KR100979462B1 - Anthracycline anticancer drug-encapsulated liposomes and preparation method thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 양전하를 갖는 지질과 인지질을 함유하는 리포솜에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 도입하여 이온성 리포솜을 제조함으로써 암세포 내로 효과적으로 이입되어 항암약물의 투여가 용이한 세포이입성이 증진된 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention relates to an anthracycline-based anticancer drug encapsulation liposomes and a method for preparing the same, and more specifically, by introducing a polyethylene glycol (PEG) derivative into liposomes containing lipids and phospholipids with positive charges to prepare ionic liposomes. The present invention relates to an anthracycline-based anticancer drug-encapsulating liposome having an effective introduction into an cancer cell, which is easy to administer an anticancer drug, and a preparation method thereof.
안트라사이클라인계 항암약물, 리포솜, 폴리에틸렌글리콜 유도체, 세포이입성 Anthracycline anticancer drugs, liposomes, polyethylene glycol derivatives, cytotoxicity
Description
본 발명은 양전하를 갖는 지질과 인지질을 함유하는 리포솜에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 도입하여 이온성 리포솜을 제조함으로써 암세포 내로 효과적으로 이입되어 항암약물의 투여가 용이한 세포이입성이 증진된 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention provides an anthracycline-based system that is easily introduced into cancer cells by introducing polyethylene glycol (PEG) derivatives into liposomes containing lipids and phospholipids with positive charges to prepare ionic liposomes, thereby facilitating administration of anticancer drugs. It relates to anti-cancer drug encapsulation liposomes and a method for preparing the same.
리포솜은 체내에 존재하는 인지질을 주성분으로서 사용하기 때문에 생체적합성이 우수하고 병소로의 효율적인 약물전달을 수행 할 수 있는 입자성 전달체로서 많이 응용되어 왔다[A.D. Bangham, M. Standish, J. C. Watkis, J. Mol. Biol., 13, 238(1965)]. 리포솜은 독성이 강한 항암 약물 등의 전달체로서 약물 고유의 독성과 이에 수반되는 심각한 부작용을 감소시키는 장점을 가지고 있다[D. Needham, M. W. Dewhirst, Adv. Drug Deliver. Rev., 53, 285(2001)]. 특히, 안트라사이클린 계열의 항암약물은 심장에 강한 독성을 나타내며, 심장 이외의 조직이나 장기에서도 정상세포에까지 영향을 미치는 심각한 부작용을 나타내는 특성 이 있다. 이러한 독성이 강한 항암약물을 효율적으로 암 조직까지 운반하기 위해 리포솜을 이용함으로써 약물의 독성을 감소시키고 체내 순환시간을 증가시킬 수 있다고 보고되었다[D.J.A. Crommelin, L. van Bloois, Int. J. Pharm., 17, 135(1983)]. 그러나, 이와 같은 리포솜의 장점에도 불구하고 체내 투여된 리포솜은 혈장 단백질의 흡착과 생체효소들에 의한 지질의 분해 등에 의해서 구조적인 불안정성이 보고되었다[Alberto Gabizon, Adv. Drug Deliver. Rev., 16, 285(1995)]. 따라서, 기존의 리포솜의 표면에 생체적합성 고분자 물질을 도입하여 혈장 단백질과의 흡착을 방지함으로써 혈액 내에서 리포솜의 안정성과 순환시간을 증가시키는 연구가 활발히 진행되고 있다[H. Takeuchi, H. Kojima, H. Yamamoto, Y. Kawashima, J. Control. Release, 75, 83(2001)].Since liposomes use phospholipids present in the body as main components, they have been widely applied as particulate carriers that are excellent in biocompatibility and capable of efficient drug delivery to lesions [A.D. Bangham, M. Standish, J. C. Watkis, J. Mol. Biol., 13, 238 (1965). Liposomes are highly toxic anticancer drugs and have the advantage of reducing the inherent toxicity of drugs and the serious side effects that accompany them [D. Needham, M. W. Dewhirst, Adv. Drug Deliver. Rev., 53, 285 (2001). In particular, anti-cancer drugs of the anthracycline series has a strong toxicity to the heart, and has a characteristic side effects that affect the normal cells in tissues and organs other than the heart. It has been reported that the use of liposomes to efficiently transport these highly toxic anticancer drugs to cancer tissues can reduce drug toxicity and increase body circulation time [D.J.A. Crommelin, L. van Bloois, Int. J. Pharm., 17, 135 (1983). However, despite the advantages of liposomes, the liposomes administered in the body have been reported structural instability due to the adsorption of plasma proteins and the degradation of lipids by bioenzymes [Alberto Gabizon, Adv. Drug Deliver. Rev., 16, 285 (1995). Therefore, studies are being actively conducted to increase the stability and circulation time of liposomes in the blood by introducing biocompatible polymer materials on the surface of existing liposomes to prevent adsorption with plasma proteins [H. Takeuchi, H. Kojima, H. Yamamoto, Y. Kawashima, J. Control. Release, 75, 83 (2001).
수용성 고분자인 PEG는 생체 내 독성이 없는 생체적합성 고분자로서 단백질, 혈소판 등의 혈액성분, 세포 및 조직과의 상호작용을 거의 하지 않는 특성을 나타내고 있어 PEG를 리포솜의 표면개질용 물질로서 이용하는 시도가 있다[M.C. Woodle, D.D. Lasoc, Biochem. Biophys. Acta, 1113, 2(1992), V.P. Torchilin, J. Micro encapsul. 15, 1(1998), C.R. O'Riordan, A. Lachapelle, C. Delfado, V. Parkes, S.C. Wadsuorth, A.E. Smith, G.E. Francis, Hum. Gene Ther., 10(1999)]. 이러한 PEG를 리포솜에 도입시킨 리포솜을 제조하는 방법으로서 PEG를 지질에 공유결합시킨 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-mPEG-2000)을 리포솜을 구성하는 성분으로 사용하여 혈류 내의 단백질 흡착과 세망내피계(reticuloendothelial system)로부터 안정한 리포솜 을 제조하는 것에 관한 연구가 보고되었다[Boris Ceh, Mathias Winterhalter, Peter M. Frederik, Joseph J. Vallner, Danilo D. Lasic, Adv. Drug Delivery Reviews, 24(1997)]. 이러한 PEG 도입 리포솜은 세망내피계에 의한 리포솜의 혈류 내 손실을 감소시키고 향상된 투과성과 체류(Enhanced permeability and retention, EPR) 효과에 의해서 종양조직으로의 리포솜의 전달 효율을 증가시키지만 종양세포 주위로 전달된 리포솜을 세포 내로 이입시키는 데에는 기술적 한계가 있었다[Alberto Gabizon, Hilary Shmeeda, Aviva T. Horowitz, Sammuel Zalipsky, Adv. Drug Deliver. Rev., 56, 1177(2004)]. 미국 특허 제5,013,556호는 인지질에 공유 결합시킨 PEG를 사용하여 리포솜을 제조함으로써 리포솜의 체내 순환시간을 증가시키는 방법을 개시하였다. 그러나, 상기 특허에서 PEG가 도입된 리포솜은 혈액 내에서 안정하지만, 리포솜을 세포 내로 효과적으로 이입시키는 데에는 한계가 있었다.As a water-soluble polymer, PEG is a biocompatible polymer that has no toxicity in vivo. It shows a characteristic that little interaction with blood components such as proteins and platelets, cells, and tissues has been attempted to use PEG as a material for surface modification of liposomes. MC Woodle, DD Lasoc, Biochem. Biophys. Acta, 1113, 2 (1992), VP Torchilin, J. Micro encapsul. 15, 1 (1998), CR O'Riordan, A. Lachapelle, C. Delfado, V. Parkes, SC Wadsuorth, AE Smith, GE Francis, Hum. Gene Ther., 10 (1999). As a method for preparing a liposome in which such PEG is introduced into liposomes, 1,2-desteroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy- (polyethylene glycol) in which PEG is covalently bonded to lipids -2000] (DSPE-mPEG-2000) as a constituent of liposomes has been reported to produce protein liposomes in the bloodstream and to produce stable liposomes from the reticuloendothelial system [Boris Ceh, Mathias Winterhalter, Peter M. Frederik, Joseph J. Vallner, Danilo D. Lasic, Adv. Drug Delivery Reviews, 24 (1997). These PEG-induced liposomes reduce liposome loss in the bloodstream by the reticuloendothelial system and enhance the delivery efficiency of liposomes to tumor tissues by enhanced permeability and retention (EPR) effects but are delivered around tumor cells. There were technical limitations to the incorporation of liposomes into cells [Alberto Gabizon, Hilary Shmeeda, Aviva T. Horowitz, Sammuel Zalipsky, Adv. Drug Deliver. Rev. , 56, 1177 (2004). US Pat. No. 5,013,556 discloses a method for increasing the circulating time of liposomes by preparing liposomes using PEG covalently bound to phospholipids. However, although the liposomes to which PEG is introduced in the patent are stable in blood, there are limitations in effectively introducing liposomes into cells.
미국 특허 제7,135,192호는 양이온성 지질을 이용한 리포솜을 제조하여 리포솜의 세포 내 이입을 증가시켰다. 그러나 상기의 특허는 PEG가 도입되지 않은 양이온성 리포솜으로서 리포솜의 체내 순환시간을 증가시키는데 한계가 있었다.US Pat. No. 7,135,192 prepared liposomes using cationic lipids to increase the cellular uptake of liposomes. However, this patent is limited to increasing the circulation time of liposomes as cationic liposomes without PEG.
따라서, 본 발명은 리포솜의 세포 내 이입을 증가시킬 수 있는 리포솜의 제조로서 그 표면에 PEG가 도입된 이온성 리포솜을 제조함으로써 종양 조직으로 전달 된 리포솜이 암세포 내로 효과적으로 흡수될 수 있는 리포솜을 개발하였다. Accordingly, the present invention has developed liposomes that can effectively absorb liposomes delivered to tumor tissues by preparing ionic liposomes with PEG introduced thereon as liposomes capable of increasing intracellular import of liposomes into cancer cells. .
이에, 본 발명자들은 암 세포로의 이입이 효과적으로 증가될 수 있는 이온성 리포솜을 개발하기 위하여 연구한 결과, 리포솜의 세포 내 이입을 증가시킬 수 있는 리포솜의 제조로서 양전하를 갖는 지질과 인지질을 함유하는 리포솜 표면에 PEG를 도입시켜 이온성 리포솜을 제조하였고, 제조된 리포솜이 암세포 내로의 이입이 증가되는 것을 확인하게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. Therefore, the present inventors have studied to develop an ionic liposome that can effectively increase the import into cancer cells, and as a result of the preparation of liposomes that can increase the intracellular import of liposomes containing lipids and phospholipids with a positive charge Ionic liposomes were prepared by introducing PEG into the liposome surface, and it was confirmed that the imported liposomes were increased into cancer cells to complete the present invention.
따라서, 본 발명은 리포솜의 표면에 PEG를 가지고 있으면서 세포 내 이입성이 증진된 이온성 리포솜 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.Accordingly, an object of the present invention is to provide an ionic liposome having a PEG on the surface of the liposome and enhanced incorporation into cells, and a method for preparing the same.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 양전하를 갖는 지질과 인지질을 함유하는 리포솜에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 도입한 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 리포솜 및 이의 제조방법을 그 특징으로 한다.In order to solve the above problems, the present invention is characterized by an anthracycline-based anticancer drug-encapsulated liposome incorporating a polyethylene glycol (PEG) derivative into liposomes containing lipids and phospholipids with a positive charge, and a method of preparing the same.
이상에서 상술한 바와 같이, 본 발명은 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 그 표면에 갖는 이온성 리포솜의 제조방법에 관한 것으로, 양전하를 갖는 지질과 인지질에 공유 결합된 PEG 유도체를 혼합하여 리포솜을 제조하는 방법, 말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체와 양전하를 갖는 지질과의 이온결합에 의한 복합체를 제조한 후 이를 사용하여 리포솜을 제조하는 방법, 그 표면이 양전하를 갖는 리포솜에 음전하를 갖는 PEG 유도체를 이온결합시킴으로써 리포솜의 표면에 PEG가 도입된 리포솜을 제조하는 방법 그리고 양전하를 갖는 인지질과 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic)를 구성성분으로 하여 그 표면에 PEG가 도입된 리포솜을 제조하는 방법을 통해 제조된 이온성 리포솜은 종래의 리포솜에 비해 우수한 암세포 이입율을 나타낸다. As described above, the present invention relates to a method for producing an ionic liposome having polyethylene glycol (PEG) on its surface, and a method for producing a liposome by mixing a lipid having a positive charge and a PEG derivative covalently bonded to a phospholipid. , A method for preparing a liposome using an ion bond between a PEG derivative having a negative charge at the end and a lipid having a positive charge, and then using the same to prepare a liposome, by ionically bonding a PEG derivative having a negative charge to a liposome having a positive charge on its surface Method for preparing liposomes incorporating PEG on the surface of liposomes and PEG on the surface of the positively charged phospholipids and polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymers (PEO-PPO-PEO: pluronic) The ionic liposomes prepared by the method of preparing the liposomes prepared are superior to the conventional liposomes. Cancer cell migration rate is shown.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 양전하를 갖는 지질과 인지질을 함유하는 리포솜에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 도입하여 이온성 리포솜을 제조함으로써 암세포 내로 효과적으로 이입되어 항암약물의 투여가 용이한 세포이입성이 증진된 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 이온성 리포솜 및 이의 제조방법에 관한 것이다. The present invention provides an anthracycline-based system that is easily introduced into cancer cells by introducing polyethylene glycol (PEG) derivatives into liposomes containing lipids and phospholipids with positive charges to prepare ionic liposomes, thereby facilitating administration of anticancer drugs. The present invention relates to an ionic liposome for anticancer drug encapsulation and a method for preparing the same.
본 발명은 양전하를 갖는 지질과 인지질을 함유하는 리포솜에 폴리에틸렌글리콜(PEG) 유도체를 도입하여 이온성 리포솜에 관한 것으로서, 상기 리포솜을 제조하기 위하여 양전하를 갖는 지질, 인지질, 스테롤류, PEG 유도체가 혼합 사용되어 진다.The present invention relates to ionic liposomes by introducing polyethylene glycol (PEG) derivatives into liposomes containing lipids and phospholipids with a positive charge, wherein a positive charge lipid, phospholipids, sterols, and PEG derivatives are mixed to prepare the liposomes. It is used.
상기 양전하를 갖는 지질로는 1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP), 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), La-디올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE) 등을 들 수 있다. 양전하를 갖는 지질은 리포솜 형성 지질 중에서 1.0 ~ 25 몰% 포함하는 것이 바람직하다. 양전하를 갖는 지질의 비율이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜의 제조 및 리포솜의 이온성과 입자크기에 문제가 있다.The positively charged lipids include 1,2-disteroyl-3-trimethylammonium-propane (DSTAP), dimethyldioctadecylammonium (DDAB), 1,2-diacyl-3-dimethylammonium-propane (DAP) And La-dioleyl phosphatidylethanolamine (DOPE). The lipid having a positive charge is preferably included in 1.0 to 25 mol% of liposome-forming lipids. If the proportion of lipids having a positive charge is out of the above range, there is a problem in the preparation of liposomes and the ionicity and particle size of liposomes.
또한, 상기 리포솜의 성분인 인지질로는, 예를 들어 포스파티딜콜린으로서 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 보바인 포스파티딜콜린, 디라우로일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린 또는 디스테아로일포스파티딜콜린 등, 포스파티딜에탄올아민으로서 디라우로일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민, 디팔미토일포스파티딜에탄올아민 또는 디스테아로일포스파티딜에탄올아민, 디오레오일포스파티딜에탄올아민 등, 포스파티딜세린으로서 디라우로일포스파티딜세린, 디미리스토일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린 또는 디스테아로일포스파티딜세린 등, 포스파티딘산, 포스파티딜글리세롤로서 디라우로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디팔미토일포스파티딜글리세롤 또는 디스테아로일포스파티딜글리세롤 등, 포스파티딜이노시톨로서 디라우로일포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜이노시톨, 디팔미토일포스파티딜이노시톨 또는 디스테아로일포스파티딜이노시톨 등, 리조포스파티딜콜린, 스핑고미엘린, 난황 레시틴, 대두 레시틴 또는 수소첨가 인지질 등의 천연 또는 합성 인지질 등을 들 수 있다. 상기 인지질은 리포솜 형성 지질 중에서 30 ~ 60 몰% 포함하는 것이 바람직하다. 인지질의 비율이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜의 안정성이 저하되며 약물의 봉입에 문제가 있다. The phospholipids of the liposomes include, for example, soybean phosphatidylcholine, egg yolk phosphatidylcholine, bovine phosphatidylcholine, dilauroylphosphatidylcholine, dipyryltoylphosphatidylcholine, dispalalloylphosphatidylcholine, and the like as phosphatidylcholine. Dilauroyl as phosphatidylserine, such as dilauroyl phosphatidyl ethanolamine, dimyristoyl phosphatidyl ethanolamine, dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine or distearoyl phosphatidyl ethanolamine, and diopatiyl phosphatidyl ethanolamine as phosphatidyl ethanolamine Phosphatidylserine, dimyristoyl phosphatidylglycerol, dimyristoyl phosphatidylglycerol, diphosphoilyl phosphatidylglycerol, as phosphatidine acid, phosphatidylglycerol, and the like Dilauroyl phosphatidylinositol, dimyristoyl phosphatidyl inositol, dipalmitoyl phosphatidylinositol or distearoyl phosphatidyl inositol, such as palmitoyl phosphatidylglycerol or distearoyl phosphatidyl glycerol, and risphosphosphidyl myoline Natural or synthetic phospholipids such as egg yolk lecithin, soybean lecithin or hydrogenated phospholipids. It is preferable that the phospholipid contains 30 to 60 mol% in liposome-forming lipids. If the ratio of phospholipid is out of the above range, the stability of the liposome is lowered and there is a problem in the encapsulation of the drug.
상기 리포솜을 구성하는 성분으로서 스테롤류로는, 예를 들어 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 3-β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤, 에르고스테롤 또는 라노스테롤 등을 들 수 있고, 리포솜 형성 지질 중에서 20 ~ 40 몰% 포함하는 것이 바람직하다. 스테롤의 비율이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜의 안정성이 저하되며 약물의 봉입에 문제가 있다. As sterols as a component constituting the liposome, for example, cholesterol, cholesterol hexasuccinate, 3-β- [N- (N '(N', N'-dimethylaminoethane) carbamoyl] cholesterol, ergosterol or rano A sterol etc. are mentioned, It is preferable to contain 20-40 mol% in a liposome formation lipid. If the ratio of sterol is out of the above range, the stability of the liposome is lowered and there is a problem in the encapsulation of the drug.
상기 PEG 유도체로는 예를 들어 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000], 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-350], 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-550], 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-750], 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-1000], 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000], 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000], 1,2-디마이리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000], 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-350)], 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-550)], 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-750)], 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-1000)], 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000)], 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000)], 1,2-디올레일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000)], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-350], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-550], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-750], 1,2-디팔미토일-sn-글 리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-1000], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-2000], 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-3000]. 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌글리콜)-5000], 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[아미노-(폴리에틸렌글리콜)-2000], 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[카르복시-(폴리에틸렌글리콜)-2000] 그리고 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드-(폴리에틸렌글리콜)-2000], 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 1000(mPEG-COOH 1000), 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 2000(mPEG-COOH 2000), 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 5000(mPEG-COOH 5000), 디카르복시폴리에틸렌글리콜 3400(COOH-PEG-COOH 3400), 디카르복시폴리에틸렌글리콜 5000(COOH-PEG-COOH 5000), 디카르복시폴리에틸렌글리콜 8000(COOH-PEG-COOH 8000), 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic) 등을 들 수 있다. 상기 PEG와 결합되어 있는 인지질은 리포솜 형성 지질 중에서 5 ~ 30 몰% 포함하는 것이 바람직하다. PEG와 결합되어 있는 인지질의 비율이 상기 범위를 벗어나는 경우에는 리포솜의 제조 및 리포솜의 입자크기에 문제가 있다.Examples of the PEG derivatives include, for example, 1,2-disteroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy- (polyethylene glycol) -2000], 1,2-dimyristoyl- sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -350], 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (Polyethylene glycol) -550], 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethylene glycol) -750], 1,2-dimyristoyl-sn -Glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -1000], 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy ( Polyethylene glycol) -2000], 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -3000], 1,2-dimyristoyl-sn- Glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -5000], 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phospho Tanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -350)], 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -550)], 1,2-Dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -750)], 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanol Amine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -1000)], 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -2000)], 1 , 2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -3000)], 1,2-dioleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine -N- [methoxy (polyethyleneglycol) -5000)], 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -350], 1, 2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -550], 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine -N- [methoxy (poly Ethylene glycol) -750], 1,2-dipalmitoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -1000], 1,2-dipalmitoyl-sn -Glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -2000], 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy ( Polyethylene glycol) -3000]. 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy (polyethyleneglycol) -5000], 1,2-disteroyl-sn-glycero-3-phospho Ethanolamine-N- [amino- (polyethyleneglycol) -2000], 1,2-desteroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [carboxy- (polyethyleneglycol) -2000] and 1 , 2-Disteroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [maleimide- (polyethyleneglycol) -2000], methoxypolyethylene glycol carboxylic acid 1000 (mPEG-COOH 1000), methoxy Polyethylene glycol carboxylic acid 2000 (mPEG-COOH 2000), methoxy polyethylene glycol carboxylic acid 5000 (mPEG-COOH 5000), dicarboxy polyethylene glycol 3400 (COOH-PEG-COOH 3400), dicarboxypolyethylene glycol 5000 (COOH- PEG-COOH 5000), dicarboxypolyethylene glycol 8000 (COOH-PEG-COOH 8000), polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer (PEO-PPO-PEO: pluro nic). Phospholipids bound to the PEG is preferably contained 5 to 30 mol% in liposome-forming lipids. If the ratio of phospholipid bound to PEG is out of the above range, there is a problem in the preparation of liposomes and the particle size of liposomes.
본 명세서에서 리포솜에 목적하는 화합물을 "봉입시킨다"라는 것은 화합물이 리포솜 지질 이중막 사이의 또는 이중막 그 자체 내에서의 수성 공간에 존재하도록하는 것을 의미한다. 본 발명의 리포솜은 친수성 또는 소수성 주사용 항암 약 물로서 안트라사이클라인계열 약물(독소루비신, 에피루비신, 하이루비신, 다우노루비신, 에소루비신, 이다루비신 등) 및 약리학적으로 허용되는 그들의 염 및 산 등이 봉입에 유리하나 특별히 이에 한정하는 것은 아니다. 특히, 이온화시킨 독소루비신과 같은 안트라사이클라인계열의 약물들은 리포솜 내에서 암모늄설페이트와 이온결합이 형성되어 결정형으로 존재하여 봉입되는 특징을 가지고 있다. 상기 약물의 리포솜 내 봉입효율은 80 ~ 100% 범위를 갖는다.By "enclosing" the desired compound in the liposome herein is meant that the compound is present in the aqueous space between the liposome lipid bilayers or within the bilayer itself. The liposomes of the present invention are hydrophilic or hydrophobic injection anticancer drugs, and anthracycline-based drugs (doxorubicin, epirubicin, hirubicin, daunorubicin, esorubicin, idarubicin, etc.) and their pharmacologically acceptable salts. And acids are advantageous for encapsulation, but are not particularly limited thereto. In particular, anthracycline-based drugs such as ionized doxorubicin have the feature of forming an ionic bond with ammonium sulphate in liposomes to form and encapsulate. The encapsulation efficiency of the drug is in the range of 80 to 100%.
본 발명에 따른 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 리포솜의 제조방법은 The method for preparing liposomes for encapsulating anthracycline-based anticancer drugs according to the present invention
1) 양전하를 갖는 지질과 인지질에 공유 결합된 PEG 유도체를 혼합하여 리포솜을 제조하는 방법;1) a method of preparing liposomes by mixing a positively charged lipid and a PEG derivative covalently bound to phospholipids;
2) 말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체와 양전하를 갖는 지질과의 이온결합에 의한 복합체를 제조한 후 이를 사용하여 리포솜을 제조하는 방법;2) preparing a complex by ionic bonding of a negatively charged PEG derivative and a positively charged lipid to prepare a liposome using the same;
3) 그 표면이 양전하를 갖는 리포솜에 음전하를 갖는 PEG 유도체를 이온결합시킴으로써 리포솜의 표면에 PEG가 도입된 리포솜을 제조하는 방법; 또는3) preparing a liposome in which PEG is introduced to the surface of the liposome by ion-bonding a negatively charged PEG derivative to a liposome whose surface is positively charged; or
4) 양전하를 갖는 지질과 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic)를 구성성분으로 하여 그 표면에 PEG가 도입된 리포솜을 제조하는 방법4) A method of preparing a liposome in which PEG is introduced into a surface of a lipid having a positive charge and a polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer (PEO-PPO-PEO: pluronic) as a component
을 포함한다..
먼저, 양전하를 갖는 지질과 인지질에 공유 결합된 PEG 유도체를 혼합하여 리포솜을 제조하는 방법은 다음과 같다.First, liposomes are prepared by mixing a positively charged lipid and a PEG derivative covalently bound to phospholipids.
양전하를 갖는 지질, 인지질, 스테롤 및 인지질에 공유 결합된 PEG 유도체를 0.1 ~ 1 : 2 ~ 30 : 1 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 유기용매 5 ~ 10 ml에 용해시킨 후, 회전증발농축기를 이용하여 유기용매를 제거하여 얇은 지질막을 형성시킨다. 150 ~ 250 mM 농도의 암모늄 설페이트 수용액 3 ~ 10 ml를 사용하여 지질막을 수화시킨 후, 수화된 리포솜 용액을 가압압출기를 통해 리포솜의 크기를 90 ~ 120 nm로 균일화한다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 암모늄 설페이트는 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거한다. 상기와 같이 제조한 리포솜에 안트라사이클라인계 항암약물을 1 ~ 5 : 1 ~ 5의 부피비로 혼합하여 40 ~ 65 ℃에서 1 ~ 3시간동안 반응시켜 항암약물을 봉입시킨다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내에 함유되지 않은 항암약물은 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거한다. PEG derivatives covalently bound to positively charged lipids, phospholipids, sterols and phospholipids were mixed in a weight ratio of 0.1 to 1: 2 to 30: 1 to 10: 1 to 10, and the lipid components were dissolved in 5 to 10 ml of an organic solvent. After that, the organic solvent is removed using a rotary evaporator to form a thin lipid film. After hydrating the lipid membrane using 3 to 10 ml of an aqueous ammonium sulfate solution at a concentration of 150 to 250 mM, the hydrated liposome solution is homogenized to a size of 90 to 120 nm through a pressurized extruder. Ammonium sulphate not encapsulated in liposomes is removed by membrane dialysis at 4-10 ° C. for 24-48 hours. Anthracycline-based anticancer drugs are mixed in a liposome prepared as described above in a volume ratio of 1 to 5: 1 to 5, and reacted at 40 to 65 ° C. for 1 to 3 hours to enclose the anticancer drug. The anticancer drug not contained in liposomes in the mixed solution is removed by performing membrane dialysis at 4 to 10 ° C. for 24 to 48 hours.
이렇게 형성된 리포솜은 리포솜을 구성하는 양전하를 갖는 지질과 인지질에 PEG 유도체가 공유 결합되어 형성된 것이다.The liposomes thus formed are formed by covalent bonds of PEG derivatives to the lipids and phospholipids constituting the liposomes.
두 번째는 말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체와 양전하를 갖는 지질과의 이온결합에 의한 복합체를 제조한 후 이를 사용하여 리포솜을 제조하는 방법으로서 제조과정은 다음과 같다.Second is a method for preparing a liposome using a composite of the PEG derivative having a negative charge at the end of the ionic bond with a lipid having a positive charge and using the same.
말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체와 양전하를 갖는 지질을 5 ~ 15 : 1 ~ 3 의 중량비로 혼합하고 상기 혼합성분을 유기용매 5 ~ 10 ml에 용해시킨 후, 1 M 농도의 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 8 ~ 13으로 조절한 후 45 ~ 65 ℃에서 1 ~ 3시간동안 반응시킨다. 반응 후 회전증발농축기를 이용하여 40 ~ 50 ℃에서 반응액을 농축하고 에틸에테르를 200 ~ 500 ml 넣어 반응 생성물을 재결정시킨다. 재결정된 지질-PEG 복합체를 종이 필터를 이용하여 여과시킨 후 1 ~ 2시간동안 진공 건조한다. 제조된 지질-PEG 복합체, 인지질 및 스테롤을 1 ~ 3 : 3 ~ 9 : 1 ~ 3의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 유기용매 5 ~ 10 ml에 용해시킨 후, 회전증발농축기를 이용하여 유기용매를 제거하여 얇은 지질막을 형성시킨다. 150 ~ 250 mM 농도의 암모늄 설페이트 수용액 3 ~ 10 ml를 사용하여 지질막을 수화시킨 후, 수화된 리포솜 용액을 가압압출기를 통해 리포솜의 크기를 90 ~ 120 nm로 균일화한다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 암모늄 설페이트는 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거한다. 상기와 같이 제조한 리포솜에 안트라사이클라인계 항암약물을 1 ~ 5 : 1 ~ 5의 부피비로 혼합하여 40 ~ 65 ℃에서 1 ~ 3시간동안 반응시켜 항암약물을 봉입시킨다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내에 함유되지 않은 항암약물은 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거한다. A PEG derivative having a negative charge at the end and a lipid having a positive charge were mixed at a weight ratio of 5 to 15: 1 to 3, and the mixed component was dissolved in 5 to 10 ml of an organic solvent, and then a 1 M sodium hydroxide solution was used. After adjusting the pH to 8 ~ 13 and the reaction for 1 to 3 hours at 45 ~ 65 ℃. After the reaction, the reaction solution was concentrated at 40 to 50 ° C. using a rotary evaporator, and 200 to 500 ml of ethyl ether was recrystallized. The recrystallized lipid-PEG complex is filtered using a paper filter and then vacuum dried for 1-2 hours. The prepared lipid-PEG complex, phospholipid and sterol were mixed in a weight ratio of 1 to 3: 3 to 9: 1 to 3, and the lipid component was dissolved in 5 to 10 ml of an organic solvent, and then the organic solvent was prepared using a rotary evaporator. To form a thin lipid film. After hydrating the lipid membrane using 3 to 10 ml of an aqueous ammonium sulfate solution at a concentration of 150 to 250 mM, the hydrated liposome solution is homogenized to a size of 90 to 120 nm through a pressurized extruder. Ammonium sulphate not encapsulated in liposomes is removed by membrane dialysis at 4-10 ° C. for 24-48 hours. Anthracycline-based anticancer drugs are mixed in a liposome prepared as described above in a volume ratio of 1 to 5: 1 to 5, and reacted at 40 to 65 ° C. for 1 to 3 hours to enclose the anticancer drug. The anticancer drug not contained in liposomes in the mixed solution is removed by performing membrane dialysis at 4 to 10 ° C. for 24 to 48 hours.
상기 말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체로는 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 1000(mPEG-COOH 1000), 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 2000 (mPEG-COOH 2000), 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 5000(mPEG-COOH 5000), 디카르복시폴리에틸렌글리콜 3400(COOH-PEG-COOH 3400), 디카르복시폴리에틸렌글리콜 5000(COOH-PEG-COOH 5000), 디카르복시폴리에틸렌글리콜 8000(COOH-PEG-COOH 8000), 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic) 등을 들 수 있다. PEG 유도체는 리포솜 형성 지질 중에서 5 ~ 30 몰% 포함하는 것이 바람직하다. PEG 유도체의 비율이 상기 범위 를 벗어나는 경우에는 리포솜의 입자크기와 봉입율에 문제가 있다.PEG derivatives having a negative charge at the terminal include methoxy polyethylene glycol carboxylic acid 1000 (mPEG-COOH 1000), methoxy polyethylene glycol carboxylic acid 2000 (mPEG-COOH 2000), methoxy polyethylene glycol carboxylic acid 5000 (mPEG -COOH 5000), dicarboxypolyethylene glycol 3400 (COOH-PEG-COOH 3400), dicarboxypolyethylene glycol 5000 (COOH-PEG-COOH 5000), dicarboxypolyethylene glycol 8000 (COOH-PEG-COOH 8000), polyethylene oxide- Polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer (PEO-PPO-PEO: pluronic) etc. are mentioned. It is preferable that PEG derivatives contain 5-30 mol% in a liposome forming lipid. If the ratio of the PEG derivative is out of the above range there is a problem in the particle size and the sealing rate of liposomes.
이렇게 제조된 리포솜은 PEG 유도체와 양전하를 갖는 지질과의 이온결합에 의한 복합체 형성 후 이를 리포솜화시켜 제조된 것이다.Liposomes thus prepared are prepared by liposome formation after complex formation by ionic bonds between a PEG derivative and a positively charged lipid.
세 번째는 양전하를 갖는 리포솜에 말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체를 이온결합시킴으로써 리포솜의 표면에 PEG가 도입된 리포솜을 제조하는 방법으로서 제조과정은 다음과 같다. Third, a method of preparing a liposome in which PEG is introduced on the surface of a liposome by ion-bonding a negatively charged PEG derivative to a liposome having a positive charge is as follows.
양이온성 지질, 인지질 및 스테롤을 1 ~ 3 : 3 ~ 9 : 1 ~ 3의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 유기용매 5 ~ 10 ml에 용해시킨 후, 회전증발농축기를 이용하여 유기용매를 제거하여 얇은 지질막을 형성시킨다. 150 ~ 250 mM 농도의 암모늄 설페이트 수용액 3 ~ 10 ml를 사용하여 지질막을 수화시킨 후, 수화된 리포솜 용액을 가압압출기를 통해 리포솜의 크기를 90 ~ 120 nm로 균일화한다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 암모늄 설페이트는 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거한다. 상기와 같이 제조한 리포솜에 안트라사이클라인계 항암약물을 1 ~ 5 : 1 ~ 5의 부피비로 혼합하여 40 ~ 65 ℃에서 1 ~ 3시간동안 반응시켜 항암약물을 봉입시킨다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내에 함유되지 않은 항암약물은 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거하여 안트라사이클라인계 항암약물 봉입용 리포솜을 제조한다. 제조된 양이온성 리포솜과 음전하를 갖는 PEG 유도체를 1 ~ 3 : 5 ~ 15의 중량비(양이온성 리포솜 제조시 사용된 양이온성 지질과 PEG 유도체의 중량비)로 혼합하고 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 8 ~ 13으로 조절한 후 20 ~ 30 ℃에서 1 ~ 3시간동안 반응시킨다. 리포솜에 이온 결합되지 않은 PEG는 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거하였다. 상기 말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체는 상기 두 번째 방법에서 사용한 유도체와 동일하다.Cationic lipids, phospholipids and sterols are mixed in a weight ratio of 1 to 3: 3 to 9: 1 to 3, the lipid components are dissolved in 5 to 10 ml of organic solvent, and then the organic solvent is removed using a rotary evaporator. A thin lipid film is formed. After hydrating the lipid membrane using 3 to 10 ml of an aqueous ammonium sulfate solution at a concentration of 150 to 250 mM, the hydrated liposome solution is homogenized to a size of 90 to 120 nm through a pressurized extruder. Ammonium sulphate not encapsulated in liposomes is removed by membrane dialysis at 4-10 ° C. for 24-48 hours. Anthracycline-based anticancer drugs are mixed in a liposome prepared as described above in a volume ratio of 1 to 5: 1 to 5, and reacted at 40 to 65 ° C. for 1 to 3 hours to enclose the anticancer drug. The anticancer drug which is not contained in the liposomes in the mixed solution is removed by performing membrane dialysis for 24 to 48 hours at 4 to 10 ° C to prepare an anthracycline-based anticancer drug encapsulation liposome. The prepared cationic liposomes and negatively charged PEG derivatives were mixed at a weight ratio of 1 to 3: 5 to 15 (weight ratio of cationic lipids and PEG derivatives used to prepare cationic liposomes), and the pH was adjusted using an aqueous sodium hydroxide solution. After controlling to 13 to react for 1 to 3 hours at 20 ~ 30 ℃. PEG that was not ionically bound to liposomes was removed by membrane dialysis at 4-10 ° C. for 24-48 hours. The PEG derivative having a negative charge at the end is the same as the derivative used in the second method.
이렇게 제조된 리포솜은 양전하를 갖는 지질이 함유된 양이온성 리포솜을 제조한 후, 음전하를 갖는 PEG 유도체를 이온결합시켜 리포솜 표면에 PEG가 도입된 것이다.Liposomes thus prepared are cationic liposomes containing lipids with positive charges, and then PEG is introduced on the surface of liposomes by ion-bonding PEG derivatives with negative charges.
네 번째는 양전하를 갖는 지질과 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic)를 구성성분으로 하여 그 표면에 PEG가 도입된 리포솜을 제조하는 방법으로서 제조과정은 다음과 같다. The fourth method is to prepare liposomes with PEG on the surface of lipids having positive charges and polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymers (PEO-PPO-PEO: pluronic) as components. Is the same as
양이온성 지질, 인지질, 스테롤 및 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic)를 0.1 ~ 1 : 3 ~ 30 : 1 ~ 10 : 1 ~ 10의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 유기용매 5 ~ 10 ml에 용해시킨 후, 회전증발농축기를 이용하여 유기용매를 제거하여 얇은 지질막을 형성시킨다. 150 ~ 250 mM 농도의 암모늄 설페이트 수용액 3 ~ 10 ml를 사용하여 지질막을 수화시킨 후, 수화된 리포솜 용액을 가압압출기를 통해 리포솜의 크기를 90 ~ 120 nm로 균일화한다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 암모늄 설페이트는 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거한다. 상기 리포솜이 형성될 때 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic)의 소수성 부분인 폴리프로필렌 옥사이드는 리포솜 지질막에 위치하고 친수성 부분인 폴리에틸렌 옥사이드는 리포솜 표면에 수식된다. 상기와 같이 제조한 리포솜에 안트라사이클라인계 항암약물을 1 ~ 5 : 1 ~ 5의 부피비로 혼합하여 40 ~ 65 ℃에서 1 ~ 3시간동안 반응시켜 항암약물을 봉입시킨다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내에 함유되지 않은 항암약물은 4 ~ 10 ℃에서 24 ~ 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거한다. Cationic lipids, phospholipids, sterols and polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymers (PEO-PPO-PEO: pluronic) are mixed at a weight ratio of 0.1 to 1: 3 to 30: 1 to 10: 1 to 10, and After dissolving the lipid component in 5 ~ 10 ml of organic solvent, using a rotary evaporator to remove the organic solvent to form a thin lipid film. After hydrating the lipid membrane using 3 to 10 ml of an aqueous ammonium sulfate solution at a concentration of 150 to 250 mM, the hydrated liposome solution is homogenized to a size of 90 to 120 nm through a pressurized extruder. Ammonium sulphate not encapsulated in liposomes is removed by membrane dialysis at 4-10 ° C. for 24-48 hours. When the liposome is formed, the polypropylene oxide, the hydrophobic part of the polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer (PEO-PPO-PEO: pluronic), is located on the liposome lipid membrane and the polyethylene oxide, the hydrophilic part, is modified on the liposome surface. Anthracycline-based anticancer drugs are mixed in a liposome prepared as described above in a volume ratio of 1 to 5: 1 to 5, and reacted at 40 to 65 ° C. for 1 to 3 hours to enclose the anticancer drug. The anticancer drug not contained in liposomes in the mixed solution is removed by performing membrane dialysis at 4 to 10 ° C. for 24 to 48 hours.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위를 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited to these Examples.
실시예 1Example 1
양전하를 갖는 지질과 인지질에 공유 결합된 PEG 유도체를 혼합하여 리포솜 제조Preparation of liposomes by mixing positively charged lipids and PEG derivatives covalently bound to phospholipids
1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP), L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL), 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000](DSPE-mPEG-2000)을 0.1 : 2.9 : 1 : 1의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 클로로포름과 메탄올의 혼합용액(1 : 1 v/v) 5 ml에 용해시킨 후, 회전증발농축기를 이용하여 40 ℃에서 유기용매를 제거하고 얇은 지질막을 형성시켰다. 150 mM 농도의 암모늄 설페이트 수용액 5 ml을 사용하여 60 ℃에서 지질막을 수화시킨 후, 수화된 리포솜 용액을 가압압출기를 통해 리포솜의 크기를 100 ~ 110 nm로 균일화하였다. 리포솜 내부에 봉입되지 않은 암모늄 설페이트는 4 ℃에서 48시간동안 막투석을 실시하여 제거하였다. 제조한 리포솜에 독소루비신(5 mg/ml)을 1 : 1 (v/v)로 혼합하여 60 ℃에서 2시간 반응시켜 독소루비신을 봉입시켰다. 상기 혼합용액에서 리포솜 내에 함유되지 않은 약물은 4 ℃에서 48시간동안 막 투석을 실시하여 제거하였다. 상기 리포솜은 양전하를 갖는 지질 2.0 몰%, 인지질 55.2 몰%, 스테롤류 37.6 몰%, PEG 유도체 5.2몰%로 구성된 리포솜을 제조한 것이다.1,2-Disteroyl-3-trimethylammonium-propane (DSTAP), La-phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol (CHOL), 1,2-desteroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N- [methoxy- (polyethyleneglycol) -2000] (DSPE-mPEG-2000) was mixed at a weight ratio of 0.1: 2.9: 1: 1 and the lipid component was mixed with chloroform and methanol (1: 1 v / v). After dissolving in 5 ml, the organic solvent was removed at 40 ° C. using a rotary evaporator to form a thin lipid membrane. After hydrating the lipid membrane at 60 ° C. using 5 ml of an aqueous 150 mM ammonium sulphate solution, the hydrated liposome solution was homogenized to 100-110 nm in size through a pressurized extruder. Ammonium sulphate not encapsulated inside the liposomes was removed by performing dialysis at 48C for 48 hours. Doxorubicin (5 mg / ml) was mixed at 1: 1 (v / v) in the prepared liposome and reacted at 60 ° C. for 2 hours to enclose doxorubicin. Drugs not contained in liposomes in the mixed solution were removed by performing membrane dialysis at 4 ° C. for 48 hours. The liposome is a liposome prepared by 2.0 mole% lipid having a positive charge, 55.2 mole% phospholipid, 37.6 mole% sterols, 5.2 mole% PEG derivative.
비교예 1Comparative Example 1
상기 제조예 1에서 1,2-디스테로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시-(폴리에틸렌글리콜)-2000]의 성분을 사용하지 않고 1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP), L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL)을 성분으로 사용하고 상기 실시예 1의 제조방법과 동일한 방법으로 독소루비신이 봉입된 리포솜을 제조하였다.1,2-Distero without using the components of 1,2-Disteroyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N- [methoxy- (polyethylene glycol) -2000] in Preparation Example 1 Doxorubicin-encapsulated liposomes were prepared in the same manner as in Example 1, using one-3-trimethylammonium-propane (DSTAP), La-phosphatidylcholine (HSPC) and cholesterol (CHOL) as components.
실시예 2Example 2
말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체와 양전하를 갖는 지질과의 이온결합에 의한 복합체를 제조한 후 이를 사용하여 리포솜 제조Preparation of liposomes by preparing a complex by ionic bonding between a negatively charged PEG derivative and a positively charged lipid
말단에 음전하를 갖는 PEG 유도체로 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 2000 (mPEG-COOH 2000)과 양이온성 지질로 1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP)을 5.7 : 1 의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1 : 1 v/v) 5 ml에 용해시킨 후, 1 M 농도의 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 12.5로 조절한 후 65 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 회전증발농축기를 이용하여 50 ℃에서 반응액을 농축하고 에틸에테르를 과량 넣어 반응 생성물을 재결정시켰다. 재결정된 DSTAP-PEG 복합체를 종이 필터를 이용하여 여과시킨 후 1시간동안 진공 건조시켰다. 제조된 DSTAP-PEG 복합체와 L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL)을 1 : 3 : 1 의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1 : 1 v/v) 5 ml에 용해시킨 후, 상기 실시예 1의 방법을 이용하여 독소루비신이 봉입된 리포솜을 제조하였다. 상기 리포솜은 양전하를 갖는 지질 13.1 몰%, 인지질 36.5 몰%, 스테롤류 24.0 몰%, PEG 유도체 26.4 몰%로 구성된 리포솜을 제조한 것이다.PEG derivative with negative charge at the end of methoxy polyethyleneglycol carboxylic acid 2000 (mPEG-COOH 2000) and cationic lipid to 1,2- disteroyl-3-trimethylammonium-propane (DSTAP) in a weight ratio of 5.7: 1 The lipid component was dissolved in 5 ml of a mixture of chloroform and methanol (1: 1 v / v), the pH was adjusted to 12.5 using an aqueous solution of sodium hydroxide at a concentration of 1 M, followed by reaction at 65 ° C. for 1 hour. I was. After the reaction, the reaction solution was concentrated at 50 ° C. using a rotary evaporator, and ethyl acetate was added in excess to recrystallize the reaction product. The recrystallized DSTAP-PEG complex was filtered using a paper filter and then vacuum dried for 1 hour. The prepared DSTAP-PEG complex, La-phosphatidylcholine (HSPC) and cholesterol (CHOL) were mixed in a weight ratio of 1: 3: 1 and the lipid component was dissolved in 5 ml of a mixed solution of chloroform and methanol (1: 1 v / v). After the preparation, doxorubicin-encapsulated liposomes were prepared using the method of Example 1. The liposome is a liposome prepared from 13.1 mol% of a lipid having a positive charge, 36.5 mol% of phospholipids, 24.0 mol% of sterols, and 26.4 mol% of PEG derivatives.
비교예 2Comparative Example 2
상기 제조예 2와 동일하게 실시하되 양이온성 지질 1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP)과 PEG의 복합체를 제조할 때 DSTAP과 PEG를 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1 : 1 v/v) 5 ml에 녹인 후 용액의 pH를 12.5로 조절하는 대신에 1 M 농도의 염산 수용액을 이용하여 pH를 1.5로 조절하여 반응시킨 후 상기 실시예 2의 방법과 동일한 방법으로 DSTAP-PEG 복합체를 제조하고, 이 복합체를 구성성분으로 하여 독소루비신이 봉입된 리포솜을 제조하였다. In the same manner as in Preparation Example 2, when preparing a complex of
비교예 3Comparative Example 3
상기 실시예 2와 동일하게 실시하되 지질-PEG 복합체의 제조 시, 1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP) 대신에 디메틸디옥타데실암모늄(DDAB)을 사용하여 DDAB-PEG 복합체를 제조하였고 이를 DSTAP-PEG 성분 대신 사용하여 독소루비신이 봉입된 리포솜을 제조하였다.In the same manner as in Example 2, but in the preparation of the lipid-PEG complex, using DDAB-PEG using dimethyl dioctadecyl ammonium (DDAB) instead of 1,2- disteroyl-3-trimethylammonium-propane (DSTAP) Complexes were prepared and used in place of the DSTAP-PEG component to prepare doxorubicin-encapsulated liposomes.
실시예 3Example 3
양전하를 갖는 리포솜에 음전하를 갖는 PEG 유도체를 이온결합시켜 리포솜의 표면에 PEG가 도입된 리포솜 제조Preparation of liposomes with PEG introduced on the surface of liposomes by ion-bonding negatively charged PEG derivatives to liposomes with positive charges
1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP)과 L-a-포스파티딜콜린(HSPC) 및 콜레스테롤(CHOL)을 1 : 3 : 1 의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1 : 1 v/v) 5 ml에 용해시킨 후, 상기 실시예 1에 기술한 리포솜의 제조방법과 동일하게 리포솜을 제조하고 항암제가 그 내부에 함유된 리포솜을 제조하였다. 제조된 양이온성 리포솜과 음전하를 갖는 PEG 유도체로 메톡시폴리에틸렌글리콜 카르복실릭산 2000 (mPEG-COOH 2000)를 1 : 5.7 의 중량비로 혼합하고 1 M 농도의 수산화나트륨 수용액을 이용하여 pH를 12.5로 조절한 후 25 ℃에서 1시간동안 교반시켰다. 반응 후 리포솜에 이온 결합되지 않은 PEG는 4 ℃에서 48시간동안 막투석을 실시하여 제거하였다. 상기 리포솜은 양전하를 갖는 지질 13.1 몰%, 인지질 36.5 몰%, 스테롤류 24.0 몰%, PEG 유도체 26.4 몰%로 구성된 리포솜을 제조한 것이다.1,2-Disteroyl-3-trimethylammonium-propane (DSTAP), La-phosphatidylcholine (HSPC) and cholesterol (CHOL) are mixed at a weight ratio of 1: 3: 1 and the lipid component is mixed with chloroform and methanol 1: 1 v / v) After dissolving in 5 ml, liposomes were prepared in the same manner as in the preparation method of liposomes described in Example 1, and liposomes containing an anticancer agent were prepared therein. The prepared cationic liposomes and negatively charged PEG derivatives were mixed with methoxypolyethylene glycol carboxylic acid 2000 (mPEG-COOH 2000) at a weight ratio of 1: 5.7 and the pH was adjusted to 12.5 using an aqueous 1 M sodium hydroxide solution. After stirring at 25 ° C for 1 hour. After the reaction, PEG which was not ion-bonded to liposomes was removed by performing membrane dialysis for 48 hours at 4 ° C. The liposome is a liposome prepared from 13.1 mol% of a lipid having a positive charge, 36.5 mol% of phospholipids, 24.0 mol% of sterols, and 26.4 mol% of PEG derivatives.
실시예 4Example 4
양전하를 갖는 지질과 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic)를 구성성분으로 하여 그 표면에 PEG가 도입된 리포솜을 제조 A liposome having PEG introduced on its surface is prepared by using a lipid having a positive charge and a polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer (PEO-PPO-PEO: pluronic) as a component.
1,2-디스테로일-3-트리메틸암모늄-프로판(DSTAP), L-a-포스파티딜콜린(HSPC), 콜레스테롤(CHOL) 및 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 옥사이드-폴리에틸렌 옥사이드 공중합체(PEO-PPO-PEO:pluronic)를 0.1 : 2.9 : 1 : 1의 중량비로 혼합하고 상기 지질성분을 클로로포름과 메탄올 혼합용액(1 : 1 v/v) 5 ml에 용해시킨 후, 상기 실시예 1에 기술한 리포솜의 제조방법과 동일하게 리포솜을 제조하고 항암제가 그 내부에 함유된 리포솜을 제조하였다. 상기 리포솜은 양전하를 갖는 지질 13.0 몰%, 인지질 36.1 몰%, 스테롤류 24.1 몰%, PEG 유도체 26.8 몰%로 구성된 리포솜을 제조한 것이다.1,2-Disteroyl-3-trimethylammonium-propane (DSTAP), La-phosphatidylcholine (HSPC), cholesterol (CHOL) and polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide copolymer (PEO-PPO-PEO: pluronic) Was dissolved in a weight ratio of 0.1: 2.9: 1: 1, and the lipid component was dissolved in 5 ml of a mixed solution of chloroform and methanol (1: 1 v / v), and the same method as the preparation method of liposome described in Example 1 above. Liposomes were prepared, and liposomes containing an anticancer agent were prepared therein. The liposome is a liposome prepared by 13.0 mol% lipid having a positive charge, 36.1 mol% phospholipid, 24.1 mol% sterols, 26.8 mol% PEG derivatives.
시험예 1 Test Example 1
실시예 1 ~ 4와 비교예 1 ~ 3의 리포솜의 입자크기와 표면 전하를 입도 분석기(ELS-Z, Otuska, Japan)를 이용하여 측정하고 리포솜의 약물 봉입효율은 독소루비신의 최대 흡수파장 490 nm에서 자외선 분광광도계를 이용하여 측정하였다. [표 1]
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상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 ~ 4의 리포솜과 비교예 1 ~ 3의 입자크기는 비슷하며 그 봉입효율 또한 90% 이상으로 봉입율이 바람직하다.As shown in Table 1, the particle sizes of the liposomes of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 to 3 according to the present invention are similar, and the encapsulation efficiency is also preferably 90% or more.
시험예 2: 세포 내 이입 측정Test Example 2: Measurement of Intracellular Influx
PEG가 도입된 이온성 리포솜의 세포 내 이입을 측정하기 위하여, 24 웰 플레이트에 B16F10 흑색종 세포를 2 x 104 cells/well로 2일간 배양 후 독소루비신 수용액(Free DOX)과 기존의 리포솜 제형인 DOXIL 및 상기 실시예 1과 3의 리포솜을 15 ㎍/ml의 독소루비신 농도로 첨가하고, 소 혈청이 들어있지 않은 배지로 교체하여 2시간동안 배양하였다. 2시간 후 배지를 제거하고 PBS 수용액으로 2번 세척한 후 부착된 세포를 5 ml 튜브에 모아 유세포 분석기를 통하여 리포솜의 세포 내 이입을 평가하였다.To measure endocytosis of PEG-incorporated ionic liposomes, B16F10 melanoma cells were cultured in 2 x 10 4 cells / well in a 24-well plate for 2 days, followed by aqueous solution of doxorubicin (Free DOX) and DOXIL, a conventional liposome formulation. And liposomes of Examples 1 and 3 were added at a concentration of 15 μg / ml of doxorubicin, and cultured for 2 hours by replacing with a medium containing no bovine serum. After 2 hours, the medium was removed, washed twice with an aqueous PBS solution, and the attached cells were collected in a 5 ml tube, and the endocytosis of liposomes was evaluated by flow cytometry.
상기 실험에서의 세포 내 이입 측정 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 1과 실시예 3의 리포솜은 기존의 리포솜 제형인 DOXIL 보다 매우 우수한 세포 이입성을 보여주었으며, 특히 실시예 3의 리포솜은 Free DOX와도 대등한 세포 이입성을 나타내었다. The results of endocytosis measurement in the above experiment are shown in FIG. 1. As shown in Figure 1, the liposomes of Examples 1 and 3 showed much better cell migration than the conventional liposome formulation DOXIL, in particular, the liposomes of Example 3 shows a similar cell importability as Free DOX It was.
따라서, 본 발명에 따른 리포솜은 기존의 리포솜에 비해 봉입율면에서는 유사하나, 세포 내 이입효과가 월등히 증대되어 암세포 치료를 극대화시킬 수 있는 점에서 매우 유용하리라 기대된다.Therefore, the liposome according to the present invention is similar in terms of the encapsulation rate compared to the existing liposomes, but is expected to be very useful in terms of maximizing the cancer cell treatment by significantly increasing the effect of intracellular import.
도 1은 시험예 2에서의 세포 내 이입 결과를 나타낸 것이다.Figure 1 shows the results of the endocytosis in test example 2.
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2007
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