KR100927251B1

KR100927251B1 - 방선균 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물의 제조방법 및 이에 따른 항암제 조성물

Info

Publication number: KR100927251B1
Application number: KR1020090003029A
Authority: KR
Inventors: 신희재; 이희승; 정성윤
Original assignee: 한국해양연구원
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2009-01-14
Publication date: 2009-11-16
Also published as: KR20090011048A; KR20090011047A; KR20070055322A; KR100904982B1

Abstract

본 발명은 항암물질과 이것의 추출방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물에 관한 것으로, 특히 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양물로부터 분리되어, 인체의 백혈병 등과 같은 암세포에 대하여 강한 독성을 나타내는 항앙물질에 대한 것이다.

항암물질, 스트렙토마이세스, 메틸피리딘

Description

방선균 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물의 제조방법 및 이에 따른 항암제 조성물{Preparing Method of Pharmaceutical Compositions for Anticancer Property Comprising Actinomyces Fraction as Active Ingredients and Anti-cancer Agent Composition Using The Same}

본 발명은 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주에 관한 것으로, 특히 상기 방선균 스트렙토마이세스 속 균주의 배양물로부터 추출된 항암물질에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 상기 균주를 배양시킨 배양물로부터 추출된 메틸피리딘 유도체 계통의 항암물질과 이것의 추출방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물이다.

현대 의학의 대표적 암 치료법에는 외과적 수술요법, 생물요법, 방사선요법, 항암물질 투여에 의한 화학요법 등이 있다. 화학요법은 항암제를 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식을 억제하는 방법으로서, 화학요법이 가지는 장점은 몸의 어떤 부위에 생긴 암이라도 약물이 도달할 수 있고, 전이된 암을 치료할 수 있다는 것으로, 현재 화학요법은 전이성 암 치료에 표준요법으로 사용되고 있다. 물 론 화학요법으로 전이된 암을 완치시킬 수 있는 것은 아니지만 증상을 완화시켜 수명을 연장시켜주는 중요한 역할을 한다.

현재까지 천연물 유래의 항암제 중 가장 널리 사용되고 있는 항암제는 택솔(taxol)로서 유방암, 난소암의 치료에 사용되고 있다. 그러나 이러한 화학요법제는 부작용, 항암제 내성 등의 문제점을 가지고 있으며, 지금까지 암에 대한 많은 연구가 계속되고 있음에도 불구하고 암 자체의 다양성 및 발병기전의 다양화로 인해 부작용이 적고 내성을 극복할 수 있는 항암제는 개발되지 않았다.

종래의 육상 생물로는 신의약 소재 개발의 한계가 있어 새로운 소재 개발을 위해서는 새로운 미생물 다양성의 확보가 반드시 선결되어야 한다. 세계 해양 바이오 시장 규모는 2000년에 33억 달러로 2010년에는 163억 달러로 예상되어지며, 특히 의약용 해양 신물질 시장은 연간 18%의 성장률을 보일 것으로 예상되어 2010년에는 56만 달러로 전망된다. 해양은 지구상의 생물종의 80%가 생식하고 있는 생물 다양성의 보고이며, 특히 미이용 미생물 자원은 첨단 해양 바이오 기술 접목시 그 개발 가능성은 무한하다. 더욱이 해양 미생물의 1% 만이 실험실적으로 배양이 가능하며, 99% 이상은 난배양성으로 남아 있는 실정이다. 이와 같이 해양에는 미지의 다양하고 풍부한 생물자원이 존재하고 있으며, 해양 생물은 육상 생물과는 다른 환경에 생식하고 있기 때문에 생산되는 물질에도 신규성이 높은 화학구조를 가진 화합물이 많이 발견되었다.

그 중에서도 스트렙토마이세스 속 균주는 다양한 2차 대사산물을 생산하며 그 생리활성도 매우 다양하다. 특히 지금까지 미생물로부터 탐색된 100,000여종의 생리 활성 물질 가운데 약 2/3에 해당되는 64% 정도가 스트렙토마이세스 속 균주로부터 발견되었으며, 세균으로부터는 약 13%, 곰팡이로부터는 약 23%가 발견되었다. 이에 스트렙토마이세스 속을 포함하는 방선균 (actinomycetes)은 각종 생리 활성 물질의 생산균으로서 산업적 또는 의학적인 측면에서 매우 중요한 미생물로서 자리 잡게 되었다. 본 발명 역시 이러한 연구의 일환으로 항암활성을 나타내는 해양 방선균을 분리하여, 이를 백혈병 등의 치료에 이용하고자 하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 항암활성을 가지는 새로운 항암물질을 제공하기 위한 것이다. 특히, 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양물로부터 분리된 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물의 제조방법 및 이에 따른 항암 조성물을 제공하는 것이 본 발명이 목적이다.

또한, 상기 방선균 스트렙토마이세스 속 균주와 이것의 배양물 및 배양여과액으로부터 얻어지는 항암물질을 이용하여 인체의 백혈병과 같은 암세포에 대한 항암활성을 가지는 항암제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 상기 방선균 스트렙토마이세스 속 균주에서 분리된 항암물질뿐만 아니라, 이것의 추출방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물을 제공하여, 향후 항암제 용도로 다양하게 사용하기 위한 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양물로부터 분리된 분획물을 유효성분으로 함유하며, 아래의 성질을 보유하는 것을 특징으로 하는 방선균 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물이다.

-분자식 : C₈H₉NO₂

-분자량 : 151

-성상 : 무색의 무정형 물질로 실온에서 안정

-용해도 : 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 프로판올, 아세톤, 다이클로로메탄, 클로로포름 및 에틸아세테이트에 용해되고, 헥산 및 에틸에테르에 불용

-박막 크로마토그래피(TLC) : 전개용매를 메탄올:H₂O=8:2로 하여 ODS (Octadesylsilane) TLC상에서 R_f=0.41

-적외선 흡수대 (KBr) : 1710, 1643, 1550 cm^-1

-자외선 흡수대 (MeOH) : 217, 280 nm에서 최대흡광치

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 바람직한 실시형태는 이러한 방선균 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 즉, 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양액을 얻는 단계; 상기 균주의 배양액으로부터 균사체를 제거하여 배양여과액을 얻는 단계; 상기 배양여과액을 유기용매로 추출한 후 용매를 증발시켜서 조추출물을 얻는 단계; 및, 상기 조추출물을 헥산에 녹이고, 진공 실리카 플래쉬 크로마토그래피(vacuum silica flash chromatography)로 분획하여 분획물을 얻는 단계;를 포함하는 방선균 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물의 제조방법이다.

이에 따라, 상기한 제조방법에 의해 제조된 항암용 약학 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물 또한 본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 속하는 것은 명백하다.

이하, 본 발명에 따라 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양물로부터 분리된 신규한 항암물질과 이것의 추출방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물을 상세히 설명한다.

먼저, 본 발명은 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양물로부터 분리되어 상기한 성질을 보유하는 항암물질 또는 상기 균주를 이용한 미생물 제재에 관한 것이다. 이러한 본 발명은 항암활성 물질을 생산하는 해양 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) 균주를 새롭게 발견함으로서, 이것의 배양물 또는 배양여과액으로부터 신규한 생리 활성 물질 을 추출한 것이며, 이에 대해 항암활성 측정을 한 결과 상기 물질이 항암물질임을 확인한 것이다.

여기서, 상기 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 본 발명자에 의해 새롭게 제조된 것으로, 인체의 백혈병 세포에 대한 항암물질을 생산하는 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCCM-10664P 균주가 바람직하다. 본 발명자들은 상기 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 균주를 스트렙토마이세스 sp. KORDI-3238로 명명하였고, 이를 한국미생물보존센터(KCCM)에 2005년 7월 7 일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM-10664P를 부여받은 사실이 있다.

본 발명에 따른 상기 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P 균주는 심해저 퇴적토로부터 분리된 균주이고, 더욱 상세하게는 심해로부터 퇴적토 시료를 채취하는 단계; 상기 시료를 열처리하는 단계; 상기 열처리된 시료를 변형된 벤넷(modified Bennett's) 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배양된 시료를 도말하여 균주를 분리하는 단계;를 포함하여 심해의 퇴적토로부터 분리된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명자들은 이러한 항암활성 물질을 생산하는 해양 방선균 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P 균주를 동정하기 위하여, 형태학적, 배양학적, 생화학적 특성을 종합적으로 검토하였고, 16S rDNA 염기서열을 분석하여 계통분류학적 방법으로 이를 확 인하였으며, 그 결과 본 발명에 따른 상기 방성균 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P 균주는 인체의 백혈병 세포 등과 같은 암세포에 항암활성을 가지고 있는 새로운 균주로 확인되었다.

이에 따라, 본 발명자들은 상기한 방성균 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P 균주 속에 상기한 성질을 보유하는 항암물질이 존재함을 확인하였고, 이와 같은 방선균 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주의 배양물로부터 항암활성을 가지는 물질을 추출해 낼 수 있었다.

실험결과, 본 발명에 따라 방선균 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주의 배양물로부터 분리되어 상기한 성질을 보유하는 항암물질은 특히 인체 백혈병 세포에 대하여 항암활성을 가지며, 바람직하기로는 인간 백혈병 세포주(human leukemia cell-line) K-562, leukemia cell-line HL-60 세포, MDA-MB-231(유방암) 세포, HCT 15(결장암) 세포, PC-3(전립선암) 세포, NCI-H23(폐암) 세포, ACHN(안암) 세포 또는 LOX-IMVI(피부암) 세포에 대한 항암활성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.

그러므로, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명은 상기한 성질을 보유하는 항암물질을 포함하는 항암제 조성물도 가능하다. 이러한 항암제 조성물은 백혈병 암세포 이외에, 비세포성 폐암, 자궁암, 흑색동, 대장암, 중추신경계암 등의 암세포에 다양하게 적용될 수 있는 것이다.

그리고, 본 발명에 따른 항암물질에 있어서, 상기한 방선균 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주로부터 상기한 성질을 보유하는 항암물질을 분리하는 방법은 상기 방선균 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주의 배양물로부터 반고형 조추출물을 얻고, 상기 반고형 추출물로부터 항암물질을 분리하는 것이다. 즉, 상기 스트렙토마이세스 속 균주를 액체 배지에서 배양하고, 배양물로부터 균사체(mycelium)를 분리하여 배양여과액을 얻고, 이것을 유기용매로 추출한 후 용매를 증발시켜서 조추출물을 얻으며, 상기 조추출물을 극성에 따라 분배하여 극성 유기 농축물을 얻고, 이 농축물을 크로마토그래피로 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위한 다른 바람직한 실시형태는 이와 같이, 상기한 방선균 스트렙토마이세스 속에 속하는 균주로부터 상기한 성질을 보유하는 항암물질을 분리하여 추출하는 방법이다. 구체적으로는 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양액을 얻는 단계; 상기 균주의 배양액으로부터 균사체를 제거하여 배양여과액을 얻는 단계; 상기 배양여과액을 유기용매로 추출한 후 용매를 증발시켜서 조추출물을 얻는 단계; 상기 조추출물을 헥산에 녹이고, 진공 실리카 플래쉬 크로마토그래피(vacuum silica flash chromatography)로 분획하여 분획물을 얻는 단계; 상기 분획물을 감압하에서 증발 건조시켜 극성 유기 농축물을 얻는 단계; 및 상기 극성 유기 농축물을 크로마토그래피로 분리하는 단계;를 포함하는 항암활성을 가지는 메틸피리딘계 화합물의 추출방법이다.

상술한 바와 같이, 상기 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 본 발명자에 의해 새롭게 제조된 것으로, 인체의 백혈병 세포에 대한 항암물질을 생산하는 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCCM-10664P 균주가 바람직하다. 또한, 상기 항암제 조성물은 상기한 성질을 보유하는 것을 특징으로 하는 항암물질 추출방법이 바람직하다.

이러한 항암물질 추출방법을 더욱 구체적으로 살펴보면 다음과 같다. 즉, 본 발명의 다른 실시형태로서, 상기 조출물을 얻는 단계에서 사용된 유기용매는 에틸아세테이트(ethyl acetoacetate), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 아세토나이트릴(acetonitrile), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone) 및 다이클로로메탄(dichloromethane)으로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상이 선택된 것을 특징으로 하는 항암물질 추출방법이 가능하다.

그리고, 상기 분획물을 얻는 단계는 상기 조추출물을 헥산(hexane)에 녹인 후 용리액으로 에틸아세테이트를 사용하여 진공 실리카 플래쉬 크로마토그래피로 극성에 따라 분획하는 것이 바람직하며, 여기서 상기 헥산은 60중량% 내지 40중량% 범위 내로 사용되고, 상기 에틸아세테이트는 60중량% 내지 40중량% 범위 내로 사용되는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 상기 극성 유기 농축물을 얻는 단계는 상기 분획물을 갑압하에서 증발 건조시켜서 잔류물을 얻고, 상기 잔류물을 물과 메탄올의 혼합물에 녹인 후 여과하여 불용성 물질을 제거하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이러한 본 발명은 상기한 추출방법에 따라 최종적으로 상기 극성 유기 농축물을 크로마토그래피로 분리하여 본 발명에 따른 항암물질을 추출하는 것이다. 나아가, 상기 크로마토그래피로 분리하는 단계 이후에, 상기 분리된 분리물을 자외선 분광기, TLC, 질량분석기, 적외선 분광기, 자외선 분광기 또는 핵자기 공명 분광기로 분석하여 상기 분리물의 구조를 확인하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이와 같이 분리된 물질의 분자 구조는 핵자기공명(NMR) 스펙트럼, 적외선(IR), 자외선(UV) 분광자료, 고해상도 질량(High-resolution mass)분석 데이터 등에 의하여 결정되었다. 핵자기공명 스펙트럼에서 수소핵자기공명(¹H-NMR) 시그널과 탄소핵자기공명(¹³C-NMR) 시그널에 대한 위치 지정(assignment)은 COSY(correlation spectroscopy), 구배 HSQC(gradient heteronuclear single quantum coherence), 구배 HMBC(gradient heteronuclear multiple bond coherence) 등의 다차원 핵자기공명 실험을 통하여 이루어졌다.

더불어, 상기 크로마토그래피로 분리하는 단계 이후에는, 상기 분리된 분리물의 항암활성을 MTT방법으로 확인하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항암물질 추출방법도 가능하다.

물론, 이러한 추출방법에 의해 추출되는 항암물질과 이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물 또한 본 발명의 또 다른 바람직한 실시형태에 속하는 것은 명백하다. 나아가, 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 속 균주로부터 생산되는 항암물질은 세포외로 분비될 수 있다. 이에 본 발명에서는 스트렙토마이세스 속 균주, 이의 배양물 및 배양여과액으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것을 유효성분으로 포함하는 항암용 약학 조성물, 이것의 제조방법, 및 이를 포함하는 항암제 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명자들은 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양물로부터 분리된 분획물에서 얻은 항암물질이 항암활성을 가진다는 것을 확인하였고(실시예 4 참조), 또한 상기 균주의 배양물로부터 분리된 분획물에 유의적인 대사물질들이 함유되어 있다는 것을 확인하였는바(실시예 3 참조), 상기 분획물을 유효성분으로 함유하는 약학 조성물이 항암활성을 가진다는 것은 이 기술분야에서 보통의 지식을 가진자에게 명백하다.

상기 배양물은 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P을 고체 한천배지 또는 액체 배양 배지에서 15 내지 40℃에서 3일 내지 14일 배양하여 수득할 수 있으며, 이를 액상 또는 감압하에서 증발 건조시킨 고체상의 조추출물로 항암제 조성물에 포함될 수 있다. 상기 배양여과액은 상기 배양물에서 균사체 (mycelium)를 제거한 상청액으로, 원심분리 또는 여과를 통하여 수득할 수 있으며, 이를 액상 또는 감압하에서 증발 건조시킨 고체상의 조추출물로 항암제 조성물에 포함될 수 있다.

상기 항암제 조성물 중 유효성분의 함량은 사용 목적 및 사용 방법 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 0.01 중량% 이상일 수 있다. 또한 상기 항암 제 조성물은 통상적으로 사용되는 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 항암제 조성물은 상기한 유효성분 이외에 사용용도, 목적 및 방법에 따라 담체를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 항암제 조성물은 식품 첨가제 및 약제로 사용할 수도 있다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 하나의 실시형태를 첨부된 도면을 참고로 하여 구체적으로 설명한다. 본 발명은 하기의 실시예에 의하여 보다 더 잘 이해 될 수 있으며, 하기의 실시예는 본 발명의 예시 목적을 위한 것이고, 첨부된 특허청구범위에 의하여 한정되는 보호범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 방선균 스트렙토마이세스 속 KCCM -10664P의 분리

먼저, 본 발명에 따른 방선균 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P를 분리하고자 하였다. 서태평양의 Ayu Trough 해역(01° 38´ 355N, 132° 43´ 591E)의 심해 퇴적토에서 채취한 시료 약 1g을 멸균된 해수 20 ㎖가 채워진 유리병(vial)에 넣고 5분 동안 sonification하였다. 그리고, 일반 세균(박테리아)을 사멸시키기 위하여 60℃ dry oven에서 50분간 열처리하고, 열처리를 마친 시료를 10^-1, 10^-2, 10^-3으로 순차적으로 희석하였다. 이어서, 상기 희석된 시료를 방선균 분리용 배지인 변형된 벤넷 배지에 0.1 ㎖을 접종하여 순차적으로 도말하였다. 계속해서, 이를 30℃ 배양기에서 14일 동안 배양한 후, 방선균 집락이 관찰되면 2차 분리용 변 형된 벤넷(modified Bennett's) 배지에 3차 도말(streaking)하여 분리한 균주를 집락형태 및 광학 현미경상에서 관찰하여 전형적인 방선균 형태의 300여 균주를 1차로 순수 분리, 선별하였다.

실시예 2: 스트렙토마이세스 속 KCCM -10664P 균주의 배양

상술한 실시예에서 선별된 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P 균주 중에서 포자가 완전히 형성된 균주를 20% (w/v) glycerol을 넣어 -70℃에서 동결 보존하였다. 상기 동결 보존한 균주를 방선균 배양용 배지인 변형된 벤넷(modified Bennett's) 액체배지에 접종하여 27℃ 배양기에서 7일 동안 배양하여 활성화시킨 후, 동일 배지 100 ㎖이 들어있는 플라스크(×3)에서 27℃, 150 rpm으로 4일간 종배양 (seed culture)하였다. 종배양한 균주를 다시 동일한 배지 0.8 ℓ가 들어있는 3 ℓ Fernbach flask (×10)에 30 ㎖씩 접종하여 동일 조건하에서 7일간 진탕 배양하였다. 여기서, 변형된 벤넷 배지의 조성은 배지 1 ℓ당 0.1% 효모추출물(yeast extract), 0.1% 쇠고기 추출물(beef extract), 0.2% 트립톤(tryptone), 1% 포도당(glucose), 1.5% 한천(agar), pH 7.2, 숙성해수:증류수=7:3이었다.

실시예 3: 메틸피리딘 유도체 항암물질의 추출

상기한 실시예 2에서 얻은 스트렙토마이세스 속 균주의 배양액에 대하여 고속 원심분리기(ultracentrifuge, 9000 rpm, 15분)를 사용하여 균사체를 제거하였다. 이와 같이 분리된 배양여과액을 다시 0.2 ㎛ 멤브레인 필터(membrane filter) 로 여과하여 여분의 균사체를 완전히 제거하였다. 이와 같이 하여 얻은 배양여과액을 1ℓ 정도가 되도록 감압하에서 증발 농축한 후, 상기 배양여과액에 에틸아세테이트(1ℓ)를 첨가하여 혼합(3회 반복)한 후, 에틸아세테이트 층과 수층으로 분획하였다. 그 중에서 항암활성을 나타낸 에틸아세테이트 층을 감압 증류하여 반고형 조추출물 450 ㎎을 얻었다.

그리고, 상기한 조추출물을 소량의 헥산에 녹인 후 진공 실리카 플래쉬 크로마토그래피(vacuum silica flash chromatography)를 이용하여 여러 개의 분획(fraction)으로 나누었다. 이때 컬럼은 유리필터 컬럼 50×45 ㎜ (내경×길이), 고정상은 실리카겔 (Kieselgel 60, 230-400 메쉬, 머크)을 사용하고, 용리액은 100% 헥산에서 시작하여 에틸아세테이트를 20%씩 증가시켜 사용하였으며, 100% 에틸아세테이트 이후에는 메탄올로 잔류물질을 세척하였다. 이와 같이 하여 얻은 7개의 분획물(각 700 ㎖) 중에서 분획 3 (40% 에틸아세테이트/헥산으로 용리) 및 분획 4 (60% 에틸아세테이트/헥산으로 용리)에 유의적인 대사물질들이 함유되어 있다는 것이 수소 핵자기공명 분광스펙트럼과 백혈병 암세포에 대한 독성실험에 의하여 확인되었다.

이에 따라, 분획 3과 4의 분획물을 합하여 감압하에서 용매를 증발시켜 잔류물 100.8 ㎎을 얻고, 이것을 50% 물/50% 메탄올에 녹인 후 여과(spartan filter: Aldrich)하여 불용성 물질을 제거하였다. 용액을 50~80% 메탄올 용리 유체를 이용 하여 C¹⁸ 역상 반-분취 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼(C¹⁸ reversed-phase semi-preparative HPLC column) (YMC-ODS-A 컬럼, 입자 직경 5 ㎛, 10×250 ㎜ (내경×길이), 용리액: 50~80% 메탄올, 용출 속도: 1.5 ㎖/분, 자외선 검출기, 파장: 210 nm)상에서 크로마토그래피하여, 머무름 시간 19분에서 무색의 무정형 물질인 신규의 메틸피리딘 유도체를 11.5 mg 얻었다. 본 화합물의 순도는 TLC와 HPLC로 확인하였다. TLC 플레이트의 발색은 아니스알데하이드 염색 용액 (5% H₂SO₄, 2.5% 아세트산, 5% 아니스알데하이드, 87.5% 에탄올)으로 전열기에서 가열하여 발색시켰다.

이와 같이 하여 얻어진 메틸피리딘 유도체(methylpyridine derivative)의 물리적 특성 및 분광학적 특성은 다음과 같다. 이에 관한 특성을 하기의 표 1에 정리하였다.

[표 1: 메틸피리딘 유도체의 물리적 특성 및 분광학적 특성]

분자식	C₈H₉NO₂
분자량	151
성상	무색의 무정형 물질로 실온에서 대체적으로 안정하고 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 프로판올, 아세톤, 다이클로로메탄, 클로로포름 및 에틸아세테이트 등 극성 및 중간 극성의 유기 용매에 잘 녹는다. 그러나 헥산 및 에틸에테르 등의 비극성 유기용매에는 녹지 않는다.
박막 크로마토그래피(TLC)	전개용매를 메탄올:H₂O=8:2로 하여 ODS (Octadesylsilane) TLC상에서 R_f=0.41
적외선 흡수대 (KBr)	1710, 1643, 1550 cm^-1
자외선 흡수대 (MeOH)	217, 280 nm에서 최대흡광치

또한, 상기 메틸피리딘 유도체의 ¹H와 ¹³C NMR 지정 실험을 하였다. ¹H와 ¹³C-NMR 스펙트럼은 바리안 유니티 500 스펙트로포토미터(Varian Unity 500 spectrophotometer)를 사용하여, 중메탄-d ₄ 용매에서 각각 500 MHz와 125 MHz에서 측정되었다. 화학전이(chemical shift)는 ¹H의 경우 테트라메틸실란(Tetramethylsilane: TMS) 피이크(0 ppm)를 기준으로 하였고, ¹³C의 경우에는 중메탄-d ₄에서 잔여 용매 피이크(49.0 ppm)를 기준으로 하였으며, 화학전이 값(chemical shift value)은 파트 퍼 밀리언(part per million: ppm) 단위로 나타내었다.

적외선(IR) 스펙트럼은 Matterson사의 Galaxy FT-IR 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였고, 자외선(UV) 스펙트럼은 Milton-Roy 스펙트로미터를 이용하여 측정하였다. 또한, 매스 스펙트럼은 Jeol사의 JMS-HX 110 고해상능 매스 스펙트로포토미터를 이용하여 측정하였다. 이용된 모든 용매는 HPLC 등급 또는 이용 전에 재증류하여 사용하였다. 그 결과는 하기의 표 2에 나타난 바와 같다.

[표 2: 메틸피리딘 유도체의 ¹H와 ¹³C NMR 데이타]

위치	¹H J (Hz)	¹³C (mult.)	HMBC
NH
2		163.2 (s)
3	6.15 (d, 2.2)	101.8 (d)	C-2, C-4, C-5
4		118.4 (d)
5	6.19 (d, 2.2)	112.2 (s)	C-3, C-4, C-7
6		142.8 (q)
7	2.39 (s)	23.4 (s)	C-5, C-6
8		206.5 (s)
9	2.55 (s)	33.1 (q)	C-4, C-8

이상의 결과로부터, 본 발명에서 정제한 상기 메틸피리딘 유도체 화합물은 분자량이 151인 C₈H₉NO₂의 구조식을 가짐을 알 수 있었고, 이것은 메틸피리딘(methylpyridine)계의 화합물임을 알 수 있었다. 지금까지 메틸피리딘계 화합물은 몇가지 알려져 있으나, 문헌 조사 결과 본 발명의 화합물과 같이 아세틸기의 곁 가지를 가지는 메틸피리딘계 화합물은 전혀 발견되지 않았다.

이러한 본 발명의 신규 화합물 메틸피리딘 유도체(methylpyridine derivative)는 생리활성 실험 결과 인체의 백혈병의 암세포에 대하여 강한 독성을 나타내어, 향후 항암제로 개발될 수 있을 것으로 기대된다. 여기서, 사용된 상기 배지는 통상의 스트렙토마이세스 속 균주의 배양에 사용되는 것이면 어느 것이나 될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 방선균의 배양물 또는 배양여과액으로부터 신규한 항암물질을 추출하는 단계는 통상의 분리정제 수단을 사용할 수 있다. 예를 들면, 유기용매 추출 및 HPLC가 사용될 수 있다.

실시예 4: 메틸피리딘 유도체 항암물질의 항암활성 측정

본 발명에 따라 스트렙토마이세스 속 균주로부터 상기 실시예 3을 통하여 얻은 상기한 물리적 특성을 보유하는 메틸피리딘 유도체에 대한 저해 활성 (LC₅₀)은, 세포내 환원효소에 의한 MTT (3-[4,5-dimethylthiazo1-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 환원에 따른 생세포수 측정 방법으로 측정하였다. 본 실험에 사용한 암세포는 백혈병 세포 (leukemia cell-line K-562)였다.

활성 측정시 시료는 디메틸술폭시드 (DMSO)에 각 농도별로 적정량씩 녹여 1.5 ㎖ 에펜돌프 튜브 (Eppendorf tube)에 분주한 후 사용하였다. 세포 배양을 위해서 실 험에 사용될 암세포는 10% FBS (Fetal Bovine Serum)와 카나마이신 (kanamycin) 20 ㎍/㎖가 들어있는 RPMI 1640 배양액을 사용하여, 25 ㎤의 표면적을 갖는 플라스크에서 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기 내에서 배양하였다. 세포독성능 측정시에는 세포를 원심분리하여 세척한 후 새로운 배양액에 2×10⁴ cell/㎖로 부유시켜 사용하였다.

MTT 측정법은 다음과 같이 실시하였다: 대수기에 도달한 암세포 배양액을 96 웰 (well) 플레이트에 0.1 ㎖ 접종하고 시료 (메틸피리딘 유도체)를 각각 10배씩 연속 희석, 0.1 ㎖씩 첨가하여 최종 부피가 0.2 ㎖가 되게 한 후, 37℃, 5% CO₂가 유지되는 배양기에서 4일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 증류수에 녹인 MTT 용액(1㎎/㎖)을 각각의 웰에 50 ㎕씩 가해주고 4시간 동안 추가 배양하였다. 배양 상등액을 제거하고 살아있는 세포의 환원 효소에 의하여 형성된 포르마존(formazone) 결정을 0.15 ㎖의 DMSO에 녹인 다음 540 nm의 광학필터 (optic filter)를 이용하여 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)로 측정하였다.

시료를 처리하지 않은 세포에서는 진한 보라색으로 나타나고 암세포가 모두 죽은 경우에는 거의 투명한 용액으로 결과가 나타나, 흡광도에 따라 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다. 측정의 정확도를 높이기 위하여 모든 시료는 3배수로 실험하였으며, 흡광도가 기준의 50%에 달하는 농도를 IC₅₀로 정의 하였다. 실험 결과, 세 포내 환원효소에 의한 MTT 환원에 따른 생세포수 측정방법으로 측정하였을 때, 본 발명의 메틸피리딘 유도체는 백혈병 세포 (leukemia cell-line K-562)에 대하여 8.9 ㎍/㎖의 저해활성 (IC₅₀)을 나타내었다.

실시예 5: SRB 방법에 의한 메틸피리딘 유도체 항암물질의 항암활성 측정

이어서, 부유세포나 monolayer세포의 단백질 함량을 측정하여 세포 생존률을 측정하였다.

배양세포를 trichloroacetic acid로 고정하고 1% acetic acid에 녹인 0.4%(w/v) sulforhodamine B(SRB)로 염색한 후 결합 안된 SRB를 1% acetic acid로 충분히 세척하여 단백질과 결합한 SRB를 강알칼리인 10mM unbuffered Tris base(tris(hydroxy-methyl)-aminomethane)로 추출하여 흡광도를 microplate reader로 측정하였다. 본 실험은 서로 다른 장기유래 인체 암세포주 MDA-MB-231(유방암), HCT 15(결장암), PC-3(전립선암), NCI-H23(폐암), ACHN(안암), LOX-IMVI(피부암)에 대하여 활성을 측정하였다.

세포성장저해효과의 측정실험은 NCI protocol에 따라서 시행하였다. 세포주를 loading하는 농도는 세포주의 성장속도에 따라서 다르게 한다. 각각의 세포주는 0day에 loading을 한 후에 시료를 처리하는 날에 Time Zero Plate(Tz plate)를 만 들어 계산시에 영점으로 하였다. 메틸피리딘 유도체를 희석하여 100, 10, 1, 0.1, 0.01(ug/ml)이 되도록 처리하였다. 48시간 후에 메틸피리딘 유도체를 처리한 plate를 50% TCA로 50㎕/well씩 넣어서 고정을 하였다. 고정한 plate는 4℃에서 60분간 방치한 뒤 tap water로 4~5번 정도 세척을 하였다. 세척한 plate는 건조한 후, 0.4% SRB(Sulforhodamine B) (0.1% acetic acid로 용해한 용액; 단백질의 염색 시약)을 100㎕/well을 가한다. 30분정도 방치한 후에 0.1% acetic acid로 세척을 하여 결합하지 않은 염색시약을 세척하였다. 다시, plate를 건조한 후에 10mM Tris Base(pH 10.5)를 100㎕/well를 가하여 염색시약을 용해시키고, 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 결과는 하기의 표 3에 기재된 바와 같다.

[표 3: 메틸피리딘 유도체의 암세포주 성장억제 농도(GI₅₀)]

	메틸피리딘 유도체 (㎍/㎖)	Adriamycin (㎍/㎖)
MDA-MB-231(유방암)	7.5	0.8
HCT 15(결장암)	7.8	0.9
PC-3(전립선암)	3.2	0.7
NCI-H23(폐암)	3.5	0.5
ACHN(안암)	4.7	0.6
LOX-IMVI(피부암)	7.4	0.5
K-562(백혈병)	8.6	0.3

상기의 표 3에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 메틸피리딘 유도체는 종래에 암 치료에 사용되는 항암물질로 널리 알려진 아드리아마이신보다 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따르면 항암활성을 가지는 새로운 항암물질을 제공할 수 있다. 특히, 방선균(actinomycetes) 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양물로부터 분리된 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물의 추출방법 및 이에 따른 항암제 조성물을 제공할 수 있다.

이러한 본 발명에 의하는 경우, 상기 방선균 스트렙토마이세스 속 균주와 이것의 배양물 및 배양여과액으로부터 얻어지는 항암물질은 생리 활성 실험 결과 인체의 백혈병과 같은 암세포에 대하여 강한 독성을 나타내는 효과가 있다. 본 발명은 상기 방선균 스트렙토마이세스 속 균주에서 분리된 항암물질뿐만 아니라, 이것의 추출방법 및 이를 포함하는 항암제 조성물을 제공할 수 있어서, 향후 항암제 용도로 다양하게 개발될 수 있을 것이다.

Claims

방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주의 배양액을 얻는 단계;

상기 균주의 배양액으로부터 균사체를 제거하여 배양여과액을 얻는 단계;

상기 배양여과액을 유기용매로 추출한 후 용매를 증발시켜서 조추출물을 얻는 단계; 및,

상기 조추출물을 헥산에 녹이고, 진공 실리카 플래쉬 크로마토그래피(vacuum silica flash chromatography)로 분획하여 분획물을 얻는 단계;를 포함하고,

상기 방선균 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.)에 속하는 균주는, 인체의 백혈병 세포에 대한 항암물질을 생산하는 방선균 스트렙토마이세스 속 KCCM-10664P 균주이며,

상기 분획물은 아래의 성질을 보유하는 것을 특징으로 하는 방선균 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물의 제조방법:

-분자식 : C₈H₉NO₂

-분자량 : 151

-성상 : 무색의 무정형 물질로 실온에서 안정

-용해도 : 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴, 프로판올, 아세톤, 다이클로로메탄, 클로로포름 및 에틸아세테이트에 용해되고, 헥산 및 에틸에테르에 불용

-박막 크로마토그래피(TLC) : 전개용매를 메탄올:H₂O=8:2로 하여 ODS (Octadesylsilane) TLC상에서 R_f=0.41

-적외선 흡수대 (KBr) : 1710, 1643, 1550 cm^-1

-자외선 흡수대 (MeOH) : 217, 280 nm에서 최대흡광치.
삭제
제1항에 있어서, 상기 조출물을 얻는 단계에서 사용된 유기용매는 에틸아세테이트(ethyl acetoacetate), 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 아세토나이트릴(acetonitrile), 클로로포름(chloroform), 아세톤(acetone) 및 다이클로로메탄(dichloromethane)으로 이루어진 군에서 적어도 하나 이상이 선택된 것을 특징으로 하는 방선균 분획물을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물의 제조방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항 또는 제3항에 따른 제조방법에 의해 제조된 항암용 약학 조성물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항암제 조성물.