KR100994443B1 - Antibiotics marker free soybean having resistance against two herbicides - Google Patents

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Abstract

본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터를 이용한 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체에 관한 것이다. 본 발명의 콩 식물체는 두 가지의 비선택성 제초제에 복합 저항성을 가지므로 잡초방제효과를 향상시킬 수 있어 콩 생산성을 높이고, 항생제 마커-프리이기 때문에 항생제 내성 확산 문제를 일으키지 않으며, 이의 재배시 상기 두 가지의 비선택성 제초제를 혼합처리 할 경우 상승적인 제초효과가 나타나므로 최종 처리 약량(제초제 투입량)을 낮출 수 있어 환경부담을 감소시키는 장점이 있다.The present invention provides a method for producing an antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant using a plant expression vector containing a herbicide resistant bar gene and a CP4 - EPPS gene and not including an antibiotic marker gene, and prepared by the method. Antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plants. The soybean plants of the present invention have complex resistance to two non-selective herbicides, so that weed control effects can be improved, soybean productivity is increased, and antibiotic marker-free does not cause antibiotic resistance diffusion problems. When mixed with non-selective herbicides of eggplant, a synergistic herbicidal effect is shown, which can lower the final amount of treatment (herbicide input), thereby reducing the environmental burden.

콩, 아그로박테리움, 제초제 복합 저항성, 항생제 마커-프리, 형질전환 Soybean, Agrobacterium, Herbicide Complex Resistance, Antibiotic Marker-Free, Transformation

Description

두 가지 제초제에 대하여 저항성을 가지는 항생제 마커프리 형질전환 콩 식물체{ANTIBIOTICS MARKER FREE SOYBEAN HAVING RESISTANCE AGAINST TWO HERBICIDES}ANTIBIOTICS MARKER FREE SOYBEAN HAVING RESISTANCE AGAINST TWO HERBICIDES Resistant to Two Herbicides

본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터를 이용한 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체에 관한 것이다.The present invention provides a method for producing an antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant using a plant expression vector containing a herbicide resistant bar gene and a CP4 - EPPS gene and not including an antibiotic marker gene, and prepared by the method. Antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plants.

콩[Glycine max (L.) Merr.]은 생육 특성면에서 볼 때, 공중질소의 고정능력과 토양미생물의 증가를 가능케 함으로써 토양의 이화학적 성질을 개선시켜 지력을 증대시키는 장점을 가졌고, 여러 환경조건에서 생육 가능함으로 재배 가능 지역이 광범위하다. 그리고 콩은 식물성 단백질과 오일을 다량으로 생산하는 식물로써 쌀을 주식으로 하는 동양인에게 경제적인 단백질원인 동시에 여러 가지 생리적 기능성 물질도 풍부하게 들어 있어서 세계적으로 주목받고 있는 작물이다 (세계 콩 생산량은 2006년의 경우 약 2억 3천만톤에 이르며 우리나라 연간 콩 수요량은 170만 톤 정도이다). 아울러 최근에는 바이오에너지 및 친환경 화학제품 생산 원료물질로 사용되기 때문에 그 수요가 더욱 증대되고 있다. 따라서 많은 연구자들은 형질전환을 통해 새로운 특징의 콩 품종을 개발하는 연구를 꾸준히 탐구하고 있을 뿐만 아니라 수요에 부응하기 위한 고생산성/저생산비용 재배기술의 개발에 노력을 경주하고 있다. 특히 생산량을 높임과 동시에 생산비용을 낮추고자 추진하는 방안중의 하나로서 제초제 저항성 유전자를 작물에 도입한 후 이를 재배하면서 도입유전자에 적용되는 제초제를 처리하여 보다 손쉽게 잡초의 피해를 줄이는 방법이 강구되고 있다(김 등, 2001, 한잡초지, 21:122-143).Soybean [ Glycine max (L.) Merr.] Has the advantage of improving the physicochemical properties of soil by increasing the microorganism's physicochemical properties by increasing the fixation capacity of aerial nitrogen and the increase of soil microorganisms. It is possible to grow under conditions, so the growing area is wide. Soybean is a plant that produces a large amount of vegetable protein and oil. It is an economical protein source for Asians whose rice is a staple food, and abundant in various physiological and functional substances. In this case, the amount of soybean is about 230 million tons, and Korea's annual soybean demand is about 1.7 million tons). In addition, since it is used as a raw material for the production of bioenergy and eco-friendly chemicals, the demand is further increased. Therefore, many researchers are constantly exploring research on developing new varieties of soybean varieties through transformation, and are making efforts to develop high productivity / low production cost cultivation techniques to meet demand. In particular, as one of the measures to increase production and at the same time lower production costs, a method of reducing the weed damage by introducing herbicide-resistance genes into crops and cultivating them is treated with herbicides applied to the introduced gene. there (Kim et al., 2001, not a weed, 21: 122-143).

제초제 저항성 형질전환 작물의 기술개발이 본격적으로 활성화되기 시작한 것은 몬산토사(Monsanto)가 1996년에 라운드업 레디(roundup ready) 콩을 미국에 출시한 이후부터이다. 현재는 옥수수, 목화, 유채(또는 캐놀라), 벼, 기타 작물을 대상으로 주로 비선택성 제초제(글리포제이트, 글루포시네이트암모늄)를 중심으로 한 제초제 저항성 작물이 개발되어 실용화되고 있는데(Duke S.O., 2005, Pest Manag . Sci ., 61:211-2118), 잡초 방제 측면에서 보면 거의 모두가 한 가지의 제초제 저항성 유전자를 가지면서 선택표지(selection marker) 유전자로서 항생제 저항성 유전자가 포함된 것들이다 (작물보호 분야에서 두 가지 이상의 유전자가 도입된 작물의 경우는 해충저항성 또는 내병성 유전자가 도입된 것들이 대부분이다). The development of herbicide-tolerant transgenic crops has begun in earnest since Monsanto launched roundup ready soybeans in the United States in 1996. Currently, herbicide-tolerant crops, mainly non-selective herbicides (glyphosate, ammonium glufosinate), have been developed for corn, cotton, rapeseed (or canola), rice and other crops (Duke SO). , 2005, Pest Manag . Sci . , 61: 211-2118), in terms of weed control, almost all have one herbicide-resistance gene and include antibiotic resistance genes as selection marker genes ( Most crops that have two or more genes in crop protection are introduced with pest-resistant or pathogenic genes).

이 경우, 잡초방제 효율화라는 차원에서 볼 때 몇 가지 개선되어야 할 기술적 과제가 존재한다. 첫째는 항생제 마커가 없는 형질전환작물이 개발되어야 한다. 기존의 형질전환방법(Binns et al., 1988, Ann Rev Microbiol., 42: 575-606)에서 는 목적 유전자가 도입된 세포 또는 식물체를 선발하기 위해서 주로 항생제 내성 유전자를 표지로 사용해 왔다. 이렇게 해서 만들어진 형질전환작물을 재배하면 환경 또는 인축에 항생제 내성 유전자를 자연적으로 노출시키기 때문에 "항생제 내성 확산"이라는 문제를 야기시킬 우려가 높다. 따라서 항생제 내성 표지 유전자를 사용하지 않는 형질전환기술을 개발하고(Scutt et al., 2002, Biochimie, 84: 1119-1126), 이를 통해 창출한 소위 항생제 내성 문제가 없는 형질전환작물("항생제 마커-프리 작물")의 활용이 강력히 요구되고 있다. 둘째는 잡초방제 효율성의 제고이다. 잡초는 종류 자체가 수백종에 이르며 형태, 생리, 생태적 특성이 서로 다르기 때문에 선택성 제초제로서는 효율적으로 잡초를 방제하지 못한다. 비선택성으로 알려진 제초제의 경우라 할지라도 제초 스펙트럼에 제한을 가지고 있다. 셋째, 한가지의 제초제 저항성 유전자가 도입된 작물을 재배하면 동일 제초제를 계속해서 사용하게 되며 이로 인해 야기되는 문제점이 있다. 즉 동일 제초제가 매년 여러 번 사용되면 해당 제초제 및 분해 중간산물의 생물내 축적, 해당 제초제에 잘 방제되지 않는 잡초의 번무와 잡초군락 변이, 저항성 잡초 출현 촉진 등의 문제점이 발생한다 (Owed & Zelaya, 2005, Pest Manag . Sci ., 61:301-311; Arregui et al., 2003, Pest manag . Sci ., 60: 163-166; Sandermann H., 2006, Trends in Plant Sci ., 11: 324-328). 아울러 친환경 농업을 위해서는 가능한 한 저농도의 제초제 살포가 요구된다. 한편, 형질전환의 경우 식물종에 따라 가능한 것과 가능하지 않은 것이 있으며, 동일 식물종이라고 하여도 품종 또는 계통에 따라서 형질전환 여부가 다름이 알려지고 있다. 콩의 경우도 마찬가지로서 그동안 개발된 형질전환 콩 은 모두 외국종이었으며 국내종을 가지고서는 그동안 성공한 사례가 없었으며 본 발명이 처음이다.In this case, there are some technical problems to be improved in view of the efficiency of weed control. First, transgenic crops without antibiotic markers should be developed. Conventional transformation methods (Binns et al., 1988, Ann Rev Microbiol. , 42: 575-606, mainly used antibiotic resistance genes as markers for selection of cells or plants into which the genes of interest have been introduced. The cultivation of transgenic crops thus produced is highly susceptible to the problem of "antibiotic spread" because they naturally expose antibiotic resistance genes to the environment or to humans. Therefore, we developed a transformation technique that does not use antibiotic resistance marker genes (Scutt et al., 2002, Biochimie , 84: 1119-1126), and created the so-called transformant crops without the problem of antibiotic resistance ("Antibiotic marker- Free crops ”) is strongly required. Second is the improvement of weed control efficiency. Hundreds of varieties of weeds themselves are different in form, physiology and ecology, so selective weeds do not control weeds efficiently. Even herbicides known to be non-selective have limitations in the herbicide spectrum. Third, cultivating crops into which one herbicide resistance gene has been introduced continues to use the same herbicides and there is a problem caused by this. That is, if the same herbicide is used several times each year, problems such as accumulation of the herbicides and degradation intermediates in the organism, the weeding and weed colonization of the weeds that are not well controlled by the herbicides, and the emergence of resistant weeds occur (Owed & Zelaya, 2005, Pest Manag . Sci . 61: 301-311; Arregui et al., 2003, Pest manag . Sci . , 60: 163-166; Sandermann H., 2006, Trends in Plant Sci . 11: 324-328). In addition, environmentally friendly agriculture requires spraying as low a herbicide as possible. Meanwhile, in the case of transformation, there are some that are not possible and not possible depending on the plant species, and even the same plant species is known to vary in transformation depending on the variety or lineage. Likewise, in the case of soybeans, all of the transgenic soybeans developed in the past were foreign species, and there were no successful cases with domestic species, and the present invention is the first time.

이러한 문제점을 극복하기 위해서 본 발명에서는 잡초방제 측면에서 상승작용을 가지는 비선택성 제초제 조합을 통해, 보다 저농도로 혼합처리하거나 또는 체계처리하는 것이 가능하도록 해당 제초제 저항성 두 가지 유전자가 도입된 콩 작물, 바람직하기로는 국내 품종의 형질전환 콩을 개발하고자 하였다. In order to overcome this problem, in the present invention, soybean crops in which two genes of the herbicide resistance are introduced, so that it can be mixed or systematically treated at a lower concentration through a non-selective herbicide combination having a synergistic effect in terms of weed control, In the following, we tried to develop transgenic soybean of domestic varieties.

본 발명에서는 글루포시네이트암모늄과 글리포제이트를 사용할 수 있도록 bar와 CP4-EPSPS 유전자를 도입하고자 하였다. 글루포시네이트암모늄은 주성분이 포스피노트리신(phosphinothricin, PPT)으로서 식물의 글루타민 합성효소를 저해하여 체내에 암모니아를 축적시키고 살포 후 5일 정도 지나면 식물체를 강력히 고사시키는데(Tachibana et al., 1986, J. Pesticide Sci., 11:297-304), 토양에 떨어지면 곧 분해가 되는 특징이 있어 환경오염 정도가 타 제초제에 비하여 매우 적다고 알려져 있다. 그런데 본 제초제의 경우 포장 추천농도가 비교적 높고(성분량 기준으로 1kg/ha 이상), 보다 낮은 농도로 처리하고자 할 경우 잡초의 감수성 차이로 인해 상대적으로 잘 죽지 않는 잡초가 존재한다. 한편, 글리포제이트 제초제는 경엽처리 제초제로서 처리 후 식물체에 용이하게 흡수 이동되며, 흡수된 제초제 성분은 방향족 아미노산 생합성 과정의 EPSPS 효소(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase)를 저해함으로써 살포 후 10일 정도 지나야 식물체를 고사시킨다(Dill G.M., 2005, Pest Manag. Sci., 61:211-218). 전반적으로 광엽식물이 화본과 식물보다 글리포제이트에 대해 상대적으로 내성을 가지는 바(Jordan et al., 1997, Weed Technol . 11: 354-362), 이들 모두를 방제하기 위해서 비교적 고농도로 처리되고 있다. 최근에는 글리포제이트의 연용으로 인해 구즈그래스, 이탈리안라이그래스 등의 잡초에서 글리포제이트 저항성을 가지는 생태형의 자연적 출현이 보고되고 있다(Sandemann H., 2006, Trends in Plant Science 11:324-328). 따라서 상기 두 제초제 각각의 단점을 개선시켜 효율적으로 사용할 수 있는 기술이 개발되면 작물재배에 매우 유용하게 사용될 것이다.In the present invention, bar and CP4-EPSPS genes were introduced to use glufosinate ammonium and glyphosate . Glufosinate ammonium, the main component of phosphinothricin (PPT), inhibits glutamine synthase in plants, accumulating ammonia in the body and strongly killing plants after 5 days of application (Tachibana et al., 1986, J. Pesticide Sci ., 11: 297-304), which is known to decompose upon falling into the soil, which is known to have less environmental pollution than other herbicides. However, the herbicide has a relatively high recommended packaging concentration (more than 1 kg / ha based on the amount of ingredients), and when we want to treat it at a lower concentration, weeds do not die relatively well due to the difference in sensitivity of the weeds. On the other hand, glyphosate herbicide is a foliage herbicide, which is easily absorbed and transferred to plants after treatment, and the absorbed herbicide component inhibits EPSPS enzyme (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) during the aromatic amino acid biosynthesis process after spraying. After a few days, the plants are killed (Dill GM, 2005, Pest Manag. Sci. , 61: 211-218). Overall, broadleaf plants are relatively more resistant to glyphosate than flowering plants and plants (Jordan et al., 1997, Weed Technol . 11: 354-362), they are treated at a relatively high concentration to control them all. Recently, natural appearance of glyphosate-resistant ecotypes has been reported in the weeds of goosegrass and Italian ligras due to the use of glyphosate (Sandemann H., 2006, Trends in Plant Science 11: 324-328). Therefore, if the technology that can be used efficiently by improving the disadvantages of each of the two herbicides will be very useful for crop cultivation.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 -EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터를 이용한 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 제조 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention is the production of antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plants using a plant expression vector containing a herbicide-resistant bar gene and CP4- EPSPS gene, and does not include an antibiotic marker gene Provide a method.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체를 제공한다.The present invention also provides antibiotic marker free herbicide complex resistant soybean plants prepared by the above method.

또한, 본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 형질전환된, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체 및 이의 종자를 제공한다.In addition, the present invention provides an antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant and its seeds, including herbicide resistant bar gene and CP4 - EPPS gene, and transformed with a plant expression vector that does not include an antibiotic marker gene. to provide.

또한, 본 발명은 본 발명의 항생제 마커-프리 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 재배지에 글루포시네이트(glufosinate) 및 글리포제이트(glyphosate)를 혼합 또는 체계 처리하는 단계를 포함하는 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for controlling weeds comprising mixing or systematically treating glufosinate and glyphosate in a plantation of the antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant of the present invention. to provide.

본 발명의 형질전환 콩 식물체는 두 가지의 비선택성 제초제에 복합 저항성을 가지므로 잡초 방제효과를 향상시킬 수 있어 궁극적으로 보다 적은 노동력 투입으로 콩 생산성을 높이는 효과를 가지며, 이의 재배시 상기 두 가지의 비선택성 제초제를 혼합처리할 경우, 상승적인 제초효과가 나타나므로 최종 처리 약량(제초제 투입량)을 낮출 수 있어 환경부담을 감소시키는 효과를 가진다. 또한, 본 발명의 콩작물은 항생제 마커-프리이기 때문에 항생제 내성 확산 문제를 일으키지 않으며, 우수 품질의 콩 재배를 확산시킬 수 있어 농가소득을 증대시키는 효과를 가진다.The transgenic soybean plant of the present invention has a complex resistance to two non-selective herbicides, thereby improving the weed control effect, and ultimately has the effect of increasing the productivity of soybeans with less labor input. When mixed with non-selective herbicides, a synergistic herbicidal effect is seen, which can lower the final treatment dose (herbicide dosage), thereby reducing the environmental burden. In addition, since the soybean crop of the present invention is an antibiotic marker-free, it does not cause the problem of antibiotic resistance diffusion, can spread the soybean cultivation of excellent quality and has the effect of increasing farm income.

본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4-EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계;In order to achieve the object of the present invention, the present invention comprises the steps of transforming Agrobacterium with a plant expression vector comprising a herbicide resistant bar gene and CP4-EPSPS gene, and does not include an antibiotic marker gene;

상기 형질전환된 아그로박테리움과 콩 조직을 공동배양하는 단계; 및Co-culturing the transformed Agrobacterium and soybean tissue; And

상기 공동배양된 콩 식물체 조직으로부터 형질전환된 신초를 선발하여 신장시키고 뿌리를 유기하는 단계를 포함하는, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 제조 방법을 제공한다.It provides a method for producing an antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant, comprising the step of selecting and stretching transformed shoots from the co-cultured soybean plant tissues and organically rooting them.

본 발명의 방법은 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계를 포함한다. 본 발명의 제초제 저항성 bar 유전자는 당업계에 통상적으로 이용되는 유전자를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 pCAMBIA3300(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia) 벡터에 포함된 bar 유전자를 이용할 수 있다. CP4 -EPSPS 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 염기 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.The method of the present invention comprises transforming Agrobacterium with a plant expression vector comprising a herbicide resistant bar gene and a CP4 - EPPS gene and not comprising an antibiotic marker gene. The herbicide resistant bar gene of the present invention may use a gene commonly used in the art, and preferably, a bar gene included in a pCAMBIA3300 (Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia) vector. The CP4- EPSPS gene may have a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. In addition, variants of the above nucleotide sequences are included within the scope of the present invention. Specifically, the gene has a base sequence having a sequence homology of at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90%, most preferably at least 95% with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, respectively. It may include. The "% sequence homology" for polynucleotides and polypeptides is determined by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein a portion of the polynucleotide and polypeptide sequences in the comparison region are the reference sequences for the optimal alignment of the two sequences. It may include additions or deletions (ie gaps) compared to (not including additions or deletions).

본 발명의 제초제 복합 저항성 콩 식물체는 글루포시네이트 암모늄 저항성 bar 유전자와 제초제 글리포제이트 저항성 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터로 형질전환되어 상기 유전자들을 모두 발현하므로 비선택적 제초제인 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트에 대해 복합 저항성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 콩 식물체는 항생제 표지 유전자를 포함하지 않으므로, 항생제 내성 확산 문제를 일으키지 않는 장점이 있다.The herbicide complex-resistant soybean plant of the present invention is transformed with a plant transformation expression vector comprising a glufosinate ammonium resistant bar gene and a herbicide glyphozate resistant CP4 - EPSPS gene to express all of the genes, thereby being a non-selective herbicide. It exhibits complex resistance to glufosinate ammonium and glyphosate. In addition, since the soybean plant of the present invention does not include an antibiotic marker gene, there is an advantage that does not cause antibiotic resistance diffusion problem.

본 발명의 일 구현예에 따른 식물 발현 벡터에서, 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, 히스톤 프로모터, 벼 유래 Clp 프로모터일 수 있으나, 바람직하게는 엽록체 형질전환용 벼 유래 Clp 프로모터이다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사 를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다.In the plant expression vector according to an embodiment of the present invention, the promoter may be CaMV 35S, actin, ubiquitin, pEMU, histone promoter, rice-derived Clp promoter, but preferably, rice-derived Clp promoter for chloroplast transformation. The term "promoter " refers to the region of DNA upstream from the structural gene and refers to a DNA molecule to which an RNA polymerase binds to initiate transcription. A "plant promoter" is a promoter capable of initiating transcription in plant cells. A "constitutive promoter" is a promoter that is active under most environmental conditions and developmental conditions or cell differentiation.

터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이 있다.The terminator can use a conventional terminator, for example, nopaline synthase (NOS), rice α-amylase RAmy1 A terminator, phaseoline terminator, agrobacterium tumefaciens (ocrobacterium tumefaciens) (Octopine) gene terminator, E. coli rrnB1 / B2 terminator, and the like.

본 발명의 상기 발현벡터는 아그로박테리움(Agrobacterium)과 함께 콩 식물체에 도입될 것이므로, 아그로박테리움에서 복제, 발현 및 선별이 가능하도록 구성된 어떠한 벡터라도 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 예에서는, 식물체 선발인자로 bar 유전자를 포함하는 플라스미드 pCAMBIA 3300(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)에 CaMV 35S 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 제초제 저항성 유전자 CP4-EPSPS를 삽입하여 제조된 식물 형질전환용 발현 벡터를 사용한다. 바람직하게는 상기 재조합 식물 발현 벡터는 도 1에 기재된 p35S-EPSPS-B 벡터일 수 있다.The expression vectors of the invention because it will be introduced into the Agrobacterium bean plants with Solarium (Agrobacterium), any configured to enable the replication, expression and selection in Agrobacterium vector may be used in the present invention. In a preferred embodiment of the present invention, the plant selection factor bar An expression vector for plant transformation is prepared by inserting the herbicide resistance gene CP4-EPSPS into the plasmid pCAMBIA 3300 (Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia) containing genes to regulate expression by the CaMV 35S promoter. . Preferably, the recombinant plant expression vector may be a p35S-EPSPS-B vector described in FIG.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.Transformation of a plant means any method of transferring DNA to a plant. Such transformation methods do not necessarily have a regeneration and / or tissue culture period. Transformation of plant species is now common for plant species, including both terminal plants as well as dicotyledonous plants. In principle, any transformation method can be used to introduce hybrid DNA according to the invention into suitable progenitor cells. Method is calcium / polyethylene glycol method for protoplasts (Krens, FA et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), protoplasts Electroporation (Shillito RD et al., 1985 Bio / Technol. 3, 1099-1102), microscopic injection into plant elements (Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185 ), (DNA or RNA-coated) particle bombardment of various plant elements (Klein TM et al., 1987, Nature 327, 70), Agrobacterium tumulopasis by plant infiltration or transformation of mature pollen or vesicles And infection with (incomplete) virus (EP 0 301 316) in en mediated gene transfer. A preferred method according to the present invention comprises Agrobacterium mediated DNA delivery. Especially preferred is the use of the so-called binary vector technology as described in EP A 120 516 and US Pat. No. 4,940,838.

본 발명에서 식물 형질전환용 아그로박테리움 균주로는 통상 이용되는 어떠한 균주라도 사용이 가능하다. 구체적으로 본 발명에서는, 식물시료에 침투하여 외래 유전자를 전달하는데 필요한 병원성이 큰 것으로 알려진 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 더욱 바람직하게는 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 105 (A. tumefaciens EHA 105)를 이용한다. 상기 식물 형질전환용 발현벡터로 형질전환된 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA 105 (아그로박데리움 투메파시엔스 EHA 105/p35E-Bar)는 2006년 10월 25일자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11008BP로 기탁되었다.Agrobacterium strain for plant transformation in the present invention can be used any strain commonly used. Specifically, in the present invention, Agrobacterium tumefaciens ( Agrobacterium) known to be large pathogenicity necessary to penetrate plant samples and deliver foreign genes tumefaciens ), more preferably Agrobacterium tumefaciens EHA 105 ( A. tumefaciens EHA 105). Agrobacterium tumefaciens EHA 105 (Agrobacterium tumefaciens EHA 105 / p35E-Bar) transformed with the plant transformation expression vector was deposited on October 25, 2006 to the Korea Biotechnology Research Institute Gene Bank. Deposited as KCTC 11008BP.

본 발명에서 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 제조를 위해 사용할 수 있는 콩 품종으로는 광안콩, 소진콩, 다채콩, 청자콩2호, 검정콩1호, 검정콩2호, 일품 검정콩, 다원콩, 단백콩, 대원콩, 명주나물콩, 무한콩, 보광콩, 소명콩, 소록콩, 신팔달콩, 은하콩, 자수콩, 진율콩, 청자콩, 태광콩, 화엄풋콩, 버트(Burt) 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 콩 품종은 버트 또는 광안콩일 수 있다.Soybean varieties that can be used for the production of herbicide complex resistant soybean plants in the present invention Gwangan beans, sojin beans, multi-beans, Cheongja bean No. 2, black beans No. 1, black beans No. 2, one black bean, Dawon beans, protein beans, Daewon Beans, silken sprouts, endless beans, Bokwang beans, Myeong bean, Sorrow beans, sour green beans, galaxy beans, embroidery beans, Jinyul beans, celadon beans, Taekwang beans, Hwaeum beans, Burt, etc. can be exemplified, but not limited thereto. Do not. Preferably, the soybean varieties may be butts or light beans.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 형질전환된 아그로박테리움과 콩 조직의 공동배양 단계는 상기 형질전환된 아그로박테리움의 고농축액에 콩 조직을 침지시키는 단계; 및 상기 침지된 콩 조직을 진공 처리한 후 공동배양하는 단계로 이루어질 수 있다. 상기 침지 단계는 외과용 메스를 고농축액의 아그로박테리움속 세균에 침지시킨 후, 상기 침지된 외과용 메스로 콩 조직에 상처를 내는 것일 수 있으며, 상기 상처 내기(wounding)는 6~10회 수행할 수 있으며, 바람직하게는 8회 수행할 수 있다.In the method according to an embodiment of the present invention, the co-culturing of the transformed Agrobacterium and soybean tissue comprises the steps of immersing soybean tissue in a high concentration of the transformed Agrobacterium; And co-culturing the immersed soybean tissue under vacuum. The dipping step may be to immersed the surgical scalpel in a high concentration of Agrobacterium bacteria, and then wound the soybean tissue with the immersed surgical scalpel, the wound is carried out 6 to 10 times It may be performed, preferably eight times.

바람직하게는, 고농축액 침지란, 접종 당일 액체 YEP 배지 200㎖를 50㎖씩 나누어서 펠렛이 생긴 튜브 중 하나에는 액체 공배양 배지를 5㎖만 첨가하여 고농축 상태로 만든 후, 접종 상처 시 측아(axillary bud)와 자엽절(cotyledonary node)를 현미경으로 보면서 외과용 메스(＃11 blade)를 준비된 고농축액에 묻힌 다음 목표 부위에 8번 정도 상처를 내는 것을 말한다. Preferably, the high-concentrate dipping solution is divided into 50 ml of 200 ml of liquid YEP medium on the day of inoculation and pelletized into one of the tubes in which pellets are formed. A microscopic examination of buds and cotyledonary nodes involves placing a surgical scalpel (＃ 11 blade) on the prepared high-concentrate solution and then wounding the target area eight times.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에서, 상기 아그로박테리움속 세균의 농도는 OD650이 8~10인 것이 바람직하다. In the method according to an embodiment of the present invention, the concentration of Agrobacterium bacteria is preferably OD 650 is 8 ~ 10.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 진공 처리는 아그로박테리움을 접종한 후, 공동배양 (co-cultivation)에 들어가기 전에 10~45초 수행할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 30초이다. 진공 처리 시간은 30초가 가장 효율이 높았으며, 상기 범위를 벗어난 경우에는 신초 다발의 형성률이 저하될 수 있다. 진공처리란, 접종을 한 후 공배양 (co-cultivation)에 들어가기에 전에 Clean bench 안에서 데시게이터 {250㎜(가로)×50㎜(세로)×300㎜(높이)}와 다이어프램펌프(GAST사)를 이용하여 식물체를 예를 들면, 30초 동안 500mm.Hg까지 진공 상태로 두는 것을 말한다.In the method according to an embodiment of the present invention, the vacuum treatment may be performed 10 to 45 seconds after inoculation of Agrobacterium, before entering the co-cultivation, more preferably 30 seconds. The vacuum treatment time was the most efficient 30 seconds, the formation rate of the new shoot bundle may be lowered outside the above range. Vacuum treatment is a desiccator {250 mm (width) × 50 mm (length) × 300 mm (height)) and a diaphragm pump (GAST) in a clean bench after inoculation and before co-cultivation. Plant using For example, vacuuming to 500 mm Hg for 30 seconds.

본 발명의 벡터로 형질전환된 상기 아그로박테리움 고농축액을 측아가 있는 콩 하배축 조직에 상처를 내어 접종하면서 진공처리를 하고, 이어 공동배양한 후 먼저 신초를 유기 신장시키고, 이어 뿌리 발생 및 신장을 유도시키는 배양법을 통해 형질전환체를 얻는다. 형질전환체를 선발하기 위해 신초를 유기 신장시키는 배양단계에서는 통상의 배양 배지, 예를 들어, MS 고체배지(Murashige & Skoog, Physiol. Plant 15:473-497, 1962)에 포스피노트리신을 첨가한 배지를 이용하여 형질전환체를 선발할 수 있다. 이때, 포스피노트리신은 배지에 0.1 내지 15 mg/L, 바람직하게는 5 내지 10 mg/L의 양으로 첨가할 수 있다. 형질전환체 선발용 배지는 또한 벤질아미노퓨린(6-Benzyl aminopurine), 지베렐린(Gibbelleic acid 3)과 같은 식물 생장 호르몬을 각각 0.5 내지 2.0 mg/L, 및 0.1 내지 0.5 mg/L의 양으로 포함할 수 있다.The Agrobacterium high-concentrate transformed with the vector of the present invention was inoculated by wounding and inoculating the hypocotyl tissue of the soybean hypocotyl tissue, and then co-cultivated, followed by organic elongation of the shoots, followed by root development and elongation. The transformant is obtained through induction culture. In the culturing step of organic elongation of shoots to select a transformant, phosphinothricin is added to a conventional culture medium, for example, MS solid medium (Murashige & Skoog, Physiol. Plant 15: 473-497, 1962). The transformant may be selected using a medium. At this time, phosphinothricin may be added to the medium in an amount of 0.1 to 15 mg / L, preferably 5 to 10 mg / L. Transformant selection medium may also contain plant growth hormones such as 6-Benzyl aminopurine and Gibbelleic acid 3 in amounts of 0.5 to 2.0 mg / L, and 0.1 to 0.5 mg / L, respectively. Can be.

이어서, 얻어진 형질전환체를 대상으로 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 실시간 PCR (RT-PCR), 서던 혼성화반응(Southern hybridization) 등을 실시하여 유전자 의 도입 및 안정적 발현 여부를 확인할 수 있다. 얻어진 형질전환 식물의 제초제 저항성 여부는 글루포시네이트암모늄의 엽신 국부처리 반응, 글리포제이트가 처리된 잎 절편에서의 쉬키메이트(shikimate) 축적 확인 등의 생물검정법으로 조사할 수 있고, 나아가 전식물체에 글루포시네이트암모늄과 글리포제이트의 단독처리 또는 혼합처리를 통해서 제초제 저항성 여부를 최종 확인할 수 있다.Subsequently, the obtained transformants can be subjected to polymerase chain reaction (PCR) amplification, real-time PCR (RT-PCR), Southern hybridization, and the like to confirm the introduction of genes and stable expression. The herbicide resistance of the obtained transgenic plants can be examined by bioassay such as chlorophyll localization reaction of glufosinate ammonium and confirmation of shikimate accumulation in glyphosate-treated leaf sections. Final treatment of herbicide resistance can be achieved through single or mixed treatment of glufosinate ammonium and glyphosate.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체를 제공한다. 상기 콩 식물체는 콩 식물체의 줄기, 뿌리, 잎뿐만 아니라 꽃가루(화분)까지 포함하는 개념이다. 따라서, 본 발명은 또한, 본 발명의 형질전환 콩 식물체의 꽃가루와 형질전환되지 않은 콩 식물체를 교배하여 새로운 콩 식물체를 육종하는 방법을 포함할 수 있다.The present invention also provides antibiotic marker free herbicide complex resistant soybean plants prepared by the method of the present invention. The soybean plant is a concept that includes pollen (pollen) as well as the stem, root, leaf of the soybean plant. Thus, the present invention may also include a method of breeding new soybean plants by crossing the pollen of the transgenic soybean plants of the present invention with the untransformed soybean plants.

본 발명의 제초제 복합 저항성 콩 식물체는 글루포시네이트 암모늄 저항성 bar 유전자와 제초제 글리포제이트 저항성 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하는 식물 형질전환용 발현벡터로 형질전환되어 상기 유전자들을 모두 발현하므로 비선택적 제초제인 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트에 대해 복합 저항성을 나타낸다. 또한, 본 발명의 콩 식물체는 항생제 표지 유전자를 포함하지 않으므로, 항생제 내성 확산 문제를 일으키지 않는 장점이 있다.The herbicide complex-resistant soybean plant of the present invention is transformed with a plant transformation expression vector comprising a glufosinate ammonium resistant bar gene and a herbicide glyphozate resistant CP4 - EPSPS gene to express all of the genes, thereby being a non-selective herbicide. It exhibits complex resistance to glufosinate ammonium and glyphosate. In addition, since the soybean plant of the present invention does not include an antibiotic marker gene, there is an advantage that does not cause antibiotic resistance diffusion problem.

본 발명은 또한, 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자를 포함하고, 항생제 마커 유전자를 포함하지 않는 식물 발현 벡터로 형질전환된, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체를 제공한다. 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4 - EPSPS 유전자는 전술한 바와 같다.The present invention also provides an antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant comprising a herbicide resistant bar gene and a CP4 - EPPS gene and transformed with a plant expression vector that does not include an antibiotic marker gene. The herbicide resistant bar gene and the CP4 - EPPS gene are as described above.

상기 콩 품종은 광안콩, 소진콩, 다채콩, 청자콩2호, 검정콩1호, 검정콩2호, 일품검정콩, 다원콩, 단백콩, 대원콩, 명주나물콩, 무한콩, 보광콩, 소명콩, 소록콩, 신팔달콩, 은하콩, 자수콩, 진율콩, 청자콩, 태광콩, 화엄풋콩, 버트(Burt) 등일 수 있으며, 바람직하게는 광안콩 또는 버트(Burt)일 수 있다.The bean varieties Gwangan bean, Sojin bean, Dachae bean, Cheongja bean No. 2, Black bean No. 1, Black bean No. 2, a la carte black bean, Dawon bean, protein bean, Daewon bean, Silken bean bean, Wuhan bean, Bogwang bean, Somyung bean, It may be sorbent beans, soybeans, galaxy beans, embroidered beans, jinyul beans, celadon beans, Taekwang beans, Hwaamfoot beans, Butt (Burt) and the like, preferably may be a light eye or Burt (Burt).

상기 식물 발현 벡터는 도 1에 기재된 p35S-EPSPS-B 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The plant expression vector may be the p35S-EPSPS-B vector described in FIG. 1, but is not limited thereto.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 종자를 제공한다.The present invention also provides seeds of the antibiotic marker free herbicide complex resistant soybean plant according to the present invention.

본 발명은 또한, 본 발명의 항생제 마커-프리 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 재배지에 글루포시네이트(glufosinate) 및 글리포제이트(glyphosate)를 혼합 또는 체계 처리하는 단계를 포함하는 잡초를 방제하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method for controlling weeds comprising mixing or systematically treating glufosinate and glyphosate in a plantation of the antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant of the present invention. to provide.

본 발명의 형질전환 콩 식물체는 비선택성 제초제인 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트에 대해 복합 저항성을 가지므로 글루포시네이트 암모늄과 글리포제이트를 상기 식물체의 재배지에 처리함으로써 잡초에 대해 상승된 방제효과를 얻을 수 있다.The transgenic soybean plants of the present invention have complex resistance to glufosinate ammonium and glyphosate, which are non-selective herbicides, so that they are elevated to weeds by treating glufosinate ammonium and glyphosate on the plantation of the plant. Control effect can be obtained.

본 발명의 두 가지 비선택성 제초제에 저항성을 가지는 콩을 재배하면 잡초방제를 위해 선택할 수 있는 약제가 하나에서 두 가지로 확대되기 때문에 잡초방제 체계(혼합처리 및 체계처리)를 보다 원활하게 세울 수 있고, 서로 다른 특성의 제초제를 사용하게 됨에 따라 잡초방제효과를 향상시킬 수 있어 궁극적으로 보다 적은 노동력 투입으로 콩 생산성을 높이는 효과를 가진다.Cultivation of soybeans resistant to the two non-selective herbicides of the present invention allows the weed control system (mixing and system treatment) to be set up more smoothly because of the wide selection of drugs for weed control from one to two. However, the use of different herbicides can improve the effectiveness of weed control, ultimately increasing the productivity of soybeans with less labor.

또한, 한 가지 비선택성 제초제만 사용할 수 있도록 제작된 콩을 재배할 경우, 제초제를 계속적으로 사용함으로 인해 저항성 잡초의 조기 출현 문제가 발생될 수 있는데 본 발명의 콩은 서로 다른 기작의 제초제를 교대로 처리할 수 있기 때문에 저항성 잡초 조기 출현 문제를 막거나 최소화시킬 수 있다. 아울러 글리포제이트 제초제는 자연계에서 이미 몇몇 저항성 잡초가 발생된 것으로 보고되고 있는 바(Sandermann H. 2006, Trends in Plant Sci., 11: 324-328), 저항성 잡초 발생이 보고되지 않은 글루포시네이트를 처리함으로서 이들을 용이하게 방제할 수 있다(Duke et al., 2005, Outlooks on Pest Management - October: 208-211).In addition, when cultivating soybeans made to use only one non-selective herbicide, the continuous use of herbicides may cause early emergence of resistant weeds, soybeans of the present invention alternately herbicides of different mechanisms The treatment can prevent or minimize the problem of early emergence of resistant weeds. In addition, glyphosate herbicides have already been reported to have some resistant weeds in nature (Sandermann H. 2006, Trends in Plant Sci ., 11: 324-328), these can be easily controlled by treating glufosinate for which no resistant weed outbreaks have been reported (Duke et al., 2005, Outlooks on Pest Management-October: 208-211).

아울러, 본 발명의 형질전환 콩 재배지의 잡초를 방제하기 위해 글루포시네이트 및 글리포제이트 제초제를 혼합처리할 경우, 상기 제초제들이 상승효과를 나타내므로 최종 처리 약량(제초제 투입량)을 낮출 수 있어 환경부담을 감소시키는 효과를 가진다.In addition, when glufosinate and glyphosate herbicides are mixed in order to control the weeds of the transgenic soybean plantation of the present invention, the herbicides exhibit a synergistic effect and thus lower the final dosage (herbicide dosage). It has the effect of reducing the burden.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples.

실시예Example

재료 및 방법Materials and methods

실험을 위하여 광안콩과 비교품종으로 미국품종 버트(Bert)를 재료로 형질전환을 수행하였다.For the experiment, US varieties Bert was transformed into materials with Gwangan bean and comparative varieties.

가) 파종A) sowing

종자는 강염산(12N)에 락스를 혼합하여 발생시킨 염산 가스에 소독을 한 후, 1% 나트륨 차아염소산염(sodium hypochlorite)에 30분간 흔들면서 2차 소독을 하였고, 10분 간격으로 멸균수로 3회 수세하였다. GM(germination medium, 발아 배지; B5 salt 3.16g/ℓ, MES 3mM, 수크로스 3%, 한천 0.8%, pH 5.8)에 파종 후 24℃ 배양실에서 16시간 광조건과 8시간 암조건으로 5일간 발아시켰다.Seeds were sterilized in hydrochloric acid gas produced by mixing Lactose with strong hydrochloric acid (12N), followed by secondary disinfection by shaking with 1% sodium hypochlorite for 30 minutes. Washed twice. After germination to GM (germination medium; B16 salt 3.16 g / L, MES 3 mM, sucrose 3%, agar 0.8%, pH 5.8), germination was carried out for 5 days under conditions of 16 hours light and 8 hours dark at 24 ° C. .

나) 제초제 내성 유전자의 발현 벡터인 p35S-EPSPS-B의 제조B) Preparation of p35S-EPSPS-B, an expression vector of herbicide resistance gene

Bar 유전자를 포함하는 pCAMBIA3300(Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia)의 CaMV 35S 프로모터와 NOS 종결인자 사이에 CP4-EPSPS 유전자를 도입하여 식물체용 발현 벡터 p35S-EPSPS-B를 제작하였다 (도 1).Plant expression vector p35S-EPSPS-B was constructed by introducing the CP4-EPSPS gene between the CaMV 35S promoter and the NOS terminator of pCAMBIA3300 (Center for Application of Molecular Biology to International Agriculture, Australia) containing the Bar gene (Fig. One).

구체적으로, 먼저 CP4 5- enol - pyrubylshikimate -3- phosphate synthase (EPSPS) 유전자를 분리하기 위하여 서열번호 2(5'-TAG CAG ATC TTT CAA GAA TGG-3') 및 서열번호 3(5'-GCA TGC TTC ACG GTG CAA GCA-3')을 이용하였다. 또한 유전자 변형 콩인 Roundup-Ready

Figure 112007093432574-pat00001
(RR)콩에서 통상적인 방법으로 총 RNA를 분리하고, 이를 역전사효소를 이용하여 합성한 cDNA를 제조하였다. 상기의 프라이머와 합성한 cDNA를 사용하여 94℃에서 1분, 52℃에서 1분, 72℃에서 2분의 1사이클의 PCR을 수행하여 CP4-EPSPS 유전자를 증폭한 후, 공급자가 제공하는 프로토콜에 따라 증폭된 PCR 산물을 pGEM-T Easy에 클로닝하고 염기서열을 결정하였고 이를 pCP4-EPSPS라 명명하였다.Specifically, first CP4 5- enol - pyrubylshikimate- 3- phosphate synthase SEQ ID NO: 2 (5'-TAG CAG ATC TTT CAA GAA TGG-3 ') and SEQ ID NO: 3 (5'-GCA TGC TTC ACG GTG CAA GCA-3') were used to isolate (EPSPS) genes. In addition, the genetically modified soybean Roundup-Ready
Figure 112007093432574-pat00001
Total RNA was isolated from the conventional (RR) soybean, and the synthesized cDNA was prepared using reverse transcriptase. After amplifying the CP4-EPSPS gene by performing PCR for 1 minute at 94 ° C, 1 minute at 52 ° C, and 2 minutes at 72 ° C using the cDNA synthesized with the above primer, the protocol provided by the supplier The PCR product amplified accordingly was cloned into pGEM-T Easy and the sequence was determined and named pCP4-EPSPS.

최종적으로 bar 유전자를 포함하는 pCAMBIA3300의 CaMV 35S 프로모터와 NOS 종결인자 사이에 CP4 - EPSPS를 도입하여 p35S-EPSPS-B를 제작하였다 (도 1). 구체적으로, pCAMBIA3300을 CaMV 35S 프로모터 하류의 BamHI과 NOS 종결인자 상류의 SacI으로 절단한 위치에 pCP4-EPSPS를 BglII와 SacI 제한효소로 절단하여 얻은 CP4-EPSPS 절편 (프라이머 서열에 각각 BglII 및 SacI 제한효소 위치가 도입됨)을 삽입하여 p35S-EPSPS-B를 제작하였다. Finally CP4 pCAMBIA3300 between the CaMV 35S promoter and the NOS terminator of factors, including the bar gene-introduced into the EPSPS were prepared p35S-EPSPS-B (Fig. 1). Specifically, a CP4-EPSPS fragment obtained by cleaving pCP4-EPSPS with BglII and SacI restriction enzymes at a position where pCAMBIA3300 was cleaved with SamI upstream of the BamHI and NOS terminators downstream of the CaMV 35S promoter (BglII and SacI restriction enzymes in the primer sequence, respectively). Location was introduced) to construct p35S-EPSPS-B.

p35S-EPSPS-B를 안(An)의 방법(An, Meth. Enzymol., 153: 292-305, 1987)에 따라 아그로박테리움 투메파시엔스 EHA105 (Hood, et al., Trans. Res., 2: 208-218, 1993)에 도입하였으며, 얻어진 아그로박테리움 균주를 한국생명공학연구원 부설 유전자은행(KCTC)에 2006년 10월 25일자로 수탁번호 KCTC 11008BP로서 기탁하였다.p35S-EPSPS-B was converted to Agrobacterium tumefaciens EHA105 (Hood, et al., Trans. Res. , 2) according to the method of An (An, Meth. Enzymol. , 153: 292-305, 1987) . : 208-218, 1993), and the obtained Agrobacterium strain was deposited with the Korea Biotechnology Research Institute Genetic Bank (KCTC) on October 25, 2006 as Accession No. KCTC 11008BP.

다) 접종 균(Agrobacterium tumefaciens) 준비C) Agrobacterium tumefaciens ) ready

상기에서 제조한 아그로박테리움 균주를 고체 YEP 배지 [카나마이신 100㎎/ℓ, 리팜피신 25㎎/ℓ, 펩톤 10g/ℓ, NaCl 5g/ℓ, 효모 추출액 5g/ℓ, 1.5%(w/v) 한천 (pH 7.0)]에 긁은 후 25℃에서 배양하여 생성된 단일 콜로니를 같은 항생제가 들어 있는 액체 YEP 배지 10㎖에 넣고 OD650 0.8이 될 때까지 25℃에서 250rpm으로 배양기에서 교반하였다. 다 자란 배양균에 30% 글리세롤 스톡 10㎖을 넣고 섞은 뒤, 1.5㎖ 튜브에 1㎖씩 분주하여 액체질소로 급속 냉각하여 -70℃에 보관하였다. 접종 하루 전에 항생제가 들어있는 액체 YEP 배지 200㎖에 -70℃에서 보관해 놓은 Agrobacterium tumefaciens 스톡 (competent cell)을 1㎖ 넣고 OD650이 0.8~1.0이 될 때까지 25℃에서 250rpm으로 배양기에서 흔들어 주었다.Agrobacterium strains prepared above were prepared in solid YEP medium [Kanamycin 100mg / l, Rifampicin 25mg / l, Peptone 10g / l, NaCl 5g / l, Yeast extract 5g / l, 1.5% (w / v) agar ( pH 7.0)] and the single colonies produced by incubation at 25 ℃ was placed in 10 ml of liquid YEP medium containing the same antibiotics and stirred in the incubator at 25 ℃ 250 rpm until the OD 650 0.8. 10 ml of 30% glycerol stock was added to the grown cultures, and then, 1 ml was dispensed into a 1.5 ml tube and rapidly cooled with liquid nitrogen and stored at -70 ° C. Agrobacterium , stored at -70 ° C in 200 ml of liquid YEP medium containing antibiotics one day before inoculation tumefaciens 1 ml of stock (competent cell) was added and shaken in an incubator at 250 ° C. at 25 ° C. until OD 650 became 0.8-1.0.

접종 당일에 액체 YEP 배지 200㎖을 50㎖씩 나눠서 20℃, 3270g에서 10분 동안 원심분리하였다. 각각의 튜브에 있는 A. tumefaciens 펠렛을 액체 CCM(co-cultivation medium, 공배양 배지; B5 salt 0.316g/ℓ, BA 1.67㎎/ℓ, MES 20mM, GA3 0.25㎎/ℓ, 아세토시링곤 0.2mM, L-시스테인 3.3mM, 소듐 티오설페이트 1.0mM, DTT 1.0mM, 수크로스 3%, pH 5.4)에 5㎖을 넣어 고농축액 상태로 제조하였다.On the day of inoculation, 200 ml of liquid YEP medium was divided into 50 ml and centrifuged at 20 ° C. and 3270 g for 10 minutes. A. tumefaciens in each tube Pellets were liquid CCM (co-cultivation medium; coculture medium; B5 salt 0.316 g / l, BA 1.67 mg / l, MES 20 mM, GA3 0.25 mg / l, acetosyringone 0.2 mM, L-cysteine 3.3 mM, sodium thio Sulfate 1.0mM, DTT 1.0mM, sucrose 3%, pH 5.4) 5ml was prepared in a high concentration state.

라) 접종과 공배양D) inoculation and co-culture

발아한 식물체의 배축을 떡잎 밑 약 1㎝ 되는 곳에서 자른 후 양 떡잎 사이로 외과용 메스를 넣어 하배축까지 수직으로 자르고 새로 나온 본엽을 제거하였다. 드러난 측아(axillary bud)와 자엽절 (cotyledonary node)를 현미경으로 보면서 외과용 메스(＃11 blade)로 8회 정도 상처를 내었다. 이 때 외과용 메스에 5㎖ 농축액을 묻힌 다음 목표 부위에 상처를 내었으며, Clean bench 안에서 30분 정도 UV 소독을 한 데시게이터｛250㎜(가로)x250㎜(세로)x300㎜(높이)}와 다이어프램펌프(GAST사)를 이용해서 진공(vacuum) 30초 처리(500mm.Hg)를 하였다.The germ of the germinated plant was cut at about 1cm under the cotyledon, and then a surgical scalpel was inserted between the two cotyledones to cut vertically to the lower hypocotyl and the new main leaf was removed. Microscopical examination of the exposed axillary bud and cotyledonary node was performed with a surgical scalpel (＃ 11 blade) for eight wounds. At this time, 5 ml concentrated solution was applied to the surgical scalpel, and the target area was wounded. The desiccator ｛250 mm (width) x 250 mm (length) x 300 mm (height)} was UV sterilized for 30 minutes in a clean bench. The vacuum 30 seconds treatment (500 mm.Hg) was performed using the diaphragm pump (GAST Corporation).

각각의 절편체를 튜브에서 꺼내 멸균한 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤, 고체 공배양 배지에도 여과지를 한 장 깔고 15개체 내외로 올려두었다 (향축 (adaxial) 부분이 밑으로 향하도록 둔다). Micropore로 봉한 뒤 25℃에 5일 동안 암배양하였다.Each section was removed from the tube, placed on a sterile filter paper and drained, and then placed on a solid coculture medium with one sheet of filter paper and placed in or out of 15 (adaxial side down). Sealed with micropore and then cultured for 5 days at 25 ℃.

마) 세척 및 신초의 유도E) washing and induction of shoots

5일간 공배양을 한 후에 제균을 위해서 액체 1/2 SIM(shoot induction medium, 신초 유도 배지)에 간단히 세척하였다. 각각의 절편체를 여과지 위에 놓고 물기를 제거한 뒤 선발항생제가 없는 SI-①(shoot induction; B5 salt 3.16g/ℓ, BA 1.67㎎/ℓ, MES 3mM, 수크로스 3%, 한천 0.8%, 세포탁심 500㎎/ℓ, pH 5.6)에 한 플레이트당 7 개체씩 배지와 수평이 되도록 치상하였다.After 5 days of coculture, the cells were briefly washed in liquid 1/2 SIM (shoot induction medium) for sterilization. Each piece was placed on a filter paper and drained, and then SI-① (shoot induction; B5 salt 3.16g / ℓ, BA 1.67mg / ℓ, MES 3mM, sucrose 3%, agar 0.8%, cytotactile 500 mg / L, pH 5.6), 7 individuals per plate were toothed to be parallel to the medium.

2주 후 신초가 나온 절편체를 선발항생제가 들어있는 SI-②(shoot induction; B5 salt 3.16g/ℓ, MES 3mM, BA 1.67㎎/ℓ, 수크로스 3%, 한천 0.8%, 세포탁심 500㎎/ℓ, 하이그로마이신 B 5㎎/ℓ 또는 DL-포스피노트리신 10㎎/ℓ, pH 5.6)에 치상하였는데, 이 때 신초를 제외한 나머지 부분은 잘라 버리고 향축 (adaxial) 부분이 밑으로 향하도록 치상하였다. Two weeks later, the shoots from which shoots emerged were selected as SI-② (shoot induction; B5 salt 3.16g / l, MES 3mM, BA 1.67mg / l, sucrose 3%, agar 0.8%, cytotaxin 500mg / l, hygromycin B 5 mg / l or DL-phosphinothricin 10 mg / l, pH 5.6), with the exception of the shoots being cut off and the adaxial portion facing down. It was healed.

2주 후 갈변한 신초/신초 pad는 외과용 메스(＃15 blade)로 깎아내고 선발 항생제가 들어있는 SEM(shoot elongation medium, 신초 신장 배지; MS salt 4.4g/ℓ, MES 3mM, GA3 0.5㎎/ℓ, 아스파라긴 50㎎/ℓ, 피로글루탐산 100㎎/ℓ, IAA 0.1㎎/ℓ, 제아틴-리보시드 1㎎/ℓ, 실버 니트레이트 10㎎/ℓ, 수크로스 3%, 한천 0.8%, 세포탁심 500㎎/ℓ, DL-포스피노트리신 5㎎/ℓ, pH 5.6)에 치상하였다.Two weeks later, the browned shoots and shoot pads were cut with a surgical scalpel (＃ 15 blade) and taken with SEM (shoot elongation medium, shoot kidney medium; MS salt 4.4g / L, MES 3mM, GA3 0.5mg / l, asparagine 50 mg / l, pyroglutamic acid 100 mg / l, IAA 0.1 mg / l, zeatine-riboside 1 mg / l, silver nitrate 10 mg / l, sucrose 3%, agar 0.8%, cytotaxin 500 mg / l, DL-phosphinothricin 5 mg / l, pH 5.6).

바) 유전자 도입 분석F) gene transfer analysis;

선발된 형질전환 콩 식물체의 PCR을 통한 유전자 도입 여부를 확인하기 위해 서, bar 유전자 특이 프라이머와 CP4-EPSPS 유전자 특이 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하였다. PCR 증폭반응은 TaKaRa사의 TaKaRa LA TagTM을 사용하였으며 혼합용액은 다음과 같다. DNA Library (0.1㎍/㎕) 2㎕, GSP(Gene-Specific primer: 20 pmole) 2㎕, Tag 중합효소 0.5㎕, 10X LA PCRTm 버퍼 5㎕, dNTP(2.5mM) 8㎕, MgCl2 (2.5mM) 5㎕, 탈이온수 25.5㎕를 넣은 후 잘 섞어주었다. 94℃에서 3분간 변성반응시킨 후, 94℃에서 30초 변성, 60℃(bar)/65.6℃(CP4 - EPSPS)에서 30초 중합(polymerization) 어닐링(annealing), 그리고 72℃에서 30초씩 35회 신장(extension) 반응을 행하고, 72℃에서 10분간 추가 신장시켰다. 사용한 효소는 Taq 중합효소(Takara)이며 PCR 증폭의 결과는 1.0 %(w/v) 아가로즈 젤(agarose gel)에서 전기영동으로 확인하였다. In order to confirm whether the selected transgenic soybean plants were introduced through PCR, PCR was performed using bar-specific primers and CP4-EPSPS gene-specific primers. PCR amplification reaction was performed using TaKaRa LA Tag TM of TaKaRa, and the mixed solution is as follows. 2 μl of DNA Library (0.1 μg / μl), 2 μl of Gene-Specific Primer (20 pmole), 0.5 μl of Tag Polymerase, 5 μl of 10X LA PCRTm Buffer, 8 μl of dNTP (2.5 mM), MgCl 2 (2.5 mM) 5 μl, deionized water was added 25.5 μl and mixed well. After denaturation at 94 ° C. for 3 minutes, denaturation at 94 ° C. for 30 seconds, polymerization at 60 ° C. ( bar ) /65.6° C. ( CP4 - EPSPS ) for 30 seconds, annealing at 35 ° C., and 35 cycles at 72 ° C. for 30 seconds An extension reaction was performed and it extended further at 72 degreeC for 10 minutes. The enzyme used was Taq polymerase (Takara) and the results of PCR amplification were confirmed by electrophoresis on 1.0% (w / v) agarose gel.

아울러 서던 혼성화 반응(Southern hybridization) 분석을 통한 형질전환체의 확인은 다음과 같이 실시하였다. 온실에서 생육중인 형질전환된 콩 식물체 및 비형질전환 콩 식물체의 잎으로부터 디엔이지　 플랜트 맥시 키트(DNeasy　 Plant Maxi kit, QIAGEN 사)를 이용하여 게놈 DNA를 각각 추출하였다. 얻어진 게놈 DNA 30 ㎍씩을 제한효소 EcoRI 및 HindIII로 절단하여 아가로즈 겔에서 전기영동을 수행하였다. 상기 겔 상의 게놈 DNA를 제타프로브 멤브레인(Zeta Probe membrane, Bio-Rad 사)으로 전달한 후, 상기 멤브레인에 전달된 DNA와 bar 유전자의 일부분인 0.5 kb 절편 및 CP4 - EPSPS 유전자의 일부분인 1.0 kb 절편을 32P로 표지한 유전자 단편을 탐침으로 이용하여 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다. 혼성화 반응이 종료된 후, 멤브레인을 세척하고, X-선 필름에 노출시켜 밴드를 확인하였다.In addition, the identification of transformants through Southern hybridization analysis was performed as follows. Deage from leaves of transformed soybean plants and non-transformed soybean plants growing in greenhouses 　 Plant maxi kit (DNeasy 　 Genomic DNA was extracted using Plant Maxi kit (QIAGEN). 30 μg of each of the obtained genomic DNAs was digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII and electrophoresed on an agarose gel. After transferring genomic DNA on the gel to Zeta Probe membrane (Bio-Rad), a 0.5 kb fragment, which is part of the DNA and bar genes delivered to the membrane, and a 1.0 kb fragment, which is part of the CP4 - EPPS gene A hybridization reaction was performed using a 32 P-labeled gene fragment as a probe. After the hybridization reaction was complete, the membrane was washed and exposed to an X-ray film to identify the bands.

유전자 발현 검정을 위한 RT-PCR의 경우, RNA 추출을 위하여 SOLD(4M 구아니디늄 티오시아네이트 23.63g, 25mM 소듐 시트레이트 pH 7.0, 0.5% 사르코실(sarcosyl), DEPC 처리수를 첨가하여 총 부피 50㎖로 맞춤) 10㎖/g와 2-머캅토에탄올 75㎕를 넣은 50㎖짜리 시험관에 시료 1g을 액체질소를 부어가며 곱게 갈아 넣어 교반하여 실온에 10∼15분 둔 후, 2M 소듐 아세테이트(pH 4.0)를 0.1 부피(1㎖)을 넣었다. 그 후, 페놀(물 포화)을 1 부피(10㎖)을 넣고, 클로로포름/이소아밀 알코올 (49:1)을 0.2 부피(2㎖)을 넣고, 1분 동안 inversion하여 얼음에 15분간 처리한 후, 4℃, 12000rpm으로 20 분간 원심분리하였다. 그 후 상층액을 따서 새 시험관에 옮기고 클로로포름/이소아밀 알코올(49:1)을 상등액의 0.5∼1 부피의 양만큼 넣고 1분 동안 inversion하였다. 그 후 4℃, 12000rpm으로 20분간 한 번 더 원심분리하였다. 상층액을 따서 새 시험관에 옮기고, 1 부피의 이소프로판올을 넣고 inversion하여 고루 섞어서 -20℃에서 1시간 처리하였다. 그 후, 4℃, 12000rpm으로 20분간 원심분리하였다. 그 후 상층액을 버리고 RNA를 모아서 750㎕의 용액 D(또는 DEPC water)를 넣어 펠렛을 녹였다. 이소프로판올을 동일 부피로 넣은 뒤 4℃, 12000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 버리고, 70% 에탄올을 1㎖ 넣고 4℃, 8000rpm에서 10분간 원심분리하여, 70% 에탄올을 버리고 깨끗이 말렸다. 그 후, DEPC 처리수를 500㎕ 넣고 잘 녹였다. RT-PCR을 수행하기 위해 Invitrogen 사의 SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platinum(R) Taq을 사용하였다. 2X 반응 버퍼 12.5㎕, 주형 RNA 1㎕, 센스 프라이머 1㎕, 안티센스 프라이머 1㎕, RT/Platinum(R) Taq Mix 0.5㎕, DEPC water 9㎕를 넣어 총 부피를 25㎕로 만들고 잘 섞어 주었다. 48℃에서 90분, 94℃에서 5분간 cDNA를 합성하고 예비변성을 한 후, 94℃에서 1분간 변성(denaturation)시켰고 55℃에서 1분간 어닐링(annealing), 그리고 72℃에서 1분 30초 동안 신장(extension) 반응을 30회 행하였고, 72℃에서 10분간 추가 신장시켰다.For RT-PCR for gene expression assay, total volume was added by adding SOLD (23.63 g of 4M guanidinium thiocyanate, 25 mM sodium citrate pH 7.0, 0.5% sarcosyl, DEPC treated water) for RNA extraction. 50 ml of 10 ml / g and 75 µl of 2-mercaptoethanol were added to a 50 ml test tube, followed by stirring with fine liquid N, adding 10 g of liquid nitrogen and stirring at room temperature for 10 to 15 minutes. pH 4.0) was added 0.1 volume (1 mL). Then, add 1 volume (10 ml) of phenol (saturated water), add 0.2 volume (2 ml) of chloroform / isoamyl alcohol (49: 1), inversion for 1 minute, and treat with ice for 15 minutes. , Centrifuged for 20 minutes at 4 ℃, 12000rpm. The supernatant was then transferred to a new test tube and chloroform / isoamyl alcohol (49: 1) was added in an amount of 0.5-1 volume of the supernatant and inversion was performed for 1 minute. Then, centrifuged once more for 20 minutes at 4 ℃, 12000rpm. The supernatant was picked up, transferred to a new test tube, 1 volume of isopropanol was added, inversion mixed, and treated at -20 ° C for 1 hour. Thereafter, the mixture was centrifuged at 4 DEG C and 12000 rpm for 20 minutes. After that, the supernatant was discarded, RNA was collected, and 750 µl of Solution D (or DEPC water) was added to dissolve the pellets. Isopropanol was added in the same volume and centrifuged at 4 ° C. and 12000 rpm for 15 minutes. The supernatant was discarded, 1 ml of 70% ethanol was added and centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The 70% ethanol was discarded and dried. Thereafter, 500 µl of DEPC treated water was added and dissolved well. Invitrogen's SuperScript ™ One-Step RT-PCR with Platinum (R) Taq was used to perform RT-PCR. 2X reaction buffer 12.5μL, template RNA 1μL, sense primer 1μL, antisense primer 1μL, RT / Platinum (R) Taq Mix 0.5μL was added to the total volume to 25μL and mixed well. CDNA was synthesized for 90 minutes at 48 ° C. and 5 minutes at 94 ° C., followed by preliminary denaturation, followed by denaturation at 94 ° C. for 1 minute, annealing at 55 ° C. for 1 minute, and 1 minute 30 seconds at 72 ° C. The extension reaction was performed 30 times and further extended at 72 ° C. for 10 minutes.

사) 제초제 저항성 검정G) herbicide resistance test

재분화 식물체의 제초제 저항성 생물검정을 위하여 두 단계로 조사하였다. 첫 번째 단계는 간이검정법으로서 bar 저항성의 경우는 잎의 일부에 글루포시네이트암모늄을 도포처리하여 세포괴사 여부를, EPSPS 저항성의 경우에는 글리포제이트 용액에 치상된 잎절편 내의 쉬키메이트 축적여부를 조사하여 평가하는 것이다. 두 번째 단계에서는 식물체가 정상적인 생육을 거쳐 일정한 크기에 이르렀을 때 비선택성 제초제를 식물체 전체에 경엽처리하여 실제 제초제 저항성을 나타내는지를 확인하는 것이다.Two stages were investigated for herbicide resistant bioassay of regenerated plants. The first step is a simple assay. In the case of bar- resistance, glufosinate ammonium is applied to a part of the leaves to determine cell necrosis. Investigate and evaluate. In the second step, when the plant reaches normal size through normal growth, non-selective herbicides are applied to the whole plant to check whether they show actual herbicide resistance.

Bar 유전자 활성 여부를 알기 위한 간이검정으로서 글루포시네이트암모늄 용액을 250 - 1000 ㎍/㎖ 농도로 조제하여(0.1 % 트윈 20 함유) 순화된 어린 식물체 잎의 약 1cm2에 10 ㎕씩 대상처리(band treatment)하였다. 비형질전환체는 황화증상과 함께 세포괴사가 일어난다.As a simple assay to determine whether the Bar gene is active, glufosinate ammonium solution was prepared at a concentration of 250-1000 ㎍ / ml (containing 0.1% Tween 20) and treated with 10 μl of approximately 1 cm 2 of leaves of purified young plants. treatment). Nontransformers undergo cell necrosis with sulfidation.

CP4 - EPSPS 유전자 활성 여부를 알기 위한 간이검정으로서 글리포제이트 용액에 치상한 식물체 조직의 쉬키메이트 축적 여부를 조사하였다(김 등, 2006, 식생공지, 33:57-63). 글리포제이트의 EPSPS 저해로 인해 조직 내에서 쉬키메이트가 축적되면 380 nm에서의 흡광도가 비형질전환체에서와 같이 증가한다.As a simple test to determine the CP4 - EPPS gene activity, we investigated the accumulation of shchimate in plant tissues grafted in glyphosate solution (Kim et al., 2006, Vegetation Bulletin , 33: 57-63). The accumulation of shchimate in tissues due to EPSPS inhibition of glyphosate increases the absorbance at 380 nm as in nontransformants.

제초제 경엽처리에 의한 전식물체 수준에서의 저항성 검정을 위해서는 다음과 같이 실시하였다. T1 세대 또는 T2 세대의 종자를 부농상토 5호가 담긴 가로 22 cm, 세로 15 cm의 사각 포트에 파종한 다음, 온실(주간 25℃ 내외/야간 20℃ 내외)에서 10-20일 생장시켰다 (지상부가 20-30 cm 정도 자람). 제초제 글리포제이트 원제 (순도 62 %, (주) 경농)와 글루포시네이트암모늄(순도 50 %, 바이엘 크롭사이언스)을 0.1 % 트윈 20 ＋ 20 % 아세톤 용액에 각각 250 ㎍/㎖ 농도로 용해시킨 후, 얻어진 제초제 용액들을 콩 식물체의 지상부에 흠뻑 젖을 정도로 포트 당 20 ㎖씩 살포하였다. 제초제가 처리된 콩 식물체를 온실조건에 옮겨, 처리 후 3일째에 잎의 엽록소 함량 변화와 광계 II의 광량자 수율 변화를 측정하였고, 7일째에 제초활성 반응을 달관조사하였다. 잎의 엽록소 함량은 엽록소계(SPAD 502, Minolta, Japan)를 이용하여 비파괴적으로 조사하였으며, 광량자 수율값은 펄스 진폭 변조 형광계(Pulse Amplitude Modulation Fluorometer; PAM 2000, Walz, Germany)를 이용하여 하기 수학식 1에 따라 조사하였다:For the resistance test at the whole plant level by the herbicide foliage treatment was carried out as follows. Seeds of T1 or T2 generations were planted in a square pot of 22 cm wide and 15 cm long containing the subcontracting soil No. 5, and then grown for 10-20 days in a greenhouse (about 25 ° C per week / 20 ° C at night). Grows about 20-30 cm). Herbicide glyphosate raw material (purity 62%, light concentrate) and glufosinate ammonium (purity 50%, Bayer CropScience) were dissolved in a 0.1% Tween 20 + 20% acetone solution at a concentration of 250 µg / ml, respectively. The herbicide solutions obtained were then sprayed 20 ml per pot soaking the ground above the soybean plants. The herbicide-treated soybean plants were transferred to greenhouse conditions, and the changes of chlorophyll content of leaves and photon yield of photosystem II were measured at 3 days after treatment, and herbicide response was examined at 7 days. The chlorophyll content of the leaves was investigated non-destructively using the chlorophyllometer (SPAD 502, Minolta, Japan), and the photon yield value was determined using the Pulse Amplitude Modulation Fluorometer (PAM 2000, Walz, Germany). It was investigated according to equation 1:

광합성 광량자 수율 =(Fm＇－Ft)/Fm'Photosynthetic photon yield = (Fm＇-Ft) / Fm '

상기 식에서, Fm'는 명조건에서의 최대 형광 수율, Ft는 명조건에서의 최소 형광 수율을 의미한다.In the above formula, Fm 'means maximum fluorescence yield in bright conditions, and Ft means minimum fluorescence yield in bright conditions.

실시예Example 1. 제초제 저항성 형질전환체 생산 1. Production of herbicide resistant transformants

상기에서 기술한 바와 같은 방법으로 형질전환체를 생산하였다. 신초를 형성하기 위해 신초형성(Shoot Induction) 배지에 치상하고 2주 뒤에는 10㎎/ℓ PPT(DL-phosphinothricin)가 포함된 신초형성 배지에 계대하였다(도 2-a). 그 후 2주 뒤에는 신초를 신장하기 위해 5㎎/ℓ PPT가 포함된 신초신장(Shoot Elongation) 배지에 계대하였다(도 2-b). 신초가 4cm 정도 자라게 되면 뿌리유도(Rooting) 배지로 옮겨 뿌리가 충분히 자랄 때까지 지켜보았다(도 2-c).Transformants were produced in the same manner as described above. To form shoots, they were wound on Shoot Induction medium and two weeks later, they were passaged on Shooting medium containing 10 mg / L PPT (DL-phosphinothricin) (FIG. 2-a). Two weeks later, it was passaged in Shoot Elongation medium containing 5 mg / L PPT to elongate shoots (Fig. 2-b). When shoots grow about 4cm, they were transferred to Rooting medium and watched until the roots had grown sufficiently (Fig. 2-c).

뿌리가 충분히 자라게 되면, 뿌리에 붙어있는 한천(agar) 배지를 물로 헹궈주고 바로 흙으로 옮겨주었다. 이때 덮개가 있는 마젠타 상자(Magenta box) 안에 흙이 들어 있는 포트에 심어 주었다(도 3-a). 그 후 식물체가 충분히 자라게 되면 더 큰 포트로 옮겨 심었고 6-8개의 구멍이 뚫려 있는 덮개를 덮어주었다. 2-3주 정도 지나 덮개를 제거하여 온실에서 키웠다(도 3-b). Once the roots had grown sufficiently, the agar medium attached to the roots was rinsed with water and immediately transferred to the soil. At this time it was planted in a pot containing soil in a magenta box with a cover (Fig. 3-a). After that, when the plants were fully grown, they were transferred to larger pots and covered with 6-8 holes. After 2-3 weeks the cover was removed and grown in a greenhouse (Figure 3-b).

식물체가 크면 잎에 바스타(Basta, 53 ㎎/ℓ)를 처리하여 조직의 괴사여부를 살펴보았다. 바스타에 저항성을 나타내는 형질전환체(T0 식물)에서 종자가 맺히게 되면 이를 수확을 하여 건강한 종자들을 사각형의 큰 포트에 심었다. T1 종자로부터 식물체(T1 식물)를 재배하여(도 4-a) T2 종자를 수확하였다(도 4-b).If the plant is large, the leaves were treated with Bassta (Basta, 53 ㎎ / ℓ) to examine the necrosis of the tissue. Seeds formed from transformants (T0 plants) resistant to basta were harvested and healthy seeds were planted in large pots in squares. T2 seeds were harvested by cultivating plants (T1 plants) from T1 seeds (Fig. 4-a).

이렇게 하여 수확한 T1과 T2의 종자의 개수는 표 1에서와 같았다.The number of seeds of T1 and T2 harvested in this way was as shown in Table 1.

표 1. 도입된 제초제저항성 유전자의 형질전환체에서 수확한 종자의 개수Table 1. Number of seeds harvested from transformants of herbicide-tolerant genes introduced

벡터 및 도입 유전자Vector and transgene 콩 품종
Bean varieties
수확한 종자 개수Harvested Seed Count T1 종자T1 seed T2 종자T2 seed pCAMBIA3300pCAMBIA3300 버트Burt 5656 345345 barbar /Of CP4CP4 -- EPSPSEPSPS 광안콩Gwangan Kong 1818 116116

실시예Example 2:  2: 광안콩과Gwangan Kong 버트콩에서의At the butte 글루포시네이트Glufosinate 및  And 글리포제이트Glyphozeate 저항성 식물체의 유전자 도입 확인 Confirmation of gene introduction in resistant plants

광안콩과 버트콩에서의 bar와 CP4-EPSPS 유전자 도입을 확인하기 위해 DNA를 분리하여 PCR (DNA 30㎍)을 수행하였다. PPT 프라이머인 PPT-5' (5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAA-3'; 서열번호 4)과 PPT-3' (5'-CGACGCCCGGCCGACATC-3'; 서열번호 5)을 사용하여 bar 유전자의 도입을 확인한 결과, 500bp의 밴드 크기를 확인할 수 있었고(도 5-a), EPSPS 프라이머인 Epsps-5' (5'-CCGTAAGGAAGGCGACAC-3'; 서열번호 6)과 Epsps-3' (5'-AGGAAGCTCATGGCGATG-3'; 서열번호 7)을 사용하여 CP4-EPSPS 유전자의 도입을 확인한 결과, 1kb의 밴드 크기를 확인하였다(도 5-b). 이를 통해 광안콩과 버트콩 모두에 유전자가 도입됨을 보여주었다.In order to confirm the introduction of bar and CP4-EPSPS genes in light and soybeans, DNA was isolated and PCR (DNA 30㎍) was performed. PBP-5 '(5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAA-3'; SEQ ID NO: 4) and PPT-3 '(5'-CGACGCCCGGCCGACATC-3'; SEQ ID NO: 5) were used to confirm the introduction of the bar gene. The band size of (Fig. 5-a), EPSps primers Epsps-5 '(5'-CCGTAAGGAAGGCGACAC-3'; SEQ ID NO: 6) and Epsps-3 '(5'-AGGAAGCTCATGGCGATG-3'; SEQ ID NO: As a result of confirming the introduction of the CP4-EPSPS gene using 7), a band size of 1 kb was confirmed (Fig. 5-B). This showed that the genes were introduced into both Gwangan and Butte beans.

이를 더욱 확인하기 위하여 광안콩과 버트콩의 genomic DNA(10㎍)을 EcoRI 제한효소로 처리하여 서던 분석을 한 결과, 하나 내지 두개의 카피 수를 확인할 수 있었다(도 6).In order to further confirm this, the genomic DNA of Gwangan and Butte beans (10 μg) was treated with EcoRI restriction enzymes, and Southern analysis was performed. As a result, one to two copy numbers were confirmed (FIG. 6).

한편 광안콩과 버트콩에서의 도입된 제초제 저항성 유전자가 전사(transcription)되는지를 확인하기 위하여 RNA를 분리하여 RT-PCR (RNA 30㎍)을 수행하였다. PPT 프라이머인 PPT-5' (5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAA-3'; 서열번호 4)과 PPT-3'(5'-CGACGCCCGGCCGACATC-3'; 서열번호 5)을 사용하여 bar 유전자의 전사를 확인한 결과, 500bp의 밴드 크기를 확인할 수 있었고(도 7-a), EPSPS 프라이머인 Epsps-5' (5'-CCGTAAGGAAGGCGACAC-3'; 서열번호 6)과 Epsps-3' (5'-AGGAAGCTCATGGCGATG-3'; 서열번호 7)을 사용하여 CP4 - EPSPS 유전자의 전사를 확인한 결과, 1kb의 밴드 크기를 확인하였다(도 7-b). 이는 도입된 유전자가 정상적으로 발현되고 있음을 나타내준다.On the other hand, RNA was isolated and RT-PCR (RNA 30µg) was performed to confirm whether the herbicide resistance genes introduced in Gwangan and Butte were transcribed. The transcription of the bar gene was confirmed using the PPT primers PPT-5 '(5'-GAAGTCCAGCTGCCAGAA-3'; SEQ ID NO: 4) and PPT-3 '(5'-CGACGCCCGGCCGACATC-3'; SEQ ID NO: 5). The band size of (Fig. 7-a), EPSps primers Epsps-5 '(5'-CCGTAAGGAAGGCGACAC-3'; SEQ ID NO: 6) and Epsps-3 '(5'-AGGAAGCTCATGGCGATG-3'; SEQ ID NO: 7) was used to confirm the transcription of the CP4 - EPPS gene, and the band size of 1 kb was confirmed (FIG. 7-b). This indicates that the introduced gene is normally expressed.

실시예Example 3:  3: 버트콩에서의At the butte 글루포시네이트Glufosinate 및  And 글리포제이트Glyphozeate 저항성 식물체의 제초제 저항성 확인 Confirmation of herbicide resistance of resistant plants

실시예 1에서와 같은 조건으로 제조되고, 실시예 2에서와 같이 유전자 도입이 확인된 버트-4 계통을 대상으로 T1 세대에서의 글루포시네이트 저항성 선발과정을 거쳐 3번 식물체로부터 종자를 수확하였다. 이들 종자 9립을 파종한 다음, 생육이 양호한 5개의 유묘를 대상으로 제초제 저항성 검정을 실시하였다. 엽면 대상처리를 통한 글루포시네이트 간이검정시 모든 개체가 저항성을 보였으며, 쉬키메이트 축적을 통한 글리포제이트 저항성 간이검정에서도 모두 저항성을 보였다(표 2).Seeds were harvested from plants 3 through the glufosinate resistance selection process in the T1 generation to the Butt-4 strains prepared under the same conditions as in Example 1 and confirmed to be transgenic as in Example 2. Nine of these seeds were sown, and herbicide resistance assays were conducted on five well-grown seedlings. All individuals showed resistance in the glufosinate simple test through foliar treatment, and all glyphosate resistant simple test through Shikimate accumulation (Table 2).

표 2. 잠정 형질전환 버트-4 콩(T2)의 두 가지 제초제에 대한 저항성 검정Table 2. Resistance test for two herbicides of potential transgenic Butte-4 soybean (T2)

품종/계통Breed / System 제초제 처리Herbicide treatment 실험 종자 번호Experiment seed number 22 33 44 88 99 버트-4
Butt-4
글루포시네이트
글리포제이트Glufosinate
Glyphozeate R
RR
R R
RR
R R
RR
R R
RR
R R
RR
R

1) S: 감수성, R: 저항성 1) S: sensitive, R: resistant

한편, 전술한 재료 및 방법에서와 같이 전식물체에 글루포시네이트와 글리포제이트를 각각 250 ㎍/㎖ 수준으로 경엽처리한 다음 저항성 여부를 조사하였다. 약 제처리 후 3일째 비형질전환체는 제초제 처리에 따른 엽록소 함량과 광합성 광량자 수율의 감소가 뚜렷하게 진전된 반면에 형질전환체는 모두 정상상태를 나타내었다(표 3 및 표 4).Meanwhile, as in the aforementioned materials and methods, the whole plants were treated with glufosinate and glyphosate at 250 µg / ml, respectively, and then examined for resistance. At 3 days after drug treatment, the non-transformants showed a marked improvement in chlorophyll content and photosynthetic photon yield following herbicide treatment, while the transformants showed steady state (Table 3 and Table 4).

표 3. 잠정 형질전환 버트-4 콩(T2) 식물체에 대한 제초제 처리후 3일째의 엽록소 함량 변화Table 3. Changes in chlorophyll content on day 3 after herbicide treatment for potential transgenic Butte-4 soybean (T2) plants

제초제 처리
(250 ㎍/㎖)Herbicide treatment
(250 μg / ml) 엽록소 함량 (SPAD values)Chlorophyll content (SPAD values) 비형질전환체Nontransformer 형질전환체 (버트-4 ③)Transformant (Bert-4 ③) 무처리(대조구)
글루포시네이트
글리포제이트No treatment (control)
Glufosinate
Glyphozeate 29.9±3.1 (100%)
18.9±6.1 (63.2%)
23.7±0.9 (79.3%)29.9 ± 3.1 (100%)
18.9 ± 6.1 (63.2%)
23.7 ± 0.9 (79.3%) 28.6±2.0 (100%)
29.3±1.3 (102%)
29.0±1.1 (102%)28.6 ± 2.0 (100%)
29.3 ± 1.3 (102%)
29.0 ± 1.1 (102%)

표 4. 잠정 형질전환 버트-4 콩(T2) 식물체에 대한 제초제 처리후 3일째의 광합성 효율 변화Table 4. Changes in photosynthetic efficiency on day 3 after herbicide treatment for potential transgenic Butte-4 soybean (T2) plants

제초제 처리
(250 ㎍/㎖)Herbicide treatment
(250 μg / ml) 광합성 광량자 수율Photosynthetic photon yield 비형질전환체Nontransformer 형질전환체 (버트-4 ③)Transformant (Bert-4 ③) 무처리(대조구)
글루포시네이트
글리포제이트No treatment (control)
Glufosinate
Glyphozeate 0.764±0.02 (100%)
0.212±0.04 (27.7%)
0.610±0.07 (79.8%)0.764 ± 0.02 (100%)
0.212 ± 0.04 (27.7%)
0.610 ± 0.07 (79.8%) 0.767±0.02 (100%)
0.769±0.01 (100%)
0.773±0.01 (101%)0.767 ± 0.02 (100%)
0.769 ± 0.01 (100%)
0.773 ± 0.01 (101%)

처리 후 8일째 생장정도와 약해 증상을 달관조사한 결과, 비형질전환체는 글루포시네이트 처리에서 90% 이상 고사했고, 글리포제이트 처리에서 생장 정지, 잎의 황화, 엽맥 갈변 등의 전형적인 제초증상이 보이지만 버트-4 형질전환체는 정상적으로 생육하였다(도 8). 이상의 결과는 버트-4 형질전환체가 글루포시네이트와 글리포제이트 제초제 두 가지 모두에 대해 저항성을 발현하고 있음을 보여준다.On the 8th day after treatment, the non-transformants died more than 90% in glufosinate treatment, and typical herbicidal symptoms such as growth arrest, leaf yellowing, and leaf vein browning in glyphosate treatment. Is shown, but the Butt-4 transformant grew normally (FIG. 8). The above results show that Butt-4 transformant expresses resistance to both glufosinate and glyphosate herbicides.

실시예Example 4:  4: 광안콩에서의Gwangan Kong 글루포시네이트Glufosinate 및  And 글리포제이트Glyphozeate 저항성 식물체의 제초제 저항성 확인 Confirmation of herbicide resistance of resistant plants

실시예 1에서와 같은 조건으로 제조되고, 실시예 2에서와 같이 유전자 도입 이 확인된 광안콩-1 계통을 대상으로 T1 세대에서의 글루포시네이트 저항성 선발과정을 거쳐 12번 식물체로부터 종자를 수확하였다. 이들 종자 9립을 파종한 다음 제초제 저항성 검정을 실시하였다. 엽면 대상처리를 통한 글루포시네이트 간이검정시 7 개체가 저항성을 보여 저항성 개체 출현율이 77.8%를 보였으며, 쉬키메이트 축적을 통한 글리포제이트 저항성 간이검정의 결과 광안콩-1-12-K3에서의 쉬키메이트 축적이 비형질전환체보다 50% 이상 낮아 저항성이 나타남을 보였다(표 5).Seeds were harvested from plants No. 12 through Glufosinate resistance selection in the T1 generation of Gwangan Kong-1 strains prepared under the same conditions as in Example 1 and confirmed gene introduction as in Example 2. . Nine of these seeds were sown and then herbicide resistance assays were performed. In the glufosinate simple test through foliar treatment, 7 individuals were resistant and showed 77.8% resistant individuals. Glyphozate-resistant simple test through Shikimate accumulation resulted in Gwangankong-1-12-K3. Has a resistance of 50% lower than that of the non-transformer (Table 5).

표 5. 잠정 형질전환 광안콩-1-12 (T2)의 두 가지 제초제에 대한 저항성 검정Table 5. Resistance test of two herbicides of the potential transgenic Gwangan-1-12 (T2)

품종/계통Breed / System 제초제 처리Herbicide treatment 쉬키메이트 축적량 (㎍/㎖)Shikimate accumulation (μg / ml) 비형질전환체Nontransformer 형질전환체
(광안콩-1-12)Transformant
(Gwangan Kong-1-12) 광안콩-1-12Gwangan Bean-1-12 무처리
글리포제이트 32 ㎍/㎖No treatment
Glyphozate 32 μg / ml 0.0±0.35
32.41±6.110.0 ± 0.35
32.41 ± 6.11 0.40±0.40
15.77±5.550.40 ± 0.40
15.77 ± 5.55

한편, 전술한 재료 및 방법에서와 같이 전식물체에 글루포시네이트와 글리포제이트를 500 + 750 ㎍/㎖ 수준으로 경엽처리한 다음 저항성 여부를 조사하였다. 약제처리 후 4일째 비형질전환체는 제초제 처리에 따른 엽록소 함량과 광합성 광량자 수율의 감소가 뚜렷하게 진전된 반면에 형질전환체는 모두 정상상태에 가까웠다 (표 6 및 표 7).On the other hand, as in the aforementioned materials and methods, the whole plants were treated with glufosinate and glyphosate at the level of 500 + 750 µg / ml, and then examined for resistance. At 4 days after drug treatment, the non-transformants showed a marked improvement in chlorophyll content and photosynthetic photon yield following herbicide treatment, while the transformants were all in steady state (Table 6 and Table 7).

표 6. 잠정 형질전환 광안콩-1-12 (T2)에 제초제 처리후 4일째의 엽록소 함량 변화Table 6. Changes in Chlorophyll Content on Day 4 after Herbicide Treatment in Transient Gwangan Soybean-1-12 (T2)

제초제 처리Herbicide treatment 엽록소 함량 (SPAD 값)Chlorophyll Content (SPAD Value) 비형질전환체Nontransformer 형질전환체(광안콩-1-12)Transformant (Gwangan Bean-1-12) 무처리
글루포시네이트 500 ㎍/㎖(Glu)
글리포제이트 750 ㎍/㎖(Gly)
Glu + GlyNo treatment
Glufosinate 500 μg / ml (Glu)
Glyphozate 750 μg / ml (Gly)
Glu + Gly 26.2±2.6 (100)
-
-
14.1±1.3 (53.8)26.2 ± 2.6 (100)
-
-
14.1 ± 1.3 (53.8) 26.5±1.8 (100)
25.8±1.9 (97.4)
24.6±1.5 (92.8)
24.5±3.0 (92.4)26.5 ± 1.8 (100)
25.8 ± 1.9 (97.4)
24.6 ± 1.5 (92.8)
24.5 ± 3.0 (92.4)

표 7. 잠정 형질전환 광안콩-1-12 (T2)에 제초제 처리후 4일째의 광합성 효율 변화Table 7. Changes in photosynthetic efficiency on day 4 after herbicide treatment in Tent-free Transgenic Soybean-1-12 (T2)

제초제 처리Herbicide treatment 광합성 광량자 수율Photosynthetic photon yield 비형질전환체Nontransformer 형질전환체(광안콩-1-12)Transformant (Gwangan Bean-1-12) 무처리
글루포시네이트 500 ㎍/㎖(Glu)
글리포제이트 750 ㎍/㎖(Gly)
Glu + GlyNo treatment
Glufosinate 500 μg / ml (Glu)
Glyphozate 750 μg / ml (Gly)
Glu + Gly 0.772±0.03 (100)
-
-
0.054±0.04 (7.0)0.772 ± 0.03 (100)
-
-
0.054 ± 0.04 (7.0) 0.756±0.05 (100)
0.739±0.09 (97.8)
0.702±0.10 (92.9)
0.720±0.08 (95.2)0.756 ± 0.05 (100)
0.739 ± 0.09 (97.8)
0.702 ± 0.10 (92.9)
0.720 ± 0.08 (95.2)

처리 후 7일째 생장정도와 약해 증상을 달관조사한 결과, 비형질전환체는 두약제 혼합처리에서 95% 이상 고사했고, 형질전환체 광안콩-1-12은 미약한 약해가 관찰되나 거의 정상적으로 생육하였다(도 9). 이상의 결과는 광안콩-1-12 형질전환체가 글루포시네이트와 글리포제이트 제초제 두 가지 모두에 대해 저항성을 발현하고 있음을 보여준다.On the 7th day after treatment, the non-transformants were killed more than 95% in the combination of soybean drugs, and the transformant Gwangan-1--1- was found to have weak weakness but grew almost normally. (FIG. 9). The above results show that Gwangan-1-1-12 transformant expresses resistance to both glufosinate and glyphosate herbicide.

실시예Example 5:  5: 비선택성제초제Non-selective herbicides 혼합처리에 의한 잡초방제 효과의 상승 Increase of weed control effect by mixing treatment

글루포시네이트와 글리포제이트를 실제로 혼합처리했을 때 잡초방제의 상승효과가 있는지를 알아보기 위하여 온실조건에서의 실험을 수행하였다. 실험에 사용한 식물 초종은 콩, 목화, 까마중, 어저귀, 자귀풀, 도꼬마리, 메꽃 등 7종이었다.In order to examine whether synergistic effects of weed control were obtained when glufosinate and glyphosate were actually mixed, experiments were conducted under greenhouse conditions. The plant species used in the experiment were seven species, such as beans, cotton, crow, tabby, larvae, dokmari, and buckthorn.

식물을 350 cm2 사각 포트에 파종하고, 온실조건(주간 온도 25-35℃/야간온도 20-25℃, 14시간 광주기)에 두어 11일간 육성하였다. 처리 화합물은 원제형태의 글루포시네이트 암모늄(순도 51.0 %, 바이엘그롭사이언스)과 글리포제이트 이소프로필아민 (순도 62.0 %, (주) 경농)을 사용하였다. 약제처리의 경우, 글루포시 네이트는 성분량(active ingredient, ai)으로 0, 20, 40, 80, 160 g/ha 처리농도를 설정하고, 글리포제이트는 0, 16, 32, 63, 125, 250, 500 g/ha 처리 농도를 두어 각각의 농도별로 단제 또는 합제를 만들어 조합처리(combinatorial treatment)하였다. 최종 처리 용액 내에는 제초제 성분 이외에 아세톤과 트윈 20이 각각 50 %, 0.1 % 함유되어 있으며 이로 인한 약해는 관찰되지 않았다.The plants were sown in 350 cm 2 square pots and placed in greenhouse conditions (day temperature 25-35 ° C./night temperature 20-25 ° C., 14 hours photoperiod) for 11 days. As the treatment compound, glufosinate ammonium (purity 51.0%, Bayer Gropsscience) and glyphosate isopropylamine (purity 62.0%, light concentrate) were used. In the case of pharmaceutical treatment, glufosinate sets 0, 20, 40, 80, 160 g / ha as the active ingredient (ai), and glyphosate is 0, 16, 32, 63, 125, 250 In addition, 500 g / ha treatment concentrations were made at each concentration to prepare a combination or a combination (combinatorial treatment). In addition to the herbicide component, the final treatment solution contained 50% and 0.1% of acetone and tween 20, respectively, and no harmful effects were observed.

제초활성 평가는 약제처리 후 온실조건에 2주 동안 생육시키면서 각 초종에 대한 제초활성을 처리 후 14일째에 각각 달관조사(0-100%)하였다. 그 후 평균 방제가를 구하여 제초활성 정도를 표시하였고, 혼합처리에 의한 상호작용성 평가와 그 정도는 콜비 방법(Colby, 1967, Weeds, 15: 20-22)에 준하여 분석하였다. 즉, 실측치(observed value)가 기대치(expected value)와 같아 뺀 값이 0이면 상가작용, 실측치가 상대적으로 높아서 양수가 얻어지면 상승작용, 실측치가 낮아서 음수가 얻어지면 길항작용성이 있음을 나타낸다. 이 때 상승 및 길항 작용성 정도는 실측치에서 기대치를 뺀 값의 양수 또는 음수의 크기로 나타내며 수치가 큰 값은 상호작용성 정도가 큰 것으로 해석된다(김 등, 2005, 한잡초지, 25(3): 171-178).The herbicidal activity was assessed by herbicide activity (0-100%) at 14 days after treatment with each herbicide while growing in greenhouse conditions for 2 weeks. After that, the average control value was obtained and the degree of herbicidal activity was displayed. The interaction evaluation by the mixing treatment and the degree were analyzed according to Colby's method (Colby, 1967, Weeds , 15: 20-22). In other words, if the observed value is equal to the expected value and subtracted from 0, the additive value is relatively high and the measured value is relatively high, indicating that the positive value is synergistic and the lower value is antagonistic. At this time, the rise and antagonistic acting degree refers to the size of the positive or negative of a value obtained by subtracting the expected value from the found value is a large value is interpreted as a large interactive level (Kim et al., 2005, if a weed, 25 (3 ): 171-178).

실험결과, 모든 처리 농도 조합에서 0~14.4의 값이 얻어져 두 제초제를 혼합처리의 경우 길항작용성은 나타나지 않았고 상가 또는 약한 상승작용을 보였다(표 8). 대표적인 처리조합을 살펴보면, 글리포제이트 500 g/ha과 글루포시네이트 40 g/ha를 단독으로 처리하면 각각 54.3%, 4.3%의 제초활성을 보이지만 이들을 합제 처리하면 70.7%의 제초활성을 보였다. 이는 단독처리보다는 혼합처리 했을 때 제초효과가 높아짐을 의미하기 때문에 동일한 제초효과를 거두는데 있어서 보다 적은량 의 제초제 투입이 가능함을 보여준다.As a result, the values of 0 ~ 14.4 were obtained in all combinations of treatment concentrations. Thus, the mixture of two herbicides showed no antagonism but showed an additive or weak synergy (Table 8). Representative treatment combinations showed that herbicide activity of 54.3% and 4.3% of glyphosate 500 g / ha and glufosinate 40 g / ha alone, respectively, showed 70.7% herbicidal activity. This means that the herbicidal effect is increased when the mixture is treated rather than the single treatment, so that a smaller amount of herbicide can be added to achieve the same herbicidal effect.

표 8. 글리포제이트와 글루포시네이트의 혼합처리에 의한 제초활성의 증진 (콜비방법으로 계산)Table 8. Enhancement of herbicidal activity by mixing glyphosate and glufosinate (calculated by Colby method)

글루포시네이트
(성분량, g/ha)Glufosinate
(Component amount, g / ha) 글리포제이트 (성분량, g/ha)Glyphozate (Amount of Ingredient, g / ha) 6363 125125 250250 500500 40
80
16040
80
160 7.3
4.9
0.87.3
4.9
0.8 5.9
1.0
3.45.9
1.0
3.4 0.2
8.6
6.80.2
8.6
6.8 14.4
11.6
11.214.4
11.6
11.2

도 1은 본 발명에 사용된 제초제 저항성 유전자 식물형질전환용 벡터 p35S-EPSPS-B의 모식도이다.1 is a schematic diagram of the herbicide resistance gene plant transformation vector p35S-EPSPS-B used in the present invention.

도 2는 본 발명의 방법에 준하여 진행했을 때의 신초 형성(a), 신초 신장(b) 및 뿌리 유도(c) 모습을 보여주는 사진이다. Figure 2 is a photograph showing the shoot formation (a), shoot kidney (b) and root induction (c) when proceeding according to the method of the present invention.

도 3은 기내에서 생산된 형질전환체의 토양순화를 위해 포트에 심고 덮게를 한 다음(a), 2-3주 정도 지나 덮개를 제거하여 온실에서 키운 모습을(b) 보여주는 사진이다.Figure 3 is a photograph showing the appearance of plants grown in a greenhouse after planting and covering the pot for soil purification of the transformant produced in the cabin (a), 2-3 weeks after removing the cover.

도 4는 도 3에서와 같이 얻어진 식물체에 바스타를 처리한 다음 저항성을 보이는 개체를 온실에서 생육시켜(a) 결실된 종자를 수확한(b) 모습이다. 4 is a state in which the treated plants obtained as shown in FIG. 3 and then grown in a greenhouse after the treatment of the resistant (a) harvested seeds (b).

도 5는 본 발명에 의하여 획득한 형질전환 콩 식물체에서 제초제 저항성 유전자(bar 및 CP4-EPSPS)의 존재를 보여주는 PCR 분석의 결과이다. (a)는 bar 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이고, (b)는 CP4-EPSPS 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이다. M은 분자량 마커, C는 비형질전환체를 의미한다. 5 is a result of PCR analysis showing the presence of herbicide resistance genes ( bar and CP4-EPSPS ) in the transgenic soybean plants obtained by the present invention. (a) is a bar gene as a probe and (b) is a CP4-EPSPS gene as a probe. M is the molecular weight marker and C is the non-transformer.

도 6은 본 발명의 방법에 의하여 획득한 형질전환 콩 식물체에서 제초제 저항성 유전자의 존재를 보여주는 서던분석(Southern hybridization)의 결과이다. (a)는 bar 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이고, (b)는 CP4-EPSPS 유전자를 탐침으로하여 분석한 것이다. M은 마커, C는 비형질전환체를 의미한다. 6 is a result of Southern hybridization showing the presence of herbicide resistance genes in transgenic soybean plants obtained by the method of the present invention. (a) is a bar gene as a probe, and (b) is a CP4-EPSPS gene as a probe. M is a marker and C is a non-transformer.

도 7는 본 발명에 의하여 획득한 형질전환 콩 식물체에서 제초제 저항성 유전자(bar 및 CP4 - EPSPS)의 전사를 보여주는 RT-PCR 분석의 결과이다. (a)는 bar 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이고, (b)는 CP4 - EPSPS 유전자를 탐침으로 하여 분석한 것이다. M은 분자량 마커, C는 비형질전환체를 의미한다. 7 is a result of RT-PCR analysis showing the transcription of herbicide resistance genes ( bar and CP4 - EPSPS ) in transgenic soybean plants obtained by the present invention. (a) is a bar gene as a probe, (b) CP4 - EPSPS The gene was analyzed as a probe. M is the molecular weight marker and C is the non-transformer.

도 8은 형질전환 버트-4 콩의 글루포시네이트와 글리포제이트 제초제에 대한 전식물체 수준에서의 저항성 발현을 나타내는 사진이다. A: bar와 CP4 - EPSPS 유전자가 도입된 형질전환체로서 두 가지 제초제에 대해 뚜렷한 저항성이 보인다, B: 비형질전환체로서 글리포제이트를 250 ㎍/mL 수준으로 경엽처리한 후 8일째의 모습으로서 생육저해와 엽맥 갈변 및 조직괴사가 관찰된다. C: 비형질전환체로서 글루포시네이트암모늄을 250 ㎍/mL 수준으로 경엽처리한 후 8일째의 모습으로서 조직괴사 및 건조, 생육저해 증상이 관찰된다. FIG. 8 is a photograph showing resistance expression at the whole plant level of glufosinate and glyphosate herbicide of transformed Butte-4 soybean. A: bar and CP4 - EPSPS genes were introduced into the herbicides, showing a clear resistance to the two herbicides, B: non-transformant glyphosate at 250 ㎍ / mL level 8 days after foliage Intense growth, leaf vein browning and tissue necrosis are observed. C: Tissue necrosis, dryness, and growth inhibition were observed on day 8 after glufosinate ammonium was treated at 250 µg / mL as a non-transformant.

도 9는 형질전환 광안콩(광안콩-1-12)의 글루포시네이트와 글리포제이트 제초제의 혼합처리에 대한 전식물체 수준에서의 저항성 발현을 나타내는 사진이다. A 포트는 비형질전환체, B 포트는 형질전환체가 심겨진 것을 나타낸다. 글루포시네이트와 글리포제이트를 500 + 750 ㎍/mL 수준으로 혼합하여 경엽처리한 후 7일째의 모습으로서 비형질전환체는 모두 죽었지만 형질전환체는 무처리와 가깝게 생육하고 있다.Figure 9 is a photograph showing the expression of resistance at the whole plant level for the mixing treatment of glufosinate and glyphosate herbicide of transformed gwangan bean (Gwangan bean-1-12). A port indicates a non-transformant, and B port indicates that a transformant is planted. 7 days after glufosinate and glyphosate were mixed at 500 + 750 µg / mL level, and all of the non-transformants were dead, but the transformants were growing near untreated.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> ANTIBIOTICS MARKER FREE SOYBEAN HAVING RESISTANCE AGAINST TWO HERBICIDES <130> pn07123 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1604 <212> DNA <213> Roundup-Ready soybean <220> <221> gene <222> (1)..(1604) <223> CP4-EPSPS gene <400> 1 agatctttca agaatggcac aaattaacaa catggcacaa gggatacaaa cccttaatcc 60 caattccaat ttccataaac cccaagttcc taaatcttca agttttcttg tttttggatc 120 taaaaaactg aaaaattcag caaattctat gttggttttg aaaaaagatt caatttttat 180 gcaaaagttt tgttccttta ggatttcagc atcagtggct acagcctgca tgcttcacgg 240 tgcaagcagc cggcccgcaa ccgcccgcaa atcctctggc ctttccggaa ccgtccgcat 300 tcccggcgac aagtcgatct cccaccggtc cttcatgttc ggcggtctcg cgagcggtga 360 aacgcgcatc accggccttc tggaaggcga ggacgtcatc aatacgggca aggccatgca 420 ggccatgggc gccaggatcc gtaaggaagg cgacacctgg atcatcgatg gcgtcggcaa 480 tggcggcctc ctggcgcctg aggcgccgct cgatttcggc aatgccgcca cgggctgccg 540 cctgaccatg ggcctcgtcg gggtctacga tttcgacagc accttcatcg gcgacgcctc 600 gctcacaaag cgcccgatgg gccgcgtgtt gaacccgctg cgcgaaatgg gcgtgcaggt 660 gaaatcggaa gacggtgacc gtcttcccgt taccttgcgc gggccgaaga cgccgacgcc 720 gatcacctac cgcgtgccga tggcctccgc acaggtgaag tccgccgtgc tgctcgccgg 780 cctcaacacg cccggcatca cgacggtcat cgagccgatc atgacgtgcg atcatacgga 840 aaagatgctg cagggctttg gcgccaacct taccgtcgag acggatgcgg acggcgtgcg 900 caccatccgc ctggaaggcc gcggcaagct caccggccaa gtcatcgacg tgccgggcga 960 cccgtcctcg acggccttcc cgctggttgc ggccctgctt gttccgggct ccgacgtcac 1020 catcctcaac gtgctgatga accccacccg caccggcctc atcctgacgc tgcaggaaat 1080 gggcgccgac atcgaagtca tcaacctgcg ccttgccggc ggcgaagacg tggcggacct 1140 gcgcgttcgc tcctccacgc tgaagggcgt cacggtgccg gaagaccgcg cgcctccgat 1200 gatcgacgaa tatccgattc tcgctgtcgc cgccgccttc gcggaagggg cgaccgtgat 1260 gaacggtctg gaagaactcc gcgtcaagga aagcgaccgc ctctcggccg tcgccaatgg 1320 cctcaagctc aatggcgtgg attgcgatga gggcgagacg tcgctcgtcg tgcgtggccg 1380 ccctgacggc aaggggctcg gcaacgcctc gggcgccgcc gtcgccaccc atctcgatca 1440 ccgcatcgcc atgagcttcc tcgtcatggg cctcgtgtcg gaaaaccctg tcacggtgga 1500 cgatgccacg atgatcgcca cgagcttccc ggagttcatg gacctgatgg ccgggctggg 1560 cgcgaagatc gaactctccg atacgaaggc tgcctgatga gctc 1604 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 tagcagatct ttcaagaatg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 gcatgcttca cggtgcaagc a 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPT-5' primer <400> 4 gaagtccagc tgccagaa 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPT-3' primer <400> 5 cgacgcccgg ccgacatc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epsps-5' primer <400> 6 ccgtaaggaa ggcgacac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epsps-3' primer <400> 7 aggaagctca tggcgatg 18 <110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY          Dong-A University Research Foundation For Industry-Academy Cooperation <120> ANTIBIOTICS MARKER FREE SOYBEAN HAVING RESISTANCE AGAINST TWO          HERBICIDES <130> pn07123 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1604 <212> DNA <213> Roundup-Ready soybean <220> <221> gene (222) (1) .. (1604) <223> CP4-EPSPS gene <400> 1 agatctttca agaatggcac aaattaacaa catggcacaa gggatacaaa cccttaatcc 60 caattccaat ttccataaac cccaagttcc taaatcttca agttttcttg tttttggatc 120 taaaaaactg aaaaattcag caaattctat gttggttttg aaaaaagatt caatttttat 180 gcaaaagttt tgttccttta ggatttcagc atcagtggct acagcctgca tgcttcacgg 240 tgcaagcagc cggcccgcaa ccgcccgcaa atcctctggc ctttccggaa ccgtccgcat 300 tcccggcgac aagtcgatct cccaccggtc cttcatgttc ggcggtctcg cgagcggtga 360 aacgcgcatc accggccttc tggaaggcga ggacgtcatc aatacgggca aggccatgca 420 ggccatgggc gccaggatcc gtaaggaagg cgacacctgg atcatcgatg gcgtcggcaa 480 tggcggcctc ctggcgcctg aggcgccgct cgatttcggc aatgccgcca cgggctgccg 540 cctgaccatg ggcctcgtcg gggtctacga tttcgacagc accttcatcg gcgacgcctc 600 gctcacaaag cgcccgatgg gccgcgtgtt gaacccgctg cgcgaaatgg gcgtgcaggt 660 gaaatcggaa gacggtgacc gtcttcccgt taccttgcgc gggccgaaga cgccgacgcc 720 gatcacctac cgcgtgccga tggcctccgc acaggtgaag tccgccgtgc tgctcgccgg 780 cctcaacacg cccggcatca cgacggtcat cgagccgatc atgacgtgcg atcatacgga 840 aaagatgctg cagggctttg gcgccaacct taccgtcgag acggatgcgg acggcgtgcg 900 caccatccgc ctggaaggcc gcggcaagct caccggccaa gtcatcgacg tgccgggcga 960 cccgtcctcg acggccttcc cgctggttgc ggccctgctt gttccgggct ccgacgtcac 1020 catcctcaac gtgctgatga accccacccg caccggcctc atcctgacgc tgcaggaaat 1080 gggcgccgac atcgaagtca tcaacctgcg ccttgccggc ggcgaagacg tggcggacct 1140 gcgcgttcgc tcctccacgc tgaagggcgt cacggtgccg gaagaccgcg cgcctccgat 1200 gatcgacgaa tatccgattc tcgctgtcgc cgccgccttc gcggaagggg cgaccgtgat 1260 gaacggtctg gaagaactcc gcgtcaagga aagcgaccgc ctctcggccg tcgccaatgg 1320 cctcaagctc aatggcgtgg attgcgatga gggcgagacg tcgctcgtcg tgcgtggccg 1380 ccctgacggc aaggggctcg gcaacgcctc gggcgccgcc gtcgccaccc atctcgatca 1440 ccgcatcgcc atgagcttcc tcgtcatggg cctcgtgtcg gaaaaccctg tcacggtgga 1500 cgatgccacg atgatcgcca cgagcttccc ggagttcatg gacctgatgg ccgggctggg 1560 cgcgaagatc gaactctccg atacgaaggc tgcctgatga gctc 1604 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR primers <400> 2 tagcagatct ttcaagaatg g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> PCR primers <400> 3 gcatgcttca cggtgcaagc a 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPT-5 'primer <400> 4 gaagtccagc tgccagaa 18 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> P223-3 'primer <400> 5 cgacgcccgg ccgacatc 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epsps-5 'primer <400> 6 ccgtaaggaa ggcgacac 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Epsps-3 'primer <400> 7 aggaagctca tggcgatg 18  

Claims (13)

T-DNA 좌측 보더(border) 및 T-DNA 우측 보더 사이에 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4-EPSPS (CP4 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 아그로박테리움을 형질전환하는 단계;Agrobacterium is transformed with a plant expression vector comprising a herbicide resistant bar gene and a CP4-EPSPS (CP4 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase) gene between the T-DNA left border and the T-DNA right border. step; 상기 형질전환된 아그로박테리움과 콩 조직을 공동배양하는 단계; 및Co-culturing the transformed Agrobacterium and soybean tissue; And 상기 공동배양된 콩 식물체 조직으로부터 형질전환된 신초를 선발하여 신장시키고 뿌리를 유기하는 단계를 포함하는, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 제조 방법.A method for producing an antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant, comprising the step of selecting and elongating transformed shoots from the co-cultured soybean plant tissues and organic roots. 제1항에 있어서, 상기 형질전환된 아그로박테리움과 콩 조직의 공동배양 단계는 상기 형질전환된 아그로박테리움의 고농축액에 콩 조직을 침지시키는 단계; 및 상기 침지된 콩 조직을 진공 처리한 후 공동배양하는 단계로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the co-culturing of the transformed Agrobacterium and soybean tissue comprises: immersing soybean tissue in a high concentration of the transformed Agrobacterium; And co-culturing the vacuum of the soaked soybean tissue. 제2항에 있어서, 상기 침지 단계는 외과용 메스를 고농축액의 아그로박테리움에 침지시킨 후, 상기 침지된 외과용 메스로 콩 조직에 상처를 내는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the immersing step is characterized by immersing the surgical scalpel in Agrobacterium of high concentration, and then wound the soybean tissue with the immersed surgical scalpel. 제2항에 있어서, 상기 진공 처리는 아그로박테리움을 접종한 후, 공동배양 (co-cultivation)에 들어가기 전에 10~45초 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the vacuum treatment is performed for 10 to 45 seconds after inoculating Agrobacterium and before entering co-cultivation. 제1항에 있어서, 상기 형질전환에 사용된 콩 품종은 광안콩, 소진콩, 다채콩, 청자콩2호, 검정콩1호, 검정콩2호, 일품검정콩, 다원콩, 단백콩, 대원콩, 명주나물콩, 무한콩, 보광콩, 소명콩, 소록콩, 신팔달콩, 은하콩, 자수콩, 진율콩, 청자콩, 태광콩, 화엄풋콩 및 버트(Burt)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.According to claim 1, wherein the soybean varieties used in the transformation is Gwangan bean, Sojin bean, Dachae bean, Cheongja bean No. 2, Black bean No. 1, Black bean No. 2, a la carte black beans, Dawon beans, protein beans, Daewon beans, silken herbs Soybeans, infinite beans, Bokwang beans, Myeong bean, Sorrow beans, soybeans, galaxy beans, embroidered beans, jinju beans, celadon beans, Taekwang beans, Hwaamfoot beans and Butt (Burt) method characterized in that it is selected from the group consisting of. 제5항에 있어서, 상기 형질전환에 사용된 콩 품종은 광안콩 또는 버트(Burt)인 것을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 5, wherein the soybean varieties used for transformation are light beans or butt (Burt). 제1항에 있어서, 상기 식물 발현 벡터는 도 1에 기재된 p35S-EPSPS-B 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the plant expression vector is a p35S-EPSPS-B vector described in FIG. 1. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체.An antibiotic marker free herbicide complex resistant soybean plant prepared by the method of any one of claims 1 to 7. T-DNA 좌측 보더(border) 및 T-DNA 우측 보더 사이에 제초제 저항성 bar 유전자 및 CP4-EPSPS 유전자를 포함하는 식물 발현 벡터로 형질전환된, 항생제 마커-프리(marker free) 제초제 복합 저항성 콩 식물체.An antibiotic marker free herbicide complex resistant soybean plant transformed between a T-DNA left border and a T-DNA right border with a plant expression vector comprising a herbicide resistant bar gene and a CP4-EPSPS gene. 제9항에 있어서, 상기 콩 품종은 광안콩 또는 버트(Burt)인 것을 특징으로 하는 콩 식물체.10. The soybean plant according to claim 9, wherein the soybean variety is a light bean or a butt. 제9항에 있어서, 상기 식물 발현 벡터는 도 1에 기재된 p35S-EPSPS-B 벡터인 것을 특징으로 하는 콩 식물체.The soybean plant according to claim 9, wherein the plant expression vector is a p35S-EPSPS-B vector described in FIG. 제9항에 따른 콩 식물체의 종자.Seeds of soybean plants according to claim 9. 제8항의 항생제 마커-프리 제초제 복합 저항성 콩 식물체의 재배지에 글루포시네이트(glufosinate) 및 글리포제이트(glyphosate)를 혼합 또는 체계 처리하는 단계를 포함하는 잡초를 방제하는 방법.A method of controlling weeds comprising mixing or systematically treating glufosinate and glyphosate in a plantation of the antibiotic marker-free herbicide complex resistant soybean plant of claim 8.
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