KR100962185B1 - 다우노루비신 처리에 따른, 심혈관독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 - Google Patents

다우노루비신 처리에 따른, 심혈관독성 유발 약물 검색용마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 심혈관독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 심혈관독성 유발 약물인 다우노루비신(Daunorubicin)에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 심혈관독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다. 본 발명의 마커유전자는 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 심혈관독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링 및 판정하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 다우노루비신이 심혈관독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
다우노루비신, 마커유전자, 마이크로어레이, 심혈관독성

Description

다우노루비신 처리에 따른, 심혈관독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법{Marker genes based on daunorubicin treatment for screening of drug inducing cardio toxicity and screening method using thereof}
본 발명은 심혈관독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 검색 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 심혈관독성 유발 약물인 다우노루비신에 의해 유전자 발현이 증가 또는 감소하는 마커유전자 및 이를 이용한 다우노루비신의 심혈관독성 유발 약물의 검색 방법에 관한 것이다.
다우노루비신은 급성 백혈병의 치료제로 사용된다. 좁은 범위에서 사용되는 다우노루비신은 1960년 초반에 스트렙토마이시스퍼시셔스(Streptomyces peucetius)로부터 추출되어 상용화되었으며 항종양 항생제(Antitumor antibiotics)에 속한다.
다우노루비신의 부작용으로는 심근장애, 심전도이상, 빈맥, 심부전, 쇼크, 빈혈, 과립구감소, 혈소판감소, 출혈경향, 발열, 발진, 간 기능 수치상승, 신장장 애, 궤양성구내염, 식욕부진, 구역, 구토, 설사, 탈모, 권태감, 두통, 현기, 오한, 호흡곤란, 무월경, 무정자증, 및 계속 사용 시에는 후천적 내성이 발현하여 약물의 암 세포 내 유입을 감소시키고, 약물의 유출을 증가시켜 다수 약물에 저항성을 지니게 된다.
다우노루비신의 화학 구조적 작용기전으로 첫째는 DNA에 결합되어 두 이중사슬에 삽입된 다음 DNA(a-helix)구조를 파괴하고 핵산 합성의 주형(template)으로서 작용하지 못하게 하여 세포 독성을 일으킨다. 둘째는 토포아이소머라제Ⅱ(topoisomerase Ⅱ)의 작용 또는 유리기(free radical)형성으로 인하여 DNA절단 효과를 가지고 있다(Line Wergelasdl., et al., BioMed Cental 1-11, 2007). 이처럼 다우노루비신의 인체 내 부작용에도 불구하고, 인체에서의 위해도 평가 데이터가 충분하지 않고, 노출에 대한 검색 방법 역시 고전적인 방법에 국한되어 있어 보다 빠르고 정확한 위해성 평가 방법을 통해 인체에서의 부작용을 탐색할 수 있는 분자적 지표를 발굴하고 활용하여 다우노루비신을 이용한 치료 및 진단에 적절한 대책 및 관리를 수행하는 것이 중요한 과제라 하겠다.
포유류 6종, 미생물 292종 등 여러 종의 게놈(genome) 염기서열 프로젝트가 완성되어 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 보고되었다. 이렇게 얻어진 막대한 양의 데이터를 기본으로 유전자의 기능을 연구하기 위하여 게놈-와이드 익스프레션(genome-wide expression) 연구가 이루어지고 있다. 한번의 실험으로 수천 개의 유전자의 발현을 분석하기 위하여 DNA 마이크로어레 이(microarray) 분석을 수행한다(Schena, M., et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:10614-10619, 1996).
마이크로어레이는 cDNA(complementary DNA)나 20-25 염기쌍(base pair) 길이의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)들의 세트를 유리에 집적화한 것이다. cDNA 마이크로어레이는 학교 내의 연구실 또는 에질런트(Agilent), 제노믹 솔루션(Genomic Solutions) 등의 회사에서 칩 위에 cDNA 수집물을 기계적로 고정화 하거나 잉크젯(ink jetting) 방법을 이용하여 생산하고 있다(Sellheyer, K and Belbin, T.J., J. Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004). 올리고뉴클레오티드 마이크로어레이는 애피메트릭스(Affymetrix)사에서 사진 식각 공정(photolithography)을 이용하여 칩 위에서 직접 합성 방법에 의해 만들고 있으며, 에질런트(Agillent)사 등에는 합성된 올리고뉴클레오티드를 고정화하는 방법으로 생산하고 있다(Sellheyer, K. et. al., Am . Acad . Dermatol. 51: 681-692, 2004).
유전자의 발현을 분석을 위해서는 조직 등 시료에서 RNA를 얻어 DNA 마이크로어레이에 있는 올리고뉴클레오티드와 교잡반응을 수행한다. 얻어진 RNA는 형광이나 동위원소로 표지화하며, cDNA로 전환시킨다. 올리고 마이크로어레이는 주로 두개의 다른 형광(예: Cye3과 Cye5)으로 대조군과 실험군을 각각 표지화하여 같은 칩 상에서 동시에 교잡 반응을 수행한 후 광학적으로 이미지를 스캔하여 형광의 세기를 얻고 그 결과를 분석한다. 두개의 형광 세기의 비율에 따라 유전자의 발현 여부를 결정한다(Somasundaram, K., et al ., Genomics Proteomics I:1-10, 2002).
최근 DNA 마크로어레이 기술을 이용한 첨단 기법인 독성 유전체학(Toxicogenomics) 연구 등과 접목하여 대량(high throughput)으로 의약품 및 신의약 후보물질은 물론 모든 화학물질에 의한 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석이 가능해졌다. 이에 따라 특정 세포 내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 약물의 부작용과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 약물의 작용 및 부작용에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 독성 및 부작용을 유발하는 물질의 검색 및 진단이 가능하게 될 것이다.
이에 본 발명자들은 인간 유전자 4만 1천개가 집적된 올리고마이크로어레이를 이용하여 다우노루비신의 유전자 발현 프로파일을 인간 제대 혈관 내피 세포인 HUVEC 세포주에서 관찰 및 분석함으로써 다우노루비신에 의해 과발현 또는 저발현 되는 유전자를 발굴하고 확인함으로써 다우노루비신을 검출할 수 있는 마커유전자 및 이를 이용한 심혈관독성 유발 약물의 검색 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 심혈관독성 유발 약물인 다우노루비신에 의해 과발현 또는 저발현되는 마커유전자 및 상기 마커유전자를 이용한 심혈관독성 유발 약물 검색 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 심혈관독성 유발 약물인 다우노루비신에 의해 자극받은 인간 제대 혈관 내피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 심혈관독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 심혈관독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 마커유전자를 이용한 심혈관독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 심혈관독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
본 발명의 심혈관독성 유발 약물 검색용 마커유전자 및 이를 이용한 심혈관 독성 유발 약물의 검색 방법은 DNA 마이크로어레이 칩을 통하여 선별된 반응 유전자들을 마커유전자로 이용하여 새로운 심혈관독성의 위험성을 지닌 약물 또는 화학물질을 모니터링하거나 위해성을 판정하는데 유용하며, 다우노루비신에 의해 야기되는 심혈관독성 및 부작용을 일으키는 작용 기작을 규명하는 도구로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 심혈관독성 유발 약물인 다우노루비신에 의해 자극받은 인간 제대 혈관 내피 세포에서 발현 변화를 일으키는 것을 특징으로 하는 심혈관독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 제공한다.
상기 마커유전자는 아포토시스(apoptosis), 세포 주기(cell cycle), DNA 대사(DNA metabolism), 단백질 활성 조절 효소(regulation of protein kinase activity), 전이 활성 조절 효소(regulation of transferase activity), 알코올 대사(alcohol metabolism)에 관련된 유전자로 구성되어 있다.
본 발명은 하기의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 마커유전자를 제공한다:
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1) 4, 37kDa], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003258(Thymidine kinase 1, soluble), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003362(Uracil-DNA glycosylase), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003621[PTPRF interacting protein, binding protein 2(liprin beta 2)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_004111(Flap structure-specific endonuclease 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004153[Origin recognition complex, subunit 1-like(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005441[Chromatin assembly factor 1, subunit B(p60)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_005914[MCM4 minichromosome maintenance deficient 4(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006306[SMC1 structural maintenance of chromosomes 1-like 1(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006591[Polymerase(DNA-directed), delta 3, accessory subunit], 유전자 등록번호(Genebank) NM_006892[DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012117[Chromobox homolog 5(HP1 alpha homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012415[RAD54 homolog B(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_014321[Origin recognition complex, subunit 6 homolog-like(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_015895(Geminin, DNA replication inhibitor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016937[Polymerase(DNA directed), alpha].
1) 상기 마커유전자 중에서 심혈관독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 증가하는 마커유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호(Genebank) NM_078487[cyclin-dependent kinase inhibitor 2b(p15, inhibits cdk4)], 유전자 등록번호(Genebank) X06374(platelet-derived growth factor alpha polypeptide), 유전자 등록번호(Genebank) AK057315[testis specific a2 homolog(mouse)], 유전자 등록번호(Genebank) AK127033(dynamin 2), 유전자 등록번호(Genebank) AB209596(g protein pathway suppressor 1), 유전자 등록번호(Genebank) AB209095[cell division cycle 2-like 1(pitslre proteins)], 유전자 등록번호(Genebank) AF033122(sestrin 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_053056(cyclin d1),유전자 등록번호(Genebank) AY123223(Sestrin 2), 유전자 등록번호(Genebank) AK001361[Protein phosphatase 1, regulatory(inhibitor) subunit 15A], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003550[MAD1 mitotic arrest deficient-like 1(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_139314(Angiopoietin-like 4), 유전자 등록번호(Genebank) NM_078467[Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A(p21, Cip1)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003311(Pleckstrin homology-like domain, family A, member 2), 유전자 등록번호(Genebank) AK125880(Tumor protein p53 inducible nuclear protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) AB208907(Macrophage erythroblast attacher), 유전자 등록번 호(Genebank) AB096256[Unc-5 homolog B(C. elegans)], 유전자 등록번호(Genebank) AK092970[protein(peptidylprolyl cis/trans isomerase) nima-interacting 1], 유전자 등록번호(Genebank) CR623038(inhibitor of dna binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein), 유전자 등록번호(Genebank) NM_033238(promyelocytic leukemia), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003236(transforming growth factor, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) BC060797[par-6 partitioning defective 6 homolog gamma(c. elegans)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_078467[cyclin-dependent kinase inhibitor 1a(p21, cip1)], 유전자 등록번호(Genebank) AY123223(sestrin 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_004642(cdk2-associated protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_033030[bol, boule-like(drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_004359(cell division cycle 34), 유전자 등록번호(Genebank) CR612719(growth arrest and dna-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) BC064996[rho guanine nucleotide exchange factor(gef) 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_002838(protein tyrosine 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등록번호(Genebank) BX641114(annexin a4), 유전자 등록번호(Genebank) NM_002744(protein kinase c, zeta), 유전자 등록번호(Genebank) R612719(growth arrest and dna-damage-inducible, alpha), 유전자 등록번호(Genebank) BM557864(heat shock 27kda protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001024807[amyloid beta(a4) precursor-like protein 1], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003311(pleckstrin homology-like domain, family a, member 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_020418[poly(rc) binding protein 4], 유전자 등록번호(Genebank) AF332558(bcl2 binding component 3), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003811[tumor necrosis factor(ligand) superfamily, member 9], 유전자 등록번호(Genebank) AK125880(tumor protein p53 inducible nuclear protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) AK128462(cisplatin resistance related protein crr9p), 유전자 등록번호(Genebank) AK001361[protein phosphatase 1, regulatory(inhibitor) subunit 15a], 유전자 등록번호(Genebank) AB208907(macrophage erythroblast attacher), 유전자 등록번호(Genebank) AB209361[fas(tnf receptor superfamily, member 6)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_013258(pyd and card domain containing), 유전자 등록번호(Genebank) AB096256[unc-5 homolog b(c. elegans)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_004309[rho gdp dissociation inhibitor(gdi) alpha], 유전자 등록번호(Genebank) BC063507(heat shock 70kda protein 1a), 유전자 등록번호(Genebank) BG033621(tumor protein, translationally-controlled 1), 유전자등록번호(Genebank) NM_003841(tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10c, decoy without an intracellular domain),유전자 등록번호(Genebank) NM_003806[harakiri, bcl2 interacting protein(contains only bh3 domain)], 유전자 등록번호(Genebank) CR611266(fas-activated serine/threonine kinase), 유전자 등록번호(Genebank) AK126489(tubulin, beta), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003820[tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14(herpesvirus entry mediator)], 유전자 등록번호(Genebank) AK122614(peroxisome proliferative activated receptor, delta).
2) 상기 마커유전자 중에서, 심혈관독성 유발 약물의 처리에 의하여 발현이 감소하는 마커유전자 유전자는 하기와 같다:
유전자 등록번호 AB020641[PFTAIRE protein kinase 1], 유전자 등록번호 AB033068[Fizzy/cell division cycle 20 related 1(Drosophila)], 유전자 등록번호AB057597(Testis-specific kinase 2), 유전자 등록번호AB188493(MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2), 유전자 등록번호 AB208919[Fibroblast growth factor receptor 1(fms-related tyrosine kinase 2, Pfeiffer syndrome)], 유전자 등록번호 AB209154(Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2), 유전자 등록번호 AB209179[Polo-like kinase 1(Drosophila)], 유전자 등록번호AB209337[CDC7 cell division cycle 7(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 AB209615(Protein phosphatase 5, catalytic subunit), 유전자 등록번호 AB209681[Rap guanine nucleotide exchange factor(GEF) 4], 유전자 등록번호 AF041210[Midline 1(Opitz/BBB syndrome)], 유전자 등록번호 AF045459(BMX non-receptor tyrosine kinase), 유전자 등록번호 AF053305[BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog(yeast)], 유전자 등록번호 AF053306[BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta(yeast)], 유전자 등록번호 AF332220[Transducin(beta)-like 1Y-linked], 유전자 등록번호 AF375884(Protein O-fucosyltransferase 1), 유전자 등록번호 AK000581[Unc-51-like kinase 4(C. elegans)], 유전자 등록번호 AK055221(F-box protein 5),유전자 등록번호 AK056691[Germ cell associated 2(haspin)], 유전자 등록번호 AK074377(Chromosome 19 open reading frame 31), 유전자 등록번호 AK091289(Zinc finger protein 367), 유전자 등록번호 AK092352(Weakly similar to serine/threonine protein kinase Kp78),유전자 등록번호 AK123004(Microtubule associated serine/threonine kinase-like), 유전자 등록번호 AK131531[Cyclin-dependent kinase(CDC2-like) 10)], 유전자 등록번호 AL833316[Membrane-associated ring finger(C3HC4) 8], 유전자 등록번호 AY257469[Citron(rho-interacting, serine/threonine kinase 21)], 유전자 등록번호 BC011498(Histone deacetylase 6), 유전자 등록번호 BC015416(Ring finger protein 32), 유전자 등록번호 BC032677(Ubiquitin-conjugating enzyme E2C), 유전자 등록번호 BC035407[Interleukin 3 receptor, alpha(low affinity)], 유전자 등록번호 BC035514[TEK tyrosine kinase, endothelial(venous malformations, multiple cutaneous and mucosal)], 유전자등록번호 BC038295(Mitogen-activated protein kinase kinase 7), 유전자 등록번호 BC043502[NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2], 유전자 등록번호 BC070168(Tetraspanin 8), 유전자 등록번호 BC071593(V-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog), 유전자 등록번호 BC081541[Poly(ADP-ribose) polymerase family, member 12], 유전자 등록번호 BX537987(Tripartite motif-containing 59), 유전자 등록번호 CR749621(SNF related kinase), 유전자 등록번호 CR933728(Cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M),유전자등록번호 DQ097177(HECT, UBA and WWE domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_000513[Opsin 1(cone pigments), medium-wave-sensitive(color blindness, deutan)], 유전자 등록번호 NM_001005862[V-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2, neuro/glioblastoma derived oncogene homolog(avian)], 유전자 등록번호 NM_001014796(Discoidin domain receptor family, member 2), 유전자 등록번호 NM_001274[CHK1 checkpoint homolog(S. pombe)], 유전자 등록번호 NM_001490[Glucosaminyl(N-acetyl) transferase 1, core 2(beta-1,6-N-acetylglucosaminyltransferase)], 유전자 등록번호 NM_001543[N-deacetylase/N-sulfotransferase(heparan glucosaminyl) 1], 유전자 등록번호 NM_001618[Poly(ADP-ribose) polymerase family, member 1], 유전자 등록번호 NM_001789(Cell division cycle 25A), 유전자 등록번호 NM_001790(Cell division cycle 25C), 유전자 등록번호 NM_001798(Cyclin-dependent kinase 2), 유전자 등록번호 NM_002612(Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4), 유전자 등록번호 NM_002648(Pim-1 oncogene), 유전자 등록번호 NM_002758(Mitogen-activated protein kinase kinase 6), 유전자 등록번호 NM_002834[Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 11(Noonan syndrome 1)], 유전자 등록번호NM_002839(Protein tyrosine phosphatase, receptor type, D), 유전자 등록번호 NM_002843(Protein tyrosine phosphatase, receptor type, J), 유전자 등록번호 NM_002982[Chemokine(C-C motif) ligand 2], 유전자 등록번호NM_003242(Transforming growth factor, beta receptor II(70/80kDa)), 유전자 등록번호 NM_003318(TTK protein kinase), 유전자 등록번호 NM_003335(Ubiquitin-activating enzyme E1-like), 유전자 등록번호 NM_003384(Vaccinia related kinase 1), 유전자 등록번호 NM_003607[CDC42 binding protein kinase alpha(DMPK-like)], 유전자 등록번호 NM_004318(Aspartate beta-hydroxylase), 유전자 등록번호 NM_004667(Hect domain and RLD 2), 유전자 등록번호 NM_004687( Myotubularin related protein 4), 유전자 등록번호 NM_004938(Death-associated protein kinase 1), 유전자 등록번호 NM_005082(Tripartite motif-containing 25), 유전자 등록번호 NM_005188[Cas-Br-M(murine) ecotropic retroviral transforming sequence], 유전자 등록번호 NM_005391(Pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 3), 유전자 등 록번호 NM_005483[Chromatin assembly factor 1, subunit A(p150)], 유전자 등록번호 NM_005983[S-phase kinase-associated protein 2(p45)],유전자 등록번호 NM_006904(Protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide), 유전자 등록번호 NM_007039(Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 21), 유전자 등록번호 NM_007295(Breast cancer 1, early onset), 유전자 등록번호 NM_007313(V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1), 유전자 등록번호NM_007375(TAR DNA binding protein), 유전자 등록번호 NM_014176[Ubiquitin-conjugating enzyme E2T(putative)], 유전자 등록번호 NM_014238(Kinase suppressor of ras 1), 유전자 등록번호 NM_014264[Polo-like kinase 4(Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_014501(Ubiquitin-conjugating enzyme E2S), 유전자 등록번호 NM_014502[PRP19/PSO4 pre-mRNA processing factor 19 homolog(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호 NM_014671(Ubiquitin protein ligase E3C), 유전자 등록번호 NM_014791(Maternal embryonic leucine zipper kinase), 유전자 등록번호 NM_015148(PAS domain containing serine/threonine kinase), 유전자 등록번호 NM_015967[Protein tyrosine phosphatase, non-receptor type 22(lymphoid)], 유전자 등록번호 NM_016513[Intestinal cell(MAK-like) kinase], 유전자 등록번호 NM_016653(Hypothetical protein LOC339751), 유전자 등록번호 NM_020205(Zinc finger, A20 domain containing 1), 유전자 등록번호 NM_020438(Dolichyl pyrophosphate phosphatase 1), 유전자 등록번호 NM_020914(Chromosome 17 open reading frame 27), 유전자 등록번호 NM_021643[Tribbles homolog 2(Drosophila)], 유전자 등록번호 NM_022455(Nuclear receptor binding SET domain protein 1), 유전자 등록번호 NM_033389[Slingshot homolog 2(Drosophila), 유전자 등록번호 NM_080836(Serine/threonine kinase 35), 유전자 등록번호 NM_153498(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase ID), 유전자 등록번호 NM_172207(Calcium/calmodulin-dependent proteinkinase kinase 1, alpha), 유전자 등록번호 NM_173216(ST6nbeta-galactosamide alpha-2,6-sialyltranferase 1), 유전자 등록번호 NM_198268(Homeodomain interacting protein kinase 1), 유전자 등록번호 U67156(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5), 유전자 등록번호(Genebank) AB033337(M-phase phosphoprotein 1), 유전자 등록번호(Genebank) AB187578[Shugoshin-like 1(S. pombe)], 유전자 등록번호(Genebank) AB209271(Ets2 repressor factor), 유전자 등록번호(Genebank) AF345347(Sperm associated antigen 5), 유전자 등록번호(Genebank) AJ421269(Regulator of chromosome condensation 2), 유전자 등록번호(Genebank) AK091170[Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C(p18, inhibits CDK4)], 유전자 등록번호(Genebank) AK096393(DIRAS family, GTP-binding RAS-like 3), 유전자 등록번호(Genebank) AK096541(M-phase phosphoprotein 9), 유전자 등록번호(Genebank) AL713771(Nuclear transcription factor Y, gamma), 유전자 등록번호(Genebank) AL832666[Establishment of cohesion 1 homolog 2(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) AL833052(Hypothetical protein FLJ40137), 유전자 등록번호(Genebank) AL833191[SMC2 structural maintenance of chromosomes 2-like 1(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank) AY366508(Loss of heterozygosity, 11, chromosomal region 2, gene A), 유전자 등록번호(Genebank) AY367065[Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly associated(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) BC004352(Kinesin family member 22), 유전자 등록번호(Genebank) BC011000(Cell division cycle associated 5), 유전자 등록번호(Genebank) BC033086[Transcription factor 19(SC1)], 유전자 등록번호(Genebank) BC038666(Fanconi anemia, complementation group D2), 유전자 등록번호(Genebank) BC050369(E2F transcription factor 1), 유전자 등록번호(Genebank) BC073878(Kinesin family member C1), 유전자 등록번호(Genebank) BX640816(Nibrin), 유전자 등록번호(Genebank) BX641109[Spindle assembly 6 homolog(C. elegans)], 유전자 등록번호(Genebank) CR592757[Barren homolog 1(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) D79987[Extra spindle poles like 1(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_000059(Breast cancer 2, early onset), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000189(Hexokinase 2), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001005414(ZW10 interactor antisense), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001012271(Effector cell peptidase receptor 1), 유전자 등록번호(Genebank) 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등록번호(Genebank) AY032677[Polymerase(DNA directed), theta], 유전자 등록번호(Genebank) AY281068(Polybromo 1), 유전자 등록번호(Genebank) BC034480(Bloom syndrome), 유전자 등록번호(Genebank) BC038666(Fanconi anemia, complementation group D2), 유전자 등록번호(Genebank) BC067848[Karyopherin alpha 2(RAG cohort 1, importin alpha 1)], 유전자 등록번호(Genebank) BX537939[Elastin(supravalvular aortic stenosis, Williams-Beuren syndrome)], 유전자 등록번호(Genebank) D80008(DNA replication complex GINS protein PSF1), 유전자 등록번호(Genebank) L08238[Suppressor of variegation 3-9 homolog 1(Drosophila)], 유전자 등록번 호(Genebank) NM_000059(Breast cancer 2, early onset), 유전자 등록번호(Genebank) NM_000946(Primase, polypeptide 1, 49kDa), 유전자 등록번호(Genebank) NM_001003689[L(3)mbt-like 2(Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001067[Topoisomerase(DNA) II alpha 170kDa], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001254[CDC6 cell division cycle 6 homolog(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_001269(Regulator of chromosome condensation 1),유전자 등록번호(Genebank) NM_002689[Polymerase(DNA directed), 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NM_006892[DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta ], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012117[Chromobox homolog 5(HP1 alpha homolog, Drosophila)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_012415 [RAD54 homolog B(S. cerevisiae)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_014321[Origin recognition complex, subunit 6 homolog-like(yeast)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_015895(Geminin, DNA replication inhibitor), 유전자 등록번호(Genebank) NM_016937[Polymerase(DNA directed), alpha ].
본 발명자들은 심혈관독성 유발 약물 검색용 마커유전자를 발굴하기 위하여, 심혈관독성을 나타내는 다우노루비신을 인간 제대 혈관 내피 세포주(human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)에 처리하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과, 상기 다우노루비신은 인간 제대 혈관 내피 세포주에 독성을 가짐이 확인되었고(도 1 참조), 상기 실험을 바탕으로 다우노루비신의 농도를 결정하였다. 이후 상기 결정된 농도로 다우노루비신을 인간 제대 혈관 내피 세포주에 처리하고, 상기 약물을 처리한 세포주에서 mRNA를 분리하여 cDNA를 합성하면서 Cy5 형광물질로 표지하였으며, 약물을 처리하지 않은 대조군의 경우 Cy3 형광물질로 표지하였다. 상기 형광표지된 cDNA를 44 k 인간 유전체 전체(Human whole genome) 올리고마이크로어레이 칩(Agilent, USA)과 혼성화하였고, 형광 이미지를 스캔하여 유전자 발현 양상의 차이를 분석하였다(도 2 및 도3 참조). 분석시 Cy5/Cy3 비율이 2.0 배 이상인 경우 발현 증가된 유전자로 분류하였고, 0.5 배 이하인 경우 발현 감소화된 유전자로 분류하였다. 분석 결과, 발현이 증가된 유전자는 0.87%(44291개의 유전자 중 384개) 발현이 감소된 유전자는 1.39%(44,291개의 유전자 중 615개)임을 확인하였다. 이때, 다우노루비신에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 심혈관독성에 작용하는 기능으로 판단되는 아포토시스(apoptosis), 세포 주기(cell cycle), DNA 대사(DNA metabolism), 단백질 활성 조절 효소(regulation of protein kinase activity), 전이 활성 조절 효소(regulation of transferase activity), 알코올 대사(alcohol metabolism)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 다우노루비신을 처리 했을 때, 인간 제대 혈관 내피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
다우노루비신을 처리했을 때, 알코올 대사(alcohol metabolism)는 심근의 수축 기능을 조절하여 기능의 장애를 일으킨다(Alvaro Mordente., et al,.Lubmb Life 83-88. 2001).
다우노루비신은 혈관과 관련된 특이적인 유전자들의 발현이 감소하는 것으로 보고되었다. 발현이 감소되는 유전자에는 혈관과 관련된 PAI-1이 보고되었다. 안트라사이클린(Anracycline) 항생제인 다우노루비신은 HUVEC 세포에서 PAI-1(Plasminogen activator inhibitor-1) 유전자 발현을 감소시킨다. PAI-1은 동맥경화의 주요인자로 작용하는 섬유소의 분해를 억제시키는 작용을 하는데, 이 유전자의 변이시에는 혈관 내의 섬유소의 축적으로 혈관을 섬유화시키며 동맥의 폐색을 일으키어 동맥경화를 촉진시킨다. 체내 PAI-1(Plasminogen activator inhibitor-1) 농도가 올라가면 심장발작의 위험도를 증가시킨다. 또한 PAI-1의 유전자 발현이 감소하면 TNF-a(Tumor necrosis factor)유전자 발현을 증가시켜 아포토시스(apoptosis)를 일으킨다(Shinji Soeda., et al ., Biochimica et Biophysica Acta 234-241, 2001).
만성 골수증 백혈병 세포 안에서 다우노루비신을 처리했을때 bcl-2 단백질의 증가나 p53 단백질의 인산화의 증가를 대표적인 유전자인 막근처의 FLT3로 확인할수 있다. 발현이 감소되는 유전자에는 아포토시스(apoptosis) 관련된 Mcl-1 및 Hdm2 등이 보고되어있다.
다우노루비신은 DNA나 RNA와 결합해서 단백합성을 억제할 뿐 아니라 토포아이소머라제 II(topoisomerase II)에 작용해 DNA사슬을 자르는 작용도 한다. 또 세포막에 결합해서 물질 수송계(transport system)에 영향을 주거나 산소라디칼의 형성으로 세포독성을 보이는 여러 가지 작용기전을 가진 약물이다(Line Wergelasdl., et al ., BioMed Central 1-11. 2007).
다우노루비신은 단백질 활성효소 C(protein kinase C)경로를 억제한다. 다우노루비신의 내성이 생성되면 조정물질인 P-170 당단백질(glycoprotein)이 유출 되며 토포아이소머라제 II(topoisomerase II)는 활성화되고, bcl-2는 높은 발현이 되어 진다고 보고되어 있다. 반드시 혈관 외의 곳에서는 세포괴사를 일으키므로 주의해서 투여해야 한다(Shiwei Duan., et al ., Cancer Res 1-9, 2007).
또한, 본 발명은 상기 마커유전자 유전자 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고 뉴클레오티드, 또는 이의 상보가닥 분자가 집적된 심혈관독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩을 제공한다.
상기 올리고 뉴클레오티드 또는 이의 상보가닥 분자는 상기 마커유전자의 18 내지 30개의 핵산을 포함하고, 바람직하게는 20 내지 25개의 핵산을 포함한다.
본 발명의 심혈관독성 유발 약물 검색용 DNA 마이크로어레이 칩은 당업자에게 알려진 방법으로 제작할 수 있다. 상기 마이크로어레이칩을 제작하는 방법은 하기와 같다:
상기 탐색된 마커유전자를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판 상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 핀 형태의 스폿터인 마이크로어레이를 이용하였다. 상기 DNA 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 아미노-실란이 코팅된 슬라이드 글래스를 이용하였다.
또한, 본 발명은 상기 바이오바커를 이용한 심혈관독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
본 발명은
1) 인간 제대 혈관 내피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검 화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 실험군과 대조군의 RNA를 cDNA로 합성하면서 실험군과 대조군을 각기 다른 형광물질을 표지하는 단계;
4) 단계 3)의 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이칩과 혼성화시키는 단계;
5) 단계 4)의 반응한 DNA 마이크로어레이칩을 분석하는 단계; 및
6) 단계 5)의 분석한 데이터에서 본 발명의 마커유전자의 발현 정도를 대조군과 비교하여 확인하는 단계를 포함하는 심혈관독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 제대 혈관 내피 세포는 HUVEC을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 제대 혈관 내피 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 형광물질은 Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(rhodamine-B-isothiocyanate, RITC), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정하는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 5)의 DNA 마이크로어레이 칩은 Whole Human Genome Oligo Microarray(Agilent, USA)등을 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 인간 게놈 중 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자(표 2 및 포 3 참조)가 탑재된 마이크로어레이 칩이라면 사용 가능하고, 상기 본 발명자가 제작한 DNA 마이크로어레이 칩을 사용하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 단계 5)의 분석 방법은 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 분석 소프트웨어라면 모두 사용 가능하다.
또한, 본 발명은
1) 인간 제대 혈관 내피 세포에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 피검화합물을 처리한 실험군 세포와 피검화합물을 처리하지 않은 대조군 세포에서 RNA를 분리하는 단계;
3) 단계 2)의 RNA를, 본 발명의 마커유전자에 상보적이고 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 실시간 RT-PCR(Real-time reverse transcript polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
4) 단계 3)의 유전자 산물을 대조군과 비교하여 발현 정도를 확인하는 단계 를 포함하는 심혈관독성 유발 약물 검색 방법을 제공한다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 1)의 인간 제대 혈관 내피 세포는 HUVEC을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 제대 혈관 내피 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색 방법에 있어서, 단계 3)의 프라이머는 본 발명에서 탐색된 마커유전자 유전자와 상보적이고, 마커유전자를 증폭할 수 있으며, 증폭산물이 100 내지 300 bp(base pair)가 되도록 설계된 프라이머라면 모두 사용가능하다.
아울러, 본 발명은 상기 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 심혈관독성 유발 약물 검색용 키트를 제공한다.
상기 DNA 마이크로어레이 칩은 본 발명의 방법으로 제작한 것을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명은 상기 검색용 키트에 추가적으로 인간 제대 혈관 내피 세포를 포함하는 다우노루비신 검색 및 진단용 키트를 제공한다. 상기 인간 제대 혈관 내피 세포는 HUVEC을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 인간의 제대 혈관 내피 세포 및 조직에서 유래한 세포라면 모두 사용 가능하다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 Cy3와 Cy5를 사용하였다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 반응 시약을 포함시킬 수 있으며, 상기 반응 시약은 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 형광 염색제의 화학적 유도제와 같은 표식시약, 세척 완충용액 등으로 구성될 수 있으나 이에 한정된 것은 아니며, 당업자에게 알려진 DNA 마이크로어레이 칩의 혼성화 반응에 필요한 반응 시약은 모두 포함할 수 있다.
상기 검색용 키트에 추가적으로 상기 마커유전자 유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함할 수 있으며, 프라이머는 상기 마커유전자에 상보적이고, 마커유전자 유전자를 증폭할 수 있으며 증폭산물이 100 내지 300bp가 되도록 설계된 정방향 또는 역방향 프라이머쌍은 모두 사용 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 세포 배양 및 화학물질 처리
<1-1> 세포배양
인간 제대 혈관 내피 세포주인 HUVEC 세포(CC-2517, CAMBREX, USA)를 2% FBS 와 성장인자(CC-4176, CAMBREX, USA)가 첨가된 EBM-2 배지(CAMBREX, USA)를 이용하여 100 mm dish에서 5 × 105 세포/ml이 되도록 배양하였다. 본 발명자들은 기존의 연구와 보고를 통해 심혈관독성을 부작용으로 나타나는 대표적인 약물인 다우노루비신을 선정하였으며, DMSO에 용해시켰다. 매질(vehicle) 농도는 모든 실험에서 0.1% 이하였다.
<1-2> 세포 독성 실험(MTT assay) 및 화학 물질 처리
Mossman 등(J. Immunol . Methods, 65, 55-63, 1983)의 방법으로 HUVEC 세포주를 이용한 MTT 실험을 수행하였다. 세포는 24-웰 플레이트에 10× 104/웰 세포수로 EBM-2 배지(CAMBREX, USA)에서 DMSO에 용해된 다우노루비신을 처리하고 48시간 후에 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2,5-diphenyltetra zolium bromide) 5 ㎎/㎖을 혼합하여 튜브에 가하여 37℃에서 3 시간 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 형성된 포르마잔 크리스탈(formazan crystal)을 DMSO 500 ㎕에 용해하였다. 96-웰 플레이트로 옮겨 분주(aliquot)하고 흡광도 540 nm에서 O.D.값을 측정하였다. HUVEC 세포주에서 다우노루비신의 세포독성을 살펴본 결과, 20% 생존 저해 농도(IC20)는 191.00 ng/ml 이었으며(도 1 참조), 상기 농도들로 결정하여 마이크로어레이 실험을 수행하였다.
<실시예 2> 마이크로어레이 실험
<2-1> 표적 RNA의 분리 및 형광 물질 표지
1.65 × 106 cell/㎖ 농도로 100 mm dish에 HUVEC 세포를 분주한 후, 실시예 1-2에서 결정된 다우노루비신의 농도를 48 시간 동안 처리하였다. 이후, 상기 처리한 세포에서 트리졸(trizol) 시약(Invitrogen life technologies, USA)을 사용하여 제조사의 방법대로 전체 RNA를 분리하고, RNeasy mini kit(Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 게놈 DNA는 RNA 정제 동안 RNase-free DNase set(Qiagen, USA)를 사용하여 제거하였다. 각 전체 RNA 시료의 양은 분광광도계로 측정하였고, 순도는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, USA)으로 확인하였다.
<2-2> 표지된 cDNA 제조
올리고 마이크로어레이 분석을 위하여 실시예<2-1>에서 수득한 다우노루비신 처리군의 전체 RNA를 사용하여 cDNA를 제조하였다. 상기 수득한 전체 RNA 30 ㎍과 올리고(dT) 프라이머 2 ㎍(1 ㎍/㎕)과 혼합하고 65℃에서 10분간 반응시킨 후 바로 얼음에 넣어 어닐링(annealing)시켰다. 상기 어닐링된 RNA의 역전사(Reverse Transcript) 반응을 위해 표 1과 같이 시약을 혼합하였다.
구성 부피(㎕)
5X first strand buffer 6
dNTPs 0.6
0.1 M DDT 3
SuperScript Ⅱ 효소 3
Cy-3 또는 Cy-5 dUTP 2
대조군인 HUVEC 세포주에서 분리한 전체 RNA는 Cy3-dUTP(녹색)으로 표지화하였고, 다우노루비신을 처리한 HUVEC 세포주로부터 분리한 RNA는 Cy5-dUTP(적색)를 표지화 하였다. 이때 두 시료는 Microcon YM-30 컬럼(Millipore, USA)을 사용하여 혼합, 정제되었다.
<2-3> 혼성화 반응
혼성화 및 세척 과정은 지노첵(주)의 지시방법에 따라 수행되었다. 혼성화는 12시간 동안 62℃ 오븐에서 수행되었다. DNA 마이크로어레이 칩으로 44 k Whole Human Genome 올리고 마이크로어레이(Agilent, USA)를 이용하였다. 세척(2분간 2× SSC/0.1% SDS에 세척, 3분간 1× SSC, 2분간 0.2× SSC에 세척) 후 슬라이드는 3분간 800 rpm으로 원심분리하여 건조하였다.
<2-4> 형광 이미지 획득
슬라이드 상의 혼성화 이미지는 Genepix 4000B(Axon Instruments, USA)로 스캔하였다. 결합되지 않은 유전자를 세척한 칩은 레이저 광 스캐너(laser fluorescence scanner)를 사용하여 형광 이미지를 획득하였다. 이때 녹색 형광 이미지는 대조군에서, 적색 형광 이미지는 실험군에서만 특이하게 발현되는 유전자의 활성정도를 나타내게 되며, 노란색 형광 이미지는 녹색과 적색의 보색으로 두 군의 발현이 큰 차이가 없음을 의미한다. 스캔한 이미지들은 유전자 발현 비율을 얻기 위하여 GenePix 4.1 소프트웨어(Axon Instruments, USA)로 분석하였다. 이렇게 얻어진 데이터로부터 다우노루비신에 대한 마커 유전자를 선별하였다(도 2 참조).
그 결과, 올리고 칩 상에 존재하는 대략 4만 4천 개의 유전자 중에서 다우노루비신에 의해 Cy5/Cy3의 비율이 2.0배 이상으로 유전자 발현 증가를 보이는 유전자는 0.87%(44,291개의 유전자 중384 개) 발현이 감소된 유전자는 1.39%(44,291개의 유전자 중 615개)임을 확인하였다.
이때, 다우노루비신에 의해 2.0 배 이상 발현이 변화된 유전자들을 기능별로 분류하였을 때, 심혈관독성에 작용하는 기능으로 판단되는 아포토시스(apoptosis), 세포 주기(cell cycle), DNA 대사(DNA metabolism), 단백질 활성 조절 효소(regulation of protein kinase activity), 전이 활성 조절 효소(regulation of transferase activity), 알코올 대사(alcohol metabolism)에 관련된 유전자를 선별하였다(표 2 및 표 3 참조). 상기 유전자들은 본 발명에서 사용한 다우노루비신을 처리했을 때, 인간 제대 혈관 내피 세포에서 독성과 관련이 있다는 보고는 없다.
다우노루비신에 의해 발현이 증가하는 유전자
등록번호(Genebank) 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
(1)세포주기(cell cycle)
AK057315 TSGA2 testis specific a2 homolog(mouse) 2.05309
AF033122 SESN1 sestrin 1 2.79039
NM_053056 CCND1 cyclin d1 2.14236
NM_003236 TGFA transforming growth factor, alpha 2.24130
NM_033238 PML promyelocytic leukemia 3.65163
AY123223 SESN2 sestrin 2 2.63663
NM_006455 SC65 synaptonemal complex protein sc65 2.70626
NM_020418 PCBP4 poly(rc) binding protein 4 2.01122
NM_006396 SSSCA1 sjogren's syndrome/scleroderma autoantigen 1 2.19973
NM_003620 PPM1D protein phosphatase 1d magnesium-dependent, delta isoform 2.28086
AK001361 PPP1R15A protein phosphatase 1, regulatory(inhibitor) subunit 15a 2.01752
NM_057158 DUSP4 dual specificity phosphatase 4 2.79719
NM_012127 CIZ1 cdkn1a interacting zinc finger protein 1 2.55424
NM_001759 CCND2 cyclin d2 2.44304
NM_002632 PGF placental growth factor, vascular endothelial growth factor-related protein 2.22896
NM_003550 MAD1L1 mad1 mitotic arrest deficient-like 1(yeast) 2.07140
(2)단백질 활성 조절 효소(regulation of protein kinase activity)
NM_078487 CDKN2B cyclin-dependent kinase inhibitor 2b(p15, inhibits cdk4) 2.02176
AB209596 GPS1 g protein pathway suppressor 1 2.24663
NM_181805 PKIG protein kinase(camp-dependent, catalytic) inhibitor gamma 2.95804
NM_013366 ANAPC2 anaphase promoting complex subunit 2 2.92252
(3)아포토시스(apoptosis)
AK127033 DNM2 dynamin 2 3.29723
NM_139314 ANGPTL4 angiopoietin-like 4 5.79447
AB209095 CDC2L2 cell division cycle 2-like 1(pitslre
proteins) 		2.55619
NM_078467 CDKN1A cyclin-dependent kinase inhibitor 1a(p21, cip1) 8.10811
NM_001024807 APLP1 amyloid beta(a4) precursor-like protein 1 6.35267
NM_003311 PHLDA2 pleckstrin homology-like domain, family a, member 2 2.21963
AK125880 TP53INP1 tumor protein p53 inducible nuclear protein 1 2.15787
AB208907 MAEA macrophage erythroblast attacher 2.03114
AB096256 UNC5B unc-5 homolog b(c. elegans) 2.11226
NM_003841 TNFRSF10C tumor necrosis factor receptor superfamily,
member 10c, decoy without an intracellular domain 		2.63799
NM_003806 HRK harakiri, bcl2 interacting protein(contains only bh3 domain) 3.05562
NM_003820 TNFRSF1 tumor necrosis factor receptor superfamily,
member 14(herpesvirus entry mediator) 		2.16602
(4)전이 활성 조절 효소(regulation of transferase activity)
NM_002419 MAP3K11 mitogen-activated protein kinase kinase
kinase 11		 3.33089
NM_002838 PTPRC protein tyrosine phosphatase, receptor type, c 2.54511
AY247738 TRIB3 tribbles homolog 3(drosophila) 2.31361
AK074652 SERTAD1 serta domain containing 1 2.03357
다우노루비신에 의해 발현이 감소하는 유전자
등록번호(Genebank) 유전자 약어 유전자 명 중간값의 비
(1)세포주기(cell cycle)
AB033068 FZR1 Fizzy/cell division cycle 20 related 1
(Drosophila)		 0.42943
AB033337 MPHOSPH1 M-phase phosphoprotein 1 0.32913
AB187578 SGOL1 Shugoshin-like 1(S. pombe) 0.23275
AB209179 PLK1 Polo-like kinase 1(Drosophila) 0.07319
AB209271 ERF Ets2 repressor factor 0.3478
AF053305 BUB1 BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog(yeast) 0.06571
AF053306 BUB1B BUB1 budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta(yeast) 0.05547
AF345347 SPAG5 Sperm associated antigen 5 0.07229
AJ421269 TD-60 Regulator of chromosome condensation 2 0.44479
AK056691 GSG2 Germ cell associated 2(haspin) 0.32192
AK074377 UHRF1 Chromosome 19 open reading frame 31 0.07671
AK091170 CDKN2C Cyclin-dependent kinase inhibitor 2C(p18,
inhibits CDK4)		 0.12231
AK096393 ARHI DIRAS family, GTP-binding RAS-like 3 0.41212
AK096541 MPHOSPH9 M-phase phosphoprotein 9 0.40989
AK131531 CDK10 Cyclin-dependent kinase(CDC2-like) 10 0.44758
AL713771 NFYC Nuclear transcription factor Y, gamma 0.48498
AL832666 ESCO2 Establishment of cohesion 1 homolog 2(S.
cerevisiae)		 0.43779
AL833052 FLJ40137 Hypothetical protein FLJ40137 0.4844
AL833191 SMC2L1 SMC2 structural maintenance of chromosomes 2-like 1(yeast) 0.21063
AY257469 CIT Citron(rho-interacting, serine/threonine
kinase 21)		 0.10936
AY366508 LOH11CR2A Loss of heterozygosity, 11, chromosomal
region 2, gene A		 0.32248
AY367065 ASPM Asp(abnormal spindle)-like, microcephaly
associated(Drosophila)		 0.03951
BC004352 KIF22 Kinesin family member 22 0.17767
BC011000 CDCA5 Cell division cycle associated 5 0.0695
BC032677 UBE2C Ubiquitin-conjugating enzyme E2C 0.13309
BC033086 TCF19 Transcription factor 19(SC1) 0.07014
BC043502 NEK2 NIMA(never in mitosis gene a)-related kinase 2 0.04214
BC050369 E2F1 E2F transcription factor 1 0.28667
BC073878 KIFC1 Kinesin family member C1 0.24991
BX640816 NBS1 Nibrin 0.48659
BX641109 DKFZp761A078 Spindle assembly 6 homolog(C. elegans) 0.32725
CR592757 BRRN1 Barren homolog 1(Drosophila) 0.07665
CR933728 CDC2 Cell division cycle 2, G1 to S and G2 to M 0.03382
D79987 ESPL1 Extra spindle poles like 1(S. cerevisiae) 0.10605
NM_000189 HK2 Hexokinase 2 0.22601
NM_001005414 ZWINT ZW10 interactor antisense 0.14056
NM_001012271 BIRC5 Effector cell peptidase receptor 1 0.09013
NM_001761 CCNF Cyclin F 0.37686
NM_001789 CDC25A Cell division cycle 25A 0.26275
NM_001790 CDC25C Cell division cycle 25C 0.04715
NM_001813 CENPE Centromere protein E, 312kDa 0.11374
NM_001827 CKS2 CDC28 protein kinase regulatory subunit 2 0.42546
NM_002417 MKI67 Antigen identified by monoclonal antibody
Ki-67		 0.01213
NM_002758 MAP2K6 Mitogen-activated protein kinase kinase 6 0.30599
NM_002776 KLK10 Kallikrein 10 0.38859
NM_002895 RBL1 Retinoblastoma-like 1(p107) 0.44428
NM_003318 TTK TTK protein kinase 0.03428
NM_003579 RAD54L RAD54-like(S. cerevisiae) 0.14413
NM_003858 CCNK Chromosome 14 open reading frame 65 0.48783
NM_003981 PRC1 Protein regulator of cytokinesis 1 0.07085
NM_004091 E2F2 E2F transcription factor 2 0.31906
NM_004523 KIF11 Kinesin family member 11 0.23936
NM_004526 MCM2 MCM2 minichromosome maintenance deficient 2, mitotin(S. cerevisiae) 0.14575
NM_004701 CCNB2 Cyclin B2 0.03772
NM_005427 TP73 Tumor protein p73 0.47574
NM_005483 CHAF1A Chromatin assembly factor 1, subunit A(p150) 0.36944
NM_005504 BCAT1 Branched chain aminotransferase 1, cytosolic 0.42509
NM_005915 MCM6 MCM6 minichromosome maintenance deficient 6(MIS5 homolog, S. pombe)(S. cerevisiae) 0.27146
NM_005938 MLLT7 Myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia(trithorax homolog, Drosophila); translocated to, 7 0.3934
NM_005983 SKP2 S-phase kinase-associated protein 2(p45) 0.48021
NM_006101 KNTC2 Kinetochore associated 2 0.03983
NM_006739 MCM5 MCM5 minichromosome maintenance deficient 5, cell division cycle 46(S. cerevisiae) 0.28432
NM_006845 KIF2C Kinesin family member 2C 0.03695
NM_007295 BRCA1 Breast cancer 1, early onset 0.44938
NM_007313 ABL1 V-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog 1 0.18529
NM_007375 TARDBP TAR DNA binding protein 0.42362
NM_012112 TPX2 TPX2, microtubule-associated, homolog(Xenopus laevis) 0.04405
NM_013975 LIG3 Ligase III, DNA, ATP-dependent 0.27978
NM_014264 PLK4 Polo-like kinase 4(Drosophila) 0.06002
NM_014708 KNTC1 Kinetochore associated 1 0.38732
NM_014750 DLG7 Discs, large homolog 7(Drosophila) 0.04628
NM_015097 CLASP2 Cytoplasmic linker associated protein 2 0.49449
NM_015714 G0S2 G0/G1switch 2 0.44837
NM_016169 SUFU Suppressor of fused homolog(Drosophila) 0.39425
NM_016272 TOB2 Transducer of ERBB2, 2 0.40084
NM_016343 CENPF Centromere protein F, 350/400ka(mitosin) 0.01651
NM_016426 GTSE1 G-2 and S-phase expressed 1 0.16086
NM_016653 ZAK Hypothetical protein LOC339751 0.40223
NM_018560 WWOX WW domain containing oxidoreductase 0.41397
NM_020238 INCENP Inner centromere protein antigens 135/155kDa 0.42731
NM_024342 GRLF1 Glucocorticoid receptor DNA binding factor 1 0.27529
NM_024680 FLJ23311 E2F transcription factor 8 0.36544
NM_031966 CCNB1 Cyclin B1 0.04859
NM_057749 CCNE2 Cyclin E2 0.38421
NM_138555 KIF23 Kinesin family member 23 0.0728
NM_144665 SESN3 Sestrin 3 0.37186
NM_152526 ALS2CR19 Amyotrophic lateral sclerosis 2(juvenile)
chromosome region, candidate 19		 0.47827
NM_183380 DST Dystonin 0.44214
U65410 MAD2L1 MAD2 mitotic arrest deficient-like 1(yeast) 0.07002
XM_034274 MYBL1 V-myb myeloblastosis viral oncogene homolog(avian)-like 1 0.28284
XM_496557 RGP1 Plasminogen-like B2 0.42893
(2)알코올 대사(alcohol methabolism)
NM_002612 PDK4 pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 4 0.35557
NM_005391 PDK3 pyruvate dehydrogenase kinase, isozyme 3 0.37266
NM_000189 HK2 hexokinase 2 0.22600
AF285167 ABCA1 cholesterol efflux regulatory protein 0.41932
BX648281 LDLR low density lipoprotein receptor(familial
hypercholesterolemia)		 0.37942
NM_002130 HMGCS1 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme a
synthase 1(soluble)		 0.48082
NM_005165 ALDOC aldolase c, fructose-bisphosphate 0.49372
XM_113962 KIAA0650 structural maintenance of chromosomes
flexible hinge domain containing 1		 0.42359
AF285167 ABCA1 atp-binding cassette, sub-family a(abc1), member 1 0.41932
X66610 ENO1B; HLE1 enolase alpha, lung-specific 0.33868
NM_022755 C9orf12 inositol 1,3,4,5,6-pentakisphosphate 2-kinase 0.44723
AF375884 POFUT1 protein o-fucosyltransferase 1 0.33105
NM_014465 SULT1B1 sulfotransferase family, cytosolic, 1b,
member 1		 0.34589
NM_014762 DHCR24 24-dehydrocholesterol reductase 0.25654
NM_000689 NM_000689 aldehyde dehydrogenase 1 family, member a1 0.25165
NM_006389 HYOU1 hypoxia up-regulated 1 0.49384
AL833741 ENO1 enolase 1,(alpha) 0.34051
NM_002541 OGDH oxoglutarate(alpha-ketoglutarate)
dehydrogenase(lipoamide)		 0.23662
BC000054 DHCR7 7-dehydrocholesterol reductase 0.45278
AK223395 FBP1 fructose-1,6-bisphosphatase 1 0.41066
NM_182470 PKM2 pyruvate kinase, muscle 0.46000
(3)DNA 대사(DNA methabolism)
AB028450 NCOR1 Nuclear receptor co-repressor 1 0.29648
AB053172 CDT1 DNA replication factor 0.30334
AB209337 CDC7 CDC7 cell division cycle 7(S. cerevisiae) 0.44491
AF095289 PTTG3 Pituitary tumor-transforming 3 0.17649
AF360549 BRIP1 BRCA1 interacting protein C-terminal helicase 1 0.30262
AJ007669 FANCG Fanconi anemia, complementation group G 0.37762
AK074377 UHRF1 Chromosome 19 open reading frame 31 0.07671
AK093320 TOE1 Target of EGR1, member 1(nuclear) 0.47256
AK123010 RRM2 Ribonucleotide reductase M2 polypeptide 0.06679
AY032677 POLQ Polymerase(DNA directed), theta 0.0915
AY281068 PB1 Polybromo 1 0.46175
BC011498 HDAC6 Histone deacetylase 6 0.44705
BC034480 BLM Bloom syndrome 0.19473
BC038666 FANCD2 Fanconi anemia, complementation group D2 0.48627
BC067848 KPNA2 Karyopherin alpha 2(RAG cohort 1, importin alpha 1) 0.32905
BX537939 ELN Elastin(supravalvular aortic stenosis,
Williams-Beuren syndrome)		 0.48189
D80008 KIAA0186 DNA replication complex GINS protein PSF1 0.48368
DQ097177 UREB1 HECT, UBA and WWE domain containing 1 0.15108
L08238 SUV39H1 Suppressor of variegation 3-9 homolog 1
(Drosophila)		 0.18829
NM_000059 BRCA2 Breast cancer 2, early onset 0.33063
NM_000946 PRIM1 Primase, polypeptide 1, 49kDa 0.28839
NM_001003689 L3MBTL2 L(3)mbt-like 2(Drosophila) 0.48748
NM_001067 TOP2A Topoisomerase(DNA) II alpha 170kDa 0.01856
NM_001254 CDC6 CDC6 cell division cycle 6 homolog(S.
cerevisiae)		 0.20776
NM_001269 CHC1 Regulator of chromosome condensation 1 0.49675
NM_001274 CHEK1 CHK1 checkpoint homolog(S. pombe) 0.40987
NM_001798 CDK2 Cyclin-dependent kinase 2 0.4747
NM_002388 MCM3 MCM3 minichromosome maintenance deficient 3(S. cerevisiae) 0.41603
NM_002689 POLA2 Polymerase(DNA directed), alpha 2(70kD subunit) 0.45176
NM_002692 POLE2 Polymerase(DNA directed), epsilon 2(p59
subunit)		 0.25833
NM_002915 RFC3 Replication factor C(activator 1) 3, 38kDa 0.22105
NM_002916 RFC4 Replication factor C(activator 1) 4, 37kDa 0.42826
NM_003258 TK1 Thymidine kinase 1, soluble 0.05323
NM_003362 UNG Uracil-DNA glycosylase 0.32924
NM_003504 CDC45L CDC45 cell division cycle 45-like(S.
cerevisiae)		 0.07699
NM_003621 PPFIBP2 PTPRF interacting protein, binding protein 2(liprin beta 2) 0.30163
NM_004111 FEN1 Flap structure-specific endonuclease 1 0.19996
NM_004153 ORC1L Origin recognition complex, subunit 1-like(yeast) 0.44115
NM_005441 CHAF1B Chromatin assembly factor 1, subunit B(p60) 0.34329
NM_005914 MCM4 MCM4 minichromosome maintenance deficient 4(S. cerevisiae) 0.35446
NM_006306 SMC1L1 SMC1 structural maintenance of chromosomes 1-like 1(yeast) 0.33196
NM_006591 POLD3 Polymerase(DNA-directed), delta 3, accessory subunit 0.43002
NM_006892 DNMT3B DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3 beta 0.3838
NM_006904 PRKDC Protein kinase, DNA-activated, catalytic
polypeptide		 0.25843
NM_012117 CBX5 Chromobox homolog 5(HP1 alpha homolog,
Drosophila)		 0.42306
NM_012415 RAD54B RAD54 homolog B(S. cerevisiae) 0.29873
NM_014321 ORC6L Origin recognition complex, subunit 6
homolog-like(yeast)		 0.48654
NM_015895 GMNN Geminin, DNA replication inhibitor 0.41952
NM_016937 POLA Polymerase(DNA directed), alpha 0.37117
NM_022455 NSD1 Nuclear receptor binding SET domain protein 1 0.29251
NM_022836 DCLRE1B DNA cross-link repair 1B(PSO2 homolog, S.
cerevisiae)		 0.42494
NM_130398 EXO1 Exonuclease 1 0.11793
NM_144678 TOM1L2 Target of myb1-like 2(chicken) 0.23585
NM_181578 RFC5 Replication factor C(activator 1) 5, 36.5kDa 0.49855
NM_182776 MCM7 MCM7 minichromosome maintenance deficient 7(S. cerevisiae) 0.22656
U47742 MYST3 MYST histone acetyltransferase(monocytic
leukemia) 3		 0.46944
U81234 CXCL6 Chemokine(C-X-C motif) ligand 6(granulocyte chemotactic protein 2) 0.30656
도 1은 다우노루비신의 인간 제대 혈관 내피 세포주에서의 세포 독성을 조사한 그래프이고,
도 2 및 도 3은 마이크로어레이 칩을 이용한 다우노루비신을 처리한 인간 제대 혈관 내피 세포주의 유전자 발현 양상을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.

Claims (15)

  1. 하기의 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 핵산서열의 전부 또는 18 내지 30개의 핵산 서열로 구성되는 상기 유전자의 단편인 올리고뉴클레오티드 또는 그의 상보가닥 분자가 집적된 다우노루비신 처리에 대한 세포사멸(apoptosis) 관련 유전자 발현 여부 확인용 DNA 마이크로어레이 칩:
    유전자 등록번호(Genebank) AK127033(dynamin 2), 유전자 등록번호(Genebank) AB209095[cell division cycle 2-like 1(pitslre proteins)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003311(Pleckstrin homology-like domain, family A, member 2), 유전자 등록번호(Genebank) AK125880(Tumor protein p53 inducible nuclear protein 1), 유전자 등록번호(Genebank) AB096256[Unc-5 homolog B(C. elegans)], 유전자등록번호(Genebank) NM_003841(tumor necrosis factor receptor superfamily, member 10c, decoy without an intracellular domain), 유전자 등록번호(Genebank) NM_003806[harakiri, bcl2 interacting protein(contains only bh3 domain)], 유전자 등록번호(Genebank) NM_003820[tumor necrosis factor receptor superfamily, member 14(herpesvirus entry mediator)].
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1항의 DNA 마이크로어레이 칩을 포함하는 다우노루비신 처리에 대한 세포사멸(apoptosis) 관련 유전자 발현 여부 확인용 키트.
  12. 제 11항에 있어서, 인간 제대혈관 내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cells, HUVEC)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  13. 제 11항에 있어서, 스트렙타비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질(chemiluminescent)로 이루어진 형광물질군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  14. 제 11항에 있어서, 혼성화에 사용되는 완충용액, RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사효소, cNTPs 및 rNTP(사전 혼합형 또는 분리 공급형), 표식시약, 및 세척 완충용액으로 이루어진 반응시약군으로부터 선택되는 어느 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  15. 삭제
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