KR100953762B1

KR100953762B1 - 벼에서 분리된 병 저항성 증진 및 단간 유도 유전자를포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질 전환체, 및 이 형질전환체의 제조방법

Info

Publication number: KR100953762B1
Application number: KR1020070112184A
Authority: KR
Inventors: 황덕주; 손성환; 이정숙
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2007-11-05
Filing date: 2007-11-05
Publication date: 2010-04-21
Also published as: KR20090046190A

Abstract

본 발명은 벼에서 분리된 벼의 병 저항성 증진 및 단간(短桿) 유도 유전자를 포함하는 발현벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체, 및 이 형질 전환체의 제조방법에 관한 것으로, 상기 형질 전환체는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지며, 벼 유래의 병 저항성 및 단간 유도 OsWRKY51 유전자를 포함하는 발현 벡터 pB2GW7-OsWRKY51에 의해 형질 전환된 아그로박테리움 형질전환체로 형질 전환된 식물세포 형질 전환체이다.

OsWRKY51 유전자 , 병 저항성, 단간 유도, 벼 흰잎마름병 저항성

Description

벼에서 분리된 병 저항성 증진 및 단간 유도 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질 전환체, 및 이 형질 전환체의 제조방법{TRANSFORMANT TRANSFORMED BY EXPRESSION VECTOR CONTAININGDISEASE RESISTANCE AND SEMIDWARF PHENOTYPE GENE ISOLATED FROM Oryza sativa, AND METHOD FOR PREPARATION OF TRANSFORMANT}

본 발명은 벼(Oryza sativa)에서 분리된 병 저항성 및 단간 유도 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이 형질전환체의 제조방법에 관한 것이다.

농작물은 고착생활을 하기 때문에, 끊임없이 수많은 병원균(곰팡이, 세균, 바이러스 등)들의 공격을 받게 되고, 그로 인해 다양한 질병의 발생으로 생산량이 감소되었다. 이와 같은 병원균에 의한 농작물의 피해를 줄이고 생산성을 향상시키기 위하여 일반적으로 농약이 사용되어오고 있으나, 농약의 사용은 환경오염이라는 심각한 문제를 야기시킴으로서 돌이킬 수 없는 자연환경의 파괴와 회복불능의 환경을 만들어 내고 있다(Sherman JD et al., Arch. Environ.Health., 52, 332-333, 1997). 뿐만 아니라, 농약을 살포하는 농민들의 경우 맹독성의 농약을 인체에 흡입하게 되고, 이로 인해 인체내의 축적과 불치의 유전병이 생성되게 되고, 잔류농약 의 흡수에 의해 소비자들에게도 치명적인 건강상의 손실을 유발시키게 된다(London et al., Scan. J., Work. Environ. Health., 24, 18-29, 1998). 이에 따라 식물의 병 방제와 농약사용으로 인한 환경오염이나 인체 축적에 의한 치명적인 질병 발생 등을 방지할 수 있는 방법에 대한 연구가 이루어지고 있다.

식물의 병 발생에 대한 방어반응으로 건강한 식물에서는 미량으로 존재하거나 발견되지 않는 유전자 또는 단백질들이 병 감염시 특이적으로 증가되거나 나타난다. 이를 병 저항성 유전자 또는 병 생성 관련 단백질(pathogenesis-related protein)이라 한다. 식물들은 특이한 병 방어유전자를 다양하게 발현하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 특이한 병 방어 유전자를 식물체로부터 분리하여, 유전공학적으로 적용하고자 하는 연구가 진행되어 왔다. 그 예로서 생물체내에 존재하는 병원균 살균 단백질의 탐색과 분리 및 이들을 코딩하는 유전자의 클로닝과 이들을 이용한 내병성 형질전환 식물체에 대한 개발이 이루어지고 있다.

이러한 노력의 일환으로 병 저항성 작물의 육성 프로그램들이 다양한 작물-병원균의 상호작용을 대상으로 진행되어져 왔으며, 병 저항성에 대한 이해 및 이의 실제적 응용을 위해 병 저항성 식물에서의 저항성 기작의 연구가 여러 가지 작물 및 모델 식물을 대상으로 실시되어져 왔다. 집중적으로 연구가 되고 있는 작물로는 담배, 토마토 및 벼가 그 대표사례라 할 수 있으며, 잡초의 일종인 애기장대풀은 식물병 저항성 연구를 위한 모델 식물로서 세계적으로 사용되고 있다.

그러나, 종래 병 저항성 품종 육성의 연구는 전통적인 교배 육종에 의존한 수직 저항성을 이용한 것이기 때문에, 저항성이 쉽게 무너지는 문제가 있었다.

이에 대해 본 발명에서는 병 저항성 작물 육종을 위하여 병 저항성을 조절하는 전사 인자를 분리, 분석한 후 이를 벼에 형질전환시켜 병원균에 저항성인 벼를 개발하고자 하였다.

이에 따라 본 발명은 OsWRKY51 유전자가 벼내에서 과다 발현되면 병원균 특히 벼 흰잎마름병(Xanthomonas pryzae pv. oryzae)에 대한 병 저항성이 높아지고, 단간(短桿)이 유도되는 것을 발견하고, 병원균에 대하여 병 저항성을 나타내는 벼 유래의 OsWRKY51 유전자 및 그 염기서열을 제공하고자 한다.

본 발명은 또한 숙주세포의 키를 조절하여 단간을 유도하는 벼 유래의 OsWRKY51 유전자 및 그 염기서열을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 OsWRKY51 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기 목적을 이루기 위하여, 본 발명의 일 실시 예에 따르면, 본 발명의 형질 전환체는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지며, 벼 유래의 병 저항성 및 단간 유도 OsWRKY51 유전자를 포함하는 발현 벡터 pB2GW7-OsWRKY51에 의해 형질 전환된 아그로박테리움 형질전환체로 형질 전환된 것을 특징으로 하는 식물세포 형질 전환체이다.
또한, 본 발명의 형질 전환체 제조방법은 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 벼 유래의 OsWRKY51 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계와; 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 및; 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계;에 의해 OsWRKY51 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물세포 형질 전환체 제조방법이다.

삭제

본 발명의 OsWRKY51 유전자는 벼 유래의 병 저항성 관련 유전자로서, 벼에 병원균이나 병 방어 유도물질 처리시 발현이 증폭되기 때문에, 이 OsWRKY51 유전자를 식물에 도입하여 발현시키면 병 저항성 작물 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 상기 OsWRKY51 유전자는 키 조절에 관여하여 단간 품종육성에 사용될 수 있다. 이와 같은 병 저항성 및 단간 품종육성으로 인해 농약사용절감 및 비나 태풍에 의한 피해를 줄여 생산성 향상 및 안전한 농산물 공급이 가능하다.

이하, 본 발명에 대해서 상세히 설명한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지는, 벼 유래의 병 저항성 및 단간 유도 OsWRKY51 유전자를 제공한다.

상기 유전자는 식물이 병원균이나 병 방어 유도물질로 처리될 때 발현이 증 폭되는 병 저항성 및 단간 유도의 유전자로서, "OsWRKY51 유전자"로 명명하였다.

상기 OsWRKY51 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 326개의 아미노산을 코드하는 981bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 OsWRKY51 유전자를 과다 발현시키면 병원균, 특히 벼의 경우 벼 흰잎 마름병이, 애기장풀의 경우 검은 썩음병과 무름병에 대한 저항성이 현저하게 증가한다. 더불어 상기 OsWRKY51 유전자는 형질 전환체에 있어서 세미드와피즘을 나타내는 단간을 유도한다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 벼 유래의 OsWRKY51 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 상기 OsWRKY51 유전자를 공지의 적절한 발현벡터에 삽입하여, 이 유전자를 포함하는 발현벡터를 얻을 수 있다. 상기 OsWRKY51 유전자를 삽입하기 위한 발현벡터로는 pB2GW7 벡터가 바람직하고, 선별 마커로서 제초저항성을 나타내는 바스타 유전자를 포함하여 제조하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 "pB2GW7-OsWRKY51" 라고 명명하고, 도 3에 나타내었다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 벼 유래의 OsWRKY51 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환된 형질전환체(transformants)가 제공된다.

본 발명의 상기 형질전환에 사용할 수 있는 숙주세포로는 본 발명의 상기 유전자의 발현에 적합한 것이면 어느 것이라도 좋고, 식물체내로의 형질전환, 세포배 양 및 구입의 용이 등의 측면에서 특히 아그로박테리움(Agrobacterium)이 바람직하다.

여기서, "형질전환체"란 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 유용물질을 코딩하는 DNA 서열로 이루어지는 DNA 구조물(DNA construct)에 의해 형질전환된 세포 또는 식물체를 의미한다. 본 발명에서 형질전환체는 형질전환된 미생물, 동물세포, 식물세포, 형질전환된 동물 또는 식물체 및 이들로부터 유래된 배양세포 등을 포함하는 의미이다.

본 발명자들은 본 발명의 상기 OsWRKY51 유전자를 포함하는 발현벡터를 제작한 후, 이 발현벡터를 아그로박테리움에 형질전환시켜 안정적인 아그로박테리움 형질전환체를 확립하였으며, 이를 형질전환체 "LBA4404:pB2GW7-OsWRKY51"로 명명하였다.

또한, 상기 아그로박테리움 형질전환체인 LBA4404:pB2GW7-OsWRKY51를 벼, 및 애기장대에 형질전환시켜 안정적인 식물 형질 전환체를 확립하였다.

본 발명의 상기 형질전환체의 제조방법은 다음 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:

1) 프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열 또는 그것의 일부로 이루어지는 OsWRKY51 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

2) 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계; 및

3) 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계.

상기 발현벡터를 제조하는 단계 1)에 있어서, cDNA 유전자은행(cDNA library)로부터 차별화 선별법(differential screening)에 의해 벼 유래 OsWRKY51 유전자의 부분 단편을 포함하는 클론을 선별할 수 있다. 이 클론의 유전자 단편을 3'-연장 및 5'-연장하므로써 전장(full length) DNA를 획득하고, 얻어진 전장 DNA를 게이트웨이 시스템(Gateway system)을 이용하여 식물 발현벡터인 pB2GW7에 삽입하여 재조합 발현벡터인 pB2GW7-OsWRKY51을 제작할 수 있다.

상기 숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 2)에 있어서, 얻어진 발현벡터(예컨대, pB2GW7-OsWRKY51)를 식물, 예컨대 벼 또는 애기장대에 도입하는 방법은 당업자에게는 공지된 것이며, 예를 들면, 진공을 이용한 형질전환법(Vacuum infiltration method), 화아 침지법(Floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method) 등이 있으며, 벼에 상기 유전자를 도입하는 방법은 캘러스(callus)를 유도하여 아그로박테리움과 공동배양하는 방법을 이용하는 것이 가장 바람직한 방법이다. 또한, 상기 발현벡터(예컨대, pB2GW7-OsWRKY51)를 아그로박테리움에 도입하는 방법은 당업자에게는 공지된 것이며, 예를 들면, 입자 충격법(particle bombardment), 일렉트로포레이션법(electroporation), 형질감염법(transfection), 리튬아세테이트법(lithium acetate method) 등이 있으며, 일렉트로포레이션법(electroporation)이 가장 바람직하다.

이와 같은 형질전환 기술은 조직배양을 거치지 않고 식물이 생장하는 상태 그대로 생장점 부위에 위치하는 세포들을 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포로부터 재분화하는 줄기에서 형질전환된 종자를 획득하여, 유전적으로 안정된 형질전환 식 물체를 획득할 수 있는 기술이다.

상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계 3)에 있어서, 선별방법은 숙주세포의 제초제 저항성을 이용하여 선별할 수 있는 데, 즉 선별마커로서 제초제 저항성 유전자 Bar를 포함하는 상기 발현벡터 pB2GW7-OsWRKY51가 도입된 숙주를 확인하기 위하여 종자를 획득 후 파종하여 제초제(basta)를 처리한 후 저항성을 나타내는 식물을 선별할 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시 예를 기재한다.

실시예 1: 벼(Osyza sativa)에서 cDNA library부터 OsWRKY51 유전자 분리

벼 도열병을 처리한 잎으로부터 mRNA를 분리하여 만든 cDNA 유전자 은행으로부터 플라스미드 DNA를 Wizard miniprep kit(Promega사제)로 분리하고, 염기 서열 분석 키트(sequencing kit, ABI사제)로 염기 서열 분석 반응을 시켜 염기 서열을 분석한 후, NCBI의 BlastX 프로그램을 이용하여 WRKY형의 전사인자임을 확인하였다. 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.

도 1a는 상기 벼 유래 OsWRKY51을 코딩(coading)하는 cDNA의 염기서열을 나타낸 것이고, 도 1b에는 그 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 1a 및 도 1b에 나타난 바와 같이 상기 OsWRKY51 유전자는 서열번호1로 기재되는 염기서열 전체 또는 그것의 일부로 이루어지며, 326개의 아미노산을 코드하는 981bp의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 포함하는 것을 특징으로 한다.

실시예 2: OsWRKY51 유전자의 발현양상

화청벼종자를 3일간 발아시켜 파종한 후 3주된 벼를 흙을 제거하고 1mM 살리실산(SA)으로 처리하였다. SA 처리 0, 6, 12, 24, 48시간 후에 잎으로부터 시료를 채취하였다. 벼 흰잎마름병균은 PSA배지(펜톤 10g, Na-글루타메이트 1g, 수크로스 10g/l, 한천 15g )에서 2일간 키운 후 1mM MgCl₂에 현탁시켜 OD₆₀₀에서 0.5로 조정하여 분무법으로 접종한 후 0, 6, 12, 24, 48시간 후에 시료를 채취하였다.

각각의 잎을 채취하여 트리졸(Trizol, Invitrogen Co.사제)을 이용하여 전장 RNA를 분리하였고 역전사 효소(reverse transcriptase) 반응을 통하여 cDNA를 만들고 OsWRKY51의 카르복실말단 부분을 증폭하기 위한 5' 특이 프라이머인 C(5'-ATGGATCTGATGGGTGGGTAC-3')와 3'특이 프라이머인 D(5'-GATGGTGACGATGAGCATGGA-3')를 이용하여 PCR을 수행하고, 병 방어 반응 마커유전자인 OsPR1의 5' 특이 프라이머인 E (5'-ATGGCAACCTCCAGCTTGCTAG-3')와 3' 특이 프라이머인 F (5'-GAAGACGCCGAGGCTGTTGTC-3'), 액틴(actin)의 5' 특이 프라이머인 G (5'-GTCTGCGATAATGGAACTGGTATGGTCAAGGCT-3')과 3' 특이 프라이머인 H (5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2는 OsWRKY51 유전자의 발현양상을 나타낸 사진이다. 도 2에서 SA는 살리실산(salicylic acid)의 약자이고, XOO는 Xanthomonas pryzae pv. oryzae의 약자이다.

도 2에 나타난 바와 같이, OsWRKY51은 벼 흰잎마름 병원균 처리후 12시간부터 발현이 유도되었으며, SA처리시에는 처리 후 6시간부터 발현이 유도되었다. 또한 OsPR1이 병원균 처리시 및 SA 처리시 유도되는 것으로부터 병 방어 반응이 제대로 유도됨을 알 수 있다. 이로부터 OsWRKY51은 병 저항성 유도 자극에 의해 특이적으로 유도됨을 알 수 있었다.

실시예 3: 형질전환용 운반체 작성 및 애기장대와 벼로의 형질전환

OsWRKY51 cDNA 클론(clone)으로 5' 프라이머 A (5'-AAAAAGCAGGCTCCATGATTACCATGGATCTGATGAGTGGG-3')와 3' 프라이머 B (5'-AGAAAGCTGGGTATCAGGTCTGGGGATTAGCGGT-3')로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)에 의해 증폭한 후, AttB1 (5'-G GGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T-3') 과 AttB2 (5'-GGG GAC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT-3')와 다시 PCR로 증폭하고, 게이트웨이 클로닝 시스템(Gateway cloning system, Invitrogen사제)을 이용하여 pDONOR221에 BP 반응에 의해 엔트리 클론(entry clone)을 만들었다.

이 엔트리 클론으로부터 식물발현 벡터인 pB2GW7에 LR 반응에 의해 식물발현용 벡터를 만들었다. 제조된 벡터의 지도를 도 3에 나타내었다.

상기 제조된 OsWRKY51형질전환용 벡터를 아크로박테리움(Agrobacterium)에 전기충격법(electrophoration)에 의해 도입시키고, 그 균을 이용하여 먼저 애기장대의 피지 않은 꽃망울에 분무법에 의해 접종하였다. 이후 T1종자를 채취하여 파종한 후 0.3% 바스터(Barstar) 분무를 이용하여 형질전환체를 선발하였으며, 다시 T2 종자를 채취하여 병 저항성 검정을 하였다.

OsWRKY51을 포함하는 아그로박테리움균으로 화청벼에서 유도된 캘리(calli)에 형질전환하였다. 껍질 벗긴 낙동 종자를 70% EtOH에서 1분, 50% 클록소(Clorox) 용액에서 15분씩 2회 소독하고, 멸균수로 10분씩 3회 이상 세척하였다. 소독한 종자는 2N6 배지(Hiei, Y. et al. 1994)에 치상하고 28℃, 암 상태에서 4주간 배양하여 배발생 캘러스(embryogenic callus)를 형성시킨 후, 새로운 2N6 배지에 옮겨 4일간 더 배양하였다. 형질전환을 위해 각 유전자를 갖고 있는 LBA4404 세포주(strain)들은 50㎎/ℓ 스펙디노마이신(spectinomycin), 10㎎/ℓ 테트라사이클린(tetracycline)을 포함하는 AB 한천 배지 전체에 고루 퍼지도록 접종하여 28℃에서 2일간 배양한 후 50㎎/ℓ 스펙티노마이신, 10㎎/ℓ 테트라사이클린을 포함하는 AAM 배지(Hiei, Y. et al. 1994)에 현탁하여 600mM에서 OD 1.8-2.0이 되도록 준비하였다. 새로운 배지에서 4일간 배양한 캘리와 각 세포주(strain)의 현탁액을 10분간 공동 배양(co-culture)한 후 2N6-AS 배지(Hiei, Y. et al. 1994)에 옮겨 23-25℃, 암 상태에서 3일간 배양하였다. 3일 후 캘리를 250㎎/ℓ 세포탁심(cefotaxime)을 포함한 멸균수로 수차례 세척하여 250㎎/ℓ 세포탁심과 6㎎/ℓ PPT(L-phosphinothricin)가 첨가된 2N6-CP 배지로 옮겨 28℃, 암상태에서 3주간 배양하였다. 3주 후 갈변하지 않고 생생한 캘리를 새로운 2N6-CP로 옮겨 2주간 더 배양하였다. 2주 후 살아남은 캘리를 30 g/ℓ 수크로오스(sucrose), 2 ㎎/ℓ 키네틴(kinetine), 0.5 ㎎/ℓ NAA, 250 ㎎/ℓ 세포탁심과 3 ㎎/ℓ PPT를 포함하는 MSR-CP(pH 5.8)로 옮겨 26℃, 항시 빛이 비치는 조건에서 한 달간 배양하였다. 한 달 후 새로운 MSR-CP로 옮겨 더 배양한 후 형성된 shoot를 30 g/ℓ수크로스를 포함하 는 MS0 (pH 5.8)에 옮겨 뿌리를 형성시켰다. 8일 후 뿌리가 잘 형성되면 순화과정을 거쳐 흙에 이식한 후 온실로 옮겼다. 식물체가 어느 정도 적응하면 제초제 (0.1% 바스타) 저항성을 확인하였다.

실시예 4: 애기장대와 벼 형질전환체의 분자생물학적 특성분석

0.1% 바스타에 저항성을 보이는 형질전환 벼에서 게놈(genomic) DNA를 분리하여, BAR 유전자의 존재유무를 BAR 유전자의 특이적인 5' 프라이머 C (5'-ACAGCGACCACGCTGTTGAA-3')와 3' 프라이머 D (5'-TGCACCATCGTCAACCACTA-3')로 55℃, 30瑛謙Ю PCR을 이용하여 검정하였다. 그 벼의 잎으로부터 총 RNA를 분리하여 역전사 효소(reverse transcriptase) 반응을 통하여 cDNA를 만들고, OsWRKY51 특이 프라이머인 A 와 B를 이용하여 PCR을 수행하고, 액틴의 5' 특이 프라이머 G (5'-GTC TGC GAT AAT GGA ACT GGT ATG GTC AAG GCT-3') 과 3' 특이 프라이머 H (5'-GTA CCC GCA TCA GGC ATC TG-3')를 이용하여 PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 4 및 도 5에 나타내었다.

도 4는 OsWRKY51의 애기장대 형질전환체의 RT-PCR에 의한 발현분석 결과를 나타낸 사진이고 도 5는 OsWRKY51의 벼 형질전환체의 RT-PCR에 의한 발현분석 결과를 나타낸 사진이다. 도 4 및 5에서 NT는 비형질 전환체(non-transgenic)인 대조구이고, #1 내지 #7은 실험구인 형질전환체이다.

상기 도 4 및 5에 나타난 바와 같이, OsWRKY51의 애기장대 형질전환체 및 OsWRKY51의 벼 형질전환체에서는 모두 OsWRKY51이 발현됨을 확인할 수 있다.

실시예 5: OsWRKY51 형질전환 식물의 병 저항성 검정

1) OsWRKY51 애기장대 형질전환체의 검은 썩음병에 대한 저항성 검정

OsWRKY51 형질전환 애기장대가 병에 대해 저항성을 보이는지 알아보기 위해, 검은 썩음병원균을 PSA배지에서 2일간 키운후 1mM MgCl₂에 현탁시켜 OD₆₀₀에서 0.5로 조정하여 접종원을 만들고, 가위를 접종원에 담갔다가 접종원이 묻어있는 가위로 벼 잎 끝을 자르는 클리핑법으로 벼에 벼 흰잎마름 병원균을 접종하였다.

접종후 14일후에 병원균이 진전되는 정도를 자로 재어, 검은 썩음병에 대한 저항성을 검정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내였다.

도 6은 OsWRKY51 애기장대 형질전환체의 검은 썩음병에 대한 저항성 검정 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 6에서 NT는 대조구로서 비형질 전환체(non-transgenic)이고, #1 내지 #4는 실험구인 형질전환체이다.

도 6에 나타난 바와 같이, 접종 후 14일이 지난 후 상기 병원균이 침투한 길이를 측정한 결과, 검은 썩음 현상이 비형질 전환체에서 뚜렷하게 나타났다. 이로부터 벼 유래 OsWRKY51 형질 전환체(#1, #2, #3, 및 #4)는 비 형질전환체(NT)에 비해 검정 썩음병원균 감염 저항성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

2) OsWRKY51 벼 형질전환체의 벼 흰잎마름병에 대한 저항성 검정

OsWRKY51형질전환 벼가 병에 대해 저항성을 보이는지 알아보기 위해, 벼 흰잎마름 병원균을 PSA배지에서 2일간 키운 후 1mM MgCl₂에 현탁시켜 OD₆₀₀에서 0.5로 조정하여 접종원을 만들고, 가위를 접종원에 담갔다가 접종원이 묻어있는 가위로 벼 잎 끝을 자르는 클리핑법으로 벼에 벼 흰잎마름 병원균을 접종하였다.

접종후 14일후에 병원균이 진전되는 정도를 자로 재어, OsWRKY51형질전환체의 벼 흰잎마름병에 대한 저항성을 검정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7은 OsWRKY51 벼 형질전환체의 흰잎마름병에 대한 저항성 검정 실험 결과를 나타낸 사진이다. 도 7에서 NT는 대조구로서 비형질 전환체(non-transgenic)이고, #1 내지 #7은 실험구로서 형질전환체이다.

도 7에 나타난 바와 같이 접종 후 14일이 지난 후 상기 병원균이 침투한 길이를 측정한 결과, 벼 흰잎마름 현상이 비형질 전환체에서 뚜렷하게 관찰되었다. 이로부터 벼 유래 OsWRKY51 형질 전환체(#1 내지 #7)는 비 형질전환체(NT)에 비해 벼 흰잎마름병원균 감염 저항성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

3) OsWRKY51형질전환체의 농업형질특성분석

OsWRKY51형질전환 벼의 농업 형질 특성을 분석하기 위하여, OsWRKY51형질전환 벼와 비형질전환 벼의 단간 표현형을 비교하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8은 OsWRKY51 벼 형질전환체의 표현형을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다. 도 8에서 NT는 대조구로서 비형질 전환체(non-transgenic)이고, #1 및 #3은 실험구로서 형질전환체이다.

도 8에 나타난 바와 같이 OsWRKY51형질전환 벼(#1 및 #3)은 비형질전환된 벼(NT)에 비해 키가 작은 드와피즘을 나타내었다. 이로부터 OsWRKY51의 유전자가 식물의 단간 표현형 발현을 유도함을 알 수 있다.
이상과 같이 본 은 양호한 실시 예에 근거하여 설명하였지만, 이러한 실시 예는 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 예시하려는 것이므로, 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련자라면 본 발명의 기술사상을 벗어남이 없이 위 실시 예에 대한 다양한 변화나 변경 또는 조절이 가능할 것이다. 그러므로, 본 발명의 보호 범위는 본 발명의 기술적 사상의 요지에 속하는 변화 예나 변경 예 또는 조절 예를 모두 포함하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1a는 OsWRKY51를 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸 도면이다.

도 1b는 상기 유전자의 아미노산 서열을 나타낸 도면이다.

도 2는 OsWRKY51 유전자의 발현양상을 나타낸 사진이다.

도 3은 OsWRKY51 유전자를 포함하는 벼 형질전환용 벡터지도를 나타내는 모식도이다.

도 4는 도 4는 OsWRKY51의 애기장대 형질전환체의 RT-PCR에 의한 발현분석 결과를 나타낸 사진이다.

도 5는 OsWRKY51의 벼 형질전환체의 RT-PCR에 의한 발현분석 결과를 나타낸 사진이다.

도 6은 OsWRKY51 애기장대 형질전환체의 검은 썩음병에 대한 저항성 검정 실험 결과를 나타낸 사진이다.

도 7은 OsWRKY51 벼 형질전환체의 흰잎마름병에 대한 저항성 검정 실험 결과를 나타낸 사진이다.

도 8은 OsWRKY51 벼 형질전환체의 표현형을 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.

<110> REPULIC OF KOREA(MANAGEMENT:RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> DISEASE RESISTANCE AND DWARF PHENOTYPE GENE ISOLATED FROM ORYZA SATIVA, EXPRESSION VECTOR CONTAINING GENE, TRANSFORMANT TRANSFORMED BY VECTOR AND METHOD FOR PREPARATION OF TRANSFORMANT <130> OsWRKY51 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 981 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atgattacca tggatctgat gggtgggtac gggcgggtgg acgagcaggt ggccatccag 60 gaggcggcgg cggcggggct aagggggatg gagcatctta ttctgcagct gtcccagact 120 gggacgagcg agaggtcgcc ggcgccggcg caggagcagc agcaacaggt ggactgcagg 180 gagatcacgg acatgacggt gtccaagttc aagaaggtga tctccatgct gaaccgcacc 240 ggccacgcgc ggttccggcg gggcccggtg gtggcgcagt cgtcgggccc ggcggcgtcc 300 gagccggcgc cggtgaggtc gtccccgtcg gcggtgtcga ggcccatgac gctcgacttc 360 accaaggcgg cgtccgggta cggcaaggac gccgggttca gcgtctccgg catctccgcc 420 gcgagctcgt ccttcctctc gtcggtcacc ggcgacggca gcgtgtccaa cgggcgcggc 480 ggcgggtcat cctccctgat gcttcccccg ccgccggcga ccagctgcgg caagccaccg 540 ctgtcctccg ccgccgccgc catgtcagcc ggcgcaggcc acaagcgcaa gtgccacgac 600 cacgcgcact ccgagaacgt cgccggcggc aagtacggat ccaccggcgg ccgctgccac 660 tgctccaagc gccggaagca tcgggtgaag aggacgatcc gcgtgccggc gataagctcg 720 aaggtggcgg acatccccgc cgacgacttc tcgtggcgga agtacgggca gaagcccatc 780 aagggctccc ccttcccacg aggatactac aagtgtagca cgctgcgcgg ttgcccggcg 840 aggaagcacg tggagcgcga cccgaccgac ccgtccatgc tcatcgtcac ctacgagggc 900 gagcaccgcc actccccctc cgccgccggc caggaccacc cgccggcgcc gcctccgccg 960 ctggcgctgc cgctcgcctg a 981

Claims

서열번호 1로 기재되는 염기서열로 이루어지며, 벼 유래의 병 저항성 및 단간 유도 OsWRKY51 유전자를 포함하는 발현 벡터 pB2GW7-OsWRKY51에 의해 형질 전환된 아그로박테리움 형질전환체로 형질 전환된 것을 특징으로 하는 식물세포 형질 전환체.
프로모터 활성을 나타내는 DNA 서열과 작동가능하게 연결되며, 서열번호 1의 염기서열로 이루어지는 벼 유래의 OsWRKY51 DNA 서열을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계와;

숙주세포에 상기 발현벡터를 도입하는 단계 및;

상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 선별하는 단계;

에 의해 OsWRKY51 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 하는 식물세포 형질 전환체의 제조방법.
제2항에 있어서,

상기 숙주세포는 아그로박테리움, 또는 식물세포인 것을 특징으로 하는 식물세포 형질 전환체의 제조방법.