KR100998175B1

KR100998175B1 - 소마토스타틴의 제조방법

Info

Publication number: KR100998175B1
Application number: KR1020080050989A
Authority: KR
Inventors: 전용국; 김재일; 김대영; 홍매화; 김도영
Original assignee: 애니젠 주식회사
Priority date: 2008-05-30
Filing date: 2008-05-30
Publication date: 2010-12-03
Also published as: KR20090124654A

Abstract

본 발명은 소마토스타틴의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조 방법은 고체상(solid-phase)합성 방법을 통하여 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진이 제거된 펩타이드의 이황화 결합 형성 반응 과정이 통상적으로 물중에서 수행하는데 반해, 본 발명은 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 수행하므로, 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이한 효과를 갖게 되어, 상업적 대량 생산이 가능하다.

소마토스타틴, 고체상합성, 이황화 결합, 유기용매

Description

소마토스타틴의 제조방법{Process for the Preparation of Somatostatin}

본 발명은 소마토스타틴의 제조방법에 관한 것이다.

소마토스타틴은 14개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드로서 1973년 미국의 기르만이 양의 시상하부에서 추출했다. 소마토스타틴은 성장호르몬인 소마토트로핀의 분비를 억제한다는 점에서 성장 호르몬 억제 인자 (growth hormone inhibiting factor, GIF), 성장 호르몬 억제 호르몬 (growth hormone inhibiting hormone, GIH), 소마토트로핀 방출 억제 인자 (somatotropin release inhibiting factor, SRIF)라고도 한다. 뿐만 아니라 뇌하수체로부터의 갑상선 자극 호르몬(thyroxine stimulation hormone, TSH)의 분비를 억제하며 나아가 인슐린, 글루카곤 또는 가스트린 등 췌장이나 소화관으로부터의 호르몬 분비를 억제하는 작용도 한다. 한편 소마토스타틴은 시상하부뿐 아니라 뇌내전역, 말초신경, 갑상선, 췌장, 위 또는 장 등에도 널리 존재한다는 것이 증명되었으며, 영양물의 소화, 흡수 또는 혈당값의 조절 등에도 관여하고 있다.

소마토스타틴을 제조하기 위한 종래의 제조방법은 다음과 같다.

미국특허 제3,862,925호는 액체상 합성방법으로 소마토스타틴 펩타이드를 제 조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 상기 제조방법은 제조단계수가 많고 제조공정이 까다로울 뿐만 아니라 제조 수율이 낮아 상업적 대량생산 시 가격적 경쟁력이 떨어진다는 단점이 있다.

미국특허 제4,337,194호는 페닐아조벤질설포닐에탄올 (phenylazobenzylsulfonylethanol)을 사용하여 t-부틸카보닐 보호화 합성기술로 각 아미노산을 순차적으로 결합시키는 방법으로 소마토스타틴 펩타이드를 제조하는 기술을 기재하고 있다. 그러나 동 제조방법의 경우, t-부틸카보닐 보호기를 제거 시, 상업적 대량생산에 적용이 어려운 트리플루오르아세트산 (trifluoroacetic acid, TFA)를 각 단계마다 사용하여야 되는 단점을 내포하고 있다.

상기에서 진술한 미국특허 제3,862,925호 및 미국특허 제4,337,194호의 제조방법에 있어서, 이황화 결합의 형성반응은 물중에서 수행하므로, 반응이 종료된 후 물과 무기염을 제거하는 공정이 쉽지 않아 목적물의 분리 및 정제가 어렵게 되어, 상업적 대량 생산의 적용에는 많은 제한이 있다.

이상에서 언급한 바와 같이 소마토스타틴 펩타이드의 제조를 위한 종래의 기술들의 경우, 상업적 대량생산에의 적용에 있어 개선되어야 하는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 따라서 소마토스타틴 펩타이드를 효과적으로 제조하는 방법에 대한 연구는 의약 산업에 있어서 매우 중요한 개발 과제라 할 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참 조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 고체상(solid-phase)합성 방법을 통한 소마토스타틴의 합성 과정 중 이황화 결합 형성 반응의 수행을 유기용매 내에서 하는 경우 안정적으로 대량 생산하기에 적합하다는 사실을 알아내어 새로운 소마토스타틴의 제조방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 소마토스타틴의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 소마토스타틴의 제조방법을 제공한다: (a) 고체상(solid-phase)합성 방법으로 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 레진을 부착된 펩타이드를 얻는 단계; (b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드를 유기용매 내에서 산화시켜 이황화결합 형성 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 펩타이드에서 탈보호화반응을 수행하여 소마토스타틴을 수득하는 단계.

화학식 Ⅰ

화학식 Ⅱ

화학식 Ⅲ

상기 화학식에서, R은 α-아미노 보호기, R¹은 티오 보호기, R²는 ε-아미노 보호기, R³는 수소 또는 아미드 보호기, R⁴는 수소 또는 인돌 보호기, 그리고 R⁵는 수소 또는 수산기 보호기이다.

약어의 정리

본 명세서에서 특별한 표시가 없는 한, 아미노산 및 보호기의 지정에 사용되는 약어는 IUPAC-IUB의 생화학 용어 위원회(Commission of Biochemical Nomenclature)에서 권장하는 용어에 기초한다(Biochemistry, 11:1726-1732(1972)).

본 명세서에서 사용한 보호기의 약어는 다음과 같다:

t-부틸카보닐: Boc

t-부틸: tBu

9-플루오레닐옥시카보닐: Fmoc

트리페닐메틸: Trt

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R은 α-아미노 보호기이고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 어떠한 보호기도 포함한다. 바람직하게는, 상기 α-아미노 보호기는 (1) 아실 타입의 보호기로, 포밀기, 트리플루오로아세틸기, 프탈릴기, 톨루엔설포닐기(토실기), 벤젠설포닐기, 디니트로페닐설포닐기, 트리틸설페닐기, o-니트로페녹시아세틸기, 클로로아세틸기, 아세틸기, γ-클로로부틸릴기, (2) 방향족 우레탄 타입 보호기로, 벤질옥시카보닐기, p-클로로벤질옥시카보닐기, p-니트로벤질옥시카보닐, p-브로모벤질옥시카보닐, p-메톡시벤질옥시카보닐, 2-(p-바이페닐)이소프로폭시카보닐, 이페닐메톡시카보닐, (3) 지방족 우레탄 보호기로, tert-부틸옥시카보닐, 디이소프로필메톡시카보닐, 이소프로필옥시카보닐, 에톡시카보닐, 알릴옥시카보닐, (4) 시클로알킬 우레탄 타입 보호기로, 시클로펜틸옥시카보닐, 아다만틸옥시카보닐, 시클로헥실옥시카보닐, (5) 티오 우레탄 타입 보호기로, 페닐티오카보닐, (6) 아랄킬 타입 보호기로 트리페닐메틸(트리틸), 벤질, (7) 트리알킬실란 그룹으로, 트리메틸실란이고, 보다 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기 또는 9-플루오레닐메톡시카보닐기이며, 가장 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R¹은 당업계에서 통상적으로 이용하는 티오 보 호기이다. 바람직하게는, 상기 티오 보호기는 벤조일, 트리틸, 벤질, p-메톡시벤질, 벤질옥시카보닐, p-니트로벤질, 아세트아미도메틸, 디페닐메틸, 트리페닐메틸기 또는 아세트아미노메틸기이며, 가장 바람직하게는 트리페닐메틸기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R²은 당업계에서 통상적으로 이용하는 ε-아미노 보호기이다. 바람직하게는, 상기 ε-아미노 보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기이고, 보다 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기이며, 가장 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R³은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 아미드 보호기를 포함한다. 바람직하게는, 상기 수소 또는 아미드 보호기는 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기이고, 보다 바람직하게는 벤질옥시메틸기 또는 트리페닐메틸기이며, 가장 바람직하게는 아미드 보호기가 트리페닐메틸기인 것이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R⁴은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 인돌보호기이다. 바람직하게는, 상기 수소 또는 인돌보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 또는 알릴기이고, 보다 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기 또는 벤질옥시카보닐기이며, 가장 바람직하게는 t-부틸옥시카보닐기이다.

상기 화학식 Ⅰ 내지 Ⅲ에서 R⁵은 당업계에서 통상적으로 이용하는 수소 또는 수산기 보호기가 될 수 있다. 바람직하게는, 상기 수소 또는 수산기 보호기는 토실기, 트리틸기, p-메톡시벤질기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, t-부틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, t-부틸카르보닐기, 아세틸기 또는 벤조일기이고, 보다 바람직하게는 t-부틸기 또는 트리페닐메틸기이며, 가장 바람직하게는 수산기 보호기가 t-부틸기인 것이다.

상기 작용기에 대한 보호기는 Protecting Groups in Organic Synthesis (Greene and Wuts, John Wiley & Sons, 1991)에 상세히 기재되어 있다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

본 발명의 제조방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:

(a) 화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 Ⅰ로 표시되는 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상(solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다 (Merrifield, R. B., J. Am . Chem . Soc . , 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal . Biochem ., 34:595-598(1970)). 즉, α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 남은 α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다.

적절한 보호기의 선택은 보호되는 작용기, 보호기가 노출되는 조건 및 그 분자내에 존재할 수 있는 다른 작용기에 따라 달라진다. 보호기는 합성 각 단계에서 ㈀ α-아미노보호기를 제거하기 위해 선택한 반응조건 및 시약에 대해 안정해야 하고, ㈁ 커플링반응에서 탈보호화반응이 일어나지 않아야 하며, ㈂ 원하는 아미노산 사슬을 포함하는 합성이 완결되었을 때 레진과의 분해 조건에서 안정하여야 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화학식 Ⅰ의 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진을 사용한다. 사용될 수 있는 레진은 제조된 펩타이드의 측쇄 보호기를 완전히 보존시킬 수 있는 온화한 산성조건하에서 쉽게 분해될 수 있는 통상적인 레진을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 상기 레진은 트리틸클로라이드 레진, 2-클로로트리틸 레진, 4-메틸트리틸 레진 또는 4-메톡시트리틸 레진이고, 보다 바람직하게는 트리틸클로라이드 레진 또는 2-클로로트리틸 레진이며, 가장 바람직하게는 2-클로로트리틸 레진이다.

(b) 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드의 수득

상기 화학식 Ⅱ로 표시되는 화합물은 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드로부터 온화한 산성조건하에서 레진을 제거하여 얻을 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 산성조건은 아미노산 사슬의 측쇄보호기가 완전하게 유지될 수 있는 온화한 조 건이여야 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 레진을 제거하는 과정은 산성 조건하에서 수행한다. 바람직하게는, 산성 조건은 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=7:2:1인 용액 하에서 수행하거나, 0.5 내지 5% 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 용액 하에서 수행한다.

(c) 화학식 Ⅲ 으로 표시되는 펩타이드의 수득

화학식 Ⅲ로 표시되는 화합물은 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드로부터 유기용매 하에서 적합한 산화제를 사용하여 이황화 결합 형성 반응을 수행하여 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 단계 (c)에서 이용 가능한 산화제는, I₂, 산소, 페리사이어나이드, 다이메틸설폭사이드, 글루타티온, 퍼옥시니트라이드 또는 과산화수소이고, 보다 바람직하게는, I₂ 또는 다이메틸설폭사이드이며, 가장 바람직하게는 I₂ 이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 이황화 결합의 형성 반응에서 유기용매를 사용한다. 바람직하게는, 상기 유기용매는 할로겐화 탄화수소 용매 또는 알코롤류 용매이며, 더욱 바람직하게는 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로포름, 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올이며, 가장 바람직하게는 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 혼합 용매이다.

상기 혼합 용매의 이황화 결합 형성 반응 농도는 화학식 Ⅲ으로 표시되는 화합물을 기준으로 하여 바람직하게는 0.01-0.0001 M이 적합하며, 가장 바람직하게는 0.005-0.0005 M이다.

(d) 소마토스타틴의 수득

소마토스타틴은 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드로부터 당업계에서 통상적으로 이용하는 반응 조건하에서 탈보호화반응을 수행하여 얻을 수 있다.

탈보호화반응의 반응 조건으로는 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 물, 페놀, 티오아니솔 및 에탄디티올의 혼합물, 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 또는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌, 물 및 에탄디티올의 혼합물 하에서 가능하며, 가장 바람직하게는 트리플루오로아세트산, 트리이소프로필실렌 및 물의 혼합물 하에서 수행된다.

상기 내용을 바탕으로 소마토스타틴을 제조하는 전체 공정을 정리하면 다음과 같다 (반응식 1).

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 소마토스타틴의 제조방법을 제공한다. 특히, 고체상(solid-phase)합성 방법을 통하여 펩타이드를 합성하는 과정에서 레진이 제거된 펩타이드의 이황화 결합 형성 반응 과정이 통상적으로 물중에서 수행하는데 반해, 본 발명은 유기용매 내에서 이황화 결합 형성 반응을 수행하므로, 반응이 종료된 후 목적물의 분리 및 정제가 용이한 효과를 갖게 되어, 상업적 대량 생산이 가능하다는 이점이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지 에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 “%”는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.

실시예 1 : 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅳ

9- 플루오레닐옥시카보닐 - Cys ( 트리페닐메틸 )-O-2- 클로로트리틸 레진의 제조

여과막이 장착된 고체상(solid-phase)합성 반응기에 2-클로로트리틸 클로라이드 레진 (23.6 g, f=1.27 mmol/g의 레진, 30 mmol) 및 디클로로메탄 (200 ㎖)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(트리페닐메틸)-OH (26.4 g, 45 mmol, 1.5당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (6.08 g, 45 mmol, 1.5당량)이 포함된 디클로로메탄 (200 ㎖)을 넣고, 이어서 디이소프로필에틸아민 (6.59 g, 51 mmol, 1.7당량)를 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 1회 세척한 후, 레진에 디클로로메탄:메탄올:디이소프로필에틸아민=17:2:1 (200 ㎖)을 넣고 20분간 교반시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 디클로로메탄으로 3회 세척한 후, 진공 하에서 건조하여 40.5 g 9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진을 수득하였다. 치환율은 0.56 mmol/g이었다.

9- 플루오레닐옥시카보닐 -아미노산- OH 커플링 반응

(a) H- Cys ( 트리페닐메틸 )-2- 클로로트리틸 레진의 수득

여과막이 장착된 고상합성 반응기에 9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진 (17.9 g, f=0.56 mmol/g, 10 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎖)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20% (v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎖)을 넣어 15분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

(b) 9- 플루오레닐옥시카보닐 - Ser (t-부틸)- Cys ( 트리페닐메틸 )-2- 클로로트리틸 레진의 수득

상기 반응 (a)에서 얻은 H-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진 (10 mmol)에 9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-OH (11.5 g, 30 mmol, 3.0당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3.0당량)의 N,N-디메틸포름아미드 (120 ㎖)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)을 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

(c) H- Ser (t-부틸)- Cys ( 트리페닐메틸 )-2- 클로로트리틸 레진의 수득

상기 반응 (b)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진에 20% (v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎖)를 넣어 15분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Ser(t-부틸)-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

(d) 9- 플루오레닐옥시카보닐 -아미노산- OH 의 커플링 및 최종 물질의 수득

상기 반응 (c) 및 (d) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으 로 커플링 하였다.

9-플루오레닐옥시카보닐-Thr(t-부틸)-OH (11.9 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸 (4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Phe-OH (11.6 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Thr(t-부틸)-OH (11.9 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Lys(t-부틸카보닐)-OH (14.1 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Trp(t-부틸카보닐)-OH (15.6 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Phe-OH (11.6 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조 트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Asn(트리페닐메틸)-OH (17.9g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(트리페닐메틸)-OH (17.6 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Gly-OH (8.92 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH (9.3 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

마지막으로 9-플루오레닐옥시카보닐-Ala-OH의 커플링 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척하여 상기 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드를 얻었다.

실시예 2 : 화학식 Ⅴ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅴ

상기 실시예 1에서 얻은 상기 화학식 Ⅳ로 표시되는 펩타이드에 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=7:2:1의 혼합액 (300 ㎖)를 넣고 2시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압 농축하여 상기 화학식 Ⅴ로 표시되는 크루드 펩타이드 29.8 g을 얻었다. 크루드의 수율은 97%였고, LC 순도는 76%였다.

실시예 3 : 화학식 Ⅵ 으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅵ

상기 실시예 2에서 얻은 상기 화학식 Ⅴ로 표시되는 크루드 펩타이드 3.0 g에 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=7:2:1(1000 ㎖)를 넣고, I₂(0.25 g, 10 mmol)의 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올= 7:2:1 혼합액 (12.5 ㎖)을 천천히 적가한 후, 15분간 더 교반시켰다. 1 N Na₂S₂O₃ 수용액 (500 ㎖)을 넣어 과량의 I₂을 제거하고, 층을 분리한 후, 유기층을 1 N 시트르산 수용액으로 세척하 였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과 및 감압증류하여 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 2.1 g을 얻었다.

실시예 4 : 화학식 Ⅶ로 표시되는 소마토스타틴의 제조

화학식 Ⅶ

상기 실시예 3에서 얻은 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 펩타이드 2.1 g을 에틸아세테이트 (20 ㎖)에 용해시키고 실온에서 트리스(2-아미노에틸)아민(TAEA)(0.22g, 1.5 mmol)를 넣고 1시간 동안 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 실시하였다. 생성된 고형물을 여과를 통해 제거하고, 유기층을 물로 3차 세척한 다음 감압 증류하여 에틸아세테이트를 제거하였다. 이어서 t-부틸메틸에테르:트리이소프로필실렌:물=95:2.5:2.5 (20 ㎖) 혼합용액을 넣고, 2시간 동안 탈보호화 반응을 수행하였다. 용매를 감압 증류하고 t-부틸메틸에테르 (30 ㎖)를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 소마토스타틴 1.3 g을 얻었다. 역상 HPLC (220 nm, 10 ㎖/분, 5 미크론 C18 컬럼에서 20분 내에 0.1% 트리플루오로아세트산 내 아세토니트릴 초기농도 20%에서 40%로 증가)로 정제하여 상기 화학식 Ⅶ로 표시되는 소마토스타틴 0.6 g 얻었다. 총수율은 36%였고, HPLC의 순도는 99%였다.

실시예 5 : 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅷ

(a) H- Cys ( 트리페닐메틸 )-2- 클로로트리틸 레진의 수득

여과막이 장착된 고상합성 반응기에 9-플루오레닐옥시카보닐-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진(17.9 g, f=0.56 mmol/g, 10 mmol) 및 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎖)를 넣고, 15분간 레진을 팽창시킨 후, 감압 하에서 여과막을 통하여 용매를 제거하였다. 20% (v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎖)를 넣어 15분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

상기 반응 (a)에서 얻은 H-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진 (10 mmol)에 9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-OH (11.5 g, 30 mmol, 3.0당량) 및 1-히드록시벤조트리아졸 (4.05 g, 30 mmol, 3.0당량)가 포함된 N,N-디메틸포름아미 드 (120 ㎖)를 넣고, 이어서 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)을 첨가한 후, 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 감압 여과하여 반응액을 제거하고 레진을 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

(c) H- Ser (t-부틸)- Cys ( 트리페닐메틸 )-O-2- 클로로트리틸 레진의 수득

상기 반응 (b)에서 얻은 9-플루오레닐옥시카보닐-Ser(t-부틸)-Cys(트리페닐메틸)-2-클로로트리틸 레진에 20% (v/v) 피페리딘이 포함된 N,N-디메틸포름아미드 (150 ㎖)을 넣어 15분간 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 수행한 후, 감압 여과하여 반응액을 제거하였다. 상기 9-플루오레닐옥시카보닐의 제거 반응을 반복하고 이어서 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 1회, 디클로로메탄으로 2회 및 N,N-디메틸포름아미드로 2회 세척하여 H-Ser(t-부틸)-Cys(트리페닐메틸)-O-2-클로로트리틸 레진을 얻었다.

상기 반응 (b) 및 (c) 과정을 반복하면서 하기 아미노산 유도체를 순차적으로 커플링 하였다.

9-플루오레닐옥시카보닐-Thr(t-부틸)-OH (11.9 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함 된 N,N-디메틸포름아미드 용액 (15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

9-플루오레닐옥시카보닐-Asn(트리페닐메틸)-OH (17.9 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량)및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

t-부틸카보닐-Ala-OH (5.68 g, 30 mmol, 3당량), 1-히드록시벤조트리아졸(4.05 g, 30 mmol, 3당량) 및 디이소프로필카르보디이미드가 포함된 N,N-디메틸포름아미드 용액(15 ㎖, 2 M 용액, 3.0당량)

마지막으로 t-부틸카보닐-Ala-OH의 커플링 반응을 수행한 후, 레진을 차례로 N,N-디메틸포름아미드로 3회 및 디클로로메탄으로 3회 세척하여 상기 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드를 얻었다.

실시예 6 : 화학식 Ⅸ로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅸ

상기 실시예 5에서 얻은 화학식 Ⅷ로 표시되는 펩타이드에 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=7:2:1의 혼합액 (300 ㎖)를 넣고 2시간 동안 교반하였다. 감압 여과하여 레진을 제거하고, 여과액을 감압 농축하여 상기 화학식 Ⅵ으로 표시되는 크루드 펩타이드 29.5 g을 얻었다. 크루드의 수율은 100%에 가까웠으며, LC의 순도는 78%였다.

실시예 7 : 화학식 Ⅹ 으로 표시되는 펩타이드의 제조

화학식 Ⅹ

상기 실시예 6에서 얻은 화학식 Ⅸ로 표시되는 크루드 펩타이드 (5.87 g)에 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=7:2:1 (2000 ㎖)를 넣고, I₂(0.5 g, 20 mmol)의 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=7:2:1 혼합액 (25 ㎖)을 천천히 적가한 후, 15분간 더 교반시켰다. 1 N의 Na₂S₂O₃ 수용액 (1000 ㎖)을 넣어 과량의 I₂을 제거하고, 층을 분리한 후, 유기층을 1 N의 시트르산 수용액으로 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄로 건조하고, 여과 및 감압증류를 수행하여 화학식 Ⅹ으로 표시되는 펩타이드 4.73 g을 얻었다.

실시예 8 : 화학식 Ⅶ로 표시되는 소마토스타틴의 제조

화학식 Ⅶ

상기 실시예 7에서 얻은 화학식 Ⅹ으로 표시되는 펩타이드 4.73 g을 t-부틸메틸에테르:트리이소프로필실렌:물=95:2.5:2.5 (40 ㎖) 혼합용액에 넣고, 2시간 동안 탈보호화 반응을 수행하였다. 용매를 감압증류하고 t-부틸메틸에테르 (60 ㎖)를 넣어 얻은 고체를 여과하여 크루드 소마토스타틴 2.82 g을 얻었다. 역상 HPLC(220 nm, 10 ㎖/분, 5 미크론 C18 컬럼에서 20분 내에 0.1% 트리플루오로아세트산 내 아세토니트릴 초기농도 20%에서 40%로 증가)로 정제하여 화학식 로 표시되는 소마토스타틴 1.24 g을 얻었다. 총수율은 38%였으며, HPLC의 순도는 99%였다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 소마토스타틴의 제조방법:

(a) 고체상(solid-phase)합성 방법으로 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 레진을 부착된 펩타이드를 얻는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에서 얻은 펩타이드에서 레진을 제거하여 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계;

(c) 상기 단계 (b)에서 얻은 펩타이드를 유기용매 내에서 산화시켜 이황화결합 형성 반응을 수행하여 하기 화학식 Ⅲ으로 표시되는 펩타이드를 얻는 단계; 및

(d) 상기 단계 (c)에서 얻은 펩타이드에서 탈보호화반응을 수행하여 소마토스타틴을 수득하는 단계.

화학식 Ⅰ

화학식 Ⅱ

화학식 Ⅲ

상기 화학식에서, R은 α-아미노 보호기, R¹은 티오 보호기, R²는 ε-아미노 보호기, R³는 수소 또는 아미드 보호기, R⁴는 수소 또는 인돌 보호기, 그리고 R⁵는 수소 또는 수산기 보호기이다.
제 1 항에 있어서, 상기 α-아미노 보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 9-플루오레닐메톡시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 티오 보호기는 트리페닐메틸기 또는 아세트아미노메틸기인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 ε-아미노 보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 수소 또는 아미드 보호기는 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기 또는 트리이소프로필실릴기인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 수소 또는 인돌 보호기는 t-부틸옥시카보닐기, 벤질옥시카보닐기, 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기 또는 알릴기인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 수소 또는 수산기 보호기는 메톡시메틸기, 벤질옥시메틸기, 테트라히드로피란기, 테트라히드로퓨란기, t-부틸기, 트리페닐메틸기, 벤질기, 알릴기, 트리메틸실릴기, t-부틸디메틸실릴기, 트리페닐실릴기, 트리이소프로필실릴기, t-부틸카르보닐기, 아세틸기 또는 벤조일기인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서의 레진은 2-클로로트리틸 클로라이드, 트리틸 클로라이드, 4-메틸트리틸 클로라이드 또는 4-메톡시트리틸 클로라이드인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서의 레진을 제거하는 과정은 산성 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 산성 조건은 디클로로메탄:아세트산:트리플루오로에탄올=7:2:1인 용액인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 산성 조건은 0.5 내지 5% 트리플루오로아세트산이 포함된 디클로로메탄 용액인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)에서의 유기용매는 디클로로메탄, 아세트산 및 트리플루오로에탄올의 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 소마토스타틴의 제조 방법.