KR100941304B1 - Novel nucleoside hydrolase ? - Google Patents
Novel nucleoside hydrolase ? Download PDFInfo
- Publication number
- KR100941304B1 KR100941304B1 KR1020040087604A KR20040087604A KR100941304B1 KR 100941304 B1 KR100941304 B1 KR 100941304B1 KR 1020040087604 A KR1020040087604 A KR 1020040087604A KR 20040087604 A KR20040087604 A KR 20040087604A KR 100941304 B1 KR100941304 B1 KR 100941304B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ala
- val
- leu
- gly
- pro
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/15—Corynebacterium
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 우리딘 (uridine)과 씨티딘 (cytidine)에 대한 기질 특이성을 갖는 신규 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 및 이를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel nucleoside hydrolase I having a substrate specificity for uridine and cytidine and a nucleic acid molecule encoding the same.
코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes), 뉴클레오시드 하이드롤라제 ICorynebacterium ammoniagenes, nucleoside hydrolase I
Description
도 1은 본 발명의 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제I을 코딩하는 유전자의 염기서열을 나타낸다. Figure 1 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the novel nucleoside hydrolase I of the present invention.
도 2는 본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 유전자의 연역 아미노산 서열과 크리티디아 파시쿨레이트 (Crithidia fasciculate), 레이쉬마니아 도노바니 (Leishmania donovani), 코리네박테리움 글루카미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 에스케리키아 콜라이 (Eschrichia coli) 및 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 아미노산 서열을 비교 분석한 결과이다: Figure 2 shows the deduced amino acid sequence of the gene encoding nucleoside hydrolase I of the present invention, Crithidia fasciculate, Leishmania donovani, Corynebacterium glucamicum A comparison of amino acid sequences from Corynebacterium glutamicum , Eschrichia coli and Saccharomyces cerevisiae results:
Ca-NHI, 코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 뉴클레오시드 하이드롤라제 I;Ca-NHI, nucleoside hydrolase I from Corynebacterium ammonia genes;
Cf-IUNH, 크리티디아 파시쿨레이트 유래의 이노신 및 우리딘에 특이적인 뉴클레오시드 하이드롤라제 (inosine-uridine-preferring nucleoside hydrolase);Inosine-uridine-preferring nucleoside hydrolase specific for Cf-IUNH, inosine and uridine from Crythedia faciculate;
Ld-NH, 레이쉬마니아 도노바니 유래의 뉴클레오타이드 하이드롤라제;Nucleotide hydrolases from Ld-NH, Laishmania donovani;
Cg-IUNH, 코리네박테리움 글루카미쿰 유래의 이노신-우리딘 하이드롤라제; Inosine-uridine hydrolase from Cg-IUNH, Corynebacterium glucamicum;
Ec-RihA, 에스케리키아 콜라이 유래의 리보뉴클레오시드 하이드롤라제;Ec-RihA, ribonucleoside hydrolases from Escherichia coli;
Ec-RihB, 에스케리키아 콜라이 유래의 리보뉴클레오시드 하이드롤라제 B; Ec-RihB, ribonucleoside hydrolase B from Escherichia coli;
Ec-RihC, 에스케리키아 콜라이 유래의 리보뉴클레오시드 하이드롤라제 C; Ec-RihC, ribonucleoside hydrolase C from Escherichia coli;
Sc-URH1, 사카로마이세스 세레비지애 유래의 우리딘 리보하이드롤라제.
Sc-URH1, uridine ribohydrolase from Saccharomyces cerevisiae.
본 발명은 우리딘 (uridine)과 씨티딘 (cytidine)에 대한 기질 특이성을 갖는 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 에 관한 것이다.
The present invention relates to a novel nucleoside hydrolase I having substrate specificity for uridine and cytidine.
뉴클레오시드와 그 유도체들은 항생물질, 항암물질, 항바이러스제 등과 같이 많은 용도를 지닌 것으로 보고되었다 (J. Virol, 72, 4858-4865).Nucleosides and their derivatives have been reported to have many uses, such as antibiotics, anticancer agents, and antiviral agents (J. Virol, 72, 4858-4865).
뉴클레오시드를 분해에 관여하는 효소에는 뉴클레오시드 포스포릴라제 (nucleoside phosphorylase) 와 뉴클레오시드 하이드롤라제 (nucleoside hydrolase)가 알려져 있다. Enzymes involved in degrading nucleosides are known nucleoside phosphorylase and nucleoside hydrolase.
뉴클레오시드 포스포릴라제는 뉴클레오시드를 가역적으로 인산기의 전이를 수반하여 분해하며 실제로 염기 치환 반응을 통한 뉴클레오시드 유도체의 합성에 많은 보고가 되어 있다 (Biosci. Biotech. Biochem, 60, 1179-1180). 뉴클레오시드 하이드롤라제는 자연계에 널리 분포하지만 포유동물에는 존재하지 않는 효소로 주로 병원성 원생동물의 치료제의 목적으로 주로 연구되어 왔다 (Biochemistry, 38, 13147-13154). 이에 대한 목적으로 다양한 생물체로부터 분리된 뉴클레오시드 하이드롤라제 및 그 유전자에 대한 보고가 되고 있다. Nucleoside phosphorylase decomposes nucleosides reversibly with the transfer of phosphate groups, and there are many reports on the synthesis of nucleoside derivatives through base substitution reactions (Biosci. Biotech. Biochem, 60, 1179 -1180). Nucleoside hydrolases are enzymes that are widely distributed in nature but not present in mammals and have been studied primarily for the treatment of pathogenic protozoa (Biochemistry, 38, 13147-13154). For this purpose, reports have been made on nucleoside hydrolases and their genes isolated from various organisms.
본 발명자들은 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 을 코딩하는 신규한 유전자를 분리하고 그의 특성을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
The inventors have isolated a novel gene encoding nucleoside hydrolase I from the Corynebacterium ammonia genes ATCC 6872 wild line and identified its properties to complete the present invention.
본 발명의 목적은 우리딘과 씨티딘에 대한 기질 특이성을 갖는 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 및 이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공하는 것이다.
It is an object of the present invention to provide a novel nucleoside hydrolase I having substrate specificity for uridine and citidine and a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding the same.
하나의 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 야생주로부터 분리된 우리딘과 씨티딘에 대한 기질 특이성을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 을 제공한다.In one embodiment, the present invention provides nucleoside hydrolase I having substrate specificity for uridine and citidine isolated from Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 wild line.
본 발명에서, 용어 "뉴클레오시드 하이드롤라제"는 리보즈와 퓨린 또는 피리미딘 사이의 N-글리코시딕 결합 (N-glycosidic bond)을 가수분해하는 효소를 일컫는다.In the present invention, the term "nucleoside hydrolase" refers to an enzyme that hydrolyzes an N-glycosidic bond between ribose and purine or pyrimidine.
코리네박테리움 암모니아게네스는 그람-양성의 비병원성 박테리아로 인간의 식품, 동물의 식량, 약제학적 조성물로 사용되는 뉴클레오타이드 (예를 들면, 이노신-5-모노포스페이트 (inosine-5-monophosphate), 구아노신-5-모노포스페이트 (guanosine-5-monophosphate) 등) 또는 아미노산 (예를 들면, 글루타메이트, 라이Corynebacterium ammonia genes are gram-positive, non-pathogenic bacteria and nucleotides (eg, inosine-5-monophosphate, guano, which are used in human food, animal food, and pharmaceutical compositions). Cino-5-monophosphate, etc.) or amino acids (eg, glutamate, lye)
신 등)을 대량 생산하는 산업적 용도로 매우 많이 사용되는 박테리아이다. It is a very widely used bacterium for industrial production of mass production.
본 발명자는 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 셧건(shot-gun) 클로닝을 통하여 라이브러리를 제작하고 이로부터 일련의 과정을 통해 뉴클레오시드 하이드롤라제 활성을 갖는 유전자를 확보하였다, The inventors produced a library through shot-gun cloning from Corynebacterium ammonia genes ATCC 6872 wild line and obtained a gene having nucleoside hydrolase activity through a series of processes therefrom.
일반적으로, 뉴클레오시드 하이드롤라제는 그들의 기질 특이성에 따라 3개의 서브 클래스로 분류된다. 첫번째는 이노신 (inosine)과 우리딘에 특이적인 뉴클레오시드 N-리보하이드롤라제 (inosine-uridine nucleoside N-ribohydrolase) (Biochemistry, 35, 5971-5981), 두번째는 이노신, 아데노신 (adenosine) 및 구아노신 (guanosine)에 특이적 뉴클레오시드 하이드롤라제 (inosine-adenocine-guanosine-preferring nucleoside hydrolase) (J. Biol. Chem, 271, 21713-21719), 세번째는 이노신과 구아노신에 특이적인 뉴클레오시드 N-글리코하이드롤라제 (guanosine-inosine-preferring nucleoside N-glycohydrolase) (J. Biol. Chem, 269, 23068-23073) 이다. 이외에도 사카로마이세스 세레비지애 유래의 우리딘 (uridine)에 기질 특이적인 효소 (Curr. Genet, 41, 132-141)가 알려졌으며, 에스케리키아 콜라이에서도 각기 다른 기질 특이성을 지닌 효소가 보고되었다 (J. Biol. Chem, 276, 884-894). In general, nucleoside hydrolases are classified into three subclasses according to their substrate specificity. The first is inosine and uridine-specific nucleoside N-ribohydrolase (Biochemistry, 35, 5971-5981), the second is inosine, adenosine and guano Inosine-adenocine-guanosine-preferring nucleoside hydrolase (J. Biol. Chem, 271, 21713-21719), and the third nucleoside specific for inosine and guanosine Guanosine-inosine-preferring nucleoside N-glycohydrolase (J. Biol. Chem, 269, 23068-23073). In addition, a substrate-specific enzyme (Curr. Genet, 41, 132-141) is known for uridine derived from Saccharomyces cerevisiae, and enzymes with different substrate specificities have been reported in Escherichia coli. (J. Biol. Chem, 276, 884-894).
본 발명에 따른 뉴클레오시드 하이드롤라제는 상기한 바와 같은 공지의 뉴클레오시드 하이드롤라제와는 달리 피리미딘 염기를 가지는 뉴클레오시드, 보다 구체적으로는 우리딘과 씨티딘 기질 특이성을 갖는 신규한 효소로서, 뉴클레오시드 하 이드롤라제 I이다. 본 발명의 신규한 뉴클레오시드 하이드롤라제 I와, 회수경로 (salvage pathway)에 포함된 뉴클레오시드 하이드롤라제를 코딩하는 유전자와의 상동성을 GenBank에서 BLAST 검색하고 분석한 결과가 도 2에 나타나 있다. The nucleoside hydrolases according to the present invention, unlike the known nucleoside hydrolases as described above, are novel nucleosides having pyrimidine bases, more particularly novel with uridine and citidine substrate specificities. As an enzyme, nucleoside hydrolase I. BLAST search and analysis on GenBank of homology between the novel nucleoside hydrolase I of the present invention and the gene encoding the nucleoside hydrolase included in the salvage pathway is shown in FIG. Is shown.
본 발명은 뉴클레오시드 하이드롤라제 I의 천연형 아미노산 서열 (서열번호 2)을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이와 기능적으로 동등한 활성을 나타내는 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 단백질의 변이체를 본 발명의 범위에 포함한다.?? 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 단백질의 변이체란 야생형 뉴클레오시드 하이드롤라제의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.? 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다 (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).? 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화 (phosphorylation), 황화 (sulfation), 아크릴화 (acrylation), 당화 (glycosylation), 메틸화 (methylation), 파네실화 (farnesylation) 등으로 수식될 수도 있다.? 야생형 단백질의 아미노산 서열에서 변이를 유발하는 방법에는 야생형 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 변이시킴으로써 변경하고자 하는 아미노산 서열에 해당하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 갖도록 하는 방법이 있다.? 이런 방법은 당 업계에 공지되어 있으며?가장 대표적인 방법은 위치-지향성 돌연변이 유발 (Site-directed mutagenesis) 기술이다.The present invention includes within the scope of the present invention variants of the nucleoside hydrolase I protein, as well as proteins having the native amino acid sequence of nucleoside hydrolase I (SEQ ID NO: 2), which exhibit functionally equivalent activity. . ?? Variant of nucleoside hydrolase I protein means a protein in which the amino acid sequence of the wild-type nucleoside hydrolase and one or more amino acid residues have different sequences by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof do.? Amino acid exchange in proteins and peptides that do not alter the activity of the molecule as a whole is known in the art (H. Neurode, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala / Ser, Val / Ile, Asp / Glu, Thr / Ser, Ala / Gly, Ala / Thr, Ser / Asn, Ala / Val, Ser / Gly, Thy / Phe, Ala / Exchange between Pro, Lys / Arg, Asp / Asn, Leu / Ile, Leu / Val, Ala / Glu, Asp / Gly. In some cases, it may be modified by phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, and the like. A method of causing a mutation in an amino acid sequence of a wild type protein includes a method of having a nucleic acid molecule comprising a nucleotide sequence corresponding to an amino acid sequence to be altered by changing the nucleotide sequence encoding the wild type nucleoside hydrolase I. ? Such methods are known in the art and the most representative is the site-directed mutagenesis technique.
또 다른 양태로서, 본 발명은 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 분리된 우리딘과 씨티딘에 대한 기질 특이성을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자를 제공한다.In another aspect, the present invention provides a nucleic acid molecule having a nucleotide sequence encoding nucleoside hydrolase I having substrate specificity for uridine and citidine isolated from Corynebacterium ammonia genes ATCC 6872 wild line. to provide.
????????본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 핵산 서열은 천연에서 분리되거나?인위적으로 합성 또는 유전적 재조합 방법을 통하여 제조할 수 있다.?? 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA (mRNA) 분자일 수 있다.? Nucleic acid sequences encoding the nucleoside hydrolase I of the present invention can be isolated in nature or can be prepared through artificially synthetic or genetic recombination methods. The sequence of such nucleic acid molecules may be single or double stranded, and may be DNA molecules or RNA (mRNA) molecules.
본 발명의 우리딘과 씨티딘에 대한 기질 특이성을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 분자는, 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 핵산 분자가 바람직하며, 특히 바람직하게는 서열번호 3의 핵산 분자이다. Nucleic acid molecules having a nucleotide sequence encoding a nucleoside hydrolase I having substrate specificity for uridine and citidine of the present invention, a nucleoside hydrolase I having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Nucleic acid molecules are preferred, particularly preferably the nucleic acid molecule of SEQ ID NO: 3.
본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 유전적 재조합 방법을 이용하여 제공하고자 하는 경우, 이를 코딩하는 핵산 분자가 삽입된 재조합 벡터를 통해 제공할 수 있다.? If the nucleoside hydrolase I of the present invention is to be provided using a genetic recombination method, the nucleic acid molecule encoding the same may be provided through a recombinant vector.
????????재조합 벡터란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말하며, 이러한 유전자 작제물은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어야 한다.? 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다.??재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. A recombinant vector is a vector capable of expressing a protein of interest in a suitable host cell, and refers to a gene construct containing essential regulatory elements operably linked to express the gene insert. The nucleic acid expression control sequence and the nucleic acid sequence encoding the desired polypeptide must be functionally linked to perform a general function. For example, promoters and nucleic acid sequences encoding proteins or RNAs may be operably linked to affect expression of coding sequences.Operative linkages with recombination vectors may employ genetic recombination techniques well known in the art. And site-specific DNA cleavage and ligation using enzymes generally known in the art.
적합한 재조합 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인해서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.? 본 발명에서 사용되는 프로모터에는 예를 들어 숙주가 에스케리키아속균인 경우에는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λP L 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다.? 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임 (in frame)에 있어야 한다.? 또한, 재조합 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커, 복제를 위한 복제 기원, 시그널 서열 등을 포함할 수 있다.? 시그널 서열에는 숙주가 에스케리키아속균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. Suitable recombinant vectors include signal sequences or leader sequences for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as promoters, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals and hence may be prepared in various ways depending on the purpose. Examples of the promoter used in the present invention include a trp promoter, a lac promoter, a recA promoter, a λP L promoter, an lpp promoter, a T7 promoter, etc., when the host is Escherichia spp., An SPO1 promoter when the host is Bacillus, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, etc. are preferable when a host is yeast, such as an SPO2 promoter and a penP promoter. The start codon and the stop codon must be functional in the subject when the gene construct is administered and must be in frame with the coding sequence. In addition, the recombinant vector may include a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, a replication origin for replication, a signal sequence, and the like. The signal sequence includes a PhoA signal sequence and an OmpA signal sequence when the host is Escherichia spp., And an α-amylase signal sequence and a subtilisin signal sequence when the host is Bacillus. Signal sequences, SUC2 signal sequences, and the like, but may be used.
상기 재조합 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질감염시켜 이러한 형질전환체로부터 발현된 뉴클레오시드 하이드록실라제 I을 분리하여 수득할 수 있으며, 예를 들어 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 슈도모나스 (Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 (Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포, 아스페르길러스 (Aspergillus)와 같은 진균, 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비지애, 쉬조사카로마세스 (Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)와 같은 효모 등을 숙주 세포로 이용할 수 있다. ?재조합 벡터의 숙주세포로의 도입은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.? 이런 방법에는 전기충격유전자전달법 (electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘 (CaPO4) 침전, 염화 칼슘 (CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.? 배양한 형질전환체로부터 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 분리될 수 있으며, 예를 들어 세포를 원심분리하여 수집하고 초음파 파쇄기를 이용하여 분쇄하고, 세포 잔여물을 원심분리로 제거하여 상등액으로부터 분리할 수 있다.?? 과발현에 의해 응집된 뉴클레오시드 하이드롤라제 I 단백질은, 적절한 용액에서 단백질을 용해시키고 및 변성시키고 재폴딩시켜서 얻을 수 있다 (Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195, 1990).? 글루타티온, 디티오트레이톨, β-머캅토에탄올, β-머캅토메탄올, 시스틴 및 시스타민의 산화 및 환원 시스템이 사용될 수 있으며 요소, 구아니딘, 아르기닌 등의 재폴딩제 등을 이용할 수 있다. 또한, 형질전환체로부터 획득한 단백질을 포함하는 용액을 염석 (예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 뉴클레오시드 하이드롤라제 I단백질을 정제할 수 있다.
By transfecting appropriate host cells with the recombinant vector, nucleoside hydroxylase I expressed from such a transformant can be obtained, for example, Escherichia coli , Bacillus subtilis. fungi, such as (Bacillus subtilis), Streptomyces (Streptomyces), Pseudomonas (Pseudomonas), Proteus Mira Billy's (Proteus mirabilis) or Staphylococcus prokaryotic host cells such as (Staphylococcus), Aspergillus way Russ (Aspergillus), Yeasts such as Pichia pastoris , Saccharomyces cervisia, Schizosaccharomyces and Neurospora crassa can be used as host cells. Introduction of the recombinant vector into a host cell includes any method of introducing a nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and may be carried out by selecting a suitable standard technique according to the host cell as known in the art. ? These methods include electroporation, protoplast fusion, calcium phosphate (CaPO 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, agitation with silicon carbide fibers, agro bacterial mediated transformation, PEG, dextran sulfate, Include but are not limited to lipofectamine. Proteins expressed from the cultured transformants can be isolated in a conventional manner, for example, cells are collected by centrifugation and crushed using an ultrasonic crusher, and cell residues are removed from the supernatant by centrifugation. Can it be ?? Nucleoside hydrolase I protein aggregated by overexpression can be obtained by dissolving, denaturing and refolding the protein in a suitable solution (Kohno, Meth. Enzym., 185: 187-195, 1990). Oxidation and reduction systems of glutathione, dithiothreitol, β-mercaptoethanol, β-mercaptomethanol, cystine and cystamine may be used, and refolding agents such as urea, guanidine, arginine and the like may be used. In addition, the solution containing the protein obtained from the transformant may be salted (e.g., ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (protein fraction precipitation using acetone, ethanol, etc.), dialysis, gel filtration, ion exchange, Techniques such as column chromatography and reverse filtration, such as reverse phase column chromatography, may be applied alone or in combination to purify the nucleoside hydrolase I protein of the present invention.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 어떤 형태로든 실시예에 의해 제한되는 것을 의미하지는 않는다.
EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, this invention is demonstrated concretely based on an Example. However, it does not mean that the scope of the present invention is limited by the embodiment in any form.
<실시예>
<Example>
실시예 1 : 코리네박테리움 암모니아게네스 (Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6872 야생주로부터 피리미딘 뉴클레오시드 분해 유전자의 분리
Example 1 Isolation of Pyrimidine Nucleoside Degradation Gene from Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 Wild Line
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 유전자를 분리하기 위해 야생주 균주를 영양 배지 (주 1)에서 배양하고 균체를 원심분리하여 확보한 다음 표준적인 방법으로 키트를 사용하여 염색체 DNA를 확보하였다. 확보된 DNA를 Sau3A1으로 15분간 37℃에서 효소처리한 후, 열처리하여 효소를 불활성화시키고 5 내지 10kb 크기의 DNA 절편을 아가로스 젤상에서 확보하였다. 이후, BamH1 효소 처리된 코리네-대장균 셔틀벡터인 pECCG117(특허공개번호 1990-0016462)에 결합시켰다. 이 샘플을 뉴클레오시드를 분해하는 효소가 결핍된 대장균 변이주 (E. coli CGSC6885)에 형질전환하고 우리딘을 함유한 (주2)의 배지에서 도말하였다. 이 배지에서 피리미딘이 각각 탄소원 기질로 이용되는 유전자를 함유한 균주가 성장하면 빨간색을 띠게 되므로 (J. Bacteriol, vol;179, pp7679-7686), 빨간색 콜로니들을 분리하여 뉴클레오시드를 분해하는 유전자를 포함한 후보로 선별하였다
To isolate genes encoding nucleoside hydrolase I from Corynebacterium ammonia genes ATCC 6872 wild strains, wild strains were cultured in nutrient medium (Note 1), and the cells were centrifuged to obtain a standard The kit was used to secure chromosomal DNA. The obtained DNA was enzymatically treated with Sau3A1 at 37 ° C. for 15 minutes, followed by heat treatment to inactivate the enzyme, and a DNA fragment of 5 to 10kb in size was obtained on agarose gel. Then, it was bound to pECCG117 (Patent Publication No. 1990-0016462), which is a Coryne-E. Coli shuttle vector treated with BamH1 enzyme. This sample was transformed into Escherichia coli mutant strain ( E. coli CGSC6885) lacking an enzyme that degrades nucleosides and plated in medium of (note 2) containing uridine. In this medium, when the strains containing genes for which pyrimidine is used as a carbon source substrate grow, the color becomes red (J. Bacteriol, vol; 179, pp7679-7686), a gene that separates nucleosides by separating red colonies Candidates were selected, including
실시예 2 : 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 분리한 피리미딘 뉴클레오시드 분해 유전자의 염기 서열 및 아미노산 서열 분석
Example 2 Analysis of Base and Amino Acid Sequences of Pyrimidine Nucleoside Degradation Gene Isolated from Corynebacterium Ammonia Genes ATCC 6872 Wild Line
실시예 1에서 분리한 유전자들의 염기서열 분석은 자동염기서열 분석장치 (model 310 Genetic analyzer; Perkin-Elmer Applied Biosystems 사)에 의해 수행하였다. 이 염기서열들의 비교분석은 NCBI, GenBank, EMBL 및 SwissPlot 데이터베이스에서 제공된 DNASIS 및 BLAST 프로그램에 의해 수행하였다. 상기 분석결과, 피리미딘 뉴클레오시드에서 분리한 유전자는 1556bp의 뉴클레오티드 서열 (서열번호 1)을 가지고 337개의 아미노산 서열 (서열번호 2)을 암호화하였다. 이를 뉴클레오시드 하이드롤라제 I으로 명명하였다. 상기 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 유전자의 염기 서열 및 연역 아미노산 서열을 각각 도 1에 나타내었다. 또한, 데이터베이스 검색을 통해, 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 유전자와 다른 뉴클레오시드 하이드롤라제와 비교 분석한 결과를 도 2에 나타내었다.
Sequence analysis of the genes isolated in Example 1 was performed by an automatic base sequence analyzer (model 310 Genetic analyzer; Perkin-Elmer Applied Biosystems). Comparative analysis of these sequences was performed by the DNASIS and BLAST programs provided in the NCBI, GenBank, EMBL and SwissPlot databases. As a result of the analysis, the gene isolated from pyrimidine nucleoside had a nucleotide sequence of 1556 bp (SEQ ID NO: 1) and encoded 337 amino acid sequences (SEQ ID NO: 2). This was named Nucleoside Hydrolase I. The base sequence and the deduced amino acid sequence of the gene encoding the nucleoside hydrolase I are shown in FIG. 1, respectively. In addition, the results of comparative analysis of the gene encoding nucleoside hydrolase I and other nucleoside hydrolases through a database search are shown in FIG. 2.
실시예 3 : 뉴클레오시드 하이드롤라제 I의 기질 특이성 검정
Example 3 Substrate Specificity Assay of Nucleoside Hydrolase I
뉴클레오시드 하이드롤라제 I의 기질 특이성을 알아보기 위해 이 유전자의 ORF 부분을 발현벡터 pTrc99A (Promega사)에 클로닝한 후, 대장균 변이주 (E. coli CGSC6885)에 형질전환하였다. 이 형질전환된 대장균을 37℃에서 하루동안 배양한 후, 원심분리하여 균체를 확보하였다. 이 균체를 세포벽 파쇄장치 (Ultrasonic disrupter; Sonics & Materials Co)를 이용하여 파쇄한 후, 조효소액을 확보하였다. 이 효소액을 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 각각 0.125M을 포함하는 100mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.0)에 첨가하여 30℃에서 반응시켰다. 이 반응을 0.35%의 트리클로로아세트산 용액을 첨가하여 종료시킨 후, 각각의 기질인 뉴클레오시드와 그 생성물인 염기들을 고압력 액체크로마토그래피 (high-pressure liquid chromatography, Waters Co.)를 이용하여 분석하였다. 퓨린과 피리미딘 뉴클레오시드 기질에 대한 특이성을 효소활성도 (unit)로 나타내었다. 즉, 분당 1mmol의 뉴클레오시드를 소비하는데 필요한 효소량 (mg)으로 하나의 unit를 정의하였다. 상기의 결과를 표 2에 나타내었다.
To determine the substrate specificity of nucleoside hydrolase I, the ORF portion of this gene was cloned into the expression vector pTrc99A (Promega) and then transformed into E. coli CGSC6885. The transformed E. coli was incubated at 37 ° C. for one day, and then centrifuged to secure the cells. The cells were lysed using a cell wall crusher (Ultrasonic disrupter; Sonics & Materials Co), and the coenzyme solution was obtained. This enzyme solution was added to 100 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0) containing 0.125M each of purine and pyrimidine nucleosides and reacted at 30 ° C. After the reaction was terminated by addition of 0.35% trichloroacetic acid solution, each substrate nucleoside and its product bases were analyzed by high-pressure liquid chromatography (Waters Co.). . Specificity for the purine and pyrimidine nucleoside substrates is expressed as enzymatic activity (unit). That is, one unit was defined as the amount of enzyme (mg) required to consume 1 mmol of nucleosides per minute. The results are shown in Table 2.
a NH I, 뉴클레오시드 하이드롤라제 I; 대조군, CGSC 6885/pTrc99A. a NH I, nucleoside hydrolase I; Control, CGSC 6885 / pTrc99A.
b 기질 특이성: 밀리유니트 (mUnit)
b Substrate specificity: milliunits (mUnit)
상기한 표로부터 확인되는 바와 같이, 뉴클레오시드 하이드롤라제 I은 우리딘과 씨티딘에 대한 기질 특이성을 보였다.
As confirmed from the table above, nucleoside hydrolase I showed substrate specificity for uridine and citidine.
본 발명의 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 6872 야생주로부터 분리한 뉴클레오시드 하이드롤라제 I을 코딩하는 유전자와 그 특성을 밝힘으로써, 향후 뉴클레오시드 하이드롤라제를 결실시키는 등의 조작을 통해 뉴클레오시드 생산율을 향상시켜 뉴클레오시드를 생산하는 미생물을 개발하는데 이용될 수 있다.By identifying the gene encoding the nucleoside hydrolase I isolated from the Corynebacterium ammonia genes ATCC 6872 wild line of the present invention and its characteristics, through the operation such as deletion of the nucleoside hydrolase in the future It can be used to develop nucleoside-producing microorganisms by enhancing the nucleoside production rate.
<110> CJ <120> Novel nucleoside hydrolase I <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1556 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <220> <221> CDS <222> (232)..(1242) <400> 1 aagtaatcag cgcctttgga ttcttgatgt aatccggcaa gctcagcgct acgcctgcaa 60 aacctgcctg gaccacgcgt ccagccaggg tgtcatcgag ggcataattg tcttcctttt 120 tgtctgcact gttgaaagat tcattcgtca tagcgcccca gaatacctgc gtttagtcaa 180 ttgccgggga gttgtgaata tatagaaaag tagcgagtag actttgcgag a 231 atg aac gca gat tcc acc tca ccg gca cag aaa atc atc ctc gat tgc 279 Met Asn Ala Asp Ser Thr Ser Pro Ala Gln Lys Ile Ile Leu Asp Cys 1 5 10 15 gac ccg ggc cat gac gat gcc att gcc atg ctc ctg gca cat ggc aat 327 Asp Pro Gly His Asp Asp Ala Ile Ala Met Leu Leu Ala His Gly Asn 20 25 30 cct aac ctg gag ctt tta gcc gta acc acc gtc gcc ggc aac caa act 375 Pro Asn Leu Glu Leu Leu Ala Val Thr Thr Val Ala Gly Asn Gln Thr 35 40 45 ctg gaa aaa gtc acc acc aat gcg cgc gcg gta gca cgc gtt gcg ggt 423 Leu Glu Lys Val Thr Thr Asn Ala Arg Ala Val Ala Arg Val Ala Gly 50 55 60 atc acc gac att cct ttt gcc gct ggt gcc tcg cgt ccg ctg gtg ggc 471 Ile Thr Asp Ile Pro Phe Ala Ala Gly Ala Ser Arg Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 ccg caa ctt atc ccc gat gaa atc cac ggc gat tct ggc ctc gac ggc 519 Pro Gln Leu Ile Pro Asp Glu Ile His Gly Asp Ser Gly Leu Asp Gly 85 90 95 cca caa ctg cct gag cct agt gtc ccg cta gaa gaa atc cac gcg gtc 567 Pro Gln Leu Pro Glu Pro Ser Val Pro Leu Glu Glu Ile His Ala Val 100 105 110 aac ctc att gcc cag gtc atc tct gag aat gaa ccc ggt tcc gtg gtc 615 Asn Leu Ile Ala Gln Val Ile Ser Glu Asn Glu Pro Gly Ser Val Val 115 120 125 att att cct acc ggc tct ttg act aac atc gca ctt ttc gcg cgc atg 663 Ile Ile Pro Thr Gly Ser Leu Thr Asn Ile Ala Leu Phe Ala Arg Met 130 135 140 tac cca cag ctg gtt gag cgc gtt ggc gga atc act ttg atg ggc ggc 711 Tyr Pro Gln Leu Val Glu Arg Val Gly Gly Ile Thr Leu Met Gly Gly 145 150 155 160 ggg cac cac acc ggc aat atg act cct gct tct gag ttc aat atc ttg 759 Gly His His Thr Gly Asn Met Thr Pro Ala Ser Glu Phe Asn Ile Leu 165 170 175 gct gac cca gaa gcc gca gcg att gtc ttt gaa gaa tcc tgg cca gta 807 Ala Asp Pro Glu Ala Ala Ala Ile Val Phe Glu Glu Ser Trp Pro Val 180 185 190 acc atg gtc gga ctc gat gtc acc cac cag gta ctc gcg gta cct gag 855 Thr Met Val Gly Leu Asp Val Thr His Gln Val Leu Ala Val Pro Glu 195 200 205 cgc atg gaa cag ctc aag gcc att ggc acc gat gtt gcg caa ttt atc 903 Arg Met Glu Gln Leu Lys Ala Ile Gly Thr Asp Val Ala Gln Phe Ile 210 215 220 gca gag ctc gtg gaa ttc ttt ggt gct tcc tac atg aaa gag cgc aac 951 Ala Glu Leu Val Glu Phe Phe Gly Ala Ser Tyr Met Lys Glu Arg Asn 225 230 235 240 tac ccg ggc cca cct atg cac gat ccg ttg gct gtg gca gca gtt gcc 999 Tyr Pro Gly Pro Pro Met His Asp Pro Leu Ala Val Ala Ala Val Ala 245 250 255 gat cca tct atc ctg cga act gtt cac gcc ccg att tat gtg gaa act 1047 Asp Pro Ser Ile Leu Arg Thr Val His Ala Pro Ile Tyr Val Glu Thr 260 265 270 caa gga cag cac gcc cgc ggg caa acc atc gtc gat ttc cgc cgc act 1095 Gln Gly Gln His Ala Arg Gly Gln Thr Ile Val Asp Phe Arg Arg Thr 275 280 285 tgg tct aat aat gac ccg agc gga cta ggg gtt acc gac gat ccc gat 1143 Trp Ser Asn Asn Asp Pro Ser Gly Leu Gly Val Thr Asp Asp Pro Asp 290 295 300 ttc gag gcc ccg aat acc gcc gta gcc gtg gac gta gat gcc gag aaa 1191 Phe Glu Ala Pro Asn Thr Ala Val Ala Val Asp Val Asp Ala Glu Lys 305 310 315 320 ttc tgg gat ctg ctg gtc gat gcc cta act cgc att ggc aac acc aac 1239 Phe Trp Asp Leu Leu Val Asp Ala Leu Thr Arg Ile Gly Asn Thr Asn 325 330 335 ttt taagactt agcgctttag ccgatccagg agaacccaat gtcttccact 1290 Phe cccaaccgcc aagcatcagc tggtgttatc gacccggttg atacccgcaa ggtggcctgc 1350 ccctgctgat ggccgtgctg ctggcagccg ccgtagcttt ccagctcaac gcctctatgc 1410 tctcaccagt gctgaccacc atggcgcacg agctgggcac cgacgaagcc gcggtggggc 1470 tcacccagac cgccttcttt actggtggtg cgatgtgcgg gctattctta ccgcgtcttt 1530 ccgatatcgt cggccgccgc aagatc 1556 <210> 2 <211> 337 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <400> 2 Met Asn Ala Asp Ser Thr Ser Pro Ala Gln Lys Ile Ile Leu Asp Cys 1 5 10 15 Asp Pro Gly His Asp Asp Ala Ile Ala Met Leu Leu Ala His Gly Asn 20 25 30 Pro Asn Leu Glu Leu Leu Ala Val Thr Thr Val Ala Gly Asn Gln Thr 35 40 45 Leu Glu Lys Val Thr Thr Asn Ala Arg Ala Val Ala Arg Val Ala Gly 50 55 60 Ile Thr Asp Ile Pro Phe Ala Ala Gly Ala Ser Arg Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 Pro Gln Leu Ile Pro Asp Glu Ile His Gly Asp Ser Gly Leu Asp Gly 85 90 95 Pro Gln Leu Pro Glu Pro Ser Val Pro Leu Glu Glu Ile His Ala Val 100 105 110 Asn Leu Ile Ala Gln Val Ile Ser Glu Asn Glu Pro Gly Ser Val Val 115 120 125 Ile Ile Pro Thr Gly Ser Leu Thr Asn Ile Ala Leu Phe Ala Arg Met 130 135 140 Tyr Pro Gln Leu Val Glu Arg Val Gly Gly Ile Thr Leu Met Gly Gly 145 150 155 160 Gly His His Thr Gly Asn Met Thr Pro Ala Ser Glu Phe Asn Ile Leu 165 170 175 Ala Asp Pro Glu Ala Ala Ala Ile Val Phe Glu Glu Ser Trp Pro Val 180 185 190 Thr Met Val Gly Leu Asp Val Thr His Gln Val Leu Ala Val Pro Glu 195 200 205 Arg Met Glu Gln Leu Lys Ala Ile Gly Thr Asp Val Ala Gln Phe Ile 210 215 220 Ala Glu Leu Val Glu Phe Phe Gly Ala Ser Tyr Met Lys Glu Arg Asn 225 230 235 240 Tyr Pro Gly Pro Pro Met His Asp Pro Leu Ala Val Ala Ala Val Ala 245 250 255 Asp Pro Ser Ile Leu Arg Thr Val His Ala Pro Ile Tyr Val Glu Thr 260 265 270 Gln Gly Gln His Ala Arg Gly Gln Thr Ile Val Asp Phe Arg Arg Thr 275 280 285 Trp Ser Asn Asn Asp Pro Ser Gly Leu Gly Val Thr Asp Asp Pro Asp 290 295 300 Phe Glu Ala Pro Asn Thr Ala Val Ala Val Asp Val Asp Ala Glu Lys 305 310 315 320 Phe Trp Asp Leu Leu Val Asp Ala Leu Thr Arg Ile Gly Asn Thr Asn 325 330 335 Phe <210> 3 <211> 1011 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <220> <221> gene <222> (1)..(1011) <400> 3 atgaacgcag attccacctc accggcacag aaaatcatcc tcgattgcga cccgggccat 60 gacgatgcca ttgccatgct cctggcacat ggcaatccta acctggagct tttagccgta 120 accaccgtcg ccggcaacca aactctggaa aaagtcacca ccaatgcgcg cgcggtagca 180 cgcgttgcgg gtatcaccga cattcctttt gccgctggtg cctcgcgtcc gctggtgggc 240 ccgcaactta tccccgatga aatccacggc gattctggcc tcgacggccc acaactgcct 300 gagcctagtg tcccgctaga agaaatccac gcggtcaacc tcattgccca ggtcatctct 360 gagaatgaac ccggttccgt ggtcattatt cctaccggct ctttgactaa catcgcactt 420 ttcgcgcgca tgtacccaca gctggttgag cgcgttggcg gaatcacttt gatgggcggc 480 gggcaccaca ccggcaatat gactcctgct tctgagttca atatcttggc tgacccagaa 540 gccgcagcga ttgtctttga agaatcctgg ccagtaacca tggtcggact cgatgtcacc 600 caccaggtac tcgcggtacc tgagcgcatg gaacagctca aggccattgg caccgatgtt 660 gcgcaattta tcgcagagct cgtggaattc tttggtgctt cctacatgaa agagcgcaac 720 tacccgggcc cacctatgca cgatccgttg gctgtggcag cagttgccga tccatctatc 780 ctgcgaactg ttcacgcccc gatttatgtg gaaactcaag gacagcacgc ccgcgggcaa 840 accatcgtcg atttccgccg cacttggtct aataatgacc cgagcggact aggggttacc 900 gacgatcccg atttcgaggc cccgaatacc gccgtagccg tggacgtaga tgccgagaaa 960 ttctgggatc tgctggtcga tgccctaact cgcattggca acaccaactt t 1011 <110> CJ <120> Novel nucleoside hydrolase I <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1556 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <220> <221> CDS (222) (232) .. (1242) <400> 1 aagtaatcag cgcctttgga ttcttgatgt aatccggcaa gctcagcgct acgcctgcaa 60 aacctgcctg gaccacgcgt ccagccaggg tgtcatcgag ggcataattg tcttcctttt 120 tgtctgcact gttgaaagat tcattcgtca tagcgcccca gaatacctgc gtttagtcaa 180 ttgccgggga gttgtgaata tatagaaaag tagcgagtag actttgcgag a 231 atg aac gca gat tcc acc tca ccg gca cag aaa atc atc ctc gat tgc 279 Met Asn Ala Asp Ser Thr Ser Pro Ala Gln Lys Ile Ile Leu Asp Cys 1 5 10 15 gac ccg ggc cat gac gat gcc att gcc atg ctc ctg gca cat ggc aat 327 Asp Pro Gly His Asp Asp Ala Ile Ala Met Leu Leu Ala His Gly Asn 20 25 30 cct aac ctg gag ctt tta gcc gta acc acc gtc gcc ggc aac caa act 375 Pro Asn Leu Glu Leu Leu Ala Val Thr Thr Val Ala Gly Asn Gln Thr 35 40 45 ctg gaa aaa gtc acc acc aat gcg cgc gcg gta gca cgc gtt gcg ggt 423 Leu Glu Lys Val Thr Thr Asn Ala Arg Ala Val Ala Arg Val Ala Gly 50 55 60 atc acc gac att cct ttt gcc gct ggt gcc tcg cgt ccg ctg gtg ggc 471 Ile Thr Asp Ile Pro Phe Ala Ala Gly Ala Ser Arg Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 ccg caa ctt atc ccc gat gaa atc cac ggc gat tct ggc ctc gac ggc 519 Pro Gln Leu Ile Pro Asp Glu Ile His Gly Asp Ser Gly Leu Asp Gly 85 90 95 cca caa ctg cct gag cct agt gtc ccg cta gaa gaa atc cac gcg gtc 567 Pro Gln Leu Pro Glu Pro Ser Val Pro Leu Glu Glu Ile His Ala Val 100 105 110 aac ctc att gcc cag gtc atc tct gag aat gaa ccc ggt tcc gtg gtc 615 Asn Leu Ile Ala Gln Val Ile Ser Glu Asn Glu Pro Gly Ser Val Val 115 120 125 att att cct acc ggc tct ttg act aac atc gca ctt ttc gcg cgc atg 663 Ile Ile Pro Thr Gly Ser Leu Thr Asn Ile Ala Leu Phe Ala Arg Met 130 135 140 tac cca cag ctg gtt gag cgc gtt ggc gga atc act ttg atg ggc ggc 711 Tyr Pro Gln Leu Val Glu Arg Val Gly Gly Ile Thr Leu Met Gly Gly 145 150 155 160 ggg cac cac acc ggc aat atg act cct gct tct gag ttc aat atc ttg 759 Gly His His Thr Gly Asn Met Thr Pro Ala Ser Glu Phe Asn Ile Leu 165 170 175 gct gac cca gaa gcc gca gcg att gtc ttt gaa gaa tcc tgg cca gta 807 Ala Asp Pro Glu Ala Ala Ala Ile Val Phe Glu Glu Ser Trp Pro Val 180 185 190 acc atg gtc gga ctc gat gtc acc cac cag gta ctc gcg gta cct gag 855 Thr Met Val Gly Leu Asp Val Thr His Gln Val Leu Ala Val Pro Glu 195 200 205 cgc atg gaa cag ctc aag gcc att ggc acc gat gtt gcg caa ttt atc 903 Arg Met Glu Gln Leu Lys Ala Ile Gly Thr Asp Val Ala Gln Phe Ile 210 215 220 gca gag ctc gtg gaa ttc ttt ggt gct tcc tac atg aaa gag cgc aac 951 Ala Glu Leu Val Glu Phe Phe Gly Ala Ser Tyr Met Lys Glu Arg Asn 225 230 235 240 tac ccg ggc cca cct atg cac gat ccg ttg gct gtg gca gca gtt gcc 999 Tyr Pro Gly Pro Pro Met His Asp Pro Leu Ala Val Ala Ala Val Ala 245 250 255 gat cca tct atc ctg cga act gtt cac gcc ccg att tat gtg gaa act 1047 Asp Pro Ser Ile Leu Arg Thr Val His Ala Pro Ile Tyr Val Glu Thr 260 265 270 caa gga cag cac gcc cgc ggg caa acc atc gtc gat ttc cgc cgc act 1095 Gln Gly Gln His Ala Arg Gly Gln Thr Ile Val Asp Phe Arg Arg Thr 275 280 285 tgg tct aat aat gac ccg agc gga cta ggg gtt acc gac gat ccc gat 1143 Trp Ser Asn Asn Asp Pro Ser Gly Leu Gly Val Thr Asp Asp Pro Asp 290 295 300 ttc gag gcc ccg aat acc gcc gta gcc gtg gac gta gat gcc gag aaa 1191 Phe Glu Ala Pro Asn Thr Ala Val Ala Val Asp Val Asp Ala Glu Lys 305 310 315 320 ttc tgg gat ctg ctg gtc gat gcc cta act cgc att ggc aac acc aac 1239 Phe Trp Asp Leu Leu Val Asp Ala Leu Thr Arg Ile Gly Asn Thr Asn 325 330 335 ttt taagactt agcgctttag ccgatccagg agaacccaat gtcttccact 1290 Phe cccaaccgcc aagcatcagc tggtgttatc gacccggttg atacccgcaa ggtggcctgc 1350 ccctgctgat ggccgtgctg ctggcagccg ccgtagcttt ccagctcaac gcctctatgc 1410 tctcaccagt gctgaccacc atggcgcacg agctgggcac cgacgaagcc gcggtggggc 1470 tcacccagac cgccttcttt actggtggtg cgatgtgcgg gctattctta ccgcgtcttt 1530 ccgatatcgt cggccgccgc aagatc 1556 <210> 2 <211> 337 <212> PRT <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <400> 2 Met Asn Ala Asp Ser Thr Ser Pro Ala Gln Lys Ile Ile Leu Asp Cys 1 5 10 15 Asp Pro Gly His Asp Asp Ala Ile Ala Met Leu Leu Ala His Gly Asn 20 25 30 Pro Asn Leu Glu Leu Leu Ala Val Thr Thr Val Ala Gly Asn Gln Thr 35 40 45 Leu Glu Lys Val Thr Thr Asn Ala Arg Ala Val Ala Arg Val Ala Gly 50 55 60 Ile Thr Asp Ile Pro Phe Ala Ala Gly Ala Ser Arg Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 Pro Gln Leu Ile Pro Asp Glu Ile His Gly Asp Ser Gly Leu Asp Gly 85 90 95 Pro Gln Leu Pro Glu Pro Ser Val Pro Leu Glu Glu Ile His Ala Val 100 105 110 Asn Leu Ile Ala Gln Val Ile Ser Glu Asn Glu Pro Gly Ser Val Val 115 120 125 Ile Ile Pro Thr Gly Ser Leu Thr Asn Ile Ala Leu Phe Ala Arg Met 130 135 140 Tyr Pro Gln Leu Val Glu Arg Val Gly Gly Ile Thr Leu Met Gly Gly 145 150 155 160 Gly His His Thr Gly Asn Met Thr Pro Ala Ser Glu Phe Asn Ile Leu 165 170 175 Ala Asp Pro Glu Ala Ala Ala Ile Val Phe Glu Glu Ser Trp Pro Val 180 185 190 Thr Met Val Gly Leu Asp Val Thr His Gln Val Leu Ala Val Pro Glu 195 200 205 Arg Met Glu Gln Leu Lys Ala Ile Gly Thr Asp Val Ala Gln Phe Ile 210 215 220 Ala Glu Leu Val Glu Phe Phe Gly Ala Ser Tyr Met Lys Glu Arg Asn 225 230 235 240 Tyr Pro Gly Pro Pro Met His Asp Pro Leu Ala Val Ala Ala Val Ala 245 250 255 Asp Pro Ser Ile Leu Arg Thr Val His Ala Pro Ile Tyr Val Glu Thr 260 265 270 Gln Gly Gln His Ala Arg Gly Gln Thr Ile Val Asp Phe Arg Arg Thr 275 280 285 Trp Ser Asn Asn Asp Pro Ser Gly Leu Gly Val Thr Asp Asp Pro Asp 290 295 300 Phe Glu Ala Pro Asn Thr Ala Val Ala Val Asp Val Asp Ala Glu Lys 305 310 315 320 Phe Trp Asp Leu Leu Val Asp Ala Leu Thr Arg Ile Gly Asn Thr Asn 325 330 335 Phe <210> 3 <211> 1011 <212> DNA <213> Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 <220> <221> gene (222) (1) .. (1011) <400> 3 atgaacgcag attccacctc accggcacag aaaatcatcc tcgattgcga cccgggccat 60 gacgatgcca ttgccatgct cctggcacat ggcaatccta acctggagct tttagccgta 120 accaccgtcg ccggcaacca aactctggaa aaagtcacca ccaatgcgcg cgcggtagca 180 cgcgttgcgg gtatcaccga cattcctttt gccgctggtg cctcgcgtcc gctggtgggc 240 ccgcaactta tccccgatga aatccacggc gattctggcc tcgacggccc acaactgcct 300 gagcctagtg tcccgctaga agaaatccac gcggtcaacc tcattgccca ggtcatctct 360 gagaatgaac ccggttccgt ggtcattatt cctaccggct ctttgactaa catcgcactt 420 ttcgcgcgca tgtacccaca gctggttgag cgcgttggcg gaatcacttt gatgggcggc 480 gggcaccaca ccggcaatat gactcctgct tctgagttca atatcttggc tgacccagaa 540 gccgcagcga ttgtctttga agaatcctgg ccagtaacca tggtcggact cgatgtcacc 600 caccaggtac tcgcggtacc tgagcgcatg gaacagctca aggccattgg caccgatgtt 660 gcgcaattta tcgcagagct cgtggaattc tttggtgctt cctacatgaa agagcgcaac 720 tacccgggcc cacctatgca cgatccgttg gctgtggcag cagttgccga tccatctatc 780 ctgcgaactg ttcacgcccc gatttatgtg gaaactcaag gacagcacgc ccgcgggcaa 840 accatcgtcg atttccgccg cacttggtct aataatgacc cgagcggact aggggttacc 900 gacgatcccg atttcgaggc cccgaatacc gccgtagccg tggacgtaga tgccgagaaa 960 ttctgggatc tgctggtcga tgccctaact cgcattggca acaccaactt t 1011
Claims (3)
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020040087604A KR100941304B1 (en) | 2004-10-30 | 2004-10-30 | Novel nucleoside hydrolase ? |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020040087604A KR100941304B1 (en) | 2004-10-30 | 2004-10-30 | Novel nucleoside hydrolase ? |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20060038524A KR20060038524A (en) | 2006-05-04 |
KR100941304B1 true KR100941304B1 (en) | 2010-02-11 |
Family
ID=37146023
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020040087604A KR100941304B1 (en) | 2004-10-30 | 2004-10-30 | Novel nucleoside hydrolase ? |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR100941304B1 (en) |
-
2004
- 2004-10-30 KR KR1020040087604A patent/KR100941304B1/en active IP Right Grant
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
논문 1: J. Biol. Chem. |
논문 2: Appl. Environ. Microbiol. |
논문 3: Biochemistry |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20060038524A (en) | 2006-05-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2770464C1 (en) | New adenyl-succinate synthetase and method for producing purine nucleotides using it | |
US7645605B2 (en) | Heat-resistant nitrile hydratase | |
KR101956510B1 (en) | Novel inosine-5'-monophosphate dehydrogenase and method for producing 5'-inosine monophosphate using the same | |
CN113832125B (en) | Nicotinamide ribokinase mutant and encoding gene and application thereof | |
RU2736372C1 (en) | Variant of phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase and method of producing purine nucleotide using it | |
WO1996037603A1 (en) | Process for producing nucleoside-5'-phosphate | |
KR102069301B1 (en) | Allose producing-strain using the fructose and method for producing allose using the same | |
RU2671087C2 (en) | Variants of l-arabinose isomerase with improved conversion activity and a method for producing d-tagatose with their application | |
KR20000076602A (en) | Process for producing purine nucleotides | |
JP5209639B2 (en) | Method for producing novel N-acetylglucosamine-2-epimerase and CMP-N-acetylneuraminic acid | |
KR102434925B1 (en) | Microorganism having inhanced activity of 3-methyl-2-oxobutanoate hydroxymethyltransferase and uses thereof | |
KR100941304B1 (en) | Novel nucleoside hydrolase ? | |
KR100942133B1 (en) | Novel nucleoside hydrolase | |
KR101005707B1 (en) | Ammonia-specific 5'-xmp aminase mutant | |
JPH08263A (en) | Recombination enzyme for converting maltose into trehalose | |
KR20170116979A (en) | Fructose 1,6-bisphosphate aldolase from Lactobacillus plantarum with conversion activity from fructose 6-phosphate to tagatose 6-phosphate and method for producing tagatose using the same | |
CA2392463C (en) | Novel use of uridine diphosphate glucose 4-epimerase | |
JP2003093091A5 (en) | ||
RU2804010C1 (en) | New variant of glutamine hydrolyzing gmp synthase and a method of producing purine nucleotide using it | |
US20040170979A1 (en) | Dna encoding l-ribose isomerase and uses thereof | |
KR100237091B1 (en) | Process for producing flavine nucleotides | |
KR100541044B1 (en) | Novel Polypeptides with Chitosanase Activity Derived from Bacillus thuringiensis | |
JP3357405B2 (en) | Method for producing flavin nucleotides | |
US20030143677A1 (en) | Activated rec-D-hydantoinases | |
KR20220147981A (en) | Modified SpoT protein and method for producing L-amino acid using the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
N231 | Notification of change of applicant | ||
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant | ||
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121218 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131128 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141226 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151228 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171129 Year of fee payment: 9 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181126 Year of fee payment: 10 |
|
FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191125 Year of fee payment: 11 |