본 발명은 계피로부터 분리, 정제된 시나믹 알데히드와 함께 이와 구조적으로 유사하며 상업적으로 이용가능한 화합물인 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde (Aldrich사) 및 2-Methoxycinnamaldehyde(Aldrich사)를 함유하는 소나무 재선충 방제약제에 관한 것으로 보다 자세하게는 녹나무과에 속하는 계피나무의 껍질을 건조하고, 잘게 분쇄하여 유기용매를 가하여 만든 추출물로부터 얻어진 시나믹 알데히드를 주요 성분으로하고, 여기에 이와 구조적으로 유사하며 상업적으로 이용가능한 화합물인 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde (98%, Aldrich사) 및 2-Methoxycinnamaldehyde(96%, Aldrich사)를 첨가하여 살선충효과를 높임으로써 소나무 재선충에 대하여 강력한 살충효과를 나타내는 방제약제에 관한 것이다.
시나믹 알데히드는 모리스등이 계피로부터 분리하여 그 존재를 확인한 바 있으나(J. Assoc. Off. Anal. Chem., (56) 1037,1973년) 본 발명과는 무관하며, 본 발명의 시나믹 알데히드는 화학구조식이 C6H5CH=CHCHO(C9H8O)로서 계피로부터 얻어진 식물성 오일이며, 이를 이용한 소나무 재선충 방제약제와 관련된 특허는 아직 보고 된 바 없다. 본 발명에서는 계피에서 분리, 정제한 시나믹 알데히드 이외에도 화학 합성법에 의하여 얻어진 동일물질의 사용도 가능하다.
본 발명에서는 우수한 소나무 재선충 살충효과를 가지고 있는 천연물유래 화합물을 탐색하기 위하여, 여러 종류의 식물추출물 처리가 소나무 재선충 밀도를 감소시키는 정도를 측정하여 살선충활성을 탐색하였다. 그 결과, 계피 추출물이 다른 천연물 추출물에 비해 소나무 재선충에 대한 살선충활성 능력이 뛰어남을 발견하였고, 이를 분리, 정제한 결과 시나믹 알데히드가 유효성분임을 확인하였다.
실시예 1
본 발명에서 실시한 계피로부터 시나믹 알데히드의 제조 방법은 다음과 같다.
계피(Cinnamomum cassia) 1kg을 분쇄한 후 중량의 5배인 70% 함수 알코올을 가하여 4-40℃에서 12시간동안 추출한 후 와트만 42번 여과지로 여과하여, 이 여액을 65℃에서 회전 감압 증발기로 건조하여 건조중량 115g을 얻었다.
이것을 다시 정제수에 현탁시키고, 이 현탁액을 헥산으로 분획하였다. 이 분획물을 실리카겔을 이용한 컬럼크로마토그래피 및 고속액체크로마토그래피로 분리, 정제하여 목적화합물인 시나믹 알데히드를 얻었다. 그러나, 목적화합물을 얻기 위한 방법이 상기의 정제방법에 한정된 것은 아니다.
상기의 정제방법으로 얻어진 목적화합물인 시나믹 알데히드의 IR, 질량분석 및 끓 는점의 측정결과는 아래와 같다.
1. IR Spectrum 측정결과
Carbonyl
streching
frequency C=O : 1679
cm-1
Aromatic C=C
streching
frequency : 1495
cm-1
Aromatic C=C-H 및 olefin C-H
sp2
탄소의
H peak
streching
frequency : 3028
cm-1
, 3061
cm-1
Aromatic out of plane bending : 751
cm-1
Aldehyde
-
CHO
의 C-H
straching
frequency : 2815
cm-1
2. 질량분석 스펙트럼(Mass Spectrum) 측정결과 (도 2 참조)
M/S(m/z) : 132 (M
+
, molecular ion), 131 (100, M-H), 115 (2),
103 (39, M-
CHO
), 77 (28, phenyl group),
63 (5), 53 (1), 51 (23), 43 (6)
질량분석결과, 분자량 Peak가 132로 나타났고 이는 알데히드기를 소유하는 화합물이 수소원자를 쉽게 잃는 특성을 보여주는 전형적인 Peak이며, 이와 함께 103 (39, M-CHO)와 77 (28, phenyl group)의 Peak의 존재로서 이 물질이 시나믹 알데히드임 을 확인하였다.
3. 끓는점 측정결과
측정값 : 100℃/10mmHg, 248℃/760mmHg
끓는점도 이미 알려진 시나믹 알데히드의 범위내에 있음을 확인하였다.
실험예 1: 시나믹 알데히드 및 이와 구조적으로 유사한 화합물인 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde및 2-Methoxycinnamaldehyde의 소나무 재선충에 대한 살충효과
계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 이와 구조적으로 유사한 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde(98%, Aldrich사) 및 2-Methoxycinnamaldehyde (96%, Aldrich사)의 처리에 의한 소나무 재선충 살충효과를 검증하고자 실내약효실험을 실시하였다. 시험에 사용된 소나무 재선충은 경상북도 구미시 선산읍 습례리 일대 야산의 소나무 재선충 감염 의심목으로부터 소나무절편을 채취하여 실험에 사용하였으며, 계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde는 에탄올로 희석하여 24-Well plate에 각 농도별로 3반복 처리하고 25℃, 차광조건하에서 24시간 경과 후에 평균선충밀도를 분석하여 살충율을 계산하였다. 소나무 재선충은 감염 의심목의 표피를 제거하고 노출된 변재부를 채취하여 바에르만깔대기법을 이용하여 분리하였고, Leica S6E 해부현미경으로 개체수를 판정하여 실험결과를 표1에 나타내었다.
계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde의 토양뿌리혹선충 살충효과
처리구 |
살충율 (%) |
무처리 |
6.28 |
CA, 0.005% (50 ppm) |
4.55 |
CA, 0.01% (100 ppm) |
26.67 |
CA, 0.02% (200 ppm) |
87.53 |
CA, 0.03% (300 ppm) |
100.00 |
CA, 0.05% (500 ppm) |
100.00 |
CA, 0.1% (1,000 ppm) |
100.00 |
CA:α-MC = 1:1, 0.005% (50 ppm) |
9.52 |
CA:α-MC = 1:1, 0.01% (100 ppm) |
22.22 |
CA:α-MC = 1:1, 0.02% (200 ppm) |
77.25 |
CA:α-MC = 1:1, 0.03% (300 ppm) |
100.00 |
CA:α-MC = 1:1, 0.05% (500 ppm) |
100.00 |
CA:α-MC = 1:1, 0.1% (1,000 ppm) |
100.00 |
CA:2-MC = 1:1, 0.005% (50 ppm) |
6.25 |
CA:2-MC = 1:1, 0.01% (100 ppm) |
20.00 |
CA:2-MC = 1:1, 0.02% (200 ppm) |
85.71 |
CA:2-MC = 1:1, 0.03% (300 ppm) |
100.00 |
CA:2-MC = 1:1, 0.05% (500 ppm) |
100.00 |
CA:2-MC = 1:1, 0.1% (1,000 ppm) |
100.00 |
CA:α-MC:2-MC = 1:1:1, 0.005% (50 ppm) |
11.11 |
CA:α-MC:2-MC = 1:1:1, 0.01% (100 ppm) |
37.36 |
CA:α-MC:2-MC = 1:1:1, 0.02% (200 ppm) |
97.65 |
CA:α-MC:2-MC = 1:1:1, 0.03% (300 ppm) |
100.00 |
CA:α-MC:2-MC = 1:1:1, 0.05% (500 ppm) |
100.00 |
CA:α-MC:2-MC = 1:1:1, 0.1% (1,000 ppm) |
100.00 |
* CA, 시나믹 알데히드; α-MC, α-Methyl-trans-cinnamaldehyde;
2-MC, 2-Methoxycinnamaldehyde
* 살충율(%) = 1-((처리후의 선충수/처리전의 선충수) × 100)
실험결과 계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde의 농도에 따른 소나무 재선충 살충효과는 표1에 나타낸 것과 같이, 실험에 사용된 소나무 재선충에 대하여 각각의 약제를 단독으로 0.02% 처리시 77%-97%의 유의적 살충효과를 나타내었으며, 0.03% 처리시에는 단독 및 혼합처리한 전체처리구에서 100% 의 강력한 살충효과를 나타내었다. 특히, 0.02%의 처리농도에서 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde를 1:1:1의 동량으로 혼합하여 처리한 실험구에서 가장 강력한 살선충효과가 확인되어 상기 시험조건에서 소나무 재선충의 방제에 가장 유효함을 나타내었다.
실시예 2
계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde를 주성분으로 하는 소나무 재선충 방제약제의 성분구성비는 표 2와 같다.
성분 |
함량(단위: 부피%) |
실시예 1 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde(98%, Aldrich사) 2-Methoxycinnamaldehyde(96%, Aldrich사) 에탄올 |
30 30 30 10 |
합계 |
100 |
실험예 2: 계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans- cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde를 주성분으로 하는 소나무 재선충 방제약제의 소나무 재선충 방제효과
계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde를 주성분으로 하는 소나무 재선충 방제약제를 현장에서 처리시에 소나무 재선충에 대한 방제효과를 검증하고자 경상북도 구미시 선산읍 습례리 일대 야산의 소나무 재선충 감염목을 대상으로 현장실험을 실시하였다. 소나무의 재선충 감염여부와 개체수 판별은 실험예 1과 동일한 방법을 이용하였다. 실시예 2의 소나무 재선충 방제약제를 이용한 방제시험은 천공에 의한 원액의 수간주사를 사용하여 실시하였다. 먼저, 천공기로 (φ12mm Drill) 흉고직경 20± 2cm의 소나무의 지상1.5m의 부위에 동일한 간격으로 깊이 10cm정도구멍을 수개 뚫고 실시예 2의 방제약제를 일정량 주입 후 실리콘으로 봉쇄하였다. 처리구당 수량은 10주, 3반복 처리하였고, 소나무의 재선충 개체수 변화는 처리전과 처리 후 4주일이 경과한 시점에서 실험예 1과 동일하게 처리구와 무처리구의 변재부 30g을 취하여 이로부터 베르만의 깔대기법을 이용하여 선충을 분리, 검경하여 판정하였으며 실험결과는 표3에 나타내었다.
소나무 재선충 감염목에 처리에 따른 실시예 2의 소나무 재선충 방제효과
처리구 |
처리전 평균선충밀도 (마리/30g) |
처리후 평균선충밀도 (마리/30g) |
방제가 (%) |
무처리 |
8,215 |
10,766 |
0% |
실시예 2 50 ml |
5,542 |
4,167 |
24.81% |
실시예 2 100 ml |
12,036 |
1,621 |
86.53% |
실시예 2 200 ml |
7,763 |
889 |
88.54% |
*방제가(%) = 1-((처리전의 선충수/처리후의 선충수) × 100)
실험결과, 실시예 2의 소나무 재선충 방제약제 처리 4주후 소나무에 존재하는 재선충 개체수가 무처리에 비하여 유의적으로 감소한 것을 확인하였으며, 본 실험에 사용된 흉고직경 20± 2cm의 소나무에 1주당 100ml 이상의 방제약제 처리에 의하여 소나무에 감염된 재선충을 효과적으로 방제가능한 것으로 나타났다. 이 결과는 실험예 1에서 실시한 실내실험(200 ppm 처리시 97% 이상의 방제효과)보다 상대적으로 악조건인 현장실험의 경우 소나무 재선충 방제효과가 다소 떨어지는 결과로 판단된다. 그러나 실시예 2의 소나무 재선충 방제약제는 원액 100ml 이상 처리구에서 소나무 재선충에 대하여 생화학농약의 허가기준인 50%이상의 방제가(농촌진흥청 고시 2005-3호, 2005년 4월 25일)를 훨씬 상회하는 86% 이상의 높은 방제가를 보인 것으로 보아 계피로부터 분리, 정제한 시나믹 알데히드 및 α-Methyl-trans-cinnamaldehyde, 2-Methoxycinnamaldehyde를 주성분으로 하는 실시예 2의 소나무 재선충 방제약제는 생화학농약으로서 활용가능함을 나타내었다.