 | Oligopeptide having improved osteoblastic differentiation ability |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100999831B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012165900A3 (en) * | 2011-06-03 | 2013-03-28 | 전남대학교병원 | Peptide bfp 4 for promoting bone formation or vasculogenesis, and application therefor |
-
2010
- 2010-02-26 KR KR1020100018148A patent/KR100999831B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ‘새로운 합성 펩타이드 PEP7의 골유도 및 골형성능에 관한 연구’(2009.12, 최규옥, 고려대학교 대학원) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012165900A3 (en) * | 2011-06-03 | 2013-03-28 | 전남대학교병원 | Peptide bfp 4 for promoting bone formation or vasculogenesis, and application therefor |
| KR101274930B1 (en) | 2011-06-03 | 2013-06-17 | 전남대학교산학협력단 | Bone forming peptide 4 for promoting osteogenesis or vascularization and use thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8846860B2 (en) | Methods of decorating hydroxyapatite biomaterials with modular biologically active molecules | |
| US8853164B2 (en) | Oligopeptide improving differentiation of osteoblasts | |
| JP2009011323A (en) | Polypeptide variant with raised heparin-binding capacity | |
| CA2269655C (en) | Peptide compositions with growth factor-like activity | |
| CA2569864A1 (en) | Ifbm's to promote attachment of target analytes | |
| AU2006314713B2 (en) | High activity growth factor mutants | |
| ES2643604T3 (en) | Peptide that has the ability to regenerate bone tissue and bind to apatite | |
| Oliver‐Cervelló et al. | Mimicking Bone Extracellular Matrix: From BMP‐2‐Derived Sequences to Osteogenic‐Multifunctional Coatings | |
| KR100999831B1 (en) | Oligopeptide having improved osteoblastic differentiation ability | |
| US7803905B2 (en) | Bioactive peptide for cell adhesion | |
| KR101944517B1 (en) | Dual functional peptide for cell penetration and bone tissue regeneration and use of the same | |
| KR20130110606A (en) | Polypeptide with chondrogenic activity of stem cell | |
| KR100879704B1 (en) | Oligopeptide for enhancing osteointegration and bone formation | |
| KR20140100969A (en) | GDF-5 mutant for inducing cartilage formation | |
| CN110072877B (en) | Peptides with titanium binding capacity | |
| JP4798560B2 (en) | Laminin 5B | |
| Wu | Beta-sheet peptide-mediated self-assembly of HPMA copolymers into nanostructured biomaterials | |
| WO1995008566A1 (en) | Novel peptide | |
| Kim et al. | Substrate-immobilized bone morphogenic protein-7 peptides on titanium surface support the expression of extracellular matrix proteins | |
| SCHULTZ-CHERRY et al. | AND JOANNE E. MURPHY-ULLRICH |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| A302 | Request for accelerated examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131031 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141203 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151127 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171026 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181001 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190402 Year of fee payment: 10 |