KR100999040B1 - A method for enhancing production of monomeric human interferon?? using a transformed cell line transfected by a vector which express human interferon?? - Google Patents
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Abstract
본 발명은 인간 인터페론 베타(interferon-β)를 발현하는 벡터를 도입한 형질전환 세포주를 이용하여 목적 단백질인 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시키는 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 인간 인터페론 베타를 발현하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주를 고삼투압 환경, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서 배양하여 인간 인터페론 베타의 집합화 현상(aggregation)을 줄임으로써 인간 인터페론 베타 중합체보다 활성화도가 상대적으로 높은 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for enhancing the production of human interferon beta monomer, a protein of interest, using a transformed cell line into which a vector expressing human interferon beta (beta) is expressed. Human interferon by reducing the aggregation of human interferon beta by culturing CHO (Chinese hamster ovary) cell line transformed with a vector containing the gene to be expressed in a high osmotic environment or an environment in which high osmotic pressure and low temperature are applied together The present invention relates to a method capable of enhancing the production of a human interferon beta monomer having a higher degree of activation than a beta polymer.
인간 인터페론 베타, 재조합 CHO 세포, 고삼투압 Human interferon beta, recombinant CHO cells, hyperosmotic pressure
Description
본 발명은 인간 인터페론 베타(interferon-β)를 발현하는 벡터를 도입한 형질전환 세포주를 이용하여 목적 단백질인 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시키는 방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 인간 인터페론 베타를 발현하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 CHO(Chinese hamster ovary) 세포주를 고삼투압 환경, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서 배양하여 인간 인터페론 베타의 집합화 현상(aggregation)을 줄임으로써 인간 인터페론 베타 중합체보다 활성화도가 상대적으로 높은 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시킬 수 있는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for enhancing the production of human interferon beta monomer, a protein of interest, using a transformed cell line into which a vector expressing human interferon beta (beta) is expressed. Human interferon by reducing the aggregation of human interferon beta by culturing CHO (Chinese hamster ovary) cell line transformed with a vector containing the gene to be expressed in a high osmotic environment or an environment in which high osmotic pressure and low temperature are applied together The present invention relates to a method capable of enhancing the production of a human interferon beta monomer having a higher degree of activation than a beta polymer.
최근에는 당쇄화(glycosylation) 등과 같은 단백질의 번역 후 수정 및 수식 과정(post-translational modification)을 통한 기능적인 전체 항체분자의 생산을 위해서는 동물 세포를 발현숙주로 사용하는 것이 적합하다고 알려져 있으며, 특히 유전자 증폭된 CHO(chinese hamster ovary) 세포가 가장 널리 사용되고 있다. CHO 세포주는 현재 재조합 항체를 포함하여 여러 종류의 치료용 단백질을 생산하는데 가장 많이 이용되고 있다. 재조합 CHO 세포를 사용하여 목적 단백질을 생산할 때에는 단위 시간당 살아있는 세포로부터 얼마나 많은 양의 단백질이 생산되는가를 표시하는 비생산 속도가 중요한데 이것은 세포 배양시의 pH, 온도 및 삼투압 등의 환경 인자들에 따라 영향을 받는다. 또한, 상기 환경 인자들은 단백질의 감성(degradation)과 집합화 현상(aggregation)에 관여하게 되어 단백질의 질과 안정성에 영향을 끼친다.Recently, it is known to use animal cells as expression hosts for the production of functional whole antibody molecules through post-translational modification and modification of proteins such as glycosylation. Amplified Chinese hamster ovary (CHO) cells are the most widely used. CHO cell lines are currently most commonly used to produce several therapeutic proteins, including recombinant antibodies. When producing a target protein using recombinant CHO cells, the specific production rate, which indicates how much protein is produced from living cells per unit time, is important, depending on environmental factors such as pH, temperature and osmotic pressure in cell culture. Receives. In addition, the environmental factors are involved in protein degradation and aggregation, affecting protein quality and stability.
삼투압은 동물 세포 배양의 중요한 환경 인자 중의 하나이다. 세포 배양 배지의 삼투압은 일반적으로 260 ~ 320 mOsm/kg을 나타낸다. 고삼투압 환경은 염(salt) 또는 당(sugar)을 배지에 첨가함으로써 쉽게 만들어질 수 있는데 고삼투압 환경에서 비생산 속도가 올라가기 때문에 비생산 속도를 올리기 위한 경제적이고 간편한 배양 방법으로 고삼투압이 쓰이고 있다. 그러나 고삼투압 환경에서 증가하는 비생산 속도에 비하여 세포 성장은 저해되기 때문에 최종 생산물의 농도는 큰 차이가 생기지 않는다. 재조합 CHO 세포에 의하여 목적 단백질을 생산하는 경우, 목적 단백질의 최종농도는 목적 단백질을 생산하는 살아 있는 세포의 농도와 비생산 속도의 영향을 받게 되기 때문이다(최종 생산물 농도 = 세포 농도 × 비생산 속도). 이런 문제점을 극복하기 위하여 세포를 고삼투압 환경에 적응시키기, 삼 투보호제(osmoprotectant) 첨가하기 및 2단계(two-stage) 배양 등의 방법을 사용하여 세포 성장을 높이고 있다.Osmotic pressure is one of the important environmental factors in animal cell culture. Osmotic pressure of the cell culture medium generally represents 260-320 mOsm / kg. The high osmotic pressure environment can be easily created by adding salt or sugar to the medium. The high osmotic pressure is used as an economical and convenient cultivation method to increase the non-productive rate because the high production rate increases in the high osmotic pressure environment. have. However, there is no significant difference in the final product concentration because cell growth is inhibited relative to the increased specific production rate in high osmotic environments. When the target protein is produced by recombinant CHO cells, the final concentration of the target protein is affected by the concentration and specific production rate of living cells producing the target protein (final product concentration = cell concentration × specific production rate). ). In order to overcome this problem, the cell growth is enhanced by adapting the cells to a high osmotic environment, adding an osmoprotectant, and two-stage culture.
또한, 온도는 동물 세포 배양의 중요 환경 인자이다. 대부분의 동물 세포 배양은 체내의 환경과 비슷한 37℃에서 이루어진다. 37℃ 아래의 저온 배양에서는 세포 성장이 저해되지만, 여러 가지의 장점이 있는데 37℃에 비하여 긴 기간 동안 높은 생존율(viability) 유지, 비생산 속도 증가, 물질대사속도 감소, 생산물질 상승 및 세포의 내구력 증가 등이 있다. 그러나 상기 효과들은 세포의 유형이나 목적 단백질의 종류에 따라 달라진다.Temperature is also an important environmental factor in animal cell culture. Most animal cell cultures take place at 37 ° C., similar to the environment in the body. Cell growth is inhibited in low temperature culture below 37 ° C, but there are several advantages compared to 37 ° C, which have higher viability, longer specific production rate, reduced metabolism rate, increased production and cell durability compared to 37 ° C. Increase, etc. However, the effects vary depending on the type of cell or the type of protein of interest.
인간 인터페론 베타(interferon-β)는 바이러스의 감염에 의해 생성된다고 알려져 있으며 다발성 경화증의 치료제로 쓰이고 있는 사이토카인(cytokine)이다. 인간 인터페론 베타와 이의 수용기의 결합으로 인해 발현되는 유전자는 항바이러스성, 항증식성 및 면역조절의 활성을 나타낸다. 인간 인터페론 베타는 두 종류가 있는데 인간 인터페론 베타-1a형과 인간 인터페론 베타-1b형이 있다. 상기 인간 인터페론 베타-1a형은 CHO 세포 등의 동물 세포에서 발현되어 당쇄화되며, 상기 인간 인터페론 베타-1b형은 대장균에서 생산되어 당쇄가 없다. 인간 인터페론 베타는 166개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 당쇄의 유무에 따라 18 kDa 또는 25 kDa의 분자량을 가진다. 인간 인터페론 베타는 당쇄가 없으면 집합화 현상이 일어나 용해도뿐만 아니라 활성도 감소하게 된다. 인간 인터페론 베타는 당쇄화가 일어났을 때 상기 당쇄에 의해서 가려지는 소수성의 아미노산 부분이 수성의 용매에 노출됨으로써 이 부분을 다시 가리기 위하여 집합화 현상이 일어난다. 이런 현상은 회분식 배양에서 얻어진 시료들을 변성시켜 효소결합면역흡수법(ELISA) 또는 특수단백질검출검사(Western blot)를 시행했을 때 변성시키지 않았을 때보다 농도가 늘어나는 현상을 통하여 입증되었다.Human interferon beta (interferon-β) is a cytokine known to be produced by viral infections and is used as a treatment for multiple sclerosis. Genes expressed due to the binding of human interferon beta and its receptors exhibit antiviral, antiproliferative and immunomodulatory activity. There are two types of human interferon beta, human interferon beta-1a and human interferon beta-1b. The human interferon beta-1a type is expressed in animal cells such as CHO cells and glycosylated, and the human interferon beta-1b type is produced in Escherichia coli and has no sugar chains. Human interferon beta consists of 166 amino acids and has a molecular weight of 18 kDa or 25 kDa, depending on the presence or absence of sugar chains. In the absence of sugar chains, human interferon beta causes aggregation to decrease not only solubility but also activity. When human interferon beta is glycosylated, the hydrophobic amino acid moiety occluded by the sugar chain is exposed to an aqueous solvent so that aggregation occurs to cover the moiety again. This phenomenon was demonstrated by denaturing samples obtained from batch cultures and increasing concentrations than without denaturation when enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or Western blot was performed.
지금까지 인터페론 베타 생산에 관한 보고에는, 미국특허 제 5,814,485호에서는 대장균에서의 인터페론 베타 생산 방법이 기재되어 있고, 미국특허번호 제 5,795,779호에서는 인간 인터페론 베타를 생산하는 CHO 세포주, 및 상기 세포주를 배양할 수 있는 배지가 기재되어 있다. 또한, CHO 세포를 이용한 인간 인터페론 베타 생산시에 야기되는 인간 인터페론 베타의 집합화 현상, 및 상기 현상을 감소시키기 위하여 글리세롤을 첨가하거나 저온배양을 이용하는 방법이 보고된 바 있고(Rodriguez, J. et al ., Biotechnol. Prog., 21(1):22-30, 2005), 다공성미립담체(macroporous microcarrier)를 사용하는 방법이 보고된 바 있었다(Spearman, M. et al ., Biotechnol . Prog., 21(1):31-39, 2005). 그러나 배지의 삼투압을 증가시킨 고삼투압 환경, 또는 상기 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경을 이용하여 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 감소시킴으로써 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시킬 수 있는 방법에 대해서는 어디에도 보고된 바 없다. So far, reports on the production of interferon beta, US Pat. No. 5,814,485 describes a method for producing interferon beta in E. coli, US Pat. No. 5,795,779 describes CHO cell lines producing human interferon beta, and the cell line A medium which can be described is described. In addition, there has been a report on aggregation of human interferon beta caused by production of human interferon beta using CHO cells, and a method of adding glycerol or using low temperature culture to reduce the phenomenon (Rodriguez, J. et. al ., Biotechnol . Prog., 21 (1): 22-30, 2005), a method of using a macroporous microcarrier has been reported (Spearman, M. et al ., Biotechnol . Prog., 21 (1): 31-39, 2005). However, there is no report on how to increase the production of human interferon beta monomer by reducing the aggregation of human interferon beta using the high osmotic pressure environment that increased the osmotic pressure of the medium, or the environment combined with the high osmotic pressure and low temperature. It has not been done.
이에, 본 발명자들은 재조합 CHO 세포의 배양을 통하여 인간 인터페론 베타의 생산을 증강시키는 방법을 개발하고자, 인간 인터페론 베타를 발현하도록 형질 전환된 재조합 CHO 세포주를 고삼투압 환경에서, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서 배양하여 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 줄임으로써, 인간 인터페론 베타 중합체보다 활성화도가 상대적으로 높은 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have developed a method for enhancing the production of human interferon beta through the culture of recombinant CHO cells, the recombinant CHO cell line transformed to express human interferon beta in a high osmotic environment, or high osmotic pressure and low temperature together The present invention was completed by confirming that by culturing in an applied environment to reduce the aggregation of human interferon beta, it is possible to enhance the production of human interferon beta monomer, which is relatively higher in activation than human interferon beta polymer.
본 발명의 목적은 인간 인터페론 베타(interferon-β)를 발현하도록 형질 전환된 세포주를 고삼투압 환경, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서 배양하여 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시키는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a method for enhancing the production of human interferon beta monomer by culturing a cell line transformed to express human interferon beta (interferon-β) in a high osmotic pressure environment, or a combination of high osmotic pressure and low temperature will be.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인간 인터페론 베타(interferon-β)를 발현하도록 형질전환된 세포주를 고삼투압 환경의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론 베타 단량체(monomer)의 생산 증강 방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for enhancing the production of human interferon beta monomer (monomer) comprising the step of culturing the cell line transformed to express human interferon beta (interferon-β) in a medium of high osmotic pressure environment to provide.
또한, 본 발명은 인간 인터페론 베타를 발현하도록 형질전환된 세포주를 고삼투압 환경의 배지에 옮겨 저온으로 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론 베타 단량체의 생산 증강 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for enhancing the production of human interferon beta monomers comprising the step of culturing at low temperature by transferring the cell line transformed to express human interferon beta in a medium of high osmotic pressure environment.
본 발명은 고삼투압 환경에서, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서 재조합 CHO 세포를 배양하여 인간 인터페론 베타를 생산하는데 있어서 발생하는 문제인 인간 인터페론 베타의 집합화 현상(aggregation)을 줄임으로써 단량체가 중합체로 변화하는 속도를 줄일 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 인간 인터페론 베타 중합체보다 활성화도가 상대적으로 높은 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시킬 수 있으므로 인간 인터페론 베타를 생산하는 관련 산업분야의 산업적 이용에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention provides a monomer polymer by reducing the aggregation of human interferon beta, which is a problem that occurs in the production of human interferon beta by culturing recombinant CHO cells in a high osmotic environment or an environment where high osmotic pressure and low temperature are applied together. This can reduce the speed of change. Therefore, the method of the present invention can enhance the production of human interferon beta monomers, which are relatively higher in activation than human interferon beta polymers, and thus can be usefully used for industrial use in related industries producing human interferon beta.
이하, 본 발명에 관련된 용어를 정의한다.Hereinafter, terms related to the present invention are defined.
본 발명에 있어서, 용어 '집합화 현상(aggregation)'이란 인간 인터페론 베타 분자들이 배양이 지남에 따라 인간 인터페론 베타 단량체들이 모여 중합체로 뭉치는 현상을 의미한다.In the present invention, the term 'aggregation' refers to a phenomenon in which human interferon beta molecules are collected and aggregated into a polymer as the culture passes.
본 발명에 있어서, 용어 '고삼투압 환경(hyperosmotic condition)'이란 CHO 세포를 배양하는 배지에 염화나트륨(NaCl) 등을 첨가하여 배지의 일반적인 삼투압(260 ∼ 320 mOsm/kg) 보다 삼투압이 높게 만들어진 스트레스 환경을 의미한다.In the present invention, the term 'hyperosmotic condition' refers to a stress environment in which the osmotic pressure is higher than the general osmotic pressure (260-320 mOsm / kg) of the medium by adding sodium chloride (NaCl) to the medium for culturing CHO cells. Means.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.
본 발명은 인간 인터페론 베타(interferon-β)를 발현하도록 형질전환된 세포주를 고삼투압 환경의 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론 베타 단량체(monomer)의 생산 증강 방법을 제공한다.The present invention provides a method for enhancing production of human interferon beta monomers comprising culturing a cell line transformed to express human interferon beta (beta) in a medium of high osmotic pressure.
상기 방법에 있어서, 상기 세포주는 CHO, VERO, BHK, HeLa, Cv1, MDCK, 293, 3T3, 미엘로마(myeloma), PC12 및 WI38로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하고, CHO 세포를 이용하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않으며 인간 인터페론 베타를 발현하는 유전자로 형질전환 또는 형질주입될 수 있는 동물 세포는 모두 이용가능하다. 상기 CHO 세포는 벡터에 클로닝 되어있는 인간 인터페론 베타 유전자를 DHFR/MTX 시스템으로 유전자 증폭반응을 하기 위하여 DHFR 유전자가 결실된 CHO 세포주를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the cell line preferably uses any one selected from the group consisting of CHO, VERO, BHK, HeLa, Cv1, MDCK, 293, 3T3, myeloma, PC12 and WI38, and uses CHO cells. Most preferably, but not limited to, all animal cells that can be transformed or transfected with genes expressing human interferon beta are available. The CHO cell is preferably a CHO cell line in which the DHFR gene is deleted in order to amplify the human interferon beta gene cloned in the vector into the DHFR / MTX system, but is not limited thereto.
상기 방법에 있어서, 상기 배지는 무혈청 배지인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며 세포주에 적합한 영양소 및 필요 요소를 포함하는 배지는 모두 이용가능하다.In the method, the medium is preferably a serum-free medium, but is not limited thereto, and any medium containing nutrients and necessary elements suitable for cell lines may be used.
상기 방법에 있어서, 상기 고삼투압 환경은 염화나트륨(sodium chloride), 구연산나트륨(sodium citrate), 인산나트륨(sodium phosphate) 및 황산암모늄(ammonium sulfate)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 첨가하여 만드는 것이 바람직하고, 염화나트륨을 첨가하여 조성하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않으며 삼투압 증가에 적합한 염 또는 당은 모두 이용가능하다(Chen, B. L. and Arakawa, T., J. Pharm . Sci ., 85(4):419-426, 1996). 상기 고삼투압 환경은 배지의 삼투압은 350 내지 550 mOsm/kg인 것이 바람직하고, 470 mOsm/kg인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the method, the high osmotic environment is preferably made by adding at least one selected from the group consisting of sodium chloride, sodium citrate, sodium phosphate and ammonium sulfate. More preferably, but not limited to, salts or sugars suitable for increasing osmotic pressure are available (Chen, BL and Arakawa, T., J. Pharm . Sci ., 85 (4): 419-426, 1996). In the high osmotic pressure environment, the osmotic pressure of the medium is preferably 350 to 550 mOsm / kg, and most preferably 470 mOsm / kg, but is not limited thereto.
또한, 본 발명은 인간 인터페론 베타를 발현하도록 형질전환된 세포주를 고삼투압 환경의 배지에 옮겨 저온으로 배양하는 단계를 포함하는 인간 인터페론 베타 단량체의 생산 증강 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for enhancing the production of human interferon beta monomers comprising the step of culturing at low temperature by transferring the cell line transformed to express human interferon beta in a medium of high osmotic pressure environment.
상기 방법에 있어서, 상기 저온 환경은 온도가 30 내지 34℃인 것이 바람직 하고, 32℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the low temperature environment is preferably a temperature of 30 to 34 ℃, most preferably 32 ℃ but is not limited thereto.
상기 방법에 있어서, 상기 배양은 1차적으로 37℃에서 배양을 시작하여 고삼투압 적용시 2차적으로 온도를 낮추어 저온 환경을 적용시키는 2단계 배양인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.In the above method, the culturing is preferably a two-stage culturing to start a cultivation at 37 ℃ first to apply a low-temperature environment by secondly lowering the temperature when applying high osmotic pressure is not limited thereto.
본 발명자들은 미국특허번호 제 5,795,779호에 기재된 바와 같이 제조된 인간 인터페론 베타를 생산하는 재조합 CHO 세포주를 무혈청 배지와 플라스크를 사용하여 배양하였다. We cultured recombinant CHO cell lines producing human interferon beta prepared as described in US Pat. No. 5,795,779 using serum-free medium and flasks.
본 발명자들은 고삼투압이 인간 인터페론 베타 단량체 생산 및 집합화 현상에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 제조한 재조합 CHO 세포를 다양한 삼투압 환경에서 배양한 후 회수한 배지로부터 CHO 세포의 성장과 생존율, 목적 단백질인 인간 인터페론 베타의 집합화 현상 및 생산량의 변화를 조사하였다. 세포의 성장은 현미경으로 세포의 수를 측정하여 계산하였고, 인간 인터페론 베타 단량체의 농도는 효소결합면역흡수법(ELISA)를 통하여 측정하였다. 인간 인터페론 베타를 변성시켜 중합체를 모두 단량체로 바꿔 총 인간 인터페론 베타 단량체농도를 측정함으로써 변성시키지 않아 중합체가 섞여있는 인간 인터페론 베타 단량체농도와 <수학식 1>을 통해서 집합화 현상의 백분율을 측정하였다. 그 결과, 기본 삼투압에 비해 삼투압이 증가할수록 배양 중간 단계까지는 집합화 현상의 값이 감소하였으나 배양 후반부에 들어서는 집합화 현상의 값이 유사하게 나타났다. 이를 통해 고삼투압 환경은 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 완전히 막진 못하지만 집합화 현상의 속도를 늦출 수 있음을 확인하였다. 고삼투압 환경에서 그렇지 않은 환경에 서보다 CHO 세포의 성장은 저해되지만, 비생산속도가 증가하고 집합화 현상의 속도가 느려져 인간 인터페론 베타 단량체의 생산량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 따라서 산업적으로 인간 인터페론 베타 생산시, 회수시기를 조절함으로써 보다 높은 생산량을 얻을 수 있음을 알 수 있다(표 1 및 도 1 참조). In order to investigate the effect of hyperosmotic pressure on the production and aggregation of human interferon beta monomers, the present inventors cultured the recombinant CHO cells prepared in various osmotic environments and recovered the growth and survival rate of CHO cells from the culture medium. Changes in aggregation and production of phosphorus human interferon beta were investigated. Cell growth was calculated by measuring the number of cells under a microscope, the concentration of human interferon beta monomer was measured by enzyme-linked immunosorbent absorption (ELISA). Human interferon beta was denatured to change all polymers to monomers, and the total human interferon beta monomer concentration was not denatured to determine the percentage of aggregation phenomena through <
또한, 본 발명자들은 고삼투압 및 저온 환경이 인간 인터페론 베타 단량체 생산 및 집합화 현상에 미치는 영향을 알아보기 위해, 상기 제조한 재조합 CHO 세포를 온도가 37℃, 32℃, 및 37℃에서 배양한 후 삼투압 변경시 32℃로 변경한 환경에서 배양한 각각의 배지로부터 상기와 동일한 방법으로 CHO 세포의 성장과 생존율, 목적 단백질인 인간 인터페론 베타의 집합화 현상 및 생산량의 변화를 조사하였다. 그 결과, 고삼투압 및 저온 환경에서 그렇지 않은 환경에서보다 CHO 세포의 성장은 저해되지만, 비생산속도가 증가하고 집합화 현상의 속도가 느려져 인간 인터페론 베타 단량체의 생산량이 증가하는 것을 알 수 있었다. 37℃에 비해 32℃일 때 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 감소하였고, 2단계식 37℃→32℃의 환경이 가장 높은 집합화 현상의 감소 및 인간 인터페론 베타 단량체의 생산량 증가를 나타내었다. 저온 환경이 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 감소시킬 수 있다는 보고(Rodriguez, J., et al., Biotechnol. Prog ., 21(1):22-30, 2005)가 있으나, 고삼투압과 저온을 함께 적용시켰을 때, 그 효과는 서로 합쳐져 각각의 환경에서 보다 월등히 집합화 현상을 감소시키고, 인간 인터페론 베타의 생산량을 증가시킬 수 있음을 알 수 있다(도 2 참조). In addition, the inventors of the present invention, in order to determine the effect of high osmotic pressure and low temperature environment on the production and aggregation of human interferon beta monomer, after culturing the prepared recombinant CHO cells at 37 ℃, 32 ℃, and 37 ℃ In the same manner as above, the growth and survival rate of CHO cells, the aggregation phenomenon of human interferon beta, a target protein, and the changes of production were examined from the respective mediums cultured at 32 ° C. when the osmotic pressure was changed. As a result, the growth of CHO cells was inhibited in high osmotic pressure and low temperature environment, but the production rate of human interferon beta monomer was increased by increasing the specific production rate and slowing the aggregation phenomenon. The aggregation of human interferon beta was reduced when compared to 37 ° C. at 32 ° C., and the environment of the two-stage 37 ° C. to 32 ° C. showed the highest reduction of aggregation and increased production of human interferon beta monomer. It has been reported that cold environments can reduce the aggregation of human interferon beta (Rodriguez, J., et al., Biotechnol. Prog ., 21 (1): 22-30, 2005), but high osmotic pressure and low temperature When applied together, the effects can be combined with each other to significantly reduce aggregation in each environment and increase the production of human interferon beta (see FIG. 2).
또한, 본 발명자들은 상기 플라스크 배양에서 보인 비생산속도 증가와 집합 화 현상 감소로 인한 인간 인터페론 베타 단량체 생산량 증가의 현상이 대규모 배양에서도 적용되는지 알아보기 위하여 3 L 동물세포반응기를 사용하여 수행하였다. 그 결과, 상기 대규모 배양에서도 인간 인터페론 베타의 집합화 현상의 감소 및 생산량의 증가가 거의 유사하게 나타났음을 확인하였다. 따라서 산업적으로 인간 인터페론 베타를 생산하는 배양에 적용할 수 있음을 알 수 있다(도 3 참조).In addition, the present inventors carried out using a 3 L animal cell reactor to see whether the increase in the specific production rate and the increase in the production of human interferon beta monomer due to the reduction of aggregation phenomenon in the flask culture is applied to large-scale culture. As a result, it was confirmed that even in the large-scale culture, the reduction of the aggregation of human interferon beta and the increase in production were almost similar. Therefore, it can be seen that it can be applied industrially to the production of human interferon beta (see FIG. 3).
또한, 본 발명자들은 삼투압이 증가함에 따라 인간 인터페론 베타의 집합화 현상이 감소하는 현상이 고삼투압이 된 배지와 세포와의 상호작용 때문인지, 또는 고삼투압이 된 배지와 인간 인터페론 베타 분자와의 상호작용 때문인지를 알아보았다. 우선, 고삼투압에서 배양한 후, 원심분리를 이용하여 세포를 인간 인터페론 베타가 포함된 배지로부터 제거한 다음, 새로운 배지를 첨가하여 다양한 삼투압 및 저온 환경에서 상기와 동일한 방법으로 인간 인터페론 베타의 집합화 현상 및 생산량의 변화를 조사하였다. 그 결과, 세포가 없는 상태에서도 삼투압이 증가함에 따라 인간 인터페론 베타의 집합화 현상이 감소하였고(도 4 참조), 37℃보다는 저온인 32℃에서 인간 인터페론 베타의 집합화 현상이 더 많이 감소하였다. 따라서 인간 인터페론 베타의 집합화 현상의 원인 중의 하나는 열이라는 것을 알 수 있고, 고삼투압 환경에서 감소된 집합화 현상은 세포보다는 인간 인터페론 베타 분자와 배지와의 상호작용에 더 의존한다는 것을 알 수 있다.In addition, the present inventors have found that the decrease in the aggregation of human interferon beta as the osmotic pressure is increased due to the interaction of the medium and cells with high osmotic pressure, or the interaction between the medium and human interferon beta molecules with high osmotic pressure. Determined whether the action. First, after culturing at high osmotic pressure, the cells were removed from the medium containing human interferon beta by centrifugation, and then a new medium was added to collect the human interferon beta in the same manner as described above under various osmotic pressure and low temperature environment. And changes in yield. As a result, in the absence of cells, as the osmotic pressure increases, the aggregation of human interferon beta decreases (see FIG. 4), and the aggregation of human interferon beta decreases more at 32 ° C. than at 37 ° C. Therefore, one of the causes of the aggregation of human interferon beta is heat, and the reduced aggregation in high osmotic environment is more dependent on the interaction of human interferon beta molecules and the medium than the cells. .
또한, 본 발명자들은 인간 인터페론 베타에 당쇄가 없으면 활성이 떨어질 뿐만 아니라 집합화 현상이 당쇄가 있는 분자보다 더 잘 일어난다는 보고(Runkel, L., et al., Pharm. Res ., 15(4):641-649, 1998)가 있기 때문에, 고삼투압 환경에 서 감소되는 집합화 현상이 기본 삼투압 환경보다 당쇄가 있는 인간 인터페론 베타 분자가 더 많아서인지 확인하기 위하여, 상기 실험에서 사용하였던 배지를 이용하여 단백질검출검사인 웨스턴블랏(Western blot)을 수행하였다. 그 결과, 당쇄가 붙은 25 kDa 위치에 있는 밴드와 당쇄가 없는 18 kDa 위치에 있는 밴드와의 비율이 삼투압에 관계없이 유사함을 확인하였다. 따라서 삼투압에 의한 집합화 현상 감소는 인간 인터페론 베타의 당쇄와는 별로 관계가 없음을 알 수 있다(도 5 참조).In addition, the present inventors report that the lack of sugar chains in human interferon beta not only decreases the activity, but also that aggregation occurs better than molecules with sugar chains (Runkel, L., et al., Pharm. Res ., 15 (4)). : 641-649, 1998), the medium used in the experiment was used to determine whether the aggregation phenomenon that is reduced in the high osmotic environment is due to the presence of more human interferon beta molecules with sugar chains than the basic osmotic environment. Western blot, a protein detection test, was performed. As a result, it was confirmed that the ratio of the band at the 25 kDa position with the sugar chain and the band at the 18 kDa position without the sugar chain was similar regardless of the osmotic pressure. Therefore, it can be seen that the decrease in aggregation by osmotic pressure is not related to the sugar chain of human interferon beta (see FIG. 5).
따라서, 본 발명의 인간 인터페론 베타를 발현하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질 전환된 세포주를 고삼투압 환경, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서 배양하는 방법은 목적 단백질인 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 줄이고, 이를 통해 인간 인터페론 베타 중합체보다 활성화도가 상대적으로 높은 인간 인터페론 베타 단량체의 생산을 증강시킬 수 있다.Therefore, the method of culturing the cell line transformed with the vector containing the gene expressing the human interferon beta of the present invention in a high osmotic pressure environment, or an environment in which high osmotic pressure and low temperature are applied is a collection phenomenon of human interferon beta which is a target protein. This can enhance the production of human interferon beta monomers that are relatively more active than human interferon beta polymers.
이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following Examples and Experimental Examples.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.However, the following Examples and Experimental Examples specifically illustrate the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following Examples and Experimental Examples.
<< 실시예Example 1> 인간 인터페론 베타 1> human interferon beta 를To 생산하는 재조합 To produce recombinant CHOCHO 세포의 125 125 of the cells mLmL 플라스크에서의 부유배양 Suspension Culture in Flasks
본 발명자들은 미국특허번호 제 5,795,779호에 기재된 바와 같이 제조된 인 간 인터페론 베타를 생산하는 재조합 CHO 세포(대웅제약, 한국)를 무혈청 배지와 125 mL 플라스크(Corning, Corning, NY)를 사용하여 다양한 삼투압, 온도 환경에서 부유배양을 수행하였다.The inventors have used recombinant CHO cells (Daewoong Pharm., Korea) producing human interferon beta prepared as described in US Pat. No. 5,795,779 using a serum-free medium and a 125 mL flask (Corning, Corning, NY). Suspension culture was performed in an osmotic, temperature environment.
실제 배양 부피는 50 mL이었으며, 무혈청 배지 SFM4CHO(Hyclone, Logan, Utah)에 100 nM MTX와 4 mM 글루타민을 첨가하여 2주간 회분식 배양을 하였다. 교반기(Vision, Gyeonggi-do, South Korea)의 속도는 110 rpm이었으며, 초기 세포 농도는 2.0 × 105 cells/mL로 접종하였다. 고삼투압을 적용하기 위해서, 37℃ 배양에서는 배양 시작 후 2일째, 32℃ 배양에서는 배양 시작 후 5일째인 성장(mid-exponential) 단계에 5M의 염화나트륨을 각각 0, 220, 440, 660, 880 및 1100 μL을 첨가하여 삼투압 농도를 각각 310, 350, 390, 430, 470 및 510 mOsm/kg으로 변화시켰다. 또한, 고삼투압과 저온 환경을 함께 적용하기 위해서, 37℃에서 배양을 시작한 후 2일째인 박테리아 성장 단계에 염화나트륨을 첨가하여 상기와 같이 다양한 삼투압 농도로 변화시키면서, 동시에 이 시기에 온도를 37℃에서 32℃로 낮추어 주는 2단계 배양을 수행하였다. 추후의 다양한 분석을 위하여 매일 1 mL 부피의 배지를 회수하였다.The actual culture volume was 50 mL and batch culture was performed for 2 weeks with 100 nM MTX and 4 mM glutamine in serum-free medium SFM4CHO (Hyclone, Logan, Utah). The speed of the stirrer (Vision, Gyeonggi-do, South Korea) was 110 rpm, and the initial cell concentration was inoculated at 2.0 × 10 5 cells / mL. In order to apply the high osmotic pressure, 5M sodium chloride was added at 0, 220, 440, 660, 880 and the mid-exponential stage at 37 ° C., 2 days after the start of culture, and 5 days after the start of culture, respectively. 1100 μL was added to change the osmotic concentration to 310, 350, 390, 430, 470 and 510 mOsm / kg, respectively. In addition, in order to apply the high osmotic pressure and low temperature environment together, sodium chloride was added to the bacterial growth stage on the second day after the start of the cultivation at 37 ° C. to change the various osmotic concentrations as described above, and at the same time, the temperature was changed at 37 ° C. Two-step culturing was carried out to lower to 32 ℃. 1 mL volume of medium was collected daily for later analysis.
<< 실시예Example 2> 인간 인터페론 베타 2> human interferon beta 를To 생산하는 재조합 To produce recombinant CHOCHO 세포의 3 L 동물세포반응기에서의 부유배양 Suspension Culture of Cells in a 3 L Animal Cell Reactor
본 발명자들은 인간 인터페론 베타를 생산하는 재조합 CHO 세포를 무혈청 배 지와 3 L 동물세포반응기(New Brunswick Scientific, Edison, NJ)를 사용하여 기본삼투압과 37℃ 외에 고삼투압, 및 고삼투압과 저온을 함께 적용한 환경에서 부유배양을 수행하였다. 상기 배양은 플라스크 배양에서 보인 비생산속도 증가와 집합화 현상 감소로 인한 인간 인터페론 베타 단량체 생산량 증가의 현상이 대규모 배양에서도 적용되는지 알아보기 위하여 수행되었다. The present inventors used recombinant CHO cells producing human interferon beta to produce high osmotic pressure, high osmotic pressure and low temperature in addition to the basic osmotic pressure and 37 ° C using a serum-free medium and a 3 L animal cell reactor (New Brunswick Scientific, Edison, NJ). Suspension culture was carried out in a co- applied environment. The culture was performed to determine whether the increase in the specific production rate and the increase in the production of human interferon beta monomer due to the decrease in aggregation phenomenon in the flask culture is also applied to large-scale culture.
실제 배양 부피는 2 L이었으며, 무혈청배지 SFM4CHO(Hyclone, Logan, Utah)에 100 nM MTX와 4 mM 글루타민을 첨가하여 회분식 배양을 하였다. pH는 7.2, 용존산소량은 50%, 및 임펠러의 회전속도는 50 rpm으로 조절하였으며, 초기 세포 농도는 2.0 × 105 cells/mL로 접종하였다. 고삼투압 및 저온을 적용하기 위하여 배양 2일째에 염화나트륨을 첨가하여 470 mOsm/kg(플라스크 배양에서 가장 좋은 생산량을 보인 삼투압 농도), 온도를 낮춰 32℃로 맞춰줌으로써 2단계 배양이 수행되었다. 추후의 다양한 분석을 위하여 매일 15 mL 부피의 배지를 회수하였다.The actual culture volume was 2 L and batch culture was performed by adding 100 nM MTX and 4 mM glutamine to serum-free medium SFM4CHO (Hyclone, Logan, Utah). The pH was 7.2, the dissolved oxygen amount was 50%, and the rotation speed of the impeller was adjusted to 50 rpm, and the initial cell concentration was inoculated at 2.0 × 10 5 cells / mL. In order to apply high osmotic pressure and low temperature, two-step culture was performed by adding sodium chloride on the second day of cultivation to adjust the temperature to 32 ° C. by adjusting the temperature to 470 mOsm / kg (the osmotic concentration showing the best yield in the flask culture) and the temperature. Daily 15 mL volumes of media were withdrawn for later analysis.
<< 실험예Experimental Example 1> 고삼투압 환경, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서의 인간 인터페론 베타의 1> Human Interferon Beta in High Osmotic Environment or High Osmotic Pressure and Low Temperature 집합화Gathering 현상 변화측정 Phenomenon change measurement
본 발명자들은 회분배양 중반부부터 발생하기 시작하는 인간 인터페론 베타의 집합화 현상이 삼투압의 변화에 따라 변화하는지 알아보았다. 본 실험에서 사용한 무혈청배지의 기본 삼투압인 310 mOsm/kg의 배지에 염화나트륨을 첨가하여 350, 390, 430, 470 및 510 mOsm/kg의 고삼투압 환경을 만들었다. 또한, 각각의 삼투압에 대해 37℃에서 배양, 32℃에서 배양, 및 삼투압 변경 시에 온도를 37℃에서 32℃로 낮춰주는 2단계 배양을 125 mL 플라스크에서 수행하였다. The present inventors examined whether the aggregation of human interferon beta, which begins to occur in the middle of batch culture, changes with osmotic pressure. Sodium chloride was added to the medium of 310 mOsm / kg, the basic osmotic pressure of the serum-free medium used in this experiment, to create a high osmotic pressure environment of 350, 390, 430, 470 and 510 mOsm / kg. In addition, two stage incubations were performed in 125 mL flasks for each osmotic incubation at 37 ° C., incubation at 32 ° C., and to lower the temperature from 37 ° C. to 32 ° C. upon osmotic pressure change.
매일 1 mL씩 회수한 배지를 가지고 효소결합면역흡수법(ELISA)을 통하여 인간 인터페론 베타 단량체의 농도를 측정하였다. 또한, 회수한 배지의 일부는 배지에 대하여 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate)와 1% 2-머캡토에탄올(2-mercaptoethanol)을 첨가하고 5분간 끓임으로써 변성시킨 배지를 가지고 효소결합면역흡수법(ELISA)을 통하여 배지 속의 총 인간 인터페론 베타 단량체의 농도를 측정하였다. 상기 농도는 인간 인터페론 베타 중합체를 모두 단량체로 푼 뒤 측정한 값이다.The concentration of human interferon beta monomer was measured by enzyme-linked immunosorbent absorption (ELISA) with 1 mL of the medium recovered daily. In addition, part of the recovered medium was denatured by adding a medium of 0.1% SDS (sodium dodecyl sulfate) and 1% 2-mercaptoethanol and then boiled for 5 minutes. ELISA) was used to determine the concentration of total human interferon beta monomer in the medium. The concentration is measured after unpacking all human interferon beta polymers with monomers.
(℃, mOsm/kg) Environment
(℃, mOsm / kg)
(day-1) Specific growth rate (μ)
(day -1 )
(μg/106cells/day) Specific production rate ( q IFN -β )
(μg / 10 6 cells / day)
(mg/L) Human Interferon Beta Concentration
(mg / L)
(%) Aggregation phenomenon
(%)
↓
3237
↓
32
상기 측정결과, 표 1에서 보는 바와 같이 기본 삼투압에 비해 삼투압이 증가할수록 배양 중간 단계까지는 집합화 현상의 값이 감소하였으나 배양 후반부에 들어서는 집합화 현상의 값이 비슷해졌다. 고삼투압 환경은 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 완전히 막진 못하지만 집합화 현상의 속도를 늦출 수 있음을 확인하였다. 따라서 산업적으로 인간 인터페론 베타 생산시, 회수시기를 조절함으로써 보다 높은 생산량을 얻을 수 있음을 알 수 있다(도 1). 저온 환경이 인간 인터페론 베타의 집합화 현상을 감소시킬 수 있다는 보고(Rodriguez, J., et al., Biotechnol . Prog ., 21(1):22-30, 2005)가 있으나, 고삼투압과 저온을 함께 적용시켰을 때, 그 효과는 서로 합쳐져 각각의 환경에서 보다 집합화 현상을 감소시키고, 이를 통해 인간 인터페론 베타의 생산량을 늘릴 수 있음을 확인하였다(도 2). 특히, 삼투압은 470 mOsm/kg, 및 온도는 이단계식 37℃→32℃의 환경이 집합화 현상 감소와 생산량 증가에 가장 좋은 결과를 보였다. As a result of the measurement, as shown in Table 1, as the osmotic pressure increased as compared with the basic osmotic pressure, the value of the aggregation phenomenon decreased until the middle stage of the culture, but the value of the aggregation phenomenon was similar in the latter part of the culture. The hyperosmotic environment did not completely prevent the aggregation of human interferon beta but could slow down the aggregation. Therefore, in the production of human interferon beta industrially, it can be seen that a higher yield can be obtained by adjusting the recovery time (FIG. 1). It has been reported that cold environments can reduce the aggregation of human interferon beta (Rodriguez, J., et al., Biotechnol . Prog ., 21 (1): 22-30, 2005). When applied together, the effects were combined with each other to reduce the aggregation phenomenon in each environment, thereby confirming that it can increase the production of human interferon beta (Fig. 2). In particular, the osmotic pressure of 470 mOsm / kg, the temperature of the two-stage 37 ℃ → 32 ℃ environment showed the best results in the reduction of aggregation and increased production.
또한, 상기 결과는 동물세포반응기(bioreactor)를 통한 대규모 배양에서도 인간 인터페론 베타의 집합화 현상의 감소 및 생산량의 증가가 거의 유사하게 나타났음을 확인하였다. 따라서 산업적으로 인간 인터페론 베타를 생산하는 배양에 적용할 수 있음을 알 수 있었다(도 3).In addition, the results confirmed that even in large-scale cultivation through an animal cell reactor (bioreactor), the reduction of the aggregation of human interferon beta and the increase in production were almost similar. Therefore, it can be seen that it can be applied industrially to produce human interferon beta (FIG. 3).
<< 실험예Experimental Example 2> 고삼투압 환경, 또는 고삼투압과 저온이 함께 적용된 환경에서 세포 제거시 인간 인터페론 베타 2> Human interferon beta when cells are removed in a high osmotic environment or in an environment with high osmotic pressure and low temperature 의of 집합화 현상 Aggregation phenomenon 의of 변화측정 및 특수단백질검출검사 Change measurement and special protein detection test
본 발명자들은 삼투압이 증가함에 따라 인간 인터페론 베타의 집합화 현상이 감소하는 현상이 고삼투압이 된 배지와 세포와의 상호작용 때문인지, 또는 고삼투압이 된 배지와 인간 인터페론 베타 분자와의 상호작용 때문인지 알아보았다. The present inventors have found that the decrease in the aggregation of human interferon beta with increasing osmotic pressure is due to the interaction of high osmotic medium with cells, or the interaction of high osmotic medium with human interferon beta molecules. I figured out.
우선, 집합화 현상이 거의 일어나지 않은 인간 인터페론 베타 단량체를 최대로 생산해내기 위하여 125 mL 플라스크에서 세포를 2.0 × 105 cells/mL의 농도로 접종한 후 37℃에서 키우다가 2일이 지난 후, 470 mOsm/kg로 삼투압을 올려서 배양한 후, 그로부터 다시 2일이 지난 후에 원심분리를 이용하여 세포를 인간 인터페론 베타가 포함된 배지로부터 분리하였다. 세포가 제거된 배지에 기본 삼투압을 가진 새 배지를 1:2 비율로 섞어줌으로써 삼투압을 360, 390, 430, 470 및 510 mOsm/kg으로 각각 맞추어 주었다. 이와 동시에 저온 인큐베이션을 위한 플라스크의 온도는 32℃로 낮추어 주었다. 매일 1 mL씩 회수한 배지를 상기 <실험예 1>과 동일한 방식으로 효소결합면역흡수법(ELISA)을 통하여 인간 인터페론 베타 단량체의 농도를 측정하였다. First, in order to produce the maximum production of human interferon beta monomer which hardly occurs, the cells were inoculated at a concentration of 2.0 × 10 5 cells / mL in a 125 mL flask and grown at 37 ° C., after 2 days, 470 After culturing with an osmotic pressure at mOsm / kg, two days later, cells were separated from the medium containing human interferon beta by centrifugation. Osmotic pressure was adjusted to 360, 390, 430, 470 and 510 mOsm / kg, respectively, by mixing the medium from which the cells were removed with fresh media having a basic osmotic pressure in a 1: 2 ratio. At the same time, the temperature of the flask for low temperature incubation was lowered to 32 ° C. The concentration of human interferon beta monomer was measured by enzyme-linked immunosorbent adsorption (ELISA) in the same manner as in <Example 1> in which the medium was recovered 1 mL daily.
상기 측정결과, 세포가 없는 상태에서도 삼투압이 증가함에 따라 인간 인터페론 베타의 집합화 현상이 감소함을 확인할 수 있었다(도 4). 또한, 이미 보고된 바와 같이 37℃보다는 저온인 32℃에서 인간 인터페론 베타의 집합화 현상이 감소하였다. 따라서 인간 인터페론 베타의 집합화 현상의 원인 중의 하나는 열이라는 것을 알 수 있었고, 고삼투압 환경에서 감소된 집합화 현상은 세포보다는 인간 인터페론 베타 분자와 배지와의 상호작용에 더 의존한다는 것을 알 수 있었다.As a result of the measurement, as the osmotic pressure was increased even in the absence of cells it was confirmed that the aggregation phenomenon of human interferon beta (Fig. 4). In addition, as previously reported, the aggregation of human interferon beta was reduced at 32 ° C, which is lower than 37 ° C. Therefore, one of the causes of the aggregation of human interferon beta is heat, and the reduced aggregation in high osmotic environment is more dependent on the interaction of human interferon beta molecule and medium than cell. .
또한, 인간 인터페론 베타에 당쇄가 없으면 활성이 떨어질 뿐만 아니라 집합화 현상이 당쇄가 있는 분자보다 더 잘 일어난다는 보고(Runkel, L., et al., Pharm. Res ., 15(4):641-649, 1998)가 있기 때문에, 고삼투압 환경에서 감소되는 집합화 현상이 기본 삼투압 환경보다 당쇄가 있는 인간 인터페론 베타 분자가 더 많아서인지 확인하기 위하여, 상기 실험에서 사용하였던 배지를 이용하여 특수단백질검출검사인 웨스턴블랏(Western blot)을 수행하였다. In addition, the lack of sugar chains in human interferon beta not only decreases activity but also reports that aggregation occurs better than molecules with sugar chains (Runkel, L., et al., Pharm. Res ., 15 (4): 641- 649, 1998), special protein detection test using the medium used in the above experiment to determine whether the reduced aggregation in the high osmotic environment is more of the human interferon beta molecules with sugar chain than the basic osmotic environment Western blot was performed.
그 결과, 당쇄가 붙은 25 kDa 위치에 있는 밴드와 당쇄가 없는 18 kDa 위치에 있는 밴드와의 비율이 삼투압에 관계없이 비슷함을 확인하였다. 따라서 삼투압에 의한 집합화 현상 감소는 인간 인터페론 베타의 당쇄와는 별로 관계가 없음을 확인하였다(도 5).As a result, it was confirmed that the ratio of the band at the 25 kDa position with the sugar chain and the band at the 18 kDa position without the sugar chain was similar regardless of the osmotic pressure. Therefore, it was confirmed that the reduction of aggregation by osmotic pressure is not related to the sugar chain of human interferon beta (FIG. 5).
도 1은 인간 인터페론 베타를 생산하는 세포를 플라스크에서 다양한 삼투압으로 배양하였을 때, 세포 성장, 세포 생존율, 인간 인터페론 베타 농도 및 집합화 현상 비율을 나타낸 그래프이다.1 is a graph showing cell growth, cell viability, human interferon beta concentration, and aggregation rate when cells producing human interferon beta were cultured at various osmotic pressure in a flask.
도 2는 인간 인터페론 베타를 생산하는 세포를 플라스크에서 고삼투압, 및 다양한 온도 조건에서 배양하였을 때, 세포 성장, 세포 생존율, 인간 인터페론 베타 농도 및 집합화 현상 비율을 나타낸 그래프이다.FIG. 2 is a graph showing cell growth, cell viability, human interferon beta concentration and aggregation rate when cells producing human interferon beta were cultured at high osmotic pressure and various temperature conditions in a flask.
도 3은 인간 인터페론 베타를 생산하는 세포를 동물세포반응기에서 대조군 조건, 및 고삼투압과 저온을 함께 적용시킨 환경에서 각각 배양하였을 때, 세포 성장, 세포 생존율, 인간 인터페론 베타 농도 및 집합화 현상 비율을 나타낸 그래프이다.Figure 3 shows the cell growth, cell viability, human interferon beta concentration and aggregation phenomenon rate when the cells producing human interferon beta were cultured in the control conditions of the animal cell reactor and the environment with high osmotic pressure and low temperature, respectively. The graph shown.
도 4는 인간 인터페론 베타를 생산하는 세포를 플라스크에서 37℃ 및 470 mOsm/kg에서 배양하여 수득한 인간 인터페론 베타를 세포를 제거한 상태에서, 37℃ 및 32℃의 온도조건에서 다양한 고삼투압 조건에서 배양하였을 때, 인간 인터페론 베타 농도 및 집합화 현상 비율을 나타낸 그래프이다.Figure 4 is cultured in a variety of high osmotic conditions at 37 ℃ and 32 ℃ temperature, while removing the cells of human interferon beta obtained by culturing cells producing human interferon beta at 37 ℃ and 470 mOsm / kg in a flask It is a graph showing the human interferon beta concentration and aggregation rate.
도 5는 인간 인터페론 베타를 생산하는 세포를 플라스크에서 37℃ 및 470 mOsm/kg에서 배양하여 수득한 배지를 특수단백질검출검사(Western blot)를 통하여 인간 인터페론 베타의 당쇄부가형(25 kDa) 및 당쇄비부가형(18 kDa)의 발현량을 나타낸 그림이다.5 is a sugar chain addition type (25 kDa) and a sugar chain ratio of human interferon beta through a Western blot of a medium obtained by culturing cells producing human interferon beta at 37 ° C. and 470 mOsm / kg in a flask. The figure shows the expression level of the additional type (18 kDa).
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