KR100976218B1

KR100976218B1 - 비행시간이차이온질량분광법을 이용한 질병의 진단 방법,질병 지표의 스크린 방법, 및 질병 지표

Info

Publication number: KR100976218B1
Application number: KR1020080048552A
Authority: KR
Inventors: 이태걸; 문대원; 유병철; 김인후
Original assignee: 한국표준과학연구원
Priority date: 2008-05-26
Filing date: 2008-05-26
Publication date: 2010-08-17
Also published as: US20130065266A1; WO2009145382A1; KR20090122638A; US8871438B2; US8283117B2; US20110095179A1

Abstract

본 발명은 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)을 이용한 질병의 진단 방법, 질병 지표의 스크린 방법, 및 질병 지표에 관한 것이며, 특히, 비행시간이차이온질량분광법을 이용한 대장암의 진단방법, 대장암 지표의 스크린 방법, 및 대장암 지표에 관한 것이다.

상세하게는 비행시간이차이온질량분광법을 이용하여 측정된 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들(peaks)의 패턴을 지표로 하여 질병을 진단하는 방법을 제공하며, 질병 보유 여부를 판단하는 기준이 되는 질병 지표의 스크린방법 및 특정한 이차이온질량 픽들로 구성된 지표를 제공한다.

질병 진단, 비행시간이차이온질량분광법, 스크린, 지표, 대장암, 분변

Description

비행시간이차이온질량분광법을 이용한 질병의 진단 방법, 질병 지표의 스크린 방법, 및 질병 지표{Disease Diagnosis Method, Marker Screening Method and Marker Using TOF-SIMS}

본 발명은 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)을 이용한 질병의 진단 방법, 질병 지표의 스크린 방법, 및 질병 지표에 관한 것이며, 특히, 비행시간이차이온질량분광법을 이용한 대장암의 진단방법, 대장암 지표의 스크린 방법, 및 대장암 지표에 관한 것이다. 본 발명의 지표 스크린 방법에 따라 특정 질병의 검출에 사용되는 지표를 추출할 수 있으며, 추출된 지표를 이용하여 질병을 진단할 수 있다. 본 발명에 따른 지표 및 진단 방법은 초진, 예후 및 질병 모니터링 등에 사용될 수 있다.

암은 세포가 무한히 증식해 정상적인 세포의 기능을 방해하는 질병으로, 폐암, 위암, 유방암, 대장암 등이 있으나, 실질적으로 어느 조직에서나 발생할 수 있다.

초기 암 진단은 암 세포의 성장에 따른 생체 조직의 외적 변화에 근거하였으 나, 근래에 들어 혈액, 당쇄, DNA등 생물의 조직 또는 세포에 미량 존재하는 생체 분자를 이용한 진단 및 검출이 시도되고 있다.(대한민국 공개특허 제2008-0003472호, 국제공개특허 제2000-004149호, 미국공개특허 제2004-586856, 미국공개특허 제 2003-690880호)

그러나 가장 보편적으로 사용되는 암 진단 방법은 생체조직검사를 통해 얻어진 조직 샘플을 이용하거나, 화상을 이용한 진단이다.

그러나 생체조직검사는 환자에게 큰 고통을 야기하며, 고비용이 들 뿐만 아니라, 진단까지 긴 시간이 소요되는 단점이 있다. 또한 환자가 실제 암에 걸린 경우, 생체조직검사 과정중 암의 전이가 유발될 수 있는 위험이 있으며, 생체조직검사를 통한 조직 샘플을 얻을 수 없는 부위의 경우, 외과적인 수술을 통해 의심되는 조직의 적출이 이루어지기 전에는 질병의 진단이 불가능한 단점이 있다.

화상을 이용한 진단은 X-레이, 질병 표적물질이 부착된 조영제를 사용한 핵자기 공명 영상법, 핵영상등을 통해 얻어진 이미지를 기반으로 암을 판정한다. 그러나, 이러한 화상 진단은 시술자 또는 판독자의 숙련도에 따라 오진의 가능성이 크며, 화상을 얻는 기기의 정밀도에 크게 의존하는 단점이 있다. 더 나아가, 가장 정밀한 기기조차도 수 mm 이하의 종양은 검출이 불가능하여, 발병 초기 단계에서는 검출이 어려운 단점이 있다. 또한, 화상을 얻기 위해 환자 또는 질병 보유 가능자가 유전자의 돌연변이를 유발하는 고에너지의 전자기파에 노출되므로, 또 다른 질병을 야기할 수 있을 뿐만 아니라, 화상을 통한 진단 횟수가 제한되는 단점이 있다.

소화기 계통의 암은 통상적으로 내시경을 이용한 육안 영상관찰을 통해 질병의 유무를 판단하나, 그 과정이 환자에게 무척 고통스러우며, 육안 영상관찰을 통해 이상이 발견된 경우라 할지라도, 악성/양성 종양, 용종 등의 정확한 질병 판별을 위해서는 생체조직검사가 필수적으로 수행되어야 한다.

특히 대장암의 경우, 세계적으로 발병률이 3위 내인 흔한 암이며, 치료의 가능성이 암의 진행 단계(stage)에 크게 좌우되는 암이다. 특히, 조기 진단을 통한 초기 단계의 발견 시 매우 높은 완치율을 가진다. 따라서, 무엇보다 정확한 조기 진단에 의한 발견이 중요한 질병이나, 암이 진행됨에 따라 동반되는 이상 징후가 미미하여 대부분 출혈에 의한 분변의 색깔 변화로 병을 인지하는 것이 보통이며, 환자 또는 질병 보유 가능자가 검사를 받는다 하더라도 내시경을 통한 관찰이 통상적이며, 정확한 질병 판별을 위해서는 생체조직검사가 필수적으로 수행되어야 한다.

상술한 문제점들을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 환자에게 고통을 주지 않으며, 비침윤적(non-invasive)인 방법으로, 빠르고 간단하게 저비용으로 질병을 진단 할 수 있는 방법을 제공하고자하며, 이러한 진단의 기준이 되는 지표의 스크리닝 방법 및 질병의 유/무를 판별할 수 있는 지표를 제공하고자 한다.

상세하게는 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)을 이용한 질병의 진단 방법 및 질병 지표의 스크린 방법을 제공하고자 하는 것이다.

상술한 문제점들을 해결하기 위한 본 발명의 다른 목적은 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)을 이용한 대장암의 진단 방법 및 대장암 지표의 스크린 방법을 제공하고자 하며, 대장암의 검출 기준이 되는 지표인 특정 이차이온질량 군을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 질병의 진단방법은 비행시간 질량분광법(TOF-MS; Time-of-Flight - Mass Spectrometry)을 이용하여 측정된 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들(peaks)의 패턴을 지표로 하여 질병을 진단하는 특징이 있으며, 상기 비행시간 질량분광법은 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)것이 바람직하다.

이때, 상기 지표가 되는 상기 패턴은 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 패턴인 특징이 있다. 이는 상기 영역에서 질병에 대한 정보를 얻을 수 있는 대사 산물, 유전자 또는 단백질과 같은 대상물 또는 이의 구성물이 분석 가능하기 때문이다. 따라서, 바람직하게 이차이온질량(m/z)의 위치가 1 내지 500인 영역, 더욱 바람직하게는 1 내지 300인 영역을 대상으로, 픽들의 존재 여부, 강도의 변화 여부가 질병 판별의 기준이 된다.

이때, 상기 생물학적 샘플은 분변; 소변; 눈물; 타액; 피부, 호흡관, 장관, 소화관들의 외부 분비물; 혈장; 혈청; 혈액; 척수액; 림프액; 체액; 조직; 조직 균질물; 조직의 부분; 세포; 세포 추출물; 또는 체외 세포 배양물;이다.

질병 진단을 위해 사용하는 상기 패턴은 생물학적 샘플을 비행시간이차이온질량분광 측정하여 얻어진 이차이온질량(m/z) 픽들의 위치, 픽들의 강도 또는 이들의 조합에 의해 구성되며, 상기 패턴에서 특정 이차이온질량(m/z) 위치에서의 픽들의 존재 여부, 강도의 변화 여부가 질병 판별의 기준이 된다.

진단의 정확성 및 신뢰성을 높이기 위해, 상기 질병의 진단방법은 특정 질병을 보유하지 않은 정상인의 상기 생물학적 샘플의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 정상 패턴 및 특정 질병을 보유한 환자의 상기 생물학적 샘플의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 질병 패턴에서 하나 이상 선택된 기준 패턴과 특정 질병 보유 가능자의 상기 생물학적 샘플의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대상 패턴을 비교하여 이차이온질량 픽들의 위치 변화, 이차이온질량 픽들의 강도 변화, 이차이온질량 픽들의 소멸, 이차이온질량 픽들의 생성 또는 이들의 조합에 의해 진단 되는 것이 바람직하다.

상기 기준 패턴은 상기 정상 패턴 또는 상기 질병 패턴일 수 있으며, 정상패턴 및 질병 패턴일 수 있다. 이때, 상기 정상 패턴은 하나 이상의 정상인의 이차이온질량 패턴이 통계적으로 처리되어 얻어진 것일 수 있으며, 상기 질병 패턴 또한 하나 이상의 환자의 이차이온질량 패턴이 통계적으로 처리되어 얻어진 것일 수 있다.

상기 정상 패턴, 상기 질병 패턴 및 상기 대상 패턴은 각각 1 내지 500 영역의 동일 이차이온질량 영역의 패턴인 것이 바람직하며, 동일한 비행시간이차이온질량분광 측정 조건에서 측정된 것이 바람직하다.

상기 정상 패턴, 상기 질병 패턴 및 상기 대상 패턴은 각각 이차이온질량 픽들의 영역(패턴을 구성하는 m/z영역)의 총 누적강도 또는 총 누적강도의 평균으로 표준화(normalization) 될 수 있으며, CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도 또는 특정 픽의 강도의 평균으로 표준화 될 수 있다.

보다 효율적인 비행시간이차이온질량분광 측정을 위해 상기 생물학적 샘플은 이차이온화가 용이하고, 낮은 표면 거칠기를 갖도록 통상적 전처리가 수행된 생물학적 샘플일 수 있다. 그러나 이러한 전처리는 비행시간이차이온질량분광 측정 조건과 마찬가지로 효율적인 이차이온질량 픽들을 얻기 위함이며, 픽들의 위치 또는 상대적 강도(표준화된 각 픽들의 강도)에 미치는 영향이 미미하므로 본 발명에 따른 질병의 진단 방법은 생물학적 샘플의 전처리 조건 또는 비행시간이차이온질량분 광 측정 조건에 의해 한정되지 않는다.

또한, 생물학적 샘플의 전처리 조건 또는 비행시간이차이온질량분광 측정조건의 영향을 최소화하기 위하여, 동일한 생물학적 샘플의 전처리 조건 및 동일한 비행시간이차이온질량분광 측정조건 하에서 정상인, 환자, 특정 질병 보유 가능자의 상기 생물학적 샘플의 이차이온질량 패턴을 측정하여, 상기 기준 패턴과 상기 대상 패턴을 비교하여 픽들의 위치 변화, 픽들의 강도 변화, 픽들의 소멸, 픽들의 생성 또는 이들의 조합에 의해 질병이 진단되는 것이 바람직하다.

상기 기준 패턴을 구성하는 정상 패턴 및 질병 패턴은 통상의 통계적 처리에 의해 얻어질 수 있으며, 상기 기준 패턴과 상기 대상 패턴의 유사 정도 또한 통상의 통계적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 진단 대상이 되는 특정 질병은 대장암인 것이 바람직하며, 상기 생물학적 샘플은 분변 또는 분변액인 것이 바람직하다. 상기 분변액은 분변;과 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 완충용액;을 교반한 후, 액을 분리하여 얻어진 것이 바람직하다.

질병이 대장암인 경우, 상기 기준 패턴과 상기 대상 패턴의 비교에 있어, 질병의 진단을 위한 비교대상(지표가 되는 상기 패턴)은 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량인 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게, 상기 패턴은 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에 서 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 해당(선택된) 이차이온질량의 강도로 구성된다.

가장 바람직하게, 상기 패턴은 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도, 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도로 표준화(normalization)된 해당(선택된) 이차이온질량의 강도로 구성된다.

질병의 지표가 되는 상기 패턴은 상기 정상 패턴; 상기 질병 패턴; 상기 정상 패턴 및 질병 패턴;이며, 상기 정상 패턴 또는 상기 질병 패턴이 다수의 이차이온 질량 검출 결과를 통계적으로 처리하여 얻어진 경우, 상기 표준화는 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도의 평균, 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도의 평균으로 표준화(normalization)된다.

이때, 상기 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량에서 이차이온이 검출되지 않은 것(노이즈 수준의 강도를 포함함) 또한 유의미한 패턴이 된다.

상기 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 복수의 이차이온질량 을 선택하여 질병을 판별하는 경우, 상기 14개의 이차이온질량(m/z)으로 구성된 이차이온질량 군에서 선택된 다수의 이차이온질량 위치들에서의 통계적 검출경향에 의해 질병이 판별되는 것이 바람직하며, 이때, 상기 검출경향은 픽들의 생성, 픽들의 소멸, 픽들의 강도 증진 또는 픽들의 강도 저하를 의미한다.

본 발명에 따른 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법은 a) 특정 질병을 보유하지 않은 정상인의 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 패턴인 정상 패턴을 얻는 단계; b) 특정 질병을 보유한 환자의 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 패턴인 질병 패턴을 얻는 단계; 및 c) 상기 정상 패턴과 상기 질병 패턴의 차이를 비교하여 특정 질병의 지표를 추출하는 단계;를 포함하여 수행되는 특징이 있다.

상기 c) 단계는 상기 정상 패턴과 상기 질병 패턴을 비교하여 위치 변화, 강도 변화, 소멸 및 생성된 픽들의 군에서 선택된 하나 이상의 이차이온질량(m/z)을 추출하여 이를 지표로 스크린하는 것이 바람직하다.

이때, 상기 정상 패턴 및 상기 질병 패턴은 각각 패턴을 구성하는 모든 이차이온질량(m/z) 위치에서의 누적 강도, 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도, 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽들의 강도로 표준화(normalization)된 것이 바람직하며, 상기 정상 패턴 및 상기 질병 패턴이 다수의 이차이온 질량 검출 결과를 통계적으로 처리하여 얻어진 경우, 상기 표준화는 각 패턴을 구성하는 모든 이차이온질량(m/z) 위치에서의 누적 강도의 평균, 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도의 평균, 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도의 평균으로 표준화(normalization)된다.

상세하게는 특정 질병을 보유하지 않은 정상인의 생물학적 샘플과 특정 질병을 보유한 환자의 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 각 패턴의 모든 이차이온질량(m/z) 위치에서의 강도가 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도의 평균 (각 정상인군과 질병환자군), 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도의 평균 (각 정상인군과 질병환자군)으로 표준화(normalization)된 각 패턴(정상 패턴, 질병 패턴)을 얻은 후, 이렇게 얻은 각 패턴의 통계 처리를 통하여 강도가 크게 차이나는 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 특정 질병의 지표를 추출하는 것이 바람직하다.

비행시간이차이온질량분광 측정 조건 및 상기 생물학적 샘플의 전처리에 의한 영향을 최소화하며, 상기 지표 스크린의 정확성을 높이기 위해, 상기 정상 패턴 및 상기 질병 패턴은 동일한 비행시간이차이온질량분광 측정 조건 및 동일한 상기 생물학적 샘플의 전처리 조건하에서 얻어진 것이 바람직하며, 상기 기준 패턴과 상기 대상 패턴에서 강도의 상이함 정도(level)는 통상의 통계적 알고리즘을 이용하여 얻어질 수 있다.

질병 보유 여부를 판별하게 되는 지표를 추출하기 위한 스크린 대상 이차이 온질량(m/z) 영역은 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역인 특징이 있으며, 상기 정상 패턴을 구성하는 이차이온질량(m/z) 영역과 상기 질병 패턴을 구성하는 이차이온질량(m/z) 영역은 동일한 영역이며, 상기 정상 패턴 및 상기 질병 패턴은 각각 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 패턴인 것이 바람직하다.

이때, 상기 정상 패턴 및 상기 질병 패턴은, 일정한 이차이온질량(m/z) 영역 중, 특정 이차이온질량 위치에서 이차이온이 검출되지 않는 것 또한 포함한다.

상기 a) 단계 및 b) 단계의 상기 생물학적 샘플은 분변; 소변; 눈물; 타액; 피부, 호흡관, 장관, 소화관들의 외부 분비물; 혈장; 혈청; 혈액; 척수액; 림프액; 체액; 조직; 조직 균질물; 조직의 부분; 세포; 세포 추출물; 또는 체외 세포 배양물;이다.

바람직하게 상기 질병은 대장암이며, 상기 a) 단계 및 b) 단계의 상기 생물학적 샘플은 분변 또는 분변액인 특징이 있다. 상기 분변액은 분변;과 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 완충용액;을 교반한 후, 액을 분리하여 얻어진 것이 바람직하다.

상기 질병이 대장암인 경우, c) 단계에서 상기 추출된 지표는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량이며, 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 해당(선택된) 이차이온질량의 강도로 구성되는 것이 더욱 바람직하다.

가장 바람직하게는 상기 추출된 지표는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도, 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도로 표준화(normalization)된 해당(선택된) 이차이온질량의 강도로 구성되는 것이 가장 바람직하다.

상기 지표는 해당 이차이온질량 위치에서 이온이 검출되지 않는 것(강도가 0 또는 노이즈 레벨인 것) 또한 포함한다.

본 발명에 따른 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표는 분변 또는 분변액을 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)으로 측정하여 얻어진 하기의 이차이온질량(m/z) 군으로부터 하나 이상 선택된 이차이온질량인 특징이 있다.

(TOF-SIMS 이차이온질량)

81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0

바람직하게 상기 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량(m/z) 군으로부터 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 해당(선택된) 이차이 온질량의 강도로 구성된다.

상기 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표는 대장암을 보유하지 않은 정상인의 분변 또는 분변액의 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 패턴인 대장암 비보유 패턴과 대장암 환자의 분변 또는 분변액의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대장암 패턴을 통계적 알고리즘으로 비교하여 서로 상이한 이차이온질량 및 해당 이차이온질량의 강도를 추출한 것이다.

따라서, 상기 지표를 구성하는 이차이온질량의 강도는 상기 대장암 비보유 패턴 또는 대장암 패턴의 해당 이차이온질량의 강도이며, 상세하게는 대장암 비보유 패턴의 이차이온질량(m/z) 중 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 또는 233.0의 강도, 또는 대장암 패턴의 이차이온질량(m/z) 중 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 또는 233.0의 강도이다.

이때, 상기 지표를 구성하는 이차이온질량의 강도는 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 총 누적강도(각 대장암 비보유군과 대장암군) 또는 특정 픽의 강도(각 대장암 비보유군과 대장암군)로 표준화(normalization)된 것이 바람직하다.

상기 대장암 비보유 패턴 또는 상기 대장암 패턴이 다수의 이차이온 질량 검출 결과를 통계적으로 처리하여 얻어진 경우, 상기 표준화는 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도의 평균(각 대장암 비보유군과 대장암군), 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도의 평균(각 대장암 비보유군과 대장암군)으로 표준화(normalization)된다.

이때, 상기 분변액은 분변;과 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 완충용액;을 교반한 후, 액을 분리하여 얻어진 특징이 있다.

본 발명에 따른 대장암의 진단방법은 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)을 이용하여 측정된 분변 또는 분변액의 이차이온질량(m/z) 픽들(peaks)의 패턴을 지표로 하여 대장암을 진단하는 특징이 있다.

상기 분변액은 분변;과 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 완충용액;을 교반한 후, 액을 분리하여 얻어진 것이 바람직하며, 상기 분변액의 제조를 위한 고액 분리는 원심분리를 이용하여 수행된다.

상기 패턴은 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 패턴인 것이 바람직하며, 상기 패턴은 상기 영역중, 특정 이차이온질량 위치에서 이차이온이 검출되지 않는 것 또한 포함한다.

상기 대장암은 정상인의 상기 분변 또는 분변액의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대장암 비보유 패턴 및 대장암을 보유한 환자의 상기 분변 또는 분변액의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대장암 패턴에서 하나 이상 선택된 기준 패턴과 대장암 보유 가능자의 상기 분변 또는 분변액의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대상 패턴을 비교하여 이차이온질량 픽들의 위치 변화, 이차이온질량 픽들의 강도 변화, 이차이온질량 픽들의 소멸, 이차이온질량 픽들의 생성 또는 이들의 조합에 의해 진단되는 것이 바람직하다.

상기 기준 패턴은 상기 대장암 비보유 패턴 또는 상기 대장암 패턴일 수 있으며, 대장암 비보유 패턴 및 대장암 패턴이며, 상기 기준 패턴과 상기 대상 패턴의 유사 정도(level)는 통상의 통계적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 대장암 비보유 패턴, 상기 대장암 패턴 및 상기 대상 패턴은 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 총 누적강도(각 대장암 비보유군과 대장암군) 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도(각 대장암 비보유군과 대장암군)로 표준화(normalization)된 것이 바람직하다.

이때, 상기 대장암 비보유 패턴은 하나 이상의 정상인의 이차이온질량 패턴이 통계적으로 처리되어 얻어진 것일 수 있으며, 상기 대장암 패턴 또한 하나 이상의 대장암 환자의 이차이온질량 패턴이 통계적으로 처리되어 얻어진 것일 수 있다. 이러한 경우, 상기 대장암 비보유 패턴, 상기 대장암 패턴 및 상기 대상 패턴은 각각 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 총 누적강도의 평균 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽의 강도의 평균으로 표준화 될 수 있다.

상기 대장암 비보유 패턴, 상기 대장암 패턴 및 상기 대상 패턴은 각각 1 내지 500 영역의 동일 이차이온질량 영역의 패턴인 것이 바람직하며, 동일한 비행시간이차이온질량분광 측정 조건에서 얻어진 것이 바람직하다.

상기 대장암은 대장암 비보유 패턴 및/또는 대장암 패턴과 대상 패턴을 비교 하여 패턴의 유사도에 의해 진단되는 것이 바람직하다. 상기 패턴의 유사도는 각 패턴을 구성하는 픽들의 생성 위치(m/z)가 동일한 정도 및 각 패턴을 구성하는 픽들의 상대 강도의 유사함이며, 상기 패턴이 대장암 비보유 패턴과 유사한 경우, 대장암 비보유로 진단되며, 상기 패턴이 대장암 패턴과 유사한 경우, 대장암으로 진단된다.

대장암의 판별에 있어서, 대장암 비보유 패턴 및/또는 대장암 패턴과 대상 패턴의 비교(질병의 지표가 되는 패턴)는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 해당(선택된) 이차이온질량의 강도를 기준으로 수행되는 것이 바람직하다.

더욱 바람직하게 상기 패턴(지표인 패턴)은 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역에서 검출된 총 누적 강도, 또는 CH₃ ⁺와 같은 특정 픽들의 강도로 표준화(normalization)된 해당(선택된) 이차이온질량의 강도로 구성된다.

상세하게, 상기 패턴(지표인 패턴)의 상기 이차이온질량의 강도는 대장암을 보유하지 않은 정상인의 분변 또는 분변액의 이차이온질량(m/z) 픽인 대장암 비보유 패턴 또는 대장암 환자의 분변 또는 분변액의 이차이온질량 픽인 대장암 패턴의 해당 이차이온질량의 강도이다.

상기 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 복수의 이차이온질량을 선택하여 질병을 판별하는 경우, 상기 14개의 이차이온질량(m/z)으로 구성된 이차이온질량 군에서 선택된 다수의 이차이온질량 위치들에서의 통계적 검출경향에 의해 질병이 판별되는 것이 바람직하다.

본 발명의 TOF-SIMS를 이용한 질병의 진단 방법은 환자에게 고통을 주지 않으며, 비침윤적(non-invasive)인 방법으로, 빠르고 간단하게 저비용으로 질병을 진단 할 수 있으며, 진단의 민감도 및 특이성이 높아 초기 검진이 가능하며, 그 검사 횟수에 제한이 없고, 정확성이 높은 장점이 있다.

본 발명의 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크리닝 방법은 질병을 보유한 환자군과 정상군의 측정 스펙스럼을 통계적 처리하여 두 군 사이 차이가 존재하는 특정 이차이온질량을 추출하는 단순한 방법에 의해, 질병의 종류에 구애됨 없이 특정 질병의 보유 여부를 진단할 수 있는 지표를 추출할 수 있는 장점이 있으며, 그 지표의 추출시까지 소요되는 시간과 경비를 대폭 감소시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 질병 진단용 TOF-SIMS 지표는 환자에게 고통을 주지 않으며, 비침윤적(non-invasive)인 방법으로, 빠르고 간단하게 저비용으로 질병을 진단 할 수 있게 하며, 시편의 전처리 과정, TOF-SIMS 측정용 장비, 시편의 보관 조건에 크게 영향을 받지 않는 안정적인 지표인 장점이 있다.

본 출원인은 수많은 실험을 통해 비행시간이차이온질량분광법을 이용한 질병의 진단, 지표의 스크리닝 및 질병의 진단을 가능하게 하는 TOF-SIMS 지표에 있어, 이차이온질량(m/z)이 500 이하인 저질량 영역 특히, 300 이하인 저질량 영역이 암과 같은 질병을 판별 할 수 있는 지표로 적합함을 발견하였다.

이에 대장암을 대상으로 하여 이러한 저질량 영역에서 대장암 지표를 스크리닝하고, 대장암의 진단을 가능케 하는 대장암용 TOF-SIMS 지표를 추출하여 본 발명의 우수함을 실험적으로 입증하였다.

이하 대장암을 진단대상으로 하여, 본 발명에 따른 질병의 진단방법, 지표의 스크리닝 방법 및 질병의 지표에 대해 상세히 설명한다. 다음에 소개되는 실시예는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.

이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

(실시예)

지표의 스크리닝 및 추출된 지표

대장암 환자군 67명과 검진을 통하여 질병이 없는 것으로 확인된 정상군 74명의 분변을 채취하였다.

대장암 환자군의 67명에게는 직장수지검사, 혈액검사, 간기능 검사, CEA(level of carcinoembryonic antigen), 생검을 포함한 대장 내시경 검사, 위 내시경 검사, 가슴/복부/ 및 골반 CT(computed tomography), 경직장 초음파검사(TRUS), 간 및 골반 MR(magnetic resonance) 스캐닝, FDGPET(F-18 deoxyfluoroglucose positron emission tomography) 검사가 행해졌으며, 병변의 위치 및 진행 단계에 대한 조사가 이루어졌다.

정상군은 한국의 국립 암센터의 건강검진 프로그램에 참여한 지원자들로, 직장수지검사, 혈액검사, 간기능 검사, CEA(level of carcinoembryonic antigen), 생검을 포함한 대장 내시경 검사, 위 내시경 검사, 가슴/복부/ 및 골반 CT(computed tomography)등을 통해 질병이 없는 것으로 판명되었다.

정상군과 환자군에서 채취된 모든 분변은 10 g씩 정량되어 분석 전까지 -70℃에서 보관되었다. 이때, 환자군의 분변은 환자에게 수술, 내시경 검사, 또는 치료를 위한 처치가 이루어지기 전에 채취된 것이다.

도 1은 정상군의 검사 결과를 정리한 도표이며, 도 2(도2(a) 및 도2(b))는 환자군의 검사결과를 정리한 도표이다.

비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry, 이하 TOF-SIMS라 지칭함)으로 채취된 분변을 분석하기 위해, 프로테 아제 억제제를 함유한 인산완충식염수((Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)와 분변을 혼합하여 교반한 후, 원심분리기(12,000g, 10분)를 이용하여 액을 분리하였다. 원심분리하여 얻어진 분변액을 유리 슬라이드에 떨어뜨려 비행시간이차이온질량분광법으로 분석하였다.

TOF-SIMS의 측정 조건으로, Bi 이온건이 장착된 TOF-SIMS V(ION-TOF GmbH, Germany) 장비를 이용하였다. 25keV Bi₃ ⁺⁺ 이온총을 이용하였으며, 19.1ns의 펄스로 5kHz에서 고 전류 번칭 모드(high current bunched mode)로 작동되었으며, 공간 분해능은 수 ㎛ 정도였다. 측정 영역은 100x100㎛²이었으며, 스태틱 SIMS(static SIMS) 조건을 만족시키기 위해 이온량은 10¹² ionsㆍcm^- ²이하로 유지되었다. 양의 모드에서 측정되었으며, 질량 분해능(M/△M)은 7000 이상이었고, 양이온 스펙트럼은 CH₃ ⁺, C₂H₃ ⁺, C₃H₅ ⁺ 및 C₇H₇ ⁺ 픽들을 레퍼런스로 하여 보정(calibration)함으로써, 픽들의 정확한 질량을 얻었다. 또한, 본 실시예에서 측정을 통해 얻어진 모든 이차이온질량분광 스펙트럼안의 픽들의 강도는 500m/z까지의 총 누적 강도 또는 CH₃ ⁺의 강도로 표준화(normalization)되었다.

도 3은 유리기판(도 3(a)), 분변액을 채취하기 위해 사용된 프로테아제 억제제를 함유한 인산완충식염수(도 3(b)), 정상군(도 3(c)) 및 환자군(도 3(d))의 비행시간이차이온질량분광 측정 결과이다. 각 군에 속한 분변액의 측정 결과는 특별 한 차이를 보이지 않았다.

정상군과 환자군의 표준화된 비행시간이차이온질량분광 스펙트럼을 통계학적으로 비교 분석하였다. T-test를 이용하여 각각 20개의 정상군과 환자군의 측정 결과에서 비교적 큰 차이를 나타내는 상위 20개의 이차이온질량 피크들을(P<0.05) 선택하였고, 이 상위 20개의 이차이온질량 피크들을 선별하여 k-NN(k-nearest neighbor, k=3) 알고리즘을 이용하여 두 그룹으로 분류(classification)하였고, 이렇게 분류된 결과는 실제 정상군과 환자군으로 분류 되는지 LOOCV(Leave-1-out cross validation) 결과들을 통해 확인하였다. 가장 낮은 ROC(receiver operation characteristic) error를 갖는 LOOCV 결과를 통해 대장암의 지표가 될 수 있는 13개 (500m/z까지의 총 누적 강도로 표준화(normalization)할 경우, m/z 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군) 또는 12 개 (CH₃ ⁺의 강도로 표준화(normalization)할 경우, m/z 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군)의 이차이온질량(m/z)을 추출하였다. 추출된 이차이온질량을 Fisher's exact test(P=5.8 X 10⁸)를 통해 통계적으로 검증하였다.

도 4는 정상군에 속하는 20개의 분변액과 환자군에 속하는 20개의 분변액을 테스트한 결과로, 지표로 추출된 이차이온질량 군에서의 강도 검출 결과의 차이 및 LOOCV 결과를 기반으로 한 대장암 유/무의 판정 결과를 각각 도시한 것이다. 도 4(a)는 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 선택된 12개의 이차이온질량을 지표로 이용하고 CH₃ ⁺ 강도로 표준화된 결과이며, 도 4(b)는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 선택된 13개의 이차이온질량을 지표로 이용하고 m/z가 500 이하인 총 누적강도로 표준화된 결과이다.

도 4에서 지표가 되는 각 이차이온질량 위치에서 검출된 상대 강도는 하기의 수식 1을 이용하여 도식화하였다.

(수식 1)

이차이온질량 (m/z) X의 상대 강도 = (X^m ^/z-X^m ^/ ^z _min)/(X^m ^/ ^z _max-X^m ^/ ^z _min)＊6 - 3

이때, X^m/z는 특정 샘플의 m/z 이차이온질량 위치에서 검출된 강도이며, 상기X^m/z _min는 m/z 이차이온질량 위치에서 검출된 최소 강도, X^m/z _max는 m/z 이차이온질량 위치에서 검출된 최대 강도이다. 이때, 상기 X^m/z, X^m/z _min, X^m/z _max는500m/z까지의 총 누적 강도 또는 CH₃ ⁺의 강도로 표준화 강도이다. 따라서 붉은색(+3)에 가까울수록 높은 강도가 검출된 것을 의미하고 푸른색(-3)에 가까울수록 낮은 강도가 검출된 것을 의미한다.

도 4에서 N(N1~N20)은 실질적으로 정상군에 속하는 분변 샘플임을, C(C1~C20)는 실질적으로 환자군에 속하는 분변 샘플임을 표시한 것이며, 추출된 지표에 의하여 분류(k-NN 알고리즘, k=3을 이용한 classification)된 정상군과 환자군은 각각 노란색과 푸른색으로 표시하였다. 총 40개의 샘플에 대한 결과 민감도 및 특이성은 각각 90% 및 95%이었다.

상술한 통계학적 방법 및 검증을 통해 정상군에서는 높은 강도를 보이나, 환자군에서는 그 강도가 미약하거나 픽들이 사라지는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군을 지표로 추출하였다.

추출된 모든 이차이온질량 군이 대장암의 지표로 사용가능하며, 바람직하게는 표준화의 방법에 따라 영향을 받지 않는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량을 지표로 한다. 그러나, 다수의 지표를 이용한 통계적 접근에 의해 질병 유/무의 판단이 이루어지므로, 사용 가능한 지표가 표준화의 방법에 따라 영향을 받지 않는 이차이온질량으로 한정되는 것은 아니다.

도 5는 지표로 추출된 이차이온질량 군에서의 정상군(N1)과 환자군(C1)의 검출 결과의 차이를 도시한 도면이다.

추출된 지표의 친수성 및 열에 대한 안정성을 테스트하였다. 추출된 지표는 정상군에서 높은 강도를 가지며 환자군에서 낮은 강도를 갖거나 또는 픽들이 나타나지 않으므로, 안정성 테스트는 정상군의 분변을 대상으로 행하였다.

정상군의 분변에서 인산완충식염수를 통해 추출된 분변액에 동일한 부피의 에틸에테르(ethyl ether)를 혼합/교반한 후, 원심분리기(12000rpm, 5분)를 통해 에틸에테르층을 분리/제거하는 과정을 2회 반복하여 지질이 제거된 분변추출액과 에틸에테르 분변추출액을 각각 얻었다.

도 6은 친수성에 대한 안정성을 테스트한 비행시간이차이온질량분광 결과로, 도 6(a)는 인산완충식염수를 통해 추출된 분변액에 대한 결과이며, 도 6(b)는 인산완충식염수를 통해 추출된 분변액에 에틸에테르를 첨가하여 지질이 제거된 분변추출액에 대한 결과이며, 도 6(c)는 에틸에테르 분변추출액에 대한 결과이며, 도 6(d)는 에틸에테르 자체에 대한 결과이다.

도 7은 도 6을 바탕으로 지표로 추출된 이차이온질량 군의 친수성에 대한 안정성을 정리 도시한 도면이다.

도 8은 인산완충식염수를 통해 추출된 분변액을 10회 동결/융해한 후 측정한 비행시간이차이온질량분광 결과(도 8의 N1은 동결/융해 실험 전 측정된 분변액의 결과이며, 도 8의 N1_FT는 동결/융해 실험 후 측정된 분변액의 결과임)로, 추출된 지표 중 125.9, 141.9, 217.0 및 233.0의 이차이온질량(m/z)에서 강도의 저하가 발생하였으나, 나머지 지표는 반복되는 동격/융해의 열 충격에 대해 안정함을 알 수 있다. 도 7 및 도 8의 결과로부터 본 발명에 의해 추출된 지표가 샘플의 전처리 또는 보관 조건에 따라 변하지 않으며, 매우 안정적이고 신뢰성 있는 지표임을 알 수 있다.

추출된 지표를 이용한 블라인드 테스트

지표로 추출된 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량에서 검출된 강도로 k-NN 알고리즘을 지표의 추출에 사용된 동일한 조건으로 대장암의 여부를 진단하였다.

대장암의 진단에 사용된 분변은 지표의 스크리닝 및 추출에 사용된 대장암 환자군 및 정상군에 속하는 분변으로, 블라인드 테스트를 행하였다.

블라인드 테스트 시 분변액의 제조 및 비행시간이차이온질량분광 측정 조건은 지표의 스크리닝시와 동일하다.

도 9는 도 4와 유사하게 정상군에 속하는 54개의 분변액과 환자군에 속하는 47개의 분변액을 블라인드 테스트한 결과로, 지표로 추출된 이차이온질량 군에서의 검출 결과의 차이 및 k-NN 알고리즘으로 검출한 결과를 기반으로 한 대장암 유/무의 판정 결과를 각각 도시한 것이다.

도 4와 마찬가지로, 도 8(a)는 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 선택된 12개의 이차이온질량을 지표로 이용하고 CH₃ ⁺ 강도로 표준화된 결과이며, 도 8(b)는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 선택된 13개의 이차이온질량을 지표로 이용하고 m/z가 500 이하인 총 누적강도로 표준화된 결과이며, 지표가 되는 각 이차이온질량 위치에서 검출된 상대 강도는 붉은색에 가까울수록 높은 강도가 검출된 것 을 의미한다. 도 4와 유사한 기준으로 TOF-SIMS 지표를 이용하여 대장암 유/무를 판별한 결과를 노란색(대장암 보유 판정)과 푸른색(대장암 비보유 판정)으로 정리 도시하였다. 총 101개의 샘플에 대해 블라인드 테스트한 결과 민감도 및 특이성은 93.6% 및 77.8%이었다.

도 10은 TOF-SIMS 지표를 이용한 블라인드 테스트 결과(도 9)와 블라인드 테스트에 사용된 동일한 분변에 대해 대변 잠혈검사(FOBT)를 수행한 결과를 정리하여 도시한 것이다. 대변 잠혈검사(FOBT)는 OC 센서 키트(EIKEN Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 이루어졌으며, 양성 반응의 기준은 100 ng Hb/ml 이었다.

도 10에서 total intensity는 측정된 비행시간이차이온질량분광 스펙트럼을 m/z 500이하의 총 누적 강도로 표준화 한 경우이며, CH₃ ⁺는 CH₃ ⁺의 강도로 표준화한 경우이다. 또한 N은 TOF-SIMS 지표를 통한 검사결과 정상으로 판정된 것을 의미하며, C는 TOF-SIMS 지표를 통한 검사결과 대장암으로 판정된 것을 의미한다. control과 patent는 실질적인 정상군과 환자군에 속한 분변을 의미한다.

도 10의 결과에서 알 수 있듯이 비행시간이차이온질량분광 스펙트럼의 표준화 방법은 추출된 지표의 민감도 및 특이성에 큰 영향을 미치지 않았으며, TOF-SIMS 지표를 이용한 진단결과 민감도 및 특이성은 93.6% 및 77.8%인 반면, 대변 잠혈검사(FOBT)의 경우, 환자군의 분변 중, 오직 37개의 분변에서 양성반응이 나타났을 뿐임을 알 수 있다(민감도 63.8%, 특이성 100%).

도 1은 정상군의 검사 결과를 정리한 도표이며,

도 2는 환자군의 검사결과를 정리한 도표이며,

도 3은 유리기판(도 3(a)), 분변액을 채취하기 위해 사용된 프로테아제 억제제를 함유한 인산완충식염수(도 3(b)), 정상군(도 3(c)) 및 환자군(도 3(d))의 비행시간이차이온질량분광 측정 결과이며,

도 4는 정상군에 속하는 20개의 분변액과 환자군에 속하는 20개의 분변액을 테스트한 결과로, 지표로 추출된 이차이온질량 군에서의 강도 검출 결과의 차이를 각각 도시한 것이며,

도 5는 지표로 추출된 이차이온질량 군에서의 정상군(N1)과 환자군(C1)의 검출 결과의 차이를 도시한 도면이며,

도 6은 친수성에 대한 안정성을 테스트한 비행시간이차이온질량분광 결과로, 도 6(a)는 인산완충식염수를 통해 추출된 분변액에 대한 결과이며, 도 6(b)는 인산완충식염수를 통해 추출된 분변액에서 에틸에테르를 이용하여 지질이 제거된 최종분변액에 대한 결과이며, 도 6(c)는 에틸에테르 분변추출액에 대한 결과이며, 도 6(d)는 에틸에테르 자체에 대한 결과이며,

도 7은 지표로 추출된 이차이온질량 군의 친수성에 대한 안정성을 정리하여 도시한 도면이며,

도 8은 인산완충식염수를 통해 추출된 분변액을 10회 동결/융해한 후 측정한 비행시간이차이온질량분광 결과이며,

도 9는 정상군에 속하는 54개의 분변액과 환자군에 속하는 47개의 분변액을 블라인드 테스트한 결과로, 지표로 추출된 이차이온질량 군에서의 검출 결과의 차이를 각각 도시한 것이며,

도 10은 TOF-SIMS 지표를 이용한 블라인드 테스트 결과와 블라인드 테스트에 사용된 동일한 분변에 대해 대변 잠혈검사(FOBT)를 수행한 결과를 정리하여 도시한 것이다

Claims

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a) 특정 질병을 보유하지 않은 정상인의 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 패턴인 정상 패턴을 얻는 단계;

b) 특정 질병을 보유한 환자의 생물학적 샘플의 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 패턴인 질병 패턴을 얻는 단계; 및

c) 상기 정상 패턴과 상기 질병 패턴의 차이를 비교하여 특정 질병의 지표를 추출하는 단계;

를 포함하여 수행되는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
제 11항에 있어서,

c) 단계는 정상 패턴과 상기 질병 패턴을 비교하여 위치 변화, 강도 변화, 소멸 및 생성된 픽들의 군에서 선택된 하나 이상의 픽들을 추출하는 것을 특징으로 하는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
제 11항에 있어서,

상기 정상 패턴 및 상기 질병 패턴은 각각 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 총 누적강도 또는 특정 픽의 강도로 표준화(normalization)된 것을 특징으로 하는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
제 13항에 있어서,

상기 정상 패턴 및 상기 질병 패턴은 각각 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 패턴인 것을 특징으로 하는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
제 11항 내지 제 14항에서 선택된 어느 한 항에 있어서,

상기 a) 단계 및 b) 단계의 상기 생물학적 샘플은 분변, 소변, 눈물, 타액 물, 혈장, 혈청, 혈액, 척수액, 림프액, 체액, 조직, 조직 균질물, 조직의 부분, 세포, 세포 추출물, 체외 세포 배양물, 피부의 외부 분비물, 호흡관의 외부 분비물, 장관의 외부 분비물 또는 소화관의 외부 분비물인 것을 특징으로 하는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
제 15항에 있어서,

상기 질병은 대장암인 것을 특징으로 하는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
제 16항에 있어서,

상기 a) 단계 및 b) 단계의 상기 생물학적 샘플은 분변 또는 분변액인 것을 특징으로 하는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
제 16항에 있어서,

c) 단계에서 상기 추출된 지표는 81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0의 이차이온질량 군에서 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 해당 이차이온질량의 강도인 것을 특징으로 하는 TOF-SIMS를 이용한 지표의 스크린 방법.
분변 또는 분변액을 비행시간이차이온질량분광법(TOF-SIMS; Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry)으로 측정하여 얻어진 하기의 이차이온질량(m/z) 군으로부터 하나 이상 선택된 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표.

(TOF-SIMS 이차이온질량 군)

81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0
제 19항에 있어서,

상기 TOF-SIMS 지표는 하기의 이차이온질량(m/z) 군으로부터 하나 이상 선택된 이차이온질량 및 해당 이차이온질량의 강도로 구성된 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표.

(TOF-SIMS 이차이온질량 군)

81.0, 83.0, 125.9, 126.9, 131.9, 140.9, 141.9, 148.9, 157.9, 158.9, 205.1, 217.0, 222.9 및 233.0
제 20항에 있어서,

상기 이차이온질량의 강도는 대장암을 보유하지 않은 정상인의 분변 또는 분변액의 이차이온질량(m/z) 픽들로 구성된 패턴인 대장암 비보유 패턴 또는 대장암 환자의 분변 또는 분변액의 이차이온질량 픽들로 구성된 패턴인 대장암 패턴의 해당 이차이온질량의 강도인 것을 특징으로 하는 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표.
제 20항에 있어서,

상기 이차이온질량의 강도는 이차이온질량(m/z)이 1 내지 500 영역의 총 누 적강도 또는 특정 픽의 강도로 표준화(normalization)된 것을 특징으로 하는 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표.
제 19항에 있어서,

상기 분변액은 분변;과 인산완충식염수(PBS)를 포함하는 완충용액;을 교반한 후, 액을 분리하여 얻어진 것을 특징으로 하는 대장암 판정용 TOF-SIMS 지표.
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