KR100984567B1 - Novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and production method of nucleoside diphosphate-glucose using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스 합성효소 및 이를 이용한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소, 상기 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균에 관한 것이며, 또한 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 생산하는 방법 및 상기 합성효소를 이용하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스를 생산하는 방법은, 당쇄화합물(Glyco-conjugate)의 올리고 당쇄(Glyco-chain)를 합성하는데 필수적인 기질인 고가의 뉴클레오티드-당류(NDP-sugar)를 반응단계를 줄여 아주 경제적으로 생산할 수 있으며, 반응 부산물인 뉴클레오시드 디포스페이트를 다시 재활용할 수 있는 매우 효과적인 방법이다.The present invention relates to a novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and a method for producing nucleoside diphosphate-glucose using the same, and more particularly to a novel nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase The present invention relates to a polynucleotide encoding the synthetase, a recombinant expression vector into which the polynucleotide is inserted, and a bacterium transformed with the recombinant expression vector, and the present invention further comprises culturing the transformed bacterium to nucleoside diphosphate. It relates to a method for producing a glucose (NDP-glucose) synthase and a method for producing a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) using the synthetase. In particular, the method of producing the nucleoside diphosphate-glucose of the present invention reacts an expensive nucleotide-saccharide (NDP-sugar) which is an essential substrate for synthesizing an oligo-glyco-chain of a glyco-conjugate. It can be produced very economically with fewer steps, and is a very effective way to recycle the reaction byproduct nucleoside diphosphate again.

뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스 합성효소, 트레할로스, 뉴클레오시드 디포스페이트 Nucleoside diphosphate-glucose synthase, trehalose, nucleoside diphosphate

Description

신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스 합성효소 및 이를 이용한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스의 생산방법{Novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and production method of nucleoside diphosphate-glucose using the same}Novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and production method of nucleoside diphosphate-glucose using the same} Novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and nucleoside diphosphate-glucose

본 발명은 신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스 합성효소 및 이를 이용한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소, 상기 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균에 관한 것이며, 또한 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 생산하는 방법 및 상기 합성효소를 이용하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and a method for producing nucleoside diphosphate-glucose using the same, and more particularly to a novel nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase The present invention relates to a polynucleotide encoding the synthetase, a recombinant expression vector into which the polynucleotide is inserted, and a bacterium transformed with the recombinant expression vector, and the present invention further comprises culturing the transformed bacterium to nucleoside diphosphate. It relates to a method for producing a glucose (NDP-glucose) synthase and a method for producing a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) using the synthetase.

올리고당(oligosaccharide)은 단당류가 글리코시드 결합을 한 것으로 단당 2 개로 이루어지는 이당류로부터 단당 10개로 이루어지는 십당류까지의 당류를 총칭한다. 상기 올리고 당은 최근 설탕으로 인한 비만, 당뇨등 부정적인 결과로 인해 이에 대한 대체 물질의 하나로 새로운 당류로 부각되고 있는 물질로, 난 소화성으로서 저칼로리를 나타내며 충치 예방효과가 있고 장내 유용 미생물인 비피더스균에 의해 선택적으로 이용될 수 있는 물질이다.Oligosaccharide is a monosaccharide is a glycosidic linkage is a generic term for sugars ranging from disaccharides consisting of two monosaccharides to ten sugars consisting of ten monosaccharides. The oligosaccharide has recently emerged as a new sugar as one of the substitutes due to the negative effects such as obesity and diabetes caused by sugar, exhibits low calorie as an indigestible digestive effect, prevents tooth decay, and is caused by Bifidobacteria, an intestinal useful microorganism. It is a material that can optionally be used.

특히 상기 올리고당은 당쇄(complex oligosaccharide)형태로 당단백질, 당지질, 호르몬 및 항생제 등과 같은 배당체(glycoconjugates)에 함유되어 있으며 상기 올리고 당쇄(complex oligosaccharide)는 정상 세포 또는 종양세포 내외의 정보전달 물질로 이용되기도 하며, 항원의 리간드, 호르몬과 항생제 기능조절 등에 중요한 역할을 담당하고 복합기능 정보 전달체로 인식되는 물질이기도 하다 (Hindsgaul, et al., Molecular Glycobiology, Oxford University Press, 1994; Varki, Glycobiology, 3: 97, 1993; Dwek, Chem. Rev., 96, 683, 1996). 따라서 상기 올리고 당쇄를 이용하여 시알릴-레x(Sialyl-Lex), PSGL-1 및 Galα1-3Gal-R 등과 같은 항염증과 면역기능 조절능을 갖는 소재가 개발되기도 하였다. In particular, the oligosaccharides are contained in glycoconjugates such as glycoproteins, glycolipids, hormones, and antibiotics in the form of complex oligosaccharides, and the oligosaccharides may be used as information transmitting materials inside or outside normal cells or tumor cells. It is also a substance that plays an important role in regulating ligands of hormones, hormones and antibiotics and is recognized as a multifunctional information carrier (Hindsgaul, et al., Molecular Glycobiology , Oxford University Press, 1994; Varki, Glycobiology , 3: 97). , 1993; Dwek, Chem. Rev. , 96, 683, 1996). Therefore, materials having anti-inflammatory and immune function regulating ability, such as sialyl-lex, PSGL-1 and Galα1-3Gal-R, have been developed using the oligosaccharide chain.

상기와 같이 유용한 올리고 당쇄는 화학적 방법으로 합성될 수 있으나 수율이 현저히 낮고 유기 용매를 사용하는데 문제가 있어 경제적이지 못하다.Useful oligosaccharide chains as described above can be synthesized by chemical methods, but the yield is remarkably low and there is a problem in using an organic solvent is not economical.

이에 따라 올리고 당쇄를 효소를 이용하여 합성하는 방법이 개발되었으며 Leloir 글리코실 전이효소(glycosyltransferases)에 의한 공정이 높은 수율과 입체 특이성을 보이기 때문에 주로 이용되고 있다. 상기 Leloir 글리코실 전이효소는 뉴 클레오티드-당류(nucleotide-sugars)의 당 부분을 절단한 후 비 당체 혹은 올리고 당쇄에 연속적으로 단당류를 당 전이시키는 작용을 하는 효소이다(Crawley, et al., Modern Methods Carbohydr. Synth., 492, 1996; Ichikawa, et al., Glycopeptides and Related Compounds, Marcel Dekker, New York, 79, 1997). 그러나 상기와 같은 올리고 당쇄의 합성방법은 뉴클레오티드-당류의 가격이 매우 비싸서 또한 경제적이지 못한 단점이 지적되어 왔다(Wong, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 34, 412, 1995; Kato et al., Biotechnol. Bioeng. 89, 424, 2005; Hidari et al., Glycoconj . J. 22, 1, 2005).Accordingly, a method of synthesizing oligosaccharide chains using enzymes has been developed and is mainly used because the process by Leloir glycosyltransferases shows high yield and stereospecificity. The Leloir glycosyl transferase is an enzyme that cleaves the sugar portion of nucleotide-sugars and subsequently transfers sugars monosaccharides to non-saccharide or oligosaccharide chains (Crawley, et al., Modern Methods Carbohydr.Synth. , 492, 1996; Ichikawa, et al., Glycopeptides and Related Compounds , Marcel Dekker, New York, 79, 1997). However, the synthesis method of the oligosaccharide chain as described above has been pointed out that the cost of the nucleotide-saccharides is very expensive and also uneconomical (Wong, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. , 34, 412, 1995) Kato et al., Biotechnol. Bioeng. 89, 424, 2005; Hidari et al., Glycoconj . J. 22, 1, 2005).

이에 따라 피로포스포리라아제(pyrophosphorylase)를 이용하여 뉴클레오티드-당류(nucleotide-sugars)의 효율적인 대량합성을 수행하고 합성 결과의 부산물로 얻어지는 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)를 재활용하는 방법이 개발되었다. 구체적으로 상기 피로포스포리라아제는 당-인산(sugar 1-phosphate)과 뉴클레오시드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate)로부터 뉴클레오시드 디포스페이트-당류를 합성하고, 상기 Leloir 글리코실 전이효소(glycosyltransferases)가 이를 이용하여 당 전이반응을 수행함으로써 올리고 당쇄가 합성되며, 상기 합성 결과의 부산물로 얻어지는 뉴클레오시드 디포스페이트는 다시 인산화효소(kinase)에 의해 뉴클레오시드 트리포스페이트로 복원되어 뉴클레오티드-당류 합성에 재활용되는 방법이다. 그러나 상기 방법은 상기 반응부산물인 뉴클레오시드 디포스페이트의 피드백 저해(feedback inhibition)를 극복하는 방법이지만, 합성 및 재활용 과정에서 두 가지 효소(피로포스포리라아제, 인산화효소)가 필요하고, 값이 비싼 당-인산이 소모 되어 여전히 비경제적인 문제점이 있었다(Weston, et al., J. Biol. Chem., 267, 4152, 1992; Heidlas, et al., J. Org. Chem., 57, 152, 1992; Ichikawa, et al., Meth. Enzymol ., 247, 107, 1994).Accordingly, a method for efficient mass synthesis of nucleotide-sugars using pyrophosphorylase and recycling of nucleoside diphosphate (NDP) obtained as a by-product of the synthesis has been developed. Specifically, the pyrophosphorylase synthesizes nucleoside diphosphate-saccharides from sugar 1-phosphate and nucleoside triphosphate, and the Leloir glycosyltransferases are The oligosaccharide chain is synthesized by performing a sugar transfer reaction using this, and the nucleoside diphosphate obtained as a by-product of the synthesis is restored to nucleoside triphosphate by kinase and recycled for nucleotide-saccharide synthesis. That's how it is. However, the method comprising the two enzymes (fatigue phosphorylation will kinase, kinases) is necessary, and the value in the process, but the synthesis, and recycling the process of overcoming the feedback inhibition (feedback inhibition) of a nucleoside diphosphate wherein the reaction by-products Expensive sugar-phosphate was consumed and there was still an uneconomic problem (Weston, et al., J. Biol. Chem. , 267, 4152, 1992; Heidlas, et al., J. Org.Chem . , 57, 152, 1992;... Ichikawa, et al, Meth Enzymol, 247, 107, 1994).

한편 초고온성 미생물(Hyperthermophile)은 최소 80℃가 넘는 곳에서 사는 미생물을 말하며, 1980년대 해저 화산 분출구 지역에서 독일의 스테터 박사에 의해 최초로 발견된 뒤로 현재까지 수십 종이 발견되었다. 상기 초고온성 미생물에는 파이롤로부스(Pyrolobus)속 균, 써모토가(Thermotoga)속 균 및 파이로코커스(Pyrococcus)속 균 등이 이에 포함되며, 이들 세포내에는 트레할로스(trehalose) 관련 효소를 발현하거나 함유하는 경우가 있는 것으로 알려져 있으나 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스 합성효소(NDP-glucose)와 관련하여서는 전혀 알려진 바가 없다.Hyperthermophile, meanwhile, refers to microorganisms that live at least 80 ° C, and dozens of them have been discovered to date since they were first discovered by Dr. Stether of Germany in the 1980's undersea volcanic eruption area. The hyperthermic microorganisms include Pyrolobus spp., Thermorgaga spp. And Pyrococcus spp., And these cells express trehalose-related enzymes. It is known to contain, but is not known in relation to nucleoside diphosphate-glucose synthase (NDP-glucose).

이에 본 발명자들은 고가인 뉴클레오티드-당류의 효과적인 합성 방법 및 반응 부산물인 뉴클레오시드 디포스페이트의 피드백 저해를 극복하는 방법에 대해 연구하던 중, 초 고온성 미생물에서 값싼 당질원료인 트레할로스(trehalose) 및 뉴클레오티드 디포스페이트를 기질로 하는 신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스 합성효소(NDP-glucose)를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.Therefore, the present inventors are studying the effective method of synthesizing expensive nucleotide-saccharides and overcoming feedback inhibition of the reaction by-product nucleoside diphosphate, while trehalose and nucleotides, which are inexpensive saccharides in ultra-high temperature microorganisms, The present invention was completed by developing a novel nucleoside diphosphate-glucose synthase (NDP-glucose) based on diphosphate.

본 발명의 과제는 신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소 및 이를 이용하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스를 합성하는 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to provide a novel nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthetase and a method for synthesizing nucleoside diphosphate-glucose using the same.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 In order to solve the above problems, the present invention

(a) 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 (a) has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or

(b) 상기 (a)의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상의 상동성(homology)이 있는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 제공한다.(b) providing a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase having an amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence of (a).

또한 본 발명은 상기 본 발명의 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.The present invention also provides a polynucleotide encoding the synthetase of the present invention.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 발현벡터를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a recombinant expression vector into which the polynucleotide is inserted.

또한 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균을 제공한다.The present invention also provides a bacterium transformed with the recombinant expression vector.

또한 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 생산하는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of producing a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase by culturing the transformed bacteria.

또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 및 트레할로스(trehalose)에 반응시켜 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention is the reaction of nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention to nucleoside diphosphate (NDP) and trehalose (nucleoside diphosphate-glucose) (NDP-glucose) Provide a way to produce.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는 트레할로스(trehalose) 및 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)를 기질로 하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스를 합성하는 활성이 있는 효소이며 현재까지 상기와 같은 활성이 있는 효소로 알려진 것은 전혀 없다.The nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention is an enzyme having an activity for synthesizing nucleoside diphosphate-glucose using trehalose and nucleoside diphosphate (NDP) as substrates. To date, there is no known enzyme with such activity.

본 발명자들은 초고온성 미생물에서 세포내 트레할로스 관련 효소를 함유하고 있는 경우가 있음을 알고, 초고온성 미생물인 써모토가속 균(Thermotoga maritima ATCC 700860)의 전체 게놈을 대상으로 그 기능이 알려지지 않은 유전자를 선별하여 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열(서열번호 3) 및 아미노산 서열(서열번호 4)을 결정하였다(<실시예 1> 참조).The inventors have found that the ultra-high temperature microorganisms may contain an intracellular trehalose-related enzyme, and thus the thermo-to- accelerated microorganism ( thermotoga) A gene of unknown function was selected from the entire genome of maritima ATCC 700860) to determine the polynucleotide sequence (SEQ ID NO: 3) and amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of the gene (see <Example 1>).

상기 결정된 아미노산 서열(서열번호 4)을 트레할로스 6-포스페이트(trehalose 6-phosphate) 합성효소의 아미노산 서열과 비교한 결과, 상기 효소의 뉴클레오티드-당 결합 부위의 아미노산 서열과 상당히 높은 유사성이 있음을 알아냈으며, 또한 상기 결정된 아미노산 서열을 글리코실 전이효소 그룹 1(glycosyltransferase group 1, Pfam00534)의 아미노산 서열과 비교한 결과 상당 히 높은 유사성이 있음을 알아내었다(결과 미도시). 특히 상기 계열에 속하는 글리코실 전이효소는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)에서 글루코오스 부분을 전이시켜 글리코시드 결합(glycosidic bonds)을 형성시키는 활성이 있음이 알려져 있어(J. A. Campbell et al., Biochem . J. 326, 929, 1997), 상기 아미노산 서열(서열번호 4)에 의해 결정되는 본 발명의 효소는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)와 트레할로스에 대한 결합 특이성 및 이와 관련된 당 전이 촉매 기작에 관여할 것으로 판단하였다(<실시예 2> 참조).Comparing the determined amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) with the amino acid sequence of trehalose 6-phosphate synthase, it was found that there is a considerable high similarity with the amino acid sequence of the nucleotide-sugar binding site of the enzyme In addition, the amino acid sequence of the determined amino acid sequence compared to the amino acid sequence of glycosyltransferase group 1 (Glycosyltransferase group 1, Pfam00534) was found to have a significantly high similarity (result not shown). In particular, glycosyl transferase belonging to the family is known to have the activity of transferring glycosides from nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) to form glycosidic bonds (JA Campbell et al. , Biochem . J. 326, 929, 1997), the enzyme of the present invention determined by the amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) is characterized in that the binding specificity for nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) and trehalose and related It was determined to be involved in the sugar transfer catalyst mechanism (see <Example 2>).

따라서 본 발명자들은 본 발명의 서열번호 3을 가지는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 본 발명의 서열번호 4를 가지는 효소를 생산하기 위해, 당업자에게 공지된 방법에 따라 발현벡터에 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조하였으며, 이를 이용하여 대장균을 형질전환함으로서 재조합 단백질을 수득하였다(<실시예 3> 참조). 이후 상기 수득된 본 발명의 효소를 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 및 트레할로스(trehalose)에 반응시킨 결과, 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)가 생산됨(도 3 참조)을 확인하여, 본 발명의 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 효소는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 합성하는 활성이 있음을 알 수 있었다(<실시예 5> 참조).Therefore, the present inventors can express the polynucleotide having SEQ ID NO: 3 of the present invention to produce an enzyme having SEQ ID NO: 4, by inserting the polynucleotide in the expression vector according to a method known to those skilled in the art recombinant recombinant vector Was prepared, and recombinant protein was obtained by transforming E. coli using this (see <Example 3>). After the reaction of the obtained enzyme of the present invention to nucleoside diphosphate (NDP) and trehalose (trehalose), it was confirmed that the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) is produced (see Fig. 3) It was found that the enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the present invention has an activity of synthesizing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) (see <Example 5>).

한편, 본 발명자들은 또 다른 초고온 미생물에서도 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성활성이 있는 효소가 있는지 여부를 확인하기 위해 파이로코커스속 균(Pyrococcus horikoshii ATCC 43589)의 전체 게놈을 대상으로 또 다시 그 기능이 알려지지 않은 유전자를 선별하여 상기와 동일한 실험을 진행하였다. 그 결과 본 발명의 서열번호 9로 표시되는 폴리뉴클레오티드와 이것이 발현된 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 효소가 개발 및 생산되었으며 상기 본 발명의 효소 또한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 합성하는 활성이 있음을 알 수 있었다(<실시예 6> 및 <실시예 8>내지 <실시예 11> 참조).On the other hand, the inventors of the present invention Pyrococcus to determine whether there is an enzyme that has nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesis activity in another ultra-high temperature microorganism Horikoshii ATCC 43589) genes whose functions are unknown again were selected from the entire genome, and the same experiment was conducted. As a result, an enzyme of the present invention having a polynucleotide represented by SEQ ID NO: 9 of the present invention and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 expressed therein has been developed and produced. The enzyme of the present invention is also a nucleoside diphosphate-glucose ( NDP-glucose) was found to have activity (see <Example 6> and <Example 8> to <Example 11>).

또한 본 발명의 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소와 본 발명의 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 효소의 아미노산 서열을 비교해 본 결과 약 70% 정도의 상동성(homology)이 있는 것으로 판단되었다(<실시예 7> 및 도 4 참조).In addition, the results of comparing the amino acid sequence of the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthetase having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 of the present invention and the enzyme having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 of the present invention It was judged that there was about 70% homology (see <Example 7> and Figure 4).

따라서 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상의 상동성(homology)이 있는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 제공하는 것을 특징으로 한다.Accordingly, the present invention provides a nucleoside diphosphate-glucose synthase having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or having an amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence. It is characterized by providing.

상기 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상의 상동성(homology)이 있는 아미노산 서열은, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖 는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소와 실질적으로 동등한 생리 활성을 나타내는 '기능적 동등물'을 말한다.The amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 is a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Refers to a 'functional equivalent' that exhibits substantially equivalent physiological activity.

상기에서 '동등한 생리활성'이란 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성을 촉진시키는 활성을 말한다. 상기 기능적 동등물은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상의 서열 상동성(homology)을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열일 수 있다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상의, 바람직하게는 80％, 더욱 바람직하게는 90％이상의 서열 상동성(즉, 동일성)을 갖는 것으로, 예를 들면 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 79％, 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 100％의 서열 상동성(homology)을 갖는 것을 포함하며, 서열번호 4의 아미노산 서열과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 아미노산 서열을 말한다. 본 명세서에서 서열 상동성(homology) 및 동질성은 서열번호 4의 아미노산 서열과 후보 서열을 정렬하고 갭(gaps)을 도입한 후 서열번호 4의 아미노산 서열에 대한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 필요한 경우, 최대 백분율 서열 동질성을 수득하기 위하여 서열 동질성의 부분으로서 보존적 치환은 고려하지 않는다. 서열번호 4의 아미노산 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부 신장, 결손 또는 삽입은 서 열 동질성 또는 상동성(homology)에 영향을 주는 서열로서 해석되지 않는다. 또한 상기 서열 동질성은 두개의 아미노산 서열의 유사한 부분을 비교하기 위해 사용되는 일반적인 표준 방법에 의해 결정할 수 있다. BLAST 또는 FASTA와 같은 컴퓨터 프로그램은 두 개의 아미노산 서열을 최적으로 매칭(matching) 되도록 정렬한다(하나 또는 두 서열의 전장서열을 따라 또는 하나 또는 두 서열의 예측된 부분을 따라). 상기 프로그램은 디펄트 오프닝 패널티(default opening penalty) 및 디펄트 갭 페널티(default gap penalty)를 제공하며 컴퓨터 프로그램과 함께 연계되어 사용될 수 있는 PAM25(표준 스코링 매트릭스; Dayhoff et al., in Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978)와 같은 스코링 매트릭스를 제공한다. 예를 들어, 백분율 동질성은 다음과 같이 계산할 수 있다: 일치하는 서열(indentical matches)의 총 수에 100을 곱한 다음 대응되는 스팬(machted span) 내의 보다 긴 서열의 길이와 두 서열을 정렬하기 위해 보다 긴 서열내로 도입된 갭(gaps)의 수의 합으로 나눈다. 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경이 이에 포함된다.As used herein, 'equivalent physiological activity' refers to an activity for promoting nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesis. The functional equivalent may be an amino acid sequence having at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more sequence homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4. Most preferably, it may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. The term "functional equivalent" means a sequence homology (ie, identity) of at least 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 as a result of the addition, substitution or deletion of an amino acid. Having, for example, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84% , 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% It refers to an amino acid sequence having a homology (homology), and exhibits a physiological activity substantially identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. Sequence homology and identity are defined herein as the percentage of amino acid residues in the candidate sequence relative to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 after aligning the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 with the candidate sequence and introducing a gap . If necessary, conservative substitutions as part of sequence homogeneity are not considered in order to obtain maximum percentage sequence identity. N-terminal, C-terminal, or internal elongation, deletion or insertion of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 is not to be construed as a sequence affecting sequence homology or homology. The sequence homogeneity can also be determined by common standard methods used to compare similar portions of two amino acid sequences. Computer programs such as BLAST or FASTA align the two amino acid sequences to optimally match (either along the full length of one or two sequences or along the predicted portion of one or two sequences). The program provides a default opening penalty and default gap penalty and can be used in conjunction with a computer program (PAM25 (Standard Scoring Matrix; Dayhoff et al., In Atlas of Protein) Scoring metrics such as Sequence and Structure, vol 5, supp. 3, 1978). For example, the percent identity can be calculated as follows: multiply the total number of indentical matches by 100, and then align the two sequences with the length of the longer sequence in the corresponding machted span. Divide by the sum of the number of gaps introduced into the long sequence. The scope of functional equivalents of the present invention also includes polypeptide derivatives in which some chemical structures of the polypeptide have been modified while maintaining the basic backbone of the polypeptide and its physiological activity. For example, this includes structural modifications for altering the stability, shelf life, volatility or solubility of the polypeptide of the present invention.

또한 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상의 상동성(homology)이 있는 아미노산 서열을 갖 는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 특징으로 한다.The present invention also provides a nucleoside diphosphate-glucose synthetase having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence. It provides a polynucleotide encoding the.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 갖거나 또는 상기 아미노산 서열과 적어도 70％ 이상의 상동성(homology)이 있는 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 암호화하는 물질을 말하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 9로 표시되는 DNA일 수 있다.The polynucleotide of the present invention has nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesis having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 or having an amino acid sequence having at least 70% homology with the amino acid sequence. Refers to a substance encoding an enzyme, the polynucleotide may be DNA or RNA, preferably DNA represented by SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 발현벡터를 제공하는 것을 특징으로 한다.In another aspect, the present invention provides a recombinant expression vector inserted with the polynucleotide of the present invention.

상기 재조합 발현벡터는 당업자들이 당업계에 알려진 어떠한 방법에 따라 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 벡터내로 삽입하여 적절한 전사/해독 조절서열을 이용하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 암호화하도록 제조된 발현벡터를 말한다.The recombinant expression vector encodes a nucleoside diphosphate-glucose synthetase by inserting the polynucleotide of the present invention into the vector according to any method known in the art using an appropriate transcriptional / translational regulatory sequence. Refers to an expression vector prepared to

상기 "발현 벡터"라는 용어는 본 발명의 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당업계에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발 현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.The term "expression vector" refers to a plasmid, virus or other media known in the art in which a polynucleotide sequence encoding a protein of the invention can be inserted or introduced. The polynucleotide sequence according to the present invention may be operably linked to an expression control sequence, wherein the operably linked gene sequence and the expression control sequence are one expression containing a selection marker and a replication origin together. Can be included in a vector. “Operably linked” can be genes and expression control sequences linked in such a way as to enable gene expression when the appropriate molecule is bound to the expression control sequences. An "expression control sequence" refers to a DNA sequence that controls the expression of a polynucleotide sequence operably linked in a particular host cell. Such regulatory sequences include promoters for carrying out transcription, any operator sequence for regulating transcription, sequences encoding suitable mRNA ribosomal binding sites, and sequences that control termination of transcription and translation.

상기 본 발명의 합성효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있는 벡터로는 대장균 유래 플라스미드(pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c 및 pGEX-GST), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5), 효모 유래 플라스미드(YEp13, YEp24 및 YCp50) 및 Ti 플라스미드 등이 있고, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스 및 식물 바이러스가 사용될 수 있으며, pPZP, pGA 및 pCAMBIA 계열과 같은 바이너리 벡터를 사용할 수 있다. 당업자라면 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 도입시키는데 적합한 벡터를 선택할 수 있으며, 본 발명에서는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열을 숙주 세포내로 도입할 수 있는 벡터라면 어떠한 벡터라도 모두 사용할 수 있다. 그러나 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 백터인 pET30a 벡터 또는 p6×His119 벡터를 사용할 수 있다(T. J. Kim et al., Appl . Environ . Microbiol ., 65: 1644, 1999).As a vector into which the polynucleotide encoding the synthetase of the present invention can be inserted, E. coli-derived plasmids (pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pET30a, pET30c and pGEX-GST), and Bacillus subtilis-derived plasmids (pUB110 and pTP5) ), Yeast derived plasmids (YEp13, YEp24 and YCp50) and Ti plasmids, animal viruses such as retroviruses, adenoviruses or vaccinia viruses, insect viruses such as baculoviruses and plant viruses can be used, pPZP, Binary vectors such as the pGA and pCAMBIA families can be used. Those skilled in the art can select a vector suitable for introducing the polynucleotide sequence of the present invention, and any vector can be used as long as the vector can introduce the polynucleotide sequence of the present invention into a host cell. However, preferably, a vector designed to facilitate protein expression induction and isolation of the expressed protein may be used, and more preferably, a pET30a vector or a p6 × His119 vector, which is a recombinant vector comprising the polynucleotide of the present invention, may be used. (TJ Kim et al., Appl . Environ . Microbiol ., 65: 1644, 1999).

또한 본 발명은 상기 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 세균을 제공하는 것을 특징으로 한다.In another aspect, the present invention is characterized by providing a bacteria transformed with the recombinant expression vector of the present invention.

상기 형질전환된 세균은 당업자들이 당업계에 공지된 방법에 따라 본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 형질전환시킨 세균을 말하며 상기 세균은 이에 한정되지는 않지만 바람직하게는 대장균(E.coli)일 수 있으며 가장 바람직하게는 대장균 BL21 또는 대장균 MC 1061일 수 있다.The transformed bacterium refers to a bacterium transformed using the recombinant expression vector of the present invention according to a method known in the art, and the bacterium may be E. coli, but is not limited thereto. And most preferably E. coli BL21 or E. coli MC 1061.

상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 세균에 도입하여 형질전환하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크(heat shock) 방법을 사용하여 본 발명의 재조합 벡터로 대장균을 형질전환 하였다.As a method for transforming by introducing the recombinant vector according to the present invention into bacteria, it is not limited thereto, but calcium chloride (CaCl 2 ) and heat shock (heat shock) method, particle gun bombardment, silicon Silicon carbide whiskers, sonication, electroporation, and precipitation by polyethylene glycol (PEG) may be used. In one embodiment of the present invention, E. coli was transformed with the recombinant vector of the present invention using calcium chloride (CaCl 2 ) and heat shock (heat shock) method.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 형질전환된 세균을 배양하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 생산하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.In another aspect, the present invention is characterized by providing a method for producing a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase by culturing the transformed bacteria of the present invention.

본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 생산하는 방법은 본 발명의 형질전환된 세균을 당업계에 공지된 방법에 따라 적당한 배지와 조건에서 배양한 후 파쇄하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 생산하는 방법을 말한다.Nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthetase of the present invention is a method for producing a transformed bacteria of the present invention in accordance with methods known in the art incubated in a suitable medium and conditions and then crushed nucleo It refers to a method for producing seed diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase.

상기 형질 전환된 세균으로부터 본 발명의 합성효소의 분리 및 정제를 위하여 본 발명의 재조합 벡터를 제조하고, 상기 재조합 벡터로 형질 전환된 세균에서 본 발명의 합성효소가 발현되도록 배양한다. 상기 형질전환 세균을 배양하여 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어있다. 예를 들면, 형질전환 세균이 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 다음, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배양이 완료되면, 상기 배양물에서 실질적으로 순수한 재조합 단백질을 회수할 수 있다. 본 발명의 정의 상 "실질적으로 순수한"이라 함은, 본 발명의 단백질 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 다른 숙주 세포로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.The recombinant vector of the present invention is prepared for isolation and purification of the synthetase of the present invention from the transformed bacteria, and cultured to express the synthase of the present invention in the bacteria transformed with the recombinant vector. Methods for expressing proteins by culturing the transgenic bacteria are known in the art. For example, the expression of a protein can be induced by inoculating a suitable medium into which a transforming bacterium can grow and seeding it, then inoculating it in the medium for culture and culturing under suitable conditions. Once incubation is complete, substantially pure recombinant protein can be recovered from the culture. By "substantially pure" in the definition of the present invention is meant that the sequence of the protein of the invention and the polynucleotide encoding it is substantially free of other proteins derived from other host cells.

상기 세균에서 발현된 단백질의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris) 등을 제거 하기 위하여 상기 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전)등을 수행할 수 있고, 세포에 초음파를 처리하여 파쇄하는 단계가 추가될 수 있으며, 투석, 전기영동 및 각종 컬럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 컬럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다(Maniatis et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2d Ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher , M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환된 대장균을 진탕 배양한 후, 원심 분리하여 균체를 회수하고 회수된 균체를 초음파 처리하여 파쇄한 후, Ni-NTA 친화 칼럼 크로마토그래피를 수행하여 본 발명의 합성효소를 분리 및 정제하였다(<실시예 3> 참조).Recovery of the protein expressed in the bacteria can be carried out through a variety of separation and purification methods known in the art, usually after centrifugation of the cell lysate to remove cell debris, etc., precipitation For example, salting out (ammonium sulfate precipitation and sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (protein fraction precipitation using acetone, ethanol, etc.) may be performed, and the step of sonicating and disrupting the cells may be added. , Dialysis, electrophoresis and various column chromatography can be performed. The chromatography may be purified alone or in combination by techniques such as ion exchange chromatography, gel-penetration chromatography, HPLC, reverse phase-HPLC, affinity column chromatography and ultrafiltration ( Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual , 2d Ed ., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Deutscher , M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology , vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA (1990). In one embodiment of the present invention, after shaking the culture of E. coli transformed with the recombinant expression vector of the present invention, the cells were recovered by centrifugation, and the recovered cells were sonicated and crushed, Ni-NTA affinity column chromatography The synthetase of the present invention was isolated and purified (see <Example 3>).

또한 본 발명은 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 및 트레할로스(trehalose)에 반응시켜 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.In addition, the present invention is the reaction of nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention to nucleoside diphosphate (NDP) and trehalose (nucleoside diphosphate-glucose) (NDP-glucose) It characterized by providing a method for producing.

본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법은, 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 및 트레할로스(trehalose)에 반응시키는 방법을 말하고, 투여량, 반응 온도, 시간 및 pH 범위는 본 발명의 효소의 활성이 유지되는 범위라면 이에 한정되지 않으며, 당업자가 용이하게 본 발명의 효소의 활성을 고려하여 이를 결정할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 4로 표시되는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소(0.01~0.05units/㎖)를 470mM의 트레할로스와 110~130mM의 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)와 혼합하여 pH 6.0, 60℃에서 1~24시간 동안 반응시켜 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하였다(<실시예 5> 참조). 또한 다른 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 10으로 표시되는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소(0.1~0.5㎎/㎖)를 300~470mM의 트레할로스와 10 ~ 300mM의 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)와 혼합하여 pH 6.0, 37℃에서 1 ~ 24시간 동안 반응시켜 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하였다(<실시예 10> 참조).The method of producing the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) of the present invention, the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthetase to nucleoside diphosphate (NDP) and trehalose (trehalose) It refers to a method of reacting, and the dosage, reaction temperature, time and pH range is not limited to the range in which the activity of the enzyme of the present invention is maintained, and those skilled in the art can easily determine this in consideration of the activity of the enzyme of the present invention. . In one embodiment of the present invention, the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthetase (0.01-0.05 units / ml) represented by SEQ ID NO: 4 is 470 mM trehalose and 110-130 mM nucleoside diphosphate ( NDP) and reacted at pH 6.0, 60 ° C. for 1 to 24 hours to produce nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) (see <Example 5>). In another embodiment of the present invention, nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase (0.1-0.5 mg / ml) represented by SEQ ID NO: 10 is 300-470 mM trehalose and 10-300 mM nucleoside. It was mixed with seed diphosphate (NDP) to react for 1 to 24 hours at pH 6.0, 37 ℃ to produce nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) (see <Example 10>).

또한 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법은 반복적 배치(Batch) 방식을 포함하며 상기 반복적 배치 방식이란, 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 및 트레할로스(trehalose)에 반응시킨 후 반응 산물을 분리 및 회수하고, 잔존하는 상기 합성효소를 다시 새로운 뉴클레오시드 디포스페이 트(NDP) 및 트레할로스(trehalose)에 반응시키는 과정을 반복하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법이다.In addition, the method for producing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) of the present invention includes a repetitive batch (Batch) method, the repetitive batch method, the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose of the present invention) ) Reacting the synthetase to nucleoside diphosphate (NDP) and trehalose, the reaction product is isolated and recovered, and the remaining synthetase is again converted into new nucleoside diphosphate (NDP) and trehalose (trehalose). ) Is repeated to produce nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose).

상기와 같은 생합성 반응에 의해 생성된 반응 산물은 분리 및 정제단계를 추가로 거침으로써 고순도의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 수득할 수 있다. 상기 분리 및 정제 단계는 당업계에 공지된 멤브레인 여과법, 분별 침전법, 결정화법 및 크로마토그래피법 등을 이용하여 수행할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 분취용 이온교환수지 및 액체고속 크로마토그래피를 이용하여 반응하지 않은 당 기질을 제거하고 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)를 분리 회수하여, 목적산물인 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)만을 고순도로 분리 획득할 수 있었다(<실시예 11> 참조).The reaction product generated by the biosynthetic reaction as described above may be further subjected to separation and purification to obtain high purity nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose). The separation and purification steps may be performed using membrane filtration, fractional precipitation, crystallization and chromatography methods known in the art. In one embodiment of the present invention by using preparative ion exchange resin and liquid high-speed chromatography to remove the unreacted sugar substrate and nucleoside diphosphate (NDP) is separated and recovered, the desired product nucleoside diphosphate- Only glucose (NDP-glucose) could be separated and obtained with high purity (see <Example 11>).

본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법은, 올리고 당쇄를 합성하는데 필수적인 기질인 고가의 뉴클레오티드-당류인 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 값싼 당류인 트레할로스(trehalose) 및 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)를 기질로 하는 한 단계 효소반응으로 생산할 수 있어 아주 경제적이며, 상기 반응의 부산물인 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)를 다시 재활용함으로써 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 재생산하는데 있어서 매우 효과적인 방법이다. 또한 상기 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법은 상기 반응 공정에 이성화효소(Epimerase)만 첨가하면 다른 고가의 뉴클레오시드 디포스페이트-갈락코오 스(NDP-galactose)를 생산하는 공정으로 유용하게 활용될 수 있다.The method for producing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) of the present invention is an inexpensive saccharide for nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose), an expensive nucleotide-saccharide that is an essential substrate for synthesizing oligosaccharide chains. It is very economical to produce one step enzymatic reaction with intrehalose and nucleoside diphosphate (NDP) as substrate and nucleoside by recycling the nucleoside diphosphate (NDP) which is a byproduct of the reaction. It is a very effective method for reproducing diphosphate-glucose (NDP-glucose). In addition, the method for producing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) is another expensive nucleoside diphosphate-galactose (NDP-galactose) is produced only by adding an isomerase (Epimerase) to the reaction process It can be usefully used as a process.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는 값싼 당류인 트레할로스(trehalose) 및 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)를 기질로 하여 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 합성하는 활성이 있다. 따라서 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법은, 올리고 당쇄를 합성하는데 필수적인 기질인 고가의 뉴클레오티드-당류를 아주 경제적으로 생산할 수 있으며, 반응 부산물인 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP)를 다시 재활용할 수 있는 매우 효과적인 방법이다.As described above, the novel nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention is a nucleoside diphosphate based on inexpensive saccharides such as trehalose and nucleoside diphosphate (NDP). -Has activity to synthesize glucose (NDP-glucose). Thus, the method of producing the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) of the present invention can very economically produce expensive nucleotide-saccharides, a substrate necessary for synthesizing oligosaccharide chains, and the reaction byproduct nucleoside di It is a very effective way to recycle phosphate (NDP) again.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.However, the following examples are illustrative of the present invention, and the present invention is not limited to the following examples.

<실시예 1>&Lt; Example 1 >

본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 암호화하는 유전자의 클로닝 및 아미노산 서열결정Cloning and Amino Acid Sequencing of Genes Encoding Nucleoside Diphosphate-Glucose (NDP-glucose) Synthetase Derived from Thermotoga Genus of the Present Invention

ATCC(Ameican Type Culture Collection)에서 구입한 초고온성 미생물인 써모토가속 균(Thermotoga maritima ATCC 700860)의 전체 게놈(GenBank accession No. BA000001)을 주형으로 하여 자동화된 PCR 기계(DNA thermal cycler, Perkin-Elmer Cetus Instrument사)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 이 때 PCR 프라이머로는, XbaⅠ 및 Hind III 제한효소 부위를 각각 포함하는, 하기 표 1의 올리고뉴클레오티드를 사용하였으며, DNA 중합효소는 Pwo DNA 중합효소(Roche Molecular Biochemicals, Minnheim, 독일)를 사용하였다. 구체적으로 상기 PCR 반응은 94℃에서 2분간 초기 변성, 94℃에서 15초간 변성, 55℃에서 30초간 어닐링(annealing) 및 72℃에서 1.5분간 신장(extension)하는 것으로 구성된 사이클을 30회 반복하고 72℃에서 7분간 1.5mM의 염화마그네슘에서 최종 신장하였다. Thermotoga accelerometer, a thermophilic microorganism purchased from the Atmeican Type Culture Collection (ATCC) PCR was performed using an automated PCR machine (DNA thermal cycler, Perkin-Elmer Cetus Instrument) as a template of the entire genome (mariBank accession No. BA000001) of maritima ATCC 700860. In this case, as the PCR primers, oligonucleotides of Table 1, each containing Xba I and Hind III restriction enzyme sites, were used, and DNA polymerase was used as Pwo DNA polymerase (Roche Molecular Biochemicals, Minnheim, Germany). . Specifically, the PCR reaction was repeated 30 cycles consisting of initial denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, denaturation at 94 ° C. for 15 seconds, annealing at 55 ° C. for 30 seconds and extension at 72 ° C. for 1.5 minutes. Final elongation was performed at 1.5 mM magnesium chloride for 7 minutes at &lt; RTI ID = 0.0 &gt;

PCR에 사용된 프라이머 Primers used for PCR 프라이머 명Primer Name 염기서열Sequence 서열번호SEQ ID NO: primer1_Fprimer1_F 5′- GGGAGGTCTAGACGTGGATGTTGTGTT - 35′- GGGAGGTCTAGACGTGGATGTTGTGTT-3 1One primer1_Rprimer1_R 5′- AAGGCAAGCTTTCACCTCAACAGATCT - 3′5′- AAGGCAAGCTTTCACCTCAACAGATCT-3 ′ 22

상기 PCR 반응 결과, 써모토가(Thermotoga)속 균의 전체 게놈 서열 중에서 기능이 규명되지 않은 1.22kb 크기의 유전자가 증폭되었으며, 상기 증폭된 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 서열분석기(BigDye terminator cycle sequencing kit for the ABI 377 Prism, Perkin-Elmer, Norwalk, 미국)를 이용하여 DNASIS(v7.0, Hitachi Software, 도쿄, 일본) 및 CLUSTAL 프로그램(J. D. Thompson et al., Nucleic Acids Res ., 22:4673-4680, 1994)으로 분석하였다.As a result of the PCR reaction, a gene having a size of 1.22 kb, whose function was not identified in the entire genome sequence of the genus Thermotoga, was amplified, and the nucleotide sequence and amino acid sequence of the amplified gene were sequenced (BigDye terminator cycle sequencing). DNASIS (v7.0, Hitachi Software, Tokyo, Japan) and CLUSTAL program (JD Thompson et al., Nucleic ) using kit for the ABI 377 Prism, Perkin-Elmer, Norwalk, USA Acids Res . , 22: 4673-4680, 1994).

그 결과, 상기 증폭된 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 3 및 4에 기재하였으며, 상기 증폭된 유전자는 분자량이 45kD으로, 406개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 판단되었다.As a result, the nucleotide sequence and amino acid sequence of the amplified gene were described in SEQ ID NOs: 3 and 4, respectively, and the amplified gene was found to encode a single polypeptide consisting of 406 amino acids with a molecular weight of 45 kD.

<실시예 2><Example 2>

본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 아미노산 서열의 유사성 검색Search for similarity of amino acid sequence of nucleoside diphosphate-glucose synthase derived from the genus Thermomotoga of the present invention

상기 <실시예 1>에서 결정된 406개의 아미노산 서열을 CDD(conserved domain database, Smart 및 Pfam을 포함)에 저장된 데이터와 비교한 결과, 트레할로스 6-포스페이트(trehalose 6-phosphate) 합성 효소들의 뉴클레오티드-당 결합 부위(Y. T. Pan et al., Eur . J. Biochem ., 269, 6091, 2002)의 아미노산 서열과 상당히 높은 유사성을 갖는 것으로 확인되었다. 또한 상기 <실시예 1>에서 결정된 아미노산 서열 중에 C-말단부위에 존재하는 아미노산 서열(215~382)은 글리코실 전이효소 그룹 1(glycosyltransferase group 1, Pfam00534)의 것과 상당히 높은 유사성을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서 상기 <실시예 1>의 아미노산 서열에 의해 결정되는 본 발명의 효소는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)와 트레할로스에 대한 결합 특이성 및 이와 관련된 당 전이 촉매 기작을 할 것으로 판단되었다.Comparing the 406 amino acid sequence determined in Example 1 with data stored in a CDD (including a conserved domain database, Smart and Pfam), nucleotide-sugar binding of trehalose 6-phosphate synthase It was found to have a significantly higher similarity with the amino acid sequence of the site (YT Pan et al., Eur . J. Biochem . , 269, 6091, 2002). In addition, the amino acid sequence (215 ~ 382) present at the C-terminal part of the amino acid sequence determined in Example 1 was confirmed to have a significantly higher similarity to that of glycosyltransferase group 1 (Pfam00534). Therefore, the enzyme of the present invention determined by the amino acid sequence of <Example 1> was determined to have a binding specificity for nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) and trehalose and a related sugar transfer catalyst mechanism.

<실시예 3><Example 3>

본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소 유전자의 발현Expression of Nucleoside Diphosphate-Glucose (NDP-glucose) Synthase Gene Derived from Thermotoga Genus of the Present Invention

상기 <실시예 1>에서 분리된 1.22kb 크기의 유전자를 구성하는 DNA를 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 증폭시킨 후, 페놀/클로로포름(1:1) 용액으로 처리하고, 그 수용액 층을 취하여 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 상기 침전된 DNA를 아가로오스 전기영동법으로 순수 분리하고, 분리된 DNA단편을 XbaⅠ 및 HindⅠ제한효소로 절단한 후, 동일 제한효소로 처리된 발현벡터 p6×His119에 삽입하였다. 이후 상기 재조합된 발현벡터를 이용하여 대장균 MC 1061 균주를 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크 방법으로 형질전환하였다.After amplifying the DNA constituting the 1.22kb size gene isolated in <Example 1> in the same manner as in <Example 1>, and treated with phenol / chloroform (1: 1) solution, the aqueous layer Was precipitated by addition of 2 volumes of ethanol. The precipitated DNA was purely separated by agarose electrophoresis, and the isolated DNA fragment was digested with Xba I and Hind I restriction enzymes, and then inserted into an expression vector p6 × His119 treated with the same restriction enzyme. Thereafter, the E. coli MC 1061 strain was transformed using calcium chloride (CaCl 2 ) and heat shock using the recombinant expression vector.

상기 형질전환된 대장균을 100㎍/㎖의 앰피실린(ampicillin)이 함유된 2× YT 배지에 37℃에서 16시간 동안 진탕 배양한 후, 그 배양액을 4℃에서 10분 동안 9,000g 속도로 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체에서 플라스미드 분리법(Molecular Cloning; edited by Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982)을 이용하여 재조합된 폴리뉴클레오티드를 분리하고 상기 재조합된 폴리뉴클레오티드를 주형으로 하기 표 2에 기재된 KpnⅠ 및 Hind III 제한효소 부위를 각각 포함하는 프라이머를 이용하여 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.The transformed E. coli was shaken in 2 × YT medium containing 100 μg / ml ampicillin for 16 hours at 37 ° C., and then the culture was centrifuged at 9,000 g for 10 minutes at 4 ° C. The cells were recovered. Plasmid separation from the recovered cells ( Molecular Cloning ; edited by Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982) was used to isolate the recombinant polynucleotide and the primers each comprising the Kpn I and Hind III restriction enzyme sites shown in Table 2 below as a template for the recombinant polynucleotide. PCR was performed in the same manner.

PCR에 사용된 프라이머 Primers used for PCR 프라이머 명Primer Name 염기서열Sequence 서열번호SEQ ID NO: primer2_Fprimer2_F 5′- GATCCTGGTACCGTGGATGTTGTGTTG - 35′- GATCCTGGTACCGTGGATGTTGTGTTG-3 55 primer2_Rprimer2_R 5′- GTGCCAAGCTTTCACCTCAACAGATCT - 3′5′- GTGCCAAGCTTTCACCTCAACAGATCT-3 ′ 66

상기 PCR 결과 증폭된 DNA 단편의 염기서열을 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 분석한 후, 페놀/클로로포름(1:1) 용액으로 처리하고, 그 수용액 층을 취하여 2배 부피의 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 상기 침전된 DNA를 아가로오스 전기영동법으로 순수 분리하고, 분리된 DNA 단편을 KpnⅠ 및 Hind III 제한효소로 절단한 후, 동일 제한효소로 처리된 발현벡터 pET 30a(Novagen, San Diego, 미국)에 삽입하였다. 이후 상기 재조합된 발현벡터를 이용하여 대장균 BL21(DE3) 균주를 염화칼슘(CaCl2) 및 열 쇼크 방법으로 형질전환하였다.The base sequence of the DNA fragment amplified by the PCR was analyzed in the same manner as in <Example 1>, followed by treatment with a phenol / chloroform (1: 1) solution, and the aqueous layer was taken to add two volumes of ethanol. Precipitated. The precipitated DNA was purely separated by agarose electrophoresis, the isolated DNA fragment was digested with Kpn I and Hind III restriction enzymes, and then treated with the same restriction enzyme expression vector pET 30a (Novagen, San Diego, USA). Inserted in Then, using the recombinant expression vector, E. coli BL21 (DE3) strain was transformed by calcium chloride (CaCl 2 ) and heat shock method.

상기 형질전환된 대장균을 카나마이신(100㎍/㎖)이 함유된 2×YT 배지에 37℃에서 5시간 동안 진탕 배양하고, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, 미국)를 최종 1mM 농도로 첨가하여 12시간 동안 추가 진탕 배양하였다. 이후 그 배양액을 4℃에서 10분 동안 9,000g 속도로 원심 분리하여 균체를 회수하였다. 상기 회수된 균체를 300mM의 염화나트륨(NaCl)과 10mM의 이미다졸(imidazole)이 함유된 50mM의 인산나트륨 완충용액에 재현탁한 후, 4℃에서 10분 동안 9,000g 속도로 다시 원심분리하고 초음파 처리함으로써 균체를 파쇄하여 재조합 조단백질의 추출물을 수득하였다.The transformed E. coli was shaken in 2 x YT medium containing kanamycin (100 ㎍ / ㎖) for 5 hours at 37 ℃, IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) was added to the final 1 mM concentration and further shake incubation for 12 hours. Thereafter, the culture was centrifuged at 9,000 g at 4 ° C. for 10 minutes to recover the cells. The recovered cells were resuspended in 50 mM sodium phosphate buffer containing 300 mM sodium chloride (NaCl) and 10 mM imidazole, and then centrifuged again at 9,000 g for 10 minutes at 4 ° C. and sonicated. The cells were crushed to obtain an extract of the recombinant crude protein.

상기 수득된 추출물의 상층액을 Ni-NTA(nickel-nitrilotriacetic acid, Qiagen, Hilden, 독일) 친화 칼럼 크로마토그래피를 수행하여, 여섯 개의 히스티딘이 N-말단에 첨가(tagging)되어 상기 친화 칼럼에 특이적으로 결합하는, 재조합 단백질을 정제하였다. 상기 재조합 단백질을 용출 용액(250mM 이미다졸 포함하는 pH 6.0의 50mM 인산나트륨 완충용액)에 투입하여 목적 단백질만을 용출 및 회수하고, 50mM의 초산나트륨 완충용액(pH 6.0)을 이용하여 투석한 후 초 여과(Millipore, Bedford, MA, 미국)를 실시하여 농축하였다.The supernatant of the obtained extract was subjected to Nickel-nitrilotriacetic acid (Qiagen, Hilden, Germany) affinity column chromatography, and six histidines were tagged at the N-terminus to be specific for the affinity column. The recombinant protein, which binds to, was purified. The recombinant protein was added to an elution solution (50 mM sodium phosphate buffer solution at pH 6.0 containing 250 mM imidazole) to elute and recover only the target protein, and then dialyzed using 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.0), followed by ultrafiltration. (Millipore, Bedford, MA, USA) and concentrated.

<< 실시예Example 4> 4>

본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(Nucleoside diphosphate-glucose derived from the genus Thermomotoga of the present invention ( NDPNDP -- glucoseglucose ) 합성효소의 특성Properties of Synthetase

상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 특성을 알아보기 위하여 하기와 같이 본 발명의 효소의 분자량을 측정하고 최적 pH, pH 안정성 및 온도 안정성을 조사하였다.In order to determine the properties of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 3, the molecular weight of the enzyme of the present invention was measured as follows, and the optimum pH, pH stability and Temperature stability was investigated.

<4-1> 분자량 측정<4-1> Molecular weight measurement

상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 분자량을 측정하기 위하여 라엠리(U. K. Laemmli; Nature, 227, 680, 1970)의 방법에 준하여 미니-겔 키트(mini-gel kit, Hoefer사)를 사용하여 12.5% SDS-폴리아크릴아마이드 겔(SDS-polyacrylamide gel) 전기영동을 수행하였다. 이 때 단백질의 검출은 쿠마시 브릴란트 블루 알-250(coomassie brilliant blue R-250)으로 염색하였다. 상기 전기영동의 결과를 도 2에 기재하였으며 상기 도2에 기재한 것과 같이 상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 분자량은 약 45,000Da정도인 것을 알 수 있었다(도 2참조).In order to measure the molecular weight of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in <Example 3> according to the method of Laemli (UK Laemmli; Nature , 227, 680, 1970) Electrophoresis was performed on 12.5% SDS-polyacrylamide gel using a mini-gel kit (Hoefer). At this time, the detection of the protein was stained with Coomassie brilliant blue R-250 (coomassie brilliant blue R-250). The result of the electrophoresis is shown in Figure 2 and the molecular weight of the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention prepared in Example 3 as described in Figure 2 is about 45,000 It was found to be about Da (see FIG. 2).

<4-2> 최적 <4-2> optimal pHpH 및  And pHpH 안정성 조사 Stability investigation

상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 최적 pH를 조사하기 위하여, 약 0.1units/㎖의 상기효소를 50mM 아세트산나트륨 완충용액(pH 6.0)에 넣어서 제조된 효소 반응액을 65℃에서 기질인 트레할로오스와 반응시킨 후, 시간별로 반응액의 일정부피를 취하여 효소의 활성을 측정하였다. 상기 완충용액은 pH 3.0~4.0에서는 50mM 소디움 시트르산 완충용액(sodium citrate buffer), pH 4.0~6.0에서는 50mM 소디움 아세테이트(sodium acetate buffer), pH 6.0~7.0에서는 50mM 소디움 포스페이트(sodium phosphate buffer), pH 7.0~9.0에서는 트리스 에이치씨엘 완충용액(tris-HCl buffer)을 각각 사용하였다.In order to investigate the optimum pH of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in <Example 3>, the enzyme of about 0.1units / ml in 50mM sodium acetate buffer solution (pH 6.0) and the enzyme reaction solution prepared in the reaction was reacted with trehalose as a substrate at 65 ℃, and then a certain volume of the reaction solution was taken over time to measure the activity of the enzyme. The buffer solution is 50mM sodium citrate buffer at pH 3.0-4.0, 50mM sodium acetate buffer at pH 4.0-6.0, 50mM sodium phosphate buffer at pH 6.0-7.0, pH 7.0 In ˜9.0, tris-HCl buffer was used, respectively.

구체적으로 상기 효소의 활성을 측정하기 위하여, 상기 트레할로오스 가수분반응결과 생성되는 글루코오스의 생성량을 비연속적 또는 연속적인 방법으로 측정하였다. 보다 구체적으로 비연속적인 방법의 경우 상기 트레할로오스 가수분해반응결과 수득된 반응산물을 와트만 K5F TLC 플레이트(20cm×20cm)에 각각 1㎕씩 로딩한 후, 전개액(2-프로필알코올:에틸아세테이트:증류수=3:1:1로 혼합)을 이용하여 전개시킨 다음, 플레이트를 건조시키고 메탄올에 0.3%(w/v) N-(1-나프틸)-에틸렌다이아민과 5% 황산을 용해시켜 제조한 발색액에 담근 후 다시 꺼내 110℃ 오븐에서 10분간 가열하여 발색시켰다. 상기 발색 후, 글루코오스의 생성량을 박막크로마토그래피상 해당하는 위치의 점(spot)의 밀도를 밀도측정계(densitometer)로 측정하였고, 이후 표준시료인 글루코오스의 농도와 박막크로마토그래피상의 점의 밀도측정계로 측정된 밀도와의 관계로부터 글루코오스 생성량을 농도로 계산하였다(J. F. Robyt et al., Carbohydr . Res ., 251, 187, 1994).Specifically, in order to measure the activity of the enzyme, the amount of glucose produced as a result of the trehalose hydrolysis was measured by a discontinuous or continuous method. More specifically, in the case of the discontinuous method, the reaction product obtained as a result of the trehalose hydrolysis reaction was loaded in 1 μl of each of the Whatman K5F TLC plates (20 cm × 20 cm), followed by developing solution (2-propyl alcohol: Ethyl acetate: mixed with distilled water = 3: 1: 1), and then dried the plate and added 0.3% (w / v) N- (1-naphthyl) -ethylenediamine and 5% sulfuric acid in methanol. After dipping into the coloring solution prepared by dissolution, it was taken out again and heated for 10 minutes in an oven at 110 ° C. for color development. After the color development, the amount of glucose produced was measured by a densitometer on the density of the spot at the corresponding position on the thin film chromatography, and then by the density meter of the concentration of glucose and the point on the thin film chromatography, which are standard samples. The glucose production was calculated as the concentration from the relationship with the density obtained (JF Robyt et al., Carbohydr . Res . , 251, 187, 1994).

한편 연속적인 방법의 경우에는 트레할로오스(최종농도 3%) 기질과 글루코오스 정량시약으로 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)에 용해시킨 시약 A(900units 글루코오스 옥시다제와 3㎎ 퍼옥시다제)와 시약 B(3.5㎎의 4-aminoantipyrine와 117㎎의 p-hydroxybenzoic acid)의 1:1 (v/v) 혼합액을 함께 섞어서 50mM 인산나트륨 완충용액(pH 7.0)의 조건에서 반응시켜 505nm에서 흡광도의 변화로부터 글루코오스 생성량을 측정하였다(M. J. Kim et al., Arch . Biochem . Biophys ., 371, 277, 1999).In the continuous method, Reagent A (900 units glucose oxidase and 3 mg peroxidase) dissolved in 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) with trehalose (final concentration 3%) substrate and glucose assay reagent A 1: 1 (v / v) mixture of reagent B (3.5 mg 4-aminoantipyrine and 117 mg p-hydroxybenzoic acid) was mixed together and reacted under 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) to change the absorbance at 505 nm. The glucose production was measured from (MJ Kim et al., Arch . Biochem . Biophys . , 371, 277, 1999).

상기 실험결과, 상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는 최적 pH가 pH 5.5~6.0인 것으로 확인되었으며, pH 4~8까지의 범위에서 비교적 안정한 것으로 나타났다.As a result of the experiment, the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention prepared in Example 3 was found to have an optimum pH of pH 5.5-6.0, and range from pH 4-8. It was found to be relatively stable at.

<4-3> 온도 안정성 조사<4-3> Temperature stability investigation

상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 50mM 소디움 아세테이트 완충용액(pH 6.0)에 상기 효소를 첨가하여 얻은 효소액을 25℃에서 90℃까지의 각 온도에서 1시간 열처리한 후, 급 냉각시켜 65℃에서 상기 <실시예 4-2>와 동일한 방법으로 효소의 활성을 측정하였다.In order to investigate the temperature stability of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 3, the enzyme was obtained by adding the enzyme to 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.0). The enzyme solution was heat-treated at 25 ° C. to 90 ° C. for 1 hour, and then rapidly cooled to measure enzyme activity at 65 ° C. in the same manner as in <Example 4-2>.

상기 실험결과, 상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는 90℃를 넘으면 활성을 잃기 시작하여 95℃에서는 50% 미만의 잔존활성을 나타내었다.As a result of the experiment, the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 3 starts to lose activity above 90 ° C. and exhibits residual activity of less than 50% at 95 ° C. Indicated.

상기 실험으로부터 알아낸 상기 <실시예 3>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 특성을 하기 표3에 기재하였다. The characteristics of the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention prepared in Example 3 found from the above experiments are shown in Table 3 below.

본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 특성Characterization of Nucleoside Diphosphate-Glucose (NDP-glucose) Synthetase Derived from Thermotoga Genus of the Present Invention 분자량Molecular Weight 최적 pHOptimal pH pH 안정성pH stability 열안정성Thermal stability 45KD45KD 5.5 ~ 6.0(65℃)5.5 to 6.0 (65 ℃) 4 ~ 8(65℃)4 to 8 (65 ° C) 90℃를 넘으면 활성을 잃기 시작하여 95℃에서는 50% 미만의 잔존활성을 나타냄(1 시간 열처리 기준).If it exceeds 90 ° C, the activity starts to be lost, and at 95 ° C, the remaining activity is less than 50% (based on 1 hour heat treatment).

<실시예 5><Example 5>

본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(Nucleoside diphosphate-glucose derived from the genus Thermomotoga of the present invention ( NDPNDP -- glucoseglucose ) 합성효소를 이용한 ) Synthetic Enzyme NDPNDP -글루코오스의 합성Synthesis of Glucose

상기 <실시예 3>에서 분리 및 정제된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소(0.01 ~ 0.05units/㎖)를 50mM의 아세트산나트륨 완충용액(pH 6.0)에 첨가하여 110mM 의 NDP(UDP, ADP, GDP, CDP) 및 470mM의 트레할로스와 혼합한 후 60℃에서 12시간 동안 반응시켰다.The nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase (0.01-0.05 units / ml) of the present invention isolated and purified in Example 3 was added to 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.0). The mixture was mixed with 110 mM NDP (UDP, ADP, GDP, CDP) and 470 mM trehalose and reacted at 60 ° C. for 12 hours.

상기의 반응 결과 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)가 합성되었는지 여부를 확인하기 위하여 상기 반응 산물을 HPLC로 분석하였다. 구체적으로 상기 반응 산물을 칼럼(250 mm×4.6mm, Carbohydrate ES 칼럼, Alltech사)에 주입하였으며, 아세토나이트릴/물(80/20%) 용액(A 용액)과 0.5M의 염화나트륨 용액(B 용액)을 용매로 사용하고, 상기 용매의 전개 속도를 1㎖/분으로 유지하여 상기 전개 용매의 조성을 시간에 따라 변화시켜(상기 B 용액이 25분에서 70%로 35분까지 70% 유지, 40분에 100%로 45분까지 100% 유지, 50분에 0%) HPLC를 수행하였다. 그 결과를 도 3에 기재하였다. 이때 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 검출하기 위해 260nm에서 1.6 ~ 48mM의 NTP(UDP, ADP, GDP, CDP)와 NDP-글루코오스(UDPG, ADPG, GDPG 및 CDPG)를 표준시료로 사용하였으며, 상기 표준시료에 대한 각 농도별 HPLC 분석상의 해당 피크의 면적으로부터 표준 검량 곡선을 작성하여 그 생성량을 계산하고 그 결과를 도 3에 기재하였다.The reaction product was analyzed by HPLC in order to confirm whether nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) was synthesized. Specifically, the reaction product was injected into a column (250 mm × 4.6 mm, Carbohydrate ES column, Alltech), and acetonitrile / water (80/20%) solution (A solution) and 0.5 M sodium chloride solution (B solution). ) As a solvent and the development rate of the solvent was maintained at 1 ml / min to change the composition of the development solvent over time (the solution B was maintained at 70% from 25 to 70% for 35 minutes, 40 minutes HPLC was performed at 100% at 45% for 100 minutes and 50% at 0%). The result is shown in FIG. In order to detect nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose), 1.6 to 48 mM NTP (UDP, ADP, GDP, CDP) and NDP-glucose (UDPG, ADPG, GDPG and CDPG) at 260 nm are used as standard samples. A standard calibration curve was prepared from the area of the corresponding peak in the HPLC analysis for each concentration of the standard sample, and the amount thereof was calculated and the results are shown in FIG. 3.

도 3에 기재된 것과 같이 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는, 트레할로스를 공여체 기질로 하고 NDP(UDP, ADP, GDP, CDP)를 수용체 기질로 하여, 당 전이 반응 즉 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성 반응을 촉매하는 활성이 있음을 알 수 있었다.As shown in Fig. 3, the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention is a sugar transfer reaction using trehalose as a donor substrate and NDP (UDP, ADP, GDP, CDP) as a receptor substrate. In other words, it was found that there is activity to catalyze nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesis reaction.

<실시예 6><Example 6>

본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(Nucleoside diphosphate-glucose derived from the genus Pyrococcus of the present invention ( NDPNDP -- glucoseglucose ) 합성효소 유전자의 ) Synthase gene 클로닝Cloning 및 아미노산 서열결정 And amino acid sequencing

본 발명자들은 또 다른 초고온 미생물에서도 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성활성이 있는 효소가 있는지 여부를 확인하기 위해 추가적인 실험을 하였다. 구체적으로 ATCC(Ameican Type Culture Collection)에서 구입한 초고온성 미생물인 파이로코커스속 균(Pyrococcus horikoshii ATCC 43589)의 전체 게놈(GenBank accession No. BA000001)을 주형으로 하여 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행하였다. 이 때 PCR 프라이머로는, XbaⅠ 및 PstⅠ 제한효소 부위를 각각 포함하는, 하기 표 4의 올리고뉴클레오티드를 사용하였다.The present inventors conducted further experiments to determine whether there is an enzyme having nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesizing activity in another ultra high temperature microorganism. Specifically, the same method as in <Example 1> using the entire genome (GenBank accession No. BA000001) of Pyrococcus horikoshii ATCC 43589, which is an ultra-high temperature microorganism, purchased from the American Type Culture Collection (ATCC) PCR reaction was performed. At this time, as the PCR primers, oligonucleotides of Table 4 below, each containing Xba I and Pst I restriction enzyme sites, were used.

PCR에 사용된 프라이머 Primers used for PCR 프라이머 명Primer Name 염기서열Sequence 서열번호SEQ ID NO: primer3_Fprimer3_F 5′- GATATTCTAGATATGAAGATGTACGAG - 35′- GATATTCTAGATATGAAGATGTACGAG-3 77 primer3_Rprimer3_R 5′- TGGTGCTGCAGTCATCCTCCGAGGGAG - 3′5′- TGGTGCTGCAGTCATCCTCCGAGGGAG-3 ′ 88

상기 PCR 반응 결과, 파이로코커스(Pyrococcus)속 균의 전체 게놈 서열 중에서 기능이 규명되지 않은 1.25kb 크기의 유전자가 증폭되었으며, 상기 증폭된 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 상기 <실시예 1>과 동일한 방법으로 분석하였다.As a result of the PCR reaction, a gene having a size of 1.25 kb, whose function was not identified in the entire genome sequence of the genus Pyrococcus, was amplified, and the nucleotide sequence and amino acid sequence of the amplified gene were compared with those of <Example 1>. The analysis was performed in the same manner.

그 결과, 상기 증폭된 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 9 및 10에 기재하였으며, 상기 증폭된 유전자는 분자량이 46kD로, 416개의 아미노산으로 이루어진 단일 폴리펩티드를 암호화하는 것으로 판단되었다.As a result, the nucleotide sequence and the amino acid sequence of the amplified gene were described in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively. The amplified gene was found to encode a single polypeptide consisting of 416 amino acids with a molecular weight of 46 kD.

<실시예 7><Example 7>

본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 및 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소들의 상동성(homology) 비교Comparison of homology of nucleoside diphosphate-glucose synthase from Pyrococcus and Thermomotoga genus of the present invention

본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소와 상기 <실시예 1>에서 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소와의 상동성(homology)을 상기 두 효소의 아미노산 서열을 비교하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.Nucleoside diphosphate-glucose synthetase derived from Pyrococcus genus of the present invention and nucleoside diphosphate-glucose (NDP) derived from thermotoga genus in <Example 1> Homology with -glucose) synthase was compared to the amino acid sequences of the two enzymes and the results are shown in FIG. 4.

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 상기 두 효소는 약 70%의 상동성(homology)을 가지는 것으로 판단되었다.As shown in FIG. 4, the two enzymes of the present invention were determined to have about 70% homology.

또한 상기 <실시예 1>에서 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소와 마찬가지로, 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 416개의 아미노산 서열이 트레할로스 6-포스페이트(trehalose 6-phosphate) 합성 효소들의 뉴클레오티드-당 결합 부위의 아미노산 서열과 높은 유사성을 갖고 있으며, C-말단부위에 존재하는 아미노산 서열(220~393)은 글리코실 전이효소 그룹 1(glycosyltransferase group 1, Pfam00534)의 것과 상당히 높은 유사성을 갖고 있음이 확인되었다. 따라서 본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소도 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성활성이 있을 것으로 사료되어 이하 실험을 진행하였다.Also In Example 1, the 416 amino acid sequences derived from Pyrococcus genus are similar to trehalose 6-phosphate as in the Thermomotoga genus-derived nucleoside diphosphate-glucose synthetase. trehalose 6-phosphate) has high similarity with amino acid sequence of nucleotide-sugar binding site of enzymes, and amino acid sequence (220 ~ 393) at C-terminal part is glycosyltransferase group 1 (Pfam00534) It was confirmed that it has a considerably high similarity with that of. Therefore, the nucleoside diphosphate-glucose synthase derived from the genus Pyrococcus of the present invention is considered to have a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesizing activity, and the following experiment is conducted. It was.

<실시예 8><Example 8>

본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(Nucleoside diphosphate-glucose derived from the genus Pyrococcus of the present invention ( NDPNDP -- glucoseglucose ) 합성효소 유전자의 발현Expression of Synthetase Gene

상기 <실시예 6>에서 분리된 1.25kb 크기의 유전자를 구성하는 DNA를 상기 <실시예 6>과 동일한 방법으로 증폭시킨 후, 상기<실시예 3>과 동일한 방법으로 발현벡터 p6×His119에 삽입하여 대장균 MC 1061 균주를 형질전환하였다. 다만 이때 XbaⅠ 및 PstⅠ제한효소를 사용하였다.After amplifying the DNA constituting the gene of 1.25kb size isolated in <Example 6> in the same manner as in <Example 6>, and inserted into the expression vector p6 × His119 in the same manner as in <Example 3> E. coli MC 1061 strain was transformed. Only Xba I and Pst I restriction enzymes were used.

상기 형질전환된 대장균을 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 배양하고 균체를 회수한 후, 회수된 균체를 300mM의 염화나트륨(NaCl)과 10mM의 이미다졸(imidazole)이 함유된 50mM의 인산나트륨 완충용액에 재현탁한 후, 4℃에서 10분 동안 9,000g 속도로 다시 원심분리하고 초음파 처리함으로써 균체를 파쇄하여 재조합 조단백질의 추출물을 수득하였다. 상기 수득된 추출물의 상층액에서 상기 <실시예 3>과 동일한 방법으로 재조합 단백질을 정제하고 목적 단백질만을 용출 및 회수한 후 농축하였다.After culturing the transformed E. coli in the same manner as in <Example 3> and recovering the cells, the recovered cells were buffered with 50 mM sodium phosphate containing 300 mM sodium chloride (NaCl) and 10 mM imidazole. After resuspending in solution, the cells were crushed by centrifugation and sonication again at 9,000 g for 10 minutes at 4 ° C. to obtain an extract of recombinant crude protein. In the supernatant of the obtained extract, the recombinant protein was purified in the same manner as in <Example 3>, only the desired protein was eluted and recovered, and concentrated.

<실시예 9>Example 9

본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(Nucleoside diphosphate-glucose derived from the genus Thermomotoga of the present invention ( NDPNDP -- glucoseglucose ) 합성효소의 특성Properties of Synthetase

상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 특성을 알아보기 위하여 하기와 같이 본 발명의 효소의 분자량을 측정하고 최적 pH, pH 안정성 및 온도 안정성을 조사하였다.In order to determine the properties of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 8, the molecular weight of the enzyme of the present invention was measured as follows, and the optimum pH, pH stability and Temperature stability was investigated.

<9-1> 분자량 측정<9-1> Molecular weight measurement

상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 분자량을 측정하기 위하여 상기 <실시예 4-1>과 동일한 방법을 이용하였다. 그 결과 상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 분자량은 약 46,000Da정도인 것으로 확인되었다(도 5 참조).In order to measure the molecular weight of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 8, the same method as in Example 4-1 was used. As a result, it was confirmed that the molecular weight of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 8 was about 46,000 Da (see FIG. 5).

<9-2> 최적 <9-2> optimum pHpH 및  And pHpH 안정성 조사 Stability investigation

상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 최적 pH를 조사하기 위하여, 약 0.3units/㎖의 상기효소를 50mM 아세트산나트륨 완충용액(pH 6.0)에 넣어서 제조된 효소 반응액을 37℃에서 기질인 트레할로오스와 반응시킨 후, 상기 <실시예 4-2>과 동일한 방법을 이용하였다.In order to investigate the optimum pH of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 8, the enzyme of about 0.3 units / ml was dissolved in 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.0) was reacted with trehalose as a substrate at 37 ° C., and the same method as in Example 4-2 was used.

상기 실험결과, 상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는 최적 pH가 pH 5.5인 것으로 확인되었으며, pH 4~8까지의 범위에서 비교적 안정한 것으로 나타났다.As a result of the experiment, the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention prepared in Example 8 was found to have an optimum pH of pH 5.5, and relatively in the range of pH 4-8. It appeared to be stable.

<9-3> 온도 안정성 조사<9-3> Temperature stability investigation

상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 온도 안정성을 조사하기 위하여, 50mM 소디움 아세테이트 완충용액(pH 6.0)에 상기 효소를 첨가하여 얻은 효소액을 25℃에서 75℃까지의 각 온도에서 1시간 열처리한 후, 급 냉각시켜 37℃에서 상기 <실시예 4-2>과 동일한 방법으로 효소 활성을 측정하였다.In order to investigate the temperature stability of the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention prepared in Example 8, it was obtained by adding the enzyme to 50 mM sodium acetate buffer (pH 6.0) The enzyme solution was heat-treated at 25 [deg.] C to 75 [deg.] C for 1 hour and then rapidly cooled to measure enzyme activity at 37 [deg.] C. in the same manner as in <Example 4-2>.

상기 실험결과, 상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는 40℃를 넘으면 활성을 잃기 시작하여 60℃에서는 20% 정도의 잔존활성을 나타내었다.As a result of the experiment, the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in <Example 8> began to lose activity when it exceeds 40 ° C. and retains about 20% of residual activity at 60 ° C. Indicated.

상기 실험으로부터 알아낸 상기 <실시예 8>에서 제조된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 특성을 하기 표5에 기재하였다.The characteristics of the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention prepared in Example 8 found from the above experiment are shown in Table 5 below.

본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 특성Characteristics of Nucleoside Diphosphate-glucose Synthetase Derived from Pyrococcus Species of the Present Invention 분자량Molecular Weight 최적 pHOptimal pH pH 안정성pH stability 열안정성Thermal stability 46KD46KD 5.5 (37℃)5.5 (37 ℃) 4 ~ 8(37℃)4 to 8 (37 ° C) 40℃를 넘으면 활성을 잃기 시작하여 60℃에서는 20%의 잔존활성을 나타냄(1 시간 열처리 기준).When it exceeds 40 degreeC, it starts to lose activity, and shows 60% of residual activity at 60 degreeC (based on 1-hour heat processing).

<실시예 10><Example 10>

본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(Nucleoside diphosphate-glucose derived from the genus Pyrococcus of the present invention ( NDPNDP -- glucoseglucose ) 합성효소를 이용한 ) Synthetic Enzyme NDPNDP -글루코오스의 합성Synthesis of Glucose

상기 <실시예 8>에서 분리 및 정제된 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스 합성효소(0.1~0.5㎎/㎖)를 상기 <실시예 5>와 동일한 방법으로 10~300mM의 NDP 및 300~470mM의 트레할로스와 37℃에서 반응시킨 후, 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)가 합성되었는지 여부를 확인하기 위하여 상기 반응 산물을 상기 <실시예 5>와 동일한 방법으로 HPLC(단, B용액을 20분에 70%로, 35분에 100%로 45분까지 100% 유지로 변경)를 수행하여 그 결과를 도 6에 기재하였다.The nucleoside diphosphate-glucose synthase (0.1-0.5 mg / ml) of the present invention isolated and purified in <Example 8> was prepared in the same manner as in <Example 5> with 10-300 mM NDP and 300- After reacting with 470 mM trehalose at 37 ° C, the reaction product was purified by HPLC in the same manner as in <Example 5> to determine whether nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) was synthesized. The solution was changed to 70% at 20 minutes, 100% at 35 minutes, to 100% retention up to 45 minutes) and the results are shown in FIG. 6.

상기 도 6에 기재된 것과 같이 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소는, 트레할로스를 공여체 기질로 하고 NDP(UDP, ADP, GDP, CDP)를 수용체 기질로 하여, 당 전이 반응 즉 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성 반응을 촉매하는 활성이 있음을 알 수 있었다.As shown in FIG. 6, the nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention is a sugar transfer using trehalose as a donor substrate and NDP (UDP, ADP, GDP, CDP) as a receptor substrate. It was found that there is activity to catalyze the reaction, that is, nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesis reaction.

<< 실시예Example 11> 11>

본 발명의Of the present invention 파이로코커스(Pyrococcus)속Genus Pyrococcus 유래 뉴클레오시드  Derived Nucleosides 디포스페이트Dephosphate -글루코오스(Glucose NDPNDP -- glucoseglucose ) 합성효소의 반복적 배치(Repetitive batches of synthetase BatchBatch ) 방식에 의한 By the method NDPNDP -글루코오스의 생산Production of glucose

본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소를 이용하여 NDP-글루코오스를 생산하기 위해 반복적 배치방식을 사용하였다. 구체적으로 반응 용기안의 효소반응의 전체부피를 2.5 ~ 5㎖로 조정하고 상기 반응 용기안에 트레할로스(최종농도 470mM)와 본 발명의 당 합성효소(60units/㎖)를 투입하고, UDP(최종농도 124mM), ADP(최종농도 117mM), GDP(최종농도 113 mM) 및 CDP(최종농도 124mM)를 각각 투입하여, 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성 효소의 최적 반응조건(pH 6.0, 37℃)에서 12시간 동안 반응시켰다.Iterative batch method was used to produce NDP-glucose using the nucleoside diphosphate-glucose synthase derived from the genus Pyrococcus of the present invention. Specifically, the total volume of the enzyme reaction in the reaction vessel was adjusted to 2.5-5 ml, and trehalose (final concentration 470 mM) and the sugar synthase (60 units / ml) of the present invention were added to the reaction vessel, and UDP (final concentration 124 mM) was added. , ADP (final concentration 117mM), GDP (final concentration 113mM) and CDP (final concentration 124mM), respectively, were added to the optimum reaction conditions (pH) of the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthetase of the present invention. 6.0, 37 ℃) for 12 hours.

상기 효소반응이 완료된 후 초여과막(ultrafiltration membrane, Millipore Co., Bedford, Mass. 미국)을 이용하여 반응용액을 원심 분리하여 반응산물을 효소로부터 분리 및 회수하고, 초여과막상에 남아 농축된 효소액은 다시 새로운 기질용액과 혼합하여 반복 사용하여 다음 배치의 효소반응을 계속 수행하였다. 상기 배치방식의 효소반응을 총 12회 반복 수행한 후, 각 배치의 효소반응으로부터 생산된 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 분석 및 정량하였다.After the enzyme reaction is completed, the reaction solution is centrifuged using an ultrafiltration membrane (Ultrafiltration membrane, Millipore Co., Bedford, Mass. USA) to separate and recover the reaction product from the enzyme, and the concentrated enzyme solution remaining on the ultrafiltration membrane is The mixture was mixed with fresh substrate solution and used repeatedly to carry out the enzymatic reaction of the next batch. After performing a total of 12 batches of enzymatic reactions, nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) produced from each batch of enzyme reactions was analyzed and quantified.

구체적으로 상기 생성된 NDP-글루코오스를 분석 및 정량하기 위하여 상기 효소 반응액을 음이온교환수지 칼럼(300mm×10mm, AG-1 X4, Biorad사)에 투입하고 용매로는 10mM의 시트르산 나트륨 완충용액(pH 3.0)과 1M의 염화나트륨 용액(pH 3.0)을 사용하였으며, 상기 용매의 전개 속도를 1㎖/분으로 유지하였다. 시트르산 나트륨 완충용액을 흘리면서 미반응 당류를 제거하고, 상기 염화나트륨 용액의 농도를 변화시켜 이온교환수지 크로마토그래피를 수행하여 이온교환수지에 결합된 NDP와 NDP-글루코오스 혼합물을 회수하였다. 상기 회수된 혼합물을 겔 여과 칼럼(W-251, 2×50cm)에 투입한 후 HPLC(LC-918, 도쿄, 일본) 시스템을 사용하여 염을 제거한 후, 분취용 음이온교환수지 칼럼(300mm×25mm, Carbohydrate ES, Alltech사)상에서 염화나트륨 용액의 농도를 변화시켜 NDP와 NDP-글루코오스를 각각 개별분리하여 정량하였다. 상기 12회에 걸친 반복적 배치반응을 통한 NDP-글루코오스 생산에 대한 대표 결과로서 UDP-글루코오스 생산에 대한 결과를 도7에 나타내었다. 또한, 상기 정량 후 겔 여과 칼럼을 통하여 염을 제거한 후 동결 보존하고 NDP-글루코오스의 생성량과 생성수율을 계산하여 하기 표 6에 기재하였다.Specifically, in order to analyze and quantify the generated NDP-glucose, the enzyme reaction solution was added to an anion exchange resin column (300 mm × 10 mm, AG-1 X4, Biorad) and 10 mM sodium citrate buffer (pH) as a solvent. 3.0) and 1 M sodium chloride solution (pH 3.0) were used and the development rate of the solvent was maintained at 1 ml / min. Unreacted sugars were removed while flowing sodium citrate buffer, and the concentration of the sodium chloride solution was changed to carry out ion exchange resin chromatography to recover the NDP and NDP-glucose mixtures bound to the ion exchange resin. The recovered mixture was poured into a gel filtration column (W-251, 2 × 50 cm), and then salt was removed using an HPLC (LC-918, Tokyo, Japan) system, followed by a preparative anion exchange resin column (300 mm × 25 mm). NDP and NDP-glucose were separately isolated and quantified by varying the concentration of sodium chloride solution on Carbohydrate ES, Alltech. As a representative result for NDP-glucose production through the 12 repeated batch reactions, the results for UDP-glucose production are shown in FIG. 7. In addition, the salt was removed through a gel filtration column after the quantification, and then cryopreserved and the amount and yield of NDP-glucose were calculated and shown in Table 6 below.

본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 반복적 배치(Batch)방식에 의한 NDP-글루코오스의 생성량 및 수율Production amount and yield of NDP-glucose by repeated batch method of nucleoside diphosphate-glucose synthase of the present invention NDP-글루코오스의 종류Types of NDP-Glucose 생성량(mg)Production amount (mg) 생성수율*(%)Yield yield * (%) UDP-글루코오스UDP-glucose 16.7 16.7 13.3613.36 ADP-글루코오스ADP-glucose 247.8247.8 99.199.1 GDP-글루코오스GDP-glucose 19.219.2 30.730.7 CDP-글루코오스CDP-glucose 8.68.6 13.813.8

* 생성수율 = (생산된 NDP-글루코오스(mg)/사용한 NDP(mg))×100 * Yield = (produced NDP-glucose (mg) / used NDP (mg)) × 100

도 1은 본 발명의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소에 의한 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 생산과정을 나타낸 개략도이다.1 is a schematic diagram showing a nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) production process by the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention.

도 2는 본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 전기영동(SDS-PAGE) 결과를 나타낸 그림이다.2 is a diagram showing the results of electrophoresis (SDS-PAGE) of the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase derived from the genus Thermomotoga of the present invention.

도 3은 본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성활성을 나타낸 그래프이다.Figure 3 is a graph showing the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthesis activity of the Thermotoga genus-derived nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase of the present invention.

도 4는 본 발명의 써모토가(Thermotoga)속 및 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소들의 상동성(homology)을 비교한 그림이다.4 is a diagram comparing the homology of the nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthetase derived from the genus Thermomotoga and Pyrococcus of the present invention.

도 5는 본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성효소의 전기영동(SDS-PAGE) 결과를 나타낸 그림이다.5 is a diagram showing the results of electrophoresis (SDS-PAGE) of nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) synthase derived from the genus Pyrococcus of the present invention.

도 6은 본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 당 합성효소의 NDP-글루코오스의 합성활성을 나타낸 그래프이다.Figure 6 is a graph showing the synthetic activity of NDP-glucose of the nucleoside sugar synthase derived from the genus Pyrococcus of the present invention.

도 7은 본 발명의 파이로코커스(Pyrococcus)속 유래 뉴클레오시드 당 합성효소의 반복적 배치(Batch) 방식에 의한 UDP-글루코오스의 합성활성을 나타낸 그래프이다.7 is a graph showing the synthetic activity of UDP-glucose by the repeated batch method of nucleoside sugar synthase derived from Pyrococcus genus of the present invention.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and production method of nucleoside diphosphate-glucose using the same <130> NP07-0142 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1_F <400> 1 gggaggtcta gacgtggatg ttgtgtt 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1_R <400> 2 aaggcaagct ttcacctcaa cagatct 27 <210> 3 <211> 1221 <212> DNA <213> Thermotoga maritima <400> 3 atggatgttg tgttgagaga gcgaagcata gaggagtacc gcaccataat cggaaacgag 60 gtggacgaga taaaaaaact cgcagaacct cttaaaggaa aaaaggtgct ccacgtcaat 120 gcgactgcct acggtggagg agttgctgaa attctccaca atctcgttcc gcttatgaga 180 tcggttggtc tggatgccag atggagggtc atagaggcac ccgatgagtt cttcaatgtc 240 acaaaaaagt ttcacaacac gcttcaggga gcagatatag agatttcaga ggaagaatgg 300 aacctttacg aagaggtctg cagaaaaaac gcagaactga tccaggatga agagttattc 360 gtgatccacg attcccaacc agcagctgtg agaaagtttg 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<213> Thermotoga maritima <400> 4 Met Asp Val Val Leu Arg Glu Arg Ser Ile Glu Glu Tyr Arg Thr Ile 1 5 10 15 Ile Gly Asn Glu Val Asp Glu Ile Lys Lys Leu Ala Glu Pro Leu Lys 20 25 30 Gly Lys Lys Val Leu His Val Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Gly Gly Val 35 40 45 Ala Glu Ile Leu His Asn Leu Val Pro Leu Met Arg Ser Val Gly Leu 50 55 60 Asp Ala Arg Trp Arg Val Ile Glu Ala Pro Asp Glu Phe Phe Asn Val 65 70 75 80 Thr Lys Lys Phe His Asn Thr Leu Gln Gly Ala Asp Ile Glu Ile Ser 85 90 95 Glu Glu Glu Trp Asn Leu Tyr Glu Glu Val Cys Arg Lys Asn Ala Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Asp Glu Glu Leu Phe Val Ile His Asp Ser Gln Pro Ala 115 120 125 Ala Val Arg Lys Phe Val Asp Leu Asn Asp Arg Lys Trp Ile Trp Arg 130 135 140 Cys His Ile Asp Leu Ser Thr Pro Asn Met Lys Val Trp Gln Lys Phe 145 150 155 160 Ser Gln Tyr Leu Glu Gly Tyr Asn Arg Leu Val Phe His Leu Glu Glu 165 170 175 Tyr Phe Pro Gln Gly Trp Lys Glu Arg Ser Ile Ala Phe Pro Pro Ser 180 185 190 Ile Asp Pro Leu Ser Glu Lys Asn Arg Asp Leu Asp Glu Asp Thr Ile 195 200 205 Arg Lys Thr Leu Glu Arg Leu Glu Ile Asp Pro Glu Arg Pro Leu Ile 210 215 220 Thr Val Val Ala Arg Phe Asp Pro Trp Lys Asp Leu Phe Ser Ala Ile 225 230 235 240 Asp Val Tyr Arg Leu Val Lys Lys Glu Ile Pro Glu Val Gln Leu Ala 245 250 255 Val Val Ser Ala Met Ala Ala Asp Asp Pro Glu Gly Trp Phe Phe Phe 260 265 270 Glu Lys Val Leu Arg Tyr Ala Gly Thr Asp Glu Asp Ile Lys Phe Cys 275 280 285 Thr Asn Leu Lys Gly Val Gly Asn Lys Glu Val Asn Ala Ile Gln Arg 290 295 300 Ala Thr Thr Val Ala Leu His Thr Ala Thr Arg Glu Gly Phe Gly Leu 305 310 315 320 Val Ile Ser Glu Ala Leu Tyr Lys Arg Val Pro Val Val Ala Arg Pro 325 330 335 Val Gly Gly Val Lys Ile Gln Val Lys His Gly Glu Asn Gly Tyr Leu 340 345 350 Ala Trp Glu Arg Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Val Val Lys Leu Ile Lys 355 360 365 Asp Glu Glu Leu Arg Arg Lys Met Gly Glu Lys Gly Arg Gln Thr Val 370 375 380 Val Glu Asn Phe Ile Ile Thr Val His Leu Lys Asn Tyr Leu Lys Leu 385 390 395 400 Phe Leu Asp Leu Leu Arg 405 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2_F <400> 5 gatcctggta ccgtggatgt tgtgttg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2_R <400> 6 gtgccaagct ttcacctcaa cagatct 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3_F <400> 7 gatattctag atatgaagat gtacgag 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3_R <400> 8 tggtgctgca gtcatcctcc gagggag 27 <210> 9 <211> 1250 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 9 atgaagatgt acgaggttaa ggaatttagt tcggggaaaa gaaagcttga agactataaa 60 agcataatag gggaggaaga agttagcaaa atccaggaaa aggccgagaa attgaaagga 120 agaagtttcg tccatgtgaa ctcaacttcc ttcggaggag gtgtcgccga gatactccac 180 agcttggtac ccctactgag gagcattgga attgaagcaa ggtggttcgt aatcgagggg 240 cccacggaat tcttcaacgt cacgaagacc tttcacaacg cacttcaagg taacgaatcc 300 ctcaagctaa cggaggagat gaaagaactt tacctcaatg tgaacaggga aaattctaaa 360 ttcattgacc tttcaagctt tgactacgtt ctagtccacg acccccagcc ggccgccctt 420 atagagttct 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Pyrococcus horikoshii <400> 10 Met Lys Met Tyr Glu Val Lys Glu Phe Ser Ser Gly Lys Arg Lys Leu 1 5 10 15 Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Ile Gly Glu Glu Glu Val Ser Lys Ile Gln 20 25 30 Glu Lys Ala Glu Lys Leu Lys Gly Arg Ser Phe Val His Val Asn Ser 35 40 45 Thr Ser Phe Gly Gly Gly Val Ala Glu Ile Leu His Ser Leu Val Pro 50 55 60 Leu Leu Arg Ser Ile Gly Ile Glu Ala Arg Trp Phe Val Ile Glu Gly 65 70 75 80 Pro Thr Glu Phe Phe Asn Val Thr Lys Thr Phe His Asn Ala Leu Gln 85 90 95 Gly Asn Glu Ser Leu Lys Leu Thr Glu Glu Met Lys Glu Leu Tyr Leu 100 105 110 Asn Val Asn Arg Glu Asn Ser Lys Phe Ile Asp Leu Ser Ser Phe Asp 115 120 125 Tyr Val Leu Val His Asp Pro Gln Pro Ala Ala Leu Ile Glu Phe Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ser Pro Trp Leu Trp Arg Cys His Ile Asp Leu Ser Ser 145 150 155 160 Pro Asn Arg Glu Phe Trp Glu Phe Leu Arg Arg Phe Val Glu Lys Tyr 165 170 175 Asp Arg Tyr Ile Phe His Leu Pro Glu Tyr Val Gln Pro Glu Leu Asp 180 185 190 Arg Asn Lys Ala Val Ile Met Pro Pro Ser Ile Asp Pro Leu Ser Glu 195 200 205 Lys Asn Val Glu Leu Lys Gln Thr Glu Ile Leu Arg Ile Leu Glu Arg 210 215 220 Phe Asp Val Asp Pro Glu Lys Pro Ile Ile Thr Gln Val Ser Arg Phe 225 230 235 240 Asp Pro Trp Lys Gly Ile Phe Asp Val Ile Glu Ile Tyr Arg Lys Val 245 250 255 Lys Glu Lys Ile Pro Gly Val Gln Leu Leu Leu Val Gly Val Met Ala 260 265 270 His Asp Asp Pro Glu Gly Trp Ile Tyr Phe Glu Lys Thr Leu Arg Lys 275 280 285 Ile Gly Glu Asp Tyr Asp Val Lys Val Leu Thr Asn Leu Ile Gly Val 290 295 300 His Ala Arg Glu Val Asn Ala Phe Gln Arg Ala Ser Asp Val Ile Leu 305 310 315 320 Gln Met Ser Ile Arg Glu Gly Phe Gly Leu Thr Val Thr Glu Ala Met 325 330 335 Trp Lys Gly Lys Pro Val Ile Gly Arg Ala Val Gly Gly Ile Lys Phe 340 345 350 Gln Ile Val Asp Gly Glu Thr Gly Phe Leu Val Arg Asp Ala Asn Glu 355 360 365 Ala Val Glu Lys Val Leu Tyr Leu Leu Lys His Pro Glu Val Ser Lys 370 375 380 Glu Met Gly Ala Lys Ala Lys Glu Arg Val Arg Lys Asn Phe Ile Ile 385 390 395 400 Thr Lys His Met Glu Arg Tyr Leu Asp Ile Leu Asn Ser Leu Gly Gly 405 410 415 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Novel nucleoside diphosphate-glucose synthetase and production          method of nucleoside diphosphate-glucose using the same <130> NP07-0142 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1_F <400> 1 gggaggtcta gacgtggatg ttgtgtt 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer1_R <400> 2 aaggcaagct ttcacctcaa cagatct 27 <210> 3 <211> 1221 <212> DNA <213> Thermotoga maritima <400> 3 atggatgttg tgttgagaga gcgaagcata gaggagtacc gcaccataat cggaaacgag 60 gtggacgaga taaaaaaact cgcagaacct cttaaaggaa aaaaggtgct ccacgtcaat 120 gcgactgcct acggtggagg agttgctgaa attctccaca atctcgttcc gcttatgaga 180 tcggttggtc tggatgccag atggagggtc atagaggcac ccgatgagtt cttcaatgtc 240 acaaaaaagt ttcacaacac gcttcaggga gcagatatag agatttcaga ggaagaatgg 300 aacctttacg aagaggtctg cagaaaaaac gcagaactga tccaggatga agagttattc 360 gtgatccacg attcccaacc agcagctgtg agaaagtttg tggatttgaa cgacaggaag 420 tggatctgga gatgtcatat agatctatcc actccaaaca tgaaggtctg gcaaaaattt 480 tctcagtatc tggaaggata caacagactc gttttccatc tcgaggagta tttcccgcag 540 ggatggaaag aaaggagcat tgcttttcca ccgagtatag accccctgag tgaaaagaat 600 cgagatcttg acgaagacac gataagaaaa actcttgaaa gactcgaaat agacccggag 660 agacctctga taactgttgt ggctcgattt gatccgtgga aagatctctt cagtgccatc 720 gacgtctata gactggtgaa gaaagagatc ccggaggttc agcttgccgt ggtttccgcc 780 atggcggcgg acgatccaga aggatggttc ttctttgaga aggtcctcag atacgccgga 840 acggacgaag atataaaatt ctgcacgaac ctgaaaggtg ttggaaacaa ggaagtgaac 900 gctattcaga gggccacaac cgttgctctt cacacggcaa caagagaagg ctttggtctc 960 gtcataagtg aagcccttta caagagggtt ccggtcgtgg caaggccagt tggtggtgtt 1020 aagatacagg tgaaacatgg agaaaatggt tatttggcat gggaaagaga agaccttgcg 1080 gggtacgtgg taaaactcat aaaggatgaa gaactcagaa gaaaaatggg agaaaaagga 1140 aggcaaaccg tggtggaaaa tttcattatc acggtgcatc tgaagaacta tctgaaactc 1200 ttcttagatc tgttgaggtg a 1221 <210> 4 <211> 406 <212> PRT <213> Thermotoga maritima <400> 4 Met Asp Val Val Leu Arg Glu Arg Ser Ile Glu Glu Tyr Arg Thr Ile   1 5 10 15 Ile Gly Asn Glu Val Asp Glu Ile Lys Lys Leu Ala Glu Pro Leu Lys              20 25 30 Gly Lys Lys Val Leu His Val Asn Ala Thr Ala Tyr Gly Gly Gly Val          35 40 45 Ala Glu Ile Leu His Asn Leu Val Pro Leu Met Arg Ser Val Gly Leu      50 55 60 Asp Ala Arg Trp Arg Val Ile Glu Ala Pro Asp Glu Phe Phe Asn Val  65 70 75 80 Thr Lys Lys Phe His Asn Thr Leu Gln Gly Ala Asp Ile Glu Ile Ser                  85 90 95 Glu Glu Glu Trp Asn Leu Tyr Glu Glu Val Cys Arg Lys Asn Ala Glu             100 105 110 Leu Ile Gln Asp Glu Glu Leu Phe Val Ile His Asp Ser Gln Pro Ala         115 120 125 Ala Val Arg Lys Phe Val Asp Leu Asn Asp Arg Lys Trp Ile Trp Arg     130 135 140 Cys His Ile Asp Leu Ser Thr Pro Asn Met Lys Val Trp Gln Lys Phe 145 150 155 160 Ser Gln Tyr Leu Glu Gly Tyr Asn Arg Leu Val Phe His Leu Glu Glu                 165 170 175 Tyr Phe Pro Gln Gly Trp Lys Glu Arg Ser Ile Ala Phe Pro Pro Ser             180 185 190 Ile Asp Pro Leu Ser Glu Lys Asn Arg Asp Leu Asp Glu Asp Thr Ile         195 200 205 Arg Lys Thr Leu Glu Arg Leu Glu Ile Asp Pro Glu Arg Pro Leu Ile     210 215 220 Thr Val Val Ala Arg Phe Asp Pro Trp Lys Asp Leu Phe Ser Ala Ile 225 230 235 240 Asp Val Tyr Arg Leu Val Lys Lys Glu Ile Pro Glu Val Gln Leu Ala                 245 250 255 Val Val Ser Ala Met Ala Ala Asp Asp Pro Glu Gly Trp Phe Phe Phe             260 265 270 Glu Lys Val Leu Arg Tyr Ala Gly Thr Asp Glu Asp Ile Lys Phe Cys         275 280 285 Thr Asn Leu Lys Gly Val Gly Asn Lys Glu Val Asn Ala Ile Gln Arg     290 295 300 Ala Thr Thr Val Ala Leu His Thr Ala Thr Arg Glu Gly Phe Gly Leu 305 310 315 320 Val Ile Ser Glu Ala Leu Tyr Lys Arg Val Pro Val Val Ala Arg Pro                 325 330 335 Val Gly Gly Val Lys Ile Gln Val Lys His Gly Glu Asn Gly Tyr Leu             340 345 350 Ala Trp Glu Arg Glu Asp Leu Ala Gly Tyr Val Val Lys Leu Ile Lys         355 360 365 Asp Glu Glu Leu Arg Arg Lys Met Gly Glu Lys Gly Arg Gln Thr Val     370 375 380 Val Glu Asn Phe Ile Ile Thr Val His Leu Lys Asn Tyr Leu Lys Leu 385 390 395 400 Phe Leu Asp Leu Leu Arg                 405 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2_F <400> 5 gatcctggta ccgtggatgt tgtgttg 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer2_R <400> 6 gtgccaagct ttcacctcaa cagatct 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3_F <400> 7 gatattctag atatgaagat gtacgag 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer3_R <400> 8 tggtgctgca gtcatcctcc gagggag 27 <210> 9 <211> 1250 <212> DNA <213> Pyrococcus horikoshii <400> 9 atgaagatgt acgaggttaa ggaatttagt tcggggaaaa gaaagcttga agactataaa 60 agcataatag gggaggaaga agttagcaaa atccaggaaa aggccgagaa attgaaagga 120 agaagtttcg tccatgtgaa ctcaacttcc ttcggaggag gtgtcgccga gatactccac 180 agcttggtac ccctactgag gagcattgga attgaagcaa ggtggttcgt aatcgagggg 240 cccacggaat tcttcaacgt cacgaagacc tttcacaacg cacttcaagg taacgaatcc 300 ctcaagctaa cggaggagat gaaagaactt tacctcaatg tgaacaggga aaattctaaa 360 ttcattgacc tttcaagctt tgactacgtt ctagtccacg acccccagcc ggccgccctt 420 atagagttct acgagaagaa gagcccatgg ctctggaggt gccacataga tctcagctca 480 ccaaacagag aattctggga gttcctgagg aggttcgtgg agaagtacga cagatatatc 540 ttccaccttc ctgagtacgt tcagcctgag ttagatagga ataaggccgt tataatgcct 600 ccatcgatag atcccctgag cgaaaagaac gttgagctta agagacggaa atcctaagaa 660 tccttgagag attcgacgtt gatccggaga aacctataat aacccaggtc tcaaggttcg 720 atccatggaa agggatattc gacgttatcg agatttacag aaaggttaag gaaaagatcc 780 caggagttca gctactccta gttggggtca tggcccacga cgacccagag ggatggatct 840 acttcgaaaa gaccctaagg aagataggag aagactacga tgtgaaagtc ctgacgaatt 900 taataggggt tcacgcgagg gaggttaacg ccttccaaag ggctagcgat gttatattac 960 aaatgtcgat aagggaaggg ttcgggttaa cagttaccga ggctatgtgg aagggaaaac 1020 ctgtaattgg tagagcagtt ggcggtatta agttccagat agtagatggg gagactggat 1080 tcttggtaag ggatgcaaat gaagccgttg agaaggtgct ctatctcctt aaacatccag 1140 aggtatcgaa ggagatggga gctaaggcca aggaaagggt gaggaaaaac ttcataataa 1200 ctaaacatat ggaaaggtac ttggatatct tgaactccct cggaggatga 1250 <210> 10 <211> 416 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <400> 10 Met Lys Met Tyr Glu Val Lys Glu Phe Ser Ser Gly Lys Arg Lys Leu   1 5 10 15 Glu Asp Tyr Lys Ser Ile Ile Gly Glu Glu Glu Val Ser Lys Ile Gln              20 25 30 Glu Lys Ala Glu Lys Leu Lys Gly Arg Ser Phe Val His Val Asn Ser          35 40 45 Thr Ser Phe Gly Gly Gly Val Ala Glu Ile Leu His Ser Leu Val Pro      50 55 60 Leu Leu Arg Ser Ile Gly Ile Glu Ala Arg Trp Phe Val Ile Glu Gly  65 70 75 80 Pro Thr Glu Phe Phe Asn Val Thr Lys Thr Phe His Asn Ala Leu Gln                  85 90 95 Gly Asn Glu Ser Leu Lys Leu Thr Glu Glu Met Lys Glu Leu Tyr Leu             100 105 110 Asn Val Asn Arg Glu Asn Ser Lys Phe Ile Asp Leu Ser Ser Phe Asp         115 120 125 Tyr Val Leu Val His Asp Pro Gln Pro Ala Ala Leu Ile Glu Phe Tyr     130 135 140 Glu Lys Lys Ser Pro Trp Leu Trp Arg Cys His Ile Asp Leu Ser Ser 145 150 155 160 Pro Asn Arg Glu Phe Trp Glu Phe Leu Arg Arg Phe Val Glu Lys Tyr                 165 170 175 Asp Arg Tyr Ile Phe His Leu Pro Glu Tyr Val Gln Pro Glu Leu Asp             180 185 190 Arg Asn Lys Ala Val Ile Met Pro Pro Ser Ile Asp Pro Leu Ser Glu         195 200 205 Lys Asn Val Glu Leu Lys Gln Thr Glu Ile Leu Arg Ile Leu Glu Arg     210 215 220 Phe Asp Val Asp Pro Glu Lys Pro Ile Ile Thr Gln Val Ser Arg Phe 225 230 235 240 Asp Pro Trp Lys Gly Ile Phe Asp Val Ile Glu Ile Tyr Arg Lys Val                 245 250 255 Lys Glu Lys Ile Pro Gly Val Gln Leu Leu Leu Val Gly Val Met Ala             260 265 270 His Asp Asp Pro Glu Gly Trp Ile Tyr Phe Glu Lys Thr Leu Arg Lys         275 280 285 Ile Gly Glu Asp Tyr Asp Val Lys Val Leu Thr Asn Leu Ile Gly Val     290 295 300 His Ala Arg Glu Val Asn Ala Phe Gln Arg Ala Ser Asp Val Ile Leu 305 310 315 320 Gln Met Ser Ile Arg Glu Gly Phe Gly Leu Thr Val Thr Glu Ala Met                 325 330 335 Trp Lys Gly Lys Pro Val Ile Gly Arg Ala Val Gly Gly Ile Lys Phe             340 345 350 Gln Ile Val Asp Gly Glu Thr Gly Phe Leu Val Arg Asp Ala Asn Glu         355 360 365 Ala Val Glu Lys Val Leu Tyr Leu Leu Lys His Pro Glu Val Ser Lys     370 375 380 Glu Met Gly Ala Lys Ala Lys Glu Arg Val Arg Lys Asn Phe Ile Ile 385 390 395 400 Thr Lys His Met Glu Arg Tyr Leu Asp Ile Leu Asn Ser Leu Gly Gly                 405 410 415  

Claims (9)

서열번호 4의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 함유하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성용 조성물.A composition for synthesizing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) containing a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or an expression protein thereof. 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 또는 그 발현 단백질을 함유하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성용 조성물.A composition for synthesizing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) containing a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or an expression protein thereof. 제 1 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성용 조성물.The composition for synthesizing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) according to claim 1, wherein the gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO. 제 2 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성용 조성물.3. The composition for synthesizing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) according to claim 2, wherein the gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9. 제 1 항 내지 제 4 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자는 발현벡터에 삽입되어 있는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 합성용 조성물.The composition for synthesizing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) according to any one of claims 1 to 4, wherein the gene is inserted into an expression vector. 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 생산하는 방법에 있어서,In the method for producing nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose), 서열번호 4 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 발현벡터에 작동가능하도록 삽입시켜 재조합 발현벡터를 만드는 단계;Creating a recombinant expression vector by operably inserting a gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 10 into the expression vector; 상기 재조합 발현벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 형질전환체를 만드는 단계;Transforming the recombinant expression vector into a host cell to make a transformant; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및Culturing the transformant; And 상기 배양물에서 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose)를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 생산방법.Nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) production method comprising the step of extracting nucleoside diphosphate-glucose from the culture. 제 6 항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 3 또는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 생산방법.The method of claim 6, wherein the gene has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9 nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) production method. 제 6 항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균인 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 생산방법.The method of claim 6, wherein the transformant is Escherichia coli, characterized in that nucleoside diphosphate-glucose (NDP-glucose) production method. 제 6 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 단계는 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 및 트레할로스(trehalose)가 포함된 배지에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드 디포스페이트-글루코오스(NDP-glucose) 생산방법.The nucleoside diphosphate-glucose (NDP) according to any one of claims 6 to 8, wherein the culturing step is performed in a medium containing nucleoside diphosphate (NDP) and trehalose. -glucose) production method.
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