KR100971791B1 - 부탄올 생성능이 개선된 재조합 변이 미생물 및 이를이용한 부탄올의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 부탄올 생성능이 개선된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 lactate, ethanol 및/또는 acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어 있는 부탄올 생성능이 개선된 재조합 변이 미생물 및 이를 이용한 부탄올의 제조방법에 관한 것이다.
최근 고유가와 환경 문제로 인해 미생물을 이용한 바이오연료 생산이 큰 관심을 끌고 있다. 특히, 바이오부탄올은 바이오에탄올에 비해 산소함유량이 낮아 화석연료와 잘 섞인다는 장점이 있다. 최근 바이오 부탄올이 휘발유의 대체 연료로 부상하면서 시장 규모가 매우 빠른 속도로 증가하고 있다. 미국에서의 연간 바이오 부탄올 시장은 370 million gal에 이르고 있고, 3.75＄/gal의 단가를 형성하고 있다. 특히, 바이오부탄올은 에너지 밀도, 휘발성 제어, 충분한 옥탄가, 낮은 불순물 등 연료로서 적합한 특성을 가지고 있다. 에탄올 보다 휘발유에 더욱 적합한 부탄올을 미생물을 이용하여 대량 생산한다면, 원유 수입 대체 효과 및 온실 가스 배출 감소로 인한 환경적 효과 등을 가져올 수 있다.
부탄올은 Clostridial 균주의 혐기적 ABE (Acetone-Butanol-Ethanol) fermentation에 의해 생물학적 방법으로 생산될 수 있는데 (Jones, D.T. and Woods, D.R., Microbiol. Rev., 50:484, 1986; Rogers, P., Adv. Appl. Microbiol., 31:1, 1986; Lesnik, E.A. et al., Necleic Acids Research, 29: 3583, 2001), 이러한 방법이 1950년대 까지만 해도 40년 이상에 걸쳐 부탄올과 아세톤의 주요 공급원이었다. Clostridial 균주는 성장 조건이 까다롭고 분자생물학적 tool 및 omics technology 등이 완전히 갖추어져 있지 않아서 추가 균주 개량에 어려움이 있다.
따라서, 성장이 우수하고 다양한 omics technology가 구비된 대장균 등에서의 부탄올 생산이 요구되고 있다. 특히, 대사공학 또는 omics technology 등을 이용한 균주 개발이 전무한 상태이므로 무한한 개발 잠재력이 있다고 하겠다.
따라서, 당업계에서는 기존의 Clostridium acetobutylicum 야생균주를 이용한 부탄올 생산과 달리, 특정 유전자의 결실로 인한 대사회로 재구성과 필요 유전자의 도입 및 증폭을 통한 대사공학적 방법에 의해 부탄올 고생성능을 갖는 미생물, 특히, 부탄올 고생성능을 갖는 대장균의 개발이 절실하게 요구되고 있다.
한편, 부탄올 생합성 경로를 도입하여 부탄올 생성능을 가지는 재조합 박테리아를 제작하고, 이를 이용하여 부탄올 생산을 시도한 바 있으나, 그 생성량이 미미하였다 (US 2007/0259410 A1; US 2007/0259411 A1).
이에, 본 발명자들은 대사공학적 방법에 의해 부탄올 고생성능을 갖는 미생물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, lactate, ethanol 및 acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시키고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시켜 재조합 변이 미생물을 제작하고, 상기 재조합 변이 미생물에 의해 부탄올 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 주된 목적은 부탄올 생성능이 개선된 재조합 변이 미생물 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 변이 미생물을 이용한 부탄올의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미생물에서, lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 고생성능을 가지는 재조합 변이 미생물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 고생성능을 가지는 재조합 변이 미생물을 제공한 다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물은 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lacI (lac operon repressor를 코딩하는 유전자) 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ldhA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 pta (phosphoacetyltransferase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 adhE (alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 효소는 thiolase (THL), 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD), crotonase (CRO), butyryl-CoA dehydrogenase (BCD), butyraldehyde dehydrogenase (AAD) 및 butanol dehydrogenase (BDH)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 THL을 코딩하는 유전자는 thl, thiL, phaA, 및 atoB로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 BCD를 코딩하는 유전자는 Pseudomonas 속 유래 bcd, Clostridium 속 유래 bcd 유전자 또는 Bacillus 속 유래 ydbM인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 BCD를 코딩하는 유전자가 Clostridium 속 유래 bcd인 경우에는 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL)와 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 (etfAB)가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 BHBD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 hbd 또는 대장균 유래 paaH인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 CRO를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 crt 또는 대장균 유래 paaFG인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 AAD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adhE 또는 대장균 유래 mhpF인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 strong promoter를 함유하는 발현벡터는 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, thiolase, butyraldehyde dehydrogenase, crotonase, butanol dehydrogenase 및 butyryl-CoA dehydrogenase로 구성된 군에서 선택되는 효소를 코딩하는 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 발현벡터는 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 및/또는 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, thiolase (THL)를 코딩하는 유전자, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD)를 코딩하는 유전자, crotonase (CRO)를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA dehydrogenase (BCD)를 코딩하는 유전자, butyraldehyde dehydrogenase (AAD)를 코딩하는 유전자, butanol dehydrogenase (BDH)를 코딩하는 유전자 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL) 및 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 (etfAB)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 변이 미생물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 변이 미생물을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
FIG. 1은 Clostridium acetobutylicum에서의 부탄올 생성 pathway를 나타낸 것이다.
FIG. 2는 pKKhbdadhEthiL (pKKHAT) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 3은 pKKhbdadhEatoB (pKKHAA) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 4는 pKKhbdadhEphaA (pKKHAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 5는 pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 6은 pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 7은 pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 8은 pKKhbdgroESLadhEphaA (pKKHGAP) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 9는 pTrc184bcdbdhABcrt (pTrc184BBC) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 10은 부탄올 생합성 경로에 관여하는 C. acetobutylicum 유래 유전자 중 일부를 대장균 유래 유전자로 대체한 경우의 부탄올 생합성 경로를 나타낸 것이다.
FIG. 11은 pKKmhpFpaaFGHatoB (pKKMPA) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
FIG. 12는 pTrc184bcdetfABbdhABgroESL (pTrc184BEBG) 벡터의 제작과정 및 유전자 지도를 나타낸 것이다.
발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예
본 발명에서 '결실'이란 해당 유전자의 일부 또는 전체 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시켜 해당유전자가 발현되지 않도록 하거나 발현되더라도 효소활성을 나타내지 못하도록 하는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로를 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "약화"란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나 일부 염기를 도입시켜 해당유전자에 의해 발현되는 효소의 활성을 감소시키는 것을 포괄하는 개념으로, 해당 유전자의 효소가 관여하는 생합성경로의 일부 또는 상당부분을 차단하는 모든 것을 포함한다.
본 발명에서 "증폭"이란 해당 유전자의 일부 염기를 변이, 치환, 또는 삭제시키거나, 일부 염기를 도입시키거나, 또는 동일한 효소를 코딩하는 다른 미생물 유래의 유전자를 도입시켜 대응하는 효소의 활성을 증가시키는 것을 포괄하는 개념이다.
본 발명에서는 재조합 미생물에서 부탄올을 생성하기 위하여, Clostridium acetobutylicum의 부탄올 생성 pathway를 모델로 이용하였다 (FIG. 1). FIG. 1의 pathway와 대장균의 pathway를 고려할 경우, 부탄올 생성에는 thiolase (THL), 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD), crotonase (CRO), butyryl-CoA dehydrogenase (BCD), butyraldehyde dehydrogenase (AAD) 및 butanol dehydrogenase (BDH) 등의 효소가 관여하는 것으로 추정할 수 있다.
상기 THL을 코딩하는 유전자로는 Clostridium 속 유래 thl이 대장균에서 효과적이라는 것은 이미 규명된 바 있다 (Bermejo, L.L. et al., Appl. Environ. Microbiol., 64:1079, 1998). 아울러 Clostridium 속 유래 THL을 코딩하는 유전자는 thl 이외에 thiL이 알려져 있다 (Nolling, J. et al., J. Bacteriol., 183:4823, 2001). THL은 acetyl-CoA를 acetoacetyl-CoA로 전환한다. 본 발명의 실 시예서는 Ralstonia 속 유래 phaA 또는 대장균 유래 atoB를 thl 또는 thiL 대신 사용할 수 있다는 것을 규명하였다. 따라서, 다른 미생물 유래의 THL을 코딩하는 유전자라 할지라도, 도입된 숙주세포에서 발현되어 THL 활성을 나타내는 한 제한 없이 사용할 수 있다.
아울러, Bennett 등은 acetoacetyl-CoA로부터 butyryl-CoA를 생성하는데 필요한 효소들 중 BCD를 제외한 BHBD 및 CRO가 대장균에서 발현된다는 것을 제시하였다 (Boynton, Z.L. et al., J. Bacteriol., 178:3015, 1996). 따라서, 본 발명에서는 BHBD를 코딩하는 유전자 및 CRO를 코딩하는 유전자로 각각 Clostridium 속 유래 hbd 및 crt를 도입하였다. 그러나, 이들 유전자 역시 다른 미생물 유래라 하더라도, 도입된 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다. 본 발명의 실시예에서는 Clostridium 속 유래 hbd 및 crt를 각각 대장균 유래 paaH (3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 paaFG (enoyl-CoA hydratase를 코딩하는 유전자)로 대체한 경우에도 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다.
다만, 상기 논문에 의하면, 상기 BCD 또는 그 co-factors (electron transfer flavoproteins putatively coded by the Clostridium acetobutylicum genes (etfB and etfA)) 들이 대장균에서 잘 발현되지 않아서 기능이 없거나, 안정성에 문제가 있어서 in vitro assay에서 활성이 감지되지 않는다고 보고한 바 있다.
본 발명에서는 Pseudomonas aeruginosa 또는 Pseudomonas putida 유래 bcd 또는 Bacillus subtilis 유래 ydbM를 도입시킴으로써 butyryl-CoA dehydrogenase 저발현 문제를 해결하였다. 결국, BCD를 코딩하는 유전자 역시 다른 미생물 유래라 하더라도 도입되는 숙주세포에서 발현되어 BCD 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
또 다른 방법으로, Clostridium acetobutylicum 유래 bcd를 도입시킬 경우에는 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL)를 함께 도입시킴으로써 butyryl-CoA dehydrogenase 저발현 문제를 해결하였다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 Clostridium acetobutylicum 유래 bcd와 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL)를 동시에 도입시킨 경우에 부탄올 생성능이 증가하는 것을 확인하였다. 또한, Clostridium acetobutylicum 유래 bcd와 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL) 이외에 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 (etfAB)를 추가로 도입시킨 경우에 부탄올 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
본 발명자들은 선행연구에서, BDH를 코딩하는 유전자의 도입이 없더라도 butyryl-CoA를 부탄올로 전환시키는 효소 (AdhE)를 코딩하는 유전자를 가지고 있는 미생물 (예: 대장균)을 숙주세포로 사용할 경우에는 butyryl-CoA를 중간체로 하여 부탄올이 생성되는 것을 확인한 바 있다. 본 발명에서는 butyryl-CoA로부터 부탄올로의 전환 수율을 높이기 위하여, BDH를 코딩하는 유전자로 Clostridium 속 유래 bdhAB를 도입하였다. Clostridium 속 유래 bdhAB 이외에 다른 미생물 유래의 BDH를 코딩하는 유전자라 하더라도 도입된 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다.
본 발명에서는 또한, butyryl-CoA로부터 부탄올로의 전환 수율을 높이기 위하여, AAD를 코딩하는 유전자로 Clostridium 속 유래 adhE를 도입하였다. Clostridium 속 유래 adhE 이외에 다른 미생물 유래의 AAD를 코딩하는 유전자라 하더라도 도입된 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 제한이 없을 것이다. 한편, 대장균 유래 mhpF 유전자가 acetaldehyde dehydrogenase를 코딩한다는 것은 이미 알려져 있다 (Ferrandez, A. et al., J. Bacteriol., 179:2573, 1997). 본 발명의 실시예에서는 Clostridium 속 유래 adhE를 대장균 유래 mhpF (acetaldehyde dehydrogenase 또는 butyraldehyde를 코딩하는 유전자)로 대체한 경우에도 부탄올이 생성되는 것을 확인하였다.
한편, FIG. 1의 pathway와 대장균의 pathway를 고려할 경우, 부탄올 생성을 높이기 위해서는 부탄올 생합성경로와 경쟁관계에 있는 pathway인 아세테이트, 에탄올 및 락테이트의 생합성 경로를 차단하는 것이 유리할 것으로 파악하고, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 유전자들의 도입 이전에 숙주 미생물에서 이들 생합성 경로를 차단하였다.
즉, 본 발명에서는 우선, 부탄올 생성능이 우수한 변이 미생물을 제작하기 위하여, 대장균 야생균주 W3110에서 lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및/또는 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 약화 또는 결실시켰다.
본 발명에서는 lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 lahA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 pta (phosphoacetyltransferase를 코딩하는 유전자)를, ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 adh (alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 결실시켰다. 상기 유전자들 이외에도 이들 생합성 경로를 차단할 수만 있다면 다른 유전자를 결실시키는 것도 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.
다음으로, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lacI (lac operon repressor를 코딩하는 유전자) 유전자를 추가로 결실시켰다.
구체적으로는 상기 세 가지 유전자 (lahA, pta 및 adh)와 lacI가 결실된 대장균 WLLPA 균주와 ldhA와 lacI가 결실된 대장균 WLL 균주를 제작하고, 여기에 부탄올 생합성에 관여하는 THL을 코딩하는 유전자, BHBD를 코딩하는 유전자, CRO를 코딩하는 유전자, BCD를 코딩하는 유전자, BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 및 BDH를 코딩하는 유전자를 모두 도입하여 부탄올 생성능이 획기적으로 증가한 재조합 변이 미생물을 제작하였다.
상기 부탄올 생합성에 관여하는 THL을 코딩하는 유전자, BHBD를 코딩하는 유전자, CRO를 코딩하는 유전자, BCD를 코딩하는 유전자, BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자, AAD를 코딩하는 유전자 및 BDH를 코딩하는 유전자는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하였다. 상기 strong promoter에는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
최종적으로, 본 발명에서는 lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유 전자, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있는 대장균에 thiolase (THL)를 코딩하는 유전자, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD)를 코딩하는 유전자, crotonase (CRO)를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA dehydrogenase (BCD)를 코딩하는 유전자, butyraldehyde dehydrogenase (AAD)를 코딩하는 유전자, butanol dehydrogenase (BDH)를 코딩하는 유전자, chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL) 및 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 (etfAB)를 도입시켜 재조합 변이 대장균을 제작하고, 상기 재조합 변이 대장균에서 부탄올 생성능이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 대장균 W3110을 숙주 미생물로 이용하였으나, 다른 대장균이나, 박테리아, 효모 및 곰팡이를 사용하여 동일한 결실 대상 유전자를 결실시키고, 부탄올 생합성에 관여하는 효소의 유전자를 도입시킨 다음, 이를 이용하여 부탄올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 도입 대상 유전자로 특정 균주 유래인 것만을 예시 하였으나, 도입되는 숙주세포에서 발현되어 동일한 활성을 나타내는 한 그 제한이 없다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.
아울러, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 여러문헌에 보고된 바와 같이, 유청(whey), CSL(corn steep liquor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것 (Lee et al., Bioprocess Biosyst. Eng., 26:63, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 58:663, 2002; Lee et al., Biotechnol. Lett., 25:111, 2003; Lee et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 54:23, 2000; Lee et al., Biotechnol. Bioeng., 72:41, 2001)도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 부탄올 고생성 재조합 변이 미생물의 제작
1-1: lacI 유전자의 결실
서열번호 1 및 2의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법(Warner et al., PNAS, 6:97(12):6640, 2000)에 의해, 대장균 W3110 (ATTC 39936)에서 lac operon의 repressor를 코딩하는 유전자로 lactose 분해를 담당하는 lac operon의 전사 억제 기능을 갖는 lacI 유전자를 결실시키고, 항생제 내성을 제거하였다.
[서열번호 1] lacI_1stup: 5'-gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagta
tgccggtgtctcttagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 2] lacI_1stdo: 5'-tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtg
ccagctgcattaatgcacttaacggctgacatggg-3'
1-2: WLLPA 균주 및 WLL 균주 제작
상기 1-1에서 수득된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110에서 ldhA, pta 및 adhE 유전자를 추가로 결실시키기 위하여, 서열번호 3 내지 8의 프라이머들을 이용한 one step inactivation 방법에 의해 ldhA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자), pta (phosphotransacetylase를 코딩하는 유전자) 및 adhE (alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 유전자를 결실시켰다.
즉, 상기 1-1에서 제작된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에서 상기 유전자 3종의 결실을 유도하여 WLLPA 균주를 제작하였다.
또한, 상기 1-1에서 제작된 lacI 유전자가 결실된 대장균 W3110 컴피턴트 세포에서 서열번호 3 및 4의 프라이머를 이용한 one step inactivation 방법에 의해 ldhA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 유전자를 결실시켜 WLL 균주를 제작하였다.
[서열번호 3] ldhA1stup: 5'-atgaaactcgccgtttatagcacaaaacagtacgaca
agaagtacctgcagattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 4] ldhA1stdo: 5'-ttaaaccagttcgttcgggcaggtttcgcctttttcc
agattgcttaagtcacttaacggctgacatggga-3'
[서열번호 5] pta1stup: 5'-gtgtcccgtattattatgctgatccctaccggaaccag
cgtcggtctgacgattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 6] pta1stdo: 5'-ttactgctgctgtgcagactgaatcgcagtcagcgcga
tggtgtagacgaacttaacggctgacatggg-3'
[서열번호 7] adhE1stup: 5'-cgtgaatatgccagtttcactcaagagcaagtagaca
aaatcttccgcgcgattgcagcattacacgtcttg-3'
[서열번호 8] adhE1stdo: 5'-taatcacgaccgtagtaggtatccagcagaatctgttt
cagctcggagatcacttaacggctgacatggg-3'
1-3: pKKhbdadhEthiL (pKKHAT) 벡터의 제작
Clostridium acetobutylicum (KCTC 1724)의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 9 내지 14의 프라이머들을 이용하여 부탄올 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 hbd (3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자), adhE (butyraldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자: 상기 1-2의 adhE (alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)와 유전자의 표기는 같으나 그 기능은 다름) 및 thiL (thiolase를 코딩하는 유전자)를 증폭하고, 순차적으로 pKK223-3 발현벡터 (Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKhbdadhEthiL (pKKHAT) 벡터를 수득하였다 (FIG. 2).
[서열번호 9] hbdf: 5'-acgcgaattcatgaaaaaggtatgtgttat-3'
[서열번호 10] hbdr: 5'-gcgtctgcaggagctcctgtctctagaatttgataatgggg
attctt-3'
[서열번호 11] adhEf: 5'-acgctctagatataaggcatcaaagtgtgt-3'
[서열번호 12] adhEr: 5'-gcgtgagctccatgaagctaatataatgaa-3'
[서열번호 13] thiLf: 5'-acgcgagctctatagaattggtaaggatat-3'
[서열번호 14] thiLr: 5'-gcgtgagctcattgaacctccttaataact-3'
1-4: pKKhbdadhEatoB (pKKHAA) 벡터의 제작
Escherichia coli W3110의 atoB (acetyl-CoA acetyltransferase를 코딩하는 유전자)를 pKKhbdadhE 벡터 (FIG. 2)에 클로닝하기 위하여, Escherichia coli W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 15 및 16의 프라이머를 사용한 PCR (95℃에서 20초간 변성, 55℃에서 30초간 서냉복원, 72℃에서 1분 30초간 신장을 한 주기로 하여, 총 24 주기를 반복)을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(atoB 유전자)을 SacI으로 절단하고, 동일 효소(SacI)로 절단한 pKKhbdadhE 벡터에 삽입하여 pKKhbdadhEatoB (pKKHAA) 벡터를 수득하였다 (FIG. 3).
[서열번호 15] atof: 5'-atacgagctctacggcgagcaatggatgaa-3
[서열번호 16] ator: 5'-gtacgagctcgattaattcaaccgttcaat-3
1-5: pKKhbdadhEphaA (pKKHAP) 벡터의 제작
Ralstonia eutropha (KCTC 1006)의 phaA (thiolase를 코딩하는 유전자)를 pKKhbdadhE 벡터에 클로닝하기 위하여, Ralstonia eutropha의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 17 및 18의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(phaA 유전자)을 SacI으로 절단하고, 동일 효소(SacI)로 절단한 pKKhbdadhE 벡터에 삽입하여 pKKhbdadhEphaA (pKKHAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 4).
[서열번호 17] phaAf: 5'-agtcgagctcaggaaacagatgactgacgttgtcatcgt-3'
[서열번호 18] phaAr: 5'-atgcgagctcttatttgcgctcgactgcca-3'
1-6: pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP) 벡터의 제작
Bacillus subtilis (KCTC 1022)의 ydbM (hypothetical protein을 코딩하는 유전자)를 pKKhbdadhE 벡터에 클로닝하기 위하여, Bacillus subtilis의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 19 및 20의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (ydbM 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdadhEphaA 벡터에 삽입하여 pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 5).
[서열번호 19] ydbMf: 5'-agcttctagagatgggttacctgacatata-3'
[서열번호 20] ydbMr: 5'-agtctctagattatgactcaaacgcttcag-3'
1-7: pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP) 벡터의 제작
Pseudomonas aeruginosa PA01 (KCTC 1637)의 bcd (butyryl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자)를 cloning 하기 위하여, Pseudomonas aeruginosa PA01의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 21 및 22의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(bcd 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdadhEphaA (pKKHAP)에 삽입하여 pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 6).
[서열번호 21] bcdPA01f: 5'-agcttctagaactgctccttggacagcgcc-3'
[서열번호 22] bcdPA01r: 5'-agtctctagaggcaggcaggatcagaacca-3'
1-8: pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP) 벡터의 제작
Pseudomonas Putida KT2440 (KCTC 1134)의 bcd (butyryl-CoA dehydrogenase 를 코딩하는 유전자)를 cloning 하기 위하여, Pseudomonas putida KT2440의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 23 및 24의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (bcd 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdadhEphaA 벡터에 삽입하여 pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 7).
[서열번호 23] bcdKT2440f: 5'-agcttctagaactgttccttggacagcgcc-3'
[서열번호 24] bcdKT2440r: 5'-agtctctagaggcaggcaggatcagaacca-3'
1-9: pKKhbdgroESLadhEphaA (pKKHGAP) 벡터의 제작
상기 Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 25 및 26의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (groESL 유전자)을 XbaI으로 절단하고, 동일 효소(XbaI)로 절단한 pKKhbdadhEphaA 벡터에 삽입하여 pKKhbdgroESLadhEphaA (pKKHGAP) 벡터를 수득하였다 (FIG. 8).
[서열번호 25] groESLf: 5'-agcttctagactcaagattaacgagtgcta-3'
[서열번호 26] groESLr: 5'-tagctctagattagtacattccgcccattc-3'
1-10: pTrc184bcdbdhABcrt 벡터의 제작
Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 27 및 28의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (bcd 유전자)을 NcoI 및 KpnI로 절단하고, pTrc99A 발현벡터(Amersham Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pTrc99Abcd를 제작하였다. 상기 pTrc99Abcd 벡터 를 BspHI 및 EcoRV로 절단한 다음, 동일 효소(BspHI 및 EcoRV)로 절단한 pACYC184(New England Biolabs)에 삽입하여 bcd 유전자를 발현시키기 위한 발현벡터인 pTrc184bcd를 제작하였다 (FIG. 9).
[서열번호 27] bcdf: 5'-agcgccatggattttaatttaacaag-3'
[서열번호 28] bcdr: 5'-agtcggtacccctccttaaattatctaaaa-3'
pTrc184bcdbdhAB 벡터를 제작하기 위하여, Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 29 및 30의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, bdhAB 유전자의 PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(bdhAB 유전자)을 BamHI 및 PstI로 절단한 다음, 동일 효소(BamHI 및 PstI)로 절단한 pTrc184bcd 절편에 삽입하여 bcd 유전자와 bdhAB 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pTrc184bcdbdhAB (pTrc184BB)를 제작하였다.
[서열번호 29] bdhABf: 5'-acgcggatccgtagtttgcatgaaatttcg-3'
[서열번호 30] bdhABr: 5'-agtcctgcagctatcgagctctataatggctacgccca
aac-3'
pTrc184bcdbdhABcrt 벡터를 제작하기 위하여, Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 31 및 32의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, crt 유전자의 PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편(crt 유전자)을 SacI 및 PstI로 절단한 다음, 동일 효소(SacI 및 PstI)로 절단한 pTrc184bcdbdhAB 절편에 삽입하여 bcd 유전자와 bdhAB 유전자 및 crt 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pTrc184bcdbdhABcrt (pTrc184BBC)를 제작하였다 (FIG. 9).
[서열번호 31] crtf: 5'-actcgagctcaaaagccgagattagtacgg-3'
[서열번호 32] crtr: 5'-gcgtctgcagcctatctatttttgaagcct-3'
1-11: 부탄올 생성 미생물의 제작
상기 1-1 및 1-2에서 제작된 lacI, ldhA, pta 및 adhE 유전자가 결실된 대장균 W3110 (WLLPA)과 lacI 및 ldhA 유전자가 결실된 대장균 W3110 (WLL)에 상기 1-3 내지 1-9에서 제작된 pKKhbdadhEthiL (pKKHAT), pKKhbdadhEatoB (pKKHAA), pKKhbdydbMadhEphaA (pKKHYAP), pKKhbdadhEphaA (pKKHAP), pKKhbdbcdPA01adhEphaA (pKKHPAP), pKKhbdbcdKT2440adhEphaA (pKKHKAP) 및 pKKhbdgroESLadhEphaA (pKKHGAP)로 구성된 군에서 선택된 벡터와 상기 1-10에서 제작된 pTrc184bcdbdhABcrt (pTrc184BBC) 벡터를 도입하여 부탄올 생성 재조합 변이 미생물 (WLLPA+pKKHPAP+pTrc184BBC, WLL+pKKHAT+pTrc184BBC, WLL+pKKHAA+pTrc184BBC, WLL+pKKHAP+pTrc184BBC, WLL+pKKHYAP+pTrc184BBC, WLL+pKKHPAP+pTrc184BBC, WLL+pKKHKAP+pTrc184BBC, 및 WLL+pKKHGAP+pTrc184BBC)을 제작하였다.
1-12: 부탄올의 생성능 측정
상기 1-11에서 제작된 부탄올 생성 미생물들을 엠피실린(ampicillin) 및 클로람페니콜(chloramphenicol)이 각각 50㎍/㎖ 및 30㎍/㎖ 첨가된 LB 평판배지에서 선별하였다. WLLPA+pKKHPAP+pTrc184BBC 균주 선별시에는 카나마이신(kanamycin) 30㎍/㎖을 추가로 첨가하였다. 상기 형질전환 균주를 10㎖ LB 배지에 접종하여 37℃에서 12시간동안 전배양을 수행하였다. 그 후, 멸균 후 80℃ 이상에서 꺼낸 100ml LB를 함유한 250mL 플라스크에 glucose(5g/L)를 첨가하고 질소가스를 채운 후 혐기 챔버에서 실온까지 식힌 후 상기 전배양액 2㎖을 접종하여, 37℃에서 10시간 배양하였다. 그 후, 증류수 1리터당 20g glucose, 2g KH2PO4, 15g (NH4)2SO4·7H2O, 20mg MnSO4·5H2O, 2g MgSO4·7H2O, 3g yeast extract, 5㎖ trace metal solution (증류수 1리터당 10g FeSO4·7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4·7H2O, 0.5g MnSO4·4H2O, 1g CuSO4·5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.23g Na2B4O7·10H2O, 35％ HCl 10㎖ 함유)의 성분으로 구성된 배지 2.0 리터를 함유한 5.0 리터 발효기(LiFlus GX, Biotron Inc., Korea)를 멸균 후 80℃ 이상에서부터 질소를 0.5vvm으로 10시간 공급하면서 실온까지 온도를 낮추었다. 상기 발효기에 상기 전배양액을 접종하여, 37℃, 200rpm에서 배양하였다. pH는 25％(v/v) NH4OH의 automatic feeding에 의해 6.8로 유지하였고, 배양 중에는 질소를 0.2vvm(air volume/working volume/minute)으로 공급하였다.
상기 배지중의 glucose를 glucose analyzer(STAT, Yellow Springs Instrument, Yellow Springs, Ohio, USA)로 측정하여 glucose가 모두 소모되었을 때 상기 배지를 채취하고, 이로부터 생성되는 부탄올 농도를 packed column (Supelco CarbopackTM B AW/6.6% PEG 20M, 2 m x 2 mm ID, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 gas chromatography (Agillent 6890N GC System, Agilent Technologies Inc., CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 표 1에 나타난 바와 같이, 야생형 대장균 W3110에서는 부탄올이 생 성되지 않은 반면, 본 발명에 따른 재조합 변이 미생물에서는 부탄올이 생성되었다. 또한, thiolase 효소를 코딩하는 유전자들 (thiL, PhaA, atoB) 모두 활성을 갖는 것을 알 수 있었으며, 특히, Pseudomonas aeruginosa 및 Pseudomonas putida의 butyryl-CoA dehydrogenase가 Clostridium acetobutylicum의 그것보다 활성이 더 우수하다는 것을 부탄올 생성능으로 확인할 수 있었다.
표 1
또한 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL)를 Clostridium acetobutylicum 유래 bcd와 함께 도입시킨 경우 (WLL+pKKHGAP+pTrc184BBC), 부탄올 생성능이 증가하는 것을 확인하였다. 즉, Clostridium acetobutylicum 유래 bcd와 groESL을 함께 도입시킨 경우에는 부탄올 생성능이 10배 이상 증가한 것으로 보아 chaperone 단백질이 butyryl-CoA dehydrogenase의 활성을 크게 증가시킨다는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명자들의 선행연구에서는 lacI 만이 결실된 대장균에 부탄올 생 합성에 관여하는 유전자들을 도입한 경우, 부탄올이 생성되는 것을 확인한 바 있다. Table 1에서는 lacI 이외에 ldhA 유전자를 결실시킨 경우, 부탄올 생성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 아울러, pta 및 adhE 유전자를 추가로 결실시킨 경우, 부탄올 생성능이 더욱 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과로부터, 부탄올 생합성 경로와 경쟁관계에 있는 lactate 생합성 경로, acetate 생합성 경로 및/또는 ethanol 생합성 경로의 차단이 부탄올의 생성에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2: 대장균 유래 유전자와 C. acetobutylicum 유래 유전자의 혼합 도입에 의한 부탄올 제조
본 실시예에서는 부탄올 생합성 경로에 관여하는 C. acetobutylicum 유래 유전자 중 일부를 대장균 유래 유전자로 대체한 경우의 부탄올 생성능을 확인하였다 (FIG. 10). 즉, 본 실시예에서는 Clostridium 속 유래 adhE, crt, hbd 및 thiL을 각각 대장균 유래 유전자로 대체하여 부탄올 생성능을 확인하였다.
2-1: pKKmhpFpaaFGHatoB 벡터의 제작
E. coli W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 33 내지 38의 프라이머들을 이용한 PCR을 수행하여 부탄올 생합성 경로에 필수적인 유전자들, 즉 mhpF (acetaldehyde dehydrogenase를 코딩하는 유전자), paaFG (enoyl-CoA hydratase를 코딩하는 유전자), paaH (3-hydroxy-acyl-CoA dehydrogenase를 코딩하는 유전자) 및 atoB (acetyl-CoA acetyltransferase를 코딩하는 유전자) 등을 순차 적으로 pKK223-3 발현벡터(Pharmacia Biotech)에 클로닝하여 pKKmhpFpaaFGHatoB (pKKMPA) 벡터를 제작하였다 (FIG. 11).
[서열번호 33] mhpFf: 5'-atgcgaattcatgagtaagcgtaaagtcgc-3'
[서열번호 34] mhpFr: 5'-tatcctgcaggagctctctagagctagcttaccgttcatg
ccgcttct-3'
[서열번호 35] paaFGHf: 5'-atacgctagcatgaactggccgcaggttat-3'
[서열번호 36] paaFGHr: 5'-tatcgagctcgccaggccttatgactcata-3'
[서열번호 37] atoBf: 5'-atacgagctctgcatcactgccctgctctt-3'
[서열번호 38] atoBr: 5'-tgtcgagctccgctatcgggtgtttttatt-3'
2-2: pTrc184bcdetfABbdhABgroESL 벡터의 제작
Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 39 및 40의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하여, PCR 절편을 수득하였다. 상기 증폭된 PCR 절편 (etfAB 유전자)을 KpnI 및 BamHI로 절단한 다음, 동일 효소(KpnI 및 BamHI)로 절단한 pTrc184bcdbdhAB 절편에 삽입하여 bcd 유전자와 bdhAB 유전자 및 etfAB 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pTrc184bcdetfABbdhAB (pTrc184BEB)를 제작하였다.
Clostridium acetobutylicum의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 41 및 42의 프라이머를 사용한 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 절편을 SacI 및 PstI로 절단한 다음, 동일 효소(SacI및 PstI)로 절단한 pTrc184bcdetfABbdhAB 절편에 삽입하여 bcd 유전자와 bdhAB 유전자, etfAB 유전자 및 groESL 유전자를 동시에 함유하는 재조합 벡터 pTrc184bcdetfABbdhABgroESL (pTrc184BEBG)를 제작하였다 (FIG. 12).
[서열번호 39] etfABf: 5'-atacggtaccaaatgtagcaatggatgtaa-3'
[서열번호 40] etfABr: 5'-gtacggatcccttaattattagcagcttta-3'
[서열번호 41] groESL1: 5'-atgcgagctcaaaaagcgagaaaaaccata-3'
[서열번호 42] groESL2: 5'-gtacctgcagattagtacattccgcccatt-3'
2-3: 부탄올 생성 미생물의 제작
실시예 1-1 및 1-2에서 제작된 lacI, ldhA, pta 및 adhE 유전자가 결실된 대장균 W3110 (WLLPA)과 lacI 및 ldhA 유전자가 결실된 대장균 W3110 (WLL)에 상기 2-1에서 제작된 pKKMPA와 실시예 1-10에서 제작된 pTrc184bcdbdhAB (pTrc184BB) 또는 상기 2-2에서 제작된 pTrc184BEBG 벡터를 도입하여 부탄올 생성 재조합 변이 미생물 (WLL+pKKMPA+pTrc184BB, WLLPA+pKKMPA+pTrc184BB, WLL+pKKMPA+pTrc184BEBG 및 WLLPA+pKKMPA+pTrc184BEBG)를 제작하였다.
2-4 부탄올의 생성능 측정
상기 2-3에서 제작된 부탄올 생성 미생물들을 실시예 1-13과 동일한 방법으로 배양하고 동일한 조건에서 부탄올을 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, C. acetobutylicum의 부탄올 생합성 pathway만을 이용했을 때 보다, 해당 효소를 코딩한다고 예상되는 대장균 유래의 유전자들 (adhE mhpF, crt paaFG, hbd paaH, thiL atoB)과 C. acetobutylicum 유래의 bcd 및 bdhAB 유전자를 혼합하여 사용한 경우에 부탄올 생성능이 향상된 것을 알 수 있었다. 즉, 대장균에서 부탄올 생산을 위해 필수적인 효소들 중 4개 (butyraldehyde dehydrogenase, crotonase, BHBD 및 THL)는 각각, 대장균 유래의 mhpF, paaFG, paaH 및 atoB 유전자에 의해 코딩되는 효소들로 대체 가능하며, 오히려 Clostridium acetobutylicum의 그것보다 활성이 더 우수하다는 것을 부탄올 생성능으로 확인할 수 있었다. 또한, 대장균에서 활성에 문제가 있다고 알려진 BCD 효소의 활성이 co-factors를 코딩하는 유전자(etfAB)와 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자(groESL)의 발현으로 인해 현저히 회복되는 것을 부탄올 생성능의 획기적인 증가로 확인할 수 있었다.
표 2
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 butyryl-CoA dehydrogenase의 활성을 증가시키는 방법과 특정 유전자의 결실로 인한 대사회로 재구성 및 필요 유전자의 증폭을 통한 대사공학적 방법에 의해 부탄올의 생성능이 획기적으로 증가된 재조합 변이 미생물을 제공하는 효과가 있다. 특히, 본 발명에 따른 재조합 변이 대장균은 기존의 Clostridium acetobutylicum과 달리 성장이 용이하고 추가 대사흐름 조작으로 인한 균주 개량의 가능성이 크므로 부탄올의 산업적 생성 미생물로 유용하다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록
전자파일 첨부하였음.
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<151> 2007-02-02
<160> 42
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacI_1stup primer
<400> 1
gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta gattgcagca 60
ttacacgtct tg 72
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> lacI_1stdo primer
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tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg cacttaacgg 60
ctgacatggg 70
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<223> ldhA1stup primer
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ldhA1stdo primer
<400> 4
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttccaga ttgcttaagt cacttaacgg 60
ctgacatggg a 71
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<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pta1stup primer
<400> 5
gtgtcccgta ttattatgct gatccctacc ggaaccagcg tcggtctgac gattgcagca 60
ttacacgtct tg 72
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pta1stdo primer
<400> 6
ttactgctgc tgtgcagact gaatcgcagt cagcgcgatg gtgtagacga acttaacggc 60
tgacatggg 69
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<220>
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cgtgaatatg ccagtttcac tcaagagcaa gtagacaaaa tcttccgcgc gattgcagca 60
ttacacgtct tg 72
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taatcacgac cgtagtaggt atccagcaga atctgtttca gctcggagat cacttaacgg 60
ctgacatggg 70
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acgcgaattc atgaaaaagg tatgtgttat 30
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> adhEf primer
<400> 11
acgctctaga tataaggcat caaagtgtgt 30
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> atof primer
<400> 15
atacgagctc tacggcgagc aatggatgaa 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ator primer
<400> 16
gtacgagctc gattaattca accgttcaat 30
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phaAf primer
<400> 17
agtcgagctc aggaaacaga tgactgacgt tgtcatcgt 39
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> phaAr primer
<400> 18
atgcgagctc ttatttgcgc tcgactgcca 30
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ydbMf primer
<400> 19
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ydbMr primer
<400> 20
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<211> 30
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<223> bcdPA01f primer
<400> 21
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<210> 22
<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bcdPA01r primer
<400> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bcdKT2440f primer
<400> 23
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bcdKT2440r primer
<400> 24
agtctctaga ggcaggcagg atcagaacca 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> groESLf primer
<400> 25
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> groESLr primer
<400> 26
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<211> 26
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bcdf primer
<400> 27
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> bcdr primer
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<220>
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<220>
<223> crtf primer
<400> 31
actcgagctc aaaagccgag attagtacgg 30
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<211> 30
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtr primer
<400> 32
gcgtctgcag cctatctatt tttgaagcct 30
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mhpFf primer
<400> 33
atgcgaattc atgagtaagc gtaaagtcgc 30
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<211> 48
<212> DNA
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<220>
<223> mhpFr primer
<400> 34
tatcctgcag gagctctcta gagctagctt accgttcatg ccgcttct 48
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> paaFGHf primer
<400> 35
atacgctagc atgaactggc cgcaggttat 30
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> paaFGHr primer
<400> 36
tatcgagctc gccaggcctt atgactcata 30
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<211> 30
<212> DNA
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<220>
<223> atoBf primer
<400> 37
atacgagctc tgcatcactg ccctgctctt 30
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<211> 30
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<220>
<223> atoBr primer
<400> 38
tgtcgagctc cgctatcggg tgtttttatt 30
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> etfABf primer
<400> 39
atacggtacc aaatgtagca atggatgtaa 30
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> etfABr primer
<400> 40
gtacggatcc cttaattatt agcagcttta 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> groESL1 primer
<400> 41
atgcgagctc aaaaagcgag aaaaaccata 30
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> groESL2 primer
<400> 42
gtacctgcag attagtacat tccgcccatt 30
Claims (45)
- 대장균에서, lactate 생합성에 관여하는 효소인 lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자(ldhA), acetate 생합성에 관여하는 효소인 phosphoacetyltransferase를 코딩하는 유전자(pta) 및 ethanol 생합성에 관여하는 효소인 alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자(adhE)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 약화 또는 결실시킨 다음, thiolase (THL), 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD), crotonase (CRO), butyryl-CoA dehydrogenase (BCD), butyraldehyde dehydrogenase (AAD) 및 butanol dehydrogenase (BDH)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lacI (lac operon repressor를 코딩하는 유전자) 유전자를 추가로 결실시키는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ldhA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 pta (phosphoacetyltransferase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 adhE (alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 THL을 코딩하는 유전자는 thl, thiL, phaA, 및 atoB로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 BCD를 코딩하는 유전자는 Pseudomonas 속 유래 bcd 또는 Bacillus 속 유래 ydbM인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 BCD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 bcd이고, chaperone 단백질을 코딩하는 유전자를 추가로 도입하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제11항에 있어서, BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 (etfAB)를 추가로 도입하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제11항에 있어서, 상기 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자는 groESL인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 BHBD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 hbd 또는 대장균 유래 paaH인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 CRO를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 crt 또는 대장균 유래 paaFG인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 AAD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adhE 또는 대장균 유래 mhpF인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제17항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제18항에 있어서, 상기 strong promoter를 함유하는 발현벡터는 thiolase (THL), 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD), crotonase (CRO), butyryl-CoA dehydrogenase (BCD), butyraldehyde dehydrogenase (AAD) 및 butanol dehydrogenase (BDH)로 구성된 군에서 선택되는 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제19항에 있어서, 상기 발현벡터는 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 및/또는 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- 제19항에 있어서, 상기 발현벡터는 (a) hbd 유전자, adhE 유전자 및 thiL 유전자를 함유하는 도 2에 기재된 pKKHAT; (b) hbd 유전자, adhE 유전자 및 atoB 유전자를 함유하는 도 3에 기재된 pKKHAA; (c) hbd 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 4에 기재된 pKKHAP; (d) hbd 유전자, ydbM 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 5에 기재된 pKKHYAP; (e) hbd 유전자, bcd 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 6에 기재된 pKKHPAP; (f) hbd 유전자, bcd 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 7에 기재된 pKKHKAP; (g) hbd 유전자, groESL 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 8에 기재된 pKKHGAP; 및 (h) mhpF 유전자, paaFGH 유전자 및 atoB 유전자를 함유하는 도 11에 기재된 pKKMPA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나와 (i) bcd 유전자 및 bdhAB 유전자를 함유하는 도 9에 기재된 pTrc184BB; (j) bcd 유전자, bdhAB 유전자 및 crt 유전자를 함유하는 도 9에 기재된 pTrc184BBC; 및 (k) bcd 유전자, etfAB 유전자, bdhAB 유전자 및 groESL 유전자를 함유하는 도 12에 기재된 pTrc184BEBG로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 하는 재조합 대장균의 제조방법.
- lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상이 약화 또는 결실되어 있고, thiolase (THL), 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD), crotonase (CRO), butyryl-CoA dehydrogenase (BCD), butyraldehyde dehydrogenase (AAD) 및 butanol dehydrogenase (BDH)로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현이 증가되도록 lacI (lac operon repressor를 코딩하는 유전자) 유전자가 추가로 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 삭제
- 삭제
- 제22항에 있어서, lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 ldhA (lactate dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 pta (phosphoacetyltransferase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 adhE (alcohol dehydrogenase를 코딩하는 유전자)인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 삭제
- 제22항에 있어서, 상기 THL을 코딩하는 유전자는 thl, thil, phaA, 및 atoB로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, 상기 BCD를 코딩하는 유전자는 Pseudomonas 속 유래 bcd 또는 Bacillus 속 유래 ydbM인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, BCD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 bcd이고, chaperone 단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제32항에 있어서, BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 (etfAB)가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제32항에 있어서, 상기 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자는 groESL인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, 상기 BHBD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 hbd 또는 대장균 유래 paaH인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, 상기 CRO를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 crt 또는 대장균 유래 paaFG인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, 상기 AAD를 코딩하는 유전자는 Clostridium 속 유래 adhE 또는 대장균 유래 mhpF인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제22항에 있어서, 상기 부탄올 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 strong promoter를 함유하는 발현벡터 형태로 도입하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제38항에 있어서, 상기 strong promoter는 trc promoter, tac promoter, T7 promoter, lac promoter 및 trp promoter로 구성된 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제39항에 있어서, 상기 strong promoter를 함유하는 발현벡터는 thiolase (THL), 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD), crotonase (CRO), butyryl-CoA dehydrogenase (BCD), butyraldehyde dehydrogenase (AAD) 및 butanol dehydrogenase (BDH)로 구성된 군에서 선택되는 효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- 제40항에 있어서, 상기 발현벡터는 chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 및/또는 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 재조합 대장균.
- 제40항에 있어서, 상기 상기 발현벡터는 (a) hbd 유전자, adhE 유전자 및 thiL 유전자를 함유하는 도 2에 기재된 pKKHAT; (b) hbd 유전자, adhE 유전자 및 atoB 유전자를 함유하는 도 3에 기재된 pKKHAA; (c) hbd 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 4에 기재된 pKKHAP; (d) hbd 유전자, ydbM 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 5에 기재된 pKKHYAP; (e) hbd 유전자, bcd 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 6에 기재된 pKKHPAP; (f) hbd 유전자, bcd 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 7에 기재된 pKKHKAP; (g) hbd 유전자, groESL 유전자, adhE 유전자 및 phaA 유전자를 함유하는 도 8에 기재된 pKKHGAP; 및 (h) mhpF 유전자, paaFGH 유전자 및 atoB 유전자를 함유하는 도 11에 기재된 pKKMPA로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나와 (i) bcd 유전자 및 bdhAB 유전자를 함유하는 도 9에 기재된 pTrc184BB; (j) bcd 유전자, bdhAB 유전자 및 crt 유전자를 함유하는 도 9에 기재된 pTrc184BBC; 및 (k) bcd 유전자, etfAB 유전자, bdhAB 유전자 및 groESL 유전자를 함유하는 도 12에 기재된 pTrc184BEBG로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
- lactate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자, acetate 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 ethanol 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 약화 또는 결실되어 있고, thiolase (THL)를 코딩하는 유전자, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase (BHBD)를 코딩하는 유전자, crotonase (CRO)를 코딩하는 유전자, butyryl-CoA dehydrogenase (BCD)를 코딩하는 유전자, butyraldehyde dehydrogenase (AAD)를 코딩하는 유전자, butanol dehydrogenase (BDH)를 코딩하는 유전자, chaperone 단백질을 코딩하는 유전자 (groESL) 및 BCD의 co-factors를 코딩하는 유전자 (etfAB)가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 부탄올 생성능을 가지는 재조합 대장균.
- 제22항 또는 제32항의 재조합 대장균을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
- 제43항의 재조합 대장균을 배양하여 부탄올을 생성시킨 다음, 배양액으로부터 부탄올을 회수하는 것을 특징으로 하는 부탄올의 제조방법.
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