KR100985143B1 - 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 함유한 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 미네랄 복합성분은 우수한 항산화 활성을 가지며, 세포독성이 없고, 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 증가한 콜라게나제(MMP-1) 및 젤라티나제(MMP-2)의 활성 저해 효과와 콜라게나제(MMP-1)의 mRNA 및 젤라티나제(MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과가 우수하며, 콜라겐 합성 촉진 효과 및 엘라스타제 활성 저해 효과도 우수하고, 간세포에 대한 재생촉진 효과가 우수하며, 사람 피부에 자극이 없고 안전하므로, 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising minerals complex components for improving wrinkle}

도 1은 본 발명의 미네랄 복합성분의 입자를 주사전자 현미경으로 관찰한 도이다(배율: ×1000).

도 2는 본 발명의 미네랄 복합성분의 방사율과 방사에너지를 나타낸 도이다.

도 3은 본 발명의 미네랄 복합성분의 항산화 활성을 나타낸 도이다.

도 4는 본 발명의 미네랄 복합성분의 세포독성 결과를 나타낸 도이다.

도 5는 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1) 활성 저해 효과를 나타낸 도이다.

도 6은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 본 발명의 미네랄 복합성분의 젤라티나제(MMP-2) 활성 저해 효과를 나타낸 도이다.

도 7은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1)의 mRNA 발현 저해 효과를 나타낸 도이다.

도 8은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 본 발명의 미네랄 복합성분의 젤라티나제(MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과를 나타낸 도이다.

도 9는 본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라겐 합성 촉진 효과를 비타민 C, 비교예 1 및 비교예 2에 따른 미네랄 복합성분의 효과와 비교하여 나타낸 도이다.

도 10은 본 발명의 미네랄 복합성분의 엘라스타제 활성저해 효과를 폴리페놀, 비교예 1 및 비교예 2에 따른 미네랄 복합성분의 효과와 비교하여 나타낸 도이다.

도 11은 본 발명의 미네랄 복합성분의 간세포에 대한 재생촉진 효과를 나타낸 도이다.

본 발명은 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 함유한 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 피부 노화는 연대기적 노화(chronologic aging)와 광노화(photo aging)로 나뉜다. 연대기적 노화(chronologic aging)는 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 생기는 퇴화현상으로 인해 주름이 생성되는 것이고, 광노화(photo aging)는 햇빛에 노출된 피부에서 관찰되는 노화현상으로 연대기적 노화에 비해 그 정도가 심하고 일찍부터 관찰된다. 광노화는 피부 노화에 있어 상대적으로 비중이 큰 부분으로 자외선(UVA, UVB)에 의한 피부의 노화이다. 자외선에 노출된 피부는 불규칙한 색소 침착이 발생하며, 피부가 거칠어지고 건조해지며, 탄력이 감소하고 주름이 많이 발생한다. 또한, 자외선에 노출된 피부는 활성산소종이 다량 생성되는데, 이들 은 핵산과 단백질의 변형과 유전자 돌연변이를 유발한다. 그리고 신호전달체계, 세포주기 및 암 유발에 관련된 유전자들의 발현을 변화시킨다. 특히 진피에서는 자외선에 의해 기질금속단백분해효소(matrix metalloproteinases, MMPs) 활성이 증가하고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성이 감소하여 주름이 유발되는 것으로 보고되고 있다.

일반적으로 진피층에는 대다수의 타입 I 콜라겐과 약간의 타입 Ⅲ 콜라겐, 엘라스틴, 프로테오글리칸(proteoglycan), 피브로넥틴(fibronectin) 등으로 구성되어 있으며, 이들 섬유 조직들은 피부 주름 형성에 관련이 있다. 진피 조직 내에 있는 콜라겐과 엘라스틴은 서로 긴밀하게 관련되어 작용함으로써 피부의 유연성과 탄력을 유지하게 하는 중요한 섬유 조직이다.

콜라겐은 피부의 유연성을 주는 섬유 조직으로서, 진피층의 90%를 차지하는 주요 구성 요소로, 피부에 강도와 장력을 부여하여 외부자극으로부터 피부를 보호하는 역할을 한다. 콜라겐 섬유의 폴리펩타이드 사슬은 섬유아세포의 과립형질세망 내에서 양끝에 확장펩타이드(telepeptide)를 가지고 있는 상태로 합성된 뒤, 3중 나선 구조로 조합된 프로콜라겐 형태로 세포외로 분비된다. 이렇게 분비된 프로콜라겐은 특정 효소에 의해서 확장펩타이드가 절단되어 트로포콜라겐이 생성되고 이들은 세포외 기질에서 서로 조합되어 콜라겐 섬유가 합성된다. 이러한 콜라겐 섬유의 합성은 피부 노화가 진행되면서 급격히 감소하고, 외부환경에 의해 콜라겐 섬유가 변형되면서 피부에 주름이 많이 생성되고 깊어지게 된다. 이러한 콜라겐의 분해에는 콜라겐 분해 효소인 콜라게나제(collagenase)가 관여한다.

또한, 엘라스틴은 콜라겐과 마찬가지로 피부의 탄력성을 좌우하는 주요 섬유 조직으로서, 그 양은 약 2% 정도로 콜라겐과 비교하여 적은 양이지만 표피를 지탱하는 연결망 조직을 형성하고 있으므로 피부 탄력에 매우 중요한 역할을 한다. 엘라스틴은 엘라스타제(elastase)라는 분해 효소에 의하여 분해되며, 18~19세까지는 섬유아세포에 의하여 계속 생성되지만 그 이후부터는 생성이 중단되고 이미 생성된 엘라스틴만으로 피부 탄력을 담당해야 하므로 엘라스틴이 한번 약화되면 그 탄력성을 회복하기가 매우 어렵다. 즉, 엘라스틴 섬유의 결핍과 응집, 엘라스타제의 활성도의 현격한 증가는 피부 주름 생성의 주요 요인이므로, 엘라스타제의 활성을 저해시키면 피부 주름 개선을 근본적으로 줄일 수 있다.

또한, MMP(Matrix metalloproteinase)는 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM)과 기저막 분해에 관여하는 효소군으로 구조와 기능적 특성에 따라 간질성 콜라게나제(interstitial collagenase), 스트로멜리신(stromelysin), 젤라티나제 (gelatinase), 막-타입 MMP(membrane-type MMP, MT-MMP) 등 네 개의 아과 (subfamily)로 나누어진다. MMP들은 포유류, 조류, 양서류, 식물류 및 선충 등 다양한 종에서 현재까지 20종류 이상이 알려져 있다. 또한 MMP들은 기질 특이성에서는 서로 차이가 나지만 구조적, 기능적 유사성을 가지고 있다. 따라서, 모든 MMP들의 명칭은 일반적으로 번호를 붙여서 부르고 있다. 즉, 콜라게나제-1, 2, 3은 MMP-1, 8, 13으로, 젤라티나제-A, B는 MMP-2, 9로, 스트로멜리신-1, 2, 3은 MMP-3, 10, 11로, 메탈로엘라스타제(metalloelastase)는 MMP-12로, 마트릴리신(matrilysin)은 MMP-7로, 막-타입 MMP(MT-MMPs)는 MMP-14, 15, 16, 17, 24로, 에나멜리신(enamelysin)은 MMP-20, MMP-19, MMP-23 등으로 부른다. 이 효소들은 각각 해당 되는 기질, 즉 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌(laminin), 프로테오글리칸, 엔탁틴, 엘라스틴 등의 단백질들을 분해할 수 있다. MMP는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 비활성 전구체(zymogen) 형태로 분비된다. 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단부위가 절단되어야 하며, 활성화된 MMP는 2-마크로글로불린(2-macroglobulin)이나 TIMPs(Tissue inhibitors of metalloproteinase)와 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다. 피부각질세포 (keratinocyte), 섬유아세포(fibroblast)를 포함한 대다수의 많은 세포들이 MMP를 분비한다. 일회의 UV 조사시에도 피부 내의 MMP 활성이 증가하여 콜라겐을 현저하게 감소시킬 수 있으므로, MMP는 광노화에 주요 인자로 보고되어 있다.

현재, 주름 개선용 화장료로는 레티노이드, 아데노신, 동물 태반 유래 단백질, 클로렐라 추출물 등이 알려져 있다. 가장 잘 알려져 있는 레티놀은 콜라겐 합성을 촉진할 뿐만 아니라 엘라스타제 효소활성을 저해함으로써 주름개선 효능을 나타낸다고 알려져 있는 물질이지만 불안정하고 피부 적용 시에 자극, 발작 등의 안전성 문제로 사용량의 제한이 있으며, 클로렐라 추출물 등은 효과가 미미하여 실질적으로 피부 주름 개선효과를 기대하기가 어렵다고 알려져 있다.

따라서, 인체 피부에 자극이 없고 안전하며, MMP의 활성을 감소시키고, 콜라겐과 엘라스틴의 합성을 증가시켜 피부노화 억제에 유용한 화장료 조성물이 필요한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 사람 피부에 자극이 없고 안전하며 피부노화 억제에 유용한 화장료 조성물에 대해 연구하던 중, 여러 가지 미네랄 성분을 특정 비율로 혼 합한 후, 이 미네랄 복합성분을 자외선을 조사한 사람피부세포에 적용한 결과, 상기 미네랄 복합성분이 우수한 항산화 활성을 가지며, 세포독성이 없고, 콜라게나제 (MMP-1) 및 젤라티나제(MMP-2)의 활성 저해 효과와 콜라게나제(MMP-1)의 mRNA 및 젤라티나제(MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과가 우수하며, 콜라겐 합성 촉진 효과 및 엘라스타제 활성저해 효과도 우수하고, 간세포에 대한 재생촉진 효과가 우수하며, 사람 피부에 자극이 없고 안전한 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 함유한 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

본 발명의 주름 개선용 화장료 조성물은 연옥 1~10 중량%, 활석 10~20 중량%, 백운모 20~35 중량%, 견운모 10~20 중량%, 고령토 35~45 중량%, 해부석 1~3 중량% 및 유기 게르마늄 0.1~0.3 중량% 함유한 미네랄 복합성분을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 미네랄 복합성분에서 각 성분들의 특징은 다음과 같다.

연옥(nephrite, CaO₃MgO₄SiO₂)은 미세한 섬유상 결정이 얽혀 치밀질의 경괴를 이룬 투섬석 또는 투녹섬석을 말하며, 경옥에 대응되는 말이다. 질이 강인하여 잘 깨지지 않고, 연마하면 순한 광택이 난다. 굳기는 5.5~6.0 이며, 비중은 2.9~3.0 이고, 색깔은 백색 및 암록색을 띤다. 동의보감에서는 "옥가루는 맛이 달고 독이 없으며, 위와 장의 열을 내려 주고 오장육부를 편하게 해주며 몸속의 노폐물을 배출시킨다. 옥수(玉水)는 혈액순환을 촉진시키고 눈을 밝게 해준다"라고 알려져 있다. 연옥에 대한 현대의 임상실험 결과 두통, 불면, 분안, 손발절임 등 치료적인 효과와, Ca²⁺에 의한 음이온의 전기적 흡착으로 살균작용과 노폐물 흡착력이 뛰어나고, 체액의 산성화를 방지할 수 있다고 알려져 있다. 본 발명의 화장료 조성물에서 연옥의 함량은 조성물 총 중량에 대해 1~10 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 1 중량% 미만이면 Ca²⁺에 의한 흡착력이 약하게 되고, 10 중량% 초과하면 아연, 마그네슘, 철 성분의 흡수를 방해하게 된다.

활석(talc, Mg₃Si₄O₁₀(OH)₂)은 운모와 같은 결정구조를 가지는 단사정계에 속하는 암석으로, 굳기는 1, 비중은 2.7∼2.8로 칼로 자를 수 있으며, 색깔은 백색, 은백색 및 담녹색 등이 있다. 활석에 포함되어 있는 마그네슘은 피부 대사를 촉진하고 ATP 에너지의 구조 안정화에 기여하며 단백질 합성을 촉진한다고 알려져 있다. 또한 마그네슘은 칼슘과 서로 상반되게 근육의 수축과 이완을 조절하는 기능이 있다. 활석은 주로 유아용 땀띠분의 주성분으로, 진물을 없애주고, 열을 내려주는 작용이 있어 습진을 치료하는데 사용되고, 화장품에서는 베이스로 사용되며, 식품이나 제약에서는 첨가물로 사용된다. 본 발명의 화장료 조성물에서 활석의 함량은 조성물 총 중량에 대해 10~20 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 10 중량% 미만이면 피부대사 및 근육이 너무 수축되고, 20 중량% 초과하면 피부대사 및 근육이 너무 이완되는 문제점이 생긴다.

백운모(muscovite, K(OHF₂)₂A1₃Si₃O₁₀)는 단사정계에 속하는 광물로 철과 마그네슘을 소량 함유하기도 한다. 굳기는 2~2.4, 비중은 2.7~3, 무색, 백색, 황색, 회색, 녹색, 갈색을 띠며, 크롬 함유 시 선록색을 띤다. 백운모의 불소성분은 멜라닌 색소의 활성화를 억제하여 미백효과가 있고 피부에 보습을 준다고 알려져 있다. 본 발명의 화장료 조성물에서 백운모의 함량은 조성물 총 중량에 대해 20~35 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 20 중량% 미만이면 피부 미백 및 보습효과가 거의 나타나지 않고, 35 중량% 초과하면 피부 미백 및 보습효과가 너무 과잉으로 나타나게 된다.

견운모(sericite, KAl₂(OH)₂(AlSi₃O₁₀))는 단사정계에 속하며, 백색 또는 회백색에 진주광택이 있다. 원래는 결정편암, 특히 견운모편암의 주성분 광물을 말하였으나, 오늘날에는 열수작용(熱水作用)으로 생긴 점토 모양의 미세한 백운모를 가리킨다. 화학성분은 백운모와 거의 같으나, 일반적으로 칼륨(K)이 백운모보다 적고 수분(H₂O)이 다소 많다. 이 외에 견운모에는 셀레늄(Se), 아연(Zn), 마그네슘(Mg), 칼슘(Ca) 등 인체에 필수적인 다양한 미네랄이 들어있어서, 중금속 해독작용과 항산화효능을 나타낸다고 한다. 또한, 견운모는 도자기나 내화벽돌의 혼입재로 쓰이며, 그 밖에 도료, 전기절연체, 활마재 및 화장품용 등 용도가 다양하다. 본 발명 의 화장료 조성물에서 견운모의 함량은 조성물 총 중량에 대해 10~20 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 10 중량% 미만이면 중금속 해독과 항산화 효과가 약해지고, 20 중량% 초과하면 세포 내 전체 항산화계의 조절이 파괴되어 오히려 중금속 해독과 항산화 효과가 더 약해지는 경향이 있다.

고령토(kaolin, Al₂Si₂O₅(OH)₄)는 고령석(카올리나이트)과 할로이사이트가 주성분으로, 바위 속에 있는 장석·정장석·소다 장석·회장석 같은 장석류가 탄산 또는 물에 의해 화학적으로 분해되는 풍화에 의해 생성되며, 순백색 또는 약간 회색이다. 고령토 가루는 피부를 청결하게 해주고, 피부 표면의 더러움과 독소, 모공의 피지, 오래된 각질을 제거해주어 지성피부와 여드름 피부에 좋다. 한방용어로는 색깔에 따라 백석지, 황석지 등으로 불리며 모두 피부 트러블에 사용되고 있다. 본 발명의 화장료 조성물에서 고령토의 함량은 조성물 총 중량에 대해 35~45 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 35 중량% 미만이면 구성성분 사이의 친화도가 떨어지고 흡착력이 약해지며, 45 중량% 초과하면 친화도가 너무 높아지고 흡착력이 너무 강해져 피부에 트러블이 생긴다.

해부석(pumice)은 화산에서 분출된 암석이 응고하여 이루어진 구멍이 많은 광물이다. 해부석은 유문암(rhyolite), 조면암(trachyte), 향암(phonolite)을 포함한 규산염 광물([SiO₂]x)로서 필수 미네랄인 칼슘, 철, 아연, 구리, 니켈, 크롬, 코발트, 바나듐, 셀레늄 등을 함유하고 있다. 본초강목에 의하면, 해부석은 피부에 혹이나 멍울이 지는 증상, 극심한 하복통을 치료하며 하기(下氣)시키는 작용이 있 고 부스럼을 가라앉힌다고 알려져 있다. 또한, 안구에 군살이 자라나 시야를 가리는 증상을 치료한다고 알려져 있다. 본 발명의 화장료 조성물에서 해부석의 함량은 조성물 총 중량에 대해 1~3 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 1 중량% 미만이면 피부에 대해 거의 작용하지 않고, 3 중량% 초과하면 중금속이 많아져 피부에 유해하다.

유기 게르마늄(Ge)은 미량 존재하며, 산소공급 작용, 반도체 작용(체내 세포의 전자흐름 조절작용, 음이온 효과), 면역력 강화 작용, 인터페론 생성, 엔돌핀 생성촉진작용, 통증제거 작용, 산성체질을 알카리화, 제독작용 및 체내 중금속 배출작용, 자연 치유력 증강작용 등의 효능이 알려져 있다. 따라서, 고순도 게르마늄을 이용한 화장품; 팔찌, 목걸이, 첩포제 등의 건강도구; 비누 등이 상품화되었고, 세계적으로도 수요에 있어 강한 증가율을 보이고 있는 물질이다. 본 발명의 화장료 조성물에서 해부석의 함량은 조성물 총 중량에 대해 0.1~0.3 중량% 포함하는 것이 바람직하다. 만일 0.1 중량% 미만이면 게르마늄의 효능이 나타나지 않고, 0.3 중량% 초과하면 피부에 독성을 나타낸다.

상기 미네랄 성분 중 유기 게르마늄을 제외한 미네랄 성분들은 화학식에 있는 원소 이외에도 Ca, Mg, P, K 등 필수 다량 원소(macro-element)와, Fe, Zn, Se, Mn, Cu, Mo, Co, Cr, F, Ni, V, B, Se 등 필수 미량 원소(micro-element)를 포함하고 있어 세포의 생명활동에 도움이 될 수 있다. 특히, 상기 원소들 중 셀레늄은 글루타치온 퍼옥시다제(athione peroxidase) 효소의 조효소로서 체내에서 발생한 과산화수소를 제거하는 작용을 하는 대표적 생체 방어효소이다. 따라서 미네랄 복합 성분 속에 함유된 셀레늄 등의 원소들은 글루타치온 퍼옥시다제의 작용을 촉진함으로써 세포 내 대사과정의 부산물을 제거하고, 세포의 분열과 분화에 관여하는 것으로 알려져 있다.

또한 상기 미네랄 성분들에 공통으로 함유된 규소(Si, silicon)는 도정하지 않은 곡물에 함유된 천연물질로서, 체중의 0.5%를 차지하는 중요한 원소로서 결합조직(connective tissue)을 이루는 단백질 합성에 중요한 역할을 하기 때문에 결합조직이 탄성을 유지하는데 필수적인 성분이다. 또한 실리콘은 면역력 강화기능에 대한 연구결과도 있다. 세포가 섭취한 실리콘을 유용하게 사용하기 위해서는 붕소, 칼슘, 마그네슘, 망간, 칼륨 등 여러 필수 미네랄 성분도 동시에 필요하다.

본 발명의 주름 개선용 화장료 조성물에서 유효성분인 미네랄 복합성분은 하기와 같이 제조된다. 먼저, 연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 물로 깨끗하게 세척한 후, 건조시켜 수분을 제거한다. 각각의 건조된 미네랄을 통상의 회전분말기에 넣고 고속분말 처리하여 입도 1~10 마이크론의 초미세 분말로 분쇄한다. 상기 분쇄된 초미세 분말을 각각 롤러식 전자석 드럼과 컨베이어 벨트에 강한 자력선을 투과시켜 강한 자기장을 형성하여 불필요한 철 성분을 최대한 제거한다. 상기 철 성분이 제거된 분말을 20배 중량의 물에 넣고 교반기를 가동시킨 후, 상층액을 버리고 침전물을 회수하거나 또는 교반기 가동 상태에서 부유물을 회수하고 침전물을 버리는 비중치 선별과정을 거친다. 상기 미네랄 중 연옥과 유기 게르마늄을 제외한 미네랄 성분들, 즉 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석을 배합비율에 따라 혼합한다. 상기 혼합물을 도자기판에 얇은 층으로 고르게 편 다음, 전기로에 넣어 700℃의 항온에서 가열한다. 상기 혼합물이 붉게 가열되면 15~25분간 이 상태를 유지시킨 후 도자기판을 꺼낸다. 여기에 연옥과 유기 게르마늄을 첨가하여 미네랄 복합성분을 얻는다.

본 발명의 미네랄 복합성분은 우수한 항산화 활성을 가지며, 0.244 ㎍/㎖ 농도에서 거의 세포독성을 나타내지 않아 세포 생존율이 거의 100%에 달한다. 또한 본 발명의 미네랄 복합성분은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 증가한 콜라게나제(MMP-1) 및 젤라티나제(MMP-2)의 활성 저해 효과와 콜라게나제(MMP-1)의 mRNA 및 젤라티나제(MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과가 우수하며, 콜라겐 합성 촉진 효과 및 엘라스타제 활성저해 효과도 우수하다. 또한, 본 발명의 미네랄 복합성분은 간세포에 대한 재생촉진 효과가 우수하므로 피부세포의 재생 촉진효과를 예측할 수 있으며, 사람 피부에 자극이 없고 안전하다. 따라서, 본 발명의 미네랄 복합성분은 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에서, 상기 미네랄 복합성분의 함량은 화장료 조성물의 총 중량에 대해 약 0.0001 내지 10.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 5.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 중량%의 양으로 포함될 수 있다. 만일 미네랄 복합성분의 함량이 0.0001 중량% 미만이면 실질적인 효과를 기대하기 어렵고, 10.0 중량%를 초과하면 함유량의 증가에 따른 뚜렷한 효과의 증가가 나타나지 않으며, 피부 자극 유발, 제형의 불안정성과 같은 문제점이 생긴다.

본 발명의 주름 개선용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어 떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 화장품학적으로 허용가능한 담체는 제형에 따라 다양하다. 본 발명의 제형이 연고, 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일이 있으며, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 비누인 경우에는 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알콜, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물에는 담체 뿐만 아니라 보조제도 포함될 수 있으며, 예를 들어 보존제, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 향료 및 이들의 혼합물이 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1~3 및 비교예 1~2 : 미네랄 복합성분의 제조

연옥, 활석, 백운모, 견운모, 고령토, 해부석 및 유기 게르마늄을 물로 깨끗하게 세척한 후, 100℃의 건조기에서 3시간 이상 건조시켜 수분을 제거하였다. 각각의 건조된 미네랄을 통상의 회전분말기에 넣고 고속분말 처리하여 입도 1~10 마이크론의 초미세 분말로 분쇄하였다. 상기 분쇄된 초미세 분말을 각각 롤러식 전자석 드럼과 컨베이어 벨트에 강한 자력선을 투과시켜 강한 자기장을 형성하여 불필 요한 철 성분을 최대한 제거하였다. 상기 철 성분이 제거된 분말을 20배 중량의 물에 넣고 교반기를 가동시킨 후, 상층액을 버리고 침전물을 회수하였다. 상기 과정은 교반기 가동 상태에서 부유물을 회수하고 침전물을 버릴 수도 있다.

상기 미네랄 중 연옥과 유기 게르마늄 이외의 미네랄 성분들은 하기 표 1에 나타난 배합비율에 따라 혼합하여 실시예 1~3을 제조하였다. 또한, 연옥 및 유기 게르마늄 함량에 따른 효과의 차이를 비교하기 위해 하기 표 1에 나타난 배합비율에 따라 비교예 1~2를 제조하였다. 상기 혼합물을 도자기판에 얇은 층으로 고르게 편 다음, 전기로에 넣어 700℃의 항온에서 가열하였다. 상기 혼합물이 붉게 가열되면 20분간 이 상태를 유지시킨 후 도자기판을 꺼내었다. 상기 혼합물에 연옥과 유기 게르마늄을 하기 표 1에 나타난 배합비율에 따라 첨가하였다.

	실시예 1 (중량%)	실시예 2 (중량%)	실시예 3 (중량%)	비교예 1 (중량%)	비교예 2 (중량%)
연옥	9	7	4	0	15
활석	11.9	18.8	13.7	22	7
백운모	25	20	31	35	20
견운모	15	13	16	18	10
고령토	38	38	34	25	43.5
해부석	1	3	1	0	4
유기 게르마늄	0.1	0.2	0.3	0	0.5

실험예 1 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 물리화학적 특성

본 발명의 미네랄 복합성분의 물리화학적 특성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 미네랄 복합성분의 입자형태 관찰

상기 실시예 1~3에서 제조한 미네랄 복합성분을 주사전자 현미경(Scanning electron microscope; SEM)용 시료대에 도전성 접착제로 접착시킨 후, 이온 스파터 코터(ion sputter coater, SEM auto coating E 5200)를 사용하여 18mA에서 약 3분간 표면을 코팅시킨 뒤 주사전자 현미경으로 20kV의 가속전압 하에서 관찰하였다.

결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분이 고르게 분포되어 있으며, 미네랄 복합성분의 입자크기가 3.26㎛인 것을 확인하였다.

2. 미네랄 복합성분의 원적외선 분광방사율 분석

상기 실시예 1~3에서 제조한 미네랄 복합성분의 원적외선 분광방사율 측정을 위해 사용된 MCT 검출기를 장착한 원적외선 방사율 측정기(FT-IR Spectrometer)는 MIDAC M2400-C(USA)로, 측정 온도범위는 37℃, 측정파장은 5~20㎛ 이며, 흑체 (Black body) 대비 측정결과를 표시하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분의 방사율은 0.916 이었고, 방사에너지는 3.53×10² W/㎡ 이었다. 따라서, 본 발명의 미네랄 복합성분의 원적외선 방사에너지 효율이 우수함을 알 수 있다.

실험예 2 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 항산화 활성 측정(DPPH 법)

본 발명의 미네랄 복합성분의 항산화 활성을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

안정한 자유 라디칼인 DPPHㆍ(1,1-디페닐-2-피크릴 히드라질)을 이용하여 일정량의 시료 용액과의 반응에 의하여 DPPH 라디칼이 감소하는 정도를 분광광도계로 측정하여 간접적으로 시료의 항산화 활성을 측정하였다. 메탄올에 녹인 1.25㎍/㎖의 상기 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분을, 100㎕의 메탄올에 용해시킨 0.15mM DPPH 용액 100㎕에 가하고 37℃에서 10분간 반응시켰다. 양성대조군으로는 0.97㎍/㎖의 폴리페놀을 사용하였으며, 미네랄 복합성분의 항산화 효과를 측정하기 위하여 하기 수학식 1의 전자공여능(Electron donating ability, EDA%)에 의한 환원력으로 항산화능을 표시하였다. ELISA 판독기를 사용하여 570㎚에서의 흡광도 감소를 측정하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.

EDA(%) = [(대조군 흡광도 - 시료 흡광도) / 대조군 흡광도] × 100

※ 대조군 흡광도 : 메탄올을 가한 시험액의 흡광도

시료 흡광도 : 본 발명의 미네랄 복합성분을 가한 시험액의 흡광도

도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분은 양성대조군과 유사한 활성산소 소거능을 나타냄으로써, 우수한 항산화 활성을 가짐을 알 수 있다.

실험예 3 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 사람피부세포에 대한 세포 생존율 측정(MTT 법)

본 발명의 미네랄 복합성분의 사람피부세포에 대한 세포 생존율을 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 세포 배양

본 실험에 사용한 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF(Human dermal fibroblast)는 (주)영사이언스(MCTT, Modern Cell & Tissue Technologies)로부터 분양받았다. 세포배양은 HDF를 T-75 세포배양 플라스크에 배지와 세포를 넣어준 뒤, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 배양하고, 현미경과 혈구계(hematocytometer)를 이용하여 세포 배양 상태와 세포 수를 측정하였다. 세포에 영양분을 공급해주는 배지로는 DMEM(dulbecco's modified eagles's medium)에 10% heat inactivated fetal bovine serum(FBS) (Hyclone)과 1% 항생제(penicillin-streptomycin) (Hyclone)가 첨가된 배지를 제조하여 세포 배양액으로 사용하였다. 모든 실험에 사용되는 HDF의 세대(passage)는 6~10을 넘기지 않았다.

2. 세포 생존율 측정

세포 생존율 측정은 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] 방법을 사용하였고, 대조군과 상대적인 %를 측정하였다. HDF를 96-웰 플레이트에 세포수가 웰당 2×10⁴이 되도록 옮겨준 후, 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분을 10% FBS와 1% 항생제가 함유된 DMEM에 ㎖당 500 ㎍을 첨가하여 (1/2)¹⁷까지 연속 희석법으로 처리하여 시료용액을 제조하였다. 24시간 후 배양중인 배지를 제거한 뒤 시료용액을 200 ㎕씩 가해준 뒤, 24시간 동안 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 시료용액 처리 24시간 후 세포에 MTT 용액(5 ㎎/㎖)을 가하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 배양 후 MTT 용액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액을 200 ㎕씩 가하여 블루 포마잔(blue formazan)을 용해시킨 뒤 ELISA 판독기를 사용하여 570 ㎚에서 대조군과 각 시료들의 흡광도 값을 측정하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분은 0.244 ㎍/㎖ 농도에서 거의 세포독성을 나타내지 않아 세포 생존율이 거의 100%에 달하였다.

실험예 4 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1) 및 젤라티나제 (MMP-2)의 활성 저해 효과

본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1) 및 젤라티나제(MMP-2)의 활성 저해 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 자외선 조사

사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF를 100Ф 플레이트에 1.5×10⁵ cells가 되도록 옮겨주고, HDF의 융합성(confluent)이 70~80% 일때 배지를 제거하였다. 그 다음 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척 후 PBS를 제거하지 않은 상태에서 100Ф 플레이트와 5㎝ 떨어진 높이에서 172초 동안 300mJ/㎠의 UVA(320~400 ㎚)를 조사하였다. 자외선 조사 후 PBS를 제거하고, 다시 PBS로 2차 세척하였다. 대조군은 UV에 노출되지 않은 조건이며, HDF의 UV 노출 후 상기 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분이 함유된 혈청 없는 배지(serum free media)를 넣어주고 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다.

2. 콜라게나제(MMP-1) 및 젤라티나제(MMP-2)의 활성 저해 효과 : 단백분해효소 분석법(zymography)

사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF가 배양접시 바닥을 70~80% 정도 채웠을 때, PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척 후 300mJ/㎠의 UVA에 노출시킨 후, 다시 PBS로 2차 세척하였다. PBS를 제거하고, 상기 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분(0.244 ㎍/㎖)이 함유된 혈청 없는 배지(serum free media)를 넣어주고 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후에 상등액만 따로 모아 0.1% 젤라틴이 함유된 8% SDS-PAGE(Sodium dodecyl slufate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 시행하였다. 전기영동이 끝난 겔은 증류수에 잠깐 세척 후 100㎖의 2.5% 트리톤 X-100 용액에 담가 진탕배양기에서 30분씩 두 번 세척하였다. 여기에 100㎖의 배양 완충용액(50mM Tris-HCl, 10mM CaCl₂, 50mM NaCl, 0.05% Brij35, pH 7.6)을 넣고, 37℃에서 20시간 동안 반응시켰다. 반응 후 coomassie brilliant blue staining solution에서 40분 정도 염색한 후 아세트산, 메탄올 및 증류수가 1:5:4로 들어있는 용액으로 단백질 가수분해 활성(proteolytic activity)이 일어난 하얀밴드가 보일 때까지 탈색해주었다. 탈색이 끝난 겔은 스캐너를 이용하여 스캔하여 하얀밴드 부분을 정량하였다.

양성대조군으로는 폴리페놀을 사용하였으며, 폴리페놀도 세포독성이 나타나지 않는 최고농도(0.122 ㎍/㎖)에서 처리하였다.

본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1) 활성 저해 효과는 도 5에 나타내었으며, 젤라티나제(MMP-2)의 활성 저해 효과는 도 6에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 증가한 콜라게나제(MMP-1)의 활성을 효과적으로 감소시켰다.

또한 도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 증가한 젤라티나제(MMP-2)의 활성도 효과적으로 감소시켰다.

실험예 5 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1) 및 젤라티나제 (MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과

본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1) 및 젤라티나제(MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 사람 진피의 섬유아 세포주(HDF)로부터 총 RNA의 분리

플레이트에 키운 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 TRI 시약 1 ㎖를 첨가 하고, 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 옮긴 뒤 실온에서 5분간 반응시켰다. 그 다음 클로로포름 200㎕를 첨가하여 15초 동안 격렬하게 혼합한 다음, 실온에서 3분간 반응시킨 후 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상층액을 취해 새 튜브로 옮겨주고 위의 과정을 1회 반복하여 RNA를 정제하였다. 정제된 RNA가 녹아있는 상층액을 취하여 이소프로판올 500㎕를 첨가하고 가볍게 혼합한 후, 실온에서 10분간 반응시킨 다음 4℃, 12,000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 생성된 침전물에 75% 에탄올 1㎖를 넣어주고 세척하였다. 다시 원심 분리하여 상등액을 제거한 후 침전물을 5분간 건조시키고, TE(RNase-free) 완충용액에 녹인 후 흡광도 (A₂₆₀/A₂₈₀)를 측정하여 그 양과 순도를 결정하였다. 측정된 흡광도 값은 1.7~2.0 사이가 적절하며, 분리된 총 RNA는 실험에 사용하기 전까지 -70℃의 극저온 냉동기에 보관하였다.

2. RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)

2-1. 첫번째 가닥 cDNA의 합성

상기 1에서 분리한 총 RNA(2㎍/㎕)를 주형으로 사용하여, Bioneer사의 Accupower RT Premix kit를 사용하여 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하기 위한 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성을 위한 반응은 3 ㎕ Template RNA, 2 ㎕ Oligo-dT 프라이머를 혼합하고, 70℃에서 5분간 반응시킨 후 얼음 위에 두어 더 이상의 반응을 중지시켰다. 이 반응물을 RT Premix tube에 넣고 DEPC-water로 최종 부피를 50㎕로 맞추고 혼합한 후, 42℃에서 60분, 94℃에 서 5분간 반응시켰다. 그리고 4℃에서 30분 동안 보존하였다. 합성된 cDNA는 실험에 사용하기 전까지 -70℃의 극저온 냉동기에 보관하였다.

2-2. 프라이머의 제작

사람 진피의 섬유아 세포주(HDF)의 유전자로부터 항상 발현되어 대조군으로 사용할 수 있는 human β-actin 유전자를 증폭하기 위하여, 센스 프라이머(sense primer)와 안티-센스 프라이머(anti-sense primer)를 제작하였다. MMP-1과 MMP-2 유전자를 증폭해 낼 수 있는 센스 프라이머와 안티-센스 프라이머를 제작하였다. 모든 프라이머들은 (주)Genotech에 의뢰하여 주문제작 하였다. RT-PCR에서 검사한 유전자의 프라이머 염기서열 및 단편 크기는 표 2에 나타내었다.

유전자	프라이머 염기서열	단편 크기(bp)
MMP-1	F 5'-AAAGGGAATAAGTACTGGGC-3' R 5'-AATTCCAGGAAAGTCATGTG-3'	237
MMP-2	F 5'-CACCCCTAAGAGATCCT-3' R 5'-GTGCATACAAAGCAAACTGC-3'	274
β-actin	F 5'-TATGCCCTCCCCCATGCCAT-3' R 5'-GAAGCATTTGCGGTGGACGATGG-3'	622

2-3. PCR(Polymerase Chain Reaction)

PCR 반응은 합성한 2㎕의 cDNA를 주형으로 하여 해당하는 프라이머 조합과, Enzynomics^TM사의 2× Dye MIX DNA Polymerase를 사용하여 20㎕의 반응액에서 PCR 반응을 수행하였다. 총 20㎕의 PCR 반응액에는 nTaq^tenuto 2.5 units, nTaq^tenuto 반응 완충액 4mM Mg²⁺, dNTP 혼합물 0.4mM, 글리세롤이 포함되어 있고, 염료(Dye)에는 자일렌 시아놀(Xylene cyanol), 오렌지 G가 포함되어 있으며, 각 반응액에는 10 pmol의 프라이머를 첨가 후 Techne사의 PROGENE을 이용하여 94℃에서 3분간 변성 후, 94℃, 55℃ 및 72℃에서 각각 1분간의 반응을 30회 반복하였고, 72℃에서 3분간 연장 반응시킨 후 4℃에서 30분간 보존시켰다. 반응이 끝난 산물은 다음 실험에 사용하기 전까지 -20℃의 냉동기에 보관하였고, 1% 아가로즈 겔을 사용하여 전기이동한 후 UV 상에서 밴드를 확인하였다.

2-4. 정량적인 RT-PCR

최초 cDNA 합성시 주형 RNA(총 RNA)의 양을 6㎍ 농도로 정량하여 cDNA를 합성하였고, 정량적인 PCR을 위해 합성된 cDNA를 연속적으로 희석하여 사용하였다. 연속적인 cDNA 희석의 범위는 1/2 ~ 1/32 까지 하였다. 정량 분석을 위하여 대조군과 처리군에서 내부 표준물질(internal standard)로 사용된 대조군 유전자 β-actin 프라이머와 동일한 양으로 증폭된 희석 조건에서 대조군, UVA, 실시예 1의 미네랄 복합성분 및 폴리페놀로 처리한 세포의 증폭된 양을 서로 비교하였다.

본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라게나제(MMP-1)의 mRNA 발현 저해 효과는 도 7에 나타내었으며, 젤라티나제(MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과는 도 8에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 증가한 콜라게나제(MMP-1)의 발현양을 효과적으로 감소시켰다.

또한 도 8에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분은 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 증가한 젤라티나제(MMP-2)의 발현양을 효과적으로 감소시켰다.

실험예 6 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라겐 합성 촉진 효과 : 프로콜라겐 타입 1 C-펩타이드(Procollagen Type 1 C-peptide; PIP)의 측정

본 발명의 미네랄 복합성분의 콜라겐 합성 촉진 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

96-웰 플레이트의 각 웰에 항체-POD(horseradish peroxidase) 컨쥬게이트 용액 100㎕를 넣고 1/2씩 미리 희석해둔 표준물질(PIP 640 ng/㎖)과 동일한 단백질 양의 상기 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분(0.244 ㎍/㎖)을 넣고 잘 혼합한 후, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 3시간 후 안의 반응물을 제거한 웰에 PBS 400㎕를 첨가하여 4회 정도 세척하고, 기질을 100㎕ 씩 첨가한 후 20~30℃에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 정지용액(stop solution, 1N H₂SO₄)을 100㎕ 씩 첨가하여 청록색에서 노란색으로 변한 반응물의 흡광도를 450㎚에서 측정하였다. 양성대조군으로는 비타민 C를 사용하였으며, 비타민 C도 세포독성이 나타나지 않는 최고농도(35 ㎍/㎖)에서 처리하였다.

결과는 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분은 대조군에 비해 프로콜라겐 생합성을 60% 정도 촉진시켰다. 또한, 실시예 2 또는 실시예 3에서 제조한 미네랄 복합성분도 대조군에 비해 프로콜라겐 생합성을 60% 정도 촉진시켰다. 이에 비해 비타민 C는 약 30% 정도 프로콜라겐 생합성을 촉진시켰으며, 비교예 1 또는 비교예 2에서 제조한 미네랄 복합성분은 프로콜라겐 생합성을 거의 촉진시키지 못하였다. 따라서, 본 발명에 따른 연옥 및 유기 게르마늄의 함량으로 제조된 미네랄 복합체가 효과적으로 콜라겐 합성을 촉진하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 엘라스타제 활성저해 효과

본 발명의 미네랄 복합성분의 엘라스타제 활성저해 효과를 알아보기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

0.2M 트리스-HCl(pH 8.0) 80㎕에 3.2 mM의 Succ-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide 120㎕, 상기 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분(0.244 ㎍/㎖) 100 ㎕를 혼합하였다. 여기에 1U의 사람 백혈구 엘라스타제(Human Leukocytes Elastase)를 1㎖의 0.2 M 트리스-HCl(pH 8.0)로 용해시킨 뒤 50㎕(50 mU)를 넣었다. 25℃에서 15분간 효소 활성화 반응을 시켰다. 대조군은 미네랄 복합성분 100 ㎕ 대신 같은 양의 증류수를 가하여 동일 조건에서 반응시켰다. 반응 후 ELISA 판독기를 사용하여 415㎚에서 대조군과 각 시료의 흡광도 값을 측정하였다.

결과는 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 1, 실시예 2 또는 실시예 3에서 제조한 미네랄 복합성분은 엘라스타제 활성을 대조군에 비해 약 40% 정도 감소시켰다. 반면에 비교예 1 또는 비교예 2에서 제조한 미네랄 복합성분은 엘라스타제 활성에 거의 영향을 미치지 못하였다. 따라서, 본 발명에 따른 연옥 및 유기 게르마늄의 함량으로 제조된 미네랄 복합체의 엘라스타제 활성 저해 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실험예 8 : 본 발명의 미네랄 복합성분의 간세포에 대한 재생촉진 효과

본 발명의 미네랄 복합성분의 간세포에 대한 재생촉진 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

1. 간 재생 실험의 재료

실험동물로는 간 재생능력이 다른 동물들에 비해 뛰어난 흰쥐를 실험모델로 하였으며, 동물 사육실에서 표준사료와 물로 2주일 동안 기초 사육한 체중 140g 내외의 5주령 Sprague-Dowley 계통의 웅성 흰쥐를 사용하였다. 실험군은 부분 간 절제 3일 전부터 매일 1회씩 상기 실시예 1에서 제조한 미네랄 복합성분을 희석하여 삽관투여하였고, 대조군은 생리식염수만을 동일한 방법으로 처리하였다. 본 실험에 이용된 시약들은 Sigma 사의 제품과 시판중인 분자생물학 시약 전문업체들로부터 특급 제품을 구매하여 사용하였다.

2. 흰쥐의 간 조직 준비(Partial hepatectomy)

흰쥐의 간을 부분 절제하는 방법은 히긴스와 앤더슨의 방법(Higgins G, M., Anderson, R.M., Experimental pathology of liver, Arch Pathol; 12, 186-202, 1936)을 개선하여 적용하였다. 간 재생을 자극하기 위하여, 웅성 흰쥐를 약한 에테르로 마취시키고, 약 70% 정도 간 절제술을 실시하였다. 즉, 약한 에테르 마취 상태에서 절개부위를 알콜로 소독하고 털을 제거한 후 복부의 중앙부위에서부터 검상돌기 위쪽까지 복개하였다. 절개할 간의 인대를 제거한 후, 수직으로 들어올려 혈관을 명주실로 묶고 가능한 한 혈관에 가까운 곳을 절단하여(중엽과 좌엽, 약 70%) 간을 제거하였다. 이어서 근육과 피부를 봉합하고 소독을 하였다. 수술 후 6시간, 3일 및 7일 경과한 날 희생시켜 실험재료로 사용하였다.

3. 광학현미경 표본제작

10% 포르말린에 고정된 간을 흐르는 물에 수세하여 조직 내에 남아있는 포르말린을 제거하였다. 그 다음 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 까지 에탄올 농도 상승 순으로 각각 1시간씩 탈수하였다. 자일렌(xylene)에 1시간씩 2회 치환하였고, 파라핀 침투과정을 거친 후 파라핀에 포매하여 블록을 제작하였다. 이렇게 준비된 파라핀 블록을 회전형 박절기(microtome, Leica사)를 사용하여 7㎛ 두께로 자른 뒤, 슬라이드 글라스(slide glass) 위에 부착하고 자일렌에서 3~5분 동안 2회에 걸쳐 파라핀을 제거하였다. 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 이중염색을 하고, 캐나다발삼(canada balsam)으로 봉입한 후 광학현미경으로 검경하고, 사진촬영을 실시하였다.

결과는 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타난 바와 같이, 부분 절제한 흰쥐의 간에 본 발명의 미네랄 복합성분을 처리한 실험군의 경우, 부분 간 절제 후 3일 이후부터 남아있는 간의 크기가 증가되었으며, 7일째에는 정상 대조군의 간 크기와 유사한 정도로 증가된 것을 육안으로 확인하였다. 또한, 간 재생 중에 나타나는 형태학적 변화로서, 6시간이 경과한 실험군에서는 중심정맥 주위의 간 세포판이 붕괴되고 군데군데 세포들이 군집을 이루고 있는 것이 관찰되었으며, 두 개의 핵을 가진 세포들이 증가하였고, 세포질에 대한 핵의 크기가 정상 대조군에 비해 큰 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 과정은 본 발명의 미네랄 복합성분을 처리한 실험군에서 세포분열상이 더욱 뚜렷하게 관찰되었다. 이는 본 발명의 미네랄 복합성분이 물질대사과정에서 발생하는 발생기 산소를 제거하는 효소의 작용을 조절함으로써 세포분열과 분화가 촉진되는 효과인 것으로 판단된다.

따라서, 본 발명의 미네랄 복합성분은 간세포에 대한 재생촉진 효과를 통해서 피부세포의 재생 촉진효과를 예측할 수 있다.

실험예 9 : 피부누적 자극 시험

본 발명의 미네랄 복합성분의 사람 피부에 대한 안전성을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

상기 실시예 1~3에서 제조한 미네랄 복합성분을 함유하는 영양크림(제제-A,B,C)을 사용하여, 20~40대의 건강한 성인 남녀 30명(남자-15명, 여자-15명)을 대상으로 윗 팔뚝 부위에 격일로 총 9회의 24시간 누적첩포를 시행하여, 본 발명에 따른 미네랄 복합성분이 피부에 자극을 주는지의 여부를 측정하였다.

첩포 방법은 핀 챔버(Finn chamber, Epitest Ltd, 핀란드)를 이용하였다. 챔버에 미네랄 복합성분을 함유하는 영양크림(제제-A,B,C)을 각각 15㎕씩 적하한 후 첩포를 실시하였다. 매회 피부에 나타난 반응 정도를 하기 수학식 2를 이용하여 점수화하였다.

평균 반응도 = {[(반응지수×반응도) / (총피검자수×최고점수(4점))] × 100} ÷ 검사횟수 (9회)

이때, 반응도에서 ±는 1점, +는 2점, ++는 4점의 점수를 부여하며, 평균 반응도가 3 미만일 때 안전한 물질로 판정하였다.

결과는 표 3에 나타내었다.

	반응이 나타난 피검자 수									평균 반응도
	1주			2주			3주
	1차	2차	3차	4차	5차	6차	7차	8차	9차
	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++	±+ ++
제제-A	2 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
제제-B	2 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
제제-C	2 - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	- - -	0.18
피검인원	30	30	30	30	30	30	30	30	30

표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 미네랄 복합성분을 포함하는 영양크림의 경우 ±, +, ++에 해당하는 사람의 수가 각각 2명, 0명, 0명이었고, 그 외 나머지는 반응이 나타나지 않았다. 또한, 평균 반응도가 0.18로 3 미만이므로, 인체 피부에 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 : 화장료 제제

1. 유연화장수 (함량 : 중량%)

미네랄 복합성분 0.01

글리세린 3.0

부틸렌 글리콜 2.0

프로필렌 글리콜 2.0

카복시비닐폴리머 0.1

에탄올 10.0

트리에탄올아민 0.1

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

2. 영양화장수 (함량 : 중량%)

미네랄 복합성분 0.01

밀납 4.0

폴리소르베이트 60 1.5

소르비탄세스퀴올레이트 0.5

유동파라핀 5.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 5.0

글리세린 3.0

부틸렌 글리콜 3.0

프로필렌 글리콜 3.0

카복시비닐폴리머 0.1

트리에탄올아민 0.2

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

3. 맛사지 크림 (함량 : 중량%)

미네랄 복합성분 0.005

밀납 10.0

폴리소르베이트 60 1.5

소르비탄세스퀴올레이트 0.8

유동파라핀 40.0

스쿠알란 5.0

카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드 4.0

글리세린 5.0

부틸렌 글리콜 3.0

프로필렌 글리콜 3.0

트리에탄올아민 0.2

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

4. 팩 (함량 : 중량%)

미네랄 복합성분 0.005

폴리비닐알콜 13.0

소듐카복시메틸셀룰로스 0.2

알란토인 0.1

에탄올 5.0

노닐페닐에테르 0.3

방부제, 미량색소, 미량향료, 미량정제수 잔량

총계 100.0

본 발명의 미네랄 복합성분은 우수한 항산화 활성을 가지며, 세포독성이 없고, 사람 진피의 섬유아 세포주인 HDF에 자외선(UVA) 조사 후 증가한 콜라게나제 (MMP-1) 및 젤라티나제(MMP-2)의 활성 저해 효과와 콜라게나제(MMP-1)의 mRNA 및 젤라티나제(MMP-2)의 mRNA 발현 저해 효과가 우수하며, 콜라겐 합성 촉진 효과 및 엘라스타제 활성저해 효과도 우수하고, 간세포에 대한 재생촉진 효과가 우수하며, 사람 피부에 자극이 없고 안전하므로, 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물에 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (4)

1. 연옥 1~10 중량%, 활석 10~20 중량%, 백운모 20~35 중량%, 견운모 10~20 중량%, 고령토 35~45 중량%, 해부석 1~3 중량% 및 유기 게르마늄 0.1~0.3 중량% 를 함유한 미네랄 복합성분을 포함하는 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 삭제
3. 청구항 1에 있어서, 상기 미네랄 복합성분의 함량은 화장료 조성물의 총 중량에 대해 0.0001 내지 10.0 중량%인 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나로 제형화되는 것을 특징으로 하는 주름 개선용 화장료 조성물.

Images