KR100985678B1 - Inducible transposition in transgenic organism using transposon vector - Google Patents

Abstract

본 발명은 형질전환된 자손을 발생시키고 전위를 유발시키는 방법으로서, (a) 전위인자의 하나 이상의 복사체를 그 게놈내에 포함하는 제 1의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (b) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 복사체 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 엘리먼트를 그 게놈내에서 포함하는 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (c) 상기 제 1의 성숙한 형질전환된 생물체를 상기 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체와 교잡하여, (i) 상기 전위인자의 하나 이상의 복사체와 (ii) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 그의 하나 이상의 세포의 게놈내에서 포함하는 자손을 제공하는 단계로서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는 상기 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있는 단계; 및 (d) 상기 자손내에서 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하여 상기 자손의 조직 또는 세포의 최소한 일부분내에서 상기 전위인자를 이동시키는 단계를 포함하는 방법을 개시한다. 이러한 방법을 이용하면, 전위인자의 이동이 예정된 배아 발달 단계에서 유도되고 단일 세포의 변이된 유전자가 차후의 세포 분열시에 복제됨으로써, 상기 전위된 유전자와 실질적으로 상동인 세포 그룹이 얻어질 수 있는 이점이 있다.

The present invention provides a method of generating a transgenic progeny and inducing a translocation comprising the steps of: (a) generating a first mature transformed organism comprising at least one copy of a translocation factor in its genome; (b) a second mature trait comprising in the genome one or more copies of a gene encoding a transposase cognate with the translocation factor and / or elements capable of modulating the expression of the gene encoding the transposase Generating a converted organism; (c) hybridizing the first mature transformed organism with the second mature transformed organism so that (i) one or more copies of the translocation factor and (ii) a transposase homologous to the translocation factor Providing a progeny comprising a gene encoding a gene within the genome of one or more cells, wherein the gene encoding the transposase is under the control of one or more regulatory sequences that allow expression of the transposase; And (d) inducing expression of a gene encoding said transposase in said progeny to move said translocation factor in at least a portion of tissue or cells of said progeny. Using this method, the transfer of translocation factors is induced at a predetermined embryonic development stage and a single cell mutated gene is replicated at a later cell division, whereby a group of cells substantially homologous to the translocated gene can be obtained. There is an advantage.

Description

형질전환된 생물체에서 전위인자 벡터에 의해 전위를 유발시키는 방법 {INDUCIBLE TRANSPOSITION IN TRANSGENIC ORGANISM USING TRANSPOSON VECTOR}Method of inducing translocation by translocation vector in transformed organism {INDUCIBLE TRANSPOSITION IN TRANSGENIC ORGANISM USING TRANSPOSON VECTOR}

본 발명은 전위인자(transposon)를 이용하여 생물체에서 유전 정보를 이동시키기 위한 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 예정된 발달 단계에서 세포의 유전자 변형을 유도하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for transferring genetic information in an organism using transposons. In particular, the present invention relates to a method of inducing genetic modification of a cell at a predetermined stage of development.

고처리량 DNA 서열분석 기술, 정교한 데이터 변환 및 컴퓨터 분석의 발달에 따라, 초파리(Drosophila melanogaster) 및 호모 사피엔스(Homo sapiens)를 포함한 전체 게놈의 서열이 결정되었다. 따라서, 새로운 예측 유전자 서열이 동정되었지만 관련된 생물학에 기인한 기능은 동정되지 않았다. 기능 정보는 어느 유전자가 사람의 질병 관리 및 진단을 위한 치료 표적인 지를 나타내기 위한 전제 조건이다.With the development of high throughput DNA sequencing technology, sophisticated data transformation and computer analysis, Drosophila The sequence of the entire genome, including melanogaster ) and Homo sapiens , was determined. Thus, new predictive gene sequences have been identified but no function due to related biology has been identified. Functional information is a prerequisite for indicating which genes are therapeutic targets for human disease management and diagnosis.

오늘날 개개 유전자 기능의 동정 및 질병 상태에 대한 유전자의 상관관계는 유전공학 및 약학 산업의 중대한 임무이다. 질병 관련 유전자를 동정하면, 새로운 약물 및 약물 발견을 표적의 개발이 가능하고, 질병 진단 및 예후 마커가 제공되고, 의사에게 처방 가이드가 제공될 수 있다. 이들중 후자는 복잡한 유전적 특질을 갖는 질병에 특히 유용하다. 환자들 사이의 유전자 변화가 측정될 수 있는 경우, 약물 작용에 대한 환자의 반응을 동정하는 개인적인 의학 프로그램이 개발될 수 있다.The identification of individual gene functions and the correlation of genes to disease states are critical tasks in the genetic engineering and pharmaceutical industries today. Identification of disease-related genes allows the development of new drugs and drug discovery targets, provides disease diagnosis and prognostic markers, and provides physicians with prescription guides. The latter of these are particularly useful for diseases with complex genetic characteristics. If genetic changes between patients can be measured, personal medical programs can be developed that identify the patient's response to drug action.

유전자 기능을 동정하기 위한 많은 방법들이 적용되고 있는데, 이는 대부분 건강한 상태 및 질병 상태에서 유전자 구조 및 유전자 발현 프로필의 비교 분석에 의존하고 있다. 이러한 방법은 비용 및 시간이 많이 들며, 그 결과는 주관적이고 유전자 발현을 시험관내 기능 질병 관련 현상과 관련시키는 확실한 증거가 부족하다. 유전자 발현을 확인하기 위해서는, 원인(즉, 유전자 서열의 돌연변이, 결실 또는 삽입)을 전체 동물에서의 측정가능한 효과(즉, 행동, 발생, 물질 대사 등)와 직접 관련시키는 동물 모델 시스템에서의 연구가 필요하다.Many methods for identifying gene function have been applied, most of which rely on comparative analysis of gene structure and gene expression profiles in healthy and disease states. These methods are costly and time consuming, and the results are subjective and lack clear evidence to correlate gene expression with in vitro functional disease-related phenomena. In order to confirm gene expression, studies in animal model systems in which the cause (ie mutation, deletion or insertion of the gene sequence) are directly related to measurable effects (ie behavior, development, metabolism, etc.) in whole animals need.

오늘날, 마우스 및 기타 포유동물에서 유전자 기능의 연구는 다음과 같이 제한되어 있다.Today, the study of gene function in mice and other mammals is limited as follows.

(A)흔히 바이러스 감염에 의해 도입되는 하나 이상의 표지 유전자를 각각 함유하는 배아 줄기 세포(ES 세포)의 라이브러리로부터 유도된 녹아웃 형잘전환 마우스의 개개 유전자의 돌연변이 분석.(A) Mutation analysis of individual genes of knockout transgenic mice derived from libraries of embryonic stem cells (ES cells), each containing one or more marker genes, often introduced by viral infection.

(B)알킬화제에 의한 마우스 유전자의 생체내 불규칙 돌연변이 유발, 및 다중 돌연변이를 동정하기 위한 전체 게놈 서열 분석.(B) In vivo random mutagenesis of mouse genes with alkylating agents, and whole genome sequence analysis to identify multiple mutations.

상기 녹아웃 방법은 알려진 기능의 밀접하게 관련된 유전자와의 서열 상동성에 기초하여 기능이 추측될 수 있는 경우에 효과적이지만, 이러한 방법은 시간 소모적이고 노동 집약적이다.The knockout method is effective when the function can be inferred based on sequence homology with closely related genes of known function, but this method is time consuming and labor intensive.

상기 알킬화 방법은 돌연변이 부위를 동정하기 위한 게놈 서열 분석 및 이미 결정된 행동 특성 및 대사 판독값의 변화의 목록에 전적으로 의존한다. 다음에, 표현형 변화의 동정이 표적 마우스 게놈에서의 아마도 수 백개의 알킬화 현상 중 하나에 상관되어져야 한다. 이러한 방법도 시간 소모적이고, 많은 마우스 라이브러리를 발생 및 유지할 필요가 있고, 동종 번식 계통의 마우스로 제한된다(Abuin et al., (2002) TIB 20, 36-42참조).The alkylation method relies entirely on genomic sequence analysis to identify mutation sites and a list of previously determined behavioral characteristics and changes in metabolic readings. Next, identification of phenotypic changes should be correlated to one of perhaps hundreds of alkylation phenomena in the target mouse genome. This method is also time consuming, needs to generate and maintain a large number of mouse libraries, and is limited to homologous breeding mice (see Abuin et al., (2002) TIB 20, 36-42).

돌연변이를 얻기위한 또 다른 방법은 외인성 DNA를 게놈내로 도입하는 것이다.Another way to obtain mutations is to introduce exogenous DNA into the genome.

전위인자는 일종(species)의 게놈내에서 하나의 위치에서 또 다른 위치로 도약(jumping)하거나 전위할 수 있는 자연적 유전자 엘리먼트이다. 전위인자의 이동은, 전위인자 DNA에 인접한 서열에 결합하여 게놈의 한 위치로부터 DNA를 절제하고 이를 상기 게놈내의 다른 위치에 재삽입시키는 트랜포사제(tranposase) 효소의 발현에 의존한다. 게놈 서열내로 삽입하면, 유전자 기능이 변화하여 전체 생물체에서 측정가능한 표현형의 변화가 얻어질 수 있다.Translocation factors are natural genetic elements that can jump or transpose from one location to another within a species of genome. Transfer of the translocation factor relies on the expression of a transposase enzyme that binds to a sequence adjacent to the transgenic DNA to excise the DNA from one location in the genome and reinsert it into another location in the genome. Insertion into the genomic sequence can alter gene function resulting in a change in measurable phenotype in the whole organism.

세 가지의 고전적인 모델 동물, 즉 파리, 벌레 및 마우스에서, 디.멜라노가스터(D. melanogaster) 및 씨.엘레간스(C. elegans)에 대한 효율적인 전위인자 기초 삽입 방법이 개발되어 왔다. 드로소필라(Drosophila)(Spradling & Rubin (1982) Science 218,341- 347)에서 P 엘리먼트 매개 유전자 도입 및 삽입 돌연변이 유발에 의하여, 드로소필라 유전자 특질이 변환되고 다른 진핵 세포에서 대응하는 방법을 개발하기 위한 패러다임이 형성되었다. 그러나, 상기 P 엘리먼트는 매우 제한적인 숙주 범위를 가지므로, 선충류, 식물, 포유류, 어류(예, 제브라다니오) 및 조류를 포함한 여러가지의 복잡한 진핵세포에서 유전자 전달 및/또는 돌연변이 유발을 위한 벡터로서 다른 엘리먼트들이 과거 십년동안 이용되어 왔다.In three classic model animals: flies, worms and mice, D. melanogaster And efficient translocation factor based insertion methods for C. elegans have been developed. Drosophila by P element mediated gene introduction and insertion mutagenesis in Drosophila (Spradling & Rubin (1982) Science 218,341-347) Genetic traits have been transformed and paradigms have been formed to develop corresponding methods in other eukaryotic cells. However, since the P element has a very limited host range, it can be used as a vector for gene transfer and / or mutagenesis in a variety of complex eukaryotic cells, including nematodes, plants, mammals, fish (eg zebradani) and birds. Elements have been used for the past decade.

제2형 전위인자이고 Tcl류의 한 엘리먼트인 미노스(Minos)가 디.히데이(D. hydei)로부터 분리되어 디.멜라노가스터(D. melanogaster), 씨.카피타트스(C. capitata) 및 아노펠레스 스테펜시(Anopheles stephensi)의 균주 형질 전환에 사용되어 왔고 (Loukeris, T. G. et al (1995) Proc Natl Acad Sci USA, 92, 9485-9; Loukeris, T. G. et al (1995) Science, 270,2002-5, CATTERUCCIA F. et al. (2000) Nature 405 959-962), 또한 일시적인 이동 분석통하여 상기 미노스는 디.멜라노가스터, 애데스 애집티(Aedees aegypti), 아노펠레스 스테펜시 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)의 배아 및 디.멜라노가스터, 애데스 애집트, 아노펠레스 감비애(Anopheles gambiae) 및 스포돕터스 프루지페르다(Spodoptera frugiperda)의 세포주에서 활성이 있는 것으로 입증되어 왔다(Catteruccia, F. et al (2000) Proc Natl Acad Sci U SA, 97,2157-2162., Klinakis et al (2000) EMBO Reports 1: 416-421 ; Shimizu et AL : Insect Mol Biol 2000 Jun; 9 (3): 277-81).D is the 2-type potential factor is the element that is the Minos (Minos) of Tcl flow is separated from the di. Hideyi (D. hydei). Melanocortin the requester (D. melanogaster), seeds, copy Tart's (C. capitata) and Anopheles stephensi ) has been used for strain transformation (Loukeris, TG et al (1995) Proc Natl Acad Sci USA , 92, 9485-9; Loukeris, TG et al (1995) Science, 270, 2002-5, CATTERUCCIA F. et al. (2000) Nature 405 959-962), also through the analysis of a transient move Di Minos. Melanoma is the master, her death aejip Tea (Aedees aegypti), anopheles Ste pensi Spring and Emory Biggs (embryo and Diego. Melanocytes of the Bombyx mori) It has been demonstrated to be active in the cell lines of Gasster, Ades Egypt, Anopheles gambiae and Spodoptera frugiperda (Catteruccia, F. et al (2000) Proc Natl Acad Sci U SA , 97,2157-2162., Klinakis et al (2000) EMBO Reports 1: 416-421; Shimizu et AL: Insect Mol Biol 2000 Jun; 9 (3): 277-81).

드로소필라스 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)의 호보(hobo) 엘리먼트가 다음문헌[Gelbart WM, Blackman RK, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol (1989); 36: 37-460]에서 설명되었다.The hobo element of Drosophila melanogaster is described by Gelbart WM, Blackman RK, Prog Nucleic Acid Res Mol Biol (1989); 36: 37-460.

어류로부터 재작제된 Tcl / 마리너 (mariner)같은 전위가능한 엘리먼트인 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty:SB ) 전위인자와 같은 연어형(Salmonid type) 전위인자가 다음문헌[Ivics et al (1997) Cell 91, 501-510 및 Horie et al (2001), Proc. Natl. Acad . Sci . USA, Vol. 98, Issue 16,9191-9196]에서 설명되었다. The rewritten from the fish the Tcl / mariner (mariner) of Sleeping Beauty potential available elements such as (Sleeping Beauty: SB) is salmon type (Salmonid type) electric potential factors such as potential parameter following the literature [Ivics et al (1997) Cell 91, 501 -510 and Horie et al (2001), Proc. Natl. Acad . Sci . USA, Vol. 98, Issue 16,9191-9196.

마리너는 드로소필라 마우리티안스(Drosophila mauritiana)로부터 최초로 분리한 전위인자이지만, 그 이후로는 여러가지 무척추 및 척추 종에서 발견되었다. 이러한 마리너를 이용하여 생물체를 형질전환하는 것이 국제 특허 출원 W099/09817호에서 기술되어 있다.Mariner was the first translocation factor to be isolated from Drosophila mauritiana , but has since been found in various invertebrate and vertebrate species. Transformation of organisms using such mariners is described in International Patent Application W099 / 09817.

헤르메스(Hermes)는 일반적인 집파리로부터 유도된다. 곤충을 형질전환하는데 있어서 헤르메스를 사용하는 것은 그 개시내용을 본원에 참조로 인용하는 미합중국 특허 제 5,614,398호에 기재되어 있다.Hermes (Hermes) is derived from the common housefly. The use of Hermes in transforming insects is described in US Pat. No. 5,614,398, the disclosure of which is incorporated herein by reference.

피기백(PiggyBac)는 살충바이러스 숙주 트리츠플러시아 니(Trichplusia ni)로부터 유도한 전위인자이다. 이를 메드플라이(Medfly)의 배선(germ-line) 형질전환에 이용하는 것이 다음문헌[Handler et al., (1998) PNAS (USA) 95: 7520-5 및 US patent 6,218,185]에서 기재되었다.Piggyback (PiggyBac) is a viral insecticide host tree you cheupeul Russia (Trichplusia ni ). The use of this in germ-line transformation of Medfly has been described in Handler et al., (1998) PNAS (USA) 95: 7520-5 and US patent 6,218,185.

그 개시내용을 본원에 참조로 인용하는 사바키스(Savakis)등의 유럽 특허 출원 제 0955364호에는 미노스를 이용하여 세포, 식물 및 동물을 형질전환하는 것이 기재되어 있다. 또한, 하나 이상의 미노스 삽입물을 포함하는 형질전환된 마우스를 생성하는 것이 기재되어 있다.European Patent Application No. 0955364 to Savakis et al., The disclosure of which is incorporated herein by reference, describes the transformation of cells, plants and animals using minos. Also, one or more minos It is described to generate a transformed mouse comprising an insert.

국제 특허 출원 제 W099/07871호에는 씨. 엘레간스(C. elegans)로부터의 Tel 전위인자 V를 이용하여 씨. 엘레간스 및 인간 세포주를 형질전환하는 것이 기재되어 있다.Mr. international patent application W099 / 07871. Seed using Tel translocation factor V from C. elegans . Transformation of elegans and human cell lines is described.

디. 멜라노가스터에서 드로소필라 P-엘리먼트를 이용하여 인핸서 표지(enhancer tagging) 및 유전자 표지를 수행하는 것이 다음문헌[Wilson et al., (1989) Genes dev. 3: 1301; Spradling et AL., (1999) Genetics 153: 135]에서 기재되었다.D. Enhancer tagging and gene labeling with drosophila P-elements in Melanogasster is described in Wilson et al., (1989) Genes dev. 3: 1301; Spradling et AL., (1999) Genetics 153: 135.

상기 종래 기술에서 기재된 기술에 있어서, 동족(cognate) 트랜스포사제를 이용하여 전위인자 도약(또는 전위)을 유도하는 것이 필수적인 것으로 인정된다.In the techniques described in the prior art, it is recognized that it is essential to induce a potential factor leap (or potential) using a cognate transposase.

형질전환된 동물이 설명되는 경우, 이것은 예를 들어 트랜스포사제 유전자를 이용한 동시형질전환(cotransformation)에 의하여, 시스(cis) 또는 트랜스(trans)로 제공되는 트랜스포사제를 가진다.When a transformed animal is described, it has a transposase that is provided in cis or trans, for example by cotransformation with a transposase gene.

전위가능한 엘리먼트 매개 형질전환을 위한 표준 방법은 예비 배반엽 배아내로 두 플라스미드의 혼합물을 동시 주입하는데, 하나의 플라스미드는 전위할 수 없지만 트랜스포사제를 발현하는 것이고(헬퍼(Helper)), 다른 하나의 플라스미드는 상기 엘리먼트의 말단 역반복체에 인접한 유전자를 가지는 것이다(도너(Doner)), 주입된 동물의 형질전환된 자손이 우성 마커 유전자의 발현을 통해 검출된다.The standard method for transpositionable element mediated transformation is the simultaneous injection of a mixture of two plasmids into a preliminary blastocyst embryo, one plasmid expressing a transposase but not translocating (Helper), the other The plasmid of has a gene adjacent to the terminal inverse repeat of the element (Donner), wherein the transformed progeny of the injected animal is detected through the expression of the dominant marker gene.

PCT/EP01/03341 (WO 01/71019)호에는 전위가능한 엘리먼트를 이용하여 형질전환된 동물을 발생시키는 것이 개시되어 있다. 이러한 방법에 있어서, 형질전환된 생물체를 교잡함으로써 트랜스포사제 기능이 제공되는데, 상기 생물체중 하나는 전위인자 기능을 제공하는 것이고, 다른 생물체는 트랜스포사제 기능을 제공하여 필요한 세포 또는 조직에서 전위인자 및 트랜스포사제 둘 모두를 함유하는 생물체를 생성하는 것이다. 조직 특이적 크로마틴 오프닝 도메인을 이용하면 조직 특이적 방식으로 트랜스포사제 활성이 유도되고 체세포 조직에서 다수의 독립적인 전위가 발생한다(Zagoraiou et al (2001) P. N. A. S. 98 11474-11478 참조).PCT / EP01 / 03341 (WO 01/71019) discloses the generation of transformed animals using transmissible elements. In this method, transposase function is provided by hybridizing transformed organisms, one of which provides transposer function, and the other organism provides transposase function to translocation factor in the cells or tissues required. And organisms containing both transposases. The use of tissue specific chromatin opening domains induces transposase activity in a tissue specific manner and results in a number of independent translocations in somatic tissue (see Zagoraiou et al (2001) P. N. A. S. 98 11474-11478).

전위를 표지(tagged)하면, 복잡한 게놈내의 위치 변화가 신속하게 측정될 수 있고 인접 유전자들이 서열 분석에 의하여 결정될 수 있다. 따라서, 원인(즉, 특정 유전자 또는 조절 엘리먼트내로의 삽입)과 효과(즉, 측정가능한 변화의 표현형)사이의 즉각적인 연결이 가능하게 된다. 그러나, 전위에 의하여 유전자 변형을 유도하는 통상적인 방법은 전위가 일어난 조직이 독특한 전위를 가지는 개개 세포들의 모자이크일 수 있다는 단점이 있다. 각각의 전위가 독특하므로 전위의 표현형 결과를 분석하는 것이 어렵게 된다. 따라서, 다수의 세포에서 동일한 유전자 변형이 제공되도록 전위(transposition)를 조절하는 방법이 당업계에 이점을 제공할 것이다.By tagging the translocation, changes in position in a complex genome can be quickly measured and adjacent genes can be determined by sequence analysis. Thus, an immediate link between the cause (ie, insertion into a particular gene or regulatory element) and the effect (ie, the phenotype of the measurable change) is possible. However, the conventional method of inducing genetic modification by translocation has the disadvantage that the tissue in which the translocation occurs can be a mosaic of individual cells with a unique translocation. Because each potential is unique, it becomes difficult to analyze the phenotypic result of the potential. Thus, methods of controlling transposition to provide the same genetic modification in multiple cells will provide advantages in the art.

본 발명의 제 1 실시양태는 형질전환된 자손을 발생시키고 전위를 유도하는 방법으로서, (a) 전위인자의 하나 이상의 복사체(copy)를 그 게놈내에 포함하는 제 1의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (b) 상기 전위인자와 동족(cognate)인 트랜스포사제(transpoase)를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 복사체 및/또는 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 조절할 수 있는 엘리먼트를 그 게놈내에 포함하는 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (c) 상기 제 1의 성숙한 형질전환된 생물체를 상기 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체와 교잡(crossing)하여, 하나 이상의 세포의 게놈내에 (i) 상기 전위인자의 하나 이상의 복사체 및 (ii) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 포함하는 자손을 제공하는 단계로서, 트랜스포사제를 암호화하는 유전자가 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있는 단계; 및 (d) 상기 자손에서 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 유도하여 자손의 조직 또는 세포의 최소한 일부내에서 상기 전위인자를 이동시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.A first embodiment of the invention is a method of generating a transformed progeny and inducing a translocation, comprising: (a) generating a first mature transformed organism comprising at least one copy of a translocation factor in its genome; Making a step; (b) comprising in its genome one or more copies of a gene encoding a transpoase cognate with said translocation factor and / or elements capable of modulating expression of said gene encoding a transposase Generating a second mature transformed organism; (c) crosslinking the first mature transformed organism with the second mature transformed organism, thereby (i) one or more copies of the translocation factor in the genome of one or more cells and (ii) the Providing a progeny comprising a gene encoding a transposase cognate with a translocation factor, wherein the gene encoding the transposase is under the control of one or more regulatory sequences allowing expression of the transposase; And (d) inducing the expression of said gene encoding a transposase in said progeny to move said translocation factor in at least a portion of the tissue or cell of said progeny.

달리 말해서, 본 발명은 전위인자 이동에 의하여 형질전환된 자손을 발생시키는 방법으로서, (a) 하나 이상의 세포의 게놈내에 (i) 전위인자의 하나 이상의 복사체와, (ii) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 자손을 제공하는 단계로서, 트랜스포사제를 암호화하는 유전자가 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있는 단계; 및 (b) 상기 자손에서 상기 트랜스포사제의 발현을 유도하여 자손의 조직 또는 세포의 최소한 일부내에서 상기 전위인자를 이동시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.In other words, the present invention provides a method for generating a progeny transformed by translocation factor migration, comprising (a) one or more copies of a translocation factor in the genome of one or more cells, and (ii) a cognate with the translocation factor. Providing a progeny comprising at least one gene encoding a transposase, wherein the gene encoding the transposase is under the control of at least one regulatory sequence allowing expression of the transposase; And (b) inducing expression of said transposase in said progeny to move said translocation factor within at least a portion of the tissue or cell of said progeny.

제 1의 성숙한 형질전환된 생물체는 안정적으로 통합된 휴면(dormant) 전위인자를 포함하는 형질전환된 생물체인 것이 바람직할 수 있다. 이러한 형질전환된 생물체는 표준 ES 세포기술을 이용하여 발생될 수 있다. 휴면 전위인자는 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체와의 교잡을 통하여 전위하도록 유도될 수 있다. 따라서, 본 발명은 마우스 변이체와 같은 수 천의 변이 자손을 신속하게 발생시킬 수 있는 방법을 제공한다.It may be desirable for the first mature transformed organism to be a transformed organism comprising a dormant translocation factor that is stably integrated. Such transformed organisms can be generated using standard ES cell techniques. Dormant translocation factors can be induced to transpose through hybridization with a second mature transformed organism. Thus, the present invention provides a method capable of rapidly generating thousands of variant offspring, such as mouse variants.

용어 "자손"(progeny)은 상기 제 1 형질전환된 생물체와 제 2 형질전환된 생물체 사이의 생식의 결과를 의미한다.The term "progeny" means the result of reproduction between said first transformed organism and said second transformed organism.

바람직한 구현예에서, 상기 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열은 배선 발달(germline development) 동안에 트랜스포사제의 특이적 발현을 가능하게 서열이다. 따라서, 상기 자손의 배세포는 전위를 갖는다.In a preferred embodiment, the one or more regulatory sequences that enable expression of the transposase are sequences that enable specific expression of the transposase during germline development. Thus, the germ cells of the progeny have translocations.

도 13은 수컷이 전위인자를 주고 암컷이 트랜스포사제를 주는 생체내 전위를 보여주는 개략도이다. 전위는 난모세포에서 일어난다. 수컷과 교잡한 후 돌연변이체가 얻어진다.FIG. 13 is a schematic showing in vivo translocation with males giving translocation factors and females giving transposase. FIG. Translocation occurs in oocytes. After hybridization with the male, a mutant is obtained.

따라서, 한 구현예에 있어서, 상기 자손은 상기 제 1 및 제 2 형질전환된 생물체 사이의 생식에 의하여 얻어지는 암컷 형질전환된 생물체이다. 이러한 구현예에서, 상기 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열은 암컷 자손에서의 난형성동안 트랜스포사제의 특이적 발현을 가능하게 하는 서열이다. 따라서, 난형성시에 트랜스포사제 발현이 유도된다. 따라서, 난모세포에서 배선 전위가 일어남으로써 삽입 서열을 갖는 난모세포가 발생된다. Thus, in one embodiment, the progeny are female transformed organisms obtained by reproduction between the first and second transformed organisms. In this embodiment, the one or more regulatory sequences that allow for expression of the transposase are sequences that enable specific expression of the transposase during egg formation in female offspring. Thus, transposase expression is induced upon oocyte formation. Thus, oocytes having an insertion sequence are generated by the germline translocation occurring in the oocytes.

이러한 실시예에서, 상기 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열은 발생중인 난모세포에서 발현되는 유전자의 조절 서열로부터 유래되는 것이다. 적당한 조절 서열로는 Zp3, Zpl, Zp2, Gdf9, Bmp15, Figla 및 Mater와 같은 난모세포 유전자의 발현을 조절하는 것들이 있다(예를 들어, Rajkovic 및 Matzuk, Molecular and Cellular Endocrinology 187 (2002), 5-9 참조). 다른 적당한 조절 서열이 Oct-4의 조절 서열로부터 유래될 수 있다. In this embodiment, one or more regulatory sequences that allow for expression of the transposase are derived from regulatory sequences of genes expressed in developing oocytes. Suitable regulatory sequences are those that regulate the expression of oocyte genes such as Zp3, Zpl, Zp2, Gdf9, Bmp15, Figla and Mater (eg Rajkovic and Matzuk, Molecular and Cellular Endocrinology 187 (2002), 5-). 9). Other suitable regulatory sequences may be derived from the regulatory sequences of Oct-4.

도 14는 암컷이 전위인자를 주고 수컷이 트랜스포사제를 주는 생체내 전위를 보여주는 개략도이다. 정액에서 전위가 일어난다. 14 is a schematic showing in vivo translocation of females to translocation factor and males to transposase. Dislocation occurs in semen.

따라서, 또 다른 구현예에서, 상기 자손은 상기 제 1 및 제 2 형질전환된 생물체 사이의 생식에 의하여 얻어지는 수컷 형질전환된 생물체이다. 이러한 구현예에서, 상기 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열은 수컷 자손에서 정자형성동안에 트랜스포사제의 특이적 발현을 가능하게 하는 서열이다. 따라서, 정자형성시에 트랜스포사제의 발현이 유도된다. 따라서, 정모세포에서 배선 전위가 일어나서 삽입 서열을 갖는 정모세포가 발생된다.Thus, in another embodiment, the progeny are male transformed organisms obtained by reproduction between the first and second transformed organisms. In such embodiments, the one or more regulatory sequences that allow for expression of the transposase are sequences that enable specific expression of transposase during spermatogenesis in male offspring. Thus, expression of transposase is induced upon spermatogenesis. Thus, germline translocation occurs in the hair cells, thereby generating the hair cells having the insertion sequence.

이러한 구현예에서, 상기 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열은 정모세포의 발생동안에 발현되는 유전자의 조절 서열로부터 유래된다. 적당한 조절 서열로는 Hlt 유전자의 전사체와 같은 정모세포 특이적 mRNA의 발현을 조절하는 것들이 있다(Bartell et al. Biol Of Reproduction 2000; Aug ; 63 (2); 409-16). In such embodiments, one or more regulatory sequences that allow for expression of the transposase are derived from regulatory sequences of genes that are expressed during the generation of hair cells. Suitable regulatory sequences include those that regulate the expression of hair cell specific mRNA, such as the transcript of the Hlt gene (Bartell et al. Biol Of Reproduction 2000; Aug; 63 (2); 409-16).

적절하게는, 배선에서 전위가 발생하는 자손은 교잡되어, 전위 사건으로 특징화될 수 있는 자손이 생성된다. 배선 전위가 발생된 자손은 정상적인 상대 또는 배선 전위를 가지도록 발생된 상대와 교잡될 수 있다.Suitably, offspring that generate a potential in the wiring are hybridized to produce offspring that can be characterized by a potential event. Progeny from which wiring potentials have been generated can be crossed with a normal counterpart or a counterpart generated to have wiring potentials.

본 발명의 또 다른 구현예에서, "자손"은 배아이다. 따라서, 이러한 구현예에서는, 형질전환된 배아를 발생시키고 전위를 유도하는 방법으로서, a) 전위인자의 하나 이상의 복사체를 그 게놈내에 포함하는 제 1의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; b) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 복사체 및/또는 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 조절할 수 있는 엘리먼트를 게놈내에 포함하는 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; c) 제 1 의 성숙한 형질전환된 생물체를 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체와 교잡하여, 하나 이상의 세포의 게놈내에 (i) 전위인자의 하나 이상의 복사체 및 (ii) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 포함하는 배아를 제공하는 단계로서, 트랜스퐈제를 암호화하는 유전자가 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있는 단계; 및 d) 상기 배아에서 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 유도하여 배아의 조직 또는 세포의 최소한 일부내에서 상기 전위인자를 이동시키는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.In another embodiment of the invention, the "offspring" is an embryo. Thus, in such embodiments, a method of generating a transformed embryo and inducing a translocation comprising the steps of: a) generating a first mature transformed organism comprising at least one copy of a translocation factor in its genome; b) a second mature transformed organism comprising in the genome one or more copies of a gene encoding a transposase cognate with the translocation factor and / or an element capable of modulating expression of the gene encoding a transposase Generating a; c) hybridizing a first mature transformed organism with a second mature transformed organism, so that (i) at least one copy of the translocation factor and (ii) a transpogative homolog to the translocation factor in the genome of one or more cells Providing an embryo comprising a gene encoding a home agent, wherein the gene encoding the transfection agent is under the control of one or more regulatory sequences that allow for expression of the transposase; And d) inducing expression of said gene encoding a transposase in said embryo to move said translocation factor within at least a portion of tissue or cells of said embryo.

달리말해서, 본 발명은 전위인자을 통해 형질전환된 배아를 발생시키는 방법으로서, a) 하나 이상의 세포의 게놈내에 (i) 전위인자의 하나 이상의 복사체와 (ii) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 배아를 제공하는 단계로서, 트랜스포사제르 암호화하는 유전자가 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있는 단계; 및 b) 상기 배아에서 상기 트랜스포사제의 발현을 유도하여 배아의 조직 또는 세포의 최소한 일부내에서 상기 전위인자를 이동시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.In other words, the present invention provides a method for generating a transformed embryo via a translocation factor, comprising a) transducing a gene in the genome of one or more cells with (i) one or more copies of the translocation factor and (ii) cognate with the translocation factor. Providing an embryo comprising one or more genes encoding, wherein the gene encoding the transposase is under the control of one or more regulatory sequences that allow expression of the transposase; And b) inducing the expression of said transposase in said embryo to move said translocation factor within at least a portion of tissue or cells of said embryo.

본원에서 사용되는 용어 "배아"(embryo)는 척추동물 또는 무척추동물의 경우에는 단일 수정란 또는 접합체(zygote)로부터 출생 또는 부화시까지 발달하는 구조체를 나타내거나 또는 식물의 경우에는 발아를 나타내는 것으로 이해된다. 따라서, 본 발명에 있어서, "배아"는 포유류의 태아도 포함하는 것으로 이해된다.As used herein, the term “embryo” is understood to refer to a construct that develops from a single fertilized egg or zygote to birth or hatching in the case of vertebrates or invertebrates or to germination in plants. . Thus, in the present invention, an "embryo" is understood to include the fetus of a mammal.

도 15는 수컷이 전위인자를 주고 암컷이 트랜스포사제를 주는 생체내 전위를 보여주는 개략도이다. 알(egg) 또는 초기 배아에서 전위가 일어난다.15 is a schematic showing in vivo translocation of males to translocation factors and females to transposase. Transition occurs in eggs or early embryos.

배아 세포 또는 조직에서 전위인자의 이동은 배아의 발달동안 임의의 시기, 예를 들어 배아의 예정된 발달 단계에서 유도될 수 있다. 이러한 발달 단계 동안에 전위를 유도함으로써, 단일 세포의 돌연변이 유전자가 후속 세포 분열시에 복제되어, 전위된 유전자에 대해 실질적으로 상동(homogeneous)인 세포 그룹(들)이 얻어진다. 따라서, 전위된 유전자는 특정 조직 또는 조직들의 그룹의 일부 또는 전부의 세포에 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나 이상의 개개 돌연변이에 상동인 세포들의 하나 이상의 클론 개체군을 포함하는 형질전환된 배아 및 생물체를 발생시킬 수 있다.Transfer of translocation factors in embryonic cells or tissues can be induced at any time during embryonic development, for example at predetermined stages of development of the embryo. By inducing translocations during this stage of development, the mutant genes of a single cell are replicated on subsequent cell division, resulting in cell group (s) that are substantially homogeneous to the translocated genes. Thus, the translocated gene may be present in cells of some or all of a particular tissue or group of tissues. Thus, the present invention can generate transformed embryos and organisms comprising one or more cloned populations of cells homologous to one or more individual mutations.

따라서, 본 발명의 제 2 실시양태는 전위인자 이동을 통해 변형된 유전자에 상동인 다수의 세포 또는 조직을 갖는 형질전환된 생물체를 발생하는 방법으로서, 본 발명의 상기 제 1 실시양태의 방법에 따라 형질전환된 배아를 발생시키고 상기 배아에서 전위를 유발하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.Accordingly, a second embodiment of the present invention is a method of generating a transformed organism having a plurality of cells or tissues homologous to a modified gene via translocation factor transfer, according to the method of the first embodiment of the present invention. It provides a method comprising generating a transformed embryo and inducing a translocation in said embryo.

발생 동안의 다양한 시기에 전위의 조절을 가능하게 함으로써, 본 발명의 방법은 게놈 전반에 걸친 전위의 가능성을 증가시키는데, 이는 전사 복합체에 접근할 수 있는 크로마틴 도메인 및 아마도 전위 사건이 배아 발달 동안, 더욱이 성체기 및 종양과 같은 비정상적인 성장 상태의 다양한 시점에서 다양한 세포 조직 유형에서 달라지기 때문이다. By enabling the regulation of translocations at various times during development, the methods of the present invention increase the likelihood of translocation across the genome, which means that the chromatin domain and possibly translocation events that have access to the transcriptional complexes during embryonic development, Moreover, they vary in various cell tissue types at various points in abnormal growth conditions such as adulthood and tumors.

게놈의 특정 영역에서 전위를 달성하는 가능성은, 크로마틴 오프닝 도메인 (chromatin opening domain), 예를 들어 편재적으로 작용하는 크로마틴 오프닝 엘리먼트 (UCOE) (PCT/GB99/02357 (WO 0005393)), 유전자좌 조절 영역 (LCR) (Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol. 10,361-365), CpG 아일랜드(island) 또는 인슐레이터(insulator)를 이용하여 전사인자 및/또는 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절함으로써 더욱 증가될 수 있다.The possibility of achieving translocation in a particular region of the genome can be found in chromatin opening domains such as the ubiquitously acting chromatin opening element (UCOE) (PCT / GB99 / 02357 (WO 0005393)), loci Regulatory region (LCR) (Fraser, P. & Grosveld, F. (1998) .Curr. Opin. Cell Biol. 10,361-365), CpG islands or insulators It can be further increased by regulating the expression of genes encoding antifoams.

본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 전위인자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 서열이 크로마틴 오프닝 도메인에 포함됨으로써 배아의 표적 유전자에서 전위를 달성하는 가능성이 증가되어, 전위 사건에 대해 상동인 그러한 조직 세포 개체군의 발생이 가능하게 된다. 예를 들어, 한정된 조직내에서 전위를 유도하는 것이 요구되는 경우, 전위인자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 서열이 유전자좌 조절 영역에 포함됨으로써, 그 조직에서 형질전환유전자(transgene)의 발현에 조직 특이적인 조절을 부여한다. 특이적인 LCR이 이용될 수 없는 조직에서 전위를 유도하는 것이 요구되거나 및/또는 특정 조직에서 전위를 조기에 유도하는 것이 요구되는 경우, 상기 전위인자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 서열이 UCOE내에 포함될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 구현예에 있어서, 상기 전위인자 및 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 모두가 크로마틴 오프닝 도메인(choromatin opening domain)에 포함되어 있다. 이는 배아 발달 동안 게놈 전반에 걸쳐 특정 유전자좌에서의 전위 효율을 유리하게 증가시킴으로써 특정 전위 사건에 상동인 세포의 하나 이상의 개체군의 생성이 가능하게 한다.In a preferred embodiment of the present invention, the target of the embryo is included in the chromatin opening domain by including a translocation factor and / or a sequence regulating the expression of the gene encoding the transposase and / or the gene encoding the transposase. The likelihood of achieving translocation in a gene is increased, allowing the development of such tissue cell populations that are homologous to translocation events. For example, where it is desired to induce translocation in defined tissues, sequences that regulate expression of translocation factors and / or genes encoding said transposase and / or genes encoding said transposase are regulated. By being included in a region, it confers tissue specific regulation on the expression of the transgene in that tissue. Genes encoding the translocation factor and / or the transposase and / or if it is desired to induce translocation in tissues in which specific LCR is not available and / or early induction of translocation in specific tissues and / or Or sequences regulating the expression of the gene encoding the transposase can be included in the UCOE. In a particularly preferred embodiment of the invention, both the translocation factor and the gene encoding the transposase are contained in the chromatin opening domain. This advantageously increases the translocation efficiency at specific loci throughout the genome during embryonic development, thereby enabling the production of one or more populations of cells homologous to specific translocation events.

따라서, 본 발명의 제 3 실시양태는 형질전환된 배아를 발생시키고 전위를 유발시키는 방법으로서, (a) 전위인자의 하나 이상의 복사체를 그 게놈내에서 포함하는 제 1의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (b) 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (c) 상기 제 1의 성숙한 형질전환된 생물체를 상기 제 2의 성숙한 형질전환된 생물체를 교잡하여, 하나 이상의 세포의 게놈내에 (i) 상기 전위인자의 하나 이상의 복사체와 (ii) 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 포함하는 배아를 제공하는 단계로서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는 상기 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있고 상기 전위인자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 유전자가 크로마틴 오프닝 도메인내에 위치하는 단계; 및 (d) 상기 배아에서 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 유도하여 상기 배아의 조직 또는 세포의 최소한 일부내에서 상기 전위인자를 이동시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.Accordingly, a third embodiment of the present invention is a method of generating a transgenic embryo and inducing a translocation, comprising: (a) generating a first mature transformed organism comprising at least one copy of a translocation factor in its genome; Making a step; (b) generating a second mature transformed organism; (c) hybridizing the first mature transformed organism to the second mature transformed organism so that (i) one or more copies of the translocation factor and (ii) the translocation factor are present in the genome of one or more cells. Providing an embryo comprising a gene encoding a cognate transposase, wherein the gene encoding the transposase is under the control of one or more regulatory sequences enabling expression of the transposase and the translocation factor and Positioning a gene encoding the transposase and / or a gene regulating expression of the gene encoding the transposase in the chromatin opening domain; And (d) inducing the expression of the gene encoding a transposase in the embryo to move the translocation factor in at least a portion of the tissue or cell of the embryo.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 배아는 상기 전위인자의 하나 이상의 복사체를 포함하는 형질전환된 생물체인 제 1 생물체와, 동족 트랜스포사제를 암호화하는 조절가능한 유전자의 하나 이상의 복사체를 게놈내에 포함하는 제 2 생물체를 교잡시킴으로써 생성된다. 변형예에서, 상기 배아는 전위인자 및 동족 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 복사체를 포함하는 형질전환된 생물체인 제 1 생물체와, 트랜스포사제를 발현하는데 필요한 조절 엘리먼트의 하나 이상의 복사체를 포함하는 제 2 생물체를 교잡시킴으로써 생성될 수 있다.In a preferred embodiment of the invention, the embryo comprises in the genome a first organism which is a transformed organism comprising at least one copy of said translocation factor and at least one copy of a controllable gene encoding a cognate transposase. It is produced by hybridizing a second organism. In a variant, said embryo comprises a first organism that is a transformed organism comprising one or more copies of a gene encoding a translocation factor and a cognate transposase, and one or more copies of regulatory elements required to express the transposase Can be produced by hybridizing a second organism.

바람직한 구현예에서, 상기 전위인자 및 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는, 상기 전위인자가 이동하는 경우 트랜스포사제를 암호화하는 유전자가 붕괴되어 전위인자의 추가 이동을 제한하도록 단일 구조물의 형태로 제공될 수 있다. 이것은 상기 전위인자가 이동하는 경우 트랜스포사제 유전자가 붕괴되도록 하는 배열로 트랜스포사제 유전자를 차단하는 인트론(intron)내에 전위인자의 역반복체(inverted repeat)중 하나를 위치시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 벡터에 의하여, 조절인자, 트랜스포사제 유전자 및 전위인자를 함유하는 형질전환된 생물체를 발생시키도록 단일 교잡 단계가 사용될 수 있다. 또한, 전위에 의하여 트랜스포사제 공급원의 완전한 불활성화가 유도됨으로써 유발인자(inducer)의 존재하에서도 새로운 삽입의 안정성이 얻어진다. 도 1은 본 발명에서 이러한 벡터의 사용을 개략적으로 예시한다.In a preferred embodiment, the gene encoding the translocation agent and the transposase is provided in the form of a single structure such that when the translocation factor moves, the gene encoding the transposase collapses to limit further movement of the translocation factor. Can be. This can be accomplished by placing one of the inverted repeats of the translocation factor in an intron that blocks the transposase gene in an arrangement that causes the transposase gene to collapse when the translocation factor moves. With such vectors, a single hybridization step can be used to generate transformed organisms containing regulators, transposase genes and translocation factors. In addition, complete inactivation of the transposase source is induced by the translocation, thereby obtaining new insertion stability even in the presence of an inducer. 1 schematically illustrates the use of such a vector in the present invention.

Cre/lox 기능 (Sauer, Methods of Enzymology; 1993, Vol. 225,890-900) 및 상이한 전위인자/트랜스포사제 결합물을 포함시키는 것을 이용하여 1차 트랜스포사제 기능을 제거할 수도 있다. 또한, 본 발명의 구현예에서, 트랜스포사제 유전자는 전위시에 분열되지 않음으로써, 예를 들어 유발인자의 투여시에 추가의 전위인자 이동이 가능하게 된다.Including the Cre / lox function (Sauer, Methods of Enzymology; 1993, Vol. 225,890-900) and the inclusion of different translocation / transposase combinations may be used to eliminate primary transposase function. In addition, in an embodiment of the present invention, the transposase gene is not cleaved at translocation, thereby enabling further translocation factor migration, for example upon administration of the trigger.

본 발명의 방법에 있어서, 당업자에게 알려진 임의의 시스템을 이용하여 전위를 유발할 수 있다. 내인성 물질의 적용 또는 발생 조절 신호와 같은 내인성 신호의 조작을 통하여 트랜스포사제 유전자의 발현을 유도하여 전위를 유발할 수 있다.In the method of the present invention, any system known to those skilled in the art can be used to cause dislocations. The translocation can be induced by inducing the expression of the transposase gene through the application of endogenous substances or manipulation of endogenous signals such as developmental control signals.

트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 조절하는 하나 이상의 조절 서열은 유도가능한 조절 서열일 수 있다. 예를 들어, 적당한 유발 시스템으로는 tet계 시스템, lac 오퍼레이터-리프레서 시스템, 엑디손(ecdysone)계 시스템 및 에스트로겐(oestrogen)계 시스템이 있으며, 이들의 설명은 하기와 같다. 외인성 유발인자는 예를 들어 모계 동물 또는 배아에 주입함으로써 어떤 편리한 형태로 제공될 수 있거나 또는 음식물 또는 물에 대한 첨가물의 형태로 모계 동물에 적절히 제공될 수 있다. 전위는 배아 발달동안 한 번 이상 유도될 수 있다. 따라서, 유발인자는 하나 이상의 발달 단계 동안에 단 한번 또는 반복적으로 투여될 수 있다.One or more regulatory sequences that control the gene encoding the transposase can be inducible regulatory sequences. For example, suitable trigger systems include a tet system, a lac operator-repressor system, an ecdysone system and an estrogen system, and their descriptions are as follows. Exogenous triggers may be provided in any convenient form, for example by injecting into a mother animal or embryo, or may be appropriately provided to a mother animal in the form of an additive to food or water. Translocation can be induced more than once during embryonic development. Thus, the trigger may be administered only once or repeatedly during one or more stages of development.

본 발명의 변형예에서, 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현은 특정 배아 발달 단계에서 생성되는 유전자 조절 신호에 반응하여 유도될 수 있다. 이러한 조절은 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를, 일시적으로 발현된 발달 조절 단백질과 같은 특정 유전자 조절 서열에 반응하는 발달 조절 특이 프로모터 등의 발달 조절 서열 또는 프로모터와 같은 유전자 조절 서열의 조절하에 있게 함으로써 달성될 수 있다. 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자가 이러한 조절하에 있는 경우, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현은, 일시적으로 발현된 발달 조절 단백질과 같은 유전자 조절 신호가 생성되거나 또는 그렇지않으면 이러한 신호 단백질이 예를 들어 주입에 의하여 또는 모계 동물의 먹이를 통해 배아에 도입되는 경우에만 달성될 수 있다.In a variant of the invention, expression of the gene encoding the transposase can be induced in response to gene regulatory signals produced at specific embryonic developmental stages. Such regulation is achieved by placing a gene encoding a transposase under control of a developmental regulatory sequence, such as a developmental regulatory specific promoter, or a gene regulatory sequence, such as a promoter, that responds to a specific gene regulatory sequence, such as a transiently expressed developmental regulatory protein. Can be. If the gene encoding the transposase is under such control, expression of the gene encoding the transposase may result in the generation of a gene regulatory signal, such as a transiently expressed developmental regulatory protein, or otherwise such a signal protein. It can only be achieved when introduced into the embryo, for example by injection or through the feeding of a maternal animal.

본 발명의 방법을 이용하여, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현시기를 조절하여 배아에서 전위 유발 시기를 조절할 수 있다.By using the method of the present invention, it is possible to control the timing of translocation in the embryo by controlling the expression time of the gene encoding the transposase.

상기 트랜스포사제 유전자의 발현 기간 및 효과를 엄격하게 조절하여 전위 시기를 추가로 제한하는 것이 요구되는 구현예에서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자가 전위인자와 동일 구조물내에 제공됨으로써, 전위인자 이동시에, 트랜스포사제를 암호화하는 유전자가 붕괴됨으로써 추가의 트랜스포사제 생성이 방지되어 추가의 전위가 제한된다.In embodiments in which it is necessary to further restrict the translocation time by strictly controlling the expression period and effect of the transposase gene, the gene encoding the transposase is provided in the same structure as the translocation factor, thereby shifting the translocation factor. The disruption of the gene encoding the transposase prevents further transposase production and limits further translocation.

이와 같이 유발 시기를 선택함으로써, 예정된 배아 발달 단계에서 전위 인자의 이동을 유도할 수 있다. 예를 들어, 접합체 단계, 4-세포 배아, 64-세포 배아 등과 같은 매우 초기의 발달 단계 또는 후기 발달 단계에서 전위가 유발될 수 있다.By selecting the triggering timing in this way, it is possible to induce the shift of translocation factors at predetermined stages of embryonic development. For example, translocation may be induced at very early or late development stages, such as at the conjugate stage, 4-cell embryo, 64-cell embryo, and the like.

한 구현예에서, 2- 또는 4-세포 단계의 초기 수정란에서 트랜스포사제 유전자 발현을 유도할 수 있는 하나 이상의 조절하에 상기 트랜스포사제를 있게함으로써 전위를 유발하는 것이 바람직하다. 이러한 단계에서 트랜스포사제 발현을 조절하기 위한 적당한 조절 서열은 발현이 이러한 단계에서 활성화되는 유전자의 조절 서열로부터 유래될 수 있다. 이러한 유전자로는 ZP3, Oct-4 (Kirchof 등, Biol Reprod 2000, Dec; 63 (6): 1698-705), 및 Zpl, Zp2, Gdf9, Bmp15, Figla 및 Mater와 같은 모계 효과 유전자기 있다. 다른 적절한 유전자로는 hsp70. 1 이 있다(Bevilacqua 등, Development 2000; Apr; 127 (7): 1541-51).In one embodiment, it is desirable to induce translocation by placing the transposase under one or more controls capable of inducing transposase gene expression in the initial fertilized egg at the 2- or 4-cell stage. Suitable regulatory sequences for controlling transposase expression at this stage can be derived from the regulatory sequences of the genes whose expression is activated at this stage. Such genes include ZP3, Oct-4 (Kirchof et al., Biol Reprod 2000, Dec; 63 (6): 1698-705), and maternal effect gene groups such as Zpl, Zp2, Gdf9, Bmp15, Figla and Mater. Another suitable gene is hsp70. 1 (Bevilacqua et al., Development 2000; Apr; 127 (7): 1541-51).

발달 단계에 좌우되어, 전위가 일어난 세포는 추가의 세포 분열 라운드가 진행됨에 따라 분열되어 초기 전위 사건에 대해 상동인 세포 개체군이 얻어질 수 있다. 전위가 한 번 이상 유발되는 경우, 새포의 개체군은 둘 이상의 전위 사건 각각에 대해 상동일 수 있다. 따라서, 발달 단계에 따라, 하나 이상의 조직, 완전 조직 또는 조직들의 그룹내의 세포 개체군에 삽입물이 존재할 수 있다. 따라서, 변형된 유전자의 유전자 발현 양상이 배아 발달 동안에 성숙한 세포 및 조직에서 모니터링될 수 있다.Depending on the stage of development, the translocated cells may divide as further rounds of cell division progress, resulting in a cell population homologous to the initial translocation event. If a translocation is induced more than once, the population of the vesicles may be homologous to each of the two or more translocation events. Thus, depending on the stage of development, an insert may be present in a cell population within one or more tissues, complete tissues, or groups of tissues. Thus, gene expression patterns of modified genes can be monitored in mature cells and tissues during embryonic development.

또한, 전형적으로 조직 재생 또는 세포 및 조직 유지 동안에, 급속하게 성장하는 성숙한 세포 및 줄기세포로부터 유래된 조직에서 초기 전위 사건에 대해 상동인 유사한 세포 개체군이 발생될 수도 있다. 이러한 세포 및 조직의 예로는 성숙한 개체의 줄기 세포로부터 급속한 전환 및/또는 재생을 받는 위장관 내층 세포, 간세포 및 혈액 세포 등이 있다. 유사하게, 종양에서도 전위 사건에 상동인 세포 개체군이 발생될 수 있다. 본 발명의 방법은 이러한 성숙한 세포에서 초기 전위 사건에 대해 상동인 세포 개체군을 제공하도록 적합될 수 있다.In addition, similar cell populations may be generated that are homologous to early translocation events in tissues derived from rapidly growing mature cells and stem cells, typically during tissue regeneration or cell and tissue maintenance. Examples of such cells and tissues are gastrointestinal lining cells, hepatocytes and blood cells that undergo rapid conversion and / or regeneration from stem cells of mature individuals. Similarly, tumors may develop cell populations that are homologous to translocation events. The methods of the invention can be adapted to provide a cell population homologous to the initial translocation event in such mature cells.

따라서, 본 발명의 그 밖의 구현예에서, 본 발명의 제 1 및 제 3 실시양태의 단계 (d)는, 신생 생물체, 청년기 생물체 또는 성숙한 생물체에서 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 유도하여, 배아에서 트랜스포사제의 발현을 유도하는 대신에 또는 그에 부가적으로 상기 생물체의 조직 또는 세포의 최소한 일부내에서 전위인자를 이동시킴으로써 적합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 신생 생물체, 청년기 생물체 또는 성숙한 생물체에서 예정된 발달 단계에서 유도된 전위 사건에 대해 상동인 세포 개체군의 발생을 가능하게 한다. 이러한 구현예에서, 상기 전위인자 또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는 형질전환 유전자의 조직 특이적 조절이 가능하도록 유전자좌 조절 영역의 조절하에 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 간세포에서 전위를 유도하는 것이 요구되는 경우, 상기 전위인자 및/또는 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는 간세포에서의 발현과 관련된 유전자좌 조절 영역의 조절하에 있을 수 있다.Thus, in other embodiments of the present invention, step (d) of the first and third embodiments of the present invention induces the expression of a gene encoding a transposase in a neoplasm, adolescent organism or mature organism, Instead of or in addition to inducing expression of transposase in the embryo, it may be adapted by moving translocation factors in at least part of the tissue or cell of the organism. Thus, the methods of the present invention enable the development of cell populations homologous to translocation events induced at predetermined developmental stages in neoplasms, adolescents or mature organisms. In this embodiment, the transgene or the gene encoding the transposase is preferably under the control of the locus regulatory region to allow tissue specific control of the transgene. For example, if it is desired to induce translocation in hepatocytes, the translocation factor and / or gene encoding the transposase may be under the control of a locus regulatory region associated with expression in hepatocytes.

접합체의 초기 발생에서 전위가 유발되는 경우, 전위를 갖는 ES 세포주를 발달시키는 것이 가능하게 된다. 이러한 ES 세포주는 차후의 사용을 위해 서열분석, 특성화 및 저장될 수 있다.When dislocations are induced in the early development of the conjugate, it becomes possible to develop ES cell lines with dislocations. Such ES cell lines can be sequenced, characterized and stored for later use.

본 발명에 따른 전위인자 삽입에 의한 형질전환된 생물체에서 유전자 돌연변이의 발생에 의하여 상기 생물체에서 새로운 표현형의 변이가 발생될 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여, 세포 또는 조직의 하나 이상의 클러스터가 상이한 전위 사건에 대해 각각 상동이며, 이들 각각은 표현형 효과를 갖거나 갖지 않을 수 있는 형질전환된 배아를 생성할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하여, 삽입이 발생하지 않은 대응하는 세포 또는 조직의 표현형과 비교하여 표현형의 변화를 나타내는 세포의 하나 이상의 클러스터 또는 그룹을 포함하는 배아 및 이로부터 발달된 성숙한 개체를 생성할 수 있다.By the generation of gene mutations in the transformed organism by translocation factor insertion according to the present invention, a new phenotype mutation can be generated in the organism. Using the methods of the present invention, one or more clusters of cells or tissues are each homologous to different translocation events, each of which can produce a transformed embryo that may or may not have a phenotypic effect. Thus, using the methods of the present invention, an embryo comprising one or more clusters or groups of cells exhibiting a change in phenotype compared to the phenotype of a corresponding cell or tissue where no insertion has occurred can be produced and mature subjects developed therefrom. can do.

물론, 형질전환된 배아의 표현형에 대한 전위 사건의 효과는 전위가 일어나는 발달 단계에 어느 정도 의존하게될 것이다. 예를 들어, 단일 접합체 단계에서 전위가 유도되는 경우, 이로부터 발달되는 배아의 모든 세포는 삽입 사건에 대해 상동이다. 따라서, 전위(예: 삽입)가 각 세포에 치명적인 표현형의 변화를 야기하는 경우, 배아가 발생하지 않을 것이다. 전위(들)가 후기 발달 단계에서 유도되어진 경우, 전위(들)이 발생한 세포의 세포 분열로부터 유래되는 세포 또는 조직의 클러스터에 각각의 삽입이 존재하게 된다. 따라서, 각 세포들은 동일한 표현형의 변화를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 특정 기관의 특정 조직의 일부 또는 전부의 세포가 유래되는 세포에서 전위가 유도되는 경우, 삽입의 표현형 결과는 상기 세포, 특정 조직 또는 특정 기관으로 제한될 수 있다. 특정 기관의 특정 조직 세포의 일부만이 유래되는 세포에서 전위가 일어난 경우, 조직의 모든 세포가 전위를 나타내는 경우에 비해 더욱 약한 표현형이 전위를 통해 얻어질 수 있다. 전위가 세포에 치명적인 경우, 세포는 살지 못하게 된다. 특정 조직 또는 기관이 구성되는 모든 세포에서 삽입이 존재하는 경우, 그 조직 또는 기관은 작용 또는 발달할 수 없고 그 배아는 생존할 수 없게 된다. 그렇지 않으면, 전위는 치명적이지 않은 표현형 결과를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 상기 전위는 감염 세포에서 효소 기능을 조절하는 효과를 가짐으로써, 비감염 세포와 비교하여 물질 대사를 상대적으로 변화시킬 수 있다. 따라서, 변종 표현형의 조직 영역이 정상 표현형 또는 심지어는 제 2 변종 표현형의 동일 조직 영역에 인접하여 위치하고 있는 간과 같은 기관이 초래될 수 있다. 따라서, 생물체내에서 변종 표현형의 분포는 전위가 유도되는 배아 발달 단계에 의존하게 된다. 또한, 본 발명의 일부의 구현예에서, 제 2 라운드의 전위를 유도하는 것은 엘리먼트 절제에 의한 표현형의 반전, 또는 더욱 중요하게는 상호작용 유전자로의 새로운 삽입에 의한 표현형의 변화를 검출하는데 유용하게 된다.Of course, the effect of the translocation event on the phenotype of the transformed embryo will depend somewhat to the stage of development in which the translocation occurs. For example, if a translocation is induced in a single conjugate step, all cells of the embryo that develop from it are homologous to the insertion event. Thus, if the translocation (eg insertion) causes a change in the phenotype that is fatal to each cell, no embryo will develop. When the translocation (s) is induced in later developmental stages, each insertion is in a cluster of cells or tissues derived from the cell division of the cell in which the translocation (s) has occurred. Thus, each cell can exhibit the same phenotype change. For example, if a translocation is induced in a cell from which cells of a part or all of a particular tissue of a particular organ are derived, the phenotypic result of the insertion may be limited to that cell, a specific tissue or a particular organ. If a translocation occurs in a cell from which only a part of a particular tissue cell of a particular organ is derived, a weaker phenotype can be obtained through the transposition than when all cells in the tissue exhibit a translocation. If the translocation is fatal to the cell, the cell is unable to live. If there is an insertion in all cells of which a particular tissue or organ is composed, the tissue or organ cannot function or develop and the embryo cannot survive. Otherwise, the dislocation may represent a nonfatal phenotypic result. For example, the translocation has the effect of modulating enzyme function in infected cells, thereby allowing relative metabolism to be altered compared to uninfected cells. Thus, organs, such as the liver, in which the tissue region of the variant phenotype is located adjacent to the normal tissue region or even the same tissue region of the second variant phenotype can be brought about. Thus, the distribution of variant phenotypes in organisms will depend on the stage of embryonic development at which translocation is induced. In addition, in some embodiments of the present invention, inducing a second round of translocations is useful for detecting inversion of the phenotype by element ablation, or more importantly, changes in the phenotype by new insertion into the interacting gene. do.

형질전환된 생물체의 세포, 조직 또는 기관의 표현형 변화에 의하여, 이러한 세포, 조직 또는 기관의 게놈에서의 전위를 규명할 수 있다.Phenotypic changes in the cells, tissues or organs of the transformed organism can be used to determine the potential in the genome of such cells, tissues or organs.

따라서, 본 발명의 제 4 실시양태는 형질전환된 생물체에서 유전자 돌연변이를 검출 및 특성화하는 방법으로서, (a) 본 발명의 제 1 및 제 3 실시양태의 방법을 이용하여 형질전환된 배아를 발생하고 상기 배아내에서 전위를 유발하거나 또는 본 발명의 제 2 실시양태에 따라 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 배아 또는 이로부터 발달된 자손에서 변종 표현형을 나타내는 다수의 세포의 존재를 동정하는 단계; 및 (c) 상기 하나 이상의 세포의 게놈에서 하나 이상의 전위인자 전위의 위치를 검출하고, 상기 관찰된 변종 표현형과 관련된 하나 이상의 유전자좌를 나타내는 상기 전위 위치를 상기 관찰된 변종 표현형과 상관시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.Accordingly, a fourth embodiment of the present invention is a method of detecting and characterizing gene mutations in a transformed organism, comprising: (a) generating a transformed embryo using the method of the first and third embodiments of the invention; Generating a translocation or transformed organism according to a second embodiment of the invention in said embryo; (b) identifying the presence of a plurality of cells exhibiting a variant phenotype in said transformed embryo or offspring developed therefrom; And (c) detecting the location of one or more translocation potentials in the genome of the one or more cells and correlating the translocation location representing one or more loci associated with the observed variant phenotype with the observed variant phenotype. Provide a method.

용어 "전위 사건"(transposition event)은 전위인자의 이동에 의하여 발생되는 게놈 서열의 변화를 말하는 것으로서, 이에는 삽입 사건(insertion event), 절제 사건(excision event) 또는 염색체 파괴(chromosomal break)가 포함된다.The term "transposition event" refers to a change in the genomic sequence caused by the shift of a translocation factor, which includes an insertion event, an excision event or a chromosomal break. do.

삽입 사건은 전위인자의 핵산 서열을 규명하여 전위인자의 존재를 탐색함으로써 검출될 수 있다. 또한, 절제후에 남아있는 시그너쳐(signature) 서열에 의하여 절제를 확인할 수도 있다.Insertion events can be detected by identifying the nucleic acid sequence of the translocation factor and searching for the presence of the translocation factor. In addition, ablation may be confirmed by signature sequences remaining after ablation.

본 발명의 제 4 실시양태는 형질전환된 동물의 다수의 세포에서의 표현형 특성과 상관되는 유전자를 분리하는 방법으로서, (a) 본 발명의 제 1 및 제 3 실시양태의 방법에 따라 형질전환된 배아를 발생하고 상기 배아내에서 전위를 유도하거나 또는 본 발명의 제 2 실시양태에 따라 형질전환된 생물체를 발생시키는 단계; (b) 상기 형질전환된 배아 또는 이로부터 발달된 자손에서 상기 표현형 특성을 나타내는 다수의 세포의 존재를 동정하는 단계; (c) 상기 하나 이상의 세포의 게놈에서 하나 이상의 전위인자 전위 사건의 위치를 검출하는 단계; 및 (d) 상기 삽입물을 포함하는 유전자좌를 클로닝하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.A fourth embodiment of the invention is a method of isolating genes that correlate with phenotypic characteristics in a plurality of cells of a transformed animal, wherein (a) is transformed according to the methods of the first and third embodiments of the invention Generating an embryo and inducing a translocation within said embryo or generating a transformed organism according to a second embodiment of the invention; (b) identifying the presence of a plurality of cells exhibiting the phenotypic characteristics in the transformed embryo or offspring developed therefrom; (c) detecting the location of one or more transgene translocation events in the genome of the one or more cells; And (d) cloning the locus comprising the insert.

상기 변형 유전자좌는 전위인자 삽입물을 위치시킴으로써 정확히 동정될 수 있다. 접해있는(flanking) 영역을 서열분석하면, 유전자좌를 서열분석할 필요없이 데이터베이스에서 상기 유전자좌를 확인할 수 있다.The modified locus can be accurately identified by locating a translocation factor insert. By sequencing the flanking regions, the locus can be identified in the database without the need for sequencing the locus.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 전위인자는 자연적 전위인자일 수 있다. 이것은 미노스와 같은 제 2형(type 2) 전위인자인 것이 바람직하다. 미노스인 것이 가장 바람직하다. 대안의 전위인자로는 마리너, 헤르메스, 피기백, 호보(hobo) 및 슬리핑 뷰티와 같은 연어형(salmonid-type) 전위인자가 있다.In a preferred embodiment of the invention, the potential factor may be a natural potential factor. This is preferably a type 2 potential factor such as Minos. Most preferred is minos. To a potential factor in the alternative mariner, Hermes, piggyback, hobo (hobo) And salmon-type potential factors such as sleeping beauty .

하나 이상의 이종 암호화 서열 및/또는 발현 조절 서열을 포함하는 변형된 전위인자도 본 발명에서 사용될 수 있다. 이러한 암호화 서열은 전위인자가 포함되어진 유전자좌의 게놈 및 클로닝에서 전위인자의 동정을 촉진할 수 있는 것으로 선별가능하거나 및/또는 선별불가능한 마커 유전자를 포함할 수 있다. 적당한 마커로는 GFP 및 이의 유도체, 루시퍼라제, 갈락토시다제, 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT)와 같은 형광 및/또는 발광 폴리펩티드가 있다. Modified translocation factors comprising one or more heterologous coding sequences and / or expression control sequences may also be used in the present invention. Such coding sequences may include selectable and / or nonselectable marker genes that may facilitate the identification of translocation factors in the genome and cloning of the locus in which the translocation factor is included. Suitable markers include fluorescent and / or luminescent polypeptides such as GFP and derivatives thereof, luciferase, galactosidase, or chloramphenicol acetyl transferase (CAT).

이러한 마커는, 인핸서 또는 엑손과 인접함으로써 그 발현 수준이 조절되는 마커 유전자를 포함하는 전위인자를 삽입함으로써 생체내 인핸서 또는 사일런서(silencer) 트랩 및 엑손 트랩에서 사용될 수 있다. 엑손 및 인핸서 트랩에서 사용하기 위한 작제물이 EP 0955364에 기재되어 있다. 본 발명의 방법을 이용하면, 전위 사건에 상동인 다수의 세포 또는 조직이 마커 유전자(들)의 발현의 조절을 나타냄으로써, 인핸서 및/또는 사일런서 및/또는 엑손을 효율적으로 트래핑(trapping)할 수 있다. 또한, 특정 유형의 세포 또는 조직의 개체군만이 전위 사건에 상동인 구현예에서, 마커 유전자의 발현의 조절은 이러한 조절을 나타내지 않는 동일 형질전환된 동물의 동일 유형의 조직 또는 세포와 비교함으로써 동정될 수 있다.Such markers can be used in in vivo enhancers or silencer traps and exon traps by inserting a translocation factor comprising a marker gene whose expression level is regulated by adjoining the enhancer or exon. Constructs for use in exon and enhancer traps are described in EP 0955364. Using the method of the present invention, a number of cells or tissues homologous to a translocation event may exhibit regulation of expression of marker gene (s), thereby efficiently trapping enhancers and / or silencers and / or exons. have. In addition, in embodiments in which only certain types of cells or populations of tissues are homologous to a translocation event, modulation of the expression of marker genes can be identified by comparison with tissues or cells of the same type in the same transgenic animal that do not exhibit this regulation. Can be.

따라서, 본 발명의 제 6 실시양태는 형질전환된 동물에서 인핸서 또는 사일런서를 분리하는 방법으로서, (a) 본 발명의 제 1 또는 제 3 실시양태에 따른 방법을 이용하여 형질전환된 배아를 발생하고 상기 배아내에 전위를 유발하거나 또는 본 발명의 제 2 실시양태에 따라 형질전환된 생물체를 발생하는 단계로서, 전위인자가 동물 프로모터의 조절하에 리포터 유전자를 포함하므로써 이것이 기저 수준에서 발현되는 단계; (b) 상기 형질전환된 배아 또는 이로부터 발달된 자손의 하나 이상의 세포 또는 조직에서 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 평가하는 단계; (c) 상기 리포터 유전자의 발현이 기저 발현 수준과 비교하여 증가 또는 감소되는 상기 세포 또는 조직에서 유전자좌를 동정 및 클로닝하는 단계; 및 (d) 상기 세포 또는 조직에서 클로닝된 유전자좌를 특성화하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.Thus, a sixth embodiment of the present invention is a method for separating an enhancer or a silencer from a transformed animal, comprising (a) generating a transformed embryo using the method according to the first or third embodiment of the invention Inducing a translocation in said embryo or generating a transformed organism according to a second embodiment of the invention, wherein said translocation factor is expressed at the basal level by including a reporter gene under the control of an animal promoter; (b) assessing the expression level of said reporter gene in one or more cells or tissues of said transformed embryo or progeny developed therefrom; (c) identifying and cloning a locus in said cell or tissue where expression of said reporter gene is increased or decreased compared to basal expression levels; And (d) characterizing the cloned locus in the cell or tissue.

본 발명의 제 7 실시양태는 형질전환된 동물에서 엑손을 분리하는 방법으로서, (a) 본 발명의 제 1 또는 제 3 실시양태의 방법을 이용하여 형질전환된 배아를 발생하고 상기 배아에서 전위를 유발하거나 본 발명의 제 3 실시양태에 따라 형질전환된 생물체를 발생하는 단계로서, 전위인자는 번역 개시 서열이 결핍되어 있지만 스플라이스 수용체(splice acceptor) 서열을 가지는 리포터 유전자를 포함하는 단계; (b) 상기 리포터 유전자가 발현되는 하나 이상의 세포 또는 조직을 상기 배 아 또는 이로부터 발달된 자손에서 동정하는 단계; 및 (c) 상기 발현된 리포터 유전자를 포함하는 유전자좌를 상기 세포 또는 조직으로부터 클로닝하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.A seventh embodiment of the invention is a method of isolating exons in a transformed animal, comprising (a) generating a transformed embryo using the method of the first or third embodiment of the invention and Generating or transforming the organism according to the third embodiment of the present invention, wherein the translocation factor comprises a reporter gene that lacks a translation initiation sequence but has a splice acceptor sequence; (b) identifying one or more cells or tissues in which the reporter gene is expressed in the embryo or offspring developed therefrom; And (c) cloning a locus comprising said expressed reporter gene from said cell or tissue.

도 2, 도 3 및 도 4는 본 발명의 이러한 실시양태에서 배아를 발생하는데 사용할 수 있는 유전자 트랩 작제물(gene trap construct)을 개략적으로 도시한다.2, 3 and 4 schematically illustrate gene trap constructs that can be used to generate embryos in this embodiment of the invention.

도 2는 최소 프로모터의 조절하에 있는 자동형광 단백질(AFP)을 암호화하는 마커 유전자를 포함하는 전위인자 및 유도가능한 TetO 프로모터의 조절하에 있는 트랜스포사제 작제물을 도시한다. 두 작제물을 모두 포함하는 형질전환된 배아에 있어서, 상기 트랜스포사제의 발현은 상기 유도가능한 TetO 프로모터의 활성화에 의해 유도됨으로써, 상기 전위인자 작제물의 전위가 달성될 수 있다. 인핸서 부위에 또는 그에 인접한 부위의 게놈으로의 도입이 상기 마커 유전자의 발현에 의해 검출될 수 있다.FIG. 2 depicts a transposase construct under the control of an inducible TetO promoter and a translocation factor comprising a marker gene encoding an autofluorescent protein (AFP) under the control of a minimal promoter. In transformed embryos comprising both constructs, expression of the transposase is induced by activation of the inducible TetO promoter, whereby the translocation of the translocation factor construct can be achieved. Introduction to the genome of or at an enhancer site can be detected by expression of the marker gene.

도 3은 유도가능한 TetO 프로모터의 조절하에 있는 트랜스포사제 작제물과, 번역 개시 서열이 결핍되어 있지만 스플라이스 수용체 서열을 가지는 AFP 형광 리포터 유전자를 포함하는 전위인자를 도시한다. 두 작제물 모두룰 포함하는 형질전환된 배아에 있어서, 상기 트랜스포사제의 발현이 상기 유도가능한 TetO 프로모터의 활성화에 의해 유도되어, 상기 전위인자 작제물의 전위가 달성될 수 있다. 적절한 배향으로 인트론내로의 도입이 상기 마커 유전자의 발현을 통해 검출할 수 있다.3 depicts a transposase construct under control of the inducible TetO promoter and a translocation factor comprising an AFP fluorescent reporter gene that lacks a translation initiation sequence but has a splice acceptor sequence. In transformed embryos comprising both constructs, the expression of the transposase can be induced by activation of the inducible TetO promoter so that the translocation of the translocation factor construct can be achieved. Introduction into the intron in the proper orientation can be detected through expression of the marker gene.

바람직한 구현예에서, 전위인자는 유전자 발현을 상향조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 전위인자는 인핸서 또는 기타 전사 활성화 엘리먼트를 포함하도록 변형될 수 있다. 유전자의 근처에서 이러한 전위인자를 이동 및 삽입하면 상기 유전자 또는 유전자좌의 발현이 상향조절된다. 이러한 구현예는, 전위인자의 위치측정을 통해 클론 유전자에서 확인될 수 있는 암유전자(oncogene)를 분리하는데 있어서 특별한 이점이 있다.In a preferred embodiment, the translocation factor can be used to upregulate gene expression. For example, the translocation factor can be modified to include an enhancer or other transcriptional activation element. Moving and inserting these translocation factors in the vicinity of the gene upregulates expression of the gene or locus. This embodiment has particular advantages in isolating oncogenes that can be identified in the clone genes through the location of translocation factors.

도 4는 이러한 본 발명의 실시양태에서 배아를 발생하는데 있어서 사용될 수 있는 유전자 활성화 시스템을 도시한다. 도 4는 유도성 TetO 프로모터의 조절하에 있는 트랜스포사제 작제물과, 유도성 TetO 프로모터의 조절하에 있는 AFP 형광 마커 유전자를 포함하는 전위인자를 도시한다. 두 작제물 모두를 포함하는 형질전환된 배아에서, 상기 트랜스포사제의 발현이 상기 유도성 TetO의 활성화에 의해 유도됨으로써, 상기 전위인자 작제물의 전위가 달성될 수 있다. 또한, AFP를 포함하는 상기 전위된 작제물이 이소성(ectopic) 유전자의 상류측에 삽입되는 경우, 상기 유전자는 활성화되고 그 표현형 효과가 상기 TetO 프로모터의 유도시에 관찰될 수 있다.4 depicts a gene activation system that can be used in developing embryos in this embodiment of the invention. 4 depicts a transposer construct under the control of the inducible TetO promoter and a translocation factor comprising the AFP fluorescent marker gene under the control of the inducible TetO promoter. In transformed embryos comprising both constructs, the expression of the transposase is induced by activation of the inducible TetO, whereby the translocation of the translocation factor construct can be achieved. In addition, when the translocated construct comprising AFP is inserted upstream of an ectopic gene, the gene is activated and its phenotypic effect can be observed upon induction of the TetO promoter.

전위에 의해 유도된 독특한 유전자 변형을 나타내는 세포들의 모자이크가 생성되는 것으로 전위를 통해 유전자 변형을 유도하는 통상의 방법에 있어서, 각각의 전위 사건의 표현형 효과를 연구하는 것은 어렵다. 마찬가지로, 전위된 세포에 대한 자연적 또는 인위적 자극 효과를 연구하는 것은 실시 및 해석하기가 어렵다. 그러나, 본 발명의 방법은 세포 또는 조직의 하나 이상의 클러스터가 단일 전위 사건에 상동인 형질전환된 배아 및 생물체의 생성을 가능하게 하므로, 세포들의 상동 클러스터에서 리포터 유전자의 발현을 주변 세포 또는 조직의 것과 비교함으로써 약학적 또는 자연적 자극 효과를 쉽게 관찰할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, 전위가 일어난 세포의 자연적 자극 및 인위적 자극에 대한 반응을 연구하는데 사용될 수 있는데, 상기 자연적 자극의 예로는 호르몬, 시토킨, 및 성장 인자와 같은 생리적 자극이 있고, 상기 인위적 자극의 예로는 약물 발견 방법 및 독성 연구에서 사용되는 약물이 있다. 실제로, 본 발명의 방법은 자극에 대한 세포 또는 조직 클러스터의 반응을 실시간으로 관찰하는 것을 가능하게 한다.It is difficult to study the phenotypic effects of each translocation event in a conventional method of inducing genetic modification through translocations as a mosaic of cells exhibiting a unique genetic modification induced by the translocation is produced. Likewise, studying the effects of natural or artificial stimulation on translocated cells is difficult to implement and interpret. However, the methods of the present invention allow for the generation of transformed embryos and organisms in which one or more clusters of cells or tissues are homologous to a single translocation event, thus expressing the expression of the reporter gene in homologous clusters of cells with that of the surrounding cells or tissues. By comparison, the pharmacological or natural stimulating effects can be easily observed. Thus, the methods of the present invention can be used to study the responses to natural and artificial stimuli of transduced cells, examples of which are physiological stimuli such as hormones, cytokines, and growth factors. Examples of artificial stimuli include drugs used in drug discovery methods and toxicity studies. Indeed, the methods of the present invention make it possible to observe in real time the response of a cell or tissue cluster to a stimulus.

따라서, 본 발명의 제 8 실시양태는 형질전환된 동물에서 자극에 반응하는 유전자를 동정하는 방법으로서, (a) 본 발명의 제 1 또는 제 3 실시양태의 방법을 이용하여 형질전환된 배아를 발생하고 상기 배아에서 전위를 유발하거나 또는 본 발명의 제 2 실시양태에 따라 형질전환된 생물체를 발생하는 단계로서, 상기 전위인자는 최소 프로모터의 조절하에 리포터 유전자를 포함하므로써 이것이 기저 수준으로 발현되는 단계; (b) 자극의 부재하에서 상기 형질전환된 배아 또는 이로부터 발달된 자손의 하나 이상의 세포 또는 조직에서 상기 리포터 유전자의 발현 수준을 평가하는 단계; (c) 자극을 주는 단계; 및 (d) 상기 리포터 유전자의 발현이 상기 기저 발현 수준과 비교하여 증가 또는 감소되는 상기 유전자 또는 조직의 하나 이상에서 유전자좌를 동정 및 클로닝하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.Thus, an eighth embodiment of the present invention is a method for identifying genes that respond to stimulation in a transgenic animal, comprising: (a) generating a transformed embryo using the method of the first or third embodiment of the present invention. And generating a translocation in the embryo or generating a transformed organism according to a second embodiment of the invention, wherein said translocation factor is expressed at the basal level by including a reporter gene under the control of a minimal promoter; (b) assessing the expression level of said reporter gene in one or more cells or tissues of said transformed embryo or progeny developed therefrom; (c) stimulating; And (d) identifying and cloning a locus in one or more of said genes or tissues where expression of said reporter gene is increased or decreased compared to said basal expression level.

또한, 상기 방법은 (e) 상기 세포 또는 조직에서 상기 클로닝된 유전자좌를 특성화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.In addition, the method may further comprise (e) characterizing the cloned locus in the cell or tissue.

따라서, 본 발명의 이러한 실시양태는 인간, 식물 또는 동물에서 질병 치료 표적을 포함한 새로운 분자 간섭 표적을 동정하고 살충제, 제초제, 항진균제 및 살균제를 개발하는데 사용될 수 있다.Thus, this embodiment of the present invention can be used to identify new molecular interference targets including disease therapeutic targets in humans, plants or animals and to develop pesticides, herbicides, antifungal agents and fungicides.

하나의 또다른 적용예는 발병기전(예, 마우스 질병 모델)의 원인이 되는 유전자를 찾는 것이다. 유전자(예, 키나아제 또는 수용체)의 활성화가 질병의 발병기전에 관련이 있는 경우, 예를 들어, 이러한 유전자를 50% 불활성화시키면 상기 질병의 하나 이상의 표현형을 약화 또는 반전시킬 수 있다. 따라서, 이러한 유전자의 두 복사체중 하나를 불활성화하는 전위인자가 삽입된 세포 그룹이 질병상태의 배경에서 건강한 클러스터로서 검출될 수 있다.Another application is to find genes that cause pathogenesis (eg, mouse disease models). If activation of a gene (eg, kinase or receptor) is involved in the pathogenesis of the disease, for example, 50% inactivation of such a gene may weaken or reverse one or more phenotypes of the disease. Thus, a group of cells into which a translocation factor that inactivates one of the two copies of this gene is inserted can be detected as a healthy cluster in the background of the disease state.

상기 전위인자가 유전자내로 삽입될 수 있다. 이러한 전위인자는 전사된 유전자내로 삽입됨으로써, 오픈 크로마틴(open chromatin)에서 국소화되는 것이 바람직하다. 상기 전위인자에는, 조직 특이적 발현을 제공하는 유전자좌 조절 영역과 같은 크로마틴 오프닝 도메인 엘리먼트가 인접 위치하거나(Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol. 10,361-365) 또는 조직 비특이적 발현을 가능하게 하는 편재적으로 작용하는(ubiquitously-acting) 크로마틴 오프닝 엘리먼트(UCOE)가 인접하여 위치한다(예를 들어, WO 0005393 참조). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 크로마틴 오프닝 도메인으로는 하우스키핑(housekeeping) 유전자 또는 조직 특이적 유전자와 일반적으로 관련이 있는 CpG 고농도 아일랜드, 또는 인슐레이터가 있다. The translocation factor can be inserted into a gene. Such translocation factors are preferably localized in open chromatin by insertion into the transcribed gene. In the translocation factor, chromatin opening domain elements, such as locus regulatory regions that provide tissue specific expression, are contiguous (Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol. 10,361-365 ) Or ubiquitously-acting chromatin opening elements (UCOE) that allow for tissue nonspecific expression are located adjacent (see, for example, WO 0005393). Other chromatin opening domains that can be used in the present invention include CpG high concentration islands, or insulators, which are generally associated with housekeeping genes or tissue specific genes.

또한, 상기 전위인자는 그 양 말단의 사이에서 크로마틴 오프닝 도메인을 포함할 수 있다. 이로써, 상기 전위인자가 도입되는 크로마틴 구조체가 활성화됨으로써, 이에 대한 상기 유도성 트랜스포사제의 접근이 세포 또는 조직 특이적인 방식으로 용이하게 된다.In addition, the translocation factor may include a chromatin opening domain between both ends thereof. This activates the chromatin structure into which the translocation factor is introduced, thereby facilitating access of the inducible transposase to it in a cell or tissue specific manner.

마찬가지로, 상기 트랜스포사제 작제물은 크로마틴 오프닝 도메인 엘리먼트를 포함하거나 또는 그에 인접하여 상기 크로마틴 오프닝 도메인 엘리먼트가 위치할 수 있다.Likewise, the transposase construct may comprise or be located near the chromatin opening domain element.

배아 발생 및 성숙한 시기에 전위 사건을 조절하기 위한 능력에 의하여, 상이한 발달 시기 동안 상이한 조직에서 존재하는 다중 크로마틴 도메인에서의 전위 사건의 가능성이 증가한다.The ability to regulate translocation events at embryonic and mature stages increases the likelihood of translocation events in multiple chromatin domains present in different tissues during different developmental periods.

본 발명의 방법은 세포 또는 조직의 하나 이상의 개체군이 예정된 발달 단계시에 전위인자의 이동에 의한 유전자 변형에 일치하고 있는 유전적으로 변형된 생물체의 라이브러리를 발생하는데 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 그 밖의 실시양태는 세포 또는 조직의 하나 이상의 개체군이 전위인자의 이동에 의하여 변형된 유전자와 일치하고 있는 형질전환된 생물체의 라이브러리를 제조하기 위한 방법으로서, 본 발명의 제 1 또는 제 3 실시양태의 방법을 이용하여 전위인자를 이동시켜서 세포를 변형하는 단계를 포함하고, 단계(d)가 예정 배아 발달 단계에서 수행되는 방법을 제공한다.The methods of the present invention can be usefully used to generate libraries of genetically modified organisms in which one or more populations of cells or tissues are consistent with genetic modification by shifting translocation factors at predetermined developmental stages. Accordingly, another embodiment of the present invention is a method for preparing a library of transformed organisms in which one or more populations of cells or tissues are consistent with genes modified by the shift of translocation factors, the method comprising: A method of shifting a translocation factor to modify a cell using the method of the third embodiment, wherein step (d) is performed at a predetermined embryonic development stage.

이러한 방법에 의해 제조되는 형질전환된 생물체의 라이브러리는 본 발명의 또 다른 실시양태를 구성한다.The library of transformed organisms produced by this method constitutes another embodiment of the present invention.

도 1은 본 발명의 구현예에서 자체 활성화 자율성 전위인자 작제물의 사용을 개략적으로 예시한다. 그 게놈이 조절인자 작제물을 포함하는 제 1 형질전환된 생물체(A)는 그 게놈이 해당 유전자를 가지는 전위인자를 포함하는 제 2 형질전환된 생물체(B)와 교잡된다. 상기 전위인자의 역반복체들중 하나는 트랜스포사제 유전자를 차단하는 인트론내에 위치한다. 교잡 자손(C)에서 상기 전위인자를 이동시키면, 상기 트랜스포사제 유전자가 분열됨으로써, 유발인자(inducer)의 부재하에서도 추가의 전위 사건없이 상기 유전자의 안정한 전위가 일어난다.1 schematically illustrates the use of a self-activating autonomous potential factor construct in an embodiment of the invention. The first transformed organism (A) whose genome comprises a regulator construct is hybridized with a second transformed organism (B) whose genome comprises a translocation factor having the gene of interest. One of the reverse repeats of the translocation factor is located in the intron that blocks the transposase gene. When the translocation factor is shifted in hybrid progeny C, the transposase gene is cleaved, so that a stable translocation of the gene occurs without additional translocation event even in the absence of an inducer.

도 2는 트랜스포사제 유전자가 유도성 TetO 프로모터의 조절하에 있고 AFP 형광 마커 유전자를 포함하는 전위인자가 본 발명의 인핸서 트랩 방법에서 사용되는 최소 프로모터의 조절하에 있는 트랜스포사제 암호화 작제물을 개략적으로 도시한다.Figure 2 schematically shows a transposase coding construct in which the transposase gene is under the control of an inducible TetO promoter and the translocation factor comprising the AFP fluorescent marker gene is under the control of the minimum promoter used in the enhancer trap method of the present invention. Illustrated.

도 3은 유도성 TetO 프로모터의 조절하에 있는 트랜스포사제 작제물과, 번역 개시 서열이 결핍되어 있지만 본 발명의 엑손 트랩 방법에서 사용되는 스플라이스 수용 서열(splice acceptor sequence)을 가지는 AFP 형광 리포터 유전자를 포함하는 전위인자를 도시한다. FIG. 3 shows an AFP fluorescent reporter gene having a transposase construct under control of an inducible TetO promoter and a splice acceptor sequence lacking a translation initiation sequence but used in the exon trap method of the present invention. A potential factor that is included is shown.

도 4는 이소성 유전자(ectopic gene)를 동정하기 위한 유전자 트랩에서 사용되는 트랜스포사제 작제물과 전위인자를 도시한다.4 depicts the transposase constructs and translocation factors used in gene traps to identify ectopic genes.

도 5는 미노스 유도 벡터 pMiCMVGFP를 도시한다. 미노스 말단 역반복체(inverted terminal repeats)는 두꺼운 검정 화살표로 도시된다. 이러한 화살표외측의 흰색 블록은 D. hydei 게놈에서 최초 미노스 엘리먼트에 인접 위치하는 서열을 나타낸다. 화살표 머리는 미노스 절제를 검출하기 위하여 사용되는 프라이머의 위치를 나타낸다. 작은 화살표는 GFP 및 트랜스포사제 유전자의 전사 방향을 나타 낸다. 검정 막대는 프로브로 사용되는 단편을 나타낸다.5 shows the minose induction vector pMiCMVGFP. Minos terminal inverted repeats are shown by thick black arrows. The white block outside the arrow represents the sequence located adjacent to the first minos element in the D. hydei genome. Arrowheads indicate the location of the primers used to detect minus ablation. Small arrows indicate the direction of transcription of the GFP and transposase genes. Assay bars represent fragments used as probes.

도 6은 실시예 4에서 기술된 본 발명의 구현예에서 사용될 수 있는 미노스 트랜스포사제 발현 카세트의 구조를 도시한다. ZP3 유전자의 6.5kb 5'-인접(flanking) 영역 및 프로모터를 미노스 트랜스포사제 cDNA (ILMi) 및 인간 β 글로빈 유전자의 제2 인트론 및 폴리아데닐화 부위에 연결했다.FIG. 6 shows the structure of minos transposase expression cassettes that may be used in the embodiments of the invention described in Example 4. FIG. The 6.5 kb 5′-flanking region and promoter of the ZP3 gene was linked to the second intron and polyadenylation site of the Minos transposase cDNA (ILMi) and human β globin gene.

도 7은 RT-PCR 분석에 의한 미노스 트랜스포사제 전사의 검출을 도시한다. 분석되는 상이한 조직들이 도시된다. 쥐의 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT)가 내부 대조구(internal control)로 사용되었다. 절단된 pUC 18 DNA MspI가 마커 (M)으로 사용되었고 H₂0가 음성 대조구로 사용되었다.7 shows the detection of minos transposase transcription by RT-PCR analysis. The different tissues that are analyzed are shown. Rat hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) was used as internal control. Truncated pUC 18 DNA MspI was used as marker (M) and H ₂ 0 was used as negative control.

도 8은 전위 사건을 보여주는 상이한 자손들의 서던 블럿 분석을 도시한다. 모든 DNA 샘플들은 ³²P 표지 GFP 프로브로 절단 및 탐침된 probeBgl II 였다. 레인 1은 대조구(Chr 14에서 다중 복사체로서 GFP 전위인자를 가지며 발생 난모세포에서 미노스 트랜스포사제를 발현하는 암컷 마우스)이다. 레인 2, 5, 6, 7, 8, 10 및 11은 이중 형질전환된 암컷 및 수컷의 자손에 해당한다. 이들 모두는 상이한 전위 사건을 나타낸다. 레인 2 및 5는 2 개의 전위가 발생된 마우스이다. 레인 3 및 4는 2개의 전위가 발생된 레인 2의 마우스의 자손에 해당하는 것으로서, 삽입물(염색체 2 상의 레인 3, 염색체 14 상의 레인 4)의 분리를 보여준다. 레인 9는 레인 8에서 나타낸 마우스의 자손으로, 분리를 나타낸다.8 shows Southern blot analysis of different offspring showing translocation events. All DNA samples were probe Bgl II digested and probed with ³² P labeled GFP probes. Lane 1 is a control (female mouse expressing Minos transposase in developing oocytes with GFP translocation as multiple copies in Ch 14). Lanes 2, 5, 6, 7, 8, 10 and 11 correspond to the progeny of double transformed females and males. All of these represent different potential events. Lanes 2 and 5 are mice in which two translocations have occurred. Lanes 3 and 4 correspond to the offspring of mice in lane 2 with two translocations occurring, showing the separation of the inserts (lane 3 on chromosome 2, lane 4 on chromosome 14). Lane 9 is the offspring of the mice shown in lane 8, indicating separation.

도 9는 뮤스 뮤스쿨루스(Mus musculus) 게놈에서 어버이 및 4개의 미노스 삽 입물의 서열을 나타낸다. 상기 새로운 역전위인자에 인접한 염색체 서열은 대문자로 나타내고, 전위인자 서열은 소문자로, 표적 부위 복제는 붉은 색으로 표시한다. 셀레라(Celera) 데이터베이스로부터 삽입물 및 골격 번호의 위치가 도시된다. 9 is Mus Musculus musculus ) shows the sequences of the parent and four minos inserts in the genome. Chromosome sequences adjacent to the new reverse potential factor are shown in capital letters, translocation factor sequences in lowercase letters, and target site replication in red. Positions of inserts and skeletal numbers from the Celera database are shown.

도 10은 미노스 전위 사건의 FISH 분석을 도시한다. 염색체는 실시예 4의 물질 및 방법에서 기술한 바와같이 4'6-디아미노-2-페닐인돌로 염색되고 GFP 프로브로 탐침되었다. 패널 A: 두 개의 전위 사건(염색체 2 및 염색체 14의 동원체; 도 8 레인 12참조)을 갖는 마우스 8218-01; 적색(화살표 머리로 표시됨): 티라미드 증폭후의 염색(실시예 4의 물질 및 방법 참조), 패널 B: 두 개의 전위 사건(염색체 18에서 1개 그리고 전위인자의 초기 위치에 근접한 염색체 14의 말단소립에서 1개)를 갖는 마우스 8218-02(도 8의 레인 5). 녹색(화살표 머리로 나타냄): FITC 염색. 황색 화살표는 전위 사건을 나타냄.10 shows FISH analysis of Minos potential events. Chromosomes were stained with 4'6-diamino-2-phenylindole and probed with GFP probes as described in the materials and methods of Example 4. Panel A: mouse 8218-01 with two translocation events (chromosome 2 and chromosome 14; see FIG. 8 lane 12); Red (indicated by arrow head): Staining after tyramide amplification (see Materials and Methods of Example 4), Panel B: Two translocation events (one on chromosome 18 and one distal end of chromosome 14 near the initial position of the translocation factor) Mouse 8218-02 (lane 5 in FIG. 8) with one). Green (indicated by arrow head): FITC staining. Yellow arrow indicates potential event.

도 11은 정자 또는 알에서 트랜스포사제의 특이 발현 또는 편재 발현을 위한 녹인(knock-in) 작제물(A) 및 규칙적(regular) 작제물(B)을 도시한다. 도11 B에서, 베타 글로빈 3' 제2 엑손(적색), 간섭 서열(녹색) 및 제3 엑손(적색)이 추가된다.FIG. 11 shows knock-in constructs (A) and regular constructs (B) for specific or ubiquitous expression of transposase in sperm or eggs. In FIG. 11B, beta globin 3 'second exon (red), interference sequence (green) and third exon (red) are added.

도 12는 형질전환된 마우스용 트랩 작제물 및/또는 레드로바이러스 플라스미드로의 클로닝을 도시한다.12 shows cloning into trap constructs for transformed mice and / or redrovirus plasmids.

도 13은 암컷이 전위인자를 주고 수컷이 트랜스포사제를 주는 생체내 전위를 도시한다. 전위는 난모세포에서 일어난다.FIG. 13 shows in vivo translocation with females giving translocation factors and males giving transposase. Translocation occurs in oocytes.

도 14는 암컷이 전위인자를 주고 수컷이 트랜스포사제를 주는 생체내 전위를 도시한다. 전위는 정자에서 일어난다.FIG. 14 shows in vivo translocation with females giving translocation factors and males giving transposase. Dislocation occurs in sperm.

도 15는 수컷이 전위인자를 주고 암컷이 트랜스포사제를 주는 생체내 전위를 도시한다. 전위는 수정란 또는 배아에서 일어난다.Figure 15 shows in vivo translocation with males giving translocation factors and females giving transposase. The translocation occurs in the fertilized egg or embryo.

본 발명에서 기재된 기술들은 당업계에서 일반적으로 잘 알려져 있는 것이지만, 특히 다음문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) 및 Ausubel 등, Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.]을 참조할 수 있다.The techniques described herein are generally well known in the art, but in particular, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) and Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc.].

전위인자Potential factor

본 발명의 방법에서는 어떤 전위인자가 이용될 수 있다. 상기 전위인자는 제 2형 전위인자인 것이 바람직하고, 미노스 , 마리너 , 헤르메스, 피기백 , 및 슬리핑 뷰티로 구성되는 군에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 전위인자는 미노스인 것이 유익하다. 각각의 전위인자는 그의 자연적 동족 트랜스포사제와 함께 이용되는 것이 유익하지만, 변형 및/또는 개량된 트랜스포사제를 이용하는 것도 생각할 수 있다. 미노스 전위인자 및 이의 동족 트랜스포사제가 미합중국 특허 제 5,840, 865호 및 유럽특허출원 EP 0955364호에 상세히 기재되어 있다.Any potential factor may be used in the method of the present invention. The potential factor is more preferable that preferably a type 2 and a potential factor, selected from the Minos, mariner, Hermes, piggyback, and the group consisting of dew ripping beauty. The translocation factor is advantageously minos . While each translocation factor is beneficial to be used with its natural cognate transposase, it is conceivable to use modified and / or improved transposases. Minos potential factors and their cognate transposases are described in detail in US Pat. Nos. 5,840, 865 and European Patent Application EP 0955364.

상기 전위인자는 이종 폴리펩티드를 함유하는 핵산 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 서열은 전위인자의 도입시에 전위인자와 함께 세포의 게놈내로 도입된다. 또한, 이러한 서열은 전위인자가 재이동시에 절제되는 때 상기 전위인자와 함께 도입된다. 바람직한 구현예에서, 상기 이종 폴리펩티드는 선택가능한 마커이다. 이러한 마커는 전위인자가 통합된 세포를 동정할 수 있게 하고 도입 부위를 정확히 지도작성할 수 있게 한다. The translocation factor preferably comprises a nucleic acid sequence containing a heterologous polypeptide. This sequence is introduced into the genome of the cell with the translocation factor upon introduction of the translocation factor. In addition, such sequences are introduced with the translocation factor when the translocation factor is excised at relocation. In a preferred embodiment, the heterologous polypeptide is a selectable marker. These markers allow for identification of cells incorporating translocation factors and accurate mapping of the site of entry.

마커 유전자Marker gene

바람직한 마커 유전자로는 형광 폴리펩티드를 암호화하는 마커 유전자가 있다. 예를 들어, 생발광(bioluminescence)에서 에너지 전달 수용체로 작용하는 자포동물의 녹색 형광 단백질(GFP)이 본 발명에서 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 녹색 형광 단백질은 녹색 형광을 내는 단백질이고, 청색 형광 단백질은 청색 형광을 내는 단백질이다. GFP는 북서 태평양 해파리인 애구오래 빅토리아(Aequorea victoria), 바다 팬지(sea pansy)인 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis), 및 피알리듐 그레가륨(Phialidium gregarium )으로부터 분리되었다(Ward 등, 1982, Photochem Photobiol., 35: 803-808; Levine 등, 1982, Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77-85). 또한 최근에, 형광 단백질은 안토자(Anthoza) 종으로부터 분리되었다(기탁번호 AF168419, AF168420, AF168421, AF168422, AF168423 및 AF168424).Preferred marker genes are marker genes that encode fluorescent polypeptides. For example, a green fluorescent protein (GFP) of a follicle that acts as an energy transfer receptor in bioluminescence can be used in the present invention. As used herein, the term green fluorescent protein is a protein that emits green fluorescence, and a blue fluorescent protein is a protein that emits blue fluorescence. GFP is a Pacific Northwest jellyfish aegu Old Vic Astoria (Aequorea victoria), the sea pansy (sea pansy) of Renilla Lenny Miss Forde (Renilla reniformis), and lithium PR upgrade the volume (Phialidium gregarium ) (Ward et al., 1982, Photochem Photobiol., 35: 803-808; Levine et al., 1982, Comp. Biochem. Physiol., 72B: 77-85). Also recently, fluorescent proteins have been isolated from Anthoza species (Accession No. AF168419, AF168420, AF168421, AF168422, AF168423 and AF168424).

애구오래 빅토리아로부터의 자연 발생 GFP의 아미노산 서열을 변형함으로써, 유용한 여기 및 방출 스펙트럼을 갖는 여러가지의 애구오래-관련 GFP가 조작되어 왔다(Prasher등, 1992, Gene, 111: 229-233; Heim 등, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 12501-12504; PCT/US95/14692). 애구오래-관련 형광 단백질의 예로는 그의 뉴클레오티드 및 추측된 아미노산 서열이 유전자뱅크 기탁 번호 L29345, M62654, M62653 및 기타 녹색 형광 단백질의 애구오래-관련 버젼(version) 으로 존재하는 야생형(천연) 애구오래 빅토리아 GFP가 있다. 이들중 몇 개, 즉, P4, P4-3, W7 및 W2는 야생형보다 명확히 짧은 파장에서 형광을 방출한다.By modifying the amino acid sequence of naturally-occurring GFP from Victoria, Victoria, many aurora-associated GFPs with useful excitation and emission spectra have been engineered (Prasher et al., 1992, Gene, 111: 229-233; Heim et al. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 12501-12504; PCT / US95 / 14692). Examples of agonist-associated fluorescent proteins include wild-type (natural) agonist victoria whose nucleotides and speculated amino acid sequences are present in the genus long - relevant versions of genebank accession numbers L29345, M62654, M62653 and other green fluorescent proteins. There is a GFP. Some of these, ie P4, P4-3, W7 and W2, emit fluorescence at clearly shorter wavelengths than the wild type.

이용될 수 있는 기타 마커의 예로는, 네오마이신, 퓨로마이신 또는 히그로마이신을 암호화하는 유전자와 같은 선별가능한 마커 유전자, 또는 시토신 데아미나제 또는 니트로리덕타제를 암호화하는 유전자와 같은 카운터 선별(counter-selection) 유전자가 있다. Examples of other markers that may be used include: selectable marker genes, such as genes encoding neomycin, puromycin or hygromycin, or counter selections such as genes encoding cytosine deaminase or nitroreductase. -selection) gene.

당업자는 이용될 수 있는 다수의 마커 유전자를 잘 알고있다. 어떤 적당한 마커 유전자가 이용될 수 있고 특정의 선택이 본 발명에 필수적인 것이 아님을 알 수 있다.Those skilled in the art are familiar with a number of marker genes that can be used. It will be appreciated that any suitable marker gene may be used and that certain choices are not essential to the invention.

삽입 및 절제 사건의 동정Identification of Incident and Ablation Cases

전위인자, 및 이러한 전위인자가 절제되는 부위는 서열 분석을 통해 동정될 수 있다. 예를 들어, 대표적으로 미노스는 TA 염기쌍에 통합되고, 절제시에, 전위인자의 4개의 말단 누클레오티드에 인접하여 위치하는 표적 TA 서열의 복제물을 남긴다. 이러한 서열 또는 관련된 서열이 존재하는 것은 서열분석, PCR 및/또는 하이브리디제이션과 같은 방법을 통해 검출할 수 있다.The translocation factor, and the site where this translocation factor is excised, can be identified through sequence analysis. For example, minos typically is incorporated into TA base pairs and, upon ablation, leaves a copy of the target TA sequence located adjacent to the four terminal nucleotides of the translocation factor. The presence of such or related sequences can be detected through methods such as sequencing, PCR and / or hybridization.

삽입된 전위인자는 말단 반복 서열에 상보적인 PCR 프라이머를 이용하는 유사한 방법을 통해 동정할 수 있다.Inserted translocation factors can be identified through similar methods using PCR primers complementary to the terminal repeat sequence.

트랜스포사제Transposase

전위인자의 효과적인 이동은 전위가능한 엘리먼트의 숙주 세포의 효율적인 이동외에도, 전위인자 도약을 촉매하기 위하여 세포내에 효율적인 동족 트랜스포사 제의 존재에 의존한다. 본 발명에서 사용되는 용어 "동족"(cognate) 트랜스포사제는 제 1 도입 부위로부터 전위인자의 절제 및/또는 제 2 도입 부위에서 전위인자의 도입을 포함한, 전위인자의 전위를 활성화하는데 효과적인 어떤 트랜스포사제를 말한다. 상기 동족 트랜스포사제는 생체내에서 그의 상태가 전위인자와 본래 관련이 있는 트랜스포사제인 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명은 개선된 활성을 가지는 변형된 트랜스포사제를 본 발명의 범위내에 포함한다. 예를 들어, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 서열은 코돈 사용(codon usage)을 최적화함으로써 전위 빈도수가 증가되도록 변형될 수 있다. 코돈 사용의 최적화는 소정 유전자의 발현 수준을 증가시키는 것으로 당업계에서 잘 알려진 방법이다, 그렇지않으면, 상기 트랜스포사제는 숙주 생물체에 강화된 활성을 제공하기 위해 아미노산의 하나 이상의 삽입(insertion), 치환(substitutuion) 또는 결실(deletion)을 포함할 수 있다.Effective migration of the translocation factor, in addition to the efficient movement of the host cell of the transpositionable element, relies on the presence of efficient cognate transposase in the cell to catalyze transpositional jump. As used herein, the term “cognate” transposase is any trans that is effective for activating the translocation of a translocation factor, including ablation of the translocation factor from the first introduction site and / or introduction of the translocation factor at the second introduction site. Says a carcass. The cognate transposase is preferably a transposase whose state is inherently related to a translocation factor in vivo. However, the present invention includes within the scope of this invention modified transposases having improved activity. For example, the sequence of the gene encoding the transposase can be modified to increase the frequency of translocation by optimizing codon usage. Optimization of codon usage is a method well known in the art to increase the expression level of a given gene; otherwise, the transposase is capable of inserting or replacing one or more amino acids to provide enhanced activity to the host organism. (substitutuion) or deletion (deletion).

상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는, 전위인자를 그 게놈내에 포함하는 제 1 생물체와 교잡되어 본 발명에서 사용되는 배아를 생성하는 제 2 생물체의 게놈내에 제공될 수 있다. 변형예에서, 상기 동족 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 및 전위인자 모두의 하나 이상의 복사체는, 유도가능한 트랜스포사제 발현을 가능하게 하여 배아의 생성을 가능하게 하는데 필수적인 조절 서열의 하나 이상의 복사체를 포함하는 제 2 생물체와 교잡될 수 있는 제 1 생물체의 게놈내에 제공될 수 있다. The gene encoding the transposase may be provided in the genome of a second organism that hybridizes with a first organism comprising a translocation factor in its genome to produce an embryo for use in the present invention. In a variation, one or more copies of both the gene encoding a cognate transposase and a translocation factor comprise one or more copies of regulatory sequences essential for enabling inducible transposase expression to enable embryonic production. It may be provided in the genome of the first organism that can be hybridized with the second organism.

숙주 세포의 게놈내로 유전자를 도입하기 위한 다수의 방법이 당업계에 알려 져 있고, 이러한 방법이 본 발명에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 트랜스포사제 유전자는 형질전환 방법을 통해 숙주세포내로 삽입될 수 있다. 이러한 방법들은 아래에서 더욱 설명된다.Many methods for introducing genes into the genome of a host cell are known in the art and such methods can be used in the present invention. For example, transposase genes can be inserted into host cells via transformation methods. These methods are described further below.

트랜스포사제 발현의 조절Regulation of Transposase Expression

상기 트랜스포사제를 암호화하는 서열은, 필요에 따라 트랜스포사제 발현을 조절하는 조절서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 상기 트랜스포사제를 암호화하는 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열로는 프로모터/인핸서 및 기타 발현 조절 시그널 서열이 있다. 이러한 조절 서열은 트랜스포사제의 발현이 요구되는 숙주 생물체와 양립가능하도록 선택될 수 있다. 용어 "프로모터"는 당업계에 잘 알려져 있는 것으로서, 최소 프로모터(mininal promoter)에서 상류 엘리먼트 및 인핸서를 포함한 프로모터에 이르는 크기 및 복잡성을 갖는 핵산 영역을 포함한다.The sequence encoding the transposase can be operably linked to regulatory sequences that regulate transposase expression as needed. Regulatory sequences operably linked to the sequences encoding the transposases include promoter / enhancer and other expression control signal sequences. Such regulatory sequences may be selected to be compatible with host organisms in which expression of the transposase is desired. The term “promoter” is well known in the art and includes nucleic acid regions having size and complexity ranging from the smallest promoter to the promoter including upstream elements and enhancers.

대표적으로, 상기 프로모터는 문제의 생물체 이러한 생물체가 속하는 속, 과, 목, 종 또는 기타 분류에 상동인 세포들에서 작용하는 프로모터들로부터 선택될 수 있지만, 이종의 프로모터도 작용할 수 있다(예를 들어, 일부의 원핵 프로모터는 진핵 세포에서 작용한다). 상기 프로모터는 바이러스 또는 진핵 유전자의 프로모터 서열로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 발현이 일어나는 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터일 수 있다. 상기 진핵 프로모터는 α-악틴, β-악틴, 튜불린 등과 같이 편재 방식으로 작용하거나 또는 피루베이트 키나아제의 유전자와 같이 조직 특이적인 방식으로 작용하는 프로모터일 수 있다. 배선(germline) 전위인자 발달의 경우, 상기 프로모터는, 그의 발현이 배우자형성, 난형성 또는 정자형성 동안에 유도되는 유전자로부터 유도될 수 있다. 그렇지 않으면, 접합체 발생 동안의 전위와 같은 발달적으로 조절되는 전위 사건의 경우, 상기 프로모터는 그 발현이 발달적으로 조절되는 유전자로부터 유도될 수 있다. 초기 접합체에서의 발현의 경우, 모계 효과 유전자로부터 유도된 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, 특이적 자극에 반응하는 프로모터일 수도 있는데, 예로는 스테로이드 호르몬 수용체를 결합하는 프로모터가 있다. 또한, 바이러스성 프로모터도 이용될 수 있는데, 이의 예로는 Moloney 쥐의 백혈병 바이러스 긴말단 반복(MMLV LTR) 프로모터, 라우스(rous) 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, 또는 인간 세포확대바이러스(CMV) IE 프로모터가 있다.Typically, the promoter may be selected from promoters that act on cells homologous to the genus, family, tree, species or other class to which the organism in question belongs, but heterologous promoters may also act (eg, , Some prokaryotic promoters work in eukaryotic cells). The promoter can be derived from the promoter sequence of a viral or eukaryotic gene. For example, it may be a promoter derived from the genome of the cell in which expression takes place. The eukaryotic promoter may be a promoter that acts in a ubiquitous manner, such as α-actin, β-actin, tubulin, or in a tissue-specific manner, such as a gene of pyruvate kinase. In the case of germline translocation factor development, the promoter may be derived from a gene whose expression is induced during sporadic, ovarian or spermatogenesis. Otherwise, in the case of developmentally regulated translocation events, such as translocation during conjugate development, the promoter may be derived from a gene whose expression is developmentally regulated. For expression in early conjugates, promoters derived from maternal effect genes can be used. It may also be a promoter that responds to specific stimuli, for example, a promoter that binds to steroid hormone receptors. Viral promoters may also be used, examples of which include the leukemia virus long-term repeat (MMLV LTR) promoter, rous sarcoma virus (RSV) LTR promoter, or human cytomegalovirus (CMV) IE promoter in Moloney rats. There is.

본 발명에 따라, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있으므로, 프로모터를 이용하여 얻어지는 발현 수준이 조절될 수 있다는 것을 알 수 있다. 예를 들어, 상기 조절 서열은 유도가능한 조절 서열일 수 있다. 유전자 발현을 위한 유도가능한 시스템이 당업계에 알려져 있으며, 이의 예로는 테트라사이클린, 탈피호르몬 및 에스트로겐-유도성 시스템 또는 lac 오퍼레이터-리프레서 시스템이 있다.According to the present invention, it is understood that the gene encoding the transposase is under the control of one or more regulatory sequences, so that the expression level obtained using the promoter can be controlled. For example, the regulatory sequence may be an inducible regulatory sequence. Inducible systems for gene expression are known in the art, examples of which are tetracycline, molar hormone and estrogen-induced systems or lac operator-repressor systems.

포유류 세포에서 광범위하게 사용되는 이러한 유형의 시스템은, TET-OFF 유전자 발현 시스템(Gossen, M. & Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547-5551)으로도 알려져 있는 테트라시이클린/독시사이클린-저지성 전사 활성인자 tTA, 또는 Tet-On 시스템으로도 알려져 있는 독시사이 클린-유도성 rtTA 전사 활성인자(Gossen, M., Freundlieb, S. ,Bender, G., Muller, G., Hilien, W. & Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells. Science 268: 1766-1769)와 결합되는 TETO 프로모터-작동인자이다.This type of system widely used in mammalian cells is known as the TET-OFF gene expression system (Gossen, M. & Bujard, H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline responsive promoters; Proc. Natl. Acad USA 89: 5547-5551), the tetracycline / doxycycline-lowering transcriptional activator tTA, or doxycycline-induced rtTA transcriptional activator, also known as the Tet-On system (Gossen, M.). , Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hilien, W. & Bujard, H. (1995) Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells.Science 268: 1766-1769) It is an operation factor.

Tet-Off 시스템에서, 유전자의 발현은 테트라사이클린(Tc) 또는 독시사이클린(Dox; Tc 유도체)이 배지로부터 제거되는 때 개시된다. 대조로, Tet-On 시스템에서는 Dox의 첨가에 의해 발현이 개시된다. 그 게놈내에 안정적으로 통합된 Tet-조절성 유전자 및 전사 활성화 유전자를 가지는 세포주를 확립하기 위한 과정이 설명되어 왔다(예를 들어, http ://www. clontech.com/techinfo/manuals/PDF/PT3001-l.pdf 참조). 예를 들어, 상기 Tet-On 시스템은 형질전환된 동물에서 미노스 트랜스포사제의 테트라시이클린-유도성 발현에 이용될 수 있다. In the Tet-Off system, expression of the gene is initiated when tetracycline (Tc) or doxycycline (Dox; Tc derivative) is removed from the medium. In contrast, in Tet-On systems, expression is initiated by the addition of Dox. Processes for establishing cell lines with Tet-regulatory genes and transcriptional activation genes that are stably integrated in the genome have been described (eg, http://www.clontech.com/techinfo/manuals/PDF/PT3001). -l.pdf). For example, the Tet-On system can be used for tetracycline-induced expression of minos transposase in transformed animals.

이중 형질전환된 동물이 표준 상동성 재조합 ES 세포 기술을 통해 발생될 수 있다. 두 작제물(construct)이 사용되는데, 제 1의 작제물은 항시적 프로모터(constitutive promoter)하에서 rtTA 유전자를 함유하는 작제물이다. 이러한 작제물의 일례는 거대세포바이러스 직접 초기 프로모터(Cytomegalovirus immediate early (CMV) promoter)의 조절하에 있는 rtTA 활성인자를 암호화하는 pTet-On 플라스미드(Clontech)이다. 이러한 작제물에 의해 암호화되는 rtTA 전사 활성인자는 독시사이클린의 존재하에서만 활성이 있다. 제 2의 작제물은 테트라사이클린-반응 엘리먼트 또는 TRE의 조절하에서 미노스 트랜스포사제를 함유한다. 상기 TRE는 tet 작동인자(TETO)를 함유하는 42-bp 서열의 7 개의 직접 반복체로 이루어지며, CMV 직접 초기 프로모터와 일반적으로 회합한 인핸서가 결핍된 최소 CMV 프로모터의 바로 상류측에 위치한다. 이러한 인핸서 엘리먼트가 누락되어 있기 때문에, rtTA에 의한 결합의 부재하에서는 TRE로부터 트랜스포사제의 누출(leaky) 발현이 없다. 이러한 작제물의 일례는 그의 MCS에 미노스 트렌스포사제 암호화 유전자가 삽입되어 있는 pTRE2 플라스미드(Clontech)이다. 상기 두 작제물로 안정적으로 형질전환된 세포에서, rtTA는 발현되지만, 독시사이클린이 동물에 투여되지 않는 경우 미노스 트랜스포사제의 발현을 활성화하지 않는다.Double transformed animals can be generated via standard homologous recombinant ES cell techniques. Two constructs are used, the first construct being a construct containing the rtTA gene under a constitutive promoter. One example of such a construct is the pTet-On plasmid (Clontech), which encodes an rtTA activator under the control of the Cytomegalovirus immediate early (CMV) promoter. The rtTA transcriptional activator encoded by this construct is active only in the presence of doxycycline. The second construct contains minose transposase under the control of the tetracycline-reactive element or TRE. The TRE consists of seven direct repeats of the 42-bp sequence containing the tet effector (TETO) and is located immediately upstream of the minimum CMV promoter lacking an enhancer, typically associated with a CMV direct early promoter. Since these enhancer elements are missing, there is no leakage of transposase from the TRE in the absence of binding by rtTA. One example of such a construct is the pTRE2 plasmid (Clontech) in which its MCS-encoded coding gene is inserted. In cells stably transformed with both constructs, rtTA is expressed but does not activate the expression of minos transposase when doxycycline is not administered to the animal.

따라서, 본 발명의 방법에 따라, pTet-On 및 pTRE2 작제물 모두를 포함하는 형질전환된 동물이 그 게놈이 전위인자를 포함하는 또 다른 동물과 교잡되는 경우, 전위인자 및 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 그 게놈내에서 포함하는 배아를 생성하는 전위인자의 이동이 독시사이클린의 부재하에서는 일어나지 않는다. 따라서, 전위를 유도하기 위해 독시사이클린을 투여할 수 있다.Thus, according to the method of the present invention, when a transformed animal comprising both pTet-On and pTRE2 constructs is hybridized with another animal whose genome contains a translocation factor, the transgenic factor and transposase are encoded. Migration of translocation factors that produce embryos containing genes in their genome does not occur in the absence of doxycycline. Thus, doxycycline can be administered to induce translocation.

독시사이클린과 같은 유도인자가 어떤 적당한 방법을 통해 투여될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 트랜스포사제 발현을 위한 유도인자가 어버이 생물체의 음식물 또는 물을 통해 투여될 수 있다.Inducers such as doxycycline can be administered by any suitable method. In a preferred embodiment, inducers for transposase expression can be administered via food or water from the parental organism.

대안의 유도성 시스템으로는 타목시펜(tamoxifen)-유도성 트랜스포사제[타목시펜이 배지에 제공될 때 까지 세포질에 남아있는 트랜스포사제에 결합되는 변형된 에스테로겐 수용체 영역(Indra 등, Nucl Acid Res. 27,4324-27, 1999)], RU418 유도성 트랜스포사제(글루코코르티코이드 수용체와 동일한 원리로 작동함; Tsujita 등, J. Neuroscience, 19,10318-23, 1999 참조), 또는 엑디손(ecdysone)-유도성 시스템이 있다.Alternative inducible systems include tamoxifen-induced transposase [modified estrogens receptor regions that bind to transposase remaining in the cytoplasm until tamoxifen is provided to the medium (Indra et al., Nucl Acid Res) 27,4324-27, 1999)], RU418 inducible transposase (acts on the same principle as glucocorticoid receptors; see Tsujita et al., J. Neuroscience, 19,10318-23, 1999), or ecdysone )-There is an inductive system.

상기 엑디손-유도성 시스템은 곤충 호르몬, 엑디손 또는 그 유도체에 의해 유도되는 초파리의 헤테로다이머 엑디손 수용체(heterodimeric ecdysone receptor)에 기초룰 두고 있다. 초파리의 변태 동안에, 엑디손 수용체를 통해 "엑디손"으로 일반적으로 나타내어지는 스테로이드 호르몬 20-OH 엑디손에 의해 형태학적 변화가 개시된다. 최적화된 엑디손 반응 프로모터를 조절하는 변형된 엑디손 수용체의 안정한 발현을 통해 엑디손 반응성이 포유류 세포에 전달될 수 있다. 변형된 엑디손 수용체를 발현하는 마우스와 같은 형질전환된 동물은 호르몬 또는 그 유도체의 투여 시에, 통합된 엑디손 반응성 프로모터를 활성화할 수 있다. 상기 수용체가 엑디손 또는 엑디손의 유사체인 무리스테론(muristerone)과 결합하면, 상기 수용체는 상기 엑디손 반응성 프로모터를 활성화하여 상기 유전자의 조절된 발현을 제공한다. 엑디손계 유도성 시스템은 테트라사이클린계 시스템과 비교하여 낮은 기저 활성 및 높은 유도성을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 엑디손계 유도성 시스템의 그 밖의 사항은 예를 들어 다음문헌[USP 6,245, 531 및 No D, Yao TP, Evans RM Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice, Proc Natl Acad Sci U S A 1996 Apr 93: 3346-51]에서 확인될 수 있으며, 이러한 문헌의 내용은 본원에 참조로 인용된다.The ecdysone-induced system is based on the heterodimeric ecdysone receptor of Drosophila induced by insect hormones, ecdysone or derivatives thereof. During the metamorphosis of Drosophila, morphological changes are initiated by the steroid hormone 20-OH exison, commonly referred to as "exidone" via the exison receptor. Exison responsiveness can be delivered to mammalian cells through stable expression of modified ecdysone receptors that regulate optimized ecdysone response promoters. Transformed animals, such as mice expressing modified exison receptors, can activate an integrated ecdysone reactive promoter upon administration of a hormone or derivative thereof. When the receptor binds to exison or muristerone, which is an analog of exison, the receptor activates the exodyne reactive promoter to provide regulated expression of the gene. Exison-based inducible systems are reported to exhibit low basal activity and high inducibility compared to tetracycline-based systems. Others of the ecdysone inducible system are described, for example, in USP 6,245, 531 and No D, Yao TP, Evans RM Ecdysone-inducible gene expression in mammalian cells and transgenic mice, Proc Natl Acad Sci USA 1996 Apr 93: 3346-51, the contents of which are incorporated herein by reference.

최근에, lac 작동인자-억제인자 시스템은 포유동물, 특히 마우스에서 기능을 나타내는 것으로 확인되었다. 그 내용이 본원에 참조로 인용되는 다음문헌[Cronin et al, Genes and Development, 15, 1506-1517 (2001)]에는 lac 억제 형질전환유전자의 사용이 기재되어 있는데, 상기 형질전환유전자는 코돈 사용 및 구조가 대표적인 포유류 유전자와 유사하고,lac 프로모터의 조절하에서 리포터 유전자의 발현이 조절되도록 마우스에서 편재적으로 기능성 lac 억제 단백질을 발현한다. 상기 리포터 유전자의 발현은 마우스의 음료수 또는 배아 또는 양육 pup에 제공된 락토오스 유사체 IPTG를 이용하여 반전시킬 수 있다. 따라서, 상기 lac 작동인자-억제인자 시스템은 트랜스포사제 유전자를 lac 프로모터의 조절하에 있게 함으로써 트랜스포사제의 발현을 조절하는데 사용할 수 있다.Recently, lac effector-inhibitor systems have been shown to function in mammals, particularly mice. Cronin et al., Genes and Development, 15, 1506-1517 (2001), the contents of which are hereby incorporated by reference, describe the use of lac inhibitory transgenes, which use codons and The structure is similar to a representative mammalian gene and expresses a functional lac inhibitory protein ubiquitously in mice so that expression of the reporter gene is regulated under the control of the lac promoter. Expression of the reporter gene can be reversed using lactose analog IPTG provided in drinking water or embryo or rearing pup of mice. Thus, the lac effector-inhibitor system can be used to regulate the expression of transposase by placing the transposase gene under the control of the lac promoter.

그 밖에, 이러한 프로모터중 어떤 것은 인핸서 서열과 같은 그 밖의 조절 서열을 추가함으로써 변형될 수 있다. 또한, 전술한 두 개 이상의 상이한 프로모터로부터의 서열 엘리먼트를 포함하는 키메라 프로모터(Chimeric promoter)를 사용할 수도 있다.In addition, some of these promoters can be modified by adding other regulatory sequences, such as enhancer sequences. It is also possible to use chimeric promoters comprising sequence elements from two or more different promoters described above.

또한, 유전자좌 조절 영역(LCR)을 사용하는 것도 생각할 수 있다. LCR은 형질전환유전자에 타이트하게 조절된 조직 특이적인 조절을 제공하고, 형질전환유전자 발현의 충실성을 크게 증가시킬 수 있는 것이다. 다수의 LCR이 당업계에서 알려져 있다. 이의 예로는 베타-글로빈 LCR(Grosveld 등, (1987) Cell 51: 975-985); 알파-글로빈(Hatton 등, (1990) Blood 76: 221-227), CD2 (Festenstein 등, (1996) Science 271: 1123-1125), T 세포 특이적 CD4(Boyer 등, J Immunol 1997,159 : 3383-3390), TCR 유전자좌(Diaz P, 등, Immunity 1994,1 : 207-217; Ortiz 등, EMBO J 1997,16 : 5037-5045; Hong 등, Mol Cell Biol 1997,17 : 2151-2157. ), B-세포 특이적 MHC 클래스 II Ea(Carson 등, Nucleic Acids Res 1993,21 : 2065-2072), 대식세포-특이적 리소자임 유전자(Bonifer 등, EMBO J 1990,9 : 2843-2848), 뉴우런-특이적 S100 유전자(Friend 등, J Neurosci 1992,12 : 4337-4346), 간-특이적 LAP 유전자(Talbot 등, Nucleic Acids Res 1994,22 : 756-766), 인간 성장 호르몬 유전자좌(Jones 등, Mol Cell Biol 1995,15 : 7010-7021), 플러스 면역글로불린, 근육 조직 등이 있다. LCR에 관한 그 밖의 사항들은 다음문헌[Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol. 10,361-365 및 Li, Q., Harju, S. & Peterson, K. R. (1999). Trends Genet. 15 : 403-408]에서 기재되어 있다.It is also conceivable to use a locus regulatory region (LCR). LCR is capable of providing tightly regulated tissue specific regulation of the transgene and greatly increasing the fidelity of transgene expression. Many LCRs are known in the art. Examples thereof include beta-globin LCR (Grosveld et al., (1987) Cell 51: 975-985); Alpha-globin (Hatton et al., (1990) Blood 76: 221-227), CD2 (Festenstein et al., (1996) Science 271: 1123-1125), T cell specific CD4 (Boyer et al., J Immunol 1997,159: 3383 -3390), TCR locus (Diaz P, et al., Immunity 1994, 1: 207-217; Ortiz et al., EMBO J 1997, 16: 5037-5045; Hong et al., Mol Cell Biol 1997,17: 2151-2157.), B-cell specific MHC class II Ea (Carson et al., Nucleic Acids Res 1993, 21: 2065-2072), macrophage-specific lysozyme gene (Bonifer et al., EMBO J 1990, 9: 2843-2848), neuron-specific Red S100 gene (Friend et al., J Neurosci 1992,12: 4337-4346), liver-specific LAP gene (Talbot et al., Nucleic Acids Res 1994,22: 756-766), human growth hormone locus (Jones et al., Mol Cell Biol 1995,15: 7010-7021), plus immunoglobulins, muscle tissue, and the like. Other matters concerning LCR can be found in Fraser, P. & Grosveld, F. (1998). Curr. Opin. Cell Biol. 10,361-365 and Li, Q., Harju, S. & Peterson, K. R. (1999). Trends Genet. 15: 403-408.

그렇지 않으면, 신체의 모든 세포에서 오픈 및 여기될 필요가 있는 유전자, 즉, 당으로부터 에너지를 발생하기 위한 유전자와 같은 그의 단백질이 생존을 위한 모든 세포에 필요하게 됨으로써 편재적으로 발현되는 유전자를, 어떤 조직에서 전위인자 및/또는 트랜스포사제의 발현이 가능하도록 개발할 수 있다. 이러한 편재적으로 작용하는 크로마틴 유전자(UCOE)의 예로는 TBP 및 hnRNPA2로 알려져 있는 인간 유전자가 있다. 이러한 UCOE의 사용에 관한 그 밖의 사항에 대하여는 그 내용이 참조로 본원에 인용되는 다음문헌[Antoniou, M. 및 Grosveld, F. (1999). Genetic approaches to therapy for the haemoglobinopathies, Blood Cell Biochemistry, Volume 8: Hematopoiesis and Gene Therapy Fairbairn and Testa eds. Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York. pp 219-242, 및 PCT/GB99/02357 (WO 0005393)]을 참조한다. Otherwise, a gene that needs to be open and excited in every cell of the body, that is, a gene that is ubiquitously expressed by its protein, such as a gene for generating energy from sugar, is needed in every cell for survival, It may be developed to allow expression of translocation factors and / or transposase in tissues. Examples of such ubiquitous chromatin genes (UCOE) are human genes known as TBP and hnRNPA2. For other matters concerning the use of such UCOE, Antoniou, M. and Grosveld, F. (1999), the contents of which are incorporated herein by reference. Genetic approaches to therapy for the haemoglobinopathies, Blood Cell Biochemistry, Volume 8: Hematopoiesis and Gene Therapy Fairbairn and Testa eds. Kluwer Academic / Plenum Publishers, New York. pp 219-242, and PCT / GB99 / 02357 (WO 0005393).                 

또한, 트랜스포사제 및/또는 전위인자의 발현은 ES 세포의 사용을 통해서도 달성될 수 있다. 형질전환된 ES 세포를 이용하여 키메라 배아를 제작하면, 그의 특정 조직에서만 트랜스포사제 또는 전위인자 엘리먼트를 함유하는 형질전환된 생물체를 생성하는 것이 가능하다. 또한 이것은 새로운 수준의 조절을 제공한다.In addition, expression of transposase and / or translocation factors can also be achieved through the use of ES cells. By constructing chimeric embryos using transformed ES cells, it is possible to produce transformed organisms containing transposase or transgenic elements only in their specific tissues. It also provides a new level of control.

전위의 극대화 효율Maximum potential efficiency

전술한 바와 같이 예를 들어 WO 01/71019 및 WO 02/062991호에서는, 전위는 통합된 전위인자의 말단 반복 서열에 트랜스포사제 효소를 작용시켜서 숙주 세포내의 그 최초 위치로부터 전위인자를 절제하고 상기 게놈내의 상이한 위치에 전위인자를 재삽입함으로써 달성된다.As described above, for example, in WO 01/71019 and WO 02/062991, translocations are effected by exposing a transposase enzyme to the terminal repeat sequence of the integrated translocation factor to ablate the translocation factor from its initial position in the host cell and This is accomplished by reinserting the translocation factor at different positions in the genome.

대부분의 생화학적 방법을 이용하는 경우와 같이, 이러한 방법은 단순히 기질의 농도를 증가시킴으로써, 즉 트랜스포사제 효소의 복사체수(copy number) 및 수준을 증가시킴으로써 더욱 효율적이게 될 수 있다.As with most biochemical methods, such methods can be made more efficient by simply increasing the concentration of the substrate, ie by increasing the copy number and level of the transposase enzyme.

복사체수를 증가시키는 것은 최초 복사체 부위에 다중 복사체 어레이를 발생시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 표준 형질도입법 또는 PAC 벡터를 이용하여 10 내지 100개의 복사체를 발생할 수 있다. 그렇지 않으면, 게놈내의 상이한 위치에 다중 삽입물을 존재시킴으로써 다중 복사체를 발생시킬 수도 있다.Increasing the number of copies can be achieved by generating multiple copy arrays at the original copy site. For example, 10-100 copies can be generated using standard transduction or PAC vectors. Otherwise, multiple copies can be generated by having multiple inserts at different locations in the genome.

트랜스포사제의 서열은 코돈 사용이 최적화됨으로써 전위 빈도수가 증가되도록 변형될 수 있다. 코돈 사용의 최적화는 소정의 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위한 것으로 당업계에서 잘 알려져 있는 방법이다.The sequence of the transposase can be modified to increase the frequency of transposition by optimizing codon usage. Optimization of codon usage is a method well known in the art for increasing the expression level of a given gene.

따라서, 포유류 세포 또는 동물에서 파리 트랜스포사제의 효율은, 포유류의 코돈 사용을 파리의 코돈 사용으로 교체함에 의해 mRNA로부터 더욱 효율적으로 번역하여 그 농도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. Thus, the efficiency of fly transposase in a mammalian cell or animal can be increased by translating the codon usage of mammals into the codon usage of flies more efficiently, thereby increasing its concentration.

트랜스포사제 효율을 측정하기 위한 분석법으로는 예를 들어 다음문헌 [Klinakis 등, Insect Molecular Biology, 9 (3), 269-275,2000]에 기재된 표준 전위 분석법을 들 수 있다.As an analytical method for measuring a transposase efficiency, the standard potential analysis method described in the following Klinakis et al., Insect Molecular Biology, 9 (3), 269-275,2000 is mentioned, for example.

또한, 트랜스포사제 mRNA의 농도는, 성장 호르몬, 글로빈, 악틴 또는 알부민과 같은 다수의 안정한 mRNA에서 확인되는 5' 및 3' 서열을 트랜스포사제 mRNA에 포함시킴으로써 증가될 수도 있다.In addition, the concentration of transposase mRNA may be increased by including in the transposase mRNA the 5 'and 3' sequences identified in a number of stable mRNAs such as growth hormone, globin, actin or albumin.

형질전환된 생물체Transformed organism

본 발명의 방법은 전위인자, 동족 트랜스포사제를 암호화하는 유전자, 또는 둘 모두를 그 게놈내에서 포함하는 하나 이상의 형질전환된 생물체를 이용할 수 있다. The methods of the present invention can utilize one or more transformed organisms comprising in their genome a translocation factor, a gene encoding a cognate transposase, or both.

트랜스포사제를 암호화하는 유전자 또는 전위인자를 도입하는 것은 형질전환/형질도입, 바이러스 또는 비바이러스 벡터를 이용한 운반 및 미세주입(microinjection)을 포함한 어떤 이용가능한 방법을 통해 달성될 수 있다. 이러한 방법들은 각각 당업계에 알려져 있다. 상기 전위인자 및 상기 트랜스포사제를 암호화하는 유전자는 동일 또는 상이한 방법을 이용하여 삽입할 수 있다. 예를 들어, 초파리의 P-엘리먼트를 이용하여 미노스 트랜스포사제 작제물을 초파리내로 도입할 수 있다.Introduction of genes or translocation factors encoding transposase can be achieved through any available method, including transformation / transduction, delivery and microinjection with viral or nonviral vectors. Each of these methods is known in the art. Genes encoding the translocation factor and the transposase can be inserted using the same or different methods. For example, Drosophila P-elements can be used to introduce Minos transposase constructs into Drosophila.

바람직한 구현예에서, 상기 트랜스포사제를 암호화하는 전위인자 또는 유전 자는 형질전환 방법을 통해 숙주 세포 게놈내로 도입됨으로써 예를 들어 전위인자, 동족 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 또는 둘 모두를 포함하는 형질전환된 동물을 생성할 수 있다. 상기 형질전환된 동물이 전위인자와 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 모두 포함하는 경우, 상기 두 작제물은 동일 또는 상이한 방법을 이용하여 삽입할 수 있다. 상기 작제물의 운반이 벡터를 통해 이루어지는 경우, Tet 작동인자와 같은 조절 서열의 조절하에서 전위인자 및 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 모두를 포함하는 복합 벡터를 이용할 수 있다.In a preferred embodiment, the translocation factor or gene encoding the transposase is introduced into the host cell genome via a transformation method such as for example a transformation comprising a translocation factor, a gene encoding a cognate transposase or both. Generated animals. If the transformed animal contains both a translocation factor and a gene encoding a transposase, the two constructs can be inserted using the same or different methods. Where delivery of the construct is via a vector, a complex vector may be used that contains both the transgene and the gene encoding the transposase under the control of regulatory sequences such as Tet effectors.

본 발명에서는 어떤 적당한 형질전환된 동물을 이용할 수 있다. 동물의 예로는 자포동물문, 유즐동물문, 편형동물문, 선형동물문, 환형동물문, 연체동물문, 협각류, 단지형문, 갑각강, 및 척색동물문의 동물이 있다. 협각류로는 날개있는 곤충등의 곤충을 포함한 육각동물아문이 있다. 척삭동물로는 포유류, 조류, 어류, 파충류, 및 양서류가 있다. 포유동물의 특별한 예로는 인간 이외의 영장류, 고양이, 개, 소, 양, 돼지, 양 및 말 등의 유제동물, 및 마우스, 쥐, 게르빌루스쥐, 및 햄스터 등의 설치류가 있다.Any suitable transformed animal can be used in the present invention. Examples of animals include animals of the squirrel, husk, scorpion, linear, squirrel, molluscs, crustaceans, complexes, crustaceans, and chordates. The crustaceans include hexagonal animals, including insects with wings. Vertebrates include mammals, birds, fish, reptiles, and amphibians. Specific examples of mammals include primates other than humans, ungulates such as cats, dogs, cattle, sheep, pigs, sheep and horses, and rodents such as mice, mice, gerbils, and hamsters.

본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 형질전환된 동물을 생성하기 위한 방법은 당업계에서 잘 알려져 있다. 이러한 주제에 관한 유용한 일반적은 교과서는 다음문헌[Houdebine, Transgenic animals-Generation and Use (Harwood Academic, 1997)으로서 상기 문헌은 형질전환된 동물을 발생하기 위해 사용되는 방법을 광범위하게 고찰하고 있다.Methods for producing transformed animals that can be used in the methods of the invention are well known in the art. A useful general textbook on this subject is Hooudebine, Transgenic animals-Generation and Use (Harwood Academic, 1997), which extensively considers the methods used to generate transformed animals.

바람직한 구현예에서, 상기 동물은 곤충이다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 형질전환된 곤충을 생성하기 위한 방법이 잘 알려져 있다(예를 들어, Loukeris 등, (1995), Science 270 2002-2005 참조). 간략히 말해서, 해당 유전자를 가지는 전위가능한 엘리먼트가 예를 들어 미세주입법을 이용하여 프리블라스토데름(preblastoderm)의 배아내로 삽입된다. 상기 새로운 유전자 물질은 초기단계의 곤충 자신의 알(egg) 또는 정자 세포가 되도록 예정되는 알의 부분인 극성 원형질에 위치하는 것이 바람직하다. 핵 물질의 많은 분열 후, 그 대부분은 주변부로 분리되어 곤충 신체의 핵이 된다. 소수의 핵은 폴(pole)로 이동하여 성숙시에 알세포가 된다. 이러한 세포가 형질전환유전자를 포함하는 경우, 자손이 형질전환된다. 형질전환된 곤충을 생성하기 위한 그 밖의 사항들이 다음문헌[Loukeris 등, (1995), Science 270 2002-2005, 및 O'Brochta and Atkinson (1998) Scientific American 279 60-65]에 기재되어 있다.In a preferred embodiment, the animal is an insect. Methods for generating transformed insects that can be used in the methods of the present invention are well known (see, eg, Loukeris et al. (1995), Science 270 2002-2005). Briefly, transmissible elements carrying the gene of interest are inserted into the embryo of the preblastoderm, for example using microinjection. The new genetic material is preferably located in the polar protoplast, which is the portion of the egg intended to be the egg or sperm cell of the early insect itself. After much cleavage of nuclear material, most of it separates into the periphery and becomes the nucleus of the insect body. A few nuclei migrate to poles and become egg cells at maturity. If such cells contain a transgene, the progeny is transformed. Others for generating transformed insects are described in Loukeris et al. (1995), Science 270 2002-2005, and O'Brochta and Atkinson (1998) Scientific American 279 60-65.

또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 동물은 포유동물인 것이 바람직하다. 배아 미세조작 기술의 발달로 인해, 예를 들어 수정된 포유동물의 알내로 이종 DNA의 도입이 가능하게 되었다. 예를 들어, 분화가능한 줄기세포가 미세주입, 인산칼슘 매개 침전, 리소좀 융합, 레트로바이러스 감염 또는 기타 방법을 통해 형질전환된 다음, 상기 형질전환된 세포가 배아내로 도입되고, 상기 배아가 형질전환된 동물로 발달할 수 있다. 아주 바람직한 방법에 있어서, 발달하는 배아가 원하는 DNA를 함유하는 레트로바이러스로 감염되고, 상기 감염된 배아로부터 형질전환된 동물이 생성된다. 그러나, 가장 바람직한 방법에서는, 적절한 DNA가 바람직하게는 단일 세포 단계에서 배아의 생식핵 또는 세포질내로 삽입되고, 상기 배아는 성숙한 형질전환된 동물로 발달할 수 있다. 잘 알려진 방법으로서는 포유류의 수정된 난자내로 이종 DNA의 미세주입을 위한 표준 실험 과정이 있으며, 이의 예로는 다음문헌[Hogan 등, Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort 등, Bio/Technology 9: 844 (1991); Palmiter 등, Cell, 41: 343 (1985); Kraemer 등, Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammer 등, Nature, 315: 680 (1985); Wagner 등, 미합중국 특허 제 No. 5,175, 385호; Krimpenfort 등, 미합중국 특허 제 5,175,384호]을 참조한다.In another preferred embodiment, the animal is preferably a mammal. Advances in embryo microfabrication techniques have made it possible to introduce heterologous DNA into, for example, fertilized mammalian eggs. For example, differentiateable stem cells are transformed through microinjection, calcium phosphate mediated precipitation, lysosomal fusion, retroviral infection or other methods, and then the transformed cells are introduced into the embryo, and the embryo is transformed. Can develop into animals. In a very preferred method, the developing embryo is infected with a retrovirus containing the desired DNA, and a transformed animal is produced from the infected embryo. However, in the most preferred method, the appropriate DNA is inserted into the germline or cytoplasm of the embryo, preferably in a single cell stage, and the embryo can develop into a mature transformed animal. Well known methods include standard experimental procedures for the microinjection of heterologous DNA into fertilized eggs in mammals, examples of which include Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Press 1986); Krimpenfort et al., Bio / Technology 9: 844 (1991); Palmiter et al., Cell, 41: 343 (1985); Kraemer et al., Genetic manipulation of the Mammalian Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1985); Hammer et al., Nature, 315: 680 (1985); Wagner et al., US Patent No. 5,175, 385; Krimpenfort et al., US Pat. No. 5,175,384.

형질전환된 동물을 생성하기 위해 사용되는 또 다른 방법은 표준 방법을 통해 핵산을 전핵 단계의 알내로 미세주입하는 것을 포함한다. 다음에, 주입된 알은 유사임신 동물의 난관내로 전달되기에 앞서 배양된다.Another method used to generate transformed animals involves microinjecting the nucleic acid into the egg at the pronuclear stage via standard methods. The injected eggs are then cultured prior to delivery into the fallopian tubes of the pseudopregnant animal.

또한, 형질전환된 동물은 다음문헌[Schnieke, A. E. 등, 1997, Science, 278: 2130 및 Cibelli, J. B. 등, 1998, Science, 280: 1256]에서 설명한 방법을 이용하여 생성될 수도 있다. 이러한 방법을 이용하여, 공여 동물로부터의 섬유아세포는, 조절 세포의 조절하에서 해당 폴리펩티드의 암호화 서열을 포함하는 플라스미드로 안정적으로 감염된다. 다음에, 안정한 감염물이 핵화된 난모세포에 융합되고, 배양되어 암컷 동물내로 전달된다.Transformed animals may also be generated using the methods described in Schnieke, A. E. et al., 1997, Science, 278: 2130 and Cibelli, J. B. et al., 1998, Science, 280: 1256. Using this method, fibroblasts from a donor animal are stably infected with a plasmid containing the coding sequence of the polypeptide under the control of regulatory cells. Next, the stable infection is fused to the nucleated oocytes, cultured and delivered into female animals.

대표적으로, 형질전환 서열을 포함하는 동물의 분석은 하기와 같이 PCR 또는 서던 블럿 분석을 이용하여 수행될 수 있다.Representatively, analysis of an animal comprising the transforming sequence can be performed using PCR or Southern blot analysis as follows.

소와 같은 형질전환된 동물의 작제를 위한 특별한 예로서, DNA 결합 분자를 암호화하는 서열을 포함하는 누클레오티드 작제물은, 포유동물로부터 새로이 제거한 난소로부터 얻어지는 난모세포내로, 예를 들어 미합중국 특허 4,873,191호에 기재된 방법을 통해 미세주입된다. 상기 난모세포는 난포로부터 흡입되고, 헤파린으로 활동화된 해동 정자와 수정하기에 앞서 고정되고, 퍼콜(Percoll) 그래디언트에 의해 예비분류되어 이동성 분획이 분리된다.As a specific example for the construction of a transformed animal such as a cow, a nucleotide construct comprising a sequence encoding a DNA binding molecule is contained in oocytes obtained from ovaries newly removed from a mammal, for example in US Pat. No. 4,873,191. Microinjection is via the method described. The oocytes are aspirated from the follicle, fixed prior to fertilization with thawed sperm activated with heparin, and pre- sorted by Percoll gradients to separate the mobile fractions.

상기 수정된 난모세포는 예를 들어 15,000g으로 8 분간 원심분리하여 주입을 위한 생식핵을 가시화한 다음, 난관 조직 상태의 배지에서 접합체로부터 상실배 또는 낭포 단계까지 배양한다. 이러한 배지는 난관으로부터 얻은 관강 조직을 배지에서 희석함으로써 제조된다. 상기 접합체는 미세주입후 2 시간 이내에 상기 배지에 위치하여야 한다.The fertilized oocytes are centrifuged at 15,000 g for 8 minutes to visualize germline for infusion, and then cultured from the conjugate to loss embryonic or cystic phase in medium of fallopian tissue. Such medium is prepared by diluting the lumen tissue obtained from the fallopian tube in the medium. The conjugate should be placed in the medium within 2 hours after microinjection.

다음에, 코프로스타놀을 투여함으로써 소와 같은 예정된 수용체 동물에서 발정이 일어난다. 2 일내에 발정이 일어나서 배아가 발정후 5-7일 후에 수용체 동물에 전달된다. 성공적인 전달 여부는 서던 블럿을 통해 자손에게서 평가할 수 있다.Next, estrus occurs in a predetermined receptor animal such as a cow by administering coprostanol. Estrous occurs within 2 days and embryos are delivered to the recipient animal 5-7 days after estrus. Successful delivery can be assessed in the offspring via Southern blots.

그렇지 않으면, 원하는 작제물을 배아 줄기 세포(ES 세포)내로 도입하고 상기 세포를 배양하여 형질전환유전자에 의한 변형을 확보할 수도 있다. 다음에, 상기 변형된 세포는 포배아 단계(blastula embryonic stage)로 주입되고 상기 포배(blastula)는 유사임신 숙주내로 위치한다. 얻어지는 자손은 상기 ES 및 숙주 세포에 대하여 키메라성이며, ES 자손만을 포함하는 비키메라성 계통이 통상적인 교잡 방법을 이용하여 얻어질 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 W091/10741호에 기재되어 있다.Otherwise, the desired construct may be introduced into embryonic stem cells (ES cells) and cultured to ensure transformation by the transgene. Next, the modified cells are injected into the blastula embryonic stage and the blastula is placed into a pseudopregnant host. The progeny obtained is chimeric with respect to the ES and host cells, and nonchimeric lines comprising only ES progeny can be obtained using conventional hybridization methods. Such a method is described, for example, in W091 / 10741.

전위인자 및/또는 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 숙주 동물의 게놈내로 운반 및 안정하게 도입하기 위한 대안의 방법은 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 사용하는 것을 포함한다. 또한, 이러한 방법은 종래 기술에서 알려져 있는데, 예를 들어 다음문헌[Zhang 등, Nucl. Ac. Res. , 1998,26 : 3687-3693)]에 기재되어 있다.Alternative methods for transporting and stably introducing genes encoding translocation factors and / or transposase into the genome of a host animal include viral vectors such as adenovirus vectors, retroviral vectors, baculovirus vectors, and herpesvirus vectors. Including use. Such methods are also known in the prior art, for example in Zhang et al., Nucl. Ac. Res. , 1998,26: 3687-3693).

적당한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있는데, 이는 어느 적당한 레트로바이러스로부터 유도될 수 있다. 다수의 상이한 레트로바이러스들이 동정되어 왔다. 이의 예로는 쥐의 백혈병 바이러스(MLV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역결핍 바이러스, 인간 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV). 말의 감염성 빈혈 바이러스(EIAV), 마우스의 유방 종양 바이러스(MMTV), 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV), 후지나미(Fujinami) 육종 바이러스(FuSV), 멀로니(Moloney)쥐 백혈병 바이러스(Mo-MLV), FBR 쥐 골육종 바이러스(FBR MSV), 멀로니 쥐 육종 바이러스(Mo-MSV), 아벨슨(Abelson) 쥐 백혈병 바이러스(A-MLV), 조류 골수종형성(myelocytomatosis) 바이러스-29(MC29), 및 조류 태아적아구증(erythroblastosis) 바이러스(AEV) 등이 있다. 레트로바이러스의 상세한 목록은 다음문헌[Coffin 등, 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763]에서 확인할 수 있다.Suitable viral vectors can be retroviral vectors, which can be derived from any suitable retrovirus. Many different retroviruses have been identified. Examples thereof include rat leukemia virus (MLV), human immunodeficiency virus (HIV), apes immunodeficiency virus, human T-cell leukemia virus (HTLV). Equine Infectious Anemia Virus (EIAV), Mice Breast Tumor Virus (MMTV), Rous Sarcoma Virus (RSV), Fujinami Sarcoma Virus (FuSV), Moloney Rat Leukemia Virus (Mo-MLV ), FBR murine osteosarcoma virus (FBR MSV), Malone murine sarcoma virus (Mo-MSV), Abelson murine leukemia virus (A-MLV), avian myelocytomatosis virus-29 (MC29), and avian Erythroblastosis virus (AEV) and the like. A detailed list of retroviruses can be found in Coffin et al., 1997, "retroviruses", Cold Spring Harbor Laboratory Press Eds: JM Coffin, SM Hughes, HE Varmus pp 758-763.

일부 레트로바이러스의 게놈 구조에 관한 사항을 당업계에서 확인할 수 있 다. 예로서, HIV 및 Mo-MLV에 관한 사항들이 NCBI GenBank로부터 Genome Accession No. AF033819 및 AF033811로서 각각 확인될 수 있다.The genome structure of some retroviruses can be found in the art. As an example, matters relating to HIV and Mo-MLV can be found in the Genome Accession No. It can be identified as AF033819 and AF033811 respectively.

레트로바이러스는 크게 단순형 및 복잡형의 두 부류로 분류될 수 있다. 또한, 레트로바이러스는 7개의 그룹으로 분류될 수 있다. 이러한 그룹들중 5개 그룹은 종양형성 능력을 갖는 레트로바이러스를 나타낸다. 나머지 두 그룹은 랜티바이러스(lentivirus) 및 스퍼마바이러스(spumavirus)이다. 이러한 레트로바이러스의 고찰이 다음문헌[상기 Coffin 등, 1997]에 기재되어 있다.Retroviruses can be broadly classified into two classes: simple and complex. Retroviruses can also be classified into seven groups. Five of these groups represent retroviruses with tumorigenic capacity. The other two groups are lentiviruses and spumaviruses. A review of such retroviruses is described in the following Coffin et al., 1997.

숙주 범위 및 조직 향성(tropism)은 레트로바이러스마다 상이하다. 일부의 경우, 이러한 특이성은 재조합 레트로바이러스 벡터의 전위 능력을 제한할 수 있다. 따라서, 많은 유전자 요법 실험에서는 MLV를 사용하여 왔다. 4070A로 불리우는 인벨로프 단백질인 특정의 MLV는 암포트로픽 바이러스(amphotropic virus)로 알려져 있고, 이것은 인간 세포를 감염시키는데 이는 그의 인벨로프 단백질이 인간과 마우스 사이에서 보존되는 인산 수송 단백질과 도킹하기 때문이다. 이러한 수송 인자는 편재해 있으므로 상기 바이러스는 많은 세포 유형을 감염시킬 수 있다.Host range and tissue tropism are different for retroviruses. In some cases, this specificity may limit the translocation ability of the recombinant retroviral vector. Therefore, many gene therapy experiments have used MLV. A specific MLV, an envelope protein called 4070A, is known as an amphotropic virus, which infects human cells because its envelope protein docks with phosphate transport proteins that are conserved between humans and mice. to be. These transport factors are so ubiquitous that the virus can infect many cell types.

예를 들어, 패키징 또는 헬퍼 세포주와 재조합 벡터의 결합물을 이용하여 차후 전위에 적당한 역가의 레트로바이러스 벡터를 제조하기 위해, 복제-결함(replication-defective) 레트로바이러스 벡터가 증식된다. 즉, 세 가지의 패키징 단백질이 트랜스 형태로 제공될 수 있다.For example, replication-defective retroviral vectors are propagated to produce retroviral vectors of suitable titer for future translocation using a combination of packaging or helper cell lines with recombinant vectors. That is, three packaging proteins may be provided in trans form.

"패키징 세포주"는 레트로바이러스 gag, pol 및 env 유전자중 한 종 이상을 함유한다. 이러한 패키징 세포주는 레트로바이러스 DNA를 패키징하는데 필요한 단백질을 생성하지만 psi 영역의 결실로 인해 단백질막 포장(encapsidation)할 수 없다. 상기 헬퍼 단백질은 psi-양성 재조합 벡터를 포장하여 재조합 바이러스 스톡(stock)을 생성할 수 있다. 이러한 바이러스 스톡을 이용하여, 벡터를 표적 세포의 게놈내로 도입할 수 있다. 이용가능한 패키징 세포주가 다음문헌[상기 Coffin 등, 1997]에 요약되어 있다.A "packaging cell line" contains one or more of the retroviral gag, pol and env genes. These packaging cell lines produce the proteins needed to package retroviral DNA but cannot encapsidate protein membranes due to deletion of the psi region. The helper protein may package a psi-positive recombinant vector to produce a recombinant virus stock. Such viral stocks can be used to introduce vectors into the genome of target cells. Available packaging cell lines are summarized in Coffin et al., 1997, supra.

상기 렌티바이러스 그룹은 영장류 또는 비영장류로 나누어질 수 있다. 영장류 렌티바이러스의 예로는 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)가 있다. 비영장류 렌티바이러스 그룹으로는 원형 "슬로우 바이러스(slow virus)" 비스나/매디(visna/maedi) 바이러스(VMV), 및 관련된 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV), 말의 전염성 빈혈 바이러스(EIAV) 및 더욱 최근에 보고된 것으로 고양이의 면역결핍 바이러스(FIV) 및 소의 면역결핍 바이러스(BIV)가 있다. 예를 들어 다음문헌[Rovira 등, Blood. 2000; 96: 4111-4117; Reiser 등, J Virol. 2000 Nov; 74 (Mulder, M. P 등, (1995). Hum Genet 96 (2): 133-141): 10589; Lai 등, Proc Natl Acad Sci USA 2000 Oct 10; 97 (Southern, E. M. (1975). J. Mol. Biol 98, 503-517): 11297-302 ; 및 Saulnier 등, J Gene Med 2000 Sep-Oct; 2 (5): 317-25]을 참조한다.The lentiviral group can be divided into primates or non-primates. Examples of primate lentiviruses are human immunodeficiency virus (HIV), and apes immunodeficiency virus (SIV). Non-primate lentiviral groups include the prototype "slow virus" visna / maedi virus (VMV), and associated goat arthritis-encephalitis virus (CAEV), infectious anemia virus (EIAV) in horses and More recently reported are feline immunodeficiency virus (FIV) and bovine immunodeficiency virus (BIV). For example, Rovira et al., Blood. 2000; 96: 4111-4117; Reiser et al., J Virol. 2000 Nov; 74 (Mulder, M. P et al., (1995). Hum Genet 96 (2): 133-141): 10589; Lai et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000 Oct 10; 97 (Southern, E. M. (1975). J. Mol. Biol 98, 503-517): 11297-302; And Saulnier et al., J Gene Med 2000 Sep-Oct; 2 (5): 317-25.

상기 렌티바이러스류와 다른 유형의 레트로바이러스 사이의 차이는 렌티바이러스가 분열 및 비분열 세포 둘 모두를 감염시키는 능력을 갖는다는 것이다. 반면에, MLV와 같은 레트로바이러스는, 예를 들어 근육, 뇌, 폐 및 간 조직을 구성하는 것들과 같은 비분열 세포를 감염시킬 수 없다.The difference between the lentivirals and other types of retroviruses is that the lentiviral has the ability to infect both dividing and non-dividing cells. Retroviruses, such as MLVs, on the other hand, are unable to infect non-dividing cells such as those that make up muscle, brain, lung and liver tissues, for example.

레트로비리데의 렌티바이러스 아류의 다수 멤버에 기초한 다수의 벡터가 개발되어 왔으며 이들중 다수는 특허 출원의 주제이다(WO-A-98/18815; WO-A-97/12622). 바람직한 렌티바이러스 벡터는 HIV, SIV 또는 EIAV를 기재로 한다. HIV-1으로부터 제작되는 가장 간단한 벡터는 env 암호화 영역의 일부의 결실 및 nef 암호화 영역의 치환을 제외하고 완전한 HIV 게놈을 갖는다. 명백하게, 이들 벡터는 gag/pol 및 모든 보조 유전자를 발현하므로 감염성 바이러스 입자의 생성에 인벨로프만을 필요로한다. 보조 유전자중에서, vif, vpr, vpu 및 nef는 필수적인 것이 아니다.Numerous vectors have been developed based on a large number of members of the lentiviral subfamily of retrovirides, many of which are the subject of patent applications (WO-A-98 / 18815; WO-A-97 / 12622). Preferred lentiviral vectors are based on HIV, SIV or EIAV. The simplest vector constructed from HIV-1 has the complete HIV genome, excluding deletions of portions of the env coding region and substitution of the nef coding region. Clearly, these vectors express gag / pol and all accessory genes and therefore only require envelope for the production of infectious viral particles. Among the auxiliary genes, vif, vpr, vpu and nef are not essential.

HIV계 렌티바이러스 벡터의 한 가지 바람직한 형태는 HIV 5'LTR 및 선도인자(leader), 일부의 gag 암호화 영역 서열(패키징 기능을 제공하지 않음), 수용체 카세트, rev 반응 엘리먼트(RRE) 및 3'LTR 이다. 이러한 벡터에서, gag/pol, 보조 유전자 생성물 및 인벨로프 기능은 딘일 플라스미드로부터, 두 종 이상의 동시감염 플라스미드로부터 공급되거나 또는 벡터를 함유하는 세포를 HIV로서 동시감염시킴으로써 제공된다.One preferred form of HIV-based lentiviral vector is HIV 5'LTR and leader, some gag coding region sequences (not providing packaging function), receptor cassette, rev response element (RRE) and 3'LTR to be. In such vectors, gag / pol, accessory gene products and envelope functions are provided by diyl plasmids, from two or more co-infected plasmids or by co-infecting cells containing the vectors as HIV.

아데노바이러스는 RNA 중간체를 거치지 않는 이중가닥 선형 DNA 바이러스이다. 50종 이상의 인간 혈청형의 아데노바이러스가 있는데 이들은 유전자 서열 상동성을 기초로 6개의 아군으로 나누어지고 이들 모두는 비교가능한 유전자 조직을 나타낸다. 인간 아데노바이러스 그룹 C의 혈청형 2 및 5(95% 서열 상동성)가 아데노바이러스 벡터 시스템에서 가장 일반적으로 사용되고 젊은층에서 상부 호흡관 감염과 일반적으로 관련이 있다. Adenoviruses are double stranded linear DNA viruses that do not go through RNA intermediates. There are more than 50 human serotypes of adenoviruses, which are divided into six subgroups based on gene sequence homology, all of which represent comparable genetic tissue. Serotypes 2 and 5 (95% sequence homology) of human adenovirus group C are most commonly used in adenovirus vector systems and are generally associated with upper respiratory tract infections in young people.                 

본 발명에서 사용될 수 있는 아데노바이러스/아데노바이러스 벡터는 인간 또는 동물 기원일 수 있다. 인간 기원의 아데노바이러스에 관하여, 바람직한 아데노바이러스는 그룹 C로 분류되는 아데노바이러스, 특히 유형 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) 또는 12 (Adl2)의 아데노바이러스이다. 동물 기원의 여러가지 아데노바이러스중에서, 개의 아데노바이러스, 마우스의 아데노바이러스 또는 CELO 바이러스(Cotton 등, 1993, J Virol 67: 3777-3785)와 같은 새의 아데노바이러스가 이용될 수 있다.Adenovirus / adenovirus vectors that may be used in the present invention may be of human or animal origin. With respect to adenoviruses of human origin, preferred adenoviruses are adenoviruses classified in group C, in particular of type 2 (Ad2), 5 (Ad5), 7 (Ad7) or 12 (Adl2). Among various adenoviruses of animal origin, bird adenoviruses such as canine adenovirus, mouse adenovirus or CELO virus (Cotton et al., 1993, J Virol 67: 3777-3785) can be used.

HSV 벡터는 예를 들어 HSV1 또는 HSV2 균주 또는 이들의 유도체로부터 유도될 수 있다. 감독 균주(attenuated strain)의 예로는 ICP34.5에서 돌연변이를 가지는 균주 1716(MacLean 등, 1991, J Gen Virol 72: 632-639), 균주 R3616 및 R4009(Chou 및 Roizman, 1992, PNAS 89: 3266-3270) 및 R930(Chou 등, 1994, J. Virol 68: 8304-8311), 및 ICP27에서 결실은 갖는 d27-1(Rice 및 Knipe, 1990, J. Virol 64: 1704-1715)를 들 수 있다. 그렇지 않으면, ICP4, ICPO, ICP22, ICP6, ICP47, vhs 또는 gH가 결실되어 있거나 VMW65에서 불활성화 돌연변이를 갖거나 또는 이들중 어떤 조합을 갖는 균주를 이용하여 본 발명의 HSV 균주를 생성할 수도 있다.HSV vectors can be derived, for example, from HSV1 or HSV2 strains or derivatives thereof. Examples of attenuated strains include strain 1716 (MacLean et al., 1991, J Gen Virol 72: 632-639), strains R3616 and R4009 (Chou and Roizman, 1992, PNAS 89: 3266-) with mutations in ICP34.5. 3270) and R930 (Chou et al., 1994, J. Virol 68: 8304-8311), and d27-1 with deletions in ICP27 (Rice and Knipe, 1990, J. Virol 64: 1704-1715). Alternatively, strains with ICP4, ICPO, ICP22, ICP6, ICP47, vhs, or gH, with inactivation mutations in VMW65, or any combination thereof, may be used to generate the HSV strain of the present invention.

각종 HSV를 설명하는데 사용된 용어법은 다음문헌[Coffin 및 Latchman, 1996. Herpes simplex virus-based vectors, Latchman DS (ed). Genetic manipulation of the nervous system. Academic Press: London, pp 99-114]에서 설명되는 바와 같다. The terminology used to describe various HSVs is described in Coffin and Latchman, 1996. Herpes simplex virus-based vectors, Latchman DS (ed). Genetic manipulation of the nervous system. Academic Press: London, pp 99-114.                 

또한, 본 발명에서는 바큘로바이러스 벡터를 이용할 수도 있다. 바큘로바이러스 오토그래파 칼리포니카 핵다각체병 바이러스(ACMNPV)는 특정 레피돕테란(lepidopteran) 곤충의 세포에서만 복제할 수 있는 DNA 바이러스로서, 곤충 세포에서 재조합 단백질의 발현에 광범위하게 사용되어 왔다. ACMNPV와 같은 바큘로바이러스는, 간종양 세포주와 같은 포유동물 세포 및 상피 세포에 이종 DNA를 고효율로 도입하기 위하여 최근에 사용되어 왔다(Boyce FM, Bucher NL (1996) Baculovirus -mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci USA 93,2348-52; Airenne KJ, Hiltunen MO, Turunen MP, Turunen AM, Laitinen OH, Kulomaa MS, Yla- Herttuala S (2000) Baculovirus -mediated periadventitial gene transfer to rabbit carotid artery. Gene Ther 7,1499-1504). 또한, 유전자 전달을 위한 벡터, 이종 DNA를 게놈내로 도입하기 위한 방법 및 곤충 세포 배지에서 재조합 바이러스 생성 방법이 상업적으로 이용가능하며, 또한, 바큘로바이러스는 포유동물 세포에서는 일반적으로 복제할 수 없으므로 이러한 용도로 조작할 필요가 없다.In the present invention, baculovirus vectors can also be used. Baculovirus autographer californica nuclear polykeratoma virus (ACMNPV) is a DNA virus that can only replicate in cells of certain lepidopteran insects, and has been widely used for expression of recombinant proteins in insect cells. Baculoviruses, such as ACMNPV, have recently been used to efficiently introduce heterologous DNA into mammalian cells such as liver tumor cell lines and epithelial cells (Boyce FM, Bucher NL (1996) Baculovirus -mediated gene transfer into mammalian cells). . Proc Natl Acad Sci USA 93,2348-52; . Airenne KJ, Hiltunen MO, Turunen MP, Turunen AM, Laitinen OH, Kulomaa MS, Yla- Herttuala S (2000) Baculovirus -mediated periadventitial gene transfer to rabbit carotid artery Gene Ther 7,1499-1504). In addition, vectors for gene transfer, methods for introducing heterologous DNA into the genome, and methods for producing recombinant viruses in insect cell media are also commercially available, and baculoviruses are also generally not able to replicate in mammalian cells. There is no need to operate for the purpose.

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 벡터의 제작에는 통상적인 라이게이션 방법을 이용할 수 있다. 분리된 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 DNA 단편이 분열 및 재단되고, 필요한 플라스미드를 발생하기에 바람직한 형태로 다시 라이게이션된다. 필요한 경우, 제작된 벡터에서 정확한 서열을 확인하기 위한 분석이 공지의 방식으로 수행한다. 전위인자의 존재 및/또는 이동은, 전위인자에 존재하는 서열에 기초할 수 있는 적절히 표지된 프로브를 이용하여, 예를 들어 통상적인 서던 블로팅, 도트 블로팅, PCR 또는 원위치 하이브리디제이션(in situ hybridization)을 통해 세포내에서 직접 측정할 수 있다. 당업자는 이러한 방법들을 필요에 따라 어떻게 변형할 수 있는 지를 쉽게 알 수 있다. 본 발명에서 유용한 벡터는 전술한 바와 같은 전위인자의 동정 및 위치측정을 용이하게 하기 위하여 마커 유전자를 구비하는 것이 유익하다.Conventional ligation methods can be used to produce vectors for use in the methods of the present invention. The isolated viral vector, plasmid or DNA fragment is cleaved and cut and ligated back into the desired form to generate the required plasmid. If necessary, an assay to identify the correct sequence in the constructed vector is performed in a known manner. The presence and / or movement of the translocation factor can be determined using, for example, conventional Southern blotting, dot blotting, PCR or in situ hybridization using appropriately labeled probes that can be based on sequences present in the translocation factor. It can be measured directly in the cell through situ hybridization. One skilled in the art can readily see how these methods can be modified as needed. Vectors useful in the present invention are advantageously provided with a marker gene to facilitate identification and localization of translocation factors as described above.

본 발명의 사용Use of the present invention

본 발명의 방법은 하나 이상의 개체 돌연변이에 상동인 하나 이상의 세포 개체군을 포함하는 형질전환된 배아 및 생물체를 발생할 수 있다. 따라서, 세포 클러스터, 조직(들) 또는 기관 또는 기관들의 그룹이 각각 동일한 유전자 변형을 가지는 형질전환된 배아 및 동물을 생성할 수 있다. 다수의 세포, 조직 또는 기관에서 동일한 유전자 변형이 존재하면, 상기 변형의 표현형 및 유전형 분석이 편리하게 되는 외에도, 해당하는 야생형 유전자와 비교될 특정 유전자 변형의 효과 또는 실제로 동일 생물체내의 세포, 조직 또는 기관에서 기타 유전자 변형의 효과를 비교하는 것이 가능하게 된다.The methods of the invention can result in transformed embryos and organisms comprising one or more cell populations homologous to one or more individual mutations. Thus, cell clusters, tissue (s) or organs or groups of organs can each produce transformed embryos and animals with the same genetic modifications. The presence of the same genetic modification in multiple cells, tissues or organs, in addition to making phenotypic and genotyping of the modification convenient, the effect of the particular genetic modification to be compared with the corresponding wild type gene or in fact the cells, tissues or organs in the same organism. It is possible to compare the effects of other genetic modifications in.

또한, 본 발명을 이용하여, 배아 발생 동안 성숙한 세포 및 조직에서 검출될 수 있는 변형된 유전자의 발현 양상을 검출할 수 있다.In addition, the present invention can be used to detect expression patterns of modified genes that can be detected in mature cells and tissues during embryonic development.

전위인자, 및 전위인자가 절제된 부위는 서열분석을 통해 동정할 수 있다. 예를 들어, 미노스는 TA 염기쌍에 도입되고, 절제시에, 표적 TA 서열의 복제로 이루어지는 족적(footprint)을 남기면서, 전위인자의 4개의 말단 누클레오티드에 인접한다. 미노스 서열, 이의 족적, 또는 관련된 서열의 존재는 서열분석, PCR 또는 하이브리디제이션 등의 방법을 통해 검출할 수 있다. The translocation factor and the site from which the translocation factor was excised can be identified through sequencing. For example, minos are introduced into the TA base pair and, upon ablation, are adjacent to the four terminal nucleotides of the translocation factor, leaving a footprint consisting of the replication of the target TA sequence. The presence of minos sequences, their feet, or related sequences can be detected through methods such as sequencing, PCR, or hybridization.                 

삽입된 전위인자는, 예를 들어 말단 반복 서열에 상보적인 PCR 프라이머를 이용하여 유사한 방법을 통해 동정할 수 있다.Inserted translocation factors can be identified through similar methods, for example, using PCR primers complementary to terminal repeat sequences.

본 발명은 예정된 발달 단계에서 유전자를 정밀하게 조정한 다음 전위인자를 이용하여 검출함으로써 게놈의 기능적인 지도작성(mapping)을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은 생물체의 하나 이상의 세포 게놈내로의 효율적인 세포내 전위인자 이동 및 삽입을 제공함으로써, 초기 발달 단계에서 형질전환된 생물체의 세포에 엑손 트래핑 기능성을 제공한다. 이러한 배아 발달 단계에서 전위인자 이동을 유도하면, 전위된 유전자에 상동인 세포 또는 조직의 클러스터를 발생할 수 있다. 따라서, 변형된 유전자의 표현형 변화를 신속하고 효율적으로 검출할 수 있거나 및/또는 변형된 유전자를 신속하게 동정할 수 있다.The present invention enables functional mapping of the genome by precisely adjusting genes at predetermined developmental stages and then detecting them using translocation factors. Accordingly, the present invention provides efficient intracellular translocation factor migration and insertion into one or more cellular genomes of an organism, thereby providing exon trapping functionality to the cells of the transformed organism at an early stage of development. Inducing translocation factor migration at this stage of embryonic development can result in clusters of cells or tissues homologous to the translocated gene. Thus, phenotypic changes in modified genes can be detected quickly and efficiently and / or modified genes can be identified quickly.

적당한 트랩 작제물의 일례가 도 12에서 도시되어 있다.One example of a suitable trap construct is shown in FIG. 12.

본 발명의 유익한 구현예에서는 유전자를 세포 또는 조직 그룹의 기능적 유전자 분석을 위해 표지하거나, 또는 전위인자 삽입을 통해 녹아웃한 다음, 비용이많이들며 시간 소모적인 유전자 분석 및 상당한 서열분석을 필요로 하지 않고 전위인자 "태그"(tag)를 통해 유전자를 특이적으로 분석할 수 있다.In an advantageous embodiment of the invention, the gene is labeled for functional gene analysis of a cell or tissue group, or knocked out via translocation insertion, and then does not require costly and time consuming gene analysis and significant sequencing. Transient factor “tags” allow for the specific analysis of genes.

본 발명의 그 밖의 구현예는 형질전환된 마우스와 같은 형질전환된 생물체의 라이브러리의 발생을 제공한다. 표적 유전자는 하나 이상의 세포, 조직 또는 기관의 표현형에 따라 표현형적으로 동정할 수 있고, 전위인자 삽입 부위의 측정을 통해 유전적으로 동정할 수 있다. 전술한 유도성 발현 시스템을 이용하여, 유전자의 일부와 안티센스-유도 녹아웃 사이의 연결(switch)을 조절할 수 있다. 전위인자가 삽입된 신체 세포는 예를 들어 표준 방법을 통해 불멸 세포주를 유도하거나 또는 핵 이식 방법을 통해 형질전환된 동물주를 발생함으로써 불멸화될 수 있다.Other embodiments of the invention provide for the generation of libraries of transformed organisms, such as transformed mice. Target genes can be identified phenotypically according to the phenotype of one or more cells, tissues or organs, and can be genetically identified through measurement of translocation factor insertion sites. The inducible expression system described above can be used to regulate the switch between a portion of a gene and antisense-induced knockout. Body cells into which a translocation factor has been inserted can be immortalized, for example, by inducing immortal cell lines through standard methods or by generating transformed animal lines via nuclear transfer methods.

이러한 라이브러리는 유전자 회합의 표현형 분석 및 동정에 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 기존 방법 이상으로 이점을 가진다.Such libraries can be used for phenotypic analysis and identification of gene associations. The method of the present invention has advantages over existing methods.

혈우병, 낭포성 섬유종, 및 근위 영양증과 같은 유전병의 경우, 단일 유전자의 잘 정의된 돌연변이 또는 이의 조절 엘리먼트는 감염된 개체의 생활 스타일에 매우 영향을 미치는 임상학적 결과를 갖는 부적절한 유전자 발현을 초래한다.In the case of genetic diseases such as hemophilia, cystic fibrosis, and proximal nutrition, well-defined mutations of a single gene or regulatory elements thereof result in inappropriate gene expression with clinical consequences that greatly affect the lifestyle of the infected individual.

그러나, 기타 질병, 특히 치매 및 정신병과 같은 노화 관련 질병; 정신분열증 및 조울증과 같은 정신병 증상; 뼈 및 관절 관련 염증 질환; 비만, 인슐린 저항성, 제2 형 당뇨병, 및 관련된 혈관 및 심혈관 질환에 있어서, 유전자 엘리먼트는 더욱 복잡하고 아직도 불충분하게 규명되어 있다(Lander 및 Schork, Science (1994) 265, 2037-2048 참조).However, other diseases, especially aging-related diseases such as dementia and psychosis; Psychotic symptoms such as schizophrenia and manic depression; Bone and joint related inflammatory diseases; For obesity, insulin resistance, type 2 diabetes, and related vascular and cardiovascular diseases, genetic elements are more complex and still insufficiently identified (see Lander and Schork, Science (1994) 265, 2037-2048).

표적을 상이하게 하는데 있어서의 다중 돌연변이가 질병 발병의 시기(예, 폐경기후 인슐린 저항성) 및 질병 상태의 심각성(예, 혈관병 및 스트로크의 전상태)과 같은 인자를 결정하는 경우, 광범위한 ES 세포 라이브러리의 단일 유전자 결실로부터 발생된 형질전환된 마우스 및 동종번식 마우스 종의 무작위 알킬화에 기초한 방법은 실패로 끝나게 된다.Extensive ES cell library when multiple mutations in different targets determine factors such as timing of disease onset (eg postmenopausal insulin resistance) and severity of disease state (eg pre-vascular disease and stroke) Methods based on random alkylation of transformed and allogeneic mouse species resulting from a single gene deletion of ended in failure.

본 발명은, 질병상태에 민감하므로 상관 질병 유발 유전자에서 기존의 돌연변이를 가지기 쉬운 배경(background)으로부터 출발하여 무작위적으로 표지된 마우스의 신속한 발생을 통해 더욱 효과적인 방법을 제공한다. 상기 배경은 알려진 통합 부위에서 다중 휴면 전위인자를 갖는 세포주를 이용하여 선택할 수 있다. 트랜스포사제의 조절가능한 활성으로 인해, 상이한 질병 모델을 반영하는 상이한 유전자 배경에서 마우스 라이브러리의 신속한 발생이 가능하게 된다.The present invention provides a more effective method through the rapid development of randomly labeled mice starting from the background that are susceptible to disease state and susceptible to existing mutations in the correlated disease causing genes. The background can be selected using a cell line with multiple dormant translocation factors at known integration sites. The controllable activity of transposase allows for the rapid development of mouse libraries in different genetic backgrounds that reflect different disease models.

예를 들어, 인슐린 수용체의 돌연변이는 마우스의 유전자 배경에 따라 약한 고인슐린혈증내지 심한 고인슐린혈증을 유발한다는 것이 확인되었다(Kido (2000) Diabetes 49,589-596 참조). 따라서, 약한 표현형의 마우스 배경에서 생체내 유전자 전위 기술을 이용하여 표지 마우스 라이브러리를 이용하면, 더욱 심한 표현형을 갖는 동물을 선택할 수 있다. 다음에, 새로운 전위 사건발생부에 접해있는 DNA 서열을 분석하면, 중증 표현형의 개시에 기여하는 유전자를 유발하는 새로운 후보 질병을 확인할 수 있다.For example, mutations in the insulin receptor have been shown to cause weak hyperinsulinemia or severe hyperinsulinemia, depending on the genetic background of the mouse (see Kido (2000) Diabetes 49,589-596). Thus, using a labeled mouse library using in vivo gene transposition techniques in a weak phenotype mouse background, animals with more severe phenotypes can be selected. Next, by analyzing the DNA sequence in contact with the new translocation event generation region, it is possible to identify new candidate diseases causing genes that contribute to the onset of a severe phenotype.

다음에, 후보 질병 유전자는 동물 모델에서 그의 정확한 역할을 측정하고 인간에 있어서 질병 관련 역할을 확인하기 위한 그 밖의 연구의 초점이 될 수 있다.Candidate disease genes can then be the focus of other research to measure their exact role in animal models and to identify disease-related roles in humans.

인간에 있어서 표적을 확인하는 데는 관련 환자 및 무처리군에 관한 DNA 및 임상학적 정보를 포함하는 기존의 임상적 및 유전적 데이터베이스를 이용하게 된다.Target identification in humans will use existing clinical and genetic databases that include DNA and clinical information about relevant patients and untreated groups.

발생되는 형질전환된 생물체의 표현형을 분석하는 것은 오줌, 혈액, 척수액 또는 조직에 존재하는 대사산물, 단백질(예, 인슐린), 지질 또는 탄수화물(글루코스 내성을 측정할 때)의 변화를 포함한 간단하고 신속한 측정을 통해 이루어질 수 있다. 체액의 측정은 NMR, Elisa, GMS 등에 의한 측정을 포함한 당업자에게 알려진 다수의 방법중 어느 방법을 통해 달성될 수 있다. Analyzing the phenotype of the resulting transformed organism is simple and rapid, including changes in urine, blood, spinal fluid, or metabolites, proteins (eg insulin), lipids or carbohydrates (when measuring glucose resistance) present in the tissues. Can be achieved through measurement. Measurement of body fluids can be accomplished through any of a number of methods known to those skilled in the art, including measurements by NMR, Elisa, GMS, and the like.                 

다른 표현형 특질은, 빛, 소리, 메모리 및 스트레스 상태와 같은 테스트를 이용하여 외부 자극에 대한 행동 양상 또는 반응을 측정함으로써 분석할 수 있다. Other phenotypic traits can be analyzed by measuring behavioral patterns or responses to external stimuli using tests such as light, sound, memory and stress states.

기타 측정가능한 표현형 특질로는 예를 들어 체중, 지방분, 및 성장 속도를 평가하여 측정할 수 있는 것으로, 성장 및 노화 파라미터, 종양 성장, 비만 등이 있다. 또한, 혈압, 심장 속도, 폐기능 등과 같은 기타 측정가능한 특징의 변화를 평가할 수 있다.Other measurable phenotypic traits can be measured, for example, by assessing weight, fat content, and growth rate, including growth and aging parameters, tumor growth, obesity, and the like. In addition, changes in other measurable features such as blood pressure, heart rate, lung function, and the like can be assessed.

본 발명의 전위인자 기술은 대량 저장의 필요성이 없이 형질전환된 동물의 라이브러리의 생성을 가능하게 하는 이점이 있다. 형질전환된 동물을 발생하는 종래의 방법은 돌연변이가 발생되는 화학적 돌연변이 유발과 같은 방법을 포함한다. 이러한 방법은 동물(예, 마우스)마다 다수의 돌연변이를 포함한다. 일단 발생된 동물은 그 표현형이 분석된 다음, 차후의 사용을 위해 보관/저장될 수 있다. 본 발명은 게놈내로 삽입된 상이한 전위인자를 갖는 출발 세포주 또는 출발 형질전환된 생물체의 발생을 가능하게 한다. 다음에, 이러한 세포주 또는 생물체는 트랜스포사제를 가지는 형질전환된 동물과 함께 증식됨으로써 새로운 라이브러리가 발생된다.The transgenic technology of the present invention has the advantage of allowing the generation of libraries of transformed animals without the need for mass storage. Conventional methods of generating transformed animals include methods such as chemical mutagenesis in which mutations are generated. This method involves multiple mutations per animal (eg mouse). Once generated, the phenotype can be analyzed and then stored / stored for future use. The present invention enables the generation of starting cell lines or starting transformed organisms having different translocation factors inserted into the genome. This cell line or organism is then propagated with the transformed animal with the transposase to generate a new library.

또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 그 게놈 도처에 분포된 상이한 전위인자 삽입물을 갖는 ES 세포의 라이브러리를 발생하는데 사용할 수 있다. 이러한 라이브러리는 서열분석 및 특성화될 수 있다. 상기 ES 세포는 차후의 사용을 위해 편리하게 저장될 수 있다.In another embodiment, the methods of the invention can be used to generate a library of ES cells with different translocation factor inserts distributed throughout the genome. Such libraries can be sequenced and characterized. The ES cells can be conveniently stored for future use.

변형예에서, 본 발명의 방법은 그 발현이 외부 자극에 의해 조절되는 유전자를 표지하는데 이용될 수 있다. 따라서, 전위인자 이동에 노출되어진 배아, 생물체 또는 조직 또는 세포는 후보 약물 또는 기타 테스트 물질과 같은 외부 자극에 의해 처리되고, 마커 발현의 조절이 관찰된다. 마커가 과도 또는 과소 발현되는 세포는 자극에 반응하여 상향 또는 하향 조절되는 유전자내에 또는 그 근처에 삽입되는 전위인자를 가질 수 있다. 따라서, 본 발명은, 인핸서 또는 엑손과의 근접에 의하여 그 발현 수준이 조절되는 마커 유전자를 포함하는 전위인자를 삽입함으로써 생체내 인핸서 트랩 및 엑손 트랩 기능을 제공하기 위하여 사용할 수 있다.In a variant, the methods of the invention can be used to label genes whose expression is regulated by external stimuli. Thus, embryos, organisms or tissues or cells exposed to translocation shift are processed by external stimuli such as candidate drugs or other test substances, and regulation of marker expression is observed. Cells in which the marker is over or underexpressed may have translocations inserted into or near genes that are up or down regulated in response to stimulation. Accordingly, the present invention can be used to provide an enhancer trap and exon trap function in vivo by inserting a translocation factor comprising a marker gene whose expression level is regulated by proximity to an enhancer or exon.

이러한 방법은 독물학적 연구 및 약물 발굴 방법 등에서 약물에 의한 유전자 조절의 연구에 유용하다. 또한, 이것은 호르몬, 시토킨 및 성장 인자와 같은 자연적 자극에 반응하는 유전자 조절의 연구, 및 인간, 식물 또는 동물에서 질병 치료용 표적을 포함한 분자 간섭용 표적의 동정, 살충제, 제초제, 항균제 및 살균제의 개발에 적용할 수 있다.This method is useful for the study of gene regulation by drugs in toxicological studies and drug discovery methods. In addition, it can be used for the study of gene regulation in response to natural stimuli such as hormones, cytokines and growth factors, and for the identification of targets for molecular interference, including targets for the treatment of diseases in humans, plants or animals, as well as Applicable to development.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에서 예시의 목적으로 더욱 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail for the purpose of illustration in the following examples.

실시예Example

A: A: 독시사이클린을Doxycycline 이용한  Used 생체내In vivo 미노스의Minos 활성화 Activation

실시예Example 1: 전위인자를 가지는 마우스 및  1: mouse with translocation factor and 트랜스포사제를Transposase 가지는 마우스의 발생 Outbreak of the mouse

두 개의 형질전환된 마우스 계열을 발생시킨다. 전위인자를 가지는 계열(MCG 계열)은 거대세포바이러스 프로모터의 조절하에서 GFP 유전자를 함유하는 미노스 전위인자를 함유하는 단편의 직렬 어레이를 포함한다. 상기 전위인자는 역반복체 내부의 거의 모든 서열이 CMV/GFP 카세트로 치환되도록 조작한다. 전위인자-암호화 유전자를 포함하지 않으므로, 이러한 전위인자는 비자율적이고, 트랜스포사제의 소오스가 존재하는 경우에만 이동할 수 있다. 상기 제 2 형질전환된 마우스 계통은 유도성 프로모터의 조절하에서 발현되는 미노스 트랜스포사제 유전자를 함유한다.Two transformed mouse strains are generated. The family of translocation factors (MCG family) includes a serial array of fragments containing Minos translocation factors containing the GFP gene under the control of the cytomegalovirus promoter. The translocation factor is engineered so that almost all sequences inside the inverse repeat are replaced with a CMV / GFP cassette. Since it does not include transposer-encoding genes, these transmutators are non-autonomous and can only migrate if the source of the transposase is present. The second transformed mouse strain contains a minos transposase gene that is expressed under the control of an inducible promoter.

전위인자 MiCMVGFP를 하기와 같이 제작했다: 플라스미드 pMILRTetR (Klinakis 등, (2000) Ins. Mol. Biol. 9,269-275 (2000b)를 BamHI로 절단하고 다시 라이게이션하여 미노스 말단들 사이의 테트라사이클린 내성 유전자를 제거하여, 플라스미드 pMILR△BamH1을 얻었다. 디. 히데이(D. hydei)로부터의 미노스 역반복체 및 최초 인접 서열을 함유하는 것으로 pMILR△BamH1로부터의 Asp 718/SacI 단편을 플라스미드 pPolyIII-I-lox (loxP 올리고: ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT를 벡터 pPolyIII-I (accession No. M18131)의 Asp718 부위내로 삽입하여 얻음)으로 클로닝하여, 플라스미드 ppolyMILR△BamH를 얻었다. CMV 프로모터에 의해 구동되는 교화된 GFP 유전자(Clontech 플라스미드 pHGFP-S65T로부터 얻음)에 연이어 SV40 간섭 서열 및 폴리아데닐화 신호 서열을 함유하는, 플라스미드 pBluescriptGFP의 2.2kb SpeI 단편을 ppolyMILR△BamH의 Spe I 부위내로 삽입하여, 형질전환된 마우스의 발생에 사용되는 최종 작제물(pMiCMVGFP, 도 5)을 얻었다.The translocation factor MiCMVGFP was constructed as follows: The plasmid pMILRTetR (Klinakis et al., (2000) Ins. Mol. Biol. Biol. 9,269-275 (2000b) was cleaved with BamH I and ligated again to tetracycline resistance genes between minus ends. to remove, to give the plasmid △ pMILR BamH 1. D. hideyi (D. hydei) the Minos station repeats, and Asp 718 / Sac I fragment of that from pMILR △ BamH 1 containing a first contiguous sequence from plasmid pPolyIII- Cloning with I-lox ( loxP oligo: ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT was obtained by inserting into the Asp 718 site of vector pPolyIII-I (accession No. M18131)) to obtain plasmid ppolyMILRΔ Bam H. Crosslinked GFP gene driven by CMV promoter (Following from Clontech plasmid pHGFP-S65T) ppol 2.2 kb Spe I fragment of plasmid pBluescriptGFP containing SV40 interference sequence and polyadenylation signal sequence Insertion into the Spe I site of yMILRΔ Bam H yielded the final construct (pMiCMVGFP, FIG. 5) used for the generation of transformed mice.

pMiCMVGFP 플라스미드의 3.2kb XhoI 단편을 FVB X FVB 수정 난모세포내로 미세주입하여 전위인자-함유 MCG 계통을 제작했다. GFP DNA를 프로브로서 이용하여, 꼬리 생검(tail biopsy)의 DNA의 서던 블로팅을 통해 형질전환된 동물을 확인했다.A 3.2 kb Xho I fragment of the pMiCMVGFP plasmid was microinjected into FVB X FVB fertilized oocytes to prepare a translocation factor-containing MCG lineage. Transformed animals were identified by Southern blotting of tail biopsy DNA using GFP DNA as a probe.

표준 상동성 재조합 ES 세포 기술을 이용하여 트랜스포사제 유전자를 배아 줄기 세포내로 도입하여 트랜스포사제-함유 계통을 발생한다. ES 세포를, 표준 과정(Manipulating the mouse embryo, Hogan 등, Cold Spring Harbor Press, 1994)을 통해 배반포내로 주입하여 형질전환된 동물을 얻는다. 두 작제물을 사용하는데, 제 1의 작제물은 표적 세포에서 발현되는 항시적 프로모터하에서 rtTA 유전자를 함유하는 작제물이다. 이와 같이 사용되는 작제물은, 거대세포바이러스 초기(CMV) 프로모터의 조절하에서 rtTA 활성인자를 암호화하는 유전자를 함유하는 pPet-On 플라스미드(Clontech)이다. 이러한 작제물에 의해 암호화되는 rtTA 전사 활성인자는 독시사이클린의 존재하에서만 활성이 있다. 제 2의 작제물은 테트라시이클린 반응 엘리먼트(TRE)의 조절하에서 미노스 트랜스포사제 유전자를 함유한다. 상기 TRE는 tet 작동인자(TETO)를 함유하는 42-bp 서열의 7 개의 직접 반복체로 구성되고, CMV 초기 프로모터와 정상적으로 회합하는 인핸서 엘리먼트가 결핍된 최소 CMV 프로모터의 바로 상류측에 위치한다. 이러한 인핸서 엘리먼트가 누락되어 있기 때문에, rtTA에 의한 결합의 부재하에서는 TRE로부터 트랜스포사제의 누출 발현이 없다. 이러한 제 2 작제물은 그의 다중 클로닝 부위(MCS)에 미노스를 암호화하는 유전자가 삽입되어 있는 pTRE2 플라스미드(Clontech)이다. 이러한 두 작제물로 안정적으로 형질전환된 세포에서, rtTA가 발현되지만, 이러한 rtTA는 독시사이클린(0.1-1㎍/ml)이 배지에 첨가되지 않는 경우에는 미노스 트랜스포사제의 전사를 활성하지 않는다.The transposase genes are introduced into embryonic stem cells using standard homologous recombinant ES cell techniques to generate the transposase-containing lineage. ES cells are injected into blastocysts via standard procedures (Manipulating the mouse embryo, Hogan et al., Cold Spring Harbor Press, 1994) to obtain transformed animals. Two constructs are used, the first construct being a construct containing the rtTA gene under a constitutive promoter expressed in the target cell. The construct used as such is a pPet-On plasmid (Clontech) containing a gene encoding a rtTA activator under the control of a cytomegalovirus early (CMV) promoter. The rtTA transcriptional activator encoded by this construct is active only in the presence of doxycycline. The second construct contains a minos transposase gene under the control of the tetracycline response element (TRE). The TRE consists of seven direct repeats of the 42-bp sequence containing the tet effector (TETO) and is located immediately upstream of the minimum CMV promoter lacking an enhancer element that normally associates with the CMV early promoter. Since these enhancer elements are missing, there is no leakage of transposase from the TRE in the absence of binding by rtTA. This second construct is the pTRE2 plasmid (Clontech) with a gene encoding minos at its multiple cloning site (MCS). In cells stably transformed with these two constructs, rtTA is expressed, but this rtTA does not activate transcription of minos transposase unless doxycycline (0.1-1 μg / ml) is added to the medium.

트랜스포사제 cDNA 단편을 프로브로 이용하여, 꼬리 생검의 DNA를 서던 블로팅하여 형질전환된 동물을 확인한다.Transfected cDNA fragments are used as probes to identify the transformed animals by Southern blotting the DNA of the tail biopsy.

실시예Example 2:  2: 생체내In vivo 미노스Minos 활성화 Activation

전위인자 함유 MCG 계통의 형질전환된 마우스를 트랜스포사제 함유 계통의 형질전환된 마우스와 교잡한다. 전위인자 및 상기 전위인자를 암호화하는 유전자 모두를 그 게놈내에서 포함하는 얻어지는 배아내에서 전위인자가 이동하는 것은 독시사이클린의 존재하에서만 일어나게 된다. 독시사이클린은 모계동물의 식수에 용해된 형태로 배아에 투여된다. 잠재적인 전위 사건발생 수를 제한하기 위하여, 독시사이클린은 한정된 시간 동안(임신중 하루 내지 이틀)만 투여한다.Transgenic mice of the transgene containing MCG line are hybridized with transgenic mice of the transposase containing line. The shift of the translocation factor in the resulting embryo containing both the translocation factor and the gene encoding the translocation factor in its genome only occurs in the presence of doxycycline. Doxycycline is administered to embryos in dissolved form in the maternal animal's drinking water. To limit the number of potential translocation events, doxycycline is administered only for a limited time (one to two days of pregnancy).

출생시, 상기 배아로부터 발생한 형질전환된 자손을 분리하고 여러가지 세포 및 조직을 유전형 분석에 사용한다.At birth, the transformed offspring resulting from the embryo are isolated and various cells and tissues are used for genotyping.

실시예Example 3:전위의 검출 3: detection of potential

상기 작제물내의 미노스 전위인자와 인접하는 비이동성 초파리 서열에 교배되는 프라이머를 이용하여, 쥐의 조직에서 미노스 트랜스포사제에 의해 활성 전위를 검출하기 위하여 전위인자 절제용 PCR 분석을 이용한다(Klinakis 등, (2000) Ins. Mol. Biol. 9,269-275). 초파리 세포에서, 미노스 트랜스포사제-매개 절제후, 특징적인 6개 염기쌍 족적을 남기는 염색분체를 회복시킨다(Arca 등, (1997) Genetics 145, 267-279). 특정 쌍의 프라이머를 PCR 분석에 이용하면, 진단용 167bp PCR 단편이 얻어진다 (Catteruccia F. 등, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,2157- 2162). Using primers crossed to non-moving Drosophila sequences contiguous with the Minos translocation factor in the construct, PCR assays for translocation factor ablation are used to detect active potential by Minos transposase in rat tissue (Klinakis et al. (2000) Ins. Mol. Biol. 9,269-275). In Drosophila cells, after minos transposase-mediated ablation, chromosomes are recovered that leave characteristic six base pair traces (Arca et al., (1997) Genetics 145, 267-279). Using a specific pair of primers for PCR analysis yields a diagnostic 167 bp PCR fragment (Catteruccia F. et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97,2157-2162).                 

DNeasy 조직-키트(QIAGEN)를 제조자의 지시에 따라 이용하여 상이한 조직으로부터 게놈 DNA를 분리한다. 프라이머 11 DML: (5'AAGTGTAAGTGCTTGAAATGC-3') 및 GOUM67: (5'-GCATCAAATTGAGTTTTGCTC-3')을 이용하여, PCR 반응을 실시한다. PCR 조건은 다음과 같다: 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 50 mM KCl, 1. 5 mM MgCl₂, 0.001% 젤라틴; 25 UL 반응당 1.2 유니트 Taq 2000^TM DNA 폴리머라제(STRATAGENE), 200g 주형 DNA 및 10 pmol의 각 프라이머. 각 사이클이 94 ℃에서 30초, 59 ℃에서 30초 및 72℃에서 30초로 이루어지는 43 또는 60 사이클을 실시한다. PCR 산물을 PCRII TA 클로닝 벡터(Invitrogen)내로 클로닝하고 T7 프라이머를 이용하여 서열화한다.DNeasy tissue-kit (QIAGEN) is used according to the manufacturer's instructions to separate genomic DNA from different tissues. PCR reactions are carried out using Primer 11 DML: (5'AAGTGTAAGTGCTTGAAATGC-3 ') and GOUM67: (5'-GCATCAAATTGAGTTTTGCTC-3'). PCR conditions were as follows: 10 mM Tris-HCl (pH 8.8), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl ₂ , 0.001% gelatin; 1.2 units Taq 2000 ^™ DNA polymerase (STRATAGENE), 200 g template DNA and 10 pmol of each primer per 25 UL reaction. Each cycle is followed by 43 or 60 cycles consisting of 30 seconds at 94 ° C, 30 seconds at 59 ° C, and 30 seconds at 72 ° C. PCR products are cloned into PCRII TA cloning vectors (Invitrogen) and sequenced using T7 primers.

진단용 띠가 상기 형질전환된 자손의 특정 조직에서 존재한다. 상기 증폭된 서열에 특이적인 표지 DNA 프로브를 이용하여 서던 블럿 분석을 통해 상기 단편의 정체를 확인한다(결과 미도시). 세포들의 클러스터는 동일한 전위된 유전자에 상동인 것으로 나타난다.Diagnostic bands are present in specific tissues of the transformed offspring. The identity of the fragment is confirmed by Southern blot analysis using a labeled DNA probe specific for the amplified sequence (result not shown). Clusters of cells appear to be homologous to the same translocated gene.

B: B: ZPZP 3 프로모터의 3 of the promoter 조절하에서Under control 트랜스포사제를Transposase 이용한  Used 생체내In vivo 미노스Minos 활성화 Activation

실시예Example 4 4

이 실시예에서는, 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 특정 발달 단계에서 생성되는 유전자 조절 신호의 조절하에 있게 함으로써, 상기 배아 발달 단계에서 전위가 유도될 수 있음을 입증한다. 이 실시예에서는, 트랜스포사제를 암호화하는 유전자를 ZP3 프로모터의 조절하에 있게 함으로써 트랜스포사제가 2-3 주 난형성 기간 동안에 성장하는 난모세포에서만 발현되도록 하였다. 성장하는 난모 세포에서 발현되는 미노스 트랜스포사제는 변형된 비자율성 미노스 전위인자의 절제를 촉매하고, 상기 게놈의 새로운 부위내로 그의 도입을 촉진했다.In this example, it is demonstrated that translocation can be induced in the embryonic development stage by bringing the expression of the gene encoding the transposase under the control of the gene regulatory signals produced in the specific developmental stage. In this example, the gene encoding the transposase was left under the control of the ZP3 promoter so that the transposase was expressed only in oocytes growing during the 2-3 week oocyte formation period. Minos transposase expressed in growing oocytes catalyzed the ablation of the modified non-autonomous Minos translocation factor and facilitated its introduction into a new site of the genome.

도 11은 트랜스포사제가 정자내의 전위를 위해 내인성 정자 특이적 H1t 유전자에 삽입되어 있는 대안의 작제물(녹인(knock-in) 및 규칙적 유전자도입을 위한 작제물)을 도시한다. 이러한 대안의 작제물은, Zp3(알(egg) 특이적으로 발현됨) 또는 hnRNP(편재적으로 발현됨) 유전자의 출발 부위에 인접한 대응하는 서열로 Hlt 서열을 치환함으로써 알 특이적 발현 또는 편재 발현용으로 제작된다.FIG. 11 depicts alternative constructs (knock-in and constructs for regular transduction) in which a transposase is inserted into an endogenous sperm specific H1t gene for translocation in sperm. Such alternative constructs are known to have a specific or ubiquitous expression by substituting the Hlt sequence with a corresponding sequence adjacent to the starting site of the Zp3 (egg specifically expressed) or hnRNP (locally expressed) gene. Made for dragons.

C: C: 미노스Minos 서열에서 포유동물  Mammal in sequence 코돈의Codon 사용 use

실시예Example 5 5

트랜스포사제의Transposa 개량 improvement

포유동물 세포 또는 동물에서 파리 트랜스포사제의 효율을 개선하기 위한 한 가지 방법은 파리 코돈 사용을 포유동물 코돈 사용으로 치환함으로써 mRNA로부터 의 번역을 더욱 효율적으로 만들어 그의 농도를 증가시키는 것이다. 이러한 목적을 위하여, 본 발명자들은 파리 미노스 트랜스포사제의 암호화 서열을 하기의 서열로 치환하였다:One way to improve the efficiency of fly transposase in mammalian cells or animals is to replace fly codon use with mammalian codon use to make translation from mRNA more efficient and increase its concentration. For this purpose, we replaced the coding sequence of Paris Minos transposase with the following sequence:

SEQ New: 1026 bp;SEQ New: 1026 bp;

조성 321 A; 235 C; 261 G; 209 T; 기타 OComposition 321 A; 235 C; 261 G; 209 T; Other O

백분율: 31% A; 23% C; 25% G; 20% T; 기타 0%Percentage: 31% A; 23% C; 25% G; 20% T; 0% other

분자량 (kDa): ssDNA: 317.79 dsDNA: 632.5 Molecular weight (kDa): ssDNA: 317.79 dsDNA: 632.5                 

오리진Origin

이러한 서열은 정상 포유동물 코돈 사용에 해당하는 것으로서, 번역후, 파리의 트랜스포사제 단백질 서열과 일치하는 단백질 서열을 생성한다. 상기 유전자(cDNA)를 각 부분이 클로닝된 세 부분의 올리고누클레오티드(상부, 센스 가닥, 하부의 안티센스 가닥 프린트)로 합성한 다음, 일제히 하나의 cDNA로 정리했다. This sequence corresponds to normal mammalian codon use and, after translation, produces a protein sequence consistent with the transposase protein sequence of the fly. The gene (cDNA) was synthesized into three parts of oligonucleotides (top, sense strand, bottom antisense strand print), each of which was cloned, and then collectively organized into one cDNA.

-출발 코돈 이전의 부분 A + Kozak-Part A + Kozak before departure codon

링커 A Kozak: CCACCATGGLinker A Kozak: CCACCATGG

링커 BLinker B

링커 CLinker C

물질 및 방법Substances and Methods

플라스미드 제작Plasmid Construction

형질전환된 마우스의 제작에 사용된 변형된 미노스 전위인자 pMiCMVGFP (도 5)의 제작이 실시예 1에서 기재되어 있다. 간략히 말해서, CMV 프로모터에 의해 구동되는 교화된 cDNA 서열에 이어서 간섭 서열 및 SV40 폴리 A 시그널을 함유하는 2.2kb 단편을 미노스 역반복체들의 사이에 위치시켰다. 필요한 경우 단일 복사체 형질전환된 동물의 발생을 위해 좌측 역반복체의 정면에 lox P 부위를 포함시켰다.The construction of the modified Minos translocation factor pMiCMVGFP (FIG. 5) used in the construction of transformed mice is described in Example 1. Briefly, a 2.2 kb fragment containing an interfering sequence and an SV40 poly A signal, followed by a hybridized cDNA sequence driven by a CMV promoter, was placed between the minus inverse repeats. If necessary, lox P sites were included in front of the left invertebrate for the generation of single copy transformed animals.

미노스 트랜스포사제 cDNA를, 벡터 Pev3(Clare Gooding, Biotechnology Dept, Zeneca, Macclesfield, UK; Pev3는 Needham 등, Nucl. Acids Res., 20, 997- 1003, 1992에서 기재되어 있음)내에 1kb ClaI/NotI 단편 형태로 클로닝하였다. 상기 얻어지는 플라스미드(미노스 트랜스포사제 cDNA에 연이어 인트론 및 폴리아데닐화 시그널을 함유함)의 3.8 kb ClaI/Asp718 단편을 pBluescript SK⁺(Stratagene, La Jolla, Ca, USA)에 클로닝하여 플라스미드 pBlue/ILMi/3β를 얻었다. 투명대 3(ZP3)의 5' 인접 영역 및 프로모터를 함유하는 플라스미드 ZP3/6.5Luc(Lira, S. 등 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,7215-7219.)의 6.5kb 블런트Asp718 단편을 pBlue/ILMi/3β의 EcoRV 부위내로 클로닝하여, 발생하는 알에서 트랜스포사제를 발현하는 형질전환된 마우스의 발생에 사용된 플라스미드 ZP3/ILMi (도 6)을 얻었다.The minos transposa cDNA was prepared in 1kb Cla I / in a vector Pev3 (Clare Gooding, Biotechnology Dept, Zeneca, Macclesfield, UK; Pev3 is described in Needham et al., Nucl. Acids Res., 20, 997-1003, 1992). Cloned into Not I fragment form. The 3.8 kb Cla I / Asp 718 fragment of the resulting plasmid (containing intron and polyadenylation signal subsequent to cDNA from Minos Transposa) was cloned into pBluescript SK ⁺ (Stratagene, La Jolla, Ca, USA) to plasmid pBlue / ILMi / 3β was obtained. 6.5kb blunt Asp718 of plasmid ZP3 / 6.5Luc (Lira, S. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87,7215-7219.) Containing the 5 'contiguous region of the zona pellucida 3 (ZP3) and the promoter. The fragment was cloned into the EcoRV site of pBlue / ILMi / 3β to obtain the plasmid ZP3 / ILMi (FIG. 6) used for the generation of transformed mice expressing transposase in the developing eggs.

형질전환된 동물의 발생Development of Transgenic Animals

미노스 트랜스포사제를 암호화하는 계통을 발생하기 위하여, 10.3kb SmaI/Asp718 단편을 pZP3/ILMi (도 6)로부터 절제하고, 겔 전기영동(Sambrook, J 등, Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989))에 의해 플라스미드 서열로부터 분리하고, ELUTIP-D (Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, Germany)를 이용하여 정제 및 응축하고, 수정된 난모세포(FVB x FVB)내로 4 ng/㎕의 농도로 주입했다. 주입된 알을 유사임신 마우스내로 전달하고, 형질전환된 자손을 꼬리 DNA의 서던 블럿 분석을 통해 확인했다(Southern, E. M. (1975). J. Mol. BIOL 98, 503-517).To generate a strain encoding Minos transposase, a 10.3 kb SmaI / Asp718 fragment was excised from pZP3 / ILMi (FIG. 6) and gel electrophoresis (Sambrook, J et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Isolated from plasmid sequences by Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), purified and condensed using ELUTIP-D (Schleicher & Schuell GmbH, Dassel, Germany), and fertilized oocytes (FVB x FVB). Injected at a concentration of 4 ng / μl. The injected eggs were transferred into pseudopregnant mice and the transformed offspring were confirmed by Southern blot analysis of the tail DNA (Southern, E. M. (1975). J. Mol. BIOL 98, 503-517).

상기 및 다음문헌[(Zagoraiou, L 등 (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,11474-11478)]에서 설명한 바와 같이, 전위인자 함유(MCG) 계통을 발생했다.As described above and in the following (Zagoraiou, L et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,11474-11478), a translocation factor containing (MCG) strain was generated.

RT-PCRRT-PCR

RT-PCR 분석을 위하여, 울라라스펙(Ultraspec) RNA 분리 시스템(Biotech Laboratories, Houston, TX, USA)을 이용하여 ZP3/ILMi 형질전환된 마우스의 상이한 기관으로부터 전체 RNA를 분리했다. 역전사효소(Super RT; HT Biotechnology, Cambridge, UK) 및 올리고(DT) 프라이머를 이용하여, 1 ㎍의 RNA로부터 cDNA를 20 ㎕ 반응물에서 합성했다. 상기 RT 반응의 1 ㎕의 cDNA, 1.5 mM MgCl₂, 100 ng의 각 프라이머, 0.2 mM dNTP 및 2.5 U Taq DNA 폴리머라제(Pharmacia)를 함유하는 50 ㎕ PCR 완충액(Life Technologies, Paisley, UK)에서 PCR 반응을 실시했다. 총 25 사이클을 실시하였는데, 각 사이클은 94 ℃에서 45초의 변성(denaturation), 55 ℃에서 30초의 어닐링(annealing) 및 72 ℃에서 45초의 신장(extension)으로 이루어졌다. PCR 산물을 2% 아가로스 셀 상에서 전기영동하여 시각화했다. 미노스 트랜스포사제 특이적 프라이머인 미노스l: 5'-CAGCTTCGAAATGAGCCAC-3' 및 beta EX: 5'-TGGACAGCAAGAAAGCGAG-3'을 사용했다. 쥐의 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제(HPRT)에 특이적인 프라이머는5'CACAGGACTAGAACACCTGC-3' 및 5'- GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3' 이었다.For RT-PCR analysis, total RNA was isolated from different organs of ZP3 / ILMi transformed mice using the Ulraspec RNA Separation System (Biotech Laboratories, Houston, TX, USA). Using reverse transcriptase (Super RT; HT Biotechnology, Cambridge, UK) and oligo (DT) primers, cDNA was synthesized in 20 μl reaction from 1 μg of RNA. PCR in 50 μl PCR buffer (Life Technologies, Paisley, UK) containing 1 μl of cDNA, 1.5 mM MgCl ₂ , 100 ng of each primer, 0.2 mM dNTP and 2.5 U Taq DNA polymerase (Pharmacia) of the RT reaction The reaction was carried out. A total of 25 cycles were run, each cycle consisting of 45 seconds of denaturation at 94 ° C., 30 seconds of annealing at 55 ° C., and 45 seconds of extension at 72 ° C. PCR products were visualized by electrophoresis on 2% agarose cells. The specific primers Minosl: 5'-CAGCTTCGAAATGAGCCAC-3 'and beta EX: 5'-TGGACAGCAAGAAAGCGAG-3' were used. Primers specific for rat hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) were 5'CACAGGACTAGAACACCTGC-3 'and 5'-GCTGGTGAAAAGGACCTCT-3'.

번식 프로그램Breeding program

전위인자 함유(MCG) 암컷을 ZP3/ILMi 계통 수컷 15 마리와 함께 사육했다. 이러한 교잡으로부터 얻은 이중 양성 암컷을 야생형 (WT) 수컷과 함께 사육하고 그 자손을 가능한 전위 사건에 대해 서던 블럿 분석으로 분석하였다. 게놈 DNA를 EcoRV 또는 BgIII로 절단하고, 0.7 or 1% 아가로스 겔(Sigma, Steinheim, Germany)상에 분리하고, 나일론막(Hybond-N+, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire England)상에 블로팅하고, pMiCMVGFP의 ³²P 표지 737bp SacI/NotI GFP 단편으로 탐침하였다.Translocation factor-containing (MCG) females were housed with 15 ZP3 / ILMi strains. Dual positive females obtained from this hybrid were bred with wild type (WT) males and their offspring analyzed by Southern blot analysis for possible translocation events. Genomic DNA is digested with Eco RV or BgI II, separated on 0.7 or 1% agarose gel (Sigma, Steinheim, Germany), blotted onto nylon membrane (Hybond-N +, Amersham Pharmacia, Buckinghamshire England), A ³² P labeled 737 bp Sac I / Not I GFP fragment of pMiCMVGFP was probed.

DNA 형광 원위치 하이브리디제이션(FISH) 분석DNA Fluorescence In situ Hybridization (FISH) Assay

일반적인 과정에 따라 말초 백혈구를 이용하여 마우스의 메타단계 번식물을 제조하였다(Mulder, M. P 등, (1995). Hum Genet 96 (2): 133-141). pMiCMVGFP 작제물의 737-bp SacI/NotI GFP 단편을 프로브로 이용했다. 상기 프로브를 비오틴(Boehringer Mannheim)으로 표지하여 FITC를 이용하여 면역화학적으로 직접 검출하거나 또는 티라미드에 기초한 단계를 포함시켜서 신호 검출을 개선하였다(Raap, A. K. et al (1995) Human Molecular Genetics 4, 529-534). 상기 DNA를 DAPI로 카운터염색했다.Meta-stage propagation of mice was prepared using peripheral white blood cells according to the general procedure (Mulder, M. P et al. (1995). Hum Genet 96 (2): 133-141). The 737-bp Sac I / Not I GFP fragment of the pMiCMVGFP construct was used as a probe. The probes were labeled with Biotin (Boehringer Mannheim) to improve signal detection by including immunochemical direct detection using FITC or based on tyramide (Raap, AK et al (1995) Human Molecular Genetics 4, 529). -534). The DNA was counterstained with DAPI.

삽입 부위의 클로닝Cloning of the insertion site

새로운 미노스 삽입 부위를 갖는 동물의 마우스 DNA를 EcoRV 또는 BglII로 절단하고, 0.7% 아가로스 겔에서 분해하였다. 전위가 발생된 상기 겔 영역을 절단하고 DNA를 분리했다. 단편의 크기에 따라, 제 1 PCR의 경우 미노스 프라이머 IMiol (5'AAGAGAATAAAATTCTCTTTGAGACG 3') 및 제 2 PCR의 경우 IMio2 (5'GATAATATAGTGTGTTAAACATTGCGC 3')를 이용하여 자체-라이게이션된 단편에 대하여 인버스 PCR을 직접 실시하거나(Klinakis, A.G., Zagoraiou, L. , Vassilatis, D. K & Savakis, C. (2000) EMBO Reports 11,416-421.), 또는 상기 얻어진 EcoRV 또는 BglII 단편을 AluI로 더 이상 절단한 다음, 원형화했다. 미노스 프라이머 IMio1 및 IMiil (5'CAAAAATATGAGTAATTTATTCAAACGG 3')를 이용하여 PCR을 실시한 다음, 프라이머 IMio2 및 IMii2 (5' GCTTAAGAGATAAGAAAAAAGTGACC 3')를 이용하여 제 2 PCR을 실시하였다(Klinakis, A.G., Zagoraiou, L. , Vassilatis, D. K & Savakis, C. (2000) EMBO Reports 11,416-421.). 이런 방법으로, 좌측 및 우측 인접부위(frank)를 각각 증폭했다. 상기 PCR 단편을 직접 서열화하거나 또는 pGEM T easy 벡터(Promega) 또는 PCRII 벡터(Invitrogen)내로 클로닝한 후에 서열화하였다. 얻어진 서열을 가지고서, Celera (www. celera. com) 데이터베이스에서 이용할 수 있는 마우스 게놈 서열에 대하여 BLAST 조사를 실시하였다.Mouse DNA of the animal with the new minos insertion site was digested with Eco RV or Bgl II and digested on a 0.7% agarose gel. The gel region in which the dislocation was generated was cut and DNA was isolated. Depending on the size of the fragments, inverse PCR was performed directly on self-ligated fragments using Minos primer IMiol (5'AAGAGAATAAAATTCTCTTTGAGACG 3 ') for the first PCR and IMio2 (5'GATAATATAGTGTGTTAAACATTGCGC 3') for the second PCR. (Klinakis, AG, Zagoraiou, L., Vassilatis, D. K & Savakis, C. (2000) EMBO Reports 11,416-421.), Or the obtained Eco RV or Bgl II fragments no longer cleaved with Alu I. Then, circularized. PCR was performed using Minos primers IMio1 and IMiil (5'CAAAAATATGAGTAATTTATTCAAACGG 3 '), followed by a second PCR using primers IMio2 and IMii2 (5' GCTTAAGAGATAAGAAAAAAGTGACC 3 ') (Klinakis, AG, Zagoraiou, L.). Vassilatis, D. K & Savakis, C. (2000) EMBO Reports 11,416-421.). In this way, the left and right franks were amplified respectively. The PCR fragments were sequenced either directly or after cloning into a pGEM T easy vector (Promega) or PCRII vector (Invitrogen). With the obtained sequence, a BLAST study was performed on mouse genome sequences available in the Celera (www.celera. Com) database.

결과result

전위인자를 가지는 형질전환된 마우스 계통(MCG)을 발생했다. 이는 마우스 염색체 14에 도입된 미노스 전위인자 MiCMVGFP (도 5)의 6개 복사체를 함유했다. 상기 전위인자는 비자율적, 즉 그 자체로서는 전위할 수 없는데, 이는 트랜스포사제 유전자가 결핍되어 있기 때문이다. 병행하여, 두 개의 트랜스포사제 발현 마우스 계통을 발생했다. 이들은 ZP3 유전자(도 6)의 6.5 kb 5' 인접 영역 및 프로모터의 사용으로 인해 성장하는 난모세포에서 특이적으로 미노스 트랜스포사제를 발현했다. 두 미노스 트랜스포사제(ZP3/ILMI) 계통에는 형질전환유전자가 직렬 어레이로 도입되었다. 이러한 실시예에서, 본 발명자들은 더욱 많은 수의 복사체를 갖는 ZP3/I LMi 계통 15를 사용했다(결과 미도시). 예상한 바와 같이, 이러한 계통에서의 트랜스포사제 발현은 난소로 제한되었다(도 7). 형질전환 ZP3/ILMi 계통의 상이한 조직에 대하여 RT-PCR을 실시한 결과, 정확히 스플라이스된 트랜스포사제 RNA에 해당하는 약 360bp 단편은 난소로 제한되었음을 확인하였다. 유사한 크기의 단편에 DNA를 오염시키는 증폭이, 엑손/인트론 접합부(베타 글로빈 IVSII; 도 6)를 연결하는 프라이머의 사용을 통해 방지되었다.Transformed mouse strains (MCGs) with translocation factors were generated. It contained six copies of the Minos translocation factor MiCMVGFP (FIG. 5) introduced on mouse chromosome 14. The translocation factor is non-autonomous, that is, it cannot be translocated on its own because it lacks the transposase gene. In parallel, two transposase-expressing mouse strains were generated. They specifically expressed minos transposase in growing oocytes due to the use of the 6.5 kb 5 ′ contiguous region and promoter of the ZP3 gene (FIG. 6). Minos two transformers priest (ZP3 / ILMI) system, the transgene was introduced into serial array. In this example, we used the ZP3 / I LMi strain 15 with a higher number of copies (results not shown). As expected, transposase expression in this line was limited to ovaries (FIG. 7). RT-PCR of different tissues of the transgenic ZP3 / ILMi line confirmed that about 360 bp fragment corresponding to exactly spliced transposase RNA was limited to the ovary. Amplification contaminating DNA into fragments of similar size was prevented through the use of primers linking exon / intron junctions (beta globin IVSII; FIG. 6).

형질전환유전자로부터 미노스 트랜스포사제의 발현이 ZP3 프로모터에 의해 유도되므로, 상기 트랜스포사제는 2-3 주간의 난형성 기간 동안에 성장하는 난모세포에서만 발현될 것이다.112. transgene expression of Minos Transportation Co. induced by the ZP3 promoter, the transformers are manufactured by two or three weeks I will be expressed only in growing oocytes I during the formation period.

일반적으로, 투명대 전사체(zona pellucida transcript)은 최초 난모세포(10-15 ㎛)에서는 검출될 수 없으며, 50 ㎛ 직경의 난모세포에서 최대 수준이 관찰된다. 난모세포가 최대 크기(70-80 ㎛)에 도달하면, ZP3 전사체의 수준은 감소하기 시작한다. 배란된 알은 투명대 전사체의 최고 수준의 5% 이하를 함유한다 (Millar 등 (1991) Molecular and Cellular Biology 11, 6197-6204; Liu, C 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93,5431-5436). 일부의 트랜스포사제 활성이 성숙한 난모세포에 남아서 부계로부터 기증된 전위인자 형질전환유전자의 전위를 매개하는 가능성을 배제하기 위하여, ZP3/ILMi 수컷(트랜스포사제를 발현하지 않음)을 다중복사체 전위인자 계통 MCG의 암컷과 교잡시켰다. 두 형질전환유전자에 대하여 양성인 암컷 자손을 선택하여 연구하였다. 본 발명의 발명자들은 상기 이중 양성 암컷과 야생형 수컷 사이의 307 마리의 자손을 서던 블럿 분석을 통해 분석하였다. EcoRV 및/또는 BglII 절단된 꼬리 DNA를 블로팅하고 GFP와 하이브리디제이션하엿다. 이러한 두 효소중 어느 것도 전위인자내에서 절단되지 않으므로, MCG 계통에서 전위인자 프로브에 하이브리디제이션되는 하나의 단일 밴드가 존재한다. 전위가 발생하고 전위인자가 이것이 초기에 존재했던 게놈 EcoRV 또는 BGlII 단편의 외측에 삽입되는 경우에는, 전위인자 프로브와의 하이브리디제이션후 새로운 띠가 검출된다. 307 마리의 마우스중에서, 146 마리의 마우스는 전위인자(GFP)에 대하여 양성이었다. 이러한 146 마리 중에서, 블럿 분석시에 새로운 제한 단편을 생성하는 12번의 전위 사건이 관찰됨으로써 8.2%의 전위 빈도수를 나타냈다. 두 마리의 마우스에서는, 두 번의 독립적인 전위 사건이 확인되었다(도 8의 레인 2 및 5). 일부의 자손이 미노스 매개 삽입물을 지니지 않지만 트랜스포사제 형질전환유전자를 물려받지 않았다는 관찰 결과는 감수분열 II 이전에 모친의 배세포에서 전위가 일어났음을 강하게 나타내는 것이다.In general, zona pellucida transcript cannot be detected in initial oocytes (10-15 μm) and maximum levels are observed in 50 μm diameter oocytes. When oocytes reach their maximum size (70-80 μm), the level of ZP3 transcript begins to decrease. Ovulated eggs contain 5% or less of the highest levels of zona pellucida (Millar et al. (1991) Molecular and Cellular Biology 11, 6197-6204; Liu, C et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci . USA. 93,5431-5436). In order to rule out the possibility that some transposase activity remains in mature oocytes and mediates the translocation of transgenes donated from the paternal line, ZP3 / ILMi males (which do not express transposase) are multiplier translocation factors. Hybridized with females of lineage MCG. Female offspring positive for both transgenes were selected and studied. The inventors of the present invention analyzed 307 offspring between the double positive females and wild type males by Southern blot analysis. Eco RV and / or Bgl II cleaved tail DNA was blotted and hybridized with GFP. Since neither of these two enzymes is cleaved within the translocation factor, there is one single band that hybridizes to the translocation probe in the MCG lineage. If a translocation occurs and the translocation factor is inserted outside of the genomic Eco RV or BGl II fragment that it was initially on, a new band is detected after hybridization with the translocation factor probe. Of 307 mice, 146 mice were positive for translocation factor (GFP). Of these 146, 12 dislocation events were observed in the blot analysis to produce new restriction fragments, resulting in a translocation frequency of 8.2%. In two mice, two independent translocation events were identified (lanes 2 and 5 in FIG. 8). Observations that some progeny do not have minos- mediated inserts but do not inherit the transposase transgenes strongly indicate that a translocation occurred in maternal germ cells prior to meiosis II.

상기 관찰된 전위 사건이 실제로 배선에서 일어났음을 입증하기 위하여, 전위가 일어난 동물들을 야생형 마우스와 추가로 교잡시켰다. 이들의 자손을 분석한 결과, 이들 마우스는 재삽입된 미노스 엘리먼트를 안정적으로 전달한 것으로 나타났다(도 8). 전위인자 콘카테머(concatemer) 및 새로운 삽입물이 FL 세대에서 두 개의 상이한 계통으로 분리된 것은 또 다른 염색체에서 전위가 일어났다는 분명한 증거가 되었다(도 8의 레인 3 및 4에 대한 레인 2, 및 레인 9에 대한 레인 8). 하나를 제외한 모든 전위 사건에서, 전위인자의 단일 복사체가 이동하였다.To demonstrate that the observed translocation event actually occurred in the germline, the transgenic animals were further hybridized with wild type mice. Analysis of their progeny showed that these mice stably delivered reinserted Minos elements (FIG. 8). Separation of the translocation concatemer and the new insert into two different lines in the FL generation provided clear evidence that the translocation occurred on another chromosome (lanes 2 and 4 for lanes 3 and 4 of FIG. 8). Lane 8 for 9). In all of the translocation events except one, a single copy of the translocation factor migrated.

전위인자의 크기는 그의 전위 빈도수에 영향을 미치며, 그의 길이가 길수록 전위 빈도수가 낮다는 것이 이미 확인되었다(Lampe, D. J. 등 (1998). Genetics 149,179-187; Fischer, S. E. 등 (1999) Mol . Gen. Genet . 262, 268-274. ). 따라서, 트랜스포사제 결합 부위(역반복체)들이 서로 근접할수록, 더욱 효율적으로 인식된다는 것을 알 수 있다.The magnitude of the potential factor affects its potential frequency, and it has already been confirmed that the longer its length, the lower the potential frequency (Lampe, DJ et al. (1998). Genetics 149,179-187; Fischer, SE et al. (1999) Mol . Gen. . Genet. 262, 268-274.) . Thus, it can be seen that the closer the transposase binding sites (reverse repeats) are to each other, the more efficiently they are recognized.

미노스 전위는 인접 DNA의 이동이 없이 상기 엘리먼트의 정밀한 도입에 특징이 있다. 초파리 및 HeLa 세포에서, 전위인자는 삽입시에 표적 부위 복제를 일으키는 TA 디누클레오티드내로 삽입된다 (17,29). 마우스 게놈내의 삽입물의 구조를 조사하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 상기 물질 및 방법 부분에서 설명한 바와 같이, 5 개의 상이한 전위 사건발생부로부터 인접 영역을 클로닝했다. 초파리에서 관찰되는 바와 같이, 미노스 말단에는 진단용 TA 디누클레오티드가 인접하여 있고, 그에 이어서, 마우스 계통 MCG의 엘리먼트에 인접하여 있는 서열과 무관한 서열들이 인접하여 있다(도 9). 얻어진 서열을 이용하여 Celera 마우스 게놈 데이터베이스에서 BLAST 조사를 수행한 결과, 상기 5 개의 새로운 인접 서열은 광범위하게 분포된 게놈 위치에 해당하는 것으로 나타났다(도 9). 분석된 5 개의 전위 사건 가운데, 하나의 전위만이 염색체 14상에 위치하였다. 이는 염색체 14의 끝부분상에 전위인자 콘카타머가 존재하지 않고 동원체 영역내로 도입된 전위인자의 단일 복사체이다. 따라서, 이러한 전위는 상이한 염색체내로 발생한 것이다(도 10 참조). 말초 백혈구의 메타단계 번식물에 대하여 DNA 형광 원위치 하이브리디제이션을 수행하여, 상기 인접 영역의 서열분석으로부터 얻은 결과를 확인하였다(결과 미도시). 그러나, 서던 블럿 분석(FISH)을 통해 분명하게 검출될 수 있었지만 동일 염색체상의 최초 위치에 근접하여 위치한 전위 사건은 FISH를 통해서는 확인할 수 없었다. FISH를 통해 단일 복사체(3kb) 전위를 검출하는 것은 실질적으로 매우 어렵고, 이는 FISH가 사용되는 유일한 검출 방법인 T-세포에서 특이적으로 발현되는 미노스 트랜스포사제 및 동일 전위인자 함유 형질전환 계통을 이용하여 본 발명자들이 예전에 얻은 0.61%의 낮은 전위 빈도수(Zagoraiou, L. 등, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,11474-11478)를 부분적으로 설명할 수 있는 것이다. 상기 엘리먼트의 본래 위치에 근접하는 국소적 삽입물은 최소한 초파리의 P 엘리먼트(Zhang, P. & Sprading, A. C. (1993) Genetics 133,361-373) 및 Sleeping Beauty (Luo, G 등 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95,10769-10773; Fisher, S. E. J. 등 (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98,6759-6764.)에서는 아주 빈번한 것이므로, 이것이 미노스 엘리먼트의 경우가 아니라고는 말할 수 없다. Minos potentials are characterized by the precise introduction of the element without the movement of adjacent DNA. In Drosophila and HeLa cells, translocation factors are inserted into TA dinucleotides that cause target site replication upon insertion (17,29). To examine the structure of the inserts in the mouse genome, the inventors cloned contiguous regions from five different translocation events, as described in the Materials and Methods section above. As observed in Drosophila, the diagnostic TA dinucleotide is adjacent to the minos terminus, followed by sequences independent of sequences adjacent to elements of the mouse line MCG (FIG. 9). BLAST searches in the Celera mouse genome database using the obtained sequences showed that these five new contiguous sequences correspond to widely distributed genomic locations (FIG. 9). Of the five translocation events analyzed, only one translocation was located on chromosome 14. This is a single copy of the translocation factor introduced into the centromere region without the translocation concatamer on the end of chromosome 14. Thus, this translocation occurs in different chromosomes (see FIG. 10). DNA fluorescence in situ hybridization was performed on meta-stage propagules of peripheral white blood cells to confirm the results obtained from sequencing of the adjacent regions (results not shown). However, although it could be clearly detected by Southern blot analysis (FISH), the translocation event located close to the initial position on the same chromosome could not be confirmed by FISH. Detecting a single copy (3 kb) translocation via FISH is practically very difficult, using a transgenic line containing minos transposase and isotransformer specifically expressed in T-cells, the only detection method in which FISH is used. This can partially explain the low potential frequency of 0.61% (Zagoraiou, L. et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98,11474-11478) obtained by the inventors. Topical inserts in close proximity to the element's original location include at least the D element of Drosophila (Zhang, P. & Sprading, AC (1993) Genetics 133,361-373) and Sleeping Beauty (Luo, G et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95,10769-10773; Fisher, SEJ et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98,6759-6764.) Are very frequent, so this is not the case for Minos elements. none.

EcoRV/BglII의 크기를 측정하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 loxP/Cre 시스템을 이용하여 MCG 계통으로부터 단일 복사체 전위인자 계통을 발생했다(결과 미도시). 서던 블럿 데이터에 따르면, EcoRV 및 BglII 진단용 절단물내에는, 전위인자에 인접한 약 10kb의 게놈 서열이 존재한다. 돌연변이 발생의 목적으로는 중요한 것이 아니지만 이러한 영역에서 일어나는 국소적 재삽입은 검출되지 않으며 본 발명자들의 전위 빈도수 평가에 포함되지 않는다. 따라서, 8.2%의 빈도수는 실제적인 전위 빈도수가 아니라 유용한 전위 빈도수를 나타내는 것이다. 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)를 이용한 수컷 마우스의 배세포주에서 보고된 전위 빈도수는 약 20%이지만, 겨우 2%만이 상이한 염색체내로 전위하였다(Fisher, S. E. J., Wienholds, E. & Plasterk, R. H. A. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 6759-6764). 대조로, 본 발명자들은 미노스의 경우 약 6%가 상이한 염색체로 전위하고(146 마리의 자손중 분석된 11 마리 가운데 8마리, 1마리는 모름), 11개의 전위중 겨우 3개 만이 동일 염색체로 전위하였음을 확인하였다(예를 들어, 도 10B). 이러한 사실로부터, 상기 미노스 시스템은 검출되지 않은 최초 부위에 근접한 많은 전위들이 없다는 것을 조건으로, 상이한 염색체로의 전위를 선택한다는 것을 알 수 있다. 그러나, 지금까지 알려진 상이한 전위인자 시스템들을 비교하는 것은 그다지 효과적이지 않음을 유념하여야 한다. 전위인자의 크기, 복사체수 및 초기 염색체 위치는 모두 전위 효율에 영향을 주고, 이들중 어느 것도 상이한 시스템에서 비교될 수 없다.To measure the size of EcoRV / BglII, the inventors of the present invention generated a single copy translocation factor line from the MCG line using the loxP / Cre system (results not shown). According to Southern blot data, within the Eco RV and Bgl II diagnostic cleavage, there is about 10 kb of genomic sequence adjacent to the translocation factor. Although not important for the purpose of mutagenesis, local reinsertions occurring in these regions are not detected and are not included in the inventors' assessment of potential frequencies. Thus, the 8.2% frequency represents a useful potential frequency rather than an actual potential frequency. The reported frequency of translocation in embryonic cell lines of male mice using Sleeping Beauty was about 20%, but only 2% translocated into different chromosomes (Fisher, SEJ, Wienholds, E. & Plasterk, RHA (2001) Proc . Natl. Acad. Sci. USA . 98, 6759-6764). Contrast, the present inventors have found that when the Minos about 6%, the potential at a different chromosome (of the analysis of the 146 progeny 11 8, 1 is unknown), a potential, only only 3 out of 11 potential to the same chromosomal (Eg, FIG. 10B). From this fact, it can be seen that the Minos system selects a potential for a different chromosome, provided that there are not many potentials close to the initial site that were not detected. However, it should be noted that comparing different potential factor systems known to date is not very effective. The size of the translocation factor, the number of copies and the initial chromosome location all influence the translocation efficiency, none of which can be compared in different systems.

끝으로, 상기의 결과들은 전위가 마우스 배선에서 달성될 수 있고, 유도 시기를 선택함으로써, 전위인자의 이동이 예정 배아 발달 단계에서 유도될 수 있음을 나타낸다. 또한, 상기 결과들은 예를 들어 미노스를 이용한 시스템은 마우스 등의 생물체에서 삽입 유전자 불활성화, 유전자 표지, 인핸서 트래핑 및 엑손 트래핑을 위한 우수한 도구임을 입증하는 것이다.Finally, the above results indicate that dislocations can be achieved in mouse wiring, and by selecting the induction timing, the shift of the translocation factor can be induced at a predetermined embryonic developmental stage. In addition, the results demonstrate that, for example, systems using minos are excellent tools for insertion gene inactivation, gene labeling, enhancer trapping and exon trapping in organisms such as mice.

상기 명세서에서 언급한 모든 간행물들은 본원에 참조로 인용되는 것이다. 본 발명에서 설명한 방법 및 시스템의 여러가지 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 정신을 일탈하지 않고 당업자에게 명백하게 된다. 특정의 바람직한 구현예에 관하여 본 발명을 설명하였지만, 청구범위에서 기재되는 본 발명이 이러한 특정의 구현예로 부당하게 제한되지 않음을 밝혀둔다.All publications mentioned in the above specification are herein incorporated by reference. Various modifications and variations of the methods and systems described herein will be apparent to those skilled in the art without departing from the scope and spirit of the invention. Although the present invention has been described with reference to certain preferred embodiments, it is to be understood that the invention described in the claims is not unduly limited to such specific embodiments.

Claims (38)

(a) 마우스의 게놈내에 전위인자(transposon)의 하나 이상의 복사체를 삽입함으로써 제 1의 성숙한 형질전환된 마우스를 발생시키는 단계;(a) generating a first mature transformed mouse by inserting one or more copies of transposons into the genome of the mouse; (b) 마우스의 게놈내에 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제(transposase)를 암호화하는 유전자의 하나 이상의 복사체 및 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 조절할 수 있는 엘리먼트를 삽입함으로써 제 2의 성숙한 형질전환된 마우스를 발생시키는 단계;(b) a second mature by inserting into the mouse genome one or more copies of a gene encoding a transposase cognate with the translocation factor and an element capable of controlling expression of the gene encoding a transposase Generating a transformed mouse; (c) 상기 제 1의 성숙한 형질전환된 마우스를 상기 제 2의 성숙한 형질전환된 마우스와 교잡시켜서, 하나 이상의 세포의 게놈내에 전위인자의 하나 이상의 복사체 (i)와 상기 전위인자와 동족인 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 (ii)를 포함하는 자손(progeny)을 제공하는 단계로서, 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자가 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열의 조절하에 있는 단계; 및(c) a hybrid of said first mature transformed mouse with said second mature transformed mouse to cognate with at least one copy of a translocation factor (i) and said translocation factor in the genome of at least one cell Providing a progeny comprising a gene (ii) encoding a medicament, wherein said gene encoding a transposase is under the control of one or more regulatory sequences to enable expression of the transposase; And (d) 상기 자손의 생식 세포에서 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현을 유도하여 상기 자손에서 생식선 발달 동안 상기 전위인자를 이동시키는 단계를 포함하여 형질전환된 마우스 자손을 발생시키는 방법으로서, 상기 제 1의 성숙한 형질전환된 마우스와 상기 제 2의 성숙한 형질전환된 마우스는 질병에 걸리기 쉬운 것으로 알려진 배경(background)을 지닌 마우스 계통의 마우스인, 형질전환된 마우스 자손을 발생시키는 방법.(d) inducing the expression of said gene encoding a transposase in the germ cells of said progeny to move said translocation factor during germline development in said progeny, wherein said method is used to generate transformed mouse progeny, said A method for generating transformed mouse offspring, wherein the first mature transformed mouse and the second mature transformed mouse are mice of a mouse strain having a background known to be susceptible to disease. 제 1 항에 있어서, 상기 자손이 형질전환된 암컷 마우스이고, 상기 전위인자의 이동이 난형성 동안 이루어짐을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein said progeny is a transformed female mouse and said translocation factor is during egg formation. 제 2 항에 있어서, 난형성 동안 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열이 ZP3 조절 서열로부터 유래된 서열임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 2, wherein the one or more regulatory sequences that allow expression of the transposase during oocyte formation are sequences derived from ZP3 regulatory sequences. 제 1 항에 있어서, 상기 자손이 형질전환된 수컷 마우스이고, 상기 전위인자의 이동이 정자형성 동안 이루어짐을 특징으로 하는 방법.2. The method of claim 1, wherein said progeny are transformed male mice, wherein said translocation factor shifts during spermatogenesis. 제 4 항에 있어서, 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열이 정자형성과정 동안 트랜스포사제의 특이적 발현을 가능하게 하는 서열임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 4, wherein the one or more regulatory sequences that enable expression of the transposase are sequences that enable specific expression of the transposase during spermatogenesis. 삭제delete 삭제delete 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1의 형질전환된 마우스가 이의 게놈내에 상기 전위인자의 하나 이상의 복사체 및 동족 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 하나 이상의 복사체를 포함하고, 상기 제 2의 형질전환된 마우스가 정자형성 또는 난형성 동안 임의의 한정된 조직(들)에서 트랜스포사제 발현을 가능하게 하는데 필요한 조절 서열의 하나 이상의 복사체를 포함함을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the first transformed mouse comprises one or more copies of the gene encoding one or more copies of the translocation factor and its cognate transposase in its genome, Wherein said second transformed mouse comprises one or more copies of regulatory sequences necessary to enable transposase expression in any defined tissue (s) during spermatogenesis or oocyte formation. 제 8 항에 있어서, 상기 전위인자 및 동족 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자가 상기 제 1 마우스의 게놈내에 단일 작제물로서 제공되어, 전위인자의 이동시에, 트랜스포사제를 암호화하는 유전자가 붕괴됨을 특징으로 하는 방법.9. The gene of claim 8, wherein said gene encoding said translocation factor and cognate transposase is provided as a single construct in the genome of said first mouse such that upon transfer of said translocation factor, the gene encoding transposase is disrupted. How to feature. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 전위인자 또는 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자가, 전위인자 또는 트랜스포사제를 암호화하는 유전자 또는 트랜스포사제를 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 유전자가 오픈 크로마틴(open chromatin) 구조에 존재하도록 크로마틴 오프닝 엘리먼트(chromatin opening element)내에 위치함을 특징으로 하는 방법.The gene according to any one of claims 1 to 5, wherein the gene encoding the translocation factor or transposase modulates the expression of the gene encoding the translocation factor or transposase or the gene encoding the transposase. Wherein the gene is located within a chromatin opening element such that the gene is in an open chromatin structure. 제 10 항에 있어서, 상기 크로마틴 오프닝 엘리먼트가 편재적으로 작용하는 크로마틴 오프닝 엘리먼트(UCOE), 유전자좌 조절 영역(LCR), CpG 아일랜드(island), 또는 인슐레이터(insulator)임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 10, wherein the chromatin opening element is a chromatin opening element (UCOE), a locus regulatory region (LCR), a CpG island, or an insulator. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열이 예정된 발달 단계에서 활성화될 수 있는 발달 조절 서열임을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 1, wherein said regulatory sequence is a developmental regulatory sequence capable of being activated at a predetermined stage of development. 7. 제 1 항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절 서열이 테트라사이클린 유도성 발현 시스템, 에스트로겐 유도성 발현 시스템, 엑디손(ecdysone) 유도성 발현 시스템, 및 lac 오퍼레이터-리프레서 시스템을 포함하는 군으로부터 선택된 유도성 조절 서열임을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 1, wherein said regulatory sequence comprises a tetracycline inducible expression system, an estrogen inducible expression system, an ecdysone inducible expression system, and a lac operator-repressor system. And an inducible regulatory sequence selected from the group. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 발현이, 전위의 결과로써의 트랜스포사제 유전자 절제(excision) (i) 또는 상기 전위인자의 이동 후 트랜스포사제 유전자의 절제 (ii)에 의해 제거됨을 특징으로 하는 방법.The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the expression of said gene encoding a transposase is transpositic after excision (i) or translocation of said translocation factor as a result of translocation. Characterized in that it is removed by excision (ii) of a pregene gene. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 전위인자, 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자, 또는 상기 전위인자와 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자 둘 모두가, 발현된 유전자내로 또는 그에 인접한 위치에 삽입됨을 특징으로 하는 방법.The gene according to any one of claims 1 to 5, wherein the translocation factor, the gene encoding a transposase, or both the translocation factor and the gene encoding a transposase, are in or adjacent to an expressed gene. And inserted in position. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 전위인자가 제 2형 전위인자임을 특징으로 하는 방법.6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein said potential factor is a second type potential factor. 제 16 항에 있어서, 상기 전위인자가 미노스(Minos), 마리너(mariner), 헤르메스(Hermes), 피기백(piggyBac) 또는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 16, wherein the potential factor is Minos, Mariner, Hermes, PiggyBac, or Sleeping Beauty. 제 17 항에 있어서, 상기 전위인자가 미노스임을 특징으로 하는 방법.18. The method of claim 17, wherein the potential factor is minos. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 전위인자가, 이러한 전위인자에 동종인 말단 역반복체가 접해있는 이종 핵산 서열을 포함하도록 변형된 것임을 특징으로 하는 방법.The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the translocation factor is modified to include a heterologous nucleic acid sequence in which a terminal inverse repeat homologous to such translocation factor is encountered. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 전위인자가 선택성 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 1, wherein said translocation factor comprises a nucleic acid sequence encoding a selectable marker. 7. 제 20 항에 있어서, 상기 선택성 마커가 형광 또는 발광 폴리펩티드임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 20, wherein said selectable marker is a fluorescent or luminescent polypeptide. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 트랜스포사제를 암호화하는 상기 유전자의 누클레오티드 서열이, 코돈 사용(codon usage)을 최적화하도록 변형된 것임을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 1, wherein the nucleotide sequence of the gene encoding a transposase is modified to optimize codon usage. 7. 삭제delete 삭제delete 형질전환된 마우스에서 표현형 특성과 관련이 있는 유전자를 분리하는 방법으로서,A method for isolating genes associated with phenotypic characteristics in transformed mice, (a) 제 1 항 내지 제 5항중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 자손을 취하는 단계;(a) taking off offspring obtained by the method according to any one of claims 1 to 5; (b) 상기 형질전환된 자손에서 상기 표현형 특성을 나타내는 다수의 세포의 존재를 확인하는 단계;(b) identifying the presence of a plurality of cells exhibiting the phenotypic characteristics in the transformed offspring; (c) 상기 하나 이상의 세포의 게놈에서 하나 이상의 전위인자 전위의 위치를 검출하는 단계; 및(c) detecting the location of one or more translocation potentials in the genome of the one or more cells; And (d) 삽입물을 포함하는 유전자좌를 클로닝하는 단계를 포함하여, 형질전환된 마우스에서 표현형 특성과 관련이 있는 유전자를 분리하는 방법.(d) cloning the locus comprising the insert, wherein the method comprises isolating genes associated with phenotypic characteristics in the transformed mouse. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 자손을 교배시켜서 상기 전위 사건으로 특징화될 수 있는 후손을 생성하는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.6. The method of claim 1, further comprising crossing the offspring to produce offspring that can be characterized by the translocation event. 7. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 트랜스포사제 유전자를 절제할 수 있는 효소에 의해 인식될 수 있는 서열이 상기 트랜스포사제 유전자에 접해있음을 특징으로 하는 방법.The method according to any one of claims 1 to 5, wherein a sequence recognizable by an enzyme capable of resecting the transposase gene is in contact with the transposase gene. 제 34항에 있어서, 상기 절제 효소 및 동족 인식 서열이 cre/lox임을 특징으로 하는 방법.35. The method of claim 34, wherein said excision enzyme and cognate recognition sequence are cre / lox. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 상기 자손을 교배시킴으로써 형질전환된 마우스를 발생시키는 것을 추가로 포함하며, 여기서 상기 마우스의 모든 세포가 전위인자 이동에 의해 변형된 유전자에 대해 상동(homogeneous)임을 특징으로 하는 방법.The method of any one of claims 1 to 5, further comprising generating a transformed mouse by crossing said progeny, wherein all cells of said mouse are homologous to a gene modified by translocation factor migration. homogeneous). 제 36항의 방법에 의해 수득될 수 있는 형질전환된 마우스로서, 상기 마우스는 질병에 걸리기 쉬운 것으로 알려진 배경을 지니며, 상기 마우스의 모든 세포가 전위인자 이동에 의해 변형된 유전자에 대해 상동인, 형질전환된 마우스.A transgenic mouse obtainable by the method of claim 36, wherein the mouse has a background known to be susceptible to disease, and wherein all cells of the mouse are homologous to genes modified by translocation factor migration. Switched mouse. 제 4항에 있어서, 트랜스포사제의 발현을 가능하게 하는 하나 이상의 조절 서열이 H1t 유전자 조절 서열임을 특징으로 하는 방법.The method of claim 4, wherein at least one regulatory sequence that enables expression of the transposase is an H1t gene regulatory sequence.

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