KR100996953B1 - Method for delivering nano particles into cells and peptide therefor - Google Patents

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KR100996953B1 KR1020080111276A KR20080111276A KR100996953B1 KR 100996953 B1 KR100996953 B1 KR 100996953B1 KR 1020080111276 A KR1020080111276 A KR 1020080111276A KR 20080111276 A KR20080111276 A KR 20080111276A KR 100996953 B1 KR100996953 B1 KR 100996953B1
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Abstract

본 발명의 세포내로 카고를 전달하기 위한 펩타이드는 세포내 전달 도메인을 포함하되, 상기 세포내 전달 도메인은 전하를 띄는 물질 간의 상호작용 및/또는 상기 세포내 전달 도메인-상기 카고의 수용성을 높일 수 있는 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 소수성 도메인을 포함하는 펩타이드이며, 상기 카고와 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 상기 카고를 세포내로 전달하는 것을 특징으로 한다. 또한, 본 발명의 세포내로 카고를 전달하는 방법은, 세포내 전달 도메인을 준비하는 단계와, 세포내로 도입할 카고를 준비하는 단계와, 상기 카고와 상기 세포내 전달 도메인을 컨쥬게이션하지 않은 상태에서 세포에 처리하는 단계와, 상기 카고를 세포내로 도입하는 단계를 포함한다. 본 발명의 펩타이드 및 방법에 따르면, 세포내 전달 도메인과 카고가 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 카고를 세포 내로 도입할 수 있어 복잡한 컨쥬게이션 과정, 정제 과정 및 분리 과정 없이 바로 카고를 효율적으로 그리고 용이하게 세포내로 도입할 수 있고, 카고 및 세포내 전달 도메인의 특성에 변화를 주지 않고 카고를 세포내로 전달할 수 있다. Peptides for delivering cargo into cells of the present invention include an intracellular delivery domain, wherein the intracellular delivery domain can enhance the interaction between the charged material and / or the intracellular delivery domain-the cargo acceptability A peptide comprising a hydrophilic domain and a hydrophobic domain that can be used for hydrophobic interaction and / or interaction with a cell membrane, characterized in that the cargo is delivered intracellularly without being conjugated with the cargo. In addition, the method for delivering cargo into a cell of the present invention, the method comprising the steps of preparing an intracellular delivery domain, preparing a cargo to be introduced into the cell, without the cargo and the intracellular delivery domain conjugated Treating the cells and introducing the cargo into the cells. According to the peptides and methods of the present invention, the cargo can be introduced into the cell without intracellular delivery domain and cargo being conjugated, thereby efficiently and easily carrying the cargo directly without complicated conjugation process, purification process and separation process. Cargo can be delivered intracellularly without changing the properties of the cargo and intracellular delivery domains.

세포내 전달 도메인, 카고, 컨쥬게이션, 비공유적 결합, 친수성 도메인, 소 수성 도메인, 세포내 도입 Intracellular delivery domain, cargo, conjugation, non-covalent binding, hydrophilic domain, hydrophobic domain, intracellular transduction

Description

세포 내로 나노입자를 전달하는 방법 및 이를 위한 펩타이드{Method for delivering nano particles into cells and peptide therefor}Method for delivering nano particles into cells and peptide therefor}

본 발명은 세포 내로 카고를 전달하는 방법 및 이를 위한 펩타이드에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 카고와 컨쥬게이션(conjugation)되지 않은 상태에서 세포 내로 카고를 전달하는 펩타이드 및 이러한 펩타이드를 이용하여 카고를 효율적이면서 용이하게 세포 내로 전달하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for delivering cargo into a cell and a peptide therefor. More particularly, the present invention relates to a peptide that delivers cargo into a cell in a non-conjugated state with cargo and to efficiently transport cargo using the peptide. It relates to a method for easy delivery into cells.

세포막은 반투과성 지질의 이중막으로서 세포내 구성요소(intracellular components)와 세포 외부 환경(extracellular environment) 사이의 물리적 장벽으로 작용한다. 세포막은 선택적 투과성을 갖으며, 특정 물질에 대해 세포내로 들어가게 할 것인가 아니면 세포 밖으로 나가게 할 것인가를 조절한다. 작은 분자이거나 지용성 물질, 즉 소수성이면서 비극성인 물질은 빠르게 지질의 이중막을 통과하여 세포내로 확산되지만, 대전된 분자, 즉 이온은 세포막의 통과가 어렵다. 특히, 신약개발에 있어서 관심대상이 되는 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA, 저분자 화합물, 입자 등과 같은 친수성 분자는 세포내로 전달되기 어렵다. 이는 결국 이들을 치료목적으로 사용하기 어렵게 제한하는 요소가 된다.The cell membrane is a bilayer of semipermeable lipids that acts as a physical barrier between intracellular components and the extracellular environment. Cell membranes have selective permeability and control whether they enter or exit the cell for a particular substance. Small molecules or fat-soluble substances, i.e., hydrophobic and nonpolar substances, quickly pass through the lipid bilayer and diffuse into the cell, but charged molecules, ie ions, are difficult to pass through the cell membrane. In particular, hydrophilic molecules such as peptides, proteins, oligonucleotides, DNA, RNA, low molecular weight compounds, particles, and the like, which are of interest in drug development, are difficult to deliver into cells. This in turn becomes a limiting factor that makes them difficult to use for therapeutic purposes.

따라서, 세포 내로 전달되기 어려운 물질을 세포 내로 전달하는 기술은 학술적인 측면 및 의료적인 측면에서 매우 중요하다고 할 수 있다. 즉, 특정 물질이 세포 내에서 어떠한 작용을 하는지를 관찰하거나 세포 자체의 연구 등에 있어 특정 물질을 세포 내로 전달하는 기술은 그 의미가 크다고 하겠다.Therefore, the technology for delivering a substance that is difficult to be delivered into the cell into the cell can be said to be very important from the academic and medical aspects. In other words, the technology of observing a specific substance in a cell or in the research of the cell itself delivers a specific substance into a cell.

본 발명의 명세서에서는 이러한 세포 내로 전달되는 전달대상 물질을 "카고(cargo)"라고 정의하여 사용한다.In the specification of the present invention, the substance to be delivered to such cells is defined as "cargo".

예를 들어, 현재 관심의 대상이 되고 있는 세포 내 전달대상물질인 카고로는 저분자 화합물(Lindgren, et al. Overcoming methotrexate resistance in breast cancer tumour cells by use of a new cell-penetrating peptide. Biochem. Pharmacol. (2006) 71, 416-425; Rousselle, et al. New advances in the transport of doxorubicin through the blood-brain barrier by a peptide vector-mediated strategy. Mol. Pharmacol. (2000) 57, 679-686; Chaloin, et al. Improvement of porphyrin cellular delivery and activity by conjugation to a carrier peptide. Bioconjug. Chem. (2001) 12, 691-700; Reich, et al. Endocytosis targets exogenous material selectively to cathepsin S in lie human dendritic cells, while cell-penetrating peptides mediate nonselective transport to cysteine cathepsins. J. Leukocyte Biol. (2007) 81, 990-1001), 펩타이드(Takada, et al. Identification of a p65 peptide that selectively inhibits NF-kappaB activation induced by various inflammatory stimuli and its role in down-regulation of NF-kappaB-mediated gene expression and up- regulation of apoptosis. J. Biol. Chem. (2004) 279, 15096-15104; Tan, et al. Selective inhibition of ErbB2-overexpressing breast cancer in vivo by a novel TAT-based ErbB2-targeting signal transducers and activators of transcription 3-blocking peptide. Cancer Res. (2006) 66, 3764-3772), 단백질(Dietz & Bahr, Deliery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach. Mol. Cell. Neurosci. (2004) 27, 85-131), 올리고뉴클레오타이드, 플라스미드 DNA, siRNA, PNAs(peptide nucleic acids) 등을 포함하는 핵산(Moschos, et al. Lung delivery studies using siRNA conjugated to TAT(48-60) and penetratin reveal peptide induced reduction in gene expression and induction of innate immunity. Bioconjug. Chem. (2007) 18, 1450-1459), 입자(Tkachenko, et al. Cellular trajectories of peptide-modified gold particle complexes: comparison of nuclear localization signals and peptide transduction domains. Bioconju. Chem. (2004) 15, 482-490; Lewin, et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells. Nat. Biotechnol. (2000) 18, 410-414), 바이러스(Kuhnel, et al. Protein transduction domains fused to virus receptors improve cellular virus uptake and enhance oncolysis by tumor-specific replication vector. J. Virol. (2004) 78, 13743-13754), 리포좀(Marty, et al. Enhanced heparin sulfate protoglycan-mediated uptake of cell-penetrating peptide-modified liposomes. Cell. Mol. Life Sci. (2004) 61, 1785-1794) 등이 있다. 특히, 위에서 언급된 카고들 중 최근에 신약개 발 및 치료분야에서 각광을 받고 있는 골드 파티클과 같은 입자는 그 크기가 수 nm에서 수 백 nm에 이르기 때문에 세포 내로 도입하는 것이 용이하지 않다. 골드 파티클과 같은 입자는 세포의 표지, 세포 내로 물질을 전달하기 위한 전달체, MRI 이미징 등의 목적으로 널리 사용되고 있다. 따라서, 카고를 효율적으로 그리고 용이하게 세포 내로 도입하는 기술은 매우 중요하다. For example, Cargoro, an intracellular delivery target of interest, is currently a small molecule compound (Lindgren, et al. Overcoming methotrexate resistance in breast cancer tumour cells by use of a new cell-penetrating peptide.Biochem.Pharmacol. (2006) 71, 416-425; Rousselle, et al. New advances in the transport of doxorubicin through the blood-brain barrier by a peptide vector-mediated strategy.Mol.Pharmacol. (2000) 57, 679-686; Chaloin, et al. Improvement of porphyrin cellular delivery and activity by conjugation to a carrier peptide.Bioconjug. Chem. (2001) 12, 691-700; Reich, et al. Endocytosis targets exogenous material selectively to cathepsin S in lie human dendritic cells, while cell-penetrating peptides mediate nonselective transport to cysteine cathepsins.J. Leukocyte Biol. (2007) 81, 990-1001), peptide (Takada, et al. Identification of a p65 peptide that selectively inhibits NF-kappaB activation induced by various inflammatory stimuli and its role in down-regulation of NF-kappa B-mediated gene expression and up- regulation of apoptosis. J. Biol. Chem. (2004) 279, 15096-15104; Tan, et al. Selective inhibition of ErbB2-overexpressing breast cancer in vivo by a novel TAT-based ErbB2-targeting signal transducers and activators of transcription 3-blocking peptide. Cancer Res. (2006) 66, 3764-3772), proteins (Dietz & Bahr, Deliery of bioactive molecules into the cell: the Trojan horse approach.Mol. Cell. Neurosci. (2004) 27, 85-131), oligonucleotides, plasmid DNA Moschos, et al. Lung delivery studies using siRNA conjugated to TAT (48-60) and penetratin reveal peptide induced reduction in gene expression and induction of innate immunity.Bioconjug. Chem. (2007) 18, 1450-1459), particles (Tkachenko, et al. Cellular trajectories of peptide-modified gold particle complexes: comparison of nuclear localization signals and peptide transduction domains.Bioconju.Chem. (2004) 15, 482- 490; Lewin, et al. Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells.Nat.Biotechnol. (2000) 18, 410-414), virus (Kuhnel, et al. Protein transduction domains fused to virus receptors improve cellular virus uptake and enhance oncolysis by tumor-spec ific replication vector.J. Virol. (2004) 78, 13743-13754), liposomes (Marty, et al. Enhanced heparin sulfate protoglycan-mediated uptake of cell-penetrating peptide-modified liposomes. Cell. Mol. Life Sci. (2004) 61, 1785-1794). In particular, among the cargoes mentioned above, particles such as gold particles, which have recently been spotlighted in the field of new drug development and treatment, are not easy to be introduced into cells because their sizes range from several nm to several hundred nm. Particles such as gold particles are widely used for labeling cells, transporters for delivering substances into cells, MRI imaging, and the like. Therefore, the technique of introducing cargo into cells efficiently and easily is very important.

일반적으로 카고를 세포 안으로 효율적으로 전달하기 위하여 단백질 전달 도메인(protein transdunction domain or cell-pentrating peptide)이 사용되며, 이때 카고와 단백질 전달 도메인은 컨쥬게이션되어 있어야 한다. 그러나, 카고와 단백질 전달 도메인을 컨쥬게이션시키는 과정은 복잡하고 효율이 낮은 단점이 있으며, 컨쥬게이션의 결과 카고 혹은 단백질 전달 도메인의 성질이 변화되어 세포 내로 전달되는 효율이 저하되거나 카고에 의한 효과가 감소하는 등의 문제점이 있었다. 따라서, 세포 내로 카고를 전달하는 종래 방법은 개선되어야 할 문제점이 있었다. In general, a protein transdunction domain or a cell-pentrating peptide is used to efficiently transport cargo into cells, and the cargo and protein delivery domain should be conjugated. However, the process of conjugating the cargo and the protein delivery domain has a complicated and low efficiency disadvantage. As a result of the conjugation, the property of the cargo or protein delivery domain is changed, resulting in a decrease in the efficiency of delivery into the cell or a decrease in the cargo effect. There was a problem such as. Therefore, the conventional method of delivering cargo into cells has had a problem to be improved.

이러한 관점에서 카고는 단백질 전달 도메인과 컨쥬게이션 없이 세포 내로 도입되는 것이 바람직하다. 결국, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 카고를 단백질 전달 도메인과 컨쥬게이션시키지 않은 상태에서 살아 있는 세포 내로 유효하게 그리고 대량으로 도입하는 기술의 제공이 절실히 요구되고 있다.In this respect, the cargo is preferably introduced into the cell without conjugation with the protein delivery domain. As a result, there is an urgent need in the art to provide a technique for effectively and in large quantities introducing cargo into living cells without conjugating the cargo with the protein delivery domain.

이와 관련하여 최근 들어, 컨쥬게이션 없이 단백질을 세포에 전달할 수 있는 단백질 전달 도메인(PTD)이 보고되고 있다[Hou, Y.-W. et al., Transdermal delivery of proteins mediated by non-covalent associated arginine-rich intracellular delivery peptides. Exp. Dermatol. 16, 999-1006 (2007); Siprashvili, Z., Reuter, J. A., & Khavari, P. A. Intracellular delivery of functional proteins via decoration with transporter peptides. Mol. Ther. 9, 721-728 (2004); Gros, E. et al., A non-covalent peptide-based strategy for protein and peptide nucleic acid transduction. Biochim. Biophys. Acta 1758, 384-393 (2006); Myrberg, H., Lindgren, M., & Langel, U. Protein delivery by the cell-penetrating peptide YTA2. Bioconjug. Chem. 18, 170-174 (2007)]. 즉, PTD와 카고인 단백질을 컨쥬게이션시키지 않고 단순히 혼합하여 반응시킨 후, 세포에 처리하면 단백질의 세포내 전달이 증가되는 PTD가 보고되고 있다. 그러나, 다양한 카고와 컨쥬게이션시키지 않은 상태에서 다양한 카고를 세포 내로 전달할 수 있는 PTD는 아직 연구개발 단계이고, 특히 PTD와 입자를 컨쥬게이션시키지 않은 상태에서 입자를 세포 내로 전달할 수 있는 PTD는 아직까지 보고되고 있지 않고 있다. Recently, protein delivery domains (PTDs) have been reported that can deliver proteins to cells without conjugation [Hou, Y.-W. et al., Transdermal delivery of proteins mediated by non-covalent associated arginine-rich intracellular delivery peptides. Exp. Dermatol. 16, 999-1006 (2007); Siprashvili, Z., Reuter, JA, & Khavari, PA Intracellular delivery of functional proteins via decoration with transporter peptides. Mol. Ther. 9, 721-728 (2004); Gros, E. et al., A non-covalent peptide-based strategy for protein and peptide nucleic acid transduction. Biochim. Biophys. Acta 1758, 384-393 (2006); Myrberg, H., Lindgren, M., & Langel, U. Protein delivery by the cell-penetrating peptide YTA2. Bioconjug. Chem. 18, 170-174 (2007). In other words, PTD has been reported to increase the intracellular delivery of proteins when the cells are treated by simply mixing and reacting the PTD with the cargoin protein without conjugation. However, PTDs that can deliver various cargoes into cells without conjugation with various cargoes are still in the R & D stage, and in particular, PTDs that can deliver particles into cells without conjugating PTDs and particles are still reported. It is not going.

PTD와 카고를 컨쥬게이션시키지 않고, 카고를 세포내로 전달할 경우, 다음과 같은 장점을 갖는다. (1) 컨쥬게이션에 의해 PTD 혹은 카고의 성질이 변형될 가능성을 배제할 수 있다, (2) 컨쥬게이션을 위해 필요한 합성 및 정제 등의 추가적인 과정에 소요되는 시간과 노력을 배제할 수 있다. 그 결과, 카고의 기능을 손쉽게 평가할 수 있으며, 카고와 PTD의 조합 등과 같은 유연성도 증가시킬 수 있다. When delivering cargo intracellularly without conjugating PTD and cargo, it has the following advantages. (1) Conjugation can eliminate the possibility of modification of the properties of PTD or cargo, and (2) Eliminate the time and effort required for additional processes such as synthesis and purification necessary for conjugation. As a result, you can easily assess the cargo's functionality and increase flexibility, such as the combination of cargo and PTD.

이에 본 발명자들은 카고와 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 카고를 유효하게 세포 내로 도입할 수 있는 새로운 단백질 전달 도메인으로서 세포내 전달 도메인(intracellular transduction domain; ITD)을 개발하기에 이르렀다.Accordingly, the present inventors have developed an intracellular transduction domain (ITD) as a new protein transfer domain capable of effectively introducing cargo into a cell without conjugation with the cargo.

따라서, 본 발명은 전술한 바와 같은 종래기술의 문제점을 해결하는데 그 목적이 있는 것으로서, 카고와 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 카고를 유효하게 세포 내로 도입할 수 있는 새로운 세포내 전달 도메인(intracellular transduction domain; ITD) 및 이를 이용한 카고의 전달 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, the present invention aims to solve the problems of the prior art as described above, and includes a novel intracellular transduction domain capable of effectively introducing cargo into a cell without being conjugated with cargo; ITD) and a cargo delivery method using the same.

본 발명의 세포내로 카고를 전달하기 위한 펩타이드는 세포내 전달 도메인을 포함하되, 상기 세포내 전달 도메인은 전하를 띄는 물질 간의 상호작용 (charge-charge interaction) 및/또는 상기 세포내 전달 도메인-상기 카고 복합체의 수용성(solubility)을 높일 수 있는 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 (hydrophophic interaction) 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 소수성 도메인을 포함하는 펩타이드이며, 상기 카고와 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 상기 카고를 세포 내로 전달하는 것을 특징으로 한다.Peptides for delivering cargo into cells of the present invention include intracellular delivery domains, wherein the intracellular delivery domains are charged-charge interactions and / or the intracellular delivery domains-the cargoes A peptide comprising a hydrophilic domain that can increase the solubility of the complex and a hydrophobic domain that can be used for hydrophophic interaction and / or interaction with the cell membrane, and is not conjugated with the cargo. In characterized in that the cargo is delivered to the cell.

상기 친수성 도메인은 RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV 및 GRKKRRQRRR로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다. The hydrophilic domain is preferably at least one amino acid sequence selected from the group of amino acid sequences consisting of RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV and GRKKRRQRRR.

또한, 상기 소수성 도메인은 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, 및 GAAIGLAWIPYFGPAA로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다.Further, it is the hydrophobic domain is at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequence of the group consisting of GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, and GAAIGLAWIPYFGPAA desirable.

상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 펩타이드의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단, 또는 그 근방에 위치할 수 있다. 또한, 상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 그 아미노산 서열이 레트로 및/또는 인버소 형태로 합성될 수 있다. 레트로 형태(retro form)란 아미노산의 선형 순서의 역순 형태를 말하며, 인버소(inverso)란 L-아미노산 대신 D-아미노산으로 합성된 형태를 말한다(Vives, 2003, Cellular uptake of the Tat peptide: an endocytosis mechanism following ionic interactions. J. Mol. Recog. 16, 265-271).The hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain may be located at or near the amino or carboxy terminus of the peptide. In addition, the hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain may be synthesized in its amino acid sequence in retro and / or inverso form. Retro form refers to the reverse form of amino acid linear order, and inverso refers to the form synthesized by D-amino acid instead of L-amino acid (Vives, 2003, Cellular uptake of the Tat peptide: an endocytosis mechanism following ionic interactions.J. Mol. Recog. 16, 265-271).

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 1 내지 서열번호 22의 아미노산 서열들 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것이 바람직하다.In one embodiment of the invention, the intracellular delivery domain is preferably a peptide comprising at least one amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 22.

또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and the cysteamine is added to the C-terminus .

또한, 본 발명의 세포내로 카고를 전달하기 위한 세포내 전달 도메인은 서열번호 1 내지 서열번호 22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. In addition, the intracellular delivery domain for delivering cargo into cells of the invention comprises at least one amino acid sequence having at least 70% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1-22.

바람직하기로는 상기 세포 내 전달 도메인은 서열번호 1 내지 서열번호 22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. Preferably said intracellular delivery domain comprises at least one amino acid sequence having at least 90% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22.

또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 내 전달 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and the cysteamine is added to the C-terminus .

본 발명의 세포내로 카고를 전달하는 방법은, 세포내 전달 도메인을 준비하는 단계와, 세포 내로 도입할 카고를 준비하는 단계와, 상기 카고와 상기 세포내 전달 도메인을 컨쥬게이션하지 않은 상태에서 세포에 처리하는 단계와, 상기 카고를 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.The method for delivering cargo into a cell of the present invention comprises the steps of preparing an intracellular delivery domain, preparing a cargo to be introduced into the cell, and in the cell without conjugating the cargo and the intracellular delivery domain. Treating and introducing the cargo into the cell.

본 발명의 세포내로 카고를 전달하는 방법의 일실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 전하를 띄는 물질 간의 상호작용(charge-charge interaction) 및/또는 상기 세포내 전달 도메인-상기 카고 복합체의 수용성(solubility)을 높일 수 있는 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 (hydrophophic interaction) 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 소수성 도메인을 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 한다.In one embodiment of the method of delivering cargo into a cell of the invention, the intracellular delivery domain is a charge-charge interaction between the charged material and / or the intracellular delivery domain-soluble of the cargo complex. and a hydrophilic domain capable of increasing solubility and a hydrophobic domain that can be used for hydrophophic interaction and / or interaction with the cell membrane.

또한, 상기 친수성 도메인은 RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV 및 GRKKRRQRRR로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다. In addition, the hydrophilic domain is preferably at least one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequence consisting of RRRQRRKKRG, YARAAARQARA, YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, PKKKRKV and GRKKRRQRRR.

또한, 상기 소수성 도메인은 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, 및 GAAIGLAWIPYFGPAA로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산 서열인 것이 바람직하다.Further, it is the hydrophobic domain is at least one amino acid sequence selected from the amino acid sequence of the group consisting of GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, GDIMGEWGNEIFGAIAGFLG, KETWWETWWTE, TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, DPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD, KLAKLAKKLAKLAK, PLSSIFSRIGDG, GGRLAYLRRRWAVLGR, GLFEAIAEFIEGGWEGLIEG, GLFKAIAKFIKGGWKGLIKG, FFGAVIGTIALGVATA, GALFLGFLGAAGSTMGA, VTVLALGALAGVGVG, AAVLLPVLLAAP, and GAAIGLAWIPYFGPAA desirable.

상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 펩타이드의 아미노 말단 혹은 카르복시 말단, 또는 그 근방에 위치할 수 있다. 또한, 상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 그 아미노산 서열이 레트로 및/또는 인버소 형태로 합성될 수 있다.The hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain may be located at or near the amino or carboxy terminus of the peptide. In addition, the hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain may be synthesized in its amino acid sequence in retro and / or inverso form.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 1 내지 서열번호 22의 아미노산 서열들 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드인 것이 바람직하다.In a preferred embodiment of the present invention, the intracellular delivery domain is preferably a peptide comprising at least one amino acid sequence of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 22.

또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and the cysteamine is added to the C-terminus .

또한, 본 발명의 세포내로 카고를 전달하는 방법의 다른 실시예에 있어서, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 1 내지 서열번호 22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. Further, in another embodiment of the method of delivering cargo into a cell of the invention, the intracellular delivery domain is at least one having at least 70% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 22 Amino acid sequence of a.

바람직하기로는 상기 세포 내 전달 도메인은 서열번호 1 내지 서열번호 22로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함한다. Preferably said intracellular delivery domain comprises at least one amino acid sequence having at least 90% sequence identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 1 to 22.

또한, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 세포내 전달 도메인은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형될 수 있다.In addition, the intracellular delivery domain can be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus. For example, the intracellular delivery domain may comprise an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, wherein the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 may be modified in such a way that the N-terminus is acetylated and the cysteamine is added to the C-terminus .

본 발명에 있어서, 상기 카고는 저분자 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 입자, 바이러스, 리포좀 등인 것이 바람직하다.In the present invention, the cargo is preferably a low molecular weight compound, peptide, protein, nucleic acid, particles, viruses, liposomes and the like.

본 발명에서 사용되는 입자는 그 직경(diameter)이 1nm 내지 2,000 nm인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 세포 내로 도입가능한 크기를 갖는 입자를 모두 포함한다.The particles used in the present invention preferably have a diameter of 1 nm to 2,000 nm. However, the present invention is not limited thereto and includes all particles having a size that can be introduced into a cell.

본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD) 및 방법은 세포내 전달 도메인과 카고가 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 세포내로 카고를 도입할 수 있어 복잡한 결합 과정, 정제 과정 및 분리 과정 없이 바로 카고를 효율적으로 그리고 용이하게 세포내로 도입할 수 있는 장점이 있다.Intracellular delivery domains (ITDs) and methods of the present invention can introduce cargo into cells without the intracellular delivery domain and cargo conjugated to efficiently and efficiently deliver cargo directly without complex binding, purification and separation processes. There is an advantage that can be easily introduced into the cell.

또한, 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD) 및 방법은 카고와 세포내 전달 도메인의 컨쥬게이션 없이 세포 내로 카고를 도입할 수 있음으로써 카고 및 세포내 전달 도메인의 특성에 변화를 주지 않고 카고를 유효하게 세포 내로 전달할 수 있다.In addition, the intracellular delivery domains (ITDs) and methods of the present invention are capable of introducing cargo into cells without conjugation of the cargo with the intracellular delivery domains, thereby making the cargo effective without altering the properties of the cargo and intracellular delivery domains. Can be delivered intracellularly.

따라서, 본 발명은 신약개발 및 치료분야에 있어서 효과적으로 세포내로 카고를 전달하는 방법을 제공한다.Accordingly, the present invention provides a method for effectively delivering cargo into cells in the field of drug development and treatment.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on examples. The following examples of the present invention are not intended to limit or limit the scope of the present invention only to embody the present invention. It will be understood by those of ordinary skill in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. References cited in the present invention are incorporated herein by reference.

실시예 1: 세포내 전달 도메인(Intracellular Transduction Domain; ITD)의 합성Example 1 Synthesis of Intracellular Transduction Domain (ITD)

본 발명의 세포내 전달 도메인은 고체상 합성(solid-phase synthesis)에 의해 합성하였고, 합성은 본 발명자들이 제공한 아미노산 서열정보에 기초하여 시그마제노시스(Sigma Genosys)(1442 Lake Front Circle The Woodlands TX 77380, USA에 소재) 및 애니젠(주)(Anygen Co., Ltd.)(대한민국 광주광역시 소재)에 의뢰하여 수행하였다. The intracellular delivery domain of the present invention was synthesized by solid-phase synthesis, and the synthesis was based on amino acid sequence information provided by the inventors of Sigma Genosys (1442 Lake Front Circle The Woodlands TX 77380). , USA) and Anygen Co., Ltd. (Gwangju Metropolitan City, Korea).

전달하고자 하는 카고와의 컨쥬게이션 없이도 세포 내로 카고를 도입할 수 있는 새로운 세포 내 전달 도메인은 전하를 띄는 물질 간의 상호작용(charge-charge interaction) 및/또는 세포 내 전달 도메인-카고 복합체의 수용성(solubility)을 높일 수 있는 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 (hydrophophic interaction) 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 소수성 도메인을 갖는 펩타이드이다. 표 1에는 이와 같은 방식으로 선정되어 합성된 세포내 전달 도메인들(ITDs)의 아미노산 서열이 예시되어 있다. New intracellular delivery domains that can introduce cargo into the cell without conjugation with the cargo to be delivered are charged with charge-charge interactions and / or solubility of the intracellular delivery domain-cargo complex. It is a peptide having a hydrophilic domain that can increase), and a hydrophobic domain that can be used for hydrophophic interaction and / or cell membrane interaction. Table 1 illustrates the amino acid sequence of intracellular delivery domains (ITDs) selected and synthesized in this manner.

[표 1] 세포내 전달 도메인들(ITDs)의 아미노산 서열 예시Table 1 Example Amino Acid Sequences of Intracellular Delivery Domains (ITDs)

서열order
번호number 펩타이드 코드Peptide Code 아미노산 서열Amino acid sequence 친수성 도메인 후보 서열Hydrophilic domain candidate sequences 1One P071P071 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGGRKKRRQRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGGRKKRRQRRR GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 22 P072P072 GRKKRRQRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDGGRKKRRQRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 33 P073P073 RRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLGRRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG RRRQRRKKRGRRRQRRKKRG 44 P074P074 GDIMGEWGNEIFGAIAGFLGRRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLGRRRQRRKKRG RRRQRRKKRGRRRQRRKKRG 55 P0721P0721 KKKYARAAARQARAGLFGAIAGFIENGWEGMIDG KKKYARAAARQARAGLFGAIAGFIENGWEGMIDG KKKYARAAARQARAKKKYARAAARQARA 66 P0722P0722 YARVRRRGPRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG YARVRRRGPRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG YARVRRRGPRRYARVRRRGPRR 77 P0723P0723 RQIKIWFQNRRMKWKKGLFGAIAGFIENGWEGMIDG RQIKIWFQNRRMKWKKGLFGAIAGFIENGWEGMIDG RQIKIWFQNRRMKWKKRQIKIWFQNRRMKWKK 88 P0724P0724 RRRRRRRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG RRRRRRRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG RRRRRRRRRRRRRRRRRR 99 P0725P0725 PKKKRKVGLFGAIAGFIENGWEGMIDG PKKKRKVGLFGAIAGFIENGWEGMIDG PKKKRKVPKKKRKV 1010 P0801P0801 GRKKRRQRRRKETWWETWWTEGRKKRRQRRRKETWWETWWTE GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1111 P0802P0802 GRKKRRQRRRTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRKGRKKRRQRRRTRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1212 P0803P0803 GRKKRRQRRRDPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPDGRKKRRQRRRDPKGDPKGVTVTVTVTVTGKGDPKPD GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1313 P0804P0804 GRKKRRQRRRKLAKLAKKLAKLAKGRKKRRQRRRKLAKLAKKLAKLAK GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1414 P0805P0805 GRKKRRQRRRPLSSIFSRIGDGGRKKRRQRRRPLSSIFSRIGDG GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1515 P0806P0806 GRKKRRQRRRRGGRLAYLRRRWAVLGRGRKKRRQRRRRGGRLAYLRRRWAVLGR GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1616 P0807P0807 GRKKRRQRRRGLFEAIAEFIEGGWEGLIEGGRKKRRQRRRGLFEAIAEFIEGGWEGLIEG GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1717 P0808P0808 GRKKRRQRRRGLFKAIAKFIKGGWKGLIKGGRKKRRQRRRGLFKAIAKFIKGGWKGLIKG GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1818 P0809P0809 GRKKRRQRRRFFGAVIGTIALGVATAGRKKRRQRRRFFGAVIGTIALGVATA GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 1919 P0810P0810 GRKKRRQRRRGALFLGFLGAAGSTMGAGRKKRRQRRRGALFLGFLGAAGSTMGA GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 2020 P0811P0811 GRKKRRQRRRVTVLALGALAGVGVGGRKKRRQRRRVTVLALGALAGVGVG GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 2121 P0812P0812 GRKKRRQRRRAAVLLPVLLAAPGRKKRRQRRRAAVLLPVLLAAP GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR 2222 P0813P0813 GRKKRRQRRRGAAIGLAWIPYFGPAAGRKKRRQRRRGAAIGLAWIPYFGPAA GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR **** Ac-P072Ac-P072 Acetyl-GRKKRRQRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG-cysteamineAcetyl-GRKKRRQRRRGLFGAIAGFIENGWEGMIDG-cysteamine GRKKRRQRRRGRKKRRQRRR

* * 표시는 펩타이드의 N-말단이 아세틸화되고 C-말단에 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형된 펩타이드를 의미한다. * * Indicates a peptide modified in such a way that the N-terminus of the peptide is acetylated and cysteamine is added to the C-terminus.

실시예 2: 본 발명의 새로운 펩타이드를 이용한 입자의 세포 내 전달Example 2: Intracellular Delivery of Particles Using Novel Peptides of the Invention

본 실시예에 사용되는 입자는 치료목적 또는 연구목적으로 당업계에서 널리 사용되고 있는 입자라면 어느 것이라도 사용이 가능하다. 예를 들어, 골드 파티클, 비드 등을 들 수 있다. 본 실시예에서는 하나의 일례로서 스트렙타비딘이 컨쥬게이션된 수퍼파라마그네틱 입자를 제작하여 사용하거나(미국특허 제5,665,582호; 미국특허공개 제2003/0092029A1호), 입자를 제작판매하고 있는 회사로부터 구입하여 사용할 수 있다. 펩타이드를 이용하여 입자를 컨쥬게이션 과정없이 세포 안으로 전달시키기 위하여, P071, P072, P073, P074, P0722, P0723, P0724, P0725 및 Ac-P072의 펩타이드를 이용하여 실험을 수행하였다. 카고인 입자로는 스트렙타비딘이 컨쥬게이션된 수퍼파라마그네틱 입자를 사용하였다. The particles used in the present embodiment may be used as long as the particles are widely used in the art for therapeutic or research purposes. For example, gold particle, bead, etc. are mentioned. In this embodiment, a superparamagnetic particle conjugated with streptavidin is used as an example (US Patent No. 5,665,582; US Patent Publication No. 2003 / 0092029A1), or purchased from a company that manufactures and sells particles. Can be used. Experiments were performed using peptides of P071, P072, P073, P074, P0722, P0723, P0724, P0725 and Ac-P072 to deliver particles into cells without conjugation. As the cargo particles, superparamagnetic particles conjugated with streptavidin were used.

μClear 96-웰 플레이트(Greiner에서 구입, Cat. No. 655090)에 HeLa 세포(ATCC에서 구입, Cat. No. CCL-2)를 웰당 6,000개 세포수(6,000 cells/well)로 계대배양(subculture)하였다. 다음날, 다음과 같은 방법으로 입자를 세포에 처리하였다:Subculture of HeLa cells (purchased from ATCC, Cat.No. CCL-2) to μClear 96-well plates (Greiner, Cat. No. 655090) at 6,000 cells / well It was. The following day, the particles were treated with cells as follows:

1) 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)을 DPBS로 각각 20 μM 및 10 μM로 희석하여 준비하였다;1) The intracellular delivery domain (ITD) of the present invention was prepared by diluting with DPBS at 20 μM and 10 μM, respectively;

2) 스트렙타비딘이 컨쥬게이션된 수퍼파라마그네틱 입자(50 nm, 스트렙타비딘 입자) 10㎕와 상기 1)에서 준비된 세포내 전달 도메인 희석액 10㎕를 혼합한 후 상온에서 30분간 반응시켰다;2) 10 μl of the superparamagnetic particles (50 nm, streptavidin particles) conjugated with streptavidin and 10 μl of the intracellular delivery domain dilution prepared in 1) above were mixed and reacted at room temperature for 30 minutes;

3) 전날 준비한 헬라 세포를 DPBS로 1회 세척 후, 2)에서 준비된 스트렙타비딘 입자와 ITD 혼합액을 20 ㎕/웰로 처리하고, OPTI MEM I을 80 μM/웰로 첨가한 후 37℃ 5% CO2 배양기에서 16시간 동안 배양하였다;3) Washing the prepared HeLa cells with DPBS once the day before, treated with 20 μl / well of the streptavidin particles and ITD mixture prepared in 2) and adding 80 μM / well of OPTI MEM I to 37 ° C. 5% CO 2 Incubated for 16 hours in the incubator;

4) 세포 내에 전달되지 않고, 세포막에 결합되어 있는 입자-ITD 복합체를 제거하기 위하여, 세포를 DPBS로 세척하고 30 ㎕/well의 트립신-EDTA (Welgene에서 구입)를 10~30초간 처리하였다. 그런 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 150 ㎕/well로 첨가한 후 파이펫팅하여 세포를 떼어내고, 이를 다시 새로운 96-well μClear Black Plate (Greiner에서 구입)에 계대배양한 후 37℃ CO2 배양기에서 3~4 시간 동안 배양하였다;4) Cells were washed with DPBS and treated with 30 μl / well of trypsin-EDTA (from Welgene) for 10-30 seconds to remove particle-ITD complexes that were not delivered into cells and bound to the cell membrane. Then, add DMEM medium containing 10% FBS to 150 μl / well and pipette to remove the cells, which are then subcultured on a new 96-well μClear Black Plate (purchased from Greener) and then at 37 ° C. CO Incubate for 3-4 hours in 2 incubators;

5) 세포 내에 전달된 입자를 확인하기 위하여 프러시안블루 염색(Prussian Blue Staining)을 시행하였다. 프러시안 블루 염색은 세포 내에 전달된 산화철 입자를 특이적으로 염색하여 관찰하는데 사용된다(참고문헌: Frank, J. A., Miller, B. R., Arbab, A. S., Zywicke, H. A., Jordan, E. K., Lewis, B. K., Bryant, L. H., & Bulte, J. W. M. (2003) Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents. Radiology 228: 480-487). 세포를 1X D-PBS(Welgene에서 구입, Cat. No. LB001-02) 100 ㎕/well로 1회 세척하였고, 37% 포름알데히드(Sigma에서 구입)를 1X D-PBS로 10배 희석하여 3.7% 포름알데히드 용액을 만들었다. 상기 포름알데히드 용액을 100 ㎕/well로 10분 동안 세포에 처리하여 세포를 고정하였다. 프러시안 블루 염색은 프러시안 블루 아이언 스테인 키트(Prussian Blue Iron Stain Kit) (Polysciences에서 구입, Cat. No. 24199)를 이용하여 수행하였다. 프러시안 블루 염색 후 투과광 이미지는 캐논사의 파워샷 A640 디지털 카메라가 장착된 니콘사의 이클립스 TS100-F 현미경을 사용하여 얻었다.5) Prussian Blue Staining was performed to confirm the particles delivered into the cells. Prussian blue staining is used to specifically stain and observe iron oxide particles delivered in cells (Ref. Frank, JA, Miller, BR, Arbab, AS, Zywicke, HA, Jordan, EK, Lewis, BK, Bryant , LH, & Bulte, JWM (2003) Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents.Radiology 228: 480-487). Cells were washed once with 100 μl / well of 1 × D-PBS (purchased from Welgene, Cat.No. LB001-02) and diluted 3.7% with 10% dilution of 37% formaldehyde (purchased from Sigma) with 1 × D-PBS. Formaldehyde solution was made. The formaldehyde solution was treated with cells at 100 μl / well for 10 minutes to fix the cells. Prussian blue staining was performed using the Prussian Blue Iron Stain Kit (purchased from Polysciences, Cat. No. 24199). Transmission images after Prussian blue staining were obtained using a Nikon Eclipse TS100-F microscope equipped with a Canon PowerShot A640 digital camera.

그 결과는 도 1에서 확인되는 바와 같다. 도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의해 카고인 입자가 세포 내로 전달되었고, 세포 내로 전달된 입자는 프러시안 블루에 의해 염색된 것을 확인할 수 있었다. 결국, 본 발명의 새로운 세포내 전달 도메인은 입자와의 컨쥬게이션 없이 입자를 세포 내로 유효하게 전달할 수 있음을 확인할 수 있다.The results are as shown in FIG. As shown in Figure 1, by the intracellular delivery domain of the present invention the cargo particles were delivered into the cells, it was confirmed that the particles delivered into the cells stained by Prussian blue. As a result, it can be seen that the new intracellular delivery domain of the present invention can effectively deliver particles into cells without conjugation with the particles.

실시예 3: 형광표지된 입자의 세포 내 전달Example 3: Intracellular Delivery of Fluorescently Labeled Particles

본 발명의 세포내 전달 도메인이 형광표지된 입자를 컨쥬게이션 없이 세포내로 전달할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.In order to determine whether the intracellular delivery domain of the present invention can deliver fluorescently labeled particles into cells without conjugation, the following experiment was performed.

μClear 96-웰 플레이트(Greiner에서 구입, Cat. No. 655090)에 HeLa 세포(ATCC에서 구입, Cat. No. CCL-2)를 웰당 6,000개 세포수(6,000 cells/well)로 계대배양(subculture)하였다. 다음날, 다음과 같은 방법으로 카고인 입자를 세포에 처리하였다:Subculture of HeLa cells (purchased from ATCC, Cat.No. CCL-2) to μClear 96-well plates (Greiner, Cat. No. 655090) at 6,000 cells / well It was. The following day, the cargoin particles were treated with the cells as follows:

1) 형광표지된 입자의 제조를 위해, 각각의 반응 당(per reaction) 0.1 mM의 비오틴-FITC 1㎕, 1X D-PBS (Welgene에서 구입, Cat. No. LB001-02) 3㎕ 및 스트렙타비딘이 컨쥬게이션된 수퍼파라마그네틱 입자(50 nm, 스트렙타비딘 입자) 10㎕를 혼합한 후 상온에서 30분 동안 반응시켰다;1) For the preparation of fluorescently labeled particles, 1 μl of biotin-FITC at 0.1 mM per reaction, 3 μl of 1 × D-PBS (purchased from Welgene, Cat. No. LB001-02) and streptabi 10 μl of the conjugated superparamagnetic particles (50 nm, streptavidin particles) conjugated with Dean were reacted at room temperature for 30 minutes;

2) 상기 30분 반응 경과 후, 혼합액을 그대로 사용하거나 혹은 혼합액을 당업계에서 알려진 자성물질 분리방법, 예를 들어 HGMS 기술(High gradient magnetic separation)을 이용하여 정제하였다[미국특허 제4,247,398호(1981. 1. 27. 발행) 및 Melville, D., F. Paul, and S. Roath (1975) Direct magnetic separation of red cells from whole blood. Nature 255:706 참조];2) After the reaction for 30 minutes, the mixed solution is used as it is or the mixed solution is purified using a magnetic material separation method known in the art, for example, HGMS technology (High gradient magnetic separation) [US Pat. No. 4,247,398 (1981) January 27) and Melville, D., F. Paul, and S. Roath (1975) Direct magnetic separation of red cells from whole blood. Nature 255: 706;

3) 상기 2)과정에서 준비된 입자 반응액 14㎕ 당 0.1 mM의 ITD 용액을 각각 1㎕씩을 혼합한 후 상온에서 30분 동안 반응시켰다;3) 1 μl of 0.1 mM ITD solution was mixed per 14 μl of the particle reaction solution prepared in step 2), followed by reaction at room temperature for 30 minutes;

4) 전날 준비된 세포를 DMEM(Welgene에서 구입, LM001-09)으로 1회 세척한 후, 상기 3)과정에서 준비된 반응액으로 처리하여 16 시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다;4) The cells prepared on the previous day were washed once with DMEM (Welgene, LM001-09), and then treated with the reaction solution prepared in step 3), and cultured in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 16 hours;

5) 다음날, 형광표지된 입자/ITD 혼합액이 처리된 세포를 OPTI-MEM I(Invitrogen에서 구입, Cat. No. 31985-070) 배지를 이용하여 2회 세척한 후, OPTI-MEM I 배지가 들어 있는 상태에서 세포 안에 전달된 입자에 컨쥬게이션된 FITC 형광을 관찰하였다. 형광 관찰을 위하여 본 실시예에서는 대물렌즈 Uplan Apo 40X0.85가 장착된 올림푸스사의 형광현미경 FV1000을 이용하여 세포의 형광 이미지를 얻었다;5) The following day, cells treated with the fluorescently labeled particles / ITD mixture were washed twice with OPTI-MEM I (purchased from Invitrogen, Cat. No. 31985-070) medium, and then OPTI-MEM I medium was added. In the presence of FITC fluorescence conjugated to the particles delivered in the cell was observed. For fluorescence observation, in this Example, a fluorescence image of the cells was obtained using an Olympus fluorescence microscope FV1000 equipped with an objective lens Uplan Apo 40X0.85;

6) 형광 관찰 후 입자를 확인하기 위하여 실시예 2에서와 같이 프러시안블루 염색(Prussian Blue Staining)을 시행하였다.6) Prussian Blue Staining was performed as in Example 2 to identify the particles after fluorescence observation.

도 2에 도시된 바와 같이 본 발명의 세포내 전달 도메인과 형광표지된 입자를 처리한 살아있는 세포에서는 입자에 컨쥬게이션된 FITC 형광이 관찰되었다. 또한, 프러시안 블루 염색을 수행한 결과 세포 안에 도입된 입자가 염색되는 것을 확인하였다. 결국, 본 발명의 새로운 단백질 전달 도메인은 형광표지된 입자와의 컨쥬게이션 없이 형광표지된 입자를 세포 내로 유효하게 전달할 수 있음을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 2, FITC fluorescence conjugated to the particles was observed in living cells treated with the intracellular delivery domain and the fluorescently labeled particles of the present invention. In addition, Prussian blue staining was confirmed that the particles introduced into the cells are stained. As a result, it can be seen that the novel protein delivery domain of the present invention can effectively deliver fluorescently labeled particles into cells without conjugation with the fluorescently labeled particles.

실시예 4: 본 발명의 새로운 펩타이드를 이용한 다양한 크기의 입자의 세포 내 전달Example 4 Intracellular Delivery of Particles of Various Sizes Using the New Peptides of the Invention

본 발명의 펩타이드를 이용하여 다양한 크기의 입자를 컨쥬게이션 없이 세포 내로 전달할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 카고인 입자로는 스트렙타비딘이 컨쥬게이션된 수퍼파라마그네틱 입자(직경이 50 nm, 130 nm, 250 nm 및 1500 nm인 스트렙타비딘 입자)를 사용하였다.In order to determine whether particles of various sizes can be delivered into cells without conjugation using the peptide of the present invention, the following experiment was performed. As the cargo particles, superparamagnetic particles (streptavidin particles having diameters of 50 nm, 130 nm, 250 nm, and 1500 nm) were used.

μClear 96-웰 플레이트(Greiner에서 구입, Cat. No. 655090)에 HeLa 세포(ATCC에서 구입, Cat. No. CCL-2)를 웰당 6,000개 세포수(6,000 cells/well)로 계대배양(subculture)하였다. 다음날, 다음과 같은 방법으로 카고인 입자를 세포에 처리하였다:Subculture of HeLa cells (purchased from ATCC, Cat.No. CCL-2) to μClear 96-well plates (Greiner, Cat. No. 655090) at 6,000 cells / well It was. The following day, the cargoin particles were treated with the cells as follows:

1) 입자/ITD 혼합액의 제조는 실시예 2에서와 같이 수행하였다;1) Preparation of the particle / ITD mixture was carried out as in Example 2;

2) 전날 준비된 세포를 DMEM(Welgene에서 구입, LM001-09)으로 1회 세척한 후, 상기 1)과정에서 준비된 입자/ITD 혼합액으로 처리하여 16 시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다;2) The cells prepared on the previous day were washed once with DMEM (Welgene, LM001-09), and then treated with the particles / ITD mixture prepared in step 1) for 16 hours and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 16 hours. Was done;

3) 다음날, 입자/ITD 혼합액이 처리된 세포를 OPTI-MEM I(Invitrogen에서 구입, Cat. No. 31985-070) 배지를 이용하여 2회 세척한 후, 프러시안 블루 염색(Prussian Blue Staining)을 시행하였다. 세포를 1X D-PBS(Welgene에서 구입, Cat. No. LB001-02) 100㎕/well로 1회 세척하였고, 37% 포름알데히드(Sigma에서 구입)를 1X D-PBS로 10배 희석하여 3.7% 포름알데히드 용액을 만들었다. 상기 포름알데히드 용액을 100㎕/well로 10분 동안 세포에 처리하여 세포를 고정하였다. 프러시안 블루 염색은 프러시안 블루 아이언 키트(Prussian Blue Iron Stain Kit) (Polysciences에서 구입, Cat. No. 24199)를 이용하여 수행하였다. 프러시안 블루 염색 후 투과광 이미지는 캐논사의 파워샷 A640 디지털 카메라가 장착된 니콘사의 이클립스 TS100-F 현미경을 사용하여 얻었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의하여 50nm, 130nm, 250nm 및 1500 nm 크기의 입자들이 세포 내에 전달되는 것이 프러시안 블루 염색에 의하여 확인되었다.3) The following day, the cells treated with the particle / ITD mixture were washed twice with OPTI-MEM I (purchased from Invitrogen, Cat. No. 31985-070) medium, followed by Prussian Blue Staining. Was implemented. Cells were washed once with 100 μl / well of 1 × D-PBS (purchased from Welgene, Cat.No. LB001-02), and 3.7% diluted 37-fold with 1 × D-PBS with 37% formaldehyde (purchased from Sigma). Formaldehyde solution was made. Cells were fixed by treating the cells with 100 μl / well of the formaldehyde solution for 10 minutes. Prussian blue staining was performed using the Prussian Blue Iron Stain Kit (purchased from Polysciences, Cat. No. 24199). Transmission images after Prussian blue staining were obtained using a Nikon Eclipse TS100-F microscope equipped with a Canon PowerShot A640 digital camera. As shown in FIG. 3, it was confirmed by Prussian blue staining that particles of 50 nm, 130 nm, 250 nm and 1500 nm size were delivered into cells by the intracellular delivery domain of the present invention.

실시예 5: 덱스트란이 코팅된 입자의 세포내 전달Example 5: Intracellular Delivery of Dextran Coated Particles

본 실시예에서 카고의 일례로서 사용되는 덱스트란이 코팅된 입자는 다음과 같이 제조하였다. 덱스트란 T40 10 g을 18 ml의 증류수에 녹인 후, 1.5 g의 FeCl3-6H2O와 0.64 g의 FeCl2-4H2O를 첨가하고 섭씨 40℃에서 교반하여 반응시켰다. 반응 후, 4N의 NaOH 10 ml을 첨가하고 섭씨 70℃에서 5분간 중탕 반응시켰다. 30%의 CH3COOH 5.5 ml을 첨가하여 중화시키고, 600 g에서 5분간 원심분리하여 침전물을 제거하고, 다시 2,000 g에서 10분간 2회 원심분리하여 침전물을 제거한 후, 0.22 μm 크기의 필터를 사용하여 덱스트란이 코팅된 입자를 여과하였다.Dextran-coated particles used as an example of cargo in this example were prepared as follows. 10 g of dextran T40 was dissolved in 18 ml of distilled water, and then 1.5 g of FeCl 3 -6H 2 O and 0.64 g of FeCl 2 -4H 2 O were added and stirred at 40 ° C. to react. After the reaction, 10 ml of 4N NaOH was added and the reaction mixture was bathed at 70 ° C. for 5 minutes. Neutralize by adding 5.5 ml of 30% CH 3 COOH, remove the precipitate by centrifugation at 600 g for 5 minutes, remove the precipitate by centrifugation twice at 2,000 g for 10 minutes, and then use a 0.22 μm filter. The dextran coated particles were filtered.

덱스트란이 코팅된 입자가 자성을 나타내는 경우 당업계에서 알려진 자성물질 분리방법, 예를 들어 HGMS 기술(High gradient magnetic separation)을 이용하여 추가로 정제하였다[미국특허 제4,247,398호(1981. 1. 27. 발행) 및 Melville, D., F. Paul, and S. Roath (1975) Direct magnetic separation of red cells from whole blood. Nature 255:706 참조].If the dextran coated particles are magnetic, they are further purified using magnetic material separation methods known in the art, such as HGMS technology (High gradient magnetic separation) [US Pat. No. 4,247,398 (1981. 1. 27). And Melville, D., F. Paul, and S. Roath (1975) Direct magnetic separation of red cells from whole blood. Nature 255: 706.

본 발명의 세포내 전달 도메인을 이용하여 텍스트란이 코팅된 입자를 컨쥬게이션 과정없이 세포 안으로 전달시키는 실험을 수행하였다. 이를 위해 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD)을 이용하여 실시예 2에서와 같이 실험을 수행하였다.Using intracellular delivery domains of the present invention was carried out experiments to deliver the textran-coated particles into the cells without the conjugation process. To this end, experiments were performed as in Example 2 using the intracellular delivery domain (ITD) of the present invention.

도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의해 덱스트란이 코팅된 입자가 세포 내로 전달되었고, 세포 내로 전달된 입자는 프러시안 블루에 의해 염색된 것을 확인할 수 있었다. 결국, 본 발명의 새로운 세포내 전달 도메인은 덱스트란이 코팅된 입자와의 컨쥬게이션 없이 덱스트란이 코팅된 입자를 세포 내로 유효하게 전달할 수 있음을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 4, the dextran-coated particles were delivered into cells by the intracellular delivery domain of the present invention, and the particles delivered into the cells were stained by Prussian blue. As a result, it can be seen that the new intracellular delivery domain of the present invention can effectively deliver dextran coated particles into cells without conjugation with the dextran coated particles.

실시예 6: 저분자 화합물의 세포내 전달Example 6: Intracellular Delivery of Low Molecular Compounds

본 발명의 세포내 전달 도메인이 살아있는 세포막을 투과하지 못하는 것으로 알려진 저분자 화합물을 컨쥬게이션 없이 세포 내로 전달하는지 여부를 확인하기 위하여 프로피디움 아이오다이드(propidium iodie)를 카고로 선택하였다. 프로피디움 아이오다이드는 분자량이 668.4 Da인 저분자 화합물로 DNA 및 RNA에 결합되는 형광물질로 사용되나, 살아있는 세포의 세포막을 직접 투과하지 못하는 것으로 알려져 있다(http://en.wikipedia.org/wiki/Propidium_iodide).Propidium iodie was selected as the cargo to determine whether the intracellular delivery domain of the invention delivers small molecule compounds known to not penetrate live cell membranes into cells without conjugation. Propidium iodide is a low molecular weight compound with a molecular weight of 668.4 Da and is used as a fluorescent material that binds to DNA and RNA, but is known to not directly penetrate the cell membrane of living cells (http://en.wikipedia.org/wiki/ Propidium_iodide).

본 발명의 세포내 전달 도메인이 카고인 프로피디움 아이오다이드를 컨쥬게이션 없이 세포 내로 전달할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.Intracellular delivery domain of the present invention is cargo propidium iodide In order to determine whether the cells can be delivered without conjugation, the following experiment was performed.

μClear 96-웰 플레이트(Greiner에서 구입, Cat. No. 655090)에 HeLa 세포(ATCC에서 구입, Cat. No. CCL-2)를 웰당 6,000개 세포수(6,000 cells/well)로 계대배양(subculture)하였다. 다음날, 다음과 같은 방법으로 카고인 프로피디움 아이오다이드를 세포에 처리하였다:Subculture of HeLa cells (purchased from ATCC, Cat.No. CCL-2) to μClear 96-well plates (Greiner, Cat. No. 655090) at 6,000 cells / well It was. The following day, the cargoin propidium iodide was treated with cells as follows:

1) 10 μM로 희석된 프로피디움 아이오다이드 용액 10 ㎕를 0.2 mM로 희석된 본 발명의 세포내 전달 도메인(ITD) 용액 10 ㎕와 혼합한 후 상온에서 30분 동안 반응시켰다;1) 10 μl of propidium iodide solution diluted to 10 μM was mixed with 10 μl of the intracellular delivery domain (ITD) solution of the present invention diluted to 0.2 mM and reacted at room temperature for 30 minutes;

2) 전날 준비된 세포를 DMEM(Welgene에서 구입, LM001-09)으로 1회 세척한 후, 상기 1)과정에서 준비된 반응액으로 처리하여 2 시간 동안, 37 ℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다;2) The cells prepared on the previous day were washed once with DMEM (Welgene, LM001-09), and then treated with the reaction solution prepared in step 1) and incubated in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator for 2 hours;

3) 세포를 OPTI-MEM I(Invitrogen에서 구입, Cat. No. 31985-070) 배지를 이 용하여 3회 세척한 후, OPTI-MEM I 배지가 들어 있는 상태에서 세포 안에 전달된 프로피디움 아이오다이드 형광을 관찰하였다. 형광 관찰을 위하여 본 실시예에서는 대물렌즈 Uplan Apo 40X0.85가 장착된 올림푸스사의 형광현미경 FV1000을 이용하여 세포의 형광 이미지를 얻었다;3) Propidium iodide delivered into cells with OPTI-MEM I medium, washed three times with OPTI-MEM I (Invitrogen, Cat. No. 31985-070) medium. Fluorescence was observed. For fluorescence observation, in this Example, a fluorescence image of the cells was obtained using an Olympus fluorescence microscope FV1000 equipped with an objective lens Uplan Apo 40X0.85;

도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 세포내 전달 도메인에 의해 프로피디움 아이오다이드가 세포 내로 전달된 것을 확인할 수 있었다. 결국, 본 발명의 새로운 세포내 전달 도메인은 저분자 화합물과의 컨쥬게이션 없이 저분자 화합물을 세포 내로 유효하게 전달할 수 있음을 확인할 수 있다.As shown in FIG. 5, it was confirmed that propidium iodide was delivered into cells by the intracellular delivery domain of the present invention. As a result, the novel intracellular delivery domains of the present invention provide for low molecular weight compounds without conjugation with the low molecular weight compounds. It can be confirmed that it can be effectively delivered into the cell.

이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.Although the present invention has been described with reference to the above embodiments, the present invention is not limited thereto. It will be understood by those skilled in the art that modifications and variations may be made without departing from the spirit and scope of the invention, and that such modifications and variations are also contemplated by the present invention.

도 1은 본 발명의 펩타이드에 의하여 50 nm 크기의 입자가 세포 내로 전달된 것을 확인한 프러시안 블루 염색 사진이다.1 is a Prussian blue staining picture confirming that the particles of the 50 nm size was delivered into the cells by the peptide of the present invention.

도 2는 본 발명의 펩타이드에 의해 형광표지된 입자의 세포 내 전달을 보여주는 형광 세포 사진 및 프러시안 블루 염색 사진이다.Figure 2 is a fluorescent cell photograph and Prussian blue staining photograph showing intracellular delivery of particles fluorescently labeled by the peptides of the present invention.

도 3는 본 발명의 펩타이드와 다양한 크기의 입자를 혼합한 후 이를 세포에 처리하고 프러시안 블루 염색을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.3 is a photograph showing the results of mixing the peptides of the present invention and particles of various sizes, treating them with cells, and performing Prussian blue staining.

도 4는 본 발명의 펩타이드에 의해 덱스트란 코팅된 입자가 세포 내로 전달된 것을 보여주는 프러시안 블루 염색 사진이다.Figure 4 is a Prussian blue staining picture showing the delivery of dextran coated particles into the cells by the peptide of the present invention.

도 5는 본 발명의 펩타이드에 의해 프로피디움 아이오다이드가 세포 내로 전달된 것을 보여주는 형광 세포 사진이다.5 is a fluorescence cell photograph showing propidium iodide delivered into cells by the peptide of the invention.

<110> CGK CO.,LTD. <120> Method for delivering cargo molecules into cells and peptide therefor <130> P07-0078KR <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P071 <400> 1 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P072 <400> 2 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile 1 5 10 15 Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P073 <400> 3 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu 1 5 10 15 Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly 20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P074 <400> 4 Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Leu Gly Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly 20 25 30 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0721 <400> 5 Lys Lys Lys Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gly Leu 1 5 10 15 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile 20 25 30 Asp Gly <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0722 <400> 6 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala 1 5 10 15 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 30 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0723 <400> 7 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 20 25 30 Met Ile Asp Gly 35 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0724 <400> 8 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala 1 5 10 15 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0725 <400> 9 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 1 5 10 15 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly 20 25 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0801 <400> 10 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Glu Thr Trp Trp Glu 1 5 10 15 Thr Trp Trp Thr Glu 20 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0802 <400> 11 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Arg Ser Ser Arg Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys 20 25 30 <210> 12 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0803 <400> 12 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asp Pro Lys Gly Asp Pro 1 5 10 15 Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Gly Lys Gly Asp 20 25 30 Pro Lys Pro Asp 35 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0804 <400> 13 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys Leu Ala 1 5 10 15 Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys 20 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0805 <400> 14 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ile Phe 1 5 10 15 Ser Arg Ile Gly Asp Gly 20 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0806 <400> 15 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Leu Arg Arg Arg Trp Ala Val Leu Gly Arg 20 25 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0807 <400> 16 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Glu Ala Ile 1 5 10 15 Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly Leu Ile Glu Gly 20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0808 <400> 17 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Ala Ile 1 5 10 15 Ala Lys Phe Ile Lys Gly Gly Trp Lys Gly Leu Ile Lys Gly 20 25 30 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0809 <400> 18 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala 20 25 <210> 19 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0810 <400> 19 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Leu Phe Leu Gly 1 5 10 15 Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala 20 25 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0811 <400> 20 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Thr Val Leu Ala Leu 1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly 20 25 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0812 <400> 21 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ala Val Leu Leu Pro 1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Ala Pro 20 <210> 22 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0813 <400> 22 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Ala Ile Gly Leu 1 5 10 15 Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala 20 25 <110> CGK CO., LTD. <120> Method for delivering cargo molecules into cells and peptide          therefor <130> P07-0078KR <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P071 <400> 1 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly   1 5 10 15 Met Ile Asp Gly Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg              20 25 30 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P072 <400> 2 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile   1 5 10 15 Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly              20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P073 <400> 3 Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly Gly Asp Ile Met Gly Glu   1 5 10 15 Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Leu Gly              20 25 30 <210> 4 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P074 <400> 4 Gly Asp Ile Met Gly Glu Trp Gly Asn Glu Ile Phe Gly Ala Ile Ala   1 5 10 15 Gly Phe Leu Gly Arg Arg Arg Gln Arg Arg Lys Lys Arg Gly              20 25 30 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0721 <400> 5 Lys Lys Lys Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala Gly Leu   1 5 10 15 Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile              20 25 30 Asp gly         <210> 6 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0722 <400> 6 Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala   1 5 10 15 Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly              20 25 30 <210> 7 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0723 <400> 7 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys   1 5 10 15 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly              20 25 30 Met Ile Asp Gly          35 <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0724 <400> 8 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala   1 5 10 15 Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly              20 25 <210> 9 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0725 <400> 9 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe   1 5 10 15 Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Ile Asp Gly              20 25 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0801 <400> 10 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Glu Thr Trp Trp Glu   1 5 10 15 Thr Trp Trp Thr Glu              20 <210> 11 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0802 <400> 11 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Thr Arg Ser Ser Arg Ala   1 5 10 15 Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg Leu Leu Arg Lys              20 25 30 <210> 12 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0803 <400> 12 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Asp Pro Lys Gly Asp Pro   1 5 10 15 Lys Gly Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Val Thr Gly Lys Gly Asp              20 25 30 Pro Lys Pro Asp          35 <210> 13 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0804 <400> 13 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Lys Leu Ala Lys Leu Ala   1 5 10 15 Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Lys              20 <210> 14 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0805 <400> 14 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Leu Ser Ser Ile Phe   1 5 10 15 Ser Arg Ile Gly Asp Gly              20 <210> 15 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0806 <400> 15 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Gly Gly Arg Leu Ala   1 5 10 15 Tyr Leu Arg Arg Arg Trp Ala Val Leu Gly Arg              20 25 <210> 16 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0807 <400> 16 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Glu Ala Ile   1 5 10 15 Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly Leu Ile Glu Gly              20 25 30 <210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0808 <400> 17 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Leu Phe Lys Ala Ile   1 5 10 15 Ala Lys Phe Ile Lys Gly Gly Trp Lys Gly Leu Ile Lys Gly              20 25 30 <210> 18 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0809 <400> 18 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Phe Phe Gly Ala Val Ile   1 5 10 15 Gly Thr Ile Ala Leu Gly Val Ala Thr Ala              20 25 <210> 19 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0810 <400> 19 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Leu Phe Leu Gly   1 5 10 15 Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala              20 25 <210> 20 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0811 <400> 20 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Val Thr Val Leu Ala Leu   1 5 10 15 Gly Ala Leu Ala Gly Val Gly Val Gly              20 25 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0812 <400> 21 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Ala Ala Val Leu Leu Pro   1 5 10 15 Val Leu Leu Ala Ala Pro              20 <210> 22 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P0813 <400> 22 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Gly Ala Ala Ile Gly Leu   1 5 10 15 Ala Trp Ile Pro Tyr Phe Gly Pro Ala Ala              20 25  

Claims (23)

세포내로 나노입자를 전달하기 위한 펩타이드에 있어서,In peptides for delivering nanoparticles into cells, 서열번호 6 내지 서열번호 9의 아미노산 서열들 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 세포내 전달 도메인을 포함하고, An intracellular delivery domain comprising at least one amino acid sequence of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9, 상기 세포내 전달 도메인은, 전하를 띄는 물질 간의 상호작용 및/또는 상기 세포내 전달 도메인-상기 나노입자 복합체의 수용성을 높일 수 있는 YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR 및 PKKKRKV로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG의 아미노산 서열의 소수성 도메인으로 구성됨으로써, 상기 나노입자와 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 상기 나노입자를 세포내로 전달하는 것을 특징으로 하는 세포내로 나노입자를 전달하기 위한 펩타이드.The intracellular delivery domain comprises a hydrophilic domain selected from the group of amino acid sequences consisting of YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, and PKKKRKV, which can enhance the interaction between charged substances and / or the water solubility of the intracellular delivery domain-the nanoparticle complex. And a hydrophobic domain of the amino acid sequence of GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, which can be used for hydrophobic interactions and / or interactions with the cell membrane, thereby delivering the nanoparticles intracellularly without being conjugated with the nanoparticles. Peptides for delivering nanoparticles into cells. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제1항에 있어서,The method of claim 1, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단의 아세틸화 및/또는 C-말단의 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형된 것을 특징으로 하는 세포내로 나노입자를 전달하기 위한 펩타이드.Wherein said intracellular delivery domain has been modified in such a way that N-terminal acetylation and / or C-terminal cysteamine are added. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 서열번호 6 내지 서열번호 9의 아미노산 서열들 중 적어도 하나의 아미노산 서열을 포함하는 세포내 전달 도메인을 준비하는 단계와, Preparing an intracellular delivery domain comprising at least one amino acid sequence of the amino acid sequences of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 9, 세포내로 도입할 나노입자를 준비하는 단계와, Preparing a nanoparticle to be introduced into the cell, 상기 나노입자와 상기 세포내 전달 도메인을 컨쥬게이션하지 않은 상태에서 세포에 처리하는 단계와, Treating the cells with the nanoparticles and the intracellular delivery domain without conjugation; 상기 세포내 전달 도메인은, 전하를 띄는 물질 간의 상호작용 및/또는 상기 세포내 전달 도메인-상기 나노입자 복합체의 수용성을 높일 수 있는 YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR 및 PKKKRKV로 구성된 아미노산 서열 군으로부터 선택된 친수성 도메인과, 소수성 상호작용 및/또는 세포막과의 상호작용에 이용될 수 있는 GLFGAIAGFIENGWEGMIDG의 아미노산 서열의 소수성 도메인으로 구성됨으로써, 상기 나노입자와 컨쥬게이션되지 않은 상태에서 상기 나노입자를 세포내로 도입하는 단계를 포함하는 세포내로 나노입자를 전달하는 방법.The intracellular delivery domain comprises a hydrophilic domain selected from the group of amino acid sequences consisting of YARVRRRGPRR, RQIKIWFQNRRMKWKK, RRRRRRRRR, and PKKKRKV, which can enhance the interaction between charged substances and / or the water solubility of the intracellular delivery domain-the nanoparticle complex. Comprising the hydrophobic domain of the amino acid sequence of GLFGAIAGFIENGWEGMIDG, which can be used for hydrophobic interactions and / or interactions with the cell membrane, thereby introducing the nanoparticles into the cell without being conjugated with the nanoparticles. A method of delivering nanoparticles into cells. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제12항에 있어서,The method of claim 12, 상기 세포내 전달 도메인은 N-말단의 아세틸화 및/또는 C-말단의 시스테아민이 부가되는 방식으로 변형된 것을 특징으로 하는 세포내로 나노입자를 전달하는 방법.And said intracellular delivery domain is modified in such a way that N-terminal acetylation and / or C-terminal cysteamine are added. 삭제delete 제1항에 있어서, The method of claim 1, 상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 그 아미노산 서열이 레트로 및/또는 인버소 형태로 합성되는 것을 특징으로 하는 세포내로 나노입자를 전달하기 위한 펩타이드.The hydrophilic domain and / or the hydrophobic domain is a peptide for delivering nanoparticles into cells, characterized in that the amino acid sequence is synthesized in retro and / or inverso form. 제12항에 있어서, The method of claim 12, 상기 친수성 도메인 및/또는 상기 소수성 도메인은 그 아미노산 서열이 레트로 및/또는 인버소 형태로 합성되는 것을 특징으로 하는 세포내로 나노입자를 전달하는 방법.Wherein said hydrophilic domain and / or said hydrophobic domain is synthesized in its retroactive and / or inverso form. 삭제delete 삭제delete
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Biochimica et Biophysica Acta, Vol.1758(3), pp. 384-393.*
Nature Medicine, Vol. 10(3), pp. 310-315.*

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