KR100945104B1 - Modulation of immunostimulatory properties of oligonucleotide-based compounds by optimal presentation of 5' ends - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역요법 분야에서의 면역자극제로서의 올리고뉴클레오티드의 치료적 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 면역 반응을 발생하기 위한 방법 또는 면역자극이 필요한 환자를 치료하기 위한 방법에 사용되는 이뮤노머를 제공한다. 본 발명의 이뮤노머는 3' 말단, 뉴클레오시드간 연결부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고뉴클레오티드중 하나 이상은 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 가지고 있다.The present invention relates to the therapeutic use of oligonucleotides as immunostimulating agents in the field of immunotherapy. More specifically, the present invention provides immunomers for use in a method for generating an immune response or for treating a patient in need of immunostimulation. Immunomers of the invention comprise two or more oligonucleotides linked to a non-nucleotide linker at the 3 'end, an internucleoside linkage or functionalized nucleobase or sugar, wherein at least one of these oligonucleotides is an immunostimulatory oligo It is a nucleotide and has an accessible 5 'end.

Description

5' 말단의 최적 제공에 의한 올리고뉴클레오티드-기초 화합물의 면역자극 특성의 조절{MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY PROPERTIES OF OLIGONUCLEOTIDE-BASED COMPOUNDS BY OPTIMAL PRESENTATION OF 5' ENDS}MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY PROPERTIES OF OLIGONUCLEOTIDE-BASED COMPOUNDS BY OPTIMAL PRESENTATION OF 5 'ENDS}

본 발명은 면역자극제로서 올리고뉴클레오티드를 사용하는 면역학 및 면역요법 분야에 관한 것이다. The present invention relates to the field of immunology and immunotherapy using oligonucleotides as immunostimulants.

올리고뉴클레오티드는 진단용 프로브 방법으로부터 PCR에서 유전자 발현의 안티센스 억제 및 면역요법 분야에 이르기까지 광범위한 기법에 사용되는, 현대 분자 생물학에서는 없어서는 안되는 도구가 되어왔다. 올리고뉴클레오티드의 이러한 광범위한 사용은 올리고뉴클레오티드를 합성하는 신속하고 효과적이면서도 값싼 방법에 대한 요구가 증가하는 추세를 낳았다. Oligonucleotides have become an indispensable tool in modern molecular biology, ranging from diagnostic probe methods to the field of PCR to antisense inhibition and immunotherapy of gene expression. This widespread use of oligonucleotides has led to an increasing demand for rapid, effective and inexpensive methods of synthesizing oligonucleotides.

안티센스 및 진단적 적용을 위한 올리고뉴클레오티드의 합성은 현재 일상적으로 이루어질 수 있다 (Methods in Molecular Biology, Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp.165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993) ; Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, ed., 1991); 및 Uhlmann & Peyman, supra; Agrawal and lyer, Curr. Op. in Biotech. 6:12 (1995); 및 Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds., CRC Press, Boca Raton, 1993)). 초기의 합성 방법은 포스포디에스테르 및 포스포트리에스테르 화학을 포함하였다. 예컨대 코라나 등은 올리고뉴클레오티드 합성에 대한 포스포디에스테르 화학을 개시하였다 (Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209 (1972)). 리스는 문헌에서 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 합성을 위한 포스포트리에스테르 화학을 개시하였다 (Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143-3179 (1978)). 이들 초기 방법은 합성에 대한 보다 효율적인 포스포라미다이트 및 H-포스포네이트 방법에 대한 길을 대대적으로 열어주었다. 예를 들어 뷰케이지와 카루테르는 폴리뉴클레오티드 합성에서 데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트를 사용하는 것에 대해 개시하였다 (Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981)). 아그라월과 잠멕닉은 미국 특허 제 5,149,798호 (1992)에서 H-포스포네이트 방법에 의한 올리고뉴클레오티드의 최적화된 합성을 개시하였다. 이들 현대적인 방법 둘 모두는 다양한 변형된 뉴클레오티드간 연결을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위해 사용되었다. 아그라월과 굿차일드는 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 메틸포스포네이트의 합성을 문헌에서 교시하였다 (Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539-3542 (1987)). 커널리 등은 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포로티오에이트의 합성을 개시하였다 (Connolly et al., Biochem. 23:3443 (1984)). 제이거 등은 포스포라미다이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트의 합성을 개시하였다 (Jager et al., Biochem. 27:7237 (1988)). 아그라월 등은 H-포스포네이트 화학을 사용하는 올리고뉴클레오티드 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트의 합성을 개시하였다 (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7079-7083 (1988)). Synthesis of oligonucleotides for antisense and diagnostic applications can now be routinely performed ( Methods in Molecular Biology , Vol. 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal, ed., Humana Press, 1993). Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach , pp. 87-108 (F. Eckstein, ed., 1991); and Uhlmann & Peyman, supra; Agrawal and lyer, Curr. Op. In Biotech. 6:12 (1995) And Antisense Research and Applications (Crooke and Lebleu, eds., CRC Press, Boca Raton, 1993). Initial synthesis methods included phosphodiester and phosphoriester chemistry. Corana et al. Disclosed phosphodiester chemistry for oligonucleotide synthesis (Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972)). Lys discloses phosphoesterester chemistry for the synthesis of oligonucleotides and polynucleotides in literature (Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)). These early methods have paved the way for more efficient phosphoramidite and H-phosphonate methods for synthesis. Buccage and Carruter, for example, disclosed the use of deoxyribonucleoside phosphoramidites in polynucleotide synthesis (Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)). Agrawall and Zammecnick disclosed optimized synthesis of oligonucleotides by the H-phosphonate method in US Pat. No. 5,149,798 (1992). Both of these modern methods have been used to synthesize oligonucleotides with various modified internucleotide linkages. Agrawal and Goodchild taught in the literature the synthesis of oligonucleotide methylphosphonates using phosphoramidite chemistry (Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)). Kerriy et al. Disclosed the synthesis of oligonucleotide phosphorothioates using phosphoramidite chemistry (Connolly et al., Biochem. 23: 3443 (1984)). Jager et al. Disclosed the synthesis of oligonucleotide phosphoramidates using phosphoramidite chemistry (Jager et al., Biochem. 27: 7237 (1988)). Agrawal et al. Disclosed the synthesis of oligonucleotide phosphoramidates and phosphorothioates using H-phosphonate chemistry (Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 7079- 7083 (1988)).

보다 최근에 이르러, 여러 연구자들에 의해 면역요법 분야에서 면역자극제로서의 올리고뉴클레오티드의 사용의 타당성이 입증되었다. 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 면역 자극을 유도할 수 있다는 관찰은 이러한 부수 효과를 치료적 도구로서 개발하는 데에 있어서 관심을 불러 일으켰다. 이런 노력들은 디뉴클레오티드 천연 CpG를 함유하고 있는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드에 초점이 모아졌다. 구라모토 등은 CpG 디뉴클레오티드를 포함하는 팔린드롬 (palindrome)을 함유하고 있는 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드가 인터페론-알파 및 감마 합성을 유도하고 천연 킬러 활성을 증강시킬 수 있다고 교시하고 있다 (Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83:1128-1131 (1992)). 크리그 등은 포스포로티오에이트 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 면역자극성이라는 것을 개시하였다 (Krieg et al., Nature 371:546-549 (1995)). 리앙 등은 그러한 올리고뉴클레오티드가 사람 B 세포를 활성화시킨다고 설명하였다 (Liang et al., J. Clin. Invest. 98:1119-1129 (1996)). 몰도베뉴 등은 CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 증강시킨다고 교시하였다 (Moldoveanu et al., Vaccine 16:1216-124 (1998)). 맥클러스키와 데이비스는 CpG-함유 올리고뉴클레오티드가 강력한 보조제로서 작용하여 B형 간염 표면 항원에 대한 면역 반응을 증강시킨다고 교시하였다 (McCluskie and Davis, J. Immunol. 161: 4463-4466 (1998)). More recently, several researchers have justified the use of oligonucleotides as immunostimulants in the field of immunotherapy. The observation that phosphodiester and phosphorothioate oligonucleotides can induce immune stimulation has raised interest in developing this side effect as a therapeutic tool. These efforts have focused on phosphorothioate oligonucleotides containing dinucleotide native CpG. Kuramoto et al. Teach that phosphodiester oligonucleotides containing palindromes, including CpG dinucleotides, can induce interferon-alpha and gamma synthesis and enhance natural killer activity (Kuramoto et al., Jpn.J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992). Krig et al. Disclosed that phosphorothioate CpG-containing oligonucleotides are immunostimulatory (Krieg et al., Nature 371: 546-549 (1995)). Liang et al. Described that such oligonucleotides activate human B cells (Liang et al., J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)). Moldovevene et al. Taught that CpG-containing phosphorothioate oligonucleotides enhance the immune response to influenza viruses (Moldoveanu et al., Vaccine 16: 1216-124 (1998)). McCluskey and Davis taught that CpG-containing oligonucleotides act as potent adjuvant to enhance the immune response to hepatitis B surface antigen (McCluskie and Davis, J. Immunol. 161: 4463-4466 (1998)).

CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 다른 변형도 면역 반응의 조절제로서 작용하는 이들의 능력에 또한 영향을 줄 수 있다 (참조: Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51:173-182; Zhao et al., Biochem Pharmacol. (1996) 52:1537-1544; Zhao et al., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. (l997) 7:495-502; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (1999) 9:3453-3458; Zhao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:1051-1054; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2000) 10:2585-2588; Yu et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. (2001) 11:2263-2267; 및 Kandimalla et al., Bioorg. Med. Chem. (2001) 9:807-813). Other modifications of CpG-containing phosphorothioate oligonucleotides can also affect their ability to act as modulators of the immune response (see Zhao et al., Biochem. Pharmacol. (1996) 51: 173-182) . ; Zhao et al, Biochem Pharmacol ( 1996) 52:.. 1537-1544; Zhao et al, Antisense Nucleic Acid Drug Dev (l997) 7:...... 495-502; Zhao et al, Bioorg Med Chem Lett . (1999) 9:.. ... 3453-3458; Zhao et al, Bioorg Med Chem Lett (2000) 10:..... 1051-1054; Yu et al, Bioorg Med Chem Lett (2000) 10: 2585-2588; Yu et al., Bioorg.Med . Chem. Lett. (2001) 11: 2263-2267; and Kandimalla et al., Bioorg.Med . Chem. (2001) 9: 807-813).

이들 보고는 면역자극성 올리고뉴클레오티드에 의해 야기된 면역 반응을 증강시킬 필요성이 있음을 명백히 보여준다.These reports clearly show the need for enhancing the immune response caused by immunostimulatory oligonucleotides.

발명의 개요Summary of the Invention

본 발명은 올리고뉴클레오티드 화합물에 의해 유발되는 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 면역요법 적용을 위해 면역자극 올리고뉴클레오티드의 면역자극 효과를 증가시킬 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 면역자극 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 최적으로 제공하는 변형이 그 올리고뉴클레오티드의 면역 자극 능력을 극적으로 증강시킨다는 것을 발견하였다. 그러한 올리고뉴클레오티드를 본원에서는 "이뮤노머(immunomer)" 로 언급한다. The present invention provides a method for enhancing an immune response induced by an oligonucleotide compound. The method according to the invention can increase the immunostimulatory effect of immunostimulatory oligonucleotides for immunotherapy applications. The inventors have surprisingly found that modifications that optimally provide the 5 'end of an immunostimulatory oligonucleotide dramatically enhance the immune stimulating ability of the oligonucleotide. Such oligonucleotides are referred to herein as "immunomers."

그러므로, 제 1 측면으로, 본 발명은 3' 말단, 뉴클레오티드간 연결부, 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고뉴클레오티드중 하나 이상이 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 지닌 이뮤노머를 제공한다. Thus, in a first aspect, the present invention includes two or more oligonucleotides linked via a non-nucleotide linker at a 3 ′ end, an internucleotide linkage, or a functionalized nucleobase or sugar, wherein at least one of these oligonucleotides This immunostimulatory oligonucleotide provides an immunomer with an accessible 5 'end.

한 구체예에서 이뮤노머는 식 5'-Pyr-Pur-3'의 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하는데, 상기 식에서 Pyr은 천연 또는 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고, Pur은 천연 또는 비-천연 푸린 뉴클레오시드이다. In one embodiment the immunomer comprises an immunostimulatory oligonucleotide of formula 5'-Pyr-Pur-3 'wherein Pyr is a natural or non-natural pyrimidine nucleoside and Pur is a natural or non-natural purine Nucleoside.

또 다른 구체예에서 이뮤노머는 CpG, C*pG, CpG*, 및 C*pG*로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는데, 여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*은 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된아라비노시티딘, 2'-O-치환된아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이며, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*은 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오시드간 연결이다. 특정한 바람직한 구체예에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG가 아니다. In another embodiment the immunomers comprise immunostimulatory dinucleotides selected from the group consisting of CpG, C * pG, CpG * , and C * pG * , wherein C is cytidine or 2′-deoxycytidine, C * is 2'-deoxythymidine, arabinocytidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinocytidine, 2'-O-substituted arabinocytidine, 2'-deoxy- 5-hydroxycytidine, 2'-deoxy-N4-alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thiouridine or other non-natural pyrimidine nucleosides, G is guanosine or 2 '-Deoxyguanosine, G * is substituted with 2' deoxy-7-deazaguanosine, 2'-deoxy-6-thioguanosine, arabinoguanosine, 2'-deoxy-2 ' -Arabinoguanosine, 2'-O-substituted-arabinoguanosine, or other non-natural purine nucleosides, p consisting of phosphodiester, phosphorothioate, and phosphorodithioate From the military Selected internucleoside linkages. In certain preferred embodiments, the immunostimulatory dinucleotide is not CpG.

또 다른 구체예에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하기 식 (III)의 면역자극성 도메인을 포함한다: In another embodiment, the immunostimulatory oligonucleotide comprises an immunostimulatory domain of formula ( III ):

5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3' (III) 5'-Nn-N1-YZ-N1-Nn-3 ' (III)

상기 식에서, Where

Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고;Y is cytidine, 2'-deoxythymidine, 2'-deoxycytidine, arabinositidine, 2'-deoxythymidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinocytidine, 2'-O-substituted arabinocytidine, 2'-deoxy-5-hydroxycytidine, 2'-deoxy-N4-alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thiouridine or Other non-natural pyrimidine nucleosides;

Z는 구아노신, 2'-데옥시구아노신, 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이고; Z is guanosine, 2'-deoxyguanosine, 2 'deoxy-7-deazaguanosine, 2'-deoxy-6-thioguanosine, arabinoguanosine, 2'-deoxy-2' Substituted-arabinoguanosine, 2'-0-substituted-arabinoguanosine, 2'-deoxyinosine, or other non-natural purine nucleosides;

N1은 각각 바람직하게는 천연 또는 합성 뉴클레오시드, 또는 비염기성(abasic) 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결을 통해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은, 제한없이, 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로부터 선택되고; Each N1 is preferably a natural or synthetic nucleoside, or abasic nucleoside, arabinonucleoside, 2'-deoxyuridine, α-deoxyribonucleoside, β-L- An immunostimulatory moiety selected from the group consisting of deoxyribonucleosides and nucleosides linked 3 ′ to adjacent nucleosides via phosphodiester or modified internucleoside linkages, wherein the internucleosides are modified The linkage is, without limitation, a linker having a length of about 2 kPa to about 200 kPa, C2-C18 alkyl linker, poly (ethylene glycol) linker, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker, glyceryl linker, 2 '-5' internucleoside linkage, and phosphorothioate, phosphorodithioate, or methylphosphonate internucleoside linkage;

Nn은 각각 천연 뉴클레오시드 또는 면역자극성 부분이며, 바람직하게는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 및 변형된 뉴클레오시드간 연결을 통해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은 아미노 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Nn is a natural nucleoside or immunostimulatory moiety, respectively, preferably a nonbasic nucleoside, arabinucleoside, 2'-deoxyuridine, α-deoxyribonucleoside, 2'-0- Substituted ribonucleosides, and nucleosides linked 3 ′ to adjacent nucleosides through modified internucleoside linkages, wherein the modified internucleoside linkages are amino linkers, 2 ′ -5 'internucleoside linkage, and methylphosphonate internucleoside linkage;

단, N1 또는 Nn 중 최소한 하나는 면역자극성 부분이며; Provided that at least one of N1 or Nn is an immunostimulatory moiety;

n은 0 내지 30의 수이고;n is a number from 0 to 30;

3' 말단, 뉴클레오티드간 연결부, 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당은 면역자극성일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 또 다른 올리고뉴클레오티드 직접 연결되거나 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된다. The 3 ′ end, internucleotide linkage, or functionalized nucleobase or sugar may be linked directly via another oligonucleotide, which may or may not be immunostimulatory, or via a non-nucleotide linker.

제 2의 측면으로, 본 발명은 상기 설명된 이뮤노머 및 접근가능한 5' 말단 외의 위치에서 이뮤노머에 컨쥬게이션된 항원을 포함하는 이뮤노머 컨쥬게이트를 제공한다. In a second aspect, the present invention provides an immunoconjugate comprising an immunoconjugate and an antigen conjugated to an immunoomer at a position other than the accessible 5 'end as described above.

제 3 측면으로 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. In a third aspect the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising an immunoomer or an immunoconjugate according to the invention and a physiologically acceptable carrier.

제 4 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 척추동물에게 투여하는 것을 포함하여 척추동물에게서 면역 반응을 생성하기 위한 방법을 제공한다. 몇몇 구체예에서, 척추동물은 포유류이다. In a fourth aspect, the present invention provides a method for generating an immune response in a vertebrate, including administering an immunomer or an immunoconjugate according to the invention to a vertebrate. In some embodiments, the vertebrate is a mammal.

제 5 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이 트를 환자에게 투여하는 것을 포함하여 질병 또는 장애에 걸린 환자를 치료적으로 처리하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서, 치료될 질병 또는 장애는 암, 자가면역 질병, 기도 염증, 천식, 알레르기, 또는 병원체에 의해 유발되는 질병이다.In a fifth aspect, the present invention provides a method of therapeutically treating a patient with a disease or disorder, comprising administering an immunomer or an immunoconjugate to a patient according to the present invention. In various embodiments, the disease or disorder to be treated is cancer, autoimmune disease, airway inflammation, asthma, allergies, or a disease caused by a pathogen.

도 1은 본 발명의 대표적인 이뮤노머의 개략적인 도면이다. 1 is a schematic diagram of a representative immunomer of the present invention.

도 2는 본 발명의 여러가지 대표적인 이뮤노머를 도시한다. 2 illustrates various representative immunomers of the present invention.

도 3은 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성을 위해 적합한 대표적인 작은 분자 링커의 군을 도시한다. 3 depicts a group of representative small molecular linkers suitable for linear synthesis of immunomers of the present invention.

도 4는 본 발명의 이뮤노머의 병렬 합성을 위해 적합한 대표적인 작은 분자 링커의 군을 도시한다. 4 depicts a group of representative small molecular linkers suitable for parallel synthesis of immunomers of the present invention.

도 5는 본 발명의 이뮤노머의 선형 합성에 대한 합성 반응식이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸. 5 is a synthetic scheme for the linear synthesis of the immunomers of the present invention. DMTr = 4,4'-dimethoxytrityl; CE = cyanoethyl.

도 6은 본 발명의 이뮤노머의 병렬 합성에 대한 합성 반응식이다. DMTr = 4,4'-디메톡시트리틸; CE = 시아노에틸. 6 is a synthetic scheme for the parallel synthesis of immunomers of the present invention. DMTr = 4,4'-dimethoxytrityl; CE = cyanoethyl.

도 7a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서의 이뮤노머 1 내지 3에 의한 IL-12의 유도를 그래프로 도시한다. 이들 데이터는 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 2가 단량체 올리고 1 보다 더 강한 IL-12의 유도인자라는 것과, 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 3이 올리고 1을 사용할 때와 비교하여 면역 자극을 생성하는데 동일하거나 더 약한 능력을 가지고 있음을 시사한다. 7A graphically depicts the induction of IL-12 by immunomers 1-3 in BALB / c mouse spleen cell culture. These data show that immunomer 2 with accessible 5'-end is an inducer of IL-12 which is stronger than monomer oligo 1, compared to when immunomer 3 without accessible 5'-end uses oligo 1 Suggesting that they have the same or weaker capacity to produce immune stimuli.

도 7b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서의 이뮤노머 1 내지 3에 의한 IL-6의 유도 (각각 상부에서 바닥까지)를 그래프로 도시한다. 이들 데이터는 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 2가 단량체 올리고 1 보다 더 강한 IL-6의 유도인자라는 것과, 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 3은 올리고 1을 사용할 때와 비교하여 면역 자극을 생성하는데 동일하거나 더 약한 능력을 가지고 있음을 시사한다. 7B graphically depicts the induction of IL-6 (each from top to bottom) by immunomers 1-3 in BALB / c mouse spleen cell cultures. These data show that immunomer 2 with accessible 5'-end is an inducer of IL-6 stronger than monomer oligo 1, and that immunoless 3 without accessible 5'-end compared with oligo 1 Suggesting that they have the same or weaker capacity to produce immune stimuli.

도 7c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서의 이뮤노머 1 내지 3에 의한 IL-10의 유도 (각각 상부에서 바닥까지)를 그래프로 도시한다. FIG. 7C graphically depicts the induction of IL-10 (from top to bottom, respectively) by immunomers 1-3 in BALB / c mouse spleen cell culture.

도 8a는 각각 이용불가능한 5'-말단과 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 다양한 농도의 이뮤노머 5와 6에 의한, 세포 배양물중에서의 BALB/c 마우스 비장 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. FIG. 8A graphically depicts the induction of BALB / c mouse spleen cell proliferation in cell culture by various concentrations of immunomers 5 and 6 having 5'-ends and 5'-ends unavailable respectively. .

도 8b는 CpG 모티프의 5'-플랭킹 (flanking) 서열에서 면역원성 화학적 변형이 일어난 이뮤노머 4 내지 6에 의한 BALB/c 마우스 비장 비대를 그래프로 도시한다. 다시 말하면, 접근가능한 5'-말단을 가지고 있는 이뮤노머 6은 접근가능한 5'-말단이 없는 이뮤노머 5 및 단량체 올리고 4와 비교할 때 비장 비대를 증가시키는 능력이 보다 크다. FIG. 8B graphically depicts BALB / c mouse splenomegaly by immunomers 4 to 6 in which immunogenic chemical modifications occurred in the 5′-flanking sequence of the CpG motif. In other words, immunomer 6 with an accessible 5'-end has a greater ability to increase splenomegaly when compared to an immunomer 5 and a monomer oligo 4 without an accessible 5'-end.

도 9a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-12의 유도를 그래프로 도시한다. 9A graphically depicts induction of IL-12 by various concentrations of oligo 4 and immunomers 7 and 8 in BALB / c mouse spleen cell culture.

도 9b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-6의 유도를 그래프로 도시한다. 9B graphically depicts the induction of IL-6 by varying concentrations of oligo 4 and immunomers 7 and 8 in BALB / c mouse spleen cell culture.

도 9c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 이뮤노머 7과 8에 의한 IL-10의 유도를 그래프로 도시한다. 9C graphically depicts the induction of IL-10 by various concentrations of oligo 4 and immunomers 7 and 8 in BALB / c mouse spleen cell culture.

도 10a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 이뮤노머 14, 15 및 16에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. 10A graphically depicts the induction of cell proliferation by immunomers 14, 15 and 16 in BALB / c mouse spleen cell cultures.

도 10b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 이뮤노머 14 및 16에 의한 IL-12에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. 10B graphically depicts the induction of cell proliferation by IL-12 by various concentrations of immunomers 14 and 16 in BALB / c mouse spleen cell culture.

도 10c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 이뮤노머 14 및 16에 의한 IL-6에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. 10C graphically depicts the induction of cell proliferation by IL-6 by various concentrations of immunomers 14 and 16 in BALB / c mouse spleen cell culture.

도 11a는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. 11A graphically depicts the induction of cell proliferation by oligos 4 and 17 and immunomers 19 and 20 in BALB / c mouse spleen cell cultures.

도 11b는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 IL-12에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. 11B graphically depicts the induction of cell proliferation by IL-12 by varying concentrations of oligos 4 and 17 and immunomers 19 and 20 in BALB / c mouse spleen cell cultures.

도 11c는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 다양한 농도의 올리고 4 및 17과 이뮤노머 19 및 20에 의한 IL-6에 의한 세포 증식의 유도를 그래프로 도시한다. 11C graphically depicts the induction of cell proliferation by IL-6 by varying concentrations of oligos 4 and 17 and immunomers 19 and 20 in BALB / c mouse spleen cell cultures.

도 12는 올리고뉴클레오티드 4 및 이뮤노머 14, 23 및 24를 사용한 BALB/c 마우스 비장 비대를 그래프로 도시한다. 12 graphically depicts BALB / c mouse splenomegaly with oligonucleotide 4 and immunomers 14, 23 and 24.

도 13은 비-뉴클레오티드 연결이 뉴클레오염기에 있는 뉴클레오시드에 3' 위치, 또는 2' 위치에서 부착될 수 있음을 보여주는, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드의 개략도이다. FIG. 13 is a schematic of the 3′-terminal nucleoside of an oligonucleotide, showing that non-nucleotide linkage may be attached at the 3 ′ or 2 ′ position to a nucleoside at a nucleobase. FIG.

도 14는 실시예 13에서 사용된 화학적 치환을 도시한다. 14 shows the chemical substitutions used in Example 13. FIG.

도 15는 실시예 13의 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어진 시토킨 프로필을 도시한다. FIG. 15 shows cytokine profiles obtained using the modified oligonucleotides of Example 13.

도 16은 아미노 링커와 비교하여 글리세롤 링커에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. FIG. 16 depicts relative cytokine induction for glycerol linkers compared to amino linkers.

도 17은 다양한 링커 및 링커 조합물에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. 17 shows relative cytokine induction for various linkers and linker combinations.

도 18a 내지 18e는 다양한 PS 및 PO 이뮤노머와 올리고뉴클레오티드에 대한 상대적인 뉴클레아제 내성을 도시한다. 18A-18E show the relative nuclease resistance to various PS and PO immunomers and oligonucleotides.

도 19는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. FIG. 19 shows relative cytokine induction for PO immunoomers as compared to PS immunoomers in BALB / c mouse spleen cell culture.

도 20은 C3H/Hej 마우스 비장 세포 배양물중에서 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다. FIG. 20 shows relative cytokine induction for PO immunoomers compared to PS immunoomers in C3H / Hej mouse spleen cell cultures.

도 21은 고농도의 이뮤노머에서 C3H/Hej 마우스 비장 세포 배양물중에서의 PS 이뮤노머와 비교하여 PO 이뮤노머에 대한 상대적인 시토킨 유도를 도시한다.FIG. 21 shows relative cytokine induction for PO immunoomers compared to PS immunoomers in C3H / Hej mouse spleen cell cultures at high concentrations of immunomers.

본 발명은 면역요법 적용을 위한 면역자극제로서의 올리고뉴클레오티드의 치료적 용도에 관한 것이다. 본원에서 인용되는 공개 특허, 특허 출원 및 참고문헌들은 본원에 참고로 삽입된다. 본원에서 인용된 참고문헌이 교시하는 것과 본 발명의 상세한 설명이 일치하지 않는 경우, 본 발명의 목적상, 본 발명의 상세한 설명이 우선한다. The present invention relates to the therapeutic use of oligonucleotides as immunostimulating agents for immunotherapy applications. Publications, patent applications, and references cited herein are hereby incorporated by reference. In the event that the references cited herein and the detailed description of the invention do not coincide, for the purposes of the present invention, the detailed description of the invention takes precedence.

본 발명은 면역요법 분야, 예컨대, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 성인 및 소아 및 수의학 분야에서의 암, 자가면역 질병, 천식, 호흡기 알레르기, 음식 알레르기, 및 세균, 기생충, 및 바이러스 감염의 치료에 사용되는 면역자극성 화합물에 의해 유발된 면역 반응을 증강시키는 방법을 제공한다. 그러므로, 본 발명은 또한 면역요법을 위한 최적 수준의 면역자극성 효과를 가지는 화합물 및 이러한 화합물의 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 이뮤노머는 DNA 백신, 항체, 알레르겐, 화학요법제, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드와 함께 사용되는 보조제(adjuvant)로서 유용하다. The invention is used in the treatment of immunotherapy, such as, but not limited to, cancer, autoimmune diseases, asthma, respiratory allergies, food allergies, and bacterial, parasite, and viral infections in the adult and pediatric and veterinary fields. Provided are methods for enhancing an immune response induced by an immunostimulatory compound. Therefore, the present invention also provides compounds having optimal levels of immunostimulatory effects for immunotherapy and methods of making and using such compounds. The immunomers of the invention are also useful as adjuvants for use with DNA vaccines, antibodies, allergens, chemotherapeutic agents, and antisense oligonucleotides.

본 발명자들은 놀랍게도 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 5' 말단을 최적으로 제공하는 변형이 그 올리고뉴클레오티드의 면역자극성 능력에 극적으로 영향을 준다는 것을 발견하였다. 그러한 올리고뉴클레오티드를 본원에서는 "이뮤노머"로 언급한다. The inventors have surprisingly found that modifications that optimally provide the 5 'terminus of an immunostimulatory oligonucleotide dramatically affect the immunostimulatory capacity of the oligonucleotide. Such oligonucleotides are referred to herein as "immunomers".

제 1 측면으로, 본 발명은 3' 말단, 또는 뉴클레오시드간 연결부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고뉴클레오티드중 하나 이상은 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 지닌 이뮤노머를 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "접근가능한 5' 말단"이란 올리고뉴클레오티드의 5' 말단이 이뮤노머를 인지하고 이것에 결합하여 면역계를 자극하는 인자들이 이것에 접근하도록 충분히 접근가능함을 의미한다. 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드에서, 말단 당의 5' OH 위치는 2개 이상의 뉴클레오시드 잔기에 공유결합되지 않는다. 임의로, 5' OH는 포스페이트, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 부분, 방향족 또는 지방족 링커, 콜레스테롤, 또는 접근성을 방해하지 않는 또 다른 물질에 연결될 수 있다. In a first aspect, the invention comprises two or more oligonucleotides linked to a non-nucleotide linker at the 3 'end, or an internucleoside linkage or functionalized nucleobase or sugar, wherein at least one of these oligonucleotides is Provided are immunostimulatory oligonucleotides and immunomers with accessible 5 ′ ends. As used herein, the term “accessible 5 ′ end” means that the 5 ′ end of the oligonucleotide is sufficiently accessible for those factors that recognize and bind to the immunonomer and stimulate the immune system to access it. In oligonucleotides having an accessible 5 'end, the 5' OH position of the terminal sugar is not covalently bound to two or more nucleoside residues. Optionally, the 5'OH can be linked to the phosphate, phosphorothioate, or phosphorodithioate moieties, aromatic or aliphatic linkers, cholesterol, or another substance that does not interfere with accessibility.

본 발명의 목적상, "이뮤노머"는 3' 말단, 또는 뉴클레오시드간 연결부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 직접 또는 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 올리고뉴클레오티드 (이뮤노머와 관련하여)중 하나 이상이 면역자극성 올리고뉴클레오티드이고 접근가능한 5' 말단을 가지는 임의의 화합물을 의미하는데, 이 화합물은 척추동물에 투여될 때 면역 반응을 유도한다. 어떤 구체예에서 척추동물은 사람을 포함한 포유류이다. For the purposes of the present invention, an “immunomer” comprises two or more oligonucleotides linked directly or via a non-nucleotide linker at the 3 ′ end, or internucleoside linkage or functionalized nucleobase or sugar, and such By one or more of the oligonucleotides (with respect to the immunoomer) is an immunostimulatory oligonucleotide and refers to any compound having an accessible 5 ′ end, which compound induces an immune response when administered to a vertebrate. In some embodiments, the vertebrate is a mammal, including a human.

어떤 구체예에서, 이뮤노머는 동일하거나 상이한 둘 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드 (이뮤노머와 관련하여)를 포함한다. 바람직하게는, 각각의 그러한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 접근가능한 5' 말단을 갖는다. In some embodiments, an immunomer comprises two or more immunostimulatory oligonucleotides (with respect to an immunoomer) that are the same or different. Preferably each such immunostimulatory oligonucleotide has one or more accessible 5 'ends.

특정 구체예에 있어서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드(들) 이외에, 이뮤노머는 또한 유전자에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "상보적인"은 생리적 조건하에서 유전자 영역에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 어떤 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 유전자의 발현을 하향조절한다. 그러한 하향조절성 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임 올리고뉴클레오티드, 작은 억제성 RNA 및 유인(decoy) 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본원에서 사용되는 용어 "유전자를 하향조절한다"는 것은 유전자의 전사 또는 유전자 생성물의 번역을 억제하는 것을 의미한다. 그러므로 본 발명의 이들 구체예에 따른 이뮤노머는 면역계를 여전히 자극하면서도 하나 이상의 특이한 질병 표적을 표적화하는 데 사용될 수 있다. In certain embodiments, in addition to the immunostimulatory oligonucleotide (s), the immunomer also includes one or more oligonucleotides that are complementary to the gene. As used herein, the term “complementary” refers to an oligonucleotide that hybridizes to a gene region under physiological conditions. In some embodiments, oligonucleotides downregulate expression of genes. Such downregulated oligonucleotides are preferably selected from the group consisting of antisense oligonucleotides, ribozyme oligonucleotides, small inhibitory RNAs and decoy oligonucleotides. As used herein, the term "downregulates a gene" means inhibiting transcription of a gene or translation of a gene product. Thus immunomers according to these embodiments of the present invention can be used to target one or more specific disease targets while still stimulating the immune system.

특정 구체예에서, 이뮤노머는 리보자임 또는 유인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "리보자임"은 촉매적 활성을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 바람직하게는 리보자임은 특이한 핵산 표적에 결합하여 그 표적을 절단한다. 본원에서 사용되는 용어 "유인 올리고뉴클레오티드"는 서열-특이적인 방식으로 전사 인자에 결합하여 전사 활성을 정지시키는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 바람직하게는 리보자임 또는 유인 올리고뉴클레오티드는 제한없이, 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 포함하는 2차 구조를 나타낸다. 어떤 구체예에서 하나 이상의 올리고뉴클레오티드는 폴리(I)-폴리(dC)를 포함한다. 특정 구체예에서는 하나 이상의 Nn 세트가 3 내지 10개의 dG 및/또는 G 또는 2'-치환된 리보 또는 아라비노 G로 된 스트링 (string)을 포함한다. In certain embodiments, the immunomers comprise ribozymes or attractant oligonucleotides. As used herein, the term "ribozyme" refers to an oligonucleotide having catalytic activity. Preferably the ribozyme binds to and cleaves a specific nucleic acid target. As used herein, the term “attractive oligonucleotide” refers to an oligonucleotide that binds to a transcription factor and stops transcriptional activity in a sequence-specific manner. Preferably the ribozyme or attractant oligonucleotide exhibits a secondary structure including, without limitation, stem-loop or hairpin structure. In some embodiments one or more oligonucleotides comprise poly (I) -poly (dC). In certain embodiments one or more sets of Nn comprise a string of 3 to 10 dG and / or G or 2′-substituted ribo or arabino G.

본 발명의 목적상, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 다수의 연결된 뉴클레오시드 단위로부터 형성된 폴리뉴클레오시드를 말한다. 그러한 올리고뉴클레오티드는 게놈 또는 cDNA를 포함하는 기존의 핵산 공급원으로부터 얻어질 수 있지만, 바람직하게는 합성 방법에 의해 제조된다. 바람직한 구체예에서 각 뉴클레오시드 유니트는 헤테로시클릭 염기 및 펜토푸라노실, 트레할로스, 아라비노스, 2'-데옥시-2'-치환된아라비노스, 2'-O-치환된 아라비노스 또는 헥소스 당 기를 포함한다. 뉴클레오시드 잔기는 공지된 수많은 뉴클레오시드간 연결중 어느 하나에 의해 상호간에 결합될 수 있다. 그러한 뉴클레오시드간 연결로는 제한없이 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포네이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카보네이트, 카르보알콕시, 아세트아미데이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노, 티오에테르, 가교된 포스포라미데이트, 가교된 메틸렌 포스포네이트, 가교된 포스포로티오에이트, 및 술폰 뉴클레오시드간 연결이 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 하나 이상의 입체 특이적 뉴클레오시드간 연결 (예컨대 (Rp)- 또는 (Sp)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 연결)을 가지고 있는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "디뉴클레오티드"는 연결이 포스페이트기를 포함하고 있는 연결이든 또는 그렇지 않든간에 그러한 임의의 뉴클레오시드간 연결을 가지고 있는 폴리뉴클레오시드 및 디뉴클레오시드를 포함하는 것으로 명백하게 의도된다. 어떤 바람직한 구체예에서 이들 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 연결, 또는 이들의 조합일 수 있다. For the purposes of the present invention, the term "oligonucleotide" refers to a polynucleoside formed from a plurality of linked nucleoside units. Such oligonucleotides may be obtained from existing nucleic acid sources, including genomes or cDNAs, but are preferably prepared by synthetic methods. In a preferred embodiment each nucleoside unit is a heterocyclic base and pentofuranosyl, trehalose, arabinose, 2'-deoxy-2'-substituted arabinose, 2'-0-substituted arabinose or hexose Include the group. Nucleoside residues may be linked to each other by any one of a number of known internucleoside linkages. Such internucleoside linkages include, but are not limited to, phosphodiester, phosphorothioate, phosphorodithioate, alkylphosphonate, alkylphosphonothioate, phosphoroester, phosphoramidate, siloxane, carbonate, carbo Alkoxy, acetamidate, carbamate, morpholino, borano, thioether, crosslinked phosphoramidate, crosslinked methylene phosphonate, crosslinked phosphorothioate, and sulfone internucleoside linkages. The term "oligonucleotide" also refers to a polynucleoside having one or more stereospecific internucleoside linkages (such as (Rp)-or (Sp) -phosphothioate, alkylphosphonate, or phosphoesterester linkages) Seed. As used herein, the terms “oligonucleotide” and “dinucleotide” include polynucleosides and dinucleosides having any such internucleoside linkages, whether or not the linkage comprises a phosphate group. It is expressly intended to be. In some preferred embodiments these internucleoside linkages may be phosphodiester, phosphorothioate, or phosphorodithioate linkages, or combinations thereof.

어떤 구체예에서, 각각의 올리고뉴클레오티드는 약 3 내지 약 35 개의 뉴클레오시드 잔기, 바람직하게는 약 4 내지 약 30 개의 뉴클레오시드 잔기, 보다 바람직하게는 약 4 내지 약 20 개의 뉴클레오시드 잔기를 가진다. 어떤 구체예에서 올리고뉴클레오티드는 약 5 내지 약 18 개, 또는 약 5 내지 약 14 개의 뉴클레오시드 잔기를 가진다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 정확한 수가 결정적이지 않다는 의미를 함축한다. 그러므로 올리고뉴클레오티드에서 뉴클레오시드 잔기의 수는 중요하지 않으며, 하나 또는 2개 더 적은 뉴클레오시드 잔기, 또는 하나 내지 여러 개의 추가의 뉴클레오시드 잔기를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드도 상술된 구체예의 각각의 균등물로서 포함된다. 어떤 구체예에서는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 11개의 뉴클레오티드를 가진다. In some embodiments, each oligonucleotide comprises about 3 to about 35 nucleoside residues, preferably about 4 to about 30 nucleoside residues, more preferably about 4 to about 20 nucleoside residues. Have In some embodiments the oligonucleotides have about 5 to about 18, or about 5 to about 14 nucleoside residues. The term "about" as used herein implies that the exact number is not critical. Therefore, the number of nucleoside residues in an oligonucleotide is not critical, and oligonucleotides having one or two fewer nucleoside residues, or one to several additional nucleoside residues, are equal in each of the embodiments described above. Included as water. In some embodiments one or more oligonucleotides have 11 nucleotides.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 제한없이, 단백질 기, 친유성 기, 인터칼레이팅 제제, 디아민, 폴산, 콜레스테롤 및 아다만탄을 포함하는 추가의 치환체를 가지는 폴리뉴클레오시드를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 또한 중합체를 함유하고 있는 어떠한 다른 뉴클레오염기를 포함하며, 이들로는 제한없이 펩티드 핵산 (PNA), 포스페이트기를 가지고 있는 펩티드 핵산 (PHONA), 록킹 (locking)된 핵산 (LNA), 모르폴리노-골격 올리고뉴클레오티드, 및 알킬 링커 또는 아미노 링커가 있는 골격 부분을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드가 있다. The term “oligonucleotide” also includes, without limitation, polynucleosides having additional substituents, including protein groups, lipophilic groups, intercalating agents, diamines, folic acid, cholesterol, and adamantane. The term "oligonucleotide" also includes any other nucleobase containing a polymer, including, but not limited to, peptide nucleic acids (PNA), peptide nucleic acids with phosphate groups (PHONA), locked nucleic acids (LNA) ), Morpholino-backbone oligonucleotides, and oligonucleotides having a backbone moiety with an alkyl linker or amino linker.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 천연 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오시드, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "변형된 뉴클레오시드"는 변형된 헤테로시클릭 염기, 변형된 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함하는 뉴클레오시드이다. 어떤 구체예에서 변형된 뉴클레오시드는 본원에서 설명되는 바와 같이 비-천연 피리미딘 또는 푸린 뉴클레오시드이다. 어떤 구체예에서, 변형된 뉴클레오시드는 2'-치환된 리보뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드 또는 2'-데옥시-2'-플루오로아라비노시드이다. Oligonucleotides of the invention include natural nucleosides, modified nucleosides, or mixtures thereof. As used herein, the term “modified nucleoside” is a nucleoside comprising a modified heterocyclic base, a modified sugar moiety, or a combination thereof. In some embodiments the modified nucleoside is a non-natural pyrimidine or purine nucleoside, as described herein. In some embodiments, the modified nucleoside is a 2'-substituted ribonucleoside, arabinonucleoside or 2'-deoxy-2'-fluoroarabinoside.

본 발명의 목적상, 용어 "2'-치환된 리보뉴클레오시드"는 펜토스 부분의 2' 위치에 있는 히드록실기가 치환되어 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드를 생성하게 되는 리보노클레오시드를 포함한다. 바람직하게 그러한 치환은 1 내지 6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하고 있는 저급 알킬기, 또는 6 내지 10개의 탄소 원자를 가지고 있는 아릴기로 이루어지며, 그러한 알킬, 또는 아릴기는 치환되지 않을 수 있거나 예컨대 할로, 히드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르보알콕시, 또는 아미노기로 치환될 수 있다. 그러한 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드의 예로는 제한 없이 2'-O-메틸리보뉴클레오시드 및 2'-O-메톡시에틸리보뉴클레오시드가 있다. For the purposes of the present invention, the term “2′-substituted ribonucleosides” refers to li, wherein the hydroxyl group at the 2 ′ position of the pentose moiety is substituted to produce 2′-O-substituted ribonucleosides. Bonocleosides. Preferably such substitution consists of a lower alkyl group containing 1 to 6 saturated or unsaturated carbon atoms, or an aryl group having 6 to 10 carbon atoms, such alkyl, or aryl group may be unsubstituted, or for example halo, It may be substituted with hydroxy, trifluoromethyl, cyano, nitro, acyl, acyloxy, alkoxy, carboxyl, carboalkoxy, or amino groups. Examples of such 2'-0-substituted ribonucleosides include, without limitation, 2'-0-methylribonucleosides and 2'-0-methoxyethylribonucleosides.

용어 "2'-치환된 리보뉴클레오시드"는 또한 2'-히드록실기가 1 내지 6개의 포화 또는 불포화 탄소 원자를 함유하고 있는 저급 알킬기, 또는 아미노 또는 할로기로 치환된 리보뉴클레오시드를 포함한다. 그러한 2'-치환된 리보뉴클레오시드의 예로는 제한 없이 2'-아미노, 2'-플루오로, 2'-알릴, 및 2'-프로파르길 리보뉴클레오시드가 있다. The term "2'-substituted ribonucleosides" also encompasses lower alkyl groups wherein the 2'-hydroxyl group contains 1 to 6 saturated or unsaturated carbon atoms, or ribonucleosides substituted with amino or halo groups. do. Examples of such 2'-substituted ribonucleosides include, without limitation, 2'-amino, 2'-fluoro, 2'-allyl, and 2'-propargyl ribonucleosides.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 하이브리드 및 키메라 올리고뉴클레오티드를 포함한다. "키메라 올리고뉴클레오티드"는 한가지 이상의 유형의 뉴클레오시드간 연결을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드이다. 그러한 키메라 올리고뉴클레오티드의 바람직한 한가지 예는 포스포로티오에이트, 포스포디에스테르 또는 포스포로디티오에이트 영역 및 비-이온성 연결, 예컨대 알킬포스포네이트 또는 알킬포스포노티오에이트 연결을 포함하는 키메라 올리고뉴클레오티드이다 (참조: Pederson et al., 미국 특허 제 5,635,377호 및 5,366,878호). The term "oligonucleotide" includes hybrid and chimeric oligonucleotides. A "chimeric oligonucleotide" is an oligonucleotide having one or more types of internucleoside linkages. One preferred example of such a chimeric oligonucleotide is a chimeric oligonucleotide comprising a phosphorothioate, phosphodiester or phosphorodithioate region and a non-ionic linkage, such as an alkylphosphonate or alkylphosphonothioate linkage. (Pederson et al., US Pat. Nos. 5,635,377 and 5,366,878).

"하이브리드 올리고뉴클레오티드"는 한가지 이상의 유형의 뉴클레오시드를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드이다. 그러한 하이브리드 올리고뉴클레오티드의 바람직한 한 가지 예는 리보뉴클레오티드 또는 2'-치환된 리보뉴클레오티드 영역, 및 데옥시리보뉴클레오티드 영역을 포함한다 (참조: Metelev 및 Agrawal, 미국 특허 제 5,652,355호, 6,346,614호 및 6,143,881호). A "hybrid oligonucleotide" is an oligonucleotide having one or more types of nucleosides. One preferred example of such hybrid oligonucleotides includes ribonucleotides or 2′-substituted ribonucleotide regions, and deoxyribonucleotide regions (Metelev and Agrawal, US Pat. Nos. 5,652,355, 6,346,614 and 6,143,881). .

본 발명의 목적상, 용어 "면역자극성 올리고뉴클레오티드"는 상술된 바와 같이 척추동물, 예컨대 어류, 가금류, 또는 포유류에 투여되었을 때 면역 반응을 유도하는 올리고뉴클레오티드를 말한다. 본원에서 사용되는 용어 "포유류"는 제한 없이 래트, 마우스, 개, 고양이, 말, 소, 젖소, 돼지, 토끼, 사람 이외의 영장류, 및 사람을 포함한다. 유용한 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 문헌에 설명되어 있다 (Agrawal et al., WO 98/49288, 1998. 11. 5. 공개; WO 01/12804, 2001. 2. 22. 공개; WO 01/55370, 2001. 8. 2. 공개; PCT/USO1/13682, 2001. 4. 30. 출원; 및 PCT/USOI/30137, 2001. 9. 26. 출원). 바람직하게는, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. For the purposes of the present invention, the term "immunostimulatory oligonucleotide" refers to an oligonucleotide that induces an immune response when administered to a vertebrate, such as fish, poultry, or mammal, as described above. As used herein, the term "mammal" includes, without limitation, rats, mice, dogs, cats, horses, cattle, dairy cows, pigs, rabbits, primates other than humans, and humans. Useful immunostimulatory oligonucleotides are described in the literature (Agrawal et al., WO 98/49288, published on Nov. 5, 1998; WO 01/12804, published on February 22, 2001; WO 01/55370, 2001. 8. 2. Publication; PCT / USO1 / 13682, filed on April 30, 2001; and PCT / USOI / 30137, filed on September 26, 2001). Preferably, the immunostimulatory oligonucleotides comprise one or more phosphodiester, phosphorothioate, or phosphorodithioate internucleoside linkages.

어떤 구체예에서 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 식 5'-Pyr-Pur-3'의 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는데, 식에서 Pyr은 천연 또는 합성 피리미딘 뉴클레오시드이고 Pur은 천연 또는 합성 푸린 뉴클레오시드이다. 본원에서 사용되는 용어 "피리미딘 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드의 염기 성분이 피리미딘 염기인 뉴클레오시드를 말한다. 마찬가지로 용어 "푸린 뉴클레오시드"는 뉴클레오시드의 염기 성분이 푸린 염기인 뉴클레오시드를 말한다. 본 발명의 목적상, "합성" 피리미딘 또는 푸린 뉴클레오시드는 비-천연 피리미딘 또는 푸린 염기, 비-천연 당 부분, 또는 이들의 조합물을 포함한다. In some embodiments the immunostimulatory oligonucleotides comprise an immunostimulatory dinucleotide of formula 5'-Pyr-Pur-3 ', wherein Pyr is a natural or synthetic pyrimidine nucleoside and Pur is a natural or synthetic purine nucleoside . The term "pyrimidine nucleoside" as used herein refers to a nucleoside wherein the base component of the nucleoside is a pyrimidine base. The term “purine nucleoside” likewise refers to a nucleoside wherein the base component of the nucleoside is a purine base. For the purposes of the present invention, "synthetic" pyrimidine or purine nucleosides include non-natural pyrimidine or purine bases, non-natural sugar moieties, or combinations thereof.

본 발명에 따른 바람직한 피리미딘 뉴클레오시드는 다음의 구조식 (I)을 갖는다: Preferred pyrimidine nucleosides according to the invention have the structure (I)

Figure 112004017052430-pct00001
(I)
Figure 112004017052430-pct00001
(I)

상기 식에서, Where

D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor;

D'은 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지는 군으로부터 선택되며; D 'is selected from the group consisting of hydrogen, hydrogen bond donors, hydrogen bond acceptors, hydrophilic groups, hydrophobic groups, electron withdrawing groups and electron donor groups;

A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or hydrophilic group;

A'는 수소결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; A 'is selected from the group consisting of hydrogen bond acceptor, hydrophilic group, hydrophobic group, electron withdrawing group and electron donor group;

X는 탄소 또는 질소이고; X is carbon or nitrogen;

S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or hexose sugar ring, or a non-natural sugar.

바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기에 적절한 다른 링커 부분으로 유도체화된다. Preferably, the sugar ring is derivatized with phosphate moieties, modified phosphate moieties, or other linker moieties suitable for linking pyrimidine nucleosides to other nucleosides or nucleoside analogs.

바람직한 수소 결합 공여체로는 제한 없이 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH가 있다. 바람직한 수소 결합 수용체로는 제한 없이 C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예컨대 시토신의 N3가 있다. Preferred hydrogen bond donors include, without limitation, -NH-, -NH 2 , -SH and -OH. Preferred hydrogen bond acceptors include, without limitation, C═O, C═S, and ring nitrogen atoms of aromatic heterocycles such as N 3 of cytosine.

어떤 구체예에서 (I)의 염기 부분은 비-천연 피리미딘 염기이다. 바람직한 비-천연 피리미딘 염기의 예로는, 제한 없이 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 및 4-티오우라실이 있다. 그러나 어떤 구체예에서는 5-브로모시토신이 특별히 배제된다. In some embodiments, the base portion of (I) is a non-natural pyrimidine base. Examples of preferred non-natural pyrimidine bases include, without limitation, 5-hydroxycytosine, 5-hydroxymethylcytosine, N4-alkylcytosine, preferably N4-ethylcytosine, and 4-thiouracil. However, in some embodiments 5-bromocytosine is specifically excluded.

어떤 구체예에서 (I)의 당 부분 S'은 비-천연 당 부분이다. 본 발명의 목적상, "천연 당 부분"은 핵산의 일부로서 천연 당 부분, 예컨대 리보스 및 2'-데옥시리보스이고, "비-천연 당 부분"은 핵산의 일부로서 천연적으로 발생하지 않지만 올리고뉴클레오티드의 골격으로서 사용될 수 있는 임의의 당, 예컨대 헥소스이다. 아라비노스와 아라비노스 유도체가 바람직한 당 부분의 예이다. In some embodiments, sugar portion S 'of (I) is a non-natural sugar portion. For the purposes of the present invention, "natural sugar moieties" are natural sugar moieties such as ribose and 2'-deoxyribose as part of the nucleic acid, and "non-natural sugar moieties" do not occur naturally as part of the nucleic acid but Any sugar that can be used as the backbone of nucleotides, such as hexose. Arabinose and arabinose derivatives are examples of preferred sugar moieties.

본 발명에 따른 바람직한 푸린 뉴클레오시드 유사체는 다음 구조식 (II)를 갖는다: Preferred purine nucleoside analogs according to the present invention have the following structure (II):

Figure 112004017052430-pct00002
(II)
Figure 112004017052430-pct00002
( II )

상기 식에서, Where

D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor;

D'은 수소, 수소 결합 공여체, 및 친수성 기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; D 'is selected from the group consisting of hydrogen, hydrogen bond donors, and hydrophilic groups;

A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or hydrophilic group;

X는 탄소 또는 질소이며; X is carbon or nitrogen;

각각의 L은 독립적으로 C, O, N, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Each L is independently selected from the group consisting of C, O, N, and S;

S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or hexose sugar ring, or a non-natural sugar.

바람직하게는, 당 고리는 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기에 적절한 다른 링커 부분으로 유도체화된다. Preferably, the sugar ring is derivatized with phosphate moieties, modified phosphate moieties, or other linker moieties suitable for linking pyrimidine nucleosides to other nucleosides or nucleoside analogs.

바람직한 수소 결합 공여체로는 제한 없이 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH가 있다. 바람직한 수소 결합 수용체로는 제한 없이 C=O, C=S, -NO2 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자, 예컨대 구아닌의 N1이 있다. Preferred hydrogen bond donors include, without limitation, -NH-, -NH 2 , -SH and -OH. Preferred hydrogen bond acceptors include, without limitation, C═O, C═S, —NO 2 and ring nitrogen atoms of aromatic heterocycles such as N1 of guanine.

어떤 구체예에서 (II)의 염기 부분은 비-천연 푸린 염기이다. 바람직한 비-천연 푸린 염기의 예로는 제한 없이 6-티오구아닌 및 7-데아자구아닌이 있다. 어떤 구체예에서, (II)의 당 부분 S'은 상기 구조식 (I)에 대하여 설명된 것과 같이 천연 당 부분이다. In some embodiments, the base portion of (II) is a non-natural purine base. Examples of preferred non-natural purine bases include, without limitation, 6-thioguanine and 7-deazaguanine. In some embodiments, the sugar moiety S 'of (II) is a natural sugar moiety as described for structural formula (I) above.

바람직한 구체예에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG, C*pG, CpG*, 및 C*pG*로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*은 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이며, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*은 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이며, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오시드간 연결이다. 어떤 바람직한 구체예에서, 면역자극성 디뉴클레오티드는 CpG가 아니다. In a preferred embodiment, the immunostimulatory dinucleotide is selected from the group consisting of CpG, C * pG, CpG * , and C * pG * , wherein C is cytidine or 2′-deoxycytidine, and C * is 2 '-Deoxythymidine, arabinocytidine, 2'-deoxythymidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinocytidine, 2'-O-substituted arabinocytidine, 2' -Deoxy-5-hydroxycytidine, 2'-deoxy-N4-alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thiouridine or other non-natural pyrimidine nucleosides, G is Guanosine or 2'-deoxyguanosine, G * is 2'-deoxy-7-deazaguanosine, 2'-deoxy-6-thioguanosine, arabinoguanosine, 2'-deoxy- 2 'substituted-arabinoguanosine, 2'-O-substituted-arabinoguanosine, 2'-deoxyinosine, or other non-natural purine nucleoside, p is a phosphodiester, phosphoro Consisting of thioate, and phosphorodithioate Losing is an internucleoside linkage selected from the group. In certain preferred embodiments, the immunostimulatory dinucleotide is not CpG.

면역자극성 올리고뉴클레오티드는 면역자극성 디뉴클레오티드의 한 쪽 또는 양쪽에 면역자극성 부분을 포함할 수 있다. 그러므로, 어떤 구체예에서, 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 다음 구조식 (III)의 면역자극성 도메인을 포함한다:Immunostimulatory oligonucleotides may comprise immunostimulatory moieties on one or both sides of the immunostimulatory dinucleotide. Therefore, in some embodiments, the immunostimulatory oligonucleotides comprise an immunostimulatory domain of the following structure ( III ):

5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3' (III)5'-Nn-N1-YZ-N1-Nn-3 '( III )

상기 식에서, Where

Y는 시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시시티딘 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고;Y is cytidine, 2'-deoxythymidine, 2'-deoxycytidine arabinocytidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinocytidine, 2'-deoxythymidine, 2 '-O-substituted arabinocytidine, 2'-deoxy-5-hydroxycytidine, 2'-deoxy- N4 -alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thiouridine or its External non-natural pyrimidine nucleosides;

Z는 구아노신, 2'-데옥시구아노신, 2' 데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2'-데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이고; Z is guanosine, 2'-deoxyguanosine, 2 'deoxy-7-deazaguanosine, 2'-deoxy-6-thioguanosine, arabinoguanosine, 2'-deoxy-2' Substituted-arabinoguanosine, 2'-0-substituted-arabinoguanosine, 2'-deoxyinosine, or other non-natural purine nucleosides;

N1은 각각 바람직하게는 천연 또는 합성 뉴클레오시드, 또는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은, 제한없이, 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Each N1 is preferably a natural or synthetic nucleoside, or a non-basic nucleoside, arabinonucleoside, 2'-deoxyuridine, α-deoxyribonucleoside, β-L-deoxyribo Nucleoside and an immunostimulatory moiety selected from the group consisting of nucleosides linked 3 ′ to adjacent nucleosides by phosphodiester or modified internucleoside linkages, wherein the modified internucleoside linkages are Without limitation, linkers having a length from about 2 kPa to about 200 kPa, C2-C18 alkyl linkers, poly (ethylene glycol) linkers, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linkers, glyceryl linkers, 2'-5 'Internucleoside linkages and phosphorothioate, phosphorodithioate, or methylphosphonate internucleoside linkages;

Nn은 각각 천연 뉴클레오시드 또는 면역자극성 부분이고, 바람직하게는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 및 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽으로 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은 아미노 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Nn is a natural nucleoside or an immunostimulatory moiety, respectively, preferably a nonbasic nucleoside, arabinonucleoside, 2'-deoxyuridine, α-deoxyribonucleoside, 2'-0- Substituted ribonucleosides, and nucleosides linked 3 ′ to adjacent nucleosides by modified internucleoside linkages, wherein the modified internucleoside linkages are amino linkers, 2 ′ -5 'internucleoside linkage, and methylphosphonate internucleoside linkage;

단, N1 또는 Nn 중 하나 이상은 면역자극성 부분이고; Provided that at least one of N1 or Nn is an immunostimulatory moiety;

n은 0 내지 30의 수이고;n is a number from 0 to 30;

3' 말단, 뉴클레오시드간 연결부, 또는 유도체화된 뉴클레오염기 또는 당은 면역자극성일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있는 또 다른 올리고뉴클레오티드에 직접 연결되거나 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된다. The 3 ′ end, internucleoside linkage, or derivatized nucleobase or sugar is linked directly to another oligonucleotide, which may or may not be immunostimulatory, or through a non-nucleotide linker.

어떤 바람직한 구체예에서 YZ는 아라비노시티딘 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘 및 아라비노구아노신 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신이다. 바람직한 면역자극성 부분은 제한 없이 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트, 포스포트리에스테르, 포스포티오트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 트리에스테르 전구약물, 술폰, 술폰아미드, 술파메이트, 포름아세탈, N-메틸히드록실아민, 카보네이트, 카바메이트, 모르폴리노, 보라노포스포네이트, 포스포라미데이트, 특히 일차 아미노-포스포라미데이트, N3 포스포라미데이트 및 N5 포스포라미데이트, 및 입체 특이적 연결 (예컨대 (Rp)- 또는 (Sp)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트, 또는 포스포트리에스테르 연결)을 포함하는 포스페이트 골격의 변형을 포함한다. In certain preferred embodiments YZ is arabinocitidine or 2'-deoxy-2'-substituted arabinositidine and arabinoganosine or 2'-deoxy-2'-substituted arabinoguanosine. Preferred immunostimulatory moieties include, without limitation, methylphosphonates, methylphosphonothioates, phosphorus esters, phosphorothiotriesters, phosphorothioates, phosphorodithioates, triester prodrugs, sulfones, sulfonamides, sulfas Mate, formacetal, N-methylhydroxylamine, carbonate, carbamate, morpholino, boranophosphonate, phosphoramidate, especially primary amino-phosphoramidate, N3 phosphoramidate and N5 phosphoramidate And modifications of phosphate backbones including stereospecific linkages (such as ( Rp ) -or ( Sp ) -phosphothioate, alkylphosphonate, or phosphoesterester linkages).

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 또한 당 변형, 예컨대 제한 없이, 2'-치환된 펜토스 당, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니나 2'-O-메틸리보스, 2'-O-메톡히에틸리보스, 2'-O-프로파르길리보스, 및 2'-데옥시-2'-플루오로리보스; 3'-치환된 펜토스 당, 예를 들면, 그것에 한정되는 것은 아니나 3'-O-메틸리보스; 1',2'-디데옥시리보스; 아라비노스; 치환된 아라비노스 당, 예를 들면 그것들에 한정되는 것은 아니나 1'-메틸아라비노스, 3'-히드록시메틸아라비노스, 4'-히드록시메틸-아라비노스, 및 2'-치환된 아라비노스 당; 헥소스 당, 예를 들면 그것에 한정되는 것은 아니나 1,5-안히드로헥시톨; 및 알파-아노머를 가지고 있는 뉴클레오시드를 포함한다. 변형된 당이 3'-데옥시리보뉴클레오시드 또는 3'-O-치환된 리보뉴클레오시드인 구체예에서 면역자극성 부분은 2'-5' 뉴클레오시드간 연결에 의하여 인접한 뉴클레오시드에 부착된다. Preferred immunostimulatory moieties according to the invention also include but are not limited to sugar modifications, such as, but not limited to, 2'-substituted pentose sugars, such as, for example, 2'-0-methylribose, 2'-0-methoxy Ethylribose, 2'-O-propargylibos, and 2'-deoxy-2'-fluororibose; 3'-substituted pentose sugars such as, but not limited to, 3'-0-methylribose; 1 ', 2'-dideoxyribose; Arabinose; Substituted arabinose sugars, such as, but not limited to, 1'-methylarabinose, 3'-hydroxymethylarabinose, 4'-hydroxymethyl-arabinose, and 2'-substituted arabinose sugars ; Hexose sugars such as, but not limited to, 1,5-anhydrohexitol; And nucleosides having alpha-anomers. In embodiments wherein the modified sugar is a 3′-deoxyribonucleoside or 3′-O-substituted ribonucleoside, the immunostimulatory moiety is linked to adjacent nucleosides by a 2′-5 ′ internucleoside linkage. Attached.

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 추가로 그 밖의 탄수화물 골격 변형 및 치환, 예를 들면 펩티드 핵산 (PNA), 포스페이트 기를 가지고 있는 펩티드 핵산 (PHONA), 록킹된 핵산 (LNA)을 가지는 올리고뉴클레오티드, 모르폴리노 골격 올리고뉴클레오티드, 및 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 골격 링커 단편, 예컨대 그것에 한정되는 것은 아니지만 알킬 링커 또는 아미노 링커를 가지고 있는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 알킬 링커는 분지된 또는 분지되지 않은, 치환된 또는 치환되지 않은, 그리고 키랄적으로 순수한 또는 라세미 화합물의 혼합물일 수 있다. 가장 바람직한 것은 그러한 알킬 링커가 약 2 내지 약 18개의 탄소 원자를 가지는 것이다. 어떤 바람직한 구체예에서 그러한 알킬 링커는 약 3 내지 약 9 개의 탄소 원자를 갖는다. 어떤 알킬 링커들은 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오에테르로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 그러한 작용기화된 어떤 알킬 링커는 식 -O-(CH2-CH2-O-)n (n=1 내지 9)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커이다. 다른 작용기화된 알킬 링커는 펩티드 또는 아미노산이다. Preferred immunostimulatory moieties according to the invention further comprise other carbohydrate backbone modifications and substitutions, for example peptide nucleic acids (PNA), peptide nucleic acids with phosphate groups (PHONA), oligonucleotides with locked nucleic acids (LNA), mor Polyno backbone oligonucleotides, and backbone linker fragments having a length of about 2 GPa to about 200 GPa, such as, but not limited to, oligonucleotides having alkyl linkers or amino linkers. The alkyl linker may be a mixture of branched or unbranched, substituted or unsubstituted, and chirally pure or racemic compounds. Most preferred are such alkyl linkers having from about 2 to about 18 carbon atoms. In certain preferred embodiments such alkyl linkers have from about 3 to about 9 carbon atoms. Some alkyl linkers include one or more functional groups selected from the group consisting of hydroxy, amino, thiols, thioethers, ethers, amides, thioamides, esters, ureas, and thioethers. Some such functionalized alkyl linkers are poly (ethylene glycol) linkers of the formula —O— (CH 2 —CH 2 —O—) n (n = 1 to 9). Other functionalized alkyl linkers are peptides or amino acids.

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 추가로 DNA 이소폼 (isoform), 예컨대 제한없이 β-L-데옥시리보뉴클레오시드 및 α-데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 3' 변형을 포함하며, 추가로 비천연 뉴클레오시드간 연결 위치, 예컨대 제한 없이 2'-5', 2'-2', 3'-3' 및 5'-5' 연결 위치를 가지는 뉴클레오시드를 포함한다. Preferred immunostimulatory moieties according to the invention further comprise DNA isoforms such as, without limitation, β-L-deoxyribonucleosides and α-deoxyribonucleosides. Preferred immunostimulatory moieties according to the invention comprise 3 'modifications and further comprise non-natural internucleoside linkage sites such as, without limitation, 2'-5', 2'-2 ', 3'-3' and 5 '. Nucleosides having a −5 ′ linkage position.

본 발명에 따른 바람직한 면역자극성 부분은 변형된 헤테로시클릭 염기, 예컨대 제한 없이 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신, 4-티오우라실, 6-티오구아닌, 7-데아자구아닌, 이노신, 니트로피롤, C5-프로피닐피리미딘, 및 디아미노푸린, 예컨대 제한 없이 2,6-디아미노푸린을 가지는 뉴클레오시드를 추가로 포함한다. Preferred immunostimulatory moieties according to the invention are modified heterocyclic bases such as, without limitation, 5-hydroxycytosine, 5-hydroxymethylcytosine, N4-alkylcytosine, preferably N4-ethylcytosine, 4-thiouracil, 6-thioguanine, 7-deazaguanine, inosine, nitropyrrole, C5-propynylpyrimidine, and diaminopurines such as, without limitation, nucleosides having 2,6-diaminopurine.

제한하는 것이 아닌 구체적인 예시로서, 예를 들면 구조식 (III)의 면역자극성 도메인에서 위치 N1 또는 Nn에 있는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결이 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 가지는 링커인 면역자극성 부분이고, 위치 X1에 있는 C2-C18 알킬 링커가 면역자극성 부분이며, 위치 X1에 있는 β-L-데옥시리보뉴클레오시드가 면역자극성 부분이다. 하기 표 1에는 면역자극성 부분의 대표적인 위치와 구조가 제시되어 있다. 특정 위치에서의 면역자극성 부분으로서의 링커에 대한 언급은 그 위치에 있는 뉴클레오시드 잔기가 그것의 3'-히드록실에서 표시된 링커로 치환되고, 그로써 그 뉴클레오시드 잔기와 3' 쪽에 인접한 뉴클레오시드 사이에 변형된 뉴클레오시드간 연결이 생성되었음을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 마찬가지로, 특정 위치에서의 면역자극성 부분으로서의 변형된 뉴클레오시드간 연결에 대한 언급은 그 위치에 있는 뉴클레오시드 잔기가 열거된 연결에 의하여 3' 쪽에서 인접한 뉴클레오시드에 연결되는 것을 의미한다. By way of example, and not by way of limitation, immunization, for example, the methylphosphonate internucleoside linkage at position N1 or Nn in the immunostimulatory domain of formula (III) is a linker having a length of about 2 GPa to about 200 GPa The irritating moiety, the C2-C18 alkyl linker at position X1 is the immunostimulatory moiety, and the β-L-deoxyribonucleoside at position X1 is the immunostimulatory moiety. Table 1 below shows representative positions and structures of immunostimulatory moieties. Reference to a linker as an immunostimulatory moiety at a particular position indicates that the nucleoside residue at that position is substituted with the linker indicated at its 3′-hydroxyl, thereby nucleoside adjacent to the nucleoside residue 3 ′. It is to be understood that it means that a modified internucleoside linkage has been created between. Likewise, reference to a modified internucleoside linkage as an immunostimulatory moiety at a particular position means that the nucleoside residue at that position is linked to an adjacent nucleoside on the 3 'side by the listed linkage.

표 1Table 1

위치  location 전형적인 면역자극성 부분                    Typical immunostimulatory part N1   N1 천연 뉴클레오시드, 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, β-L-데옥시리보뉴클레오시드 C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜)연결, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커 (아미노 링커), 2'-5'뉴클레오시드간 연결, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결.Natural nucleosides, nonbasic nucleosides, arabinonucleosides, 2′-deoxyuridines, β-L-deoxyribonucleosides C2-C18 alkyl linkers, poly (ethylene glycol) linkages, 2- Aminobutyl-1,3-propanediol linker (amino linker), 2′-5 ′ internucleoside linkage, methylphosphonate internucleoside linkage. Nn   Nn 천연 뉴클레오시드, 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, 2'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 단, N1과 N2는 둘 모두 비염기성 연결이 될 수 없다.Natural nucleosides, non-basic nucleosides, arabinonucleosides, 2'-deoxyuridines, 2'-O-substituted ribonucleosides, 2'-5 'internucleoside linkages, methylforce Phononate internucleoside linkages, provided that N1 and N2 cannot both be nonbasic links.

하기 표 2는 업스트림 (upstream) 강화 도메인을 가지고 있는 면역자극성 올리고뉴클레오티드내의 면역자극성 부분의 대표적인 위치 및 구조를 제시한다. 본원에서 사용되는 용어 "스페이서(spacer) 9"는 식 -O-(CH2-CH2-O)n- (여기서, n=3)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 나타낸다. 용어 "스페이서 18"은 식 -O-(CH2-CH2-O)n- (여기서, n=6)의 폴리(에틸렌 글리콜) 링커를 나타낸다. 본원에서 사용되는 용어 "C2-C18 알킬 링커"는 식 -O-(CH2)q-O- (식에서 q는 2 내지 18의 정수)의 링커를 나타낸다. 따라서 용어 "C3-링커" 및 "C3-알킬 링커"는 식 -O-(CH2)3-O- 의 링커를 의미한다. 스페이서 9, 스페이서 18, 및 C2-C18 알킬 링커의 각각에 대하여, 링커는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트 연결에 의하여 인접한 뉴클레오시드에 연결된다. Table 2 below shows representative positions and structures of immunostimulatory moieties within immunostimulatory oligonucleotides having upstream enhancing domains. As used herein, the term “spacer 9” refers to a poly (ethylene glycol) linker of the formula —O— (CH 2 —CH 2 —O) n −, where n = 3. The term “spacer 18” denotes a poly (ethylene glycol) linker of the formula —O— (CH 2 —CH 2 —O) n −, where n = 6. The term "C2-C18 alkyl linker" as used herein refers to a linker of the formula -O- (CH 2 ) q -O-, wherein q is an integer from 2 to 18. Thus the terms "C3-linker" and "C3-alkyl linker" mean a linker of the formula -O- (CH 2 ) 3 -O-. For each of spacer 9, spacer 18, and a C2-C18 alkyl linker, the linker is linked to adjacent nucleosides by phosphodiester, phosphorothioate, or phosphorodithioate linkages.

표 2TABLE 2

위치    location 전형적인 면역자극성 부분                    Typical immunostimulatory part 5'N2    5'N2 천연 뉴클레오시드, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커Natural nucleosides, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker 5'N1    5'N1 천연 뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜), 비염기성 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커Natural nucleosides, β-L-deoxyribonucleosides, C2-C18 alkyl linkers, poly (ethylene glycol), non-basic linkers, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linkers 3'N1    3'N1 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, 2'-O-메틸리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18Natural nucleosides, 1 ', 2'-dideoxyribose, 2'-0-methylribonucleoside, C2-C18 alkyl linker, spacer 9, spacer 18 3'N2    3'N2 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, 3'-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-프로파르길리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결Natural nucleosides, 1 ', 2'-dideoxyribose, 3'-deoxyribonucleosides, β-L-deoxyribonucleosides, 2'-0-propargylbonucleosides, C2 -C18 alkyl linker, spacer 9, spacer 18, methylphosphonate internucleoside linkage 3'N3    3'N3 천연 뉴클레오시드, 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 2',5'뉴클레오시드간 연결, d(G)n, 폴리I-폴리dCNative nucleoside, 1 ', 2'-dideoxyribose, C2-C18 alkyl linker, spacer 9, spacer 18, methylphosphonate internucleoside linkage, 2', 5 'internucleoside linkage, d ( G) n, polyI-polydC 3'N2 + 3'N3 3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC1 ', 2'-dideoxyribose, β-L-deoxyribonucleoside, C2-C18 alkyl linker, d (G) n, polyI-polydC 3'N3 + 3'N4 3'N3 + 3'N4 2'-O-메톡시에틸-리보뉴클레오시드, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, d(G)n, 폴리I-폴리dC2′-O-methoxyethyl-ribonucleoside, methylphosphonate internucleoside linkage, d (G) n, polyI-polydC 3'N5 + 3'N6 3'N5 + 3'N6 1',2'-디데옥시리보스, C2-C18 알킬 링커, d(G)n, 폴리I-폴리dC1 ', 2'-dideoxyribose, C2-C18 alkyl linker, d (G) n, polyI-polydC 5'N1 + 3'N3 5'N1 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, d(G)n, 폴리I-폴리dC1 ', 2'-dideoxyribose, d (G) n, polyI-polydC

하기 표 3은 다운스트림 강화 도메인을 가지고 있는 면역자극성 올리고뉴클레오티드내의 면역자극성 부분의 대표적인 위치 및 구조를 제시한다. Table 3 below shows representative positions and structures of immunostimulatory moieties in immunostimulatory oligonucleotides having downstream enhancing domains.

표 3TABLE 3

위치    location 전형적인 면역자극성 부분                 Typical immunostimulatory part 5'N2    5'N2 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결Methylphosphonate Internucleoside Linkage 5'N1     5'N1 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결Methylphosphonate Internucleoside Linkage 3'N1    3'N1 1',2'-디데옥시리보스, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 2'-O-메틸1 ', 2'-dideoxyribose, methylphosphonate internucleoside linkage, 2'-0-methyl 3'N2    3'N2 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, C2-C18 알킬 링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결, 2'-O-메틸1 ', 2'-dideoxyribose, β-L-deoxyribonucleoside, C2-C18 alkyl linker, spacer 9, spacer 18, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linker, methylphosphonate Internucleoside linkage, 2′-O-methyl 3'N3    3'N3 3'-데옥시리보뉴클레오시드, 3'-O-치환된 리보뉴클레오시드, 2'-O-프로파르길-리보뉴클레오시드3'-deoxyribonucleoside, 3'-O-substituted ribonucleoside, 2'-0-propargyl-ribonucleoside 3'N2 + 3'N3 3'N2 + 3'N3 1',2'-디데옥시리보스, β-L-데옥시리보뉴클레오시드1 ', 2'-dideoxyribose, β-L-deoxyribonucleoside

본 발명에 따른 이뮤노머는 3' 말단 또는 뉴클레오시드간 연결부 또는 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커를 통해 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 목적상, "비-뉴클레오티드 링커 (non-nucleotidic linker)"는 공유 또는 비-공유 연결에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있는 임의의 부분이다. 바람직하게는, 그러한 링커는 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이를 갖는다. 바람직한 링커의 여러 예를 하기에 나타낸다. 비-공유 연결로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, π-스택킹 (stacking) 상호작용, 및 수소 결합이 있다. 용어 "비-뉴클레오티드 링커"는 2개의 뉴클레오시드의 3'-히드록실기를 직접적으로 연결시키는 상술된 바와 같은 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 또는 포스포로디티오에이트를 의미하고자 하는 것이 아니다. 본 발명의 목적상, 이러한 직접적인 3'-3' 연결은 "뉴클레오티드 연결"로서 간주된다. Immunomers according to the invention comprise two or more oligonucleotides linked via a non-nucleotide linker at the 3 ′ end or internucleoside linkage or functionalized nucleobase or sugar. For the purposes of the present invention, a "non-nucleotidic linker" is any part that can be linked to an oligonucleotide by covalent or non-covalent linkages. Preferably, such linkers have a length of about 2 mm 3 to about 200 mm 3. Several examples of preferred linkers are shown below. Non-covalent linkages include, but are not limited to, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, π-stacking interactions, and hydrogen bonds. The term “non-nucleotide linker” refers to an internucleoside linkage as described above that directly links the 3′-hydroxyl groups of two nucleosides, such as phosphodiester, phosphorothioate, or phosphorodithio It is not intended to mean Eight. For the purposes of the present invention, such direct 3'-3 'linkages are considered as "nucleotide linkages".

어떤 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 금 입자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 금속이다. 그 밖의 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 가용성 또는 불용성 생분해성 중합체 비드이다. In some embodiments, the non-nucleotide linker is a metal, including but not limited to gold particles. In other embodiments, the non-nucleotide linker is a soluble or insoluble biodegradable polymer bead.

그 밖의 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 올리고뉴클레오티드에 대한 부착을 가능하게 하는 작용기를 가지고 있는 유기 부분이다. 그러한 부착은 바람직하게는 임의의 안정한 공유 연결에 의한 것이다. 비-제한적인 예로서, 링커는 도 13에서 도시된 바와 같이 뉴클레오시드의 임의의 적합한 위치에 부착될 수 있다. 어떤 바람직힌 구체예에서 링커는 3'-히드록실에 부착된다. 그러한 구체예에서 링커는 바람직하게는 히드록실 작용기를 포함하는데, 그것은 바람직하게는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 비-포스페이트-기초 연결에 의하여 3'-히드록실에 부착된다. In other embodiments, the non-nucleotide linker is an organic moiety having a functional group that enables attachment to an oligonucleotide. Such attachment is preferably by any stable covalent linkage. As a non-limiting example, the linker may be attached at any suitable position of the nucleoside as shown in FIG. 13. In certain preferred embodiments the linker is attached to the 3'-hydroxyl. In such embodiments the linker preferably comprises hydroxyl functionality, which is preferably attached to the 3'-hydroxyl by phosphodiester, phosphorothioate, phosphorodithioate or non-phosphate-based linkages. do.

어떤 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 생체분자, 예를 들면, 제한없이, 폴리펩티드, 항체, 지질, 항원, 알레르겐, 및 올리고사카라이드이다. 다른 구체예에서, 비-뉴클레오티드 링커는 작은 분자이다. 본 발명의 목적상, 작은 분자는 1,000 Da 미만의 분자량을 가지고 있는 유기 부분이다. 어떤 구체예에서, 작은 분자의 분자량은 750 Da 미만이다. In some embodiments, the non-nucleotide linker is a biomolecule, for example, without limitation, polypeptides, antibodies, lipids, antigens, allergens, and oligosaccharides. In other embodiments, the non-nucleotide linker is a small molecule. For the purposes of the present invention, small molecules are organic moieties having a molecular weight of less than 1,000 Da. In some embodiments, the molecular weight of the small molecule is less than 750 Da.

어떤 구체예에서 작은 분자는 지방족 또는 방향족 탄화수소이며, 둘 중 어느 하나는 임의로 올리고뉴클레오티드를 연결하거나 올리고뉴클레오티드에 첨부되는 선형사슬에서 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오우레아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있다. 작은 분자는 고리형이거나 비고리형이다. 작은 분자 링커의 예로는, 그것들에 한정되는 것은 아니나 아미노산, 탄수화물, 시클로덱스트린, 아단만탄, 콜레스테롤, 합텐 및 항생물질이 있다. 그러나, 비-뉴클레오티드 링커를 설명하기 위한 목적상, "작은 분자"는 뉴클레오시드를 포함하는 것을 의도되지 않는다. In some embodiments, the small molecule is an aliphatic or aromatic hydrocarbon, either of which is hydroxy, amino, thiol, thioether, ether, amide, thioamide, ester in a linear chain optionally linked to or attached to the oligonucleotide. One or more functional groups selected from the group consisting of urea, and thiourea. Small molecules are cyclic or acyclic. Examples of small molecular linkers include, but are not limited to, amino acids, carbohydrates, cyclodextrins, adanmantans, cholesterol, hapten and antibiotics. However, for the purpose of describing non-nucleotide linkers, "small molecules" are not intended to include nucleosides.

어떤 구체예에서, 작은 분자 링커는 글리세롤 또는 식 HO-(CH2) o -CH(OH)-(CH2) p -OH의 글리세롤 동족체이며, 여기서 o와 p는 독립적으로 1 내지 약 6의 정수, 1 내지 약 4의 정수, 또는 1 내지 약 3의 정수이다. 다른 어떤 구체예에서, 작은 분자 링커는 1,3-디아미노-2-히드록시프로판의 유도체이다. 그런 유도체는 식 HO-(CH2) m -C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2) m -OH을 가지며, 여기서 m은 0 내지 약 10, 0 내지 약 6, 2 내지 약 6, 또는 2 내지 약 4의 정수이다. In some embodiments, the small molecule linker is glycerol or a glycerol homologue of the formula HO— (CH 2 ) o —CH (OH) — (CH 2 ) p —OH, wherein o and p are independently an integer from 1 to about 6 , An integer from 1 to about 4, or an integer from 1 to about 3. In some other embodiments, the small molecular linker is a derivative of 1,3-diamino-2-hydroxypropane. Such derivatives have the formula HO- (CH 2 ) m -C (O) NH-CH 2 -CH (OH) -CH 2 -NHC (O)-(CH 2 ) m -OH, wherein m is from 0 to about 10, 0 to about 6, 2 to about 6, or an integer from 2 to about 4.

본 발명에 따른 어떤 비-뉴클레오티드 링커는 도 1에 개략적으로 도시된 바와 같이 2개 이상의 올리고뉴클레오티드의 부착을 가능하게 한다. 예를 들어 작은 분자 링커인 글리세롤은 3개의 히드록실기를 가지고 있는데, 여기에 올리고뉴클레오티드가 공유적으로 부착될 수 있다. 그러므로 본 발명에 따른 몇몇 이뮤노머는 3' 말단에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 그러한 이뮤노머는 2개 이상의 면역자극성 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 이러한 각각의 올리고뉴클레오티드는 접근가능한 5' 말단을 가지고 있다. Certain non-nucleotide linkers in accordance with the present invention allow for the attachment of two or more oligonucleotides as schematically shown in FIG. 1. For example, glycerol, a small molecular linker, has three hydroxyl groups, to which oligonucleotides can be covalently attached. Some immunomers according to the invention therefore comprise two or more oligonucleotides linked to a non-nucleotide linker at the 3 'end. Such immunomers comprise two or more immunostimulatory oligonucleotides, each of which has an accessible 5 'end.

본 발명의 이뮤노머는 도 5 및 6에 개략적으로 도시되고, 또한 실시예에서도 설명되는 바와 같이 자동 합성기 및 포스포라미다이트 방법을 사용하여 편리하게 합성될 수 있다. 어떤 구체예에서 이뮤노머는 선형 합성 방법에 의하여 합성된다 (도 5 참조). 본원에서 사용되는 용어 "선형 합성"이란 이뮤노머의 한쪽 끝에서 출발하여 다른 쪽 끝으로 선형으로 진행되는 합성을 말한다. 선형 합성은 동일하거나 동일하지 않은 (길이, 염기 조성 및/또는 포함된 화학적 변형의 관점에서) 단량체 단위의 이뮤노머내로 통합되는 것을 가능하게 한다. Immunomers of the present invention are shown schematically in FIGS. 5 and 6 and can also be conveniently synthesized using automated synthesizers and phosphoramidite methods as described in the Examples. In some embodiments, the immunomers are synthesized by a linear synthesis method (see FIG. 5). As used herein, the term "linear synthesis" refers to a synthesis starting linearly from one end of an immunomer to the other end. Linear synthesis makes it possible to integrate into immunomers of monomeric units (in terms of length, base composition and / or chemical modifications involved) that are the same or unequal.

또 다른 합성 방식은 "병렬 합성"으로, 이 방식에서는 중심 링커 부분으로부터 바깥쪽으로 합성이 진행된다 (도 6 참조). 링커에 부착된 고체 지지체는 미국 특허 제 5,912,332호에서 설명되는 바와 같이 병렬 합성에 대해 사용될 수 있다. 또한, 보편적인 고체 지지체, 예컨대 포스페이트가 부착되고 기공 조절된 유리 지지체가 사용될 수 있다. Another method of synthesis is "parallel synthesis", in which the synthesis proceeds outward from the central linker portion (see Figure 6). Solid supports attached to linkers can be used for parallel synthesis as described in US Pat. No. 5,912,332. In addition, universal solid supports, such as phosphate attached and pore controlled glass supports, may be used.                 

이뮤노머의 병렬 합성은 선형 합성에 비해 여러가지 장점을 가지고 있다: (1) 병렬 합성은 동일한 단량체 단위의 통합을 가능하게 하고; (2) 선형 합성과는 달리 2개의 (또는 모든) 단량체 단위가 동시에 합성되고, 이로써 합성 단계의 수 및 합성에 필요한 시간이 단량체 단위에 대한 것과 동일하며; (3) 합성 단계의 감소로 최종 이뮤노머 생성물의 순도 및 수율을 개선시킨다. Parallel synthesis of immunomers has several advantages over linear synthesis: (1) Parallel synthesis allows the integration of identical monomer units; (2) unlike linear synthesis, two (or all) monomer units are synthesized simultaneously, such that the number of synthesis steps and the time required for synthesis are the same as for the monomer units; (3) Reduction of the synthesis step improves the purity and yield of the final immunomer product.

선형 합성 또는 병렬 합성 프로토콜에 의한 합성의 종료시에, 변형된 뉴클레오시드가 통합되어 있는 경우, 이뮤노머는 농축 암모니아 용액으로 또는 포스포라미다이트 공급자에 의해 추천받은 바와 같이 편리하게 탈보호될 수 있다. 생성된 이뮤노머는 바람직하게는 역상 HPLC에 의해 정제되고, 탈트리틸화되고, 탈염되고 투석된다. At the end of synthesis by linear synthesis or parallel synthesis protocol, if modified nucleosides are incorporated, the immunomers can be conveniently deprotected in concentrated ammonia solution or as recommended by the phosphoramidite supplier. . The resulting immunomers are preferably purified by reversed phase HPLC, detritylated, desalted and dialyzed.

하기 표 4는 본 발명에 따른 대표적인 이뮤노머를 제시한다. 추가의 이뮤노머는 하기 실시예에서 설명된다. Table 4 below presents representative immunomers according to the present invention. Additional immunomers are described in the examples below.                 

표 4. 이뮤노머 서열의 예Table 4. Examples of Immunomer Sequences

Figure 112004017052430-pct00003
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Figure 112004017052430-pct00004
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제 2 측면으로 본 발명은 상술된 바와 같은 이뮤노머와, 접근가능한 5' 말단 외의 위치에서 이뮤노머에 컨쥬게이션된 항원을 포함하고 있는 이뮤노머 컨쥬게이트를 제공한다. 어떤 구체예에서 비-뉴클레오티드 링커는 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된 항원을 포함한다. 어떤 다른 구체예에서는 항원은 3' 말단 이외의 위치에서 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된다. 어떤 구체예에서, 항원은 백신 효과를 생성한다. In a second aspect the present invention provides an immunoconjugate comprising an immunomer as described above and an antigen conjugated to the immunoomer at a position other than the accessible 5 'end. In some embodiments, the non-nucleotide linker comprises an antigen conjugated to an oligonucleotide. In some other embodiments, the antigen is conjugated to the oligonucleotide at a position other than the 3 'end. In some embodiments, the antigen produces a vaccine effect.

항원은 바람직하게는 병원체와 관련된 항원, 암과 관련된 항원, 자가면역 질병과 관련된 항원, 및 다른 질병, 예컨대 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 수의학적 또는 가금류 질병과 관련된 항원으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 본 발명의 목적상, "∼과 관련된"은 항원이 병원체, 암, 자가 면역 질병, 음식 알레르기, 호흡기 알레르기, 천식 또는 다른 질병이 존재하는 경우에 존재하지만, 병원체, 암, 자가면역 질병, 음식 알레르기, 호흡기 알레르기, 또는 질병이 없는 경우, 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재함을 의미한다. The antigen is preferably selected from the group consisting of antigens associated with pathogens, antigens associated with cancer, antigens associated with autoimmune diseases, and other diseases such as, but not limited to, antigens associated with veterinary or poultry diseases. For the purposes of the present invention, "associated with" means that the antigen is present when a pathogen, cancer, autoimmune disease, food allergy, respiratory allergy, asthma or other disease is present, but the pathogen, cancer, autoimmune disease, food allergy , In the absence of respiratory allergies, or disease, means nonexistent or present in reduced amounts.

이뮤노머는 항원에 공유적으로 연결되거나, 항원과 작동가능하게 결합된다. 본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 결합된다"는 것은 이뮤노머와 항원 두가지의 활성이 모두 유지되는 모든 결합을 의미한다. 그러한 작동가능한 결합의 가능한 예는 동일한 리포솜 또는 다른 그러한 전달 비히클 또는 시약의 일부가 되는 것을 포함한다. 이뮤노머가 항원에 공유적으로 연결되는 구체예에서 그러한 공유 연결은 바람직하게는 면역자극성 올리고뉴클레오티드의 접근가능한 5' 말단이외의 이뮤노머의 어떠한 위치에서든 일어난다. 예를 들어 항원은 뉴클레오시드간 연결에 부착될 수 있거나 비-뉴클레오티드 링커에 부착될 수 있다. 또한, 항원은 그 자체가 비-뉴클레오티드 링커일 수 있다. Immunomers are covalently linked to antigens or operably linked to antigens. As used herein, the term “operably bound” means any binding in which the activity of both an immunomer and an antigen is maintained. Possible examples of such operable linkages include being part of the same liposome or other such delivery vehicle or reagent. In embodiments in which the immunoomer is covalently linked to the antigen, such covalent linkage preferably occurs at any position of the immunoomer other than the accessible 5 'end of the immunostimulatory oligonucleotide. For example, the antigen can be attached to an internucleoside linkage or can be attached to a non-nucleotide linker. In addition, the antigen may itself be a non-nucleotide linker.

제 3 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트와 생리적으로 허용될 수 있는 담체를 포함하는 약제학적 제형을 제공한다. 본원에서 사용되는 용어 "생리적으로 허용될 수 있는"은 이뮤노머의 효력을 방해하지 않고 세포, 세포 배양물, 조직, 또는 유기체와 같은 생물학적 시스템과 양립할 수 있는 물질을 말한다. 바람직하게는 생물학적 시스템은 살아있는 유기체, 예컨대 척추동물이다. In a third aspect, the present invention provides a pharmaceutical formulation comprising an immunomer or an immunoconjugate according to the invention and a physiologically acceptable carrier. As used herein, the term “physiologically acceptable” refers to a substance that is compatible with biological systems such as cells, cell cultures, tissues, or organisms without interfering with the effects of the immunomers. Preferably the biological system is a living organism, such as a vertebrate.

본원에서 사용되는 용어 "담체"는 어떠한 부형제, 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제, 지질, 또는 약제학적 제형에 사용되는 당해 기술분야에 잘 알려져 있는 다른 물질을 포함한다. 담체, 부형제, 또는 희석제의 특징은 특정 적용에 대한 투여 경로에 따라 좌우되는 것으로 이해되어야 한다. 이들 물질을 함 유하고 있는 약제학적으로 허용될 수 있는 제형의 제법은 문헌에 기술되어 있다 (예컨대 Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, ed., A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990). The term "carrier" as used herein includes any excipients, diluents, fillers, salts, buffers, stabilizers, solubilizers, lipids, or other materials well known in the art for use in pharmaceutical formulations. It is to be understood that the characteristics of the carrier, excipient, or diluent will depend on the route of administration for the particular application. The preparation of pharmaceutically acceptable formulations containing these substances is described in the literature (eg Remington's Pharmaceutical Sciences , 18th Edition, ed., A. Gennaro, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990). .

제 4 측면으로, 본 발명은 본 발명에 따른 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 척추동물에 투여하는 것을 포함하여 척추동물에게서 면역 반응을 유발시키기 위한 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 척추동물은 포유류이다. 본 발명의 목적상, 용어 "포유류"는 사람을 포함하는 것으로 명백하게 의도된다. 바람직한 구체예에서 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트는 면역자극이 필요한 척추동물에 투여된다. In a fourth aspect, the present invention provides a method for eliciting an immune response in a vertebrate, including administering an immunomer or an immunoconjugate according to the invention to a vertebrate. In some embodiments, the vertebrate is a mammal. For the purposes of the present invention, the term "mammal" is expressly intended to include humans. In a preferred embodiment the immunomer or immunoconjugate is administered to a vertebrate in need of immunostimulation.

본 발명의 이러한 측면에 따른 방법에서 이뮤노머는 어떠한 적당한 경로, 예컨대 제한 없이, 비경구, 경구, 혀 밑, 경피, 비내, 에어로솔, 안내 (intraocular), 기관지내, 직장내, 질내, 유전자 총 (gene gun)에 의해, 피부 패치 또는 점안액으로, 또는 구강세척액 형태로 투여될 수 있다. 이뮤노머의 치료적 조성물의 투여는 질병의 징후 또는 대용 마커를 감소시키는 데에 효과적인 용량으로 및 기간동안 공지된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 전신적으로 투여될 때 치료적 조성물은 바람직하게는 약 0.0001 μM 내지 약 10 μM 의 이뮤노머 혈중 수준을 수득하기에 충분한 용량으로 투여된다. 국소 투여를 위해서는 이것보다 훨씬 더 낮은 농도가 효과적일 것이며, 훨씬 더 높은 농도도 허용될 수 있다. 바람직하게는 이뮤노머의 전체 용량 범위는 환자당 약 0.001 mg 내지 약 200 mg/kg 체중/일일 것이다. 치료적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 치료 조성물을 개체에게 단일 치로 에피소드로서 동시에, 또는 차례로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. In a method according to this aspect of the invention the immunomer may be used without any suitable route, such as without limitation, parenteral, oral, sublingual, transdermal, nasal, aerosol, intraocular, intrabronchial, rectal, vaginal, gene gun ( gene gun), or may be administered in the form of dermal patches or eye drops, or in the form of mouthwashes. Administration of the therapeutic composition of the immunomers may be carried out using known procedures and at dosages effective for reducing the signs of a disease or a surrogate marker. When administered systemically, the therapeutic composition is preferably administered at a dose sufficient to obtain immunomeric blood levels of from about 0.0001 μM to about 10 μM. Much lower concentrations will be effective for topical administration, and even higher concentrations may be acceptable. Preferably the full dose range of the immunoomer will be from about 0.001 mg to about 200 mg / kg body weight / day per patient. It may be desirable to administer a therapeutically effective amount of one or more therapeutic compositions of the invention to a subject simultaneously, or in sequence, as a single tooth.

어떤 바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 이뮤노머는 백신, 항체, 세포독성 제제, 알레르겐, 항생물질, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 단백질, 유전자 요법 벡터, DNA 백신 및/또는 면역 반응의 특이성 또는 크기를 증강시키기 위한 보조제와 함께 투여된다. 이들 구체예에서, 본 발명의 이뮤노머는 보조제로서 다양하게 작용할 수 있고/있거나 직접적인 면역자극 효과를 생성시킬 수 있다. In certain preferred embodiments the immunomers according to the invention enhance the specificity or size of vaccines, antibodies, cytotoxic agents, allergens, antibiotics, antisense oligonucleotides, peptides, proteins, gene therapy vectors, DNA vaccines and / or immune responses. Together with adjuvant to make. In these embodiments, the immunomers of the invention can act variously as an adjuvant and / or produce a direct immunostimulatory effect.

이뮤노머든 백신이든, 또는 둘 다이든, 임의로 면역원성 단백질, 예컨대 키호울 림펫 헤모시아닌 (KLH), 콜레라 독소 B 서브유닛, 또는 다른 어떠한 면역원성 담체 단백질에 결합될 수 있다. 임의의 보조제, 예를 들면 제한 없이, 프로인트 완전 보조제, KLH, 모노포스포릴 지질 A (MPL), 명반, 및 사포닌, 예컨대 QS-21, 이미퀴모드 (imiquimod), R848, 또는 이들의 조합물이 과잉으로 사용될 수 있다. Either an immunomer or a vaccine, or both, may optionally be bound to an immunogenic protein such as keyhole limpet hemocyanin (KLH), cholera toxin B subunit, or any other immunogenic carrier protein. Any adjuvant such as, but not limited to Freund's complete adjuvant, KLH, monophosphoryl lipid A (MPL), alum, and saponins such as QS-21, imiquimod, R848, or combinations thereof This can be used in excess.

본 발명의 이러한 측면의 목적상, 용어 "∼과 함께"는 동일한 환자의 동일한 질병을 치료하는 과정중에 있는 것을 의미하고, 이뮤노머 및/또는 백신 및/또는 보조제를 어떠한 순서로든, 예를 들어 동시에 투여하는 것 뿐 아니라 일시적으로 여러날 간격을 두고 순차적으로 투여하는 것을 포함한다. 그러한 병용 처리는 또한 이뮤노머, 및/또는 독립적으로 백신, 및/또는 독립적으로 보조제의 1회 이상의 투여를 포함할 수 있다. 이뮤노머 및/또는 백신 및/또는 보조제의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 이루어질 수 있다. For the purposes of this aspect of the invention, the term "in conjunction with" means being in the process of treating the same disease of the same patient and in any order, for example simultaneously, an immunomer and / or vaccine and / or adjuvant In addition to administration, it includes temporary administration sequentially at several days intervals. Such concomitant treatments may also include administration of one or more of the immunomers and / or independently of the vaccine, and / or independently of the adjuvant. Administration of immunomers and / or vaccines and / or adjuvants may be by the same or different routes.

본 발명의 이러한 측면에 따른 방법은 면역계의 모델 연구에 유용하다. 이 방법은 또한 사람 또는 동물 질병의 예방 또는 치료적 처리에도 유용하다. 예를 들 면 방법은 가금류 및 수의학적 백신 분야에 유용하다. The method according to this aspect of the invention is useful for model studies of the immune system. This method is also useful for the prophylactic or therapeutic treatment of human or animal diseases. For example, the method is useful in poultry and veterinary vaccines.

제 5 측면으로, 본 발명은 환자에게 본 발명의 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트를 투여하는 것을 포함하여 질병 또는 장애를 가지고 있는 환자를 치료적으로 처리하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에서 처리될 질병 또는 장애는 암, 자가면역 질병, 기도 염증, 염증성 질병, 알레르기, 천식 또는 병원체에 의해 유발되는 질병이다. 병원체에는 세균, 기생충, 진균, 바이러스, 비로이드, 및 프리온이 있다. 투여는 발명의 제 4 측면에서 설명된 것과 같이 수행된다. In a fifth aspect, the present invention provides a method of therapeutically treating a patient having a disease or disorder comprising administering to the patient an immunonomer or immunoconjugate of the invention. In various embodiments the disease or disorder to be treated is a disease caused by cancer, autoimmune disease, airway inflammation, inflammatory disease, allergy, asthma or pathogens. Pathogens include bacteria, parasites, fungi, viruses, viroids, and prions. Administration is carried out as described in the fourth aspect of the invention.

본 발명의 목적상, 용어 "알레르기"는 제한 없이 음식 알레르기 및 호흡기 알레르기를 포함한다. 용어 "기도 염증"은 제한 없이 천식을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "자가면역 질병"은 "자기 (self)" 단백질이 면역계에 의해 공격을 받는 질병을 나타낸다. 그러한 용어는 자가면역 천식을 포함한다. For the purposes of the present invention, the term "allergy" includes, without limitation, food allergy and respiratory allergy. The term "airway inflammation" includes asthma without limitation. As used herein, the term "autoimmune disease" refers to a disease in which "self" proteins are attacked by the immune system. Such terms include autoimmune asthma.

본 발명의 이러한 측면에 따른 방법중 어떠한 것에서도 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트는 질병 또는 질환을 치료하는데 유용하면서 이뮤노머의 면역자극성 효과를 감소시키지 않는 다른 어떠한 제제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면 암의 치료에서, 이뮤노머 또는 이뮤노머 컨쥬게이트는 화학요법용 화합물과 함께 투여될 수 있는 것으로 고려된다. In any of the methods according to this aspect of the invention, the immunomer or immunoconjugate may be administered with any other agent that is useful for treating the disease or condition but does not reduce the immunostimulatory effect of the immunomer. For example, in the treatment of cancer, it is contemplated that immunomers or immunoconjugates may be administered with chemotherapeutic compounds.

하기의 실시예는 발명의 특정한 바람직한 구체예를 추가로 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범주를 제한하려는 의도는 없다. The following examples are intended to further illustrate certain preferred embodiments of the invention and are not intended to limit the scope of the invention.

실시예 1: 면역자극성 부분을 함유하고 있는 올리고뉴클레오티드의 합성Example 1 Synthesis of Oligonucleotides Containing Immunostimulatory Parts

올리고뉴클레오티드를 1 ㎛ 규모로 자동 DNA 합성기 (Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)를 사용하여, 도 5 및 6에 개략적으로 도시된 선형 합성 또는 병렬 합성 절차에 따라 합성하였다. Oligonucleotides were synthesized on an 1 μm scale using an automated DNA synthesizer (Expedite 8909; PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.) Following the linear synthesis or parallel synthesis procedures outlined in FIGS. 5 and 6.

어플라이드 바이오시스템스사 (Applied Biosystems, Foster City, CA)로부터 데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트를 얻었다. 1',2'-디데옥시리보스 포스포라미다이트, 프로필-1-포스포라미다이트, 2-데옥시우리딘 포스포라미다이트, 1,3-비스-[5-(4,4'-디메톡시트리틸)펜틸아미딜]-2-프로판올 포스포라미다이트 및 메틸 포스포라미다이트를 글렌 리서치(Glen Research, Sterling, VA)로부터 얻었다. β-L-2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트, α-2'-데옥시리보뉴클레오시드 포스포라미다이트, 모노-DMT-글리세롤 포스포라미다이트 및 디-DMT-글리세롤 포스포라미다이트를 켐젠스 (ChemGens, Ashland, MA)로부터 얻었다. (4-아미노부틸)-1,3-프로판디올 포스포라미다이트를 클론테크 (Clontech, Palo Alto, CA)로부터 얻었다. 아라비노시티딘 포스포라미다이트, 아라비노구아노신, 아라비노티미딘 및 아라비노우리딘을 릴라이어블 파마슈티칼 (Reliable Pharmaceutical, St.Louis, MO)로부터 얻었다. 아라비노구아노신 포스포라미다이트, 아라비노티미딘 포스포라미다이트 및 아라비노우리딘 포스포라미다이트를 하이브리돈, 인크. (Hybridon, Inc., Cambridge, MA)에서 합성하였다 (Noronha et al., (2000) Biochem. 39:7050-7062). Deoxyribonucleoside phosphoramidite was obtained from Applied Biosystems, Foster City, Calif. 1 ', 2'-dideoxyribose phosphoramidite, propyl-1-phosphoramidite, 2-deoxyuridine phosphoramidite, 1,3-bis- [5- (4,4'-dimeth Methoxytrityl) pentylamidyl] -2-propanol phosphoramidite and methyl phosphoramidite were obtained from Glen Research (Sterling, VA). β-L-2'-deoxyribonucleoside phosphoramidite, α-2'-deoxyribonucleoside phosphoramidite, mono-DMT-glycerol phosphoramidite and di-DMT-glycerol phosphate Poramidite was obtained from ChemGens, Ashland, Mass. (4-aminobutyl) -1,3-propanediol phosphoramidite was obtained from Clontech, Palo Alto, CA. Arabinocytidine phosphoramidite, arabinoguanosine, arabinothymidine and arabinouridine were obtained from Reliable Pharmaceutical, St. Louis, Mo. Arabinoguanosine phosphoramidite, arabinothymidine phosphoramidite and arabinouridine phosphoramidite are hybridon, inc. (Hybridon, Inc., Cambridge, Mass.) (Noronha et al., (2000) Biochem. 39: 7050-7062).

모든 뉴클레오시드 포스포라미다이트를 31P와 1H NMR 스펙트럼을 사용하여 특성을 확인하였다. 변형된 뉴클레오시드를 특정 부위에서 정상적인 커플링 사이클을 사용하여 통합시켰다. 합성 후에 올리고뉴클레오티드를 농축된 수산화 암모늄으로 탈보호시키고 역상 HPLC에 의하여 정제한 다음 투석하였다. 나트륨염 형태로서의 정제된 올리고뉴클레오티드를 사용전에 동결건조시켰다. 순도는 CGE 및 MALDI-TOF MS에 의해 시험하였다. All nucleoside phosphoramidites were characterized using 31 P and 1 H NMR spectra. Modified nucleosides were integrated at normal sites using normal coupling cycles. After synthesis the oligonucleotides were deprotected with concentrated ammonium hydroxide and purified by reverse phase HPLC and then dialyzed. Purified oligonucleotides in sodium salt form were lyophilized prior to use. Purity was tested by CGE and MALDI-TOF MS.

실시예 2: 비장 세포 증식의 분석Example 2: Analysis of Spleen Cell Proliferation

비장세포 증식의 시험관내 분석은 전술한 바와 같은 표준 절차를 사용하여 수행하였다 (참조: Zhao et al., Biochem Pharma 51:173-182 (1996)). 그 결과는 도 8a에 도시된다. 이들 결과는 고농도에서 2 개의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 이뮤노머 6이 접근가능한 5' 말단이 없는 이뮤노머 5 또는 접근가능한 5' 말단이 하나 있는 올리고뉴클레오티드 4보다 더 큰 폭으로 비장세포 증식을 유발하였음을 입증한다. 이뮤노머 6은 또한 LPS 포지티브 대조표준보다 더 큰 폭의 비장세포 증식을 유발한다. In vitro analysis of splenocyte proliferation was performed using standard procedures as described above (Zhao et al., Biochem Pharma 51: 173-182 (1996)). The result is shown in FIG. 8A. These results show that spontaneous cell proliferation at greater concentrations is greater than that of immunonomer 6 having two accessible 5 'ends, but less than immunomeric 5 without accessible 5' end or oligonucleotide 4 with one accessible 5 'end. Demonstrate that Immunomer 6 also causes greater splenocyte proliferation than LPS positive controls.

실시예 3: 생체내 비장비대 분석Example 3: In vivo Non-large Size Assay

시험관내 결과의 생체내 모델로의 적응성을 시험하기 위하여 선택된 올리고뉴클레오티드를 마우스에 투여하고 비장비대의 정도를 면역자극 활성의 수준의 지표로서 측정하였다. 5 mg/kg의 단일 용량을 BALB/c 마우스 (암컷, 생후 4-6주, Harlan Sprague Dawley Inc., Baltic, CT)에 복강내로 투여하였다. 마우스를 올리고뉴클레오티드 투여후 72시간 후에 희생시키고, 비장을 꺼내어 무게를 측정하였다. 그 결과는 도 8b에 도시된다. 이들 결과는 2 개의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 이뮤노머 6이 올리고뉴클레오티드 4 또는 이뮤노머 5보다 더 훨씬 큰 면역자극 효과를 가지고 있음을 입증한다. To test the adaptability of the in vitro results to the in vivo model, selected oligonucleotides were administered to mice and the extent of the paraplegia was measured as an indicator of the level of immunostimulatory activity. A single dose of 5 mg / kg was administered intraperitoneally to BALB / c mice (females, 4-6 weeks, Harlan Sprague Dawley Inc., Baltic, CT). Mice were sacrificed 72 hours after oligonucleotide administration and the spleen was taken out and weighed. The result is shown in FIG. 8B. These results demonstrate that immunomer 6 with two accessible 5 ′ ends has a much greater immunostimulatory effect than oligonucleotide 4 or immunomer 5.

실시예 4: 시토킨 분석Example 4: Cytokine Assay

척추동물 세포, 바람직하게는 BALB/c 마우스 비장 세포 또는 사람 PBMC에서의 IL-12 및 IL-6의 분비를 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 시토킨 항체와 시토킨 표준을 포함하는 필요한 시약들은 파밍겐 (PharMingen, San Diego, CA)으로부터 구입하였다. ELISA 플레이트 (Costar)를 PBSN 완충액 (PBS/0.05 % 나트륨 아지드, pH 9.6)중의 5 ㎍/ml 농도의 적절한 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한 후, PBS/1 % BSA로 37 ℃에서 30분동안 차단하였다. 세포 배양 상층액 및 시토킨 표준을 PBS/10 % FBS로 적당하게 희석하고 플레이트에 삼중으로 첨가한 다음 25 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트 위를 1 ㎍/ml의 적당한 비오티닐화된 항체로 덮고 25℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS-T 완충액 (PBS/0.05 % 트윈 20)으로 집중적으로 세척하고 다시 25 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션한 후, 스트렙트아비딘 컨쥬게이션된 퍼옥시다제 (Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하였다. 플레이트를 Sure BlueTM (Kirkegaard and Perry) 발색 시약으로 전개시키고 스탑 용액 (Stop Solution) (Kirkegaard and Perry)을 첨가함으로써 반응을 종결지었다. 색 변화를 Ceres 900 HDI 분광계 (Bio-Tek Instruments)상에서 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5A에 나타내었다. The secretion of IL-12 and IL-6 in vertebrate cells, preferably BALB / c mouse spleen cells or human PBMCs, was determined by sandwich ELISA. Necessary reagents, including cytokine antibodies and cytokine standards, were purchased from PharMingen, San Diego, CA. ELISA plates (Costar) were incubated at 4 ° C. overnight with appropriate antibody at a concentration of 5 μg / ml in PBSN buffer (PBS / 0.05% sodium azide, pH 9.6), followed by 30 min at 37 ° C. with PBS / 1% BSA. Blocked. Cell culture supernatants and cytokine standards were appropriately diluted with PBS / 10% FBS and added to the plate in triplicate and incubated at 25 ° C. for 2 hours. The plate was covered with 1 μg / ml of the appropriate biotinylated antibody and incubated at 25 ° C. for 1.5 hours. The plates were then intensively washed with PBS-T buffer (PBS / 0.05% Tween 20) and again incubated at 25 ° C. for 1.5 hours before streptavidin conjugated peroxidase (Sigma, St. Louis, MO) Was added. The plate was developed with Sure Blue ™ (Kirkegaard and Perry) coloration reagent and the reaction was terminated by the addition of Stop Solution (Kirkegaard and Perry). Color change was measured on a Ceres 900 HDI spectrometer (Bio-Tek Instruments). The results are shown in Table 5A below.

사람 말초혈 단핵세포 (PBMC)를 건강한 자원자의 말초혈로부터 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리 (Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO)에 의해 분리하였다. 간단하게 설명하면, 헤파린 처리된 혈액을 원추형 원심분리기에서 Histopaque-1077 (동일한 부피)위에 놓고 400×g에서 30분 동안 실온에서 원심분리하였다. 단핵세포를 함유하고 있는 담황갈색의 막 (buffy coat)을 조심스럽게 제거하여 등장성 인산염 완충된 식염수 (PBS)로 250×g에서 10분 동안 원심분리함으로써 2회 세척하였다. 그런 다음 그 결과의 세포 펠릿을 L-글루타민 (Media Tech, Inc., Herndon, VA)을 함유하고 10 % 열처리 비활성화된 FCS 및 페니실린-스트렙토마이신 (100 U/ml)이 첨가되어 있는 RPMI 1640 배지에 재현탁시켰다. 세포를 올리고뉴클레오티드의 존재 또는 부재하에 1×106 세포/ml/웰에서 상이한 기간동안 24웰 플레이트에서 배양하였다. 배양 기간의 종료시에, 상층액을 수득하여 -70 ℃에서 동결건조시켜서 저장한 후에 다양한 시토킨, 예를 들면 IL-6 (BD Pharmingen, San Diego, CA), IL-10 (BD Pharmingen), IL-12 (BioSource International, Camarillo, CA), IFN-α (BioSource International) 및 -γ (BD Pharmingen) 및 TNF-α (BD Pharmingen)를 샌드위치 ELISA에 의하여 분석하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were isolated from peripheral blood of healthy volunteers by Ficoll-Paque density gradient centrifugation (Histopaque-1077, Sigma, St. Louis, MO). Briefly, heparinized blood was placed on Histopaque-1077 (equal volume) in a conical centrifuge and centrifuged at 400 × g for 30 minutes at room temperature. The buffy coat containing monocytes was carefully removed and washed twice by centrifugation at 250 x g for 10 minutes with isotonic phosphate buffered saline (PBS). The resulting cell pellet was then added to RPMI 1640 medium containing L-glutamine (Media Tech, Inc., Herndon, VA) and added 10% heat-inactivated FCS and penicillin-streptomycin (100 U / ml). Resuspend. Cells were cultured in 24-well plates at different times at 1 × 10 6 cells / ml / well with or without oligonucleotides. At the end of the incubation period, the supernatants were obtained and lyophilized and stored at −70 ° C. before various cytokines such as IL-6 (BD Pharmingen, San Diego, CA), IL-10 (BD Pharmingen), IL -12 (BioSource International, Camarillo, Calif.), IFN-α (BioSource International) and -γ (BD Pharmingen) and TNF-α (BD Pharmingen) were analyzed by sandwich ELISA. The results are shown in Table 5 below.

모든 경우에 세포 배양 상층액중의 IL-12 및 IL-6의 수준을, IL-12 및 IL-6 각각에 대하여 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. 세포 배양 상층액중의 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α의 수준을 IL-10, IFN-감마 및 TNF-α 각각에 대하여 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. In all cases the levels of IL-12 and IL-6 in cell culture supernatants were calculated from standard curves drawn under the same experimental conditions for IL-12 and IL-6, respectively. The levels of IL-10, IFN-gamma and TNF-α in cell culture supernatants were calculated from standard curves prepared under the same experimental conditions for IL-10, IFN-gamma and TNF-α, respectively.

표 5. 이뮤노머 구조 및 사람 PBMC 배양물중의 면역자극 활성Table 5. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity in Human PBMC Cultures

올리고 번호Raised number 서열 및 변형 (5'-3')  Sequence and Modifications (5'-3 ') 올리고 길이/ 또는 각 사슬Oligo length / or each chain IL-12 (pg/ml) D1 D2IL-12 (pg / ml) D1 D2 IL-6 (pg/ml) D1 D2 IL-6 (pg / ml) D1 D2 25  25 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3' 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3 ' 18량체 (PS) 18-mer (PS) 184 332184 332 3077 53693077 5369 26  26 5'-TCTGTCR1TTCT-3'＼ X1 5'-TCTGTCR1TTCT-3'/5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'＼ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3 '/ 11량체 (PS) 11-mer (PS) 237 352237 352 3724 48923724 4892

올리고 번호Raised number 서열 및 변형 (5'-3')  Sequence and Modifications (5'-3 ') 올리고 길이/ 또는 각 사슬Oligo length / or each chain IL-10 (pg/ml) D1 D2IL-10 (pg / ml) D1 D2 IFN-γ(pg/ml) D1 D2IFN-γ (pg / ml) D1 D2 25  25 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3' 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3 ' 18량체 (PS) 18-mer (PS) 37 8837 88 125 84125 84 26  26 5'-TCTGTCR1TTCT-3'＼ X1 5'-TCTGTCR1TTCT-3'/5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'＼ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3 '/ 11량체 (PS) 11-mer (PS) 48 13948 139 251 40251 40

올리고 번호Raised number 서열 및 변형 (5'-3')   Sequence and Modifications (5'-3 ') 올리고 길이/ 또는 각 사슬Oligo length / or each chain TNF-α(pg/ml) D1 D2TNF-α (pg / ml) D1 D2 25  25 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3' 5'-CTATCTGTCGTTCTCTGT-3 ' 18량체 (PS) 18-mer (PS) 537 nt537 nt 26  26 5'-TCTGTCR1TTCT-3'＼ X1 5'-TCTGTCR1TTCT-3'/5'-TCTGTCR 1 TTCT-3'＼ X 1 5'-TCTGTCR 1 TTCT-3 '/ 11량체 (PS) 11-mer (PS) 681 nt681 nt

D1 및 D2는 공여체 1 및 2이다. D1 and D2 are donors 1 and 2.

표 5A. 이뮤노머 구조 및 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 중의 면역자극 활 성Table 5A. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity in BALB / c Mouse Spleen Cell Cultures

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정상적인 글씨체는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; 이탤릭체는 포스포디에스테르 연결을 나타낸다. Normal font indicates phosphorothioate linkages; Italics indicate phosphodiester linkages.                 

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또한, 도 7a 내지 7c에 도시된 결과는 2 개의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있는 올리고뉴클레오티드 2가 낮은 농도에서 각각 하나의 접근가능한 5' 말단을 가지고 있거나 없는 올리고뉴클레오티드 1 또는 3보다 IL-12와 IL-6을 상승시키지만, IL-10은 그렇지 않았음을 입증한다. In addition, the results shown in FIGS. 7A-7C show that oligonucleotide 2 with two accessible 5 ′ ends is less than oligonucleotide 1 or 3 with or without one accessible 5 ′ end each at low concentration. Raises IL-6, but demonstrates that IL-10 was not.

실시예 5: 사슬 길이가 이뮤노머의 면역자극 활성에 미치는 효과Example 5 Effect of Chain Length on Immunostimulatory Activity of Immunomers

올리고뉴클레오티드 사슬의 길이의 효과를 연구하기 위하여 각 사슬에 18, 14, 11 및 8개의 뉴클레오티드를 함유하고 있는 이뮤노머를 합성하고, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 시토킨 IL-12 및 IL-6의 분비를 유도하는 그것들의 능력에 의해 측정하여, 면역자극 활성에 대하여 시험하였다 (표 6-8). 이 실시예와 후속하는 모든 실시예에서 시토킨 검정은 실시예 4에서 설명된 것처럼 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 수행하였다. To study the effect of the length of the oligonucleotide chains, immunomers containing 18, 14, 11 and 8 nucleotides in each chain were synthesized and cytokine IL-12 and IL- in BALB / c mouse spleen cell cultures. Measured by their ability to induce secretion of 6, tested for immunostimulatory activity (Table 6-8). In this example and all subsequent examples, cytokine assays were performed in BALB / c mouse spleen cell culture as described in Example 4.

표 6. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성Table 6. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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표 7. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성Table 7. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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표 8. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성Table 8. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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상기의 결과들은 이뮤노머의 면역자극 활성이 올리고뉴클레오티드 사슬의 길이가 18-량체로부터 7-량체로 감소됨에 따라 증가되었음을 보여준다. 6-량체 또는 5-량체 정도의 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬을 가지고 있는 이뮤노머는 단일 5' 말단을 가지고 있는 18-량체의 올리고뉴클레오티드의 면역자극 활성에 필적하는 면역자극 활성을 보였다. 그러나, 6-량체 또는 5-량체 정도의 짧은 올리고뉴클레오티드 사슬 길이를 가지는 이뮤노머는 링커가 약 2 Å 내지 약 200 Å의 길이인 경우에 면역자극 활성을 증가시켰다. The results show that the immunostimulatory activity of the immunomers increased as the length of the oligonucleotide chain decreased from 18-mer to 7-mer. Immunomers with oligonucleotide chains as short as 6- or 5-mers showed immunostimulatory activity comparable to the immunostimulatory activity of 18-mer oligonucleotides with a single 5 'end. However, immunomers with oligonucleotide chain lengths as short as 6- or 5-mers increased immunostimulatory activity when the linker was between about 2 GPa and about 200 GPa in length.

실시예 6: 비-천연 피리미딘 또는 비-천연 푸린 뉴클레오시드를 함유하고 있는 이뮤노머의 면역자극 활성Example 6: Immunostimulatory Activity of Immunomers Containing Non-Natural Pyrimidines or Non-Natural Purine Nucleosides

하기 표 9 내지 11에서 나타내는 바와 같이 면역자극 활성은 면역자극성 디뉴클레오티드 모티프에 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드 또는 비-천연 푸린 뉴클레오시드를 가지고 있는 다양한 길이의 이뮤노머에 대해 유지되었다. As shown in Tables 9-11 below, immunostimulatory activity was maintained for immunolengths of varying lengths having non-natural pyrimidine nucleosides or non-natural purine nucleosides in the immunostimulatory dinucleotide motif.

표 9. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성Table 9. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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표 10. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 10. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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표 11. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 11. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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실시예 7: 링커가 면역자극 활성에 미치는 효과Example 7: Effect of Linker on Immunostimulatory Activity

2개의 올리고뉴클레오티드를 연결시키는 링커의 길이의 효과를 조사하기 위하여, 동일한 올리고뉴클레오티드를 함유하지만 링커는 상이한 이뮤노머들을 합성하여 면역자극 활성에 대하여 시험하였다. 하기 표 12에 나타낸 그 결과는 링커의 길이가 이뮤노머의 면역자극 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 가장 좋은 면역자극 효과는 산재된 포스페이트 전하를 가지고 있는 비염기성 링커 또는 C3- 내지 C6-알킬 링커를 사용하는 경우에 달성되었다. To investigate the effect of the length of the linker linking two oligonucleotides, the linker containing the same oligonucleotide but different immunomers were synthesized and tested for immunostimulatory activity. The results, shown in Table 12 below, suggest that the length of the linker plays an important role in the immunostimulatory activity of the immunomers. The best immunostimulatory effect was achieved when using non-basic linkers or C3- to C6-alkyl linkers with scattered phosphate charges.

표 12. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성 Table 12. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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실시예 8: 올리고뉴클레오티드 골격이 면역자극 활성에 미치는 효과Example 8 Effect of Oligonucleotide Skeleton on Immunostimulatory Activity

일반적으로 천연 포스포디에스테르 골격을 함유하는 면역자극성 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 골격을 가지고 있는 동일한 길이의 올리고뉴클레오티드보다 면역자극성이 덜하다. 이런 더 낮은 정도의 면역자극 활성은 부분적으로는 실험 조건하에서의 포스포디에스테르 올리고뉴클레오티드의 빠른 분해에 기인하는 것일 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 분해는 일차적으로 3' 말단으로부터 올리고뉴클레오티드를 분해시키는 3'-엑소뉴클레아제의 결과이다. 이 실시예의 이뮤노머는 유리 3' 말단을 함유하지 않는다. 그러므로 포스포디에스테르 골격을 가지고 있는 이뮤노머는 실험 조건하에서 상응하는 단량체 올리고뉴클레오티드보다 더 긴 반감기를 가져야 하고, 따라서 개선된 면역자극 활성을 나타내야 한다. 하기 표 13에 나타낸 결과는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 시토킨 유도에 의해 측정된 면역자극 활성을 나타내는 이뮤노머 84 및 85를 사용하여 이런 효과를 증명한다. In general, immunostimulatory oligonucleotides containing a natural phosphodiester backbone are less immunostimulatory than oligonucleotides of the same length having a phosphorothioate backbone. This lower degree of immunostimulatory activity may be due in part to the rapid degradation of phosphodiester oligonucleotides under experimental conditions. Degradation of the oligonucleotide is primarily the result of a 3'-exonuclease that degrades the oligonucleotide from the 3 'end. The immunomers of this example do not contain free 3 'ends. Therefore, immunomers with phosphodiester backbones must have longer half-lives than the corresponding monomeric oligonucleotides under experimental conditions and therefore exhibit improved immunostimulatory activity. The results shown in Table 13 below demonstrate this effect using immunomers 84 and 85 exhibiting immunostimulatory activity measured by cytokine induction in BALB / c mouse spleen cell cultures.

표 13. 이뮤노머 구조 및 면역자극 활성Table 13. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity

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실시예 9: 이뮤노머 73 내지 92의 합성Example 9: Synthesis of Immunomers 73-92

올리고뉴클레오티드를 1 μM 규모로 자동 DNA 합성기 (Expedite 8909 PerSeptive Biosystems)를 사용하여 합성하였다. 데옥시뉴클레오시드 포스포라미다이트는 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems, Foster City, CA)로부터 얻었다. 7-데아자-2'-데옥시구아노신 포스포라미다이트를 글렌 리서치 (Glen Research, Sterling Virginia)로부터 얻었다. 1,3-비스-DMT-글리세롤-CPG 를 켐젠스 (ChemGens, Ashland, MA)로부터 얻었다. 변형된 뉴클레오시드를 정상적인 커플링 사이클을 사용하여 특정 부위에서 올리고뉴클레오티드에 통합하였다. 합성후에 올리고뉴클레오티드를 농축된 수산화 암모늄을 사용하여 탈보호하고, 역상 HPLC에 의하여 정제하고, 투석하였다. 나트륨 염으로서 정제된 올리고뉴클레오티드를 사용전에 동결건조시켰다. 올리고뉴클레오티드의 순도를 CGE 및 MALDI-TOF MS (Bruker Proflex III MALDI-TOF 질량 분광계)에 의해 체크하였다. Oligonucleotides were synthesized using an automated DNA synthesizer (Expedite 8909 PerSeptive Biosystems) at 1 μM scale. Deoxynucleoside phosphoramidite was obtained from Applied Biosystems, Foster City, CA. 7-deaza-2'-deoxyguanosine phosphoramidite was obtained from Glen Research, Sterling Virginia. 1,3-bis-DMT-glycerol-CPG was obtained from ChemGens, Ashland, Mass. Modified nucleosides were incorporated into oligonucleotides at specific sites using normal coupling cycles. After synthesis the oligonucleotides were deprotected using concentrated ammonium hydroxide, purified by reverse phase HPLC and dialyzed. Purified oligonucleotides as sodium salt were lyophilized prior to use. The purity of the oligonucleotides was checked by CGE and MALDI-TOF MS (Bruker Proflex III MALDI-TOF mass spectrometer).

실시예 11: 이뮤노머 안정성Example 11: Immunomer Stability

올리고뉴클레오티드를 10 % 우혈청이 함유되어 있는 PBS 중에서 37 ℃에서 4, 24 또는 48 시간 동안 인큐베이션하였다. 온전한 올리고뉴클레오티드를 모세관 겔 전기영동에 의하여 측정하였다. 그 결과를 하기 표 14에 나타낸다. Oligonucleotides were incubated for 4, 24 or 48 hours at 37 ° C. in PBS containing 10% bovine serum. Intact oligonucleotides were measured by capillary gel electrophoresis. The results are shown in Table 14 below.

표 14. 10 % 우혈청 PBS 용액중에서의 올리고뉴클레오티드의 분해 Table 14. Degradation of Oligonucleotides in 10% Bovine Serum PBS Solution

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실시예 12: 접근가능한 5' 말단이 면역자극 활성에 미치는 효과 Example 12: Effect of Accessible 5 ′ Ends on Immunostimulatory Activity

BALB/c 마우스 (4 내지 8 주) 비장 세포를 RPMI 완전 배지중에서 배양하였다. 뮤린 대식세포-유사 세포인 J774 (ATCC, Rockville, MD)를 10 % (v/v)의 FCS 및 항생물질 (100 IU/ml의 페니실린 G/스트렙토마이신)가 첨가되어 있는 둘베코 변형 이글스 배지중에서 배양하였다. 모든 다른 배양 시약은 메디아테크 (Mediatech, Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. BALB / c mice (4-8 weeks) spleen cells were cultured in RPMI complete medium. Murine macrophage-like cells, J774 (ATCC, Rockville, MD), were treated in Dulbecco's modified Eagle's medium with 10% (v / v) of FCS and antibiotics (100 IU / ml of penicillin G / streptomycin). Incubated. All other culture reagents were purchased from Mediatech, Gaithersburg, MD.

IL-12 및 IL-6에 대한 ELISA. BALB/c 마우스 비장 또는 J774 세포를 24-웰 디쉬에 각각 5×106 또는 1×106 세포/ml의 밀도로 플레이팅하였다. TE 완충액 (10 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA)에 용해된 CpG DNA를, 마우스 비장 세포 배양물에는 최종 농도가 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, 또는 10.0 ㎍/ml이 되도록, 그리고 J774 세포 배양물에 대해서는 최종 농도가 1.0, 3.0 또는 10.0 ㎍/ml이 되도록 첨가하였다. 그런 다음 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하고, 그 상층액을 수집하여 ELISA 검정을 수행하였다. 실험을 각 농도에 대하여 삼중으로 각 CpG DNA에 대하여 2 또는 3회 수행하였다. ELISA for IL-12 and IL-6. BALB / c mouse spleen or J774 cells were plated in 24-well dishes at densities of 5 × 10 6 or 1 × 10 6 cells / ml, respectively. CpG DNA dissolved in TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), in mouse spleen cell cultures, to a final concentration of 0.03, 0.1, 0.3, 1.0, 3.0, or 10.0 μg / ml, And for the J774 cell culture was added so that the final concentration is 1.0, 3.0 or 10.0 μg / ml. Cells were then incubated at 37 ° C. for 24 hours, and the supernatants were collected for ELISA assays. Experiments were performed two or three times for each CpG DNA in triplicate for each concentration.

IL-12 및 IL-6의 분비는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 시토킨 항체 및 표준을 포함하여 필요한 시약들은 파밍겐 (PharMingen)으로부터 구입하였다. ELISA 플레이트 (Costar)를 PBSN 완충액 (PBS/0.05 % 나트륨 아지드, pH 9.6)중의 5 ㎍/ml 농도의 적절한 항체와 함께 밤새 4 ℃에서 인큐베이션한 후, PBS/1 % BSA로 37 ℃에서 30분동안 차단하였다. 세포 배양 상층액 및 시토킨 표준을 PBS/1 % BSA로 적당하게 희석하고 플레이트에 삼중으로 첨가한 다음 25 ℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 1 ㎍/ml의 적당한 비오티닐화된 항체와 함께 25℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 플레이트를 PBS/0.05 % 트윈 20으로 집중적으로 세척한 후 다시 25 ℃에서 1.5 시간 동안 인큐베이션한 후, 스트렙트아비딘 컨쥬게이션된 퍼옥시다제 (Sigma)를 첨가하였다. 플레이트를 Sure BlueTM (Kirkegaard and Perry) 발색 시약으로 전개시키고 스탑 용액 (Kirkegaard and Perry)을 첨가함으로써 반응을 종결지었다. 색 변화를 Ceres 900 HDI 분광계 (Bio-Tek Instruments)상에서 측정하였다. 세포 배양 상층액중의 IL-12 및 IL-6의 수준은 각각 IL-12 와 IL-6에 대한 동일한 실험 조건하에서 작성된 표준 곡선으로부터 계산하였다. 그 결과를 하기 표 15에 나타내었다. The secretion of IL-12 and IL-6 was measured by sandwich ELISA. Necessary reagents, including cytokine antibodies and standards, were purchased from PharMingen. ELISA plates (Costar) were incubated at 4 ° C. overnight with appropriate antibody at a concentration of 5 μg / ml in PBSN buffer (PBS / 0.05% sodium azide, pH 9.6), followed by 30 min at 37 ° C. with PBS / 1% BSA. Blocked. Cell culture supernatants and cytokine standards were appropriately diluted with PBS / 1% BSA and added to the plate in triplicate and incubated at 25 ° C. for 2 hours. Plates were washed and incubated at 25 ° C. for 1.5 hours with 1 μg / ml of appropriate biotinylated antibody. The plates were then intensively washed with PBS / 0.05% Tween 20 and then incubated at 25 ° C. for 1.5 hours before the addition of streptavidin conjugated peroxidase (Sigma). The plate was developed with Sure Blue ™ (Kirkegaard and Perry) coloration reagent and the reaction was terminated by the addition of stop solution (Kirkegaard and Perry). Color change was measured on a Ceres 900 HDI spectrometer (Bio-Tek Instruments). The levels of IL-12 and IL-6 in cell culture supernatants were calculated from standard curves drawn under the same experimental conditions for IL-12 and IL-6, respectively. The results are shown in Table 15 below.

표 15. 연구에 사용된 포스포로티오에이트 CpG DNA 서열 및 변형a Table 15. Phosphorothioate CpG DNA Sequences Used in the Study and Modifications a

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a: 화학적 구조 b ~ l에 대해서는 차트 1 참조; 5'-CG-3' 디뉴클레오티드는 밑줄로 표시한다. a : see chart 1 for chemical structures b to l; 5'-CG-3 'dinucleotide is underlined.

차트 1 Chart 1

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표 16. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중의 CpG DNA-컨쥬게이트에 의한 IL-12 및 IL-6 분비의 유도Table 16. Induction of IL-12 and IL-6 Secretion by CpG DNA-Conjugates in BALB / c Mouse Spleen Cell Cultures

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이들 결과를 함께 고려하면, CpG DNA의 접근가능한 5'-말단은 그것의 최적 면역자극 활성에 필요하며, 더 작은 기, 예컨대 포스포로티오에이트, 모노뉴클레오티드, 또는 디뉴클레오티드는 면역자극 경로에 포함된 수용체 또는 인자들에 대한 CpG DNA의 5'-말단의 이용성을 효과적으로 차단하지 못하는 것으로 나타난다. 그러나 CpG DNA의 5'-말단에서 플루오레신 또는 더 큰 분자같이 큰 분자의 컨쥬게이션은 면역자극 활성을 제거할 수 있다. 이들 결과는 CpG DNA-항원/백신/모노클로날 항체 (mAb) 컨쥬게이트의 면역자극 활성을 연구하는 데 직접적인 영향을 준다. CpG DNA의 5'-말단에서의 백신 또는 mAb와 같은 큰 분자의 컨쥬게이션은 CpG DNA의 차선의 면역자극 활성을 유도할 수 있다. CpG DNA의 3'-말단에서의 기능성 리간드의 컨쥬게이션은 증가된 뉴클레아제 안정성에 기여할 뿐 아니라 생체내에서 CpG DNA의 증가된 면역자극 능력에도 기여한다. Considering these results together, the accessible 5'-end of CpG DNA is required for its optimal immunostimulatory activity, and smaller groups such as phosphorothioate, mononucleotide, or dinucleotide are included in the immunostimulatory pathway. It appears to fail to effectively block the 5'-end availability of CpG DNA to receptors or factors. However, the conjugation of large molecules, such as fluorescein or larger molecules, at the 5'-end of CpG DNA can eliminate immunostimulatory activity. These results have a direct impact on studying the immunostimulatory activity of CpG DNA-antigen / vaccine / monoclonal antibody (mAb) conjugates. Conjugation of large molecules such as vaccines or mAbs at the 5'-end of CpG DNA can induce suboptimal immunostimulatory activity of CpG DNA. Conjugation of functional ligands at the 3'-terminus of CpG DNA not only contributes to increased nuclease stability but also to the increased immunostimulatory capacity of CpG DNA in vivo.

실시예 13: 링커가 시토킨 분비에 미치는 효과 Example 13: Effect of Linker on Cytokine Secretion

본 연구를 위하여 다음의 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 이들 변형된 올리고뉴클레오티드의 각각은 이뮤노머내로 통합될 수 있다. The following oligonucleotides were synthesized for this study. Each of these modified oligonucleotides can be integrated into an immunoomer.

표 17. 치환 위치를 나타내는 CpG DNA의 서열 Table 17 . Sequence of CpG DNA showing Substitution Position

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a: 치환 1 내지 9의 화학적 구조에 대해서는 도 14를 참조하라. 모든 CpG DNA는 포스포로티오에이트 골격이 변형되었다. a : See FIG. 14 for the chemical structure of substitutions 1-9. All CpG DNAs had modified phosphorothioate backbones.

면역자극 활성의 강화를 위한 최적 링커 크기를 평가하기 위해서 본 발명자들은, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 변형된 CpG DNA에 의해 유도된 IL-12 및 IL-6의 분비를 측정하였다. 모든 CpG DNA는 농도-의존성 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하였다. 도 15는 모 CpG DNA와 비교하여, CpG 디뉴클레오티드에 대해 5'-플랭킹 서열에서 다섯번째 뉴클레오티드에 링커를 가지고 있는 선택된 CpG DNA, 116, 119, 126, 130 및 134의 1 ㎍/ml의 농도에서 얻어진 결과를 나타낸다. C2-(1), C3-(2), 및 C4-링커 (3)을 함유한 CpG DNA는 모 CpG DNA 4의 것과 유사한 IL-12 생성물의 분비를 유도하였다. 5'-플랭킹 서열에서 CpG 디뉴클레오티드로부터 다섯번째 뉴클레오티드에 있는 C6 및 C9-링커 (4 및 5)를 함유한 CpG DNA는 모 CpG DNA가 유도한 것보다 더 낮은 수준의 IL-12 분비를 유도하였는데 (도 15), 이것은 C4-링커보다 더 긴 링커의 치환이 더 낮은 수준의 IL-12를 유도하는 결과를 초래하였음을 시사한다. 링커가 있는 다섯개의 모든 CpG DNA는 모 CpG DNA보다 2배 내지 3배 더 높은 IL-6 분비를 유도하였다. 이들 CpG DNA에서 링커의 존재는 링커를 가지고 있지 않은 CpG DNA와 비교하여 IL-6의 유도에 상당한 영향을 주었다. 그러나 본 발명자들은 IL-6 분비에 대한 길이-의존성 링커 효과는 관찰하지 못하였다. In order to assess the optimal linker size for enhancing immunostimulatory activity, we measured the secretion of IL-12 and IL-6 induced by modified CpG DNA in BALB / c mouse spleen cell culture. All CpG DNA induced concentration-dependent IL-12 and IL-6 secretion. FIG. 15 shows a concentration of 1 μg / ml of selected CpG DNA, 116, 119, 126, 130, and 134, with linker at the fifth nucleotide in the 5′-flanking sequence for CpG dinucleotide, as compared to the parent CpG DNA. The results obtained are shown below. CpG DNA containing C2- (1), C3- (2), and C4-linker (3) induced secretion of IL-12 product similar to that of parent CpG DNA 4. CpG DNA containing C6 and C9-linkers (4 and 5) at the fifth nucleotide from the CpG dinucleotide in the 5'- flanking sequence induces lower levels of IL-12 secretion than the parent CpG DNA induced (FIG. 15) suggesting that substitution of longer linkers than C4-linkers resulted in lower levels of IL-12. All five CpG DNAs with linker induced IL-6 secretion two to three times higher than the parent CpG DNA. The presence of linkers in these CpG DNAs had a significant effect on the induction of IL-6 as compared to CpG DNAs without linkers. However, we did not observe the length-dependent linker effect on IL-6 secretion.

에틸렌글리콜-링커를 함유하고 있는 CpG DNA의 면역자극 활성에 미치는 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 트리에틸렌글리콜-링커 (6)가 각각 CpG 디뉴클레오티드에 대해 5'-말단의 다섯번째 뉴클레오티드 위치 및 3'-플랭킹 서열의 네번째 뉴클레오티드 위치에 통합되어 있는 CpG DNA 137 및 138을 합성하였다. 마찬가지로 CpG DNA 139 및 140은 헥사에틸렌글리콜-링커 (7)를 각각 CpG 디뉴클레오티드에 대해 5'- 또는 3'-플랭킹 서열에 함유하고 있다. 네 개의 변형된 CpG DNA (137 ~ 140)를 모두 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 시토킨 유도 (IL-12, IL-6 및 IL-10)에 대하여 시험하고, 모 CpG DNA 4와 비교하였다. 모든 CpG DNA는 시험된 농도 범위 (0.03 내지 10.0 ㎍/ml)에 걸쳐 농도-의존성 시토킨 생성을 유도하였다 (데이터는 제시하지 않음). 0.3 ㎍/ml 농도의 CpG DNA 137 ~ 140에 의해 유도된 시토킨의 수준은 하기 표 18에 나타낸다. 5'-플랭킹 서열에 에틸렌글리콜-링커를 가지고 있는 CpG DNA 137 및 139는 모 CpG DNA 4가 유도한 것보다 더 높은 수준으로 IL-12 (2106±143 및 2066±153 pg/ml) 및 IL-6 (2362±166 및 2507±66 pg/ml) 분비를 유도하였다 (표 18). 동일한 농도에서 137과 139는 모 CpG DNA보다는 약간 더 낮은 수준의 IL-10 분비를 유도하였다 (표 18). 3'-플랭킹 서열에 더 짧은 에틸렌글리콜-링커 (6)를 가지고 있는 CpG DNA 138은 모 CpG DNA와 유사한 IL-12 분비를 유도하였지만, IL-6 및 IL-10 의 수준은 상당히 더 낮았다 (표 18). 더 긴 에틸렌글리콜-링커 (7)를 가지고 있는 CpG NDA 140은 모 CpG DNA와 비교하여, 세 가지의 시험된 모든 시토킨을 상당히 더 낮은 수준으로 유도하였다 (표 18). To investigate the effect on the immunostimulatory activity of CpG DNA containing ethyleneglycol-linker, we found that triethyleneglycol-linker (6) is the 5'-terminal fifth nucleotide position relative to CpG dinucleotide, and CpG DNA 137 and 138 integrated at the fourth nucleotide position of the 3'-flanking sequence were synthesized. Likewise CpG DNA 139 and 140 contain hexaethyleneglycol-linker (7) in the 5'- or 3'- flanking sequence for CpG dinucleotides, respectively. All four modified CpG DNAs (137-140) were tested for cytokine induction (IL-12, IL-6 and IL-10) in BALB / c mouse spleen cell cultures and compared with parental CpG DNA 4 . All CpG DNA induced concentration-dependent cytokine production over the tested concentration range (0.03-10.0 μg / ml) (data not shown). The levels of cytokines induced by CpG DNA 137-140 at a concentration of 0.3 μg / ml are shown in Table 18 below. CpG DNAs 137 and 139 with ethylene glycol-linkers in the 5'- flanking sequence have higher levels of IL-12 (2106 ± 143 and 2066 ± 153 pg / ml) and IL than the parental CpG DNA 4 induced. -6 (2362 ± 166 and 2507 ± 66 pg / ml) secretion was induced (Table 18). At the same concentration, 137 and 139 induced slightly lower levels of IL-10 secretion than the parental CpG DNA (Table 18). CpG DNA 138 with shorter ethylene glycol-linker (6) in the 3'- flanking sequence induced IL-12 secretion similar to the parent CpG DNA, but the levels of IL-6 and IL-10 were significantly lower ( Table 18). CpG NDA 140 with the longer ethylene glycol-linker (7) induced significantly lower levels of all three cytokines tested compared to the parent CpG DNA (Table 18).

트리에틸렌글리콜-링커 (6)가 C9-링커 (5)와 유사한 사슬 길이를 가지고 있긴 하지만, 트리에틸렌글리콜-링커를 함유하고 있는 CpG DNA는 비장 세포 배양물에서 시토킨 분비의 유도에 의해 측정하여 C9-링커를 함유하고 있는 CpG DNA 보다 더 좋은 면역자극 활성을 가지고 있다. 이들 결과는 더 긴 알킬-링커 (4 및 5)를 함유하고 있는 CpG DNA로 관찰된 더 낮은 면역자극 활성이 그것들의 증가된 길이가 아니라 소수성 특성과 관련이 있을 것이라는 점을 시사한다. 이러한 관찰은 본 발명자들로 하여금 면역자극 활성에 대해 친수성 작용기를 함유하고 있는 분지된 알킬-링커의 치환을 조사하게 하였다. Although triethyleneglycol-linker (6) has a chain length similar to C9-linker (5), CpG DNA containing triethyleneglycol-linker is measured by induction of cytokine secretion in spleen cell culture. It has better immunostimulatory activity than CpG DNA containing C9-linker. These results suggest that the lower immunostimulatory activity observed with CpG DNA containing longer alkyl-linkers (4 and 5) would be related to the hydrophobic nature, not their increased length. This observation led us to investigate the substitution of branched alkyl-linkers containing hydrophilic functional groups for immunostimulatory activity.

표 18. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 에틸렌글리콜-링커를 함유하는 CpG DNA에 의해 유도된 시토킨 분비. Table 18 . Cytokine secretion induced by CpG DNA containing ethylene glycol-linker in BALB / c mouse spleen cell culture.

CpG DNA 번호 CpG DNA Number 시토킨, pg/ml                   Cytokines, pg / ml IL-12      IL-12 IL-6      IL-6 IL-10      IL-10 4     4 1887±233   1887 ± 233 2130±221   2130 ± 221 86±14     86 ± 14 137     137 2106±143   2106 ± 143 2362±166   2362 ± 166 78±21     78 ± 21 138     138 1888±259   1888 ± 259 1082±25   1082 ± 25 47±14     47 ± 14 139     139 2066±153   2066 ± 153 2507±66   2507 ± 66 73±17     73 ± 17 140     140 1318±162   1318 ± 162 476±13    476 ± 13 25±5     25 ± 5 매질     medium 84±13     84 ± 13 33±6     33 ± 6 2±1      2 ± 1

분지된 알킬-링커를 함유하고 있는 CpG DNA의 면역자극 활성에 미치는 효과를 시험하기 위하여 히드록실 (8) 또는 아민 (9) 작용기를 함유하는 2개의 분지된 알킬-링커를 모 CpG DNA 4에 통합시키고 그 결과 변형된 CpG DNA (150 ~ 154-표 19)의 면역자극 활성에 미치는 효과를 조사하였다. 상이한 뉴클레오티드 위치에 아미노-링커 (9)를 함유하고 있는 CpG DNA 150 내지 154를 사용하여 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 (증식) 및 생체내에서 (비장비대) 얻어진 데이터를 하기 표 19에 나타내었다. Incorporation of two branched alkyl-linkers containing hydroxyl (8) or amine (9) functional groups into the parent CpG DNA 4 to test the effect on the immunostimulatory activity of CpG DNA containing branched alkyl-linkers As a result, the effect on the immunostimulatory activity of the modified CpG DNA (150 ~ 154-Table 19) was investigated. The data obtained in (proliferation) and in vivo (non-rigid) in BALB / c mouse spleen cell cultures using CpG DNA 150-154 containing amino-linker (9) at different nucleotide positions are shown in Table 19 below. It was.

표 19. BALB/c 마우스 비장 세포 배양물 및 BALB/c 마우스의 비장 비대에서 아미노부티릴 프로판디올-링커를 함유하고 있는 CpG DNA에 의해 유도된 비장 세포 증식 Table 19 . Spleen Cell Proliferation Induced by CpG DNA Containing Aminobutyryl Propanediol-Linker in BALB / c Mouse Spleen Cell Cultures and Spleen Hyperplasia of BALB / c Mice

CpG DNA 번호a CpG DNA Number a 비장 세포 증식 (PI)b Spleen Cell Proliferation (PI) b 비장 무게 (mg)c Spleen Weight (mg) c 4       4 3.7 ± 0.8      3.7 ± 0.8 121 ± 16    121 ± 16 150      150 2.5 ± 0.6      2.5 ± 0.6 107 ± 11    107 ± 11 151      151 9.2 ± 0.7      9.2 ± 0.7 169 ± 16    169 ± 16 152      152 8.8 ± 0.4      8.8 ± 0.4 220 ± 8    220 ± 8 153      153 7.6 ± 0.7      7.6 ± 0.7 127 ± 24    127 ± 24 154      154 7.8 ± 0.04      7.8 ± 0.04 177 ± 12    177 ± 12 M/V      M / V 1.2 ± 0.3      1.2 ± 0.3 102 ± 8    102 ± 8 LPS      LPS 2.8 ± 0.5      2.8 ± 0.5 ND 10      ND 10

모 (parent) CpG DNA 4는 0.1 ㎍/ml의 농도에서 3.7 ±0.8의 증식 지수를 보였다. 동일한 농도에서 상이한 위치에 아미노-링커 9를 가지고 있는 변형된 CpG DNA 151 내지 154는 모 CpG DNA보다 더 높은 수준으로 비장 세포 증식을 유발하였다 (표 19). 다른 링커들로도 관찰된 바와 같이 치환이 CpG 디뉴클레오티드와 인접하여 일어난 경우 (150), 모 CpG DNA와 비교하여 더 낮은 증식 지수가 관찰되었고, 이것은 추가로 CpG 디뉴클레오티드에 인접하여 링커 치환이 일어나는 것이 면역자극 활성에는 불리한 영향을 미친다는 것을 확인해준다. 일반적으로 5'-플랭킹 서열에서 2'-데옥시리보뉴클레오티드에 대한 아미노-링커의 치환 (151 및 152)은 3'-플랭킹 서열에서의 치환 (153 및 154)으로 발견된 것보다 더 높은 비장 세포 증식을 초래하였다. 유사한 결과를 비장비대 분석에서도 관찰하였고 (표 19), 그것은 비장 세포 배양물에서 관찰된 결과를 확인해준다. 글리세롤-링커 (8)를 함유하고 있는 변형된 CpG DNA는 아미노-링커 (9)를 함유하고 있는 변형 CpG DNA로 관찰된 것과 유사하거나 약간 더 높은 면역자극 활성을 보였다 (데이터는 제시되지 않음). Parent CpG DNA 4 showed a growth index of 3.7 ± 0.8 at a concentration of 0.1 μg / ml. Modified CpG DNAs 151-154 with amino-linker 9 at different positions at the same concentration induced splenic cell proliferation to higher levels than the parent CpG DNA (Table 19). As observed with other linkers, when substitution occurred adjacent to the CpG dinucleotide (150), a lower proliferation index was observed compared to the parent CpG DNA, which further indicates that linker substitution occurs adjacent to the CpG dinucleotide. It confirms that it has an adverse effect on stimulus activity. In general, the substitution of amino-linkers for 2'-deoxyribonucleotides in the 5'- flanking sequences (151 and 152) is higher than that found for substitutions in the 3'- flanking sequences (153 and 154). Resulted in spleen cell proliferation. Similar results were observed in the rig vs. analysis (Table 19), which confirms the results observed in spleen cell culture. Modified CpG DNA containing glycerol-linker (8) showed similar or slightly higher immunostimulatory activity than that observed with modified CpG DNA containing amino-linker (9) (data not shown).

링커 8 및 9를 함유하고 있는 CpG DNA의 면역자극 효과를 비교하기 위해, 본 발명자들은 5'-플랭킹 서열에 치환이 일어난 CpG DNA 145 및 152를 선택하여 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 시토킨 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하는 그것들의 능력을 분석하였다. CpG DNA 145 및 152는 둘 다 농도-의존성 시토킨 분비를 유도하였다. 도 4는 모 CpG DNA 4와 비교된, 0.3 ㎍/ml 농도에서의 145 및 152에 의해 유도된 마우스 비장 세포 배양물중의 IL-12 및 IL-6 수준을 도시한다. 두 가지 CpG DNA는 모두 모 CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IL-12 및 IL-6 을 유도하였다. 글리세롤-링커 (8)를 함유하고 있는 CpG DNA는 아미노-링커 (9)를 함유하고 있는 CpG DNA보다 약간 더 높은 수준의 시토킨 (특히 IL-12)을 유도하였다 (도 16). 이들 결과는 추가로 친수성 기를 함유하고 있는 링커가 CpG DNA의 면역자극 활성에는 더 유리하다는 것을 확인해준다. To compare the immunostimulatory effects of CpG DNA containing linkers 8 and 9, we selected CpG DNA 145 and 152 with substitutions in the 5'- flanking sequence and cytosed in BALB / c mouse spleen cell culture. Their ability to induce Keen IL-12 and IL-6 secretion was analyzed. CpG DNA 145 and 152 both induced concentration-dependent cytokine secretion. 4 depicts IL-12 and IL-6 levels in mouse spleen cell cultures induced by 145 and 152 at 0.3 μg / ml concentration compared to parent CpG DNA 4. Both CpG DNAs induced higher levels of IL-12 and IL-6 than the parent CpG DNA 4. CpG DNA containing glycerol-linker (8) induced slightly higher levels of cytokines (particularly IL-12) than CpG DNA containing amino-linker (9) (FIG. 16). These results further confirm that linkers containing hydrophilic groups are more advantageous for the immunostimulatory activity of CpG DNA.

본 발명자들은 CpG DNA의 다중 링커 치환의 2 가지의 상이한 측면을 조사하였다. 한 세트의 실험에서, 본 발명자들은 13-량체에 대한 뉴클레오티드 서열의 길이를 유지시켰고, 1 내지 5 개의 C3-링커 (2)를 5'-말단 위치에 통합시켰다 (120 ~ 124). 이들 변형된 CpG DNA는 용해도에 문제를 일으키지 않으면서 링커의 길이의 증가가 미치는 영향을 연구하는 것을 가능하게 해주었다. 두번째 세트의 실험에서는, 본 발명자들은 CpG 디뉴클레오티드에 대한 5'-플랭킹 서열에 인접한 위치에 2개의 동일한 링커 치환 (3, 4 또는 5)을 통합하였고, 그것이 면역자극 활성에 어떠한 추가의 부가 효과를 나타내는지를 연구하였다. We investigated two different aspects of multiple linker substitutions of CpG DNA. In one set of experiments, we maintained the length of the nucleotide sequence for the 13-mer and incorporated 1-5 C3-linkers (2) into the 5'-terminal position (120-124). These modified CpG DNAs made it possible to study the effect of increasing the length of the linker without causing solubility problems. In the second set of experiments, we incorporated two identical linker substitutions (3, 4 or 5) at positions adjacent to the 5'- flanking sequence for CpG dinucleotides, which added any additional effect on immunostimulatory activity. Was studied.

변형된 CpG DNA를, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물에서 모 CpG DNA 4와 비교하여 시토킨 생성을 유도하는 능력에 대하여 연구하였다. 모든 CpG DNA는 농도-의존성 시토킨 생성을 유도하였다. 1.0 ㎍/ml 농도의 CpG DNA에서 얻어진 데이터를 하기 표 20에 나타낸다. 이 분석에서 모 CpG DNA 4는 1 ㎍/ml 농도에서 967±28 pg/ml의 IL-12, 1593±94 pg/ml의 IL-6, 및 14±6 pg/ml의 IL-10 분비를 유도하였다. 표 20에 나타낸 데이터는 링커 치환의 수가 감소함에 따라 IL-12 유도 또한 감소되었음을 나타낸다. 그러나 CpG DNA 123 및 124에 의한 IL-12 분비의 더 낮은 수준의 유도는 CpG DNA의 더 짧은 길이의 결과일 수 있다. 15-뉴클레오티드보다 더 짧은 변형되지 않은 CpG DNA를 사용한 본 발명자들의 연구 결과는 별 의미없는 면역자극 활성을 보였다 (데이터는 제시되지 않음). 링커 치환의 길이나 수가 IL-6 분비에 대한 효과를 반감시키는 것은 아니다. IL-10 분비가 링커 치환에 따라 증가되긴 하였지만, 이들 CpG DNA에 의한 전체적인 IL-10 분비는 최소였다. Modified CpG DNA was studied for its ability to induce cytokine production compared to parental CpG DNA 4 in BALB / c mouse spleen cell cultures. All CpG DNA induced concentration-dependent cytokine production. Data obtained on CpG DNA at a concentration of 1.0 μg / ml is shown in Table 20 below. In this assay, parental CpG DNA 4 induced 967 ± 28 pg / ml of IL-12, 1593 ± 94 pg / ml of IL-6, and 14 ± 6 pg / ml of IL-10 at 1 μg / ml concentration It was. The data shown in Table 20 indicates that IL-12 induction also decreased as the number of linker substitutions decreased. However, lower levels of induction of IL-12 secretion by CpG DNA 123 and 124 may be the result of shorter lengths of CpG DNA. The results of our study with unmodified CpG DNA shorter than 15-nucleotides showed no significant immunostimulatory activity (data not shown). The length or number of linker substitutions does not halve the effect on IL-6 secretion. Although IL-10 secretion increased with linker substitutions, overall IL-10 secretion by these CpG DNAs was minimal.

CpG 디뉴클레오티드에 대한 5'-플랭킹 서열의 4번째 및 5번째 위치에 2개의 링커 치환을 함유하고 있는 CpG DNA (링커 3-127; 링커 4-131; 링커 5-135) 및 상응하는 5'-절단된 변형체 128, 132, 및 136 각각을, BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 시토킨 분비를 유도하는 능력에 대하여 시험하였다. 1.0 ㎍/ml 농도에서 분비된 IL-12 및 IL-6의 수준은 도 17에 도시된다. 도 17에 제시된 결과는 면역자극 활성이 통합된 링커의 성질에 좌우됨을 시사한다. C4-링커 3으로 4번째와 5번째 뉴클레오시드를 치환한 것 (CpG DNA 127)은 모 CpG DNA 4와 비교하여 시토킨 분비에 대해 미미한 영향을 나타냈고, 이것은 이들 위치에 있는 뉴클레오염기 및 당이 수용체 인지 및/또는 결합에 불필요함을 시사한다. 링커 치환 (CpG DNA 128)을 지나친 뉴클레오티드의 결실은 CpG DNA 4 및 127로 발견된 것보다 더 높은 수준의 IL-12 및 IL-6 분비를 유도하였다. 예상했던 바와 같이 2개의 C6-링커 (4)의 치환은 모 CpG DNA 4에 의해 유도된 것보다 더 낮은 수준의 IL-12 분비 및 유사한 IL-6 분비를 초래하였다. 5'-절단된 CpG DNA 132는 CpG DNA 131보다 더 높은 수준의 시토킨 분비를 유도하였다. 2개의 C9-링커 (5)를 가지고 있는 CpG DNA 135 및 136은 미미한 시토킨 분비를 유도하였으며, 이것은 상술한 바와 같이 동일한 링커를 함유하고 있는 단일-치환된 CpG DNA로 얻어진 결과를 확인해준다. CpG DNA (linker 3-127; linker 4-131; linker 5-135) and the corresponding 5 'containing two linker substitutions at the 4th and 5th positions of the 5'- flanking sequence for the CpG dinucleotide Cleaved variants 128, 132, and 136, respectively, were tested for their ability to induce cytokine secretion in BALB / c mouse spleen cell cultures. The levels of IL-12 and IL-6 secreted at 1.0 μg / ml concentration are shown in FIG. 17. The results presented in FIG. 17 suggest that immunostimulatory activity depends on the nature of the integrated linker. Substitution of the fourth and fifth nucleosides with C4-linker 3 (CpG DNA 127) showed a minor effect on cytokine secretion compared to the parental CpG DNA 4, which indicated nucleobases and Suggests that sugar is unnecessary for receptor recognition and / or binding. Deletion of nucleotides beyond linker substitution (CpG DNA 128) led to higher levels of IL-12 and IL-6 secretion than those found with CpG DNA 4 and 127. As expected, substitution of two C6-linkers (4) resulted in lower levels of IL-12 secretion and similar IL-6 secretion than those induced by parental CpG DNA 4. 5'-cut CpG DNA 132 induced higher levels of cytokine secretion than CpG DNA 131. CpG DNA 135 and 136 with two C9-linkers (5) induced slight cytokine secretion, confirming the results obtained with single-substituted CpG DNA containing the same linker as described above.

실시예 14: 포스포디에스테르 연결이 시토킨 유도에 미치는 효과 Example 14: Effect of phosphodiester linkage on cytokine induction

이뮤노머-유도된 시토킨 유도에 미치는 포스포디에스테르 연결의 효과를 시험하기 위하여 다음의 분자들을 합성하였다. The following molecules were synthesized to test the effect of phosphodiester linkages on immunomer-induced cytokine induction.

표 21. PO-이뮤노머 서열 및 분석 데이터Table 21.PO-immunomer Sequences and Analytical Data

Figure 112004017052430-pct00025
Figure 112004017052430-pct00025

a 화살표는 각각의 DNA 분자에서 CpG 디뉴클레오티드의 5'-3'방향성을 나타내고 X 및 Y의 구조는 박스안에 도시되어 있다. The arrow a indicates the 5'-3 'orientation of the CpG dinucleotide in each DNA molecule and the structures of X and Y are shown in boxes.

b PS 및 PO는 각각 포스포로티오에이트 및 포스포디에스테르 골격을 나타낸다. b PS and PO represent phosphorothioate and phosphodiester backbones, respectively.

c MALDI-TOF 질량 분광계에 의해 측정됨. c Measured by MALDI-TOF mass spectrometer.

PS-CpG DNA 4 (표 21)는 마우스에서 면역 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌고 (데이터는 제시하지 않음) PO-CpG DNA 155는 대조표준으로 작용하였다. PO-이뮤노머 156 및 157은 각각 글리세릴 링커 X (표 21)를 통해 3'-말단에 의해 결합된 모 CpG DNA 155의 2개의 동일한 절단된 복사물을 함유한다. 156과 157 각각이 14 염기의 동일한 올리고뉴클레오티드 절편을 함유하고 있는 반면, 157의 5'-말단은 2 개의 C3-링커, Y (표 21)의 첨가에 의해 변형되었다. 모든 올리고뉴클레오티드 4, 155 내지 157은 마우스 면역계를 활성화시키는 것으로 알려진 'GACGTT' 6량체 모티프를 함유한다. PS-CpG DNA 4 (Table 21) was found to induce an immune response in mice (data not shown) and PO-CpG DNA 155 served as a control. PO-immunomers 156 and 157 each contain two identical truncated copies of the parent CpG DNA 155 bound by the 3′-terminus through glyceryl linker X (Table 21). While 156 and 157 each contained the same oligonucleotide fragment of 14 bases, the 5'-terminus of 157 was modified by the addition of two C3-linkers, Y (Table 21). All oligonucleotides 4, 155-157 contain a 'GACGTT' hexameric motif known to activate the mouse immune system.

뉴클레아제에 대한 PO-이뮤노머의 안정성을, 10 % 우태아 혈청 (FBS)(열로 인해 비활성화되지 않았음)을 함유하고 있는 세포 배양 배지중에서 CpG DNA 4, 155 내지 157을 37 ℃에서 4, 24, 및 48 시간 동안 인큐베이션함으로써 분석하였다. 그런 다음 반응 혼합물중에 남아있는 온전한 CpG DNA를 CGE에 의해 측정하였다. 도 18A 내지 D는 10 % FBS에서 24시간 동안 인큐베이션된 CpG DNA 4, 155 ~ 157의 뉴클레아제 분해 프로필을 도시한다. 각 시점에서 남아있는 전장 CpG DNA의 양을 도 18E에 도시한다. 예상했던 바와 같이 모 CpG DNA 4가 혈청 뉴클레아제에 대해 가장 큰 내성을 나타냈다. 18-량체 4는 약 55 %가 48시간 인큐베이션 후에 분해되지 않은 채로 남아있었다. 대조적으로 전장 PO-이뮤노머 155는 단지 약 5 %만이 동일한 실험 조건하에서 약 4 시간 후에 남아있었고, 이것은 포스포디에스테르 연결을 함유하고 있는 DNA가 빠르게 분해된다는 것을 확인해준다. 예상했던 바와 같이 PO-이뮤노머 156과 157은 둘 다 혈청 뉴클레아제에 대해 155 보다는 더 내성이었다. 4 시간 후에 155의 약 5 %와 비교했을 때 156과 157 각각의 약 62 % 및 73 %가 온전하게 남아있었다 (도 18 E). 48시간 후에는, 156과 157의 약 23 % 및 37 %가 분해되지 않은 채로 남아있었다. 이들 연구 결과는 3'-3'-연결된 PO-이뮤노머가 혈청 뉴클레아제에 대해 더 안정함을 보여줄 뿐 아니라, 5'-말단에서의 화학적 변형이 추가로 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있음을 나타낸다. The stability of the PO-immunomer against nucleases was determined by CpG DNA 4, 155-157 at 37 ° C. in cell culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) (not inactivated due to heat). Analysis was by incubation for 24, and 48 hours. The intact CpG DNA remaining in the reaction mixture was then measured by CGE. 18A-D show nuclease degradation profiles of CpG DNA 4, 155-157 incubated for 24 hours in 10% FBS. The amount of full length CpG DNA remaining at each time point is shown in FIG. 18E. As expected, the parent CpG DNA 4 showed the greatest resistance to serum nucleases. 18-mer 4 remained about 55% undigested after 48 hours incubation. In contrast, full length PO-immunomer 155 remained only about 5% after about 4 hours under the same experimental conditions, confirming that DNA containing phosphodiester linkages rapidly degraded. As expected, both PO-immunomers 156 and 157 were more resistant than 155 to serum nucleases. After 4 hours, about 62% and 73% of 156 and 157, respectively, remained intact when compared to about 5% of 155 (FIG. 18E). After 48 hours, about 23% and 37% of 156 and 157 remained undigested. These findings show that 3'-3'-linked PO-immunomers are more stable against serum nucleases, as well as chemical modifications at the 5'-terminus may further increase nuclease stability. Indicates.

CpG DNA의 면역자극 활성을 BALB/c 및 C3H/HeJ 마우스 비장 세포 배양물중에서 분비된 시토킨 IL-12 및 IL-6의 수준을 측정함으로써 연구하였다. 모든 CpG DNA는 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 농도-의존성 시토킨 분비를 유도하였다 (도 19). PS-CpG DNA 4는 3 ㎍/ml에서 각각 2656±256 및 12234±1180 pg/ml의 IL-12 및 IL-6을 유도하였다. 모 PO-CpG DNA 155는 10 ㎍/ml 농도에서를 제외하면 바탕값 이상으로 시토킨 수준을 상승시키지 못하였다. 이 관찰은 뉴클레아제 안정성 분석 결과와 일치한다. 대조적으로 PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 IL-12 및 IL-6 두 가지 모두의 분비를 유도하였다. The immunostimulatory activity of CpG DNA was studied by measuring the levels of cytokines IL-12 and IL-6 secreted in BALB / c and C3H / HeJ mouse spleen cell cultures. All CpG DNA induced concentration-dependent cytokine secretion in BALB / c mouse spleen cell cultures (FIG. 19). PS-CpG DNA 4 induced 2656 ± 256 and 12234 ± 1180 pg / ml of IL-12 and IL-6 at 3 μg / ml, respectively. Parent PO-CpG DNA 155 did not raise cytokine levels above background except at the concentration of 10 μg / ml. This observation is consistent with the results of the nuclease stability assay. In contrast, PO-immunomers 156 and 157 induced the secretion of both IL-12 and IL-6 in BALB / c mouse spleen cell cultures.

도 19에 도시된 결과는 PS- 및 PO-CpG DNA의 시토킨 유도 프로필의 분명한 차이를 보여준다. PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에 서 PS-CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IL-12를 유도하였다 (도 19A). 대조적으로 3 ㎍/ml의 농도에서는 무시해도 좋을 정도의 양으로 IL-6을 생성하였다 (도 19B). 가장 높은 농도 (10 ㎍/ml)에서조차도 PO-이뮤노머 156은 PS-CpG DNA 4보다 상당히 덜 IL-6을 유도하였다. PO-이뮤노머 157의 5'-말단에 있는 C3 링커의 존재는 156과 비교하여 약간 더 높은 수준의 IL-6 분비를 초래하였다. 그러나 중요한 것은 PO-이뮤노머 157에 의해 유도된 IL-6의 수준은 PS CpG DNA 4에 의해 유도된 IL-6보다 훨신 더 낮다는 사실이다. 도 19A의 삽입도는 3 ㎍/ml 농도에서 분비된 IL-6에 대한 IL-12의 비율을 나타낸다. IL-12 분비를 증가시키는 것 외에 PO-이뮤노머 156 및 157은 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PS-CpG DNA 4보다 더 높은 수준의 IFN-γ를 유도하였다 (데이터는 제시되지 않음). The results shown in FIG. 19 show clear differences in cytokine induction profiles of PS- and PO-CpG DNA. PO-immunomers 156 and 157 induced higher levels of IL-12 than PS-CpG DNA 4 in BALB / c mouse spleen cell cultures (FIG. 19A). In contrast, IL-6 was produced in negligible amounts at a concentration of 3 μg / ml (FIG. 19B). Even at the highest concentration (10 μg / ml) PO-immunomer 156 induced IL-6 significantly less than PS-CpG DNA 4. The presence of the C3 linker at the 5'-end of PO-immunomer 157 resulted in slightly higher levels of IL-6 secretion compared to 156. However, it is important to note that the level of IL-6 induced by PO-immunomer 157 is much lower than IL-6 induced by PS CpG DNA 4. Inset of FIG. 19A shows the ratio of IL-12 to IL-6 secreted at 3 μg / ml concentration. In addition to increasing IL-12 secretion, PO-immunomers 156 and 157 induced higher levels of IFN-γ than PS-CpG DNA 4 in BALB / c mouse spleen cell cultures (data not shown).

BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PO- 및 PS-CpG DNA에 의해 유도된 상이한 시토킨 프로필로 인해, 본 발명자들은 C3H/HeJ 마우스 비장 세포 배양물 (LPS 저-반응성 스트레인)중에서 CpG DNA에 의한 시토킨 유도 패턴을 연구하게 되었다. 이 분석에서 시험된 3개의 모든 CpG DNA는 농도-의존성 시토킨 분비를 유도하였다 (도 20A 및 B). BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중에서 PO-CpG DNA 155가 시토킨 분비를 못하였기 때문에 그것은 C3H/HEJ 비장 세포 배양물 중에서는 더 이상 시험하지 않았다. PO-이뮤노머 156 및 157은 둘 다 PS-CpG DNA 4 보다 더 높은 IL-12 생성을 유도하였다 (도 20A). 그러나 3 ㎍/ml의 농도에서는 아무 것도 IL-6을 유도하지 못하였다. 가장 높은 시험 농도 (10 ㎍/ml)에서는 두 가지 모두 PS-CpG DNA 4보다 상당히 더 적은 양으로 IL-6을 유도하였다 (도 20B). Due to the different cytokine profiles induced by PO- and PS-CpG DNA in BALB / c mouse spleen cell cultures, we found that CpG DNA in C3H / HeJ mouse spleen cell cultures (LPS low-responsive strain) The cytokine induction pattern was studied. All three CpG DNAs tested in this assay induced concentration-dependent cytokine secretion (FIGS. 20A and B). Since PO-CpG DNA 155 failed to secrete cytokines in BALB / c mouse spleen cell cultures, it was no longer tested in C3H / HEJ spleen cell cultures. PO-immunomers 156 and 157 both induced higher IL-12 production than PS-CpG DNA 4 (FIG. 20A). However, nothing induced IL-6 at a concentration of 3 μg / ml. At the highest test concentration (10 μg / ml) both induced IL-6 in significantly less than PS-CpG DNA 4 (FIG. 20B).                 

분비된 IL-6에 대한 IL-12의 비율을 계산하여 PS 및 PO CpG DNA의 시토킨 분비 프로필을 구별하는 데 사용하였다 (도 20A 삽입도). 또한 C3H/HeJ 비장 세포 배양물의 결과는 CpG DNA로 관찰된 반응이 LPS 오염에 의한 것이 아님을 보여준다. The ratio of IL-12 to secreted IL-6 was calculated and used to distinguish cytokine secretion profiles of PS and PO CpG DNA (FIG. 20A inset). The results of C3H / HeJ spleen cell cultures also show that the response observed with CpG DNA is not due to LPS contamination.

PS-CpG DNA는 생체내에서 강력한 항종양 활성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. PO-CpG DNA가 더 큰 뉴클레아제 안정성을 나타내고 시험관내 분석에서 더 높은 수준의 IL-12 및 IFN-γ 분비를 유도하였기 때문에 본 발명자들은 PO-이뮤노머의 이런 바람직한 성질이 생체내에서 항종양 활성을 개선시키는지를 밝혀내는 데 관심을 모았다. 본 발명자들은 PO-이뮤노머 157을, 야생형 p53을 발현하는 MCF-7 유방암 세포 또는 돌연변이된 p53을 발현하는 DU-145 전립선암 세포의 종양 이종이식편을 내포하고 있는 누드 마우스에 0.5 mg/kg의 용량으로 격일로 피하 투여하였다. PO-이뮤노머 157은 식염수 대조표준과 비교하여 제 15일에 MCF-7 종양 성장을 57 % 억제하였다 (도 21A). 그것은 또한 제 34일에 DU-145 종양 성장을 52 % 억제하였다 (도 21B). 이들 항종양 연구는 제안된 디자인의 PO-이뮤노머가 생체내에서 강력한 항종양 활성을 나타낸다는 것을 시사한다. PS-CpG DNA has been shown to induce potent antitumor activity in vivo. Because PO-CpG DNA exhibited greater nuclease stability and induced higher levels of IL-12 and IFN-γ secretion in in vitro assays, we found that this preferred property of PO-immunomers in antitumor in vivo. Attention has been directed to identifying whether the activity is improved. We used a dose of 0.5 mg / kg in nude mice containing PO-immunomer 157, a tumor xenograft of MCF-7 breast cancer cells expressing wild type p53 or DU-145 prostate cancer cells expressing mutated p53. Administered subcutaneously every other day. PO-immunomer 157 inhibited 57% MCF-7 tumor growth on day 15 compared to the saline control (FIG. 21A). It also inhibited 52% of DU-145 tumor growth on day 34 (FIG. 21B). These antitumor studies suggest that the PO-immunomers of the proposed design exhibit potent antitumor activity in vivo.

실시예 22: 짧은 이뮤노머Example 22 Short Immunomers

시토킨 유도에 미치는 짧은 이뮤노머의 영향을 시험하기 위하여 다음의 이뮤노머들을 사용하였다. 이들 결과는 절편 당 5 뉴클레오티드 정도로 짧은 이뮤노머가 시토킨 생성을 유도하는 데 효과적임을 나타낸다. The following immunomers were used to test the effect of short immunomers on cytokine induction. These results indicate that immunomers as short as 5 nucleotides per fragment are effective at inducing cytokine production.

표 22. 이뮤노머 구조 및 BALB/c 마우스 비장 세포 배양물중의 면역자극 활 성Table 22. Immunomer Structure and Immunostimulatory Activity in BALB / c Mouse Spleen Cell Cultures

Figure 112004017052430-pct00026
Figure 112004017052430-pct00026

정상적인 글씨체는 포스포로티오에이트 연결을 나타낸다. Normal font indicates phosphorothioate linkages.

Figure 112004017052430-pct00027
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균등물Equivalent

전술한 발명이 명료함과 이해를 목적으로 어느 정도 상세하게 설명되긴 하였 지만, 당업자에게는 본 명세서를 숙지함에 따라 본 발명의 범주 및 첨부되는 특허청구범위를 벗어남이 없이 외형 및 상세한 부분에 다양한 변화가 이루어질 수 있음이 분명할 것이다.Although the foregoing invention has been described in some detail for purposes of clarity and understanding, those skilled in the art, upon reading the present specification, appreciate that various changes may be made in appearance and detail without departing from the scope of the invention and the appended claims. It will be clear that it can be done.

Claims (36)

3' 말단, 뉴클레오시드간 연결부, 작용기화된 뉴클레오염기 또는 당에서 비-뉴클레오티드 링커에 연결된 2개 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이뮤노머로서, 상기 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상이 접근가능한 5' 말단을 지니며, CpG, C*pG, CpG*, 및 C*pG*(여기서 C는 시티딘 또는 2'-데옥시시티딘이고, C*은 2'-데옥시티미딘, 아라비노시티딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고, G는 구아노신 또는 2'-데옥시구아노신이고, G*은 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이고, p는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 및 포스포로디티오에이트로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오시드간 연결임을 특징으로 함)로 이루어진 군에서 선택된 면역자극성 디뉴클레오티드를 포함하는, 면역자극성 올리고뉴클레오티드인 이뮤노머.An immunomer comprising a 3 'end, an internucleoside linkage, a functionalized nucleobase, or two or more oligonucleotides linked to a non-nucleotide linker in a sugar, wherein at least one of the oligonucleotides is accessible CpG, C * pG, CpG * , and C * pG * , wherein C is cytidine or 2′-deoxycytidine, and C * is 2′-deoxythymidine, arabinocitidine, 2 '-Deoxy-2'-substituted arabinositidine, 2'-O-substituted arabinositidine, 2'-deoxy-5-hydroxycytidine, 2'-deoxy- N 4-alkyl -Cytidine, 2'-deoxy-4-thiouridine or other non-natural pyrimidine nucleosides, G is guanosine or 2'-deoxyguanosine, and G * is 2'-deoxy -7-deazaguanosine, 2'-deoxy-6-thioguanosine, arabinoguanosine, 2'-deoxy-2 'substituted-arabino guanosine, 2'-O-substituted-ara Vinoguanosine, or else A natural purine nucleoside, and p is an internucleoside linkage selected from the group consisting of phosphodiester, phosphorothioate, and phosphorodithioate) Immunomer, comprising an immunostimulatory oligonucleotide. 삭제delete 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드중 하나 이상이 하기 구조식 (III)을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머:The immunoomer of claim 1, wherein at least one of the oligonucleotides has the structure ( III ): 5'-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3' (III) 5'-Nn-N1-YZ-N1-Nn-3 '( III ) 상기 식에서,Where Y는 시티딘, 2' 데옥시시티딘 아라비노시티딘, 2'-데옥시티미딘, 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노시티딘, 2'-O-치환된 아라비노시티딘, 2'-데옥시-5-히드록시시티딘, 2'-데옥시-N4-알킬-시티딘, 2'-데옥시-4-티오우리딘 또는 그 밖의 비-천연 피리미딘 뉴클레오시드이고;Y is cytidine, 2 'deoxycytidine arabinocytidine, 2'-deoxythymidine, 2'-deoxy-2'-substituted arabinocytidine, 2'-O-substituted arabinosity Dine, 2'-deoxy-5-hydroxycytidine, 2'-deoxy- N4 -alkyl-cytidine, 2'-deoxy-4-thiouridine or other non-natural pyrimidine nucleosides ego; Z는 구아노신, 2'-데옥시구아노신, 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 아라비노구아노신, 2'-데옥시-2' 치환된-아라비노구아노신, 2'-O-치환된-아라비노구아노신, 2' 데옥시이노신, 또는 그 밖의 비-천연 푸린 뉴클레오시드이고; Z is guanosine, 2'-deoxyguanosine, 2'-deoxy-7-deazaguanosine, 2'-deoxy-6-thioguanosine, arabinoguanosine, 2'-deoxy-2 'Substituted-arabinoguanosine, 2'-0-substituted-arabinoguanosine, 2'deoxyinosine, or other non-natural purine nucleosides; N1은 각각 천연 또는 합성 뉴클레오시드, 또는 비염기성(abasic) 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, β-L-데옥시리보뉴클레오시드, 및 포스포디에스테르 또는 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽에서 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 여기서 변형된 뉴클레오시드간 연결은 2 Å 내지 200 Å의 길이를 가지는 링커, C2-C18 알킬 링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 글리세릴 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 또는 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로부터 선택되지만 이들에 제한되지 않고;N1 is a natural or synthetic nucleoside, or abasic nucleoside, arabinonucleoside, 2′-deoxyuridine, α-deoxyribonucleoside, β-L-deoxyribo Nucleoside, and an immunostimulatory moiety selected from the group consisting of nucleosides linked at 3 'to an adjacent nucleoside by a phosphodiester or modified internucleoside linkage, wherein the modified internucleoside linkage is 2 Linkers having lengths of VII to 200 VII, C2-C18 alkyl linkers, poly (ethylene glycol) linkers, 2-aminobutyl-1,3-propanediol linkers, glyceryl linkers, 2'-5 'internucleoside linkages , And phosphorothioate, phosphorodithioate, or methylphosphonate internucleoside linkages; Nn은 각각 천연 뉴클레오시드, 또는 비염기성 뉴클레오시드, 아라비노뉴클레오시드, 2'-데옥시우리딘, α-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-O-치환된 또는 2'-치환된 리보뉴클레오시드, 및 변형된 뉴클레오시드간 연결에 의해 인접한 뉴클레오시드에 3' 쪽에서 연결된 뉴클레오시드로 이루어지는 군으로부터 선택된 면역자극성 부분이며, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 아미노 링커, 2'-5' 뉴클레오시드간 연결, 및 메틸포스포네이트 뉴클레오시드간 연결로 이루어지는 군으로부터 선택되고;Nn is a natural nucleoside, or a nonbasic nucleoside, arabinonucleoside, 2'-deoxyuridine, α-deoxyribonucleoside, 2'-0-substituted or 2'-substituted, respectively. Ribonucleosides, and nucleosides linked on the 3 'side to adjacent nucleosides by modified internucleoside linkages, wherein the modified internucleoside linkages are amino linkers, 2 '-5' internucleoside linkage, and methylphosphonate internucleoside linkage; n은 0 내지 30의 수임을 특징으로 하는 이뮤노머.Immunomer, characterized in that n is a number from 0 to 30. 제 1항에 있어서, 인접한 뉴클레오티드 사이의 뉴클레오티드간 연결이 포스포로티오에이트 연결을 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머.2. An immunoomer according to claim 1, wherein the internucleotide linkages between adjacent nucleotides comprise phosphorothioate linkages. 제 1항에 있어서, G*가 2'-데옥시-7-데아자구아노신임을 특징으로 하는 이뮤노머.2. An immunomer according to claim 1 wherein G * is 2'-deoxy-7-deazaguanosine. 제 1항에 있어서, 하기 구조식을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머:2. An immunomer according to claim 1 having the structural formula:
Figure 112009045752567-pct00028
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 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 유전자에 상보적인 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. 2. An immunoomer according to claim 1, wherein the immunoomer comprises one or more oligonucleotides complementary to a gene. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 하나 이상의 리보자임 또는 유인(decoy) 올리고뉴클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. 2. An immunoomer according to claim 1, wherein the immunomer comprises one or more ribozymes or decoy oligonucleotides. 제 1항에 있어서, 이뮤노머가 G4 테트라뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 Nn 부분을 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머. The immunoomer of claim 1, wherein the immunomer comprises one or more Nn moieties comprising a G4 tetranucleotide. 제 1항에 있어서, 비-천연 피리미딘이 하기 구조식 (I)을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머: The immunomer according to claim 1, wherein the non-natural pyrimidine has the structure ( I ):
Figure 112007054061142-pct00029
(I)
Figure 112007054061142-pct00029
( I ) 상기 식에서, Where D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor; D'은 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지고, 브롬이 제외되는 군으로부터 선택되고; D 'consists of hydrogen, a hydrogen bond donor, a hydrogen bond acceptor, a hydrophilic group, a hydrophobic group, an electron withdrawing group and an electron donor group and is selected from the group from which bromine is excluded; A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or hydrophilic group; A'은 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자 끌개기 및 전자 주개기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; A 'is selected from the group consisting of hydrogen bond acceptor, hydrophilic group, hydrophobic group, electron withdrawing group and electron donor group; X는 탄소 또는 질소이고; X is carbon or nitrogen; S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or hexose sugar ring, or a non-natural sugar. 제 10항에 있어서, 당 고리가 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 또 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기 위한 그 밖의 비-뉴클레오티드 링커 부분으로 유도체화됨을 특징으로 하는 이뮤노머. The method of claim 10 wherein the sugar ring is derivatized with a phosphate moiety, a modified phosphate moiety, or another non-nucleotide linker moiety for linking the pyrimidine nucleoside to another nucleoside or nucleoside analogue. Immunomer. 제 10항에 있어서, 수소 결합 공여체가 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. The immunoomer of claim 10, wherein the hydrogen bond donor is selected from the group consisting of —NH—, —NH 2 , —SH, and —OH. 제 10항에 있어서, 수소 결합 수용체가 C=O, C=S, 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. The immunoomer of claim 10, wherein the hydrogen bond acceptor is selected from the group consisting of C═O, C═S, and a ring nitrogen atom of an aromatic heterocycle. 제 10항에 있어서, 비-천연 피리미딘 염기가 5-히드록시시토신, 5-히드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, N4-에틸시토신, 및 4-티오우라실로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. The non-natural pyrimidine base of claim 10, wherein the non-natural pyrimidine base is selected from the group consisting of 5-hydroxycytosine, 5-hydroxymethylcytosine, N4-alkylcytosine, N4-ethylcytosine, and 4-thiouracil. Immunomers. 제 10항에 있어서, 비-천연 당이 아라비노스 및 아라비노스 유사체로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. The immunomer of claim 10, wherein the non-natural sugar is selected from arabinose and arabinose analogs. 제 1항에 있어서, 푸린 뉴클레오시드가 하기 구조식 (II)을 지님을 특징으로 하는 이뮤노머: The immunomer according to claim 1, wherein the purine nucleoside has the following structural formula ( II ):
Figure 112009003240787-pct00030
(II)
Figure 112009003240787-pct00030
( II ) 상기 식에서, Where D는 수소 결합 공여체이고; D is a hydrogen bond donor; D'은 수소, 수소 결합 공여체, 및 친수성 기로 이루어지는 군으로부터 선택되고; D 'is selected from the group consisting of hydrogen, hydrogen bond donors, and hydrophilic groups; A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고; A is a hydrogen bond acceptor or hydrophilic group; X는 탄소 또는 질소이고; X is carbon or nitrogen; 각각의 L은 독립적으로 C, O, N, 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되고; Each L is independently selected from the group consisting of C, O, N, and S; S'은 펜토스 또는 헥소스 당 고리, 또는 비-천연 당이다. S 'is a pentose or hexose sugar ring, or a non-natural sugar. 제 16항에 있어서, 당 고리가 포스페이트 부분, 변형된 포스페이트 부분, 또는 피리미딘 뉴클레오시드를 또 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체에 연결시키기 위한 그 밖의 링커 부분으로 유도체화됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 18. The imu of claim 16, wherein the sugar ring is derivatized with a phosphate moiety, a modified phosphate moiety, or other linker moiety for linking the pyrimidine nucleoside to another nucleoside or nucleoside analogue. Nomer. 제 16항에 있어서, 수소 결합 공여체가 -NH-, -NH2, -SH 및 -OH로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 18. An immunomer according to claim 16 wherein the hydrogen bond donor is selected from the group consisting of -NH-, -NH 2 , -SH and -OH. 제 16항에 있어서, 수소 결합 수용체가 C=O, C=S, -N= 및 방향족 헤테로사이클의 고리 질소 원자로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 18. The immunomer according to claim 16, wherein the hydrogen bond acceptor is selected from the group consisting of C = 0, C = S, -N = and ring nitrogen atoms of an aromatic heterocycle. 제 16항에 있어서, 비-천연 푸린이 6-티오구아닌 또는 7-데아자구아닌임을 특징으로 하는 이뮤노머. 18. The immunomer according to claim 16, wherein the non-natural purine is 6-thioguanine or 7-deazaguanine. 제 1항에 있어서, 비-뉴클레오티드 링커가 2 Å 내지 200 Å의 길이를 가지는 링커, 금속, 가용성 또는 불용성 생분해성 중합체 비드, 올리고뉴클레오티드의 3'-말단 뉴클레오시드에 부착되는 것을 가능하게 하는 작용기를 지닌 유기 부분, 생체 분자, 고리형 또는 비고리형 작은 분자, 지방족 또는 방향족 탄화수소, 아미노산, 탄수화물, 시클로덱스트린, 아다만탄, 콜레스테롤, 합텐, 항생물질, 글리세롤, 또는 화학식 HO-(CH2) o -CH(OH)-(CH2) p -OH의 글리세롤 유사체 (o 및 p는 독립적으로 1 내지 6의 정수임), 및 1,3-디아미노-2-히드록시프로판의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 상기 지방족 또는 방향족 탄화수소중 어느 하나는 올리고뉴클레오티드를 연결시키거나 올리고뉴클레오티드에 부착되는 선형 사슬에 히드록시, 아미노, 티올, 티오에테르, 에테르, 아미드, 티오아미드, 에스테르, 우레아, 및 티오우레아로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기를 포함할 수 있음을 특징으로 하는 이뮤노머. The functional group of claim 1, wherein the non-nucleotide linker is capable of being attached to a linker, metal, soluble or insoluble biodegradable polymer beads, oligonucleotide's 3′-terminal nucleoside having a length between 2 μs and 200 μs Organic moieties, biomolecules, cyclic or acyclic small molecules, aliphatic or aromatic hydrocarbons, amino acids, carbohydrates, cyclodextrins, adamantanes, cholesterol, hapten, antibiotics, glycerol, or the formula HO- (CH 2 ) o Glycerol analogs of -CH (OH)-(CH 2 ) p -OH (o and p are independently integers from 1 to 6), and derivatives of 1,3-diamino-2-hydroxypropane Any one of the aliphatic or aromatic hydrocarbons may be selected from the group consisting of hydroxy, amino, thiol, thioether, Termini, amide, thioamide, nomeo Emu, characterized in that it is possible to include one or more functional groups selected from ester, urea, and the group consisting of thiourea. 제 1항에 있어서, 뉴클레오시드간 연결이 필수적으로 포스포디에스테르 연결로 구성됨을 특징으로 하는 이뮤노머. 2. An immunoomer according to claim 1 wherein the internucleoside linkage consists essentially of a phosphodiester linkage. 제 1항에 따른 이뮤노머 및 접근가능한 5' 말단 이외의 위치에서 이뮤노머에 컨쥬게이션되는 항원을 포함하는 이뮤노머 컨쥬게이트. An immunoconjugate comprising an immunomer according to claim 1 and an antigen conjugated to the immunoomer at a position other than the accessible 5 'end. 제 1항에 있어서, C*가 아라비노시토신 또는 2'-데옥시-2-치환된 아라비노시토신이고, G*가 아라비노구아노신 또는 2'-데옥시-2'-치환된 아라비노구아노신, 2'-데옥시-7-데아자구아노신, 2'-데옥시-6-티오구아노신, 또는 2'-데옥시이노신임을 특징으로 하는 이뮤노머. The albinoguano according to claim 1, wherein C * is arabinoshitocin or 2'-deoxy-2-substituted arabinocytosine and G * is arabinoguanosine or 2'-deoxy-2'-substituted arabinoguano An immunomer characterized by being a cine, 2'-deoxy-7-deazaguanosine, 2'-deoxy-6-thioguanosine, or 2'-deoxyinosine. 제 1항에 따른 이뮤노머 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형. A pharmaceutical formulation comprising an immunoomer according to claim 1 and a physiologically acceptable carrier. 제 1항에 있어서, 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결을 포함함을 특징으로 하는 이뮤노머.2. An immunoomer according to claim 1 wherein the internucleoside linkage comprises a phosphorothioate linkage. 제 1항에 있어서, 뉴클레오시드간 연결이 필수적으로 포스포로티오에이트 연결로 구성됨을 특징으로 하는 이뮤노머.2. An immunoomer according to claim 1, wherein the internucleoside linkage consists essentially of phosphorothioate linkages. 제 25항에 있어서, 백신을 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.The pharmaceutical composition of claim 25, further comprising a vaccine. 제 6항에 따른 이뮤노머 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형.A pharmaceutical formulation comprising an immunoomer according to claim 6 and a physiologically acceptable carrier. 제 23항에 따른 이뮤노머 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 제형.A pharmaceutical formulation comprising an immunoomer according to claim 23 and a physiologically acceptable carrier. 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 연결부가 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 이뮤노머.2. An immunomer according to claim 1, wherein said nucleoside linkage comprises a phosphorothioate linkage. 제 1항에 있어서, 상기 뉴클레오시드 연결부가 포스포로티오에이트 연결로 이루어짐을 특징으로 하는 이뮤노머.2. An immunoomer according to claim 1, wherein said nucleoside linkage consists of a phosphorothioate linkage. 제 1항에 따른 이뮤노머를 필수 성분으로 포함하는 면역자극제.An immunostimulant comprising the immunomer according to claim 1 as an essential ingredient. 제 1항에 따른 이뮤노머를 필수 성분으로 포함하는 애주번트(adjuvant).An adjuvant comprising the immunomer according to claim 1 as an essential ingredient. 삭제delete 삭제delete
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