KR100910982B1 - System for the quantitative measurement of glycohemoglobin and a method for measuring the content of glycohemoglobin using the same - Google Patents

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Abstract

본 발명은 측방 유동 검정 스트립, 레이저 유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치를 포함하는 혈중 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈의 동시 검출 장치 및 이 장치를 이용하여 면역학적 방법으로 혈중 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈을 동시에 간편하게 측정하는 방법을 제공한다. The present invention provides a device for the simultaneous detection of hemoglobin and glycated hemoglobin in blood, including a lateral flow assay strip, a laser-induced surface fluorescence detection device, and an LED detection device, and the simple and simultaneous measurement of hemoglobin and glycated hemoglobin in blood by immunological methods using the device. Provide a method.

당화헤모글로빈, 헤모글로빈, 정량 Glycosylated Hemoglobin, Hemoglobin, Quantitative

Description

당화헤모글로빈의 정량분석을 위한 시스템 및 이를 이용한 당화헤모글로빈 측정 방법 {SYSTEM FOR THE QUANTITATIVE MEASUREMENT OF GLYCOHEMOGLOBIN AND A METHOD FOR MEASURING THE CONTENT OF GLYCOHEMOGLOBIN USING THE SAME}System for quantitative analysis of glycated hemoglobin and method for measuring glycated hemoglobin using the same {SYSTEM FOR THE QUANTITATIVE MEASUREMENT OF GLYCOHEMOGLOBIN AND A METHOD FOR MEASURING THE CONTENT OF GLYCOHEMOGLOBIN USING THE SAME}

본 발명은 혈액에 존재하는 당화헤모글로빈을 고감도로 정량할 수 있는 측방 유동 정량 검정 시스템 및 그 방법에 관한 것으로서, 특히 당화헤모글로빈과 총 헤모글로빈을 동시에 정량할 수 있는 일체형 정량 검정 방법 및 정량 시스템에 관한 것이다. The present invention relates to a lateral flow quantitative assay system and method for quantifying glycated hemoglobin present in blood with high sensitivity, and more particularly, to an integrated quantitative assay method and quantitative system capable of simultaneously quantifying glycated hemoglobin and total hemoglobin. .

당뇨병은 체내에 흡수된 포도당을 제대로 사용하지 못하는 일종의 부적절한 탄수화물 대사로서, 혈액 내에 과다한 혈당을 가지게 되어 다양한 합병증을 유발할 수 있는 질환이다. 이는 크게 세가지로 분류되며, 대표적인 것은 제1형 당뇨병인 인슐린 의존성 당뇨병으로, 이자세포의 자가면역반응에 의하여 인슐린을 합성하거나 분비하는 기능을 상실하는 타입이라 할 수 있다. 다음으로 제2형 당뇨병은 인슐린 비의존성 당뇨병으로, 인슐린에 대한 체내 저항성 또는 부적절한 인슐린 분비 등에 의해 발병한다. 그 외에 임신 중 발생할 수 있는 태아당뇨병이 있다. 그러나 제 1형 당뇨병과 태아당뇨 형태의 당뇨병은 흔하지 않으며, 당뇨병 중 대부분은 제 2형 당뇨병으로서 선진국 당뇨질환 중 90-95%를 차지하고 있는 것으로 알려져 있다. Diabetes is a type of inadequate carbohydrate metabolism that does not properly use glucose absorbed into the body, and is a disease that can cause various complications due to excessive blood sugar in the blood. These are classified into three types, and the most representative type is insulin-dependent diabetes, which is type 1 diabetes mellitus, and may be a type that loses the function of synthesizing or secreting insulin by autoimmune response of the cells. Next, type 2 diabetes is insulin-independent diabetes, which is caused by body resistance to insulin or inappropriate insulin secretion. Other fetal diabetes can occur during pregnancy. However, diabetes mellitus of type 1 and fetal diabetes is not common, and most of the diabetes is type 2 diabetes, which accounts for 90-95% of diabetes in developed countries.

당뇨병을 진단하는 방법은 요당 측정, 혈중 포도당 측정 등 여러 가지가 있지만, 요당 측정은 신뢰할 수 없으며, 혈중 포도당 측정은 식사, 운동 등 여러 요인의 영향을 받아 부정확하므로 당뇨병을 관리하고 치료하기 위해서는 혈액 중 당화헤모글로빈을 측정하는 것이 효과적인 방법 중의 하나이다. There are many ways to diagnose diabetes, including urine glucose measurement and blood glucose measurement, but urine glucose measurement is unreliable, and blood glucose measurement is inaccurate under the influence of various factors such as diet and exercise. Measuring glycated hemoglobin is one effective method.

1986년 미국 당뇨협회에서 모든 형태의 당뇨병을 관리하기 위해 연간 2회씩의 당화헤모글로빈 측정을 제안함으로써　비교적 안정한 지표인 당화헤모글로빈의 양을 당뇨병 관리지표로 사용하기 시작하였고, 1993년 DCCT (Direct Control and Complication Trial, 당뇨 조절과 합병증 연구)에서 당화헤모글로빈의 농도와 당뇨합병증의 관계를 보고하면서 본격적으로 사용하였다. In 1986, the American Diabetes Association proposed to measure glycated hemoglobin twice a year to manage all forms of diabetes and began to use the comparatively stable indicator of glycated hemoglobin as a diabetes control index, and in 1993, DCCT (Direct Control and Complication). Trial, Diabetes Control and Complication Studies) were used in earnest, reporting the relationship between glycated hemoglobin levels and diabetic complications.

당화헤모글로빈의 참고치 설정과 관련하여 ADA(American Diabetes Association, 미국 당뇨병 학회)에서는 DCCT 및 UKPDS(United Kingdom Prospective Diabetes Study, 영국 전향적 당뇨병 연구)의 보고서를 기초로 하여, 당화헤모글로빈 수치를 7% 이내로 관리할 것을 권고하고 있으며, 당화헤모글로빈 수치가 8% 이상인 경우 당뇨 관리의 재평가 및 적극적인 치료를 권고하고 있다. 2001년 미국 내분비 학회에서는 6.5%를 참고치로 제시하였는데 이는 6.5% 이상일 때도 당뇨망막증 의 발병율이 증가하는 것으로 UKPDS에서 보고한 결과를 참조한 것이다. 1999년 국제 당뇨협회(International Diabetes Federation, IDF)에서도 동일하게 당화헤모글로빈 6.5%를 참고치로 제시하고 있다. Regarding the setting of reference values for glycated hemoglobin, the American Diabetes Association (ADA) manages glycated hemoglobin levels within 7% based on reports from the DCCT and the United Kingdom Prospective Diabetes Study (UKPDS). It is recommended to reevaluate and actively treat diabetes management if the glycated hemoglobin level is above 8%. In 2001, the US Endocrinology Society recommended 6.5% as a reference, referring to the results reported by the UKPDS, which increased the incidence of diabetic retinopathy even above 6.5%. In 1999, the International Diabetes Federation (IDF) equally referred to glycated hemoglobin at 6.5%.

DCCT 연구에 의하면, 1441명의 당뇨 질환자를 대상으로 6.5년 동안 임상 실험을 수행한 결과, 당뇨병의 집중적인 혈당 관리를 통하여 당뇨질환으로 인한 미세혈관 합병증을 상당히 감소시킬 수 있다고 한다. 따라서 당뇨 환자 또는 의사에게 있어서 지속적인 혈당 관리의 필요성이 대두된다.According to a DCCT study, a 6.5-year clinical trial with 1441 diabetic patients showed that diabetes can be significantly reduced by microvascular complications through intensive blood sugar management. Therefore, there is a need for continuous blood sugar management in diabetics or doctors.

성인의 헤모글로빈은 97%의 헤모글로빈A, 2.5%의 헤모글로빈A2 및 0.5%의 헤모글로빈F의 세 종류로 구성되어있다. 이 중 헤모글로빈A는 141개의 아미노산을 가진 두 개의 알파 체인과 146개의 아미노산을 가진 두 개의 베타 체인으로 이루어진 네 개의 폴리펩타이드 구조이다. 헤모글로빈A를 크로마토그래피법을 이용하여 분석해 보면 96%의 일반적인 헤모글로빈과 5~6%의 미량 헤모글로빈으로 구성되며, 이들 헤모글로빈을 통칭하여 헤모글로빈A1 또는 당화헤모글로빈이라고 한다. 헤모글로빈A1의 80%는 베타 사슬 N-말단의 발린 잔기에 글루코스가 결합된 구조이며 그 외 미량의 헤모글로빈A1a, 헤모글로빈A1b로 이루어져 있다. Hemoglobin in adults consists of three types: 97% hemoglobin A, 2.5% hemoglobin A 2 and 0.5% hemoglobin F. Hemoglobin A is a four polypeptide structure consisting of two alpha chains with 141 amino acids and two beta chains with 146 amino acids. When hemoglobin A is analyzed by chromatography, it is composed of 96% of normal hemoglobin and 5 to 6% of trace hemoglobin, and these hemoglobins are collectively called hemoglobin A1 or glycated hemoglobin. 80% of hemoglobin A1 has a structure in which glucose is attached to a valine residue at the beta chain N-terminus, and other small amounts of hemoglobin A1a and hemoglobin A1b.

단백질의 아미노기에 당 잔기가 비 효소적인 반응으로 결합하는 것을 당화과정이라 하며, 이 반응은 매우 점진적인 비가역적인 반응이다. 당화헤모글로빈은 헤모글로빈과 혈중 포도당의 결합에 의해 형성되고, 헤모글로빈과 당화헤모글로빈의 비율은 적혈구와 혈중 포도당의 노출 정도에 의해 결정된다. 구체적으로, 당화과정에서는 헤모글로빈A의 발린 잔기에 포도당이 결합하여 헤모글로빈A1c 전구물질을 형성하게 되며, 이는 아마도리 재배열 반응을 통해 안정적인 케토아민 결합을 가진 헤모글로빈A1c가 된다. 이때 혈액 내의 포도당 수치가 높아지면 포도당과 헤모글로빈의 접촉 빈도가 높아지고, 당화헤모글로빈의 비율도 증가하게 된다. 따라서 당화헤모글로빈의 비율로써 혈액 내 포도당 수치의 정확한 정량이 가능하다. 또한 적혈구의 수명은 60 내지 120일 정도이므로 비교적 긴 기간 동안 혈중 포도당 농도 변화를 모니터링 할 수 있다. The binding of sugar residues to non-enzymatic reactions of amino groups in proteins is called glycosylation, which is a very gradual irreversible reaction. Glycosylated hemoglobin is formed by the combination of hemoglobin and blood glucose, and the ratio of hemoglobin and glycated hemoglobin is determined by the exposure of red blood cells and blood glucose. Specifically, in the glycosylation process, glucose binds to the valine residue of hemoglobin A to form a hemoglobin A1c precursor, which is a hemoglobin A1c having stable ketoamine bond through the Amadori rearrangement reaction. At this time, as the level of glucose in the blood increases, the contact frequency between glucose and hemoglobin increases, and the ratio of glycated hemoglobin also increases. Therefore, it is possible to accurately quantify the level of glucose in the blood by the ratio of glycated hemoglobin. In addition, since the life of red blood cells is about 60 to 120 days, blood glucose concentration changes can be monitored for a relatively long period of time.

혈액 내의 당화헤모글로빈을 측정하기 위한 다양한 측정법이 개발되어 왔다. 현재 상업적으로 응용되고 있는 방법으로는 이온교환크로마토그래피법, 친화성 크로마토그래피법, 전기영동법, 복합 착색법 등이 있다. 이러한 방법들은 사용 방법이 어려우며 복잡하고 숙련된 기술이 요구된다. 또한 일회성 임상분석 시스템의 기술개발 동향을 살펴보면, 원격, 재택 또는 현장검사를 위한 장비로 매우 유용하고 다양한 정량 방법이 제시되고 있으며, 그 종류는 육안 판독법, 광학 판독법, 전기화학 측정법 등이 있다. Various assays have been developed for measuring glycated hemoglobin in the blood. Current commercially available methods include ion exchange chromatography, affinity chromatography, electrophoresis and complex coloring. These methods are difficult to use and require complex and skilled techniques. In addition, looking at the trend of technology development of one-time clinical analysis system, a very useful and various quantitative methods are proposed as equipment for remote, in-home or on-site inspection, and the types thereof are visual reading, optical reading, and electrochemical measurement.

최근 당화헤모글로빈의 N-말단 펩타이드 잔기를 인식할 수 있는 단일 항체 및 다중 항체가 개발된 이래(U.S. Pat. No.4,647,654), 이를 이용하여 당화헤모글로빈을 정량하는 면역학적 방법에 관한 많은 연구가 진행중이다. 면역학적 방법은 당화헤모글로빈을 인식하는 항체를 이용하기 때문에 특이도 및 민감도가 높다는 장점이 있다. 면역학적 방법을 사용하여 당화헤모글로빈의 양을 측정할 때에는 당화헤모글로빈의 당화된 특정 부위를 고감도로 인식할 수 있는 항체를 제작하는 것이 필수 요건이다. 혈중의 당화헤모글로빈은 당화된 부위가 외부로 노출되어있지 않으므로, 우선 항체가 이 부위를 인식할 수 있도록 당화헤모글로빈을 변형해야 하며, 다음으로 전체 헤모글로빈을 분광학적인 방법으로 측정하기 위해서 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 전환해야 한다. 메트헤모글로빈은 특정 파장을 흡수하는 특성이 있으므로 분광학적인 방법으로 흡수율을 측정하여 전체 헤모글로빈의 양을 정량할 수 있고, 또한 변형된 당화헤모글로빈을 면역학적인 방법으로 측정하여 혈중 당화헤모글로빈의 양을 측정할 수 있다.Since the development of single antibodies and multiple antibodies capable of recognizing the N-terminal peptide residues of glycated hemoglobin (US Pat. No. 4,647,654), many studies on immunological methods for quantifying glycated hemoglobin are underway. . The immunological method has an advantage of high specificity and sensitivity because it uses an antibody that recognizes glycated hemoglobin. When measuring the amount of glycated hemoglobin using an immunological method, it is essential to prepare an antibody that can recognize a glycated specific portion of glycated hemoglobin with high sensitivity. Since glycated hemoglobin in the blood is not exposed to the outside of the glycated hemoglobin, the glycated hemoglobin must first be modified in order for the antibody to recognize the site, and then the hemoglobin is converted to methemoglobin to spectroscopically measure the total hemoglobin. You must switch. Since methemoglobin absorbs specific wavelengths, it is possible to quantify the total amount of hemoglobin by measuring the absorption rate by spectroscopic method, and to measure the amount of glycated hemoglobin in the blood by measuring the modified glycated hemoglobin by immunological method. have.

면역학적 방법을 이용한 기구는 그 원리에 따라 유동 통과(Flow Through) 방식과 측방 유동(Lateral Flow) 방식으로 나누어진다. 유동 통과 방식은 항체가 공유결합 되어있는 다공성 매트릭스의 표면에 검체를 첨가하여 검체 내의 분석물질이 고정상의 항체와 결합하게 되고, 이후 이차 포획항체를 첨가하여 직접 눈으로 판독하거나 효소기질을 첨가하여 발색시키는 방식이다. 측방 유동 방식은 하나의 디바이스에 전 분석과정을 함유하는 방식과 검체 용액이 표지항체가 고정되어 있는 다공성 매트릭스 지역을 통과하면서 표지항체와 결합하는 방식이 있다.The apparatus using the immunological method is divided into a flow through method and a lateral flow method according to the principle. In the flow-through method, the sample is added to the surface of the porous matrix to which the antibody is covalently attached, and the analyte in the sample binds to the fixed phase antibody. This is how you do it. The lateral flow method includes the entire analysis process in one device, and the sample solution binds to the labeled antibody while passing through the porous matrix region where the labeled antibody is fixed.

측방 유동 분석 타입의 키트 구조를 살펴보면, 시료가 적용되는 시료 패드, 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출 패드, 시료가 이동 또는 분리되면서 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막 또는 스트립, 그리고 시료가 계속하여 이동할 수 있도 록 하는 흡수 패드로 구성되어 있다. 이와 같은 기존의 측방유동 분석법은 임신진단, 암진단, 미생물 탐지 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 아주 간편하게 진단할 수 있으나, 육안으로 판단이 이루어지기 때문에 정확한 양을 확인하기 어려운 점이 있다. Looking at the kit structure of the lateral flow assay type, the sample pad to which the sample is applied, the release pad coated with detection antibody, the developing membrane or strip where the antigen-antibody reaction occurs as the sample is moved or separated, and the sample continues to It consists of an absorbent pad that allows movement. The conventional lateral flow analysis method is widely used in various fields such as pregnancy diagnosis, cancer diagnosis, microbial detection, and can be diagnosed very easily, but it is difficult to confirm the exact amount because it is judged by the naked eye.

HbA1c에 대한 항체를 이용하여 면역학적인 방법으로 검사하는 제품은 대부분 혼탁도 검사방법이며, 이때 당화헤모글로빈의 베타 사슬의 N-말단 부분만이 항원 결정 부위이므로 항원-항체 복합체에 의한 응집반응이 매우 어렵다. 그러므로 여러 개의 항원 결정기로 이루어진 폴리합텐(polyhapten)을 항체와 반응시켜 불용성 면역 복합체를 만들고 이를 측정하는 혼탁도 검사 방법을 사용한다. 이는 검체 내에 당화헤모글로빈의 농도가 증가함에 따라 혼탁도가 감소하게 되는 일종의 경쟁반응이다. 이러한 검사방식은 여러 과정을 거쳐 결과를 얻을 수 있으므로 전문화된 검사실 및 자동화된 장비가 필요하다는 단점이 있다. Most of the products tested by immunological methods using antibodies against HbA1c are turbidity test method, and the aggregation reaction by the antigen-antibody complex is very difficult because only the N-terminal part of the beta chain of glycated hemoglobin is the antigenic determining site. . Therefore, a polyhapten consisting of several antigenic determinants (polyhapten) is reacted with an antibody to create an insoluble immune complex and turbidity test method is used to measure it. This is a kind of competitive reaction in which turbidity decreases as the concentration of glycated hemoglobin in the sample increases. This test method has a disadvantage in that a specialized laboratory and automated equipment are needed because the result can be obtained through various processes.

대한민국공개특허 2004-0018893에서는 당화헤모글로빈에 대한 항체를 포함하고 있는 완충용액, 헤모글로빈에 대한 항체를 포함하는 스트립 및 세척용액으로 구성된 당화혈색소 진단 키트에 대해 개시하고 있다. 상기 한국공개특허는 반정량 시스템에 관한 것으로, 당화헤모글로빈에 대한 항체에 염료를 첨가하여 당화혈색소가 존재하는 경우의 색상변화를 표준혈색소와 육안 또는 색상대조표에의해 판정하는 방식이므로 당화헤모글로빈의 양을 실제로 정확히 정량할 수 없다는 한계가 있다. Korean Patent Laid-Open Publication No. 2004-0018893 discloses a glycated hemoglobin diagnostic kit consisting of a buffer containing an antibody against glycated hemoglobin, a strip containing an antibody to hemoglobin, and a washing solution. The Korean Laid-Open Patent relates to a semi-quantitative system, which is a method of determining the color change in the presence of glycated hemoglobin by the addition of a dye to an antibody against glycated hemoglobin by a standard hemoglobin and the naked eye or a color control table. In fact, there is a limit that cannot be accurately quantified.

또한 면역진단법에 있어서 현재까지 정량화가 가능한 RIA 방법이나 ELISA 방법은 시료에서 분석물의 정량화를 위하여 효소를 처리하고 세척하는 등의 몇 단계를 거 쳐야 한다. 따라서 빠르고 간편하면서 고감도로 정량화가 가능한 일반적인 분석법이 필요하다.In addition, RIA or ELISA methods that can be quantified to date for immunodiagnosis should go through several steps such as treating and washing enzymes to quantify analytes in a sample. Therefore, there is a need for a general method that is fast, simple and highly quantifiable.

면역학적 방법의 장점과 정량 분석의 필요성을 감안하여 이루어진 본 발명은 현장 분석용 당화헤모글로빈 측정 제품을 개발함으로써, 간단한 방법으로 효과적으로 혈중 당화헤모글로빈을 정량하여 당뇨병을 조기에 진단하여 당뇨 질환자에게 의심되는 당뇨 합병증의 예방 및 위험성을 최소화하고, 또한 의사 및 환자 스스로 정확하고 지속적으로 혈당을 관리할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. The present invention has been made in consideration of the advantages of immunological methods and the need for quantitative analysis. By developing a glycated hemoglobin measuring product for field analysis, it is effective to quantify blood glycated hemoglobin in a simple method to diagnose diabetes early and to suspect diabetes. It aims to prevent the complications and minimize the risk, and also to provide a way for doctors and patients to manage blood sugar accurately and continuously.

본 발명의 다른 목적은 당화헤모글로빈과 총 헤모글로빈을 동시에 정량할 수 있는 일체형 정량시스템, 즉 당화헤모글로빈을 검정할 수 있는 측방 유동 검정 스트립, 항원분석물을 정량하는 레이저 유발 표면형광 검출 장치 및 색소분석물을 정량하는 LED 검출 장치를 포함하는 일체형 정량시스템을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is an integrated quantitative system capable of simultaneously quantifying glycated hemoglobin and total hemoglobin, that is, a lateral flow assay strip capable of assaying glycated hemoglobin, a laser-induced surface fluorescence detection apparatus and a pigment analyte for quantifying antigen analytes. It is to provide an integrated quantitative system comprising an LED detection device for quantifying.

본 발명의 또 다른 목적은 면역반응의 특이성 및 선택성을 이용하여, 일정량의 탐지자가 도입된 항원분석물을 포함하는 시료가 측방 유동 검정 스트립을 따라 이동하면서 시료중의 탐지자와 매질 상에 고정된 포획자와 경쟁적으로 항원항체 반응을 하며, 그 후 표지된 탐지자에의해 발생된 신호를 측정하고, 측방 유동 검정 스트립 상의 색소분석물의 양을 별로도 측정하여, 색소분석물의 양에 대한 항원분석물의 비율을 산출함으로써 시료 중 항원분석물을 정량하는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to utilize the specificity and selectivity of an immune response, so that a sample containing an antigen analyte into which a certain amount of detector is introduced is immobilized on the detector and medium in the sample as it moves along the lateral flow assay strip. Competitive antigen-antibody reaction with the capture followed by measuring the signal generated by the labeled detector and separately measuring the amount of the dye analyte on the lateral flow assay strip, to determine the amount of the analyte for the amount of the dye analyte. It is to provide a method for quantifying antigen analytes in a sample by calculating the ratio.

이상에서 설명한 바, 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립, 레이져유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치가 일체로 구성된 측방 유동 검정 시스템은 항원-항체 반응에 의해 효과적으로 당화헤모글로빈을 정량할 수 있는 방법을 제공하므로 당뇨환자를 비롯하여 지속적인 혈당의 관리가 필요한 환자들에게 매우 유용할 것으로 기대된다.As described above, the lateral flow assay system in which the lateral flow assay strip, the laser-induced surface fluorescence detection device, and the LED detection device are integrated according to the present invention provides a method for effectively quantifying glycated hemoglobin by antigen-antibody reaction. Therefore, it is expected to be very useful for diabetics and patients who need continuous blood sugar management.

따라서, 본 발명의 첫 번째 양태에서는, 지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 흡수 패드(absorption pad)를 포함하는 측방 유동 검정 스트립으로서, 상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 각각 샘플 패드와 흡수 패드가 서로 겹치지 않도록 접착되어 있으며; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 상기 크로마토그래피 매질 상에는 상기 샘플 패드로 부터 일정한 거리를 두고 포획자가 분주 고정되어 있는 측방 유동 정량 검정 스트립을 제공한다. 바람직하게 상기 스트립은 상기 샘플 패드와 크로마토그래피 매질 사이에 형광물질 표지된 탐지자가 흡착된 결합체 방출패드를 더 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게, 이 와 같은 스트립은 스트립의 오염 등을 방지하기 위해 시료의 적하 위치와 표면형광측정지역 및 LED 측정지역을 제외하고 스트립 전체를 감싸도록 구성된 스트립 하우징을 더 포함할 수 있다.Thus, in a first aspect of the invention, there is provided a lateral flow assay strip comprising a baking card, a sample pad, a chromatography medium and an absorption pad, wherein the support is a strip. Supporting the entire composition of the sample, wherein both ends of the sample pad and the absorbent pad are bonded so as not to overlap each other; The sample pad has an end in the direction in which the absorbent pad is adhered to one end of the chromatography medium, and the sample to be analyzed is first loaded thereon; The other end of the chromatography medium is superimposed on an absorption pad, and on the chromatography medium provides a lateral flow quantitative assay strip in which the trapper is fixed at a distance from the sample pad. Preferably, the strip may further include a binder release pad having a phosphor labeled detector adsorbed between the sample pad and the chromatography medium. More preferably, such a strip may further include a strip housing configured to surround the entire strip except for the dropping position of the sample and the surface fluorescence measuring area and the LED measuring area to prevent contamination of the strip.

본원에서 용어 "액체 시료" 또는 "시료"는 분석물 또는 탐지자 및 분석물을 포함하는 분석대상 화합물 또는 조성물을 가리키며, 본 발명에서 사용될 수 있는 액체시료 또는 시료는 크로마토그래피매질을 이동할 수 있어야 하므로 액체상 또는 액체와 유사한 유동성 있는 물질을 말한다. As used herein, the term "liquid sample" or "sample" refers to an analyte or detector and an analyte or composition comprising the analyte, and since a liquid sample or sample that can be used in the present invention must be able to transport the chromatography medium, Refers to a liquid or liquid material similar to liquid.

본원에서 용어 “분석물”은 시료 중의 분석 대상 화합물로서, 항원분석물 및 색소분석물을 포함한다. 또한 본원에서 용어 "색소분석물" 및 "항원분석물"은 각각 단백질 및 당화단백질로서, 특히 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈을 가리킨다. 항원분석물은 항원-항체반응에 관여하고, 색소분석물 및 항원분석물 모두는 본 발명에 따른 LED에 의해 신호를 발생시킨다.As used herein, the term “analyte” refers to a compound of interest in a sample, including an analyte and a pigment analyte. The terms “pigment analyte” and “antigen analyte” herein also refer to proteins and glycosylated proteins, in particular hemoglobin and glycated hemoglobin. Antigen analytes participate in antigen-antibody reactions, both pigment analytes and antigen analytes generating signals by LEDs according to the invention.

본원에서 용어 "탐지자"는 상기 언급된 항원분석물에 대한 항체, 즉 바람직하게는 당화헤모글로빈에 대한 항체를 말하며, 더욱 바람직하게는 표면형광 물질로 표지되어 있다.The term “detector” herein refers to an antibody against the aforementioned analyte, preferably an antibody against glycated hemoglobin, more preferably labeled with a surface fluorescent substance.

본원에서 용어 "포획자"는 시료 중의 항원분석물과 동일한 물질 또는 화합물이거나, 시료 중 항원분석물의 탐지자 인식 부위와 동일한 구조를 갖는 부분을 포함하는 물질로서, 당화단백질, 바람직하게는 인간의 당화헤모글로빈이며, 스트립상에 고정되어 스트립을 따라 이동하는 시료 중의 탐지자 단일체를 특이적, 선택적으 로 포획할 수 있는 것을 가리킨다.As used herein, the term "capture" refers to a substance or compound that is the same as the antigenic analyte in a sample, or that includes a portion of the sample that has the same structure as the detector recognition site of the analyte, and is a glycosylated protein, preferably human glycosylation. Hemoglobin, which refers to the ability to specifically and selectively capture a detector monolith in a sample immobilized on a strip and moving along the strip.

또한 본원에서 용어 "표면형광"은 크로마토그래피를 이용한 측방 유동 검정스트립의 항원분석물 측정지역에 고정되는 형광물질 표지된 탐지자-분석물 복합체로부터 발광되는 형광, 또는 형광물질 표지된 탐지자로부터 발광되는 형광을 말한다.The term “surface fluorescence” herein also refers to fluorescence emitted from a fluorophore-labeled detector-analyte complex immobilized on an antigen analyte measurement region of a lateral flow assay strip using chromatography, or luminescence from a fluorophore-labeled detector. Refers to fluorescence.

본원에서 용어 "흡착"은 크로마토그래피 매질 또는 스트립을 구성하는 패드에 물질이 농축되어 붙어 있는 것을 말하며, 크로마토그래피의 이동상을 따라서 같이 이동할 수 있으나, 적절한 처리에 의해서 고정화될 수도 있다.As used herein, the term "adsorption" refers to the concentration of a substance adhered to a pad constituting a chromatography medium or strip, and may move together along a mobile phase of chromatography, but may be immobilized by appropriate treatment.

또한 본원에서 용어 "고정" 또는 "고정화"는 시료 또는 시약을 크로마토그래피 매질이나 스트립에 붙이는 것을 말하며, 특히 크로마토그래피의 이동상이나 용매에 녹지 않으며 상기 이동상이 이동하더라도 같이 이동하지 않고 고정된 자리에서 움직이지 않는 상태를 말한다.In addition, the term "fixed" or "immobilized" herein refers to the attachment of a sample or reagent to a chromatography medium or strip, in particular, insoluble in the mobile phase or solvent of the chromatography and moving in a fixed position without moving with the mobile phase. It is not a state.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 첫 번째 양태에 따른 측방 유동 검정 스트립, 상기 측방 유동 검정 스트립상의 표면형광 물질의 표면형광을 측정함으로써 항원분석물의 양을 결정하는 레이저-유발 표면형광 검출장치, 및 상기 측방 유동 검정 스트립 상의 색소분석물의 양을 결정하는 LED(light emitting diode) 검출장치를 포함하는, 시료 중의 항원분석물 및 색소분석물의 양을 동시에 측정할 수 있는 일체형 측방 유동 정량 검정 시스템을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a lateral flow assay strip according to the first aspect, a laser-induced surface fluorescence detection device for determining the amount of the antigen analyte by measuring the surface fluorescence of the surface fluorescence material on the lateral flow assay strip, and It provides an integrated lateral flow quantitative assay system including a light emitting diode (LED) detector for determining the amount of the dye analyte on the lateral flow assay strip, the amount of the antigen analyte and the pigment analyte in the sample at the same time. .

구체적으로 상기 표면형광 검출장치는 레이저의 레이저빔 형상제어용 렌즈와 여기필터를 통과한 빛을 조사하여 이로부터 반사된 빛을 포집렌즈에 통과시켜 평행광을 형성하고, 이 평행광을 형광필터에 통과시켜 산란광을 걸러내고 순수한 형광성분광만 집광렌즈로 입사시키고, 이 집광렌즈에 의해 형광성분광이 공간필터의 중심으로 집속되며, 상기 공간필터에서 순수한 형광성분 광 이외의 빛이 제거된 광만이 광검출기로 입사되며, 광검출기로 입사된 광은 아날로그 디지털 컨버터(ADC)를 통해 CPU로 전달되어 상기 복합체의 형광 양을 표준 형광양에 대하여 상대적으로 비교하여 항원분석물의 양을 결정한다. Specifically, the surface fluorescence detection device irradiates the light passing through the laser beam shape control lens of the laser and the excitation filter and passes the light reflected therefrom to the collecting lens to form parallel light, and passes the parallel light through the fluorescent filter. Filter out scattered light and inject only pure fluorescent component light into the condenser lens, and the condenser lens focuses on the center of the spatial filter, and only the light from which the light other than pure fluorescent component light is removed from the spatial filter is transferred to the photodetector. The incident light, incident on the photodetector, is delivered to the CPU via an analog-to-digital converter (ADC) to determine the amount of the analyte by comparing the amount of fluorescence of the complex relative to the standard amount of fluorescence.

또한 LED 검출장치는 색소 분석물의 양에 따라 LED 광원에 의한 빛이 흡수 및 산란되는 광량이 다른 것을 이용하여 색소분석물의 양을 측정한다. 구체적으로 LED 광원에 의한 빛을 고른 분포로 분석물에 조사시키고, 분석물에 의해 산란된 빛은 광축 전방에 위치한 공간 필터에 의해 색소분석물에 의한 산란광만을 통과시키고, 이 산란광은 광검출기로 입사된다. 광검출기로 검출된 광신호는 ADC를 통해 CPU로 전달되어 시료의 색소분석물의 양을 결정하게 된다. In addition, the LED detection device measures the amount of the dye analyte by using the amount of light absorbed and scattered by the LED light source according to the amount of the dye analyte. Specifically, the light from the LED light source is irradiated to the analyte in an even distribution, and the light scattered by the analyte passes only the scattered light by the dye analyte by a spatial filter located in front of the optical axis, and the scattered light is incident on the photodetector. do. The optical signal detected by the photodetector is transferred to the CPU through the ADC to determine the amount of the dye analyte in the sample.

또 다른 양태로서 본 발명은, 상기 본 발명에 따른 일체형 측방 유동 정량 검정 시스템을 이용하여 혈액 중 당화헤모글로빈의 양을 측정하는 방법을 제공한다. In another aspect, the present invention provides a method for measuring the amount of glycated hemoglobin in blood using the integrated lateral flow quantitative assay system according to the present invention.

구체적으로 상기 방법은, 측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드 상에 항원분석물 및 색소분석물이 함유된 것으로 예상되는 시료를 적하하여 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 이동되도록 하고, 시료의 적하 전 또는 이동 중에 시료에 일 정량의 탐지자를 도입함으로써 제 1 면역반응에 의해 탐지자-항원분석물의 결합체를 형성하고, 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 전개함에 따라 샘플 패드로부터 일정 거리에 위치한 크로마토그래피 매질 상에 고정된 포획자와 상기 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단일체가 경쟁적으로 제 2 면역 반응에 의해 결합체를 형성하면서 이동하도록 하고, 경쟁반응 후 크로마토그래피 매질 상에 고정된 포획자에 결합된 탐지자의 양과, 이와 별개로 크로마토그래피 매질 상의 색소분석물의 양을 각각 측정함으로써 시료중의 분석물에 대한 항원분석물의 비율을 결정하여 시료 중의 항원분석물을 정량하는 측방 유동 정량 검정 방법을 제공한다. Specifically, the method involves dropping a sample that is expected to contain an analyte and a dye analyte on a sample pad of a lateral flow assay strip so that the liquid sample is moved through the chromatography medium and before or before the dropping of the sample. Introducing a quantity of detector into the sample to form a conjugate of the detector-antigen analyte by the first immune response and immobilizing on a chromatography medium located at a distance from the sample pad as the sample develops along the chromatography medium. The captured capturer and the detector-antigen analyte conjugate and / or the detector single entity competitively migrate to form a conjugate by a second immune response, and after the competition is bound to the immobilizer on the chromatography medium. Determination of the amount of detector and the amount of the dye analyte on the chromatography medium separately By determining the ratio of the antigen analyte to the analyte in the sample thereby providing a lateral flow quantitative assay method for quantifying the antigen analyte in the sample.

바람직하게 상기 일정량의 탐지자는 형광물질로 표지되어 있으며, 시료의 적하 전에 액체시료에 혼합되는 방식으로 도입되거나, 또는 측방 유동 검정 스트립이 결합체 방출 패드를 포함하는 경우 결합체 방출 패드에 흡착되어, 시료가 적하되어 크로마토그래피 매질을 따라 이동하면서 상기 결합체 방출 패드를 통과하는 과정에서 시료에 용해 및/또는 혼합되는 방식으로 도입될 수 있다. 이에 따라 탐지자가 시료 중 항원분석물과 결합하여 형광물질 표지된 탐지자-항원분석물 결합체를 형성하거나 시료 중에 항원 분석물이 없거나 부족한 경우 탐지자 단일체의 형태로 크로마토그래피 매질을 따라 이동한다. Preferably the detector is labeled with a fluorescent material and introduced in such a way that it is mixed with the liquid sample prior to dropping the sample, or adsorbed to the binder release pad if the lateral flow assay strip comprises the binder release pad, It can be introduced in such a way that it is dissolved and / or mixed in the sample during the passage through the binder release pad while being dropped and moved along the chromatography medium. Accordingly, the detector binds to the antigenic analyte in the sample to form a fluorescently labeled detector-antigen analyte conjugate or, if the sample lacks or lacks the antigenic analyte, moves along the chromatography medium in the form of a detector monolith.

상기 포획자는 크로마토그래피 매질 상에 시료의 적하 지점으로부터 시료가 전개되는 방향으로 일정 간격 떨어진 위치(이하, '항원분석물 측정지역'이라 함)에 분주 고정되어, 포획자가 고정되어 있는 지역으로 유입되는 시료 중의 탐지자 단일체 및/또는 탐지자-항원분석물 결합체와 탐지자-포획자 결합체를 형성한다. 이에 따라 탐지자의 표면형광 물질을 탐지하는 레이저유발 표면 형광 검출 장치는 상기 항원분석물 측정지역에서 발생하는 표면 형광 신호에 의해 항원분석물, 즉 탐지자와 결합된 당화헤모글로빈의 양을 측정한다. The capturer is fixed at a predetermined distance (hereinafter referred to as 'antigen analyte measurement region') from the dropping point of the sample onto the chromatography medium (hereinafter referred to as the 'antigen analyte measurement region'), and is introduced into the region where the capturer is fixed. A detector monomer and / or a detector-antigen analyte conjugate and a detector-captor conjugate are formed in the sample. Accordingly, the laser-induced surface fluorescence detection device for detecting the surface fluorescent substance of the detector measures the amount of glycated hemoglobin bound to the antigen analyte, that is, the detector, by the surface fluorescence signal generated in the antigen analyte measurement region.

한편, 크로마토그래피매질 상의 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈은 색소분석물을 탐지하는 LED에 의해 측정되며, 측정된 색소분석물의 농도에 대한 항원분석물의 농도 비율을 산출하여 시료중의 항원분석물의 양을 정량하는 방법을 제공한다.On the other hand, hemoglobin and glycated hemoglobin on the chromatographic medium are measured by LED detecting the dye analyte, the method of quantifying the amount of the antigen analyte in the sample by calculating the concentration ratio of the antigen analyte to the concentration of the measured dye analyte To provide.

이하, 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립, 레이져-유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치가 일체로 구성된 측방 유동 정량 검정 시스템 및 이를 이용하여 혈액 중 총 헤모글로빈의 양 및 당화헤모글로빈의 양을 동시에 특정하는 방법을 도면을 참조하여 구체적으로 설명한다.Hereinafter, a lateral flow quantitative assay system in which the lateral flow assay strip, the laser-induced surface fluorescence detection device, and the LED detection device according to the present invention are integrally formed, and the amount of total hemoglobin and the glycated hemoglobin in the blood are simultaneously determined using the same. The method will be described in detail with reference to the drawings.

도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 측방 유동 검정 스트립의 모식도 로서, 상기 스트립은 지지대(101), 샘플 패드(102), 결합체 방출패드(103), 크로마토그래피 매질(104) 및 흡수 패드(105)를 포함한다. 측방 유동 검정 스트립을 구성하는 각 구성요소를 자세히 설명하면 다음과 같다.1 is a schematic representation of a lateral flow assay strip in accordance with a preferred embodiment of the present invention, wherein the strip is a support 101, a sample pad 102, a binder release pad 103, a chromatography medium 104 and an absorbent pad ( 105). Each component constituting the lateral flow assay strip is described in detail as follows.

지지대(support fixture( backingbacking cardcard ))

지지대(101)는 스트립의 모든 구성요소를 지지하고 있으며, 지지대가 생략되는 경우에는 크로마토그래피 매질(104) 자체가 지지대가 될 수 있다. 지지대는 보 통 수불용성, 비다공성 및 경직성이고, 보통은 지지대 위에서 시료를 전개하는 패드의 길이와 너비가 동일하나 보다 크거나 작을 수 있다. 지지대는 다양한 천연 및 합성의 유기 및 무기 재료를 사용할 수 있으나, 다만 흡수 물질의 모세 작용을 방해하거나, 분석물과 비특이적으로 결합하거나, 분석물과 탐지자의 반응을 방해해서는 안된다. 지지대로 사용가능한 대표적인 중합체로는, 이들로 한정되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리(에틸렌 테레프탈레이트), 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 유리, 세라믹, 금속 등이 포함된다.The support 101 supports all the components of the strip, and if the support is omitted, the chromatography medium 104 itself can be the support. The supports are usually water insoluble, nonporous and rigid, and usually have the same length and width of the pads that develop the sample on the supports but can be larger or smaller. The support may use various natural and synthetic organic and inorganic materials, but should not interfere with the capillary action of the absorbent material, bind nonspecifically with the analyte, or interfere with the reaction of the analyte and the detector. Representative polymers that can be used as a support include, but are not limited to, polyethylene, polyester, polypropylene, poly (4-methylbutene), polystyrene, polymethacrylate, poly (ethylene terephthalate), nylon, poly ( Vinyl butyrate), glass, ceramics, metals and the like.

일반적으로 지지대 위에는 접착제가 코팅되어 각종 패드가 부착된다. 적절한 접착제의 선택은 스트립의 성능을 개선하고 수명을 연장하는데 도움을 줄 수 있다. 본 발명에 따른 측방 유동 검정 스트립에 사용되는 것으로는 감압성 접착제(pressure-sensitive adhesive, PSA)가 대표적이다. 전형적인 측방 유동 검정 스트립에서 각종 패드의 결합은 접착제가 패드의 기공 내로 침투하고 이에 따라 패드가 지지대와 함께 결합함으로써 달성된다. 이와 같이 접착제가 정상적인 조건하에서 이동하는 과정을 콜드 플로우(cold flow)라고 한다. PSA를 패드에 적층하는 과정에서는 가열을 하지 않기 때문에 어느 정도의 콜드 플로우는 패드와 지지대 사이의 결합이 형성되기 위해서는 필수적이다. 콜드 플로우의 정도가 너무 낮으면 스트립의 저장 기간 동안에 함께 결합되어 있는 패드 내로 접착제가 이동하여 기공이 차단되거나 소수성 얼룩이 형성되거나 패드의 재습윤 문제가 발생할 수 있다. 이러한 접착제의 콜드 플로우와 연관된 문제는 직접-주조막을 사용함으로써 해결될 수 있다. 이러한 막은 지지플라스틱 시트에 의해 접착제가 막의 기공으로 들어가는 것을 차단해 주기 때문에 저장 기간 동안에 접착제의 상하이동을 예방할 수 있다. Generally, an adhesive is coated on the support to attach various pads. Choosing the right adhesive can help improve strip performance and extend its life. Pressure-sensitive adhesives (PSAs) are typically used for the lateral flow assay strips according to the invention. Bonding of various pads in a typical lateral flow assay strip is accomplished by adhesive penetration into the pores of the pad and thus the pad bonding with the support. This process of moving the adhesive under normal conditions is called cold flow. Since the PSA is not heated in the lamination process, some cold flow is necessary for the bond between the pad and the support to be formed. If the degree of cold flow is too low, the adhesive may move into the pads that are held together during the storage period of the strip, blocking pores, forming hydrophobic stains, or causing rewetting of the pads. The problem associated with cold flow of such adhesives can be solved by using direct-casting films. This membrane prevents the adhesive from entering the pores of the membrane by the supporting plastic sheet, thus preventing the adhesive from moving during storage.

샘플 패드(Sample pad ( samplesample padpad ))

샘플 패드(102)는 스트립의 한쪽 말단에 위치하며, 샘플 패드의 한쪽 말단은 크로마토그래피 매질(104) 또는 결합체 방출 패드(103)를 추가적으로 포함하는 경우에는 결합체 방출 패드의 일부와 적층된다. The sample pad 102 is located at one end of the strip, and one end of the sample pad is laminated with a portion of the binder release pad if it further comprises a chromatography medium 104 or a binder release pad 103.

원칙적으로 샘플 패드는 분석물이 함유된 시료를 접수하는 역할을 한다. 이러한 기능에 더하여, 샘플 패드는 시료중의 불용성 입자를 여과하는 기능을 가질 수 있다. 이러한 관점에서, 본 발명의 샘플 패드는 여과 기능을 부가하는 재질인 셀룰로스 소재의 여과지 또는 유리 섬유 여과지가 바람직하며, 본원 실시예에서는 S & S사가 공급하는 등급 903의 셀룰로스 여과지를 사용하였다.In principle, the sample pad serves to receive a sample containing the analyte. In addition to this function, the sample pad may have a function of filtering insoluble particles in a sample. In view of this, the sample pad of the present invention is preferably a cellulose filter paper or a glass fiber filter paper, which is a material that adds a filtration function, and in this embodiment, grade 903 cellulose filter paper supplied by S & S is used.

샘플 패드는 그 재질에 시료 중의 분석물이 비특이적으로 흡착되는 것을 막고, 동시에 시료의 성분들이 크로마토그래피 매질을 통해 용이하게 이동할 수 있도록 보조하기 위해서, 그리고 반응의 감도를 유지하고 형광물질 표지된 탐지자와 시료의 성분 사이에 이루어질 수 있는 원하지 않는 비특이적 반응을 최대한 방지하기 위하여 전처리하는 것이 바람직하다. 샘플 패드는 보통 불활성 단백질 또는 계면활성제로 전처리한다. 불활성 단백질로는 0.1 내지 10% 소 혈청 알부민(BAS) 함유 0.1M 트리스 완충액(pH 6 내지 9) 중의 0.1% 내지 10% 탈지유분의 용액 및/또는 0.1% 내지 10% 카제인 용액이 사용될 수 있고, 계면활성제로는 트리톤 X-100 또는 트윈 20이 사용될 수 있다. 그러나 이러한 전처리의 결정은 분석물 및 시료의 종류에 따라 결정될 것이다. The sample pad prevents non-specific adsorption of the analyte in the sample to the material, while at the same time assisting the components of the sample to easily move through the chromatography medium, and maintains the sensitivity of the reaction and is a fluorescently labeled detector Pretreatment is desirable to prevent as much unwanted nonspecific reactions as possible between and the components of the sample. Sample pads are usually pretreated with inert proteins or surfactants. As an inert protein, a solution of 0.1% to 10% skim milk and / or 0.1% to 10% casein solution in 0.1M Tris buffer (pH 6 to 9) containing 0.1 to 10% bovine serum albumin (BAS) may be used, Triton X-100 or Tween 20 may be used as the surfactant. However, the determination of this pretreatment will depend on the type of analyte and sample.

결합체 방출 패드(Combined release pad ( conjugateconjugate releasingreleasing padpad ))

측방 유동 검정 스트립은 선택적으로 결합체 방출 패드(103)를 포함할 수 있다. 이때, 결합체 방출 패드의 한쪽 말단의 일부는 샘플 패드(102)에, 다른 한쪽 말단의 일부는 크로마토그래피 매질(104)에 적층되어 지지대(101)에 부착된다. The lateral flow assay strip can optionally include a binder release pad 103. At this time, a portion of one end of the conjugated release pad is laminated to the sample pad 102 and a portion of the other end to the chromatography medium 104 and attached to the support 101.

결합체 방출 패드에는 시료중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성할 수 있는 형광물질 표지된 탐지자가 흡착될 수 있다. 탐지자는 패드에 고정된 것이 아니라 단순히 흡착되어 있으므로 시료 중의 분석물과 반응하여 결합체를 형성한 후, 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 전개, 이동됨에 따라 함께 이동한다. The conjugate release pad can adsorb a fluorescently labeled detector capable of reacting with the analyte in the sample to form a conjugate. Since the detector is not fixed to the pad but simply adsorbed, it reacts with the analytes in the sample to form a conjugate, and then moves together as the sample develops and moves through the chromatography medium.

결합체 방출 패드에 시약을 흡착시키는 방법은 본원 출원 이전에 이미 다양하게 이루어져 있는 통상의 방법에 의해서 이루어질 수 있다. 구체적인 예로는 침지(impregnation process), 건조 또는 동결건조를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. The method of adsorbing the reagent to the conjugate release pad can be accomplished by conventional methods which have already been made in various ways prior to the present application. Specific examples include, but are not limited to, an impregnation process, drying or lyophilization.

결합체 방출 패드는 신속한 여과 속도와 함께 양호한 입자 보유를 제공하는 것이 바람직하다. 이러한 것으로는 폴리에스테르와 같은 합성소재 및 유리 섬유 필터가 사용될 수 있다. 일반적으로 유리를 주성분으로 하는 유리 섬유 및 폴리에스테르를 사용할 수 있으며, 본원 실시예에서는 S & S사가 공급하는 유리 섬유를 사용하였다. 이들은 생물학적으로 불활성이고 천연 소재보다 정교한 섬유질을 갖고 있기 때문에 수성 시약이나 시료가 투입되었을 때 뒤틀리거나 팽창하지 않는다. 바람직하게는, 결합체 방출 패드는 이에 분석물과 형광물질 표지된 탐지자가 비특이적으로 흡착되는 것을 방지하면서 결합체의 방출과 이동이 원활히 이루어질 수 있도록 계면활성제와 같은 시약으로 전처리한다. The binder release pad preferably provides good particle retention with rapid filtration rate. As such, synthetic materials such as polyester and glass fiber filters can be used. In general, glass fibers and polyesters based on glass may be used. In the present embodiment, glass fibers supplied by S & S are used. Because they are biologically inert and have more sophisticated fibers than natural materials, they do not twist or swell when aqueous reagents or samples are added. Preferably, the conjugate release pad is pretreated with a reagent such as a surfactant to facilitate release and migration of the conjugate while preventing analyte and fluorophore labeled detectors from adsorbing nonspecifically.

결합체 방출 패드의 성능 향상 및 안정성을 위해서 안정화제 및 차단제가 사용될 수 있다. 안정화제의 예로는 수크로즈, 트레할로즈와 같은 당류를 들 수 있으며, 차단제로는 BSA(소혈청알부민), 젤라틴, 카세인, 탈지유 등의 단백질류를 들 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.Stabilizers and blockers can be used for improved performance and stability of the conjugate release pad. Examples of stabilizers include sugars such as sucrose and trehalose, and blocking agents include, but are not limited to, proteins such as BSA (bovine serum albumin), gelatin, casein, skim milk, and the like.

크로마토그래피 매질Chromatography Medium

크로마토그래피 매질(104)의 양 말단의 일부에는 각각 샘플 패드(102)와 흡수 패드(105)가, 결합체 방출 패드를 추가적으로 포함하는 경우에는 각각 결합체 방출 패드(103)와 흡수 패드(105)가 서로 겹치지 않게 적층되어 있다. Sample pads 102 and absorbent pads 105 are respectively at portions of both ends of the chromatography medium 104, where the binder release pads 103 and the absorbent pads 105 are each other if they further comprise a binder release pad. It is laminated so as not to overlap.

크로마토그래피 매질은 지지대(101)에 부착될 수 있다. 다른 방법으로서, 크로마토그래피 매질은 그 자체가 지지대가 될 수 있다. The chromatography medium may be attached to the support 101. Alternatively, the chromatography medium may itself be a support.

크로마토그래피 매질은 바람직하게는 액체 시료, 분석물 등이 모세관력에 의해 신속하게 이동하여 그 위에 고정된 포획자에 도달될 수 있도록 하는 것이면 어느 것이든 사용될 수 있으며, 다만, 균일한 특성을 갖는 것이 바람직하다. 일반적으로 크로마토그래피 매질은 모세관력에 반응하여 수성 매질에 의해 이동하기 쉽고 기공이 0.1μ 이상, 바람직하게는 1.0μ 이상인 다공성 물질을 가리킨다. 이러한 물질은 일반적으로 친수성이거나 친수성으로 될 수 있으며, 그 예로는 무기 분말(예를 들면, 필터지, 크로마토그래피지 등과 같은 섬유 함유 지), 또는 합성 또는 변형된 천연 중합체(예를 들어, 니트트로셀룰로즈, 셀룰로즈 아세테이트, 폴리(비닐 클로라이드), 폴리아크릴아미드, 가교된 텍스트란, 아가로즈, 폴리아크릴레이트 등)가 포함된다. 상기 예시된 물질은 단독으로 사용되거나 다른 물질과 조합하여 사용될 수 있다. 또 다른 예로는 세라믹 물질을 들 수 있다. The chromatography medium may preferably be used as long as the liquid sample, analyte, etc., can be moved quickly by capillary forces to reach the trappers immobilized thereon, provided that they have uniform properties. desirable. In general, a chromatography medium refers to a porous material that is easy to move by an aqueous medium in response to capillary forces and has a pore size of at least 0.1 micron, preferably at least 1.0 micron. Such materials may generally be hydrophilic or hydrophilic, for example inorganic powders (eg fiber containing paper such as filter paper, chromatography paper, etc.), or synthetic or modified natural polymers (eg nitro) Cellulose, cellulose acetate, poly (vinyl chloride), polyacrylamide, crosslinked textran, agarose, polyacrylate, etc.). The materials exemplified above may be used alone or in combination with other materials. Another example is a ceramic material.

또한 크로마토그래피 매질은 다작용성이거나 다작용성으로 변형시켜 포획자와 공유결합을 가능하게 할 수 있다. The chromatography medium can also be multifunctional or modified to be multifunctional to enable covalent bonding with the capture.

상기와 같은 성질을 갖는 크로마토그래피 매질은, 예를 들면, S&S 사의 AE98, AE99 및 AE100, Millipore 사의 HF090, HF120, HF135, HF180 및 HF240 및 Sartorius사의 CN90, CN140 및 CN200 등이 있다. 이중 바람직한 크로마토그래피 매질은 CN90 막(제조사 Satorius)이다. CN90 막은 증류수가 매질을 타고 일정 거리를 오르는데 걸리는 유속의 변화 폭이 ± 3초로서 작기 때문에 재현성이 뛰어나며, 매질의 단위면적(㎠)당 리간드가 결합할 수 있는 결합능이 10 내지 30㎍ 정도로 높은 편은 아니지만 형광 표지물질의 증폭이 뛰어난 탓에 그 정도의 결합능으로도 충분하다.Chromatographic media having such properties include, for example, AE98, AE99 and AE100 from S & S, HF090, HF120, HF135, HF180 and HF240 from Millipore, and CN90, CN140 and CN200 from Sartorius. A preferred chromatographic medium is the CN90 membrane (Satorius, manufacturer). The CN90 membrane has excellent reproducibility because the change rate of the flow rate of distilled water to reach a certain distance in the medium is ± 3 seconds, and it is excellent in reproducibility, and the binding capacity of the ligand per unit area (cm2) of the medium is as high as 10 to 30µg. It is not a side, but because of the excellent amplification of the fluorescent label, the binding capacity is enough.

크로마토그래피 매질 상에는 당화헤모글로빈 측정을 위하여 항체나 HbA1c 항원이 포획자로서 특정 위치(항원분석물 측정지역)에 분주되어 있으며, 따라서 상기 위치에서 발생하는 형광의 양을 레이저 유발 표면형광 검출 장치에 의해 측정함으로써 당화헤모글로빈을 정량할 수 있다.On the chromatography medium, antibodies or HbA1c antigens are collected at specific locations (antigen analyte measurement sites) as capturers for glycated hemoglobin measurement, and thus the amount of fluorescence generated at these locations is measured by a laser-induced surface fluorescence detection device. Thus, glycated hemoglobin can be quantified.

흡수 패드(Absorbent pad ( absorptionabsorption padpad ))

측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드가 부착된 말단과 반대 방향의 말단에는 크로마토그래피 매질의 일부와 적층되어 흡수 패드(105)가 위치하고 있다. At the end opposite to the end to which the sample pad of the lateral flow assay strip is attached, an absorbent pad 105 is positioned, stacked with a portion of the chromatography medium.

흡수 패드는 모세관 작용에 의헤 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 온 시료를 물리적으로 흡수하고 미반응 물질을 제거하기 위한 수단이다. 즉, 흡수 패드는 측방 유동 검정 스트립의 말단에 위치하면서 크로마토그래피 매질을 따라 이동해 오는 시료 및 시약의 속도를 조절 및 촉진하고 이를 담아두는 펌프 또는 저장소로서 작용한다. 시료 및 시약의 이동 속도는 흡수 패드의 질 및 크기에 따라 다를 수 있으며, 보통 사용되는 흡수 패드는 셀룰로즈 여과지, 부직물, 천 또는 셀룰로즈 아세테이트와 같은 물-흡수 재질로부터 형성된 것들이다. Absorption pads are a means for physically absorbing and removing unreacted samples that have migrated along the chromatography medium by capillary action. In other words, the absorbent pad acts as a pump or reservoir that is located at the end of the lateral flow assay strip and regulates and promotes and holds the rate of the sample and reagent traveling along the chromatography medium. The rate of movement of the samples and reagents may vary depending on the quality and size of the absorbent pad, and the absorbent pads commonly used are those formed from water-absorbing materials such as cellulose filter paper, nonwovens, cloth or cellulose acetate.

도 2는 본 발명에 의한 따른 일체형 정량 검정 시스템의 모식도이다. 본 발명에 따른 일체형 정량 검정 시스템은 상술한 측방 유동 검정 스트립(100), 레이저 유발 표면형광 검출 장치(200), LED 검출 장치(300) 및 구동장치를 포함한다. 또한 본 발명에 따른 일체형 정량 검정 시스템에 사용되는 레이저 유발 표면형광 검출 장치(200) 및 LED 검출 장치(300)의 모식도를 각각 도 3-A 와 도 3-B에 나타내었다. 이하, 상기 일체형 정량 검정 시스템을 구성하는 레이저-유발 표면형광 검출 장치 및 LED 검출 장치에 대해 자세히 설명한다.2 is a schematic diagram of an integrated quantitative assay system according to the present invention. The integrated quantitative assay system according to the present invention includes the above-described lateral flow assay strip 100, the laser-induced surface fluorescence detection device 200, the LED detection device 300 and the driving device. Also, schematic diagrams of the laser-induced surface fluorescence detection device 200 and the LED detection device 300 used in the integrated quantitative assay system according to the present invention are shown in FIGS. 3-A and 3-B, respectively. Hereinafter, the laser-induced surface fluorescence detection device and the LED detection device constituting the integrated quantitative assay system will be described in detail.

레이저-유발 Laser-induced 표면형광Surface fluorescence 검출 장치 Detection device

레이저-유발 표면형광 검출 장치(도 3-A)는 레이저(201), 레이저빔 형상제어용 렌즈(202), 여기필터, 포집렌즈(203), 형광필터(204), 집광렌즈(205), 공간필터(206), 광검출기(207), 아날로그디지털 컨버터(ADC) 및 중앙처리장치(CPU)를 포함한다. 레이져 유발 표면형광 검출 장치는 본원 출원인에 의한 등록특허 10-0639776에서 사용된 레이져 유발 표면형광 검출 장치와 동일한 것을 사용할 수 있다. 레이져 유발 표면형광 검출 장치는, 점광원 또는 선형으로 가공된 레이져 광원의 빛이 여기 필터를 통과한 뒤 시료에 입사되고, 이 위치에서 시료 중 타겟 물질에 부착된 염료에 의해 형광을 발광하면, 포집렌즈, 형광필터 및 집광렌즈에 의해 공간필터의 중심으로 집속되어 광검출기 도달하게 되며, 도달된 신호는 아날로그 디지털 컨버터(ADC) 및 중앙처리장치(CPU)에 의해 환산되어 출력된다. The laser-induced surface fluorescence detection device (FIG. 3-A) includes a laser 201, a laser beam shape control lens 202, an excitation filter, a collecting lens 203, a fluorescent filter 204, a condenser lens 205, and a space. Filter 206, photodetector 207, analog-to-digital converter (ADC) and central processing unit (CPU). The laser-induced surface fluorescence detection device may be the same as the laser-induced surface fluorescence detection device used in the patent 10-0639776 by the applicant. The laser-induced surface fluorescence detection device collects when light from a point light source or a linearly processed laser light source passes through an excitation filter and then enters a sample, and emits fluorescence by a dye attached to a target material in the sample at this position. The lens, the fluorescence filter and the condenser lens are focused to the center of the spatial filter to reach the photodetector, and the received signal is converted and output by the analog-to-digital converter (ADC) and the central processing unit (CPU).

레이저 유발 표면형광 검출 장치는 항원분석물, 즉, 바람직하게 혈액 중 당화헤모글로빈의 정량에 사용된다. 광원인 레이저와 항원분석물과 특이적으로 결합하는 탐지자의 표면에 표지된 물질이 반응하여 생성되는 형광을 광학계에 의하여 포집하여 디텍터(detector)에서 정량화한다. 즉, 액체 시료를 투하한 후 일정 시간이 지나 면역반응이 끝나면 구동장치에 의해 스트립이 일정한 속도로 광원방향으로 이동하며, 이 스캐닝 과정에서 레이저에 의하여 생성되는 형광을 디텍터에 의하여 측정한다. 바람직하게는 스트립이 이동함에 따라 항원분석물 측정지역에서 발생하는 신호를 수회 포집하여 정량화한다.Laser-induced surface fluorescence detection devices are used for the determination of antigen analytes, ie glycated hemoglobin in the blood. Fluorescence generated by the reaction of a labeled substance on the surface of a detector that specifically binds to a laser as a light source and an antigen analyte is captured by an optical system and quantified by a detector. That is, after a certain time passes after the liquid sample is dropped, the strip is moved toward the light source at a constant speed by the driving device, and the fluorescence generated by the laser is measured by the detector during this scanning process. Preferably, as the strip moves, the signals generated at the antigen analyte measurement zone are collected and quantified several times.

LEDLED 검출 장치 Detection device

분석물 내의 총헤모글로빈 양을 광학적으로 측정하기 위해 본 발명에서는 LED 검출장치(도 3-B)를 사용한다. 면역반응에 관여하는 형광물질과 달리, 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈은 원래 적색을 띄므로 녹색 LED(green-LED)를 광원으로 사용한다. 즉, 필요한 광원은 458 내지 612 ㎚의 가우시안 형태의 스펙트럼을 가지고 있는 green-LED이며, 액체 시료가 적하된 구획 또는 크로마토그래피 매질 상의 색소분석물 측정지역(107)에서 반사되는 빛의 양을 실리콘 다이오드로 측정하도록 광학계를 디자인한다. 형광을 측정하는 방식과 유사하게 스캐닝 방식을 사용하며, 광원을 조사하여 반사되는 전체 광량을 단시간 내에 측정한다. In order to optically measure the total hemoglobin amount in the analyte, the present invention uses an LED detector (FIG. 3-B). Unlike fluorescent materials involved in the immune response, hemoglobin and glycated hemoglobin are originally red, so green LEDs are used as light sources. That is, the required light source is a green-LED having a Gaussian form spectrum of 458 to 612 nm, and the amount of light reflected from the pigment analyte measurement zone 107 on the compartment in which the liquid sample is loaded or on the chromatography medium is measured. Design the optics to measure with. Similar to the method of measuring fluorescence, a scanning method is used, and a total amount of light reflected by irradiating a light source is measured within a short time.

상기 설명한 바와 같은 본 발명에 따른 측방 유동 검정 시스템을 이용하여 시료 중 항원분석물을 정량하는 방법을 역시 도면을 참조하여 보다 자세히 설명한다.The method of quantifying antigen analytes in a sample using the lateral flow assay system according to the present invention as described above will also be described in more detail with reference to the drawings.

도 1은 본 발명에 따른 측방 유동 정량 검정에 사용되는 스트립의 모식도를 나타낸다. 본 발명에 따른 항원분석물의 정량은 액체 시료를 본 발명에 따른 스트립에 적하함으로써 시작된다. 액체 시료는 샘플 패드(102)에, 바람직하게는 샘플투입구(109)를 통해 적하된다. 시료가 샘플 패드로 적하되면 모세관현상에 의해서 이 동하게 되고, 그 이동 속도는 흡수 패드의 재질, 크기 등에 영향을 받을 수 있다. 1 shows a schematic diagram of a strip for use in lateral flow quantitative assay according to the present invention. Quantification of the antigenic analyte according to the present invention begins by dropping a liquid sample onto the strip according to the present invention. The liquid sample is dropped into the sample pad 102, preferably through the sample inlet 109. When the sample is dropped into the sample pad, the sample is moved by capillary phenomenon, and the moving speed may be influenced by the material and size of the absorbent pad.

이때 시료의 적하 전 또는 이동 중에 시료에 일정량의 탐지자가 도입되면 제 1면역반응이 일어나 결합체를 형성하게 되는데, 그 방식은 전술한바와 같이 두 가지이다. 첫 번째 방식은, 액체 시료를 검체로부터 채취한 후, 정량을 실시하기 전에 시료에 직접 일정량의 표지된 탐지자를 첨가하고, 이에 따라 액체 시료중의 항원분석물과 탐지자의 제 1의 면역 반응을 마친 액체 시료를 스트립에 적하하는 것이다. 이와 대체적으로 사용될 수 있는 두 번째 방식은, 미리 형광물질 표지된 탐지자를 결합체 방출 패드(103)에 흡착시켜 제조한 결합체 방출 패드를 포함하는 스트립에 액체시료를 적하하는 것이다. 이때 탐지자는 결합체 방출 패드 상에 흡착되어 있으나, 시료가 적하되어 결합체 방출 패드로 유입되면 용매 또는 액체시료에 용해 및/또는 혼합되어 항원분석물과 제 1의 면역반응이 일어나게 된다. 상기 방식 어느 것이나 이용될 수 있으나, 여러 종류의 탐지자를 적용하여 분석하는 것이 쉬울 뿐 아니라 총헤모글로빈 측정도 용이하기 때문에 첫 번째 방식이 바람직하다. At this time, if a certain amount of detector is introduced into the sample before or during the dropping of the sample, a first immune reaction occurs to form a conjugate, as described above. The first method involves taking a liquid sample from a sample and adding a certain amount of labeled detector directly to the sample prior to quantification, thus completing the first immune response of the antigen analyte and detector in the liquid sample. The liquid sample is added to the strip. A second way that can be used alternatively is to drop a liquid sample onto a strip comprising the conjugated release pad prepared by adsorbing a fluorescently labeled detector on the conjugated release pad 103 in advance. In this case, the detector is adsorbed on the binder release pad, but when the sample is dropped and introduced into the binder release pad, the detector is dissolved and / or mixed in a solvent or a liquid sample to generate a first immune reaction with the antigen analyte. Any of the above methods can be used, but the first method is preferred because it is easy to analyze by applying various types of detectors and the total hemoglobin measurement is easy.

탐지자는 액체 시료 중 다른 색소분석물에는 결합하지 않으나 항원분석물인 당화헤모글로빈에 특이적으로 결합하는 항체로서, 본원 출원일 전에 공지된 다양한 방법에 따라 제조될 수 있다. 바람직하게는, 마우스 단일클론항체를 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 탐지자는 상술한 시료에의 도입 방식과 무관하게, 신호 발생원인이 되는 형광물질로 표지된 것을 사용하는 것이 바람직하다. The detector is an antibody that does not bind to other pigment analytes in a liquid sample but specifically binds to an analyte glycated hemoglobin, and may be prepared according to various methods known before the filing date of the present application. Preferably, mouse monoclonal antibodies may be used, but are not limited thereto. In addition, it is preferable that the detector uses a label labeled with a fluorescent substance that causes signal generation, regardless of the introduction method to the sample described above.

상기 제 1 면역반응의 결과, 형광물질 표지된 탐지자-항원분석물 결합체가 형성되어 크로마토그래피 매질(104)을 따라 이동하며, 항원분석물과 결합하지 못한 탐지자는 단독체로서 스트립을 따라 이동하여 항원분석물 측정지역(106)에 도달하게 된다. As a result of the first immune response, a fluorescently labeled detector-antigen analyte conjugate is formed and moves along the chromatographic medium 104, and the detector that fails to bind the analyte is moved along the strip as a single entity. The analyte measurement region 106 is reached.

항원분석물 측정지역은 시료 적하지점인 샘플 패드로 부터 일정한 거리에 위치하고 있으며, 일정량의 포획자가 고정되어 있다. 상기 포획자는 당화헤모글로빈 이거나 또는 상기 탐지자를 인식할 수 있는 화합물로서, 항원분석물 측정지역에 고정되어 있기 때문에 액체시료가 스트립을 따라 전개되어도 시료를 따라 같이 이동하지 않는다. 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단독체를 포함하는 시료가 포획자가 고정된 지역에 도달하면 탐지자, 탐지자-항원분석물 결합체 및 포획자 사이에서 경쟁적으로 제 2 면역반응이 일어나며, 레이저 유발 표면형광 검출 장치는 상기 포획자가 고정된 지역(항원분석물 측정지역)에서 형광물질 표지된 탐지자-포획자 결합체에 의해 발생한 신호를 수집한다. The antigen analyte measurement zone is located at a fixed distance from the sample pad, which is the loading point of the sample, and a fixed amount of capture is fixed. The trapping agent is a glycated hemoglobin or a compound capable of recognizing the detector and is fixed in the antigen analyte measurement zone so that the liquid sample does not move along the sample even when it is developed along the strip. When a sample comprising the detector-antigen analyte conjugate and / or the detector alone reaches a fixed region of the capturer, a second immune response occurs competitively between the detector, the detector-antigen analyte conjugate and the capturer The laser-induced surface fluorescence detection device is characterized by a fluorophore-labeled detector-capture combination in a fixed region (antigen analyte measurement zone). Collect the signal that occurred.

또한 시료는 계속 스트립을 따라 이동하면서 색소분석물 측정지역(107)을 통과한다. 색소분석물 측정지역은 특정되어 있는 것이 아니고 포획자가 고정된 지역이 아니라면 스트립상의 어느 위치든지 될 수 있으며, 바람직하게는 샘플 패드 또는 스트립 하우징(110)에 형성된 검사창(108)을 통해 노출된 스트립의 특정 부분 일 수 있다. 색소분석물 측정지역에서는 헤모글로빈의 적색에 반응하는 LED에 의해서 총헤모글로빈의 양이 측정된다. 그리고나서, 항원분석물 측정지역 및 색소분석물 측정지역을 통과한 시료는 흡수 패드(150)에 저장된다. The sample also passes through the pigment analyte measurement zone 107 as it continues to move along the strip. The pigment analyte measurement zone may be anywhere on the strip unless the trap is fixed and the capturer is a fixed zone, preferably exposed through an inspection window 108 formed in the sample pad or strip housing 110. It can be a specific part of. In the pigment analyte measurement zone, total hemoglobin levels are measured by LEDs reacting to the red color of hemoglobin. Then, the sample passing through the antigen analyte measurement zone and the dye analyte measurement zone is stored in the absorption pad 150.

항원분석물의 정량을 위해서는 헤모글로빈 및 당화헤모글로빈의 표준곡선의 작성이 필요한데, 이는 농도가 확인된 전혈(whole blood) 검체를 사용하며, 이때 농도는 당해 기술분야에 알려진 다양한 방법에 의해 측정할 수 있다. 준비된 전혈 검체를 본 발명에 따른 스트립에 적하하여 레이저유발 표면형광 검출 장치에 의해서 형광을 측정하여 표준곡선을 작성한다. The quantification of antigenic analytes requires the preparation of standard curves of hemoglobin and glycated hemoglobin, which use whole blood samples with confirmed concentrations, which concentrations can be determined by various methods known in the art. The prepared whole blood sample is dropped on the strip according to the present invention, and fluorescence is measured by a laser-induced surface fluorescence detection device to prepare a standard curve.

본 발명은 이하 실시예를 통해서 보다 구체적으로 설명될 것이다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 단지 예시하는 것으로 이해되어야하며, 본 발명이 이들 실시예로 한정되어서는 안된다.The invention will be explained in more detail through the following examples. However, these examples should be understood as merely illustrative of the present invention, and the present invention should not be limited to these examples.

실시예 1 : 단백질-형광물질 결합체 제조Example 1 Preparation of Protein-Fluorescent Conjugates

측정하고자 하는 항원분석물인 당화헤모글로빈(HbA1c)에 대한 마우스 단일클론 항체에 신호 발생원인 형광물질을 다음과 같은 방법으로 중합하였다. 형광물질을 부착할 단백질은 95% 이상의 고순도로 정제된 것을 사용하였으며, 농도는 1mg/ml 이상의 농도가 좋은 결합비율을 보여 주었다. 형광물질과의 반응을 용이하게 하기 위하여 정제된 단백질을 암모니아나 아민이온이 들어 있지 않은 완충용액(0.1M 중탄산나트륨, pH 8.5)으로 4℃ 냉장실에서 12 내지 24시간 동안 투석하였다. 투석된 단백질은 사용하기 전까지 영하 20℃이하 냉동고에 보관하였다. 완충용액에서 투석된 단백질에 분말로 된 Alexa 647 형광물질(Molecular Probes, USA)을 직접 첨가하여 천천히 섞어 준 후 4℃ 냉장고에서 1 내지 2시간 동안 교반기를 사용하여 반응시켰다. In the mouse monoclonal antibody against glycosylated hemoglobin (HbA1c), the antigen analyte to be measured, a fluorescent material as a signal source was polymerized in the following manner. The protein to be attached to the fluorescent material was purified to a high purity of 95% or more, the concentration was 1 mg / ml or more showed a good binding ratio. In order to facilitate the reaction with the fluorescent material, the purified protein was dialyzed with a buffer solution containing no ammonia or amine ion (0.1 M sodium bicarbonate, pH 8.5) in a 4 ° C. cold room for 12 to 24 hours. The dialyzed protein was stored in freezer below 20 ° C until use. Alexa 647 fluorescent material (Molecular Probes, USA) as a powder was added directly to the dialyzed protein in the buffer, and the mixture was slowly mixed, followed by reaction using a stirrer for 1 to 2 hours in a 4 ° C. refrigerator.

실시예 2 : 단백질-형광물질 결합체의 정제Example 2 Purification of Protein-Fluorescent Conjugates

세파덱스(Sephadex) G-25를 충전한 분배 컬럼을 사용하여 단백질/형광물질 중합체와 반응하지 않고 남아있는 여분의 형광물질을 제거하였으며, 정제 완충용액은 0.1M 중탄산나트륨(pH 8.5)를 사용하였다. 정제된 단백질/형광물질 중합체는 사용하기 전까지 냉장 또는 영하 20℃이하 냉동고에 보관하였다.A distribution column packed with Sephadex G-25 was used to remove excess fluorescent material that did not react with the protein / fluorescent polymer, and 0.1 M sodium bicarbonate (pH 8.5) was used as the purification buffer. . Purified protein / phosphor polymer was stored refrigerated or in a freezer below 20 ° C. until use.

실시예 3 : Example 3: 니트로셀룰로스Nitrocellulose 막에  At the curtain 포획자의Captive 고정 fixing

주사기 펌프에 연결된 미세 분주기(Biodot Dispenser)를 이용하여 포획자인 HbA1c를 가는 선의 형태로 농도와 분주량을 달리하여 니트로셀룰로스 막위에 분주하였다. 분주한 이후에 온도 25℃, 습도 35~50%로 유지되는 제습 장치 안에서 2시간 동안 분주된 단백질을 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 1% 수크로즈, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다. 위의 안정액 성분중에서 BSA는 젤라틴으로 트윈 20은 트리톤 X-100으로 수크로즈는 트레할로즈(trehalose)로 PVA(폴리비닐알코올)는 PEG 또는 PVP(폴리비닐피롤리돈)로 각각 대체하여 사용할 수도 있다. 처리된 막 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 건조된 막은 마찬가지로 25℃, RH 35 내지 50%가 유지되는 보관용기 안에서 사용 전까지 보관하였다.Using a Biodot Dispenser connected to a syringe pump, the capture HbA1c was dispensed on the nitrocellulose membrane with different concentrations and doses in the form of thin lines. After dispensing, the dispensed protein was immobilized for 2 hours in a dehumidifying apparatus maintained at a temperature of 25 ° C. and a humidity of 35 to 50%. In order to stabilize the protein and prevent nonspecific reactions between the reactants, the dispensed membrane was treated with a stabilizer (mixture of 1% BSA, 0.05% Tween 20, 1% sucrose, 0.1% PVA) and allowed to equilibrate for 5 minutes. Among these stabilizers, BSA can be used by replacing gelatin, Tween 20 with Triton X-100, sucrose with trehalose, PVA (polyvinyl alcohol) with PEG or PVP (polyvinylpyrrolidone), respectively. have. Excess solution of the treated membrane surface was removed and dried at 40 ° C. for 30 minutes. The dried membrane was likewise stored until use in a container maintained at 25 ° C., RH 35-50%.

실시예 4 : 샘플 패드의 전처리Example 4 Pretreatment of Sample Pads

니트로셀룰로스 막을 통한 용액 성분들의 이동을 용이하게 하며, 또한 반응의 감도를 유지하고 단백질/형광물질 중합체와 시료 사이의 비특이적 반응에 의한 시험결과의 오류를 막기 위하여 샘플 패드를 전처리 하였다. The sample pads were pretreated to facilitate the migration of solution components through the nitrocellulose membrane and to maintain the sensitivity of the reaction and to avoid errors in the test results due to nonspecific reactions between the protein / fluorescent polymer and the sample.

샘플 패드(2.5 × 30 cm)를 1ml의 전처리 용액(20mM 트리스-Cl, 0.1% 트리톤 X-100, 0.05% NaN3, pH 8.5)에 충분히 적셔 10분간 평형화시켰다. 전혈을 시료로 사용할 경우에는 다른 전처리 용액(PBS, 10mM 포스페이트, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.05% NaN3, pH 7.4)을 사용하여 적혈구 용혈현상을 방지하였다. 이어 샘플 패드의 과도한 용액을 제거하고 열에 의한 샘플 패드의 변형을 막기 위해 50℃ 내지 60℃의 온도에서 1시간 동안 진공 건조하였다. 단백질/형광물질 결합체의 변성을 최소화하기 위하여 동결건조방법을 택하였다. 준비된 패드는 위의 막과 동일한 조건의 보관용기에서 사용하기 전까지 보관하였다.The sample pad (2.5 × 30 cm) was sufficiently wetted in 1 ml of pretreatment solution (20 mM Tris-Cl, 0.1% Triton X-100, 0.05% NaN 3, pH 8.5) and allowed to equilibrate for 10 minutes. When whole blood was used as a sample, other pretreatment solutions (PBS, 10 mM phosphate, 150 mM NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, 0.05% NaN3, pH 7.4) were used to prevent erythrocyte hemolysis. The excess solution of the sample pad was then removed and vacuum dried for 1 hour at a temperature of 50 ° C. to 60 ° C. to prevent deformation of the sample pad by heat. The lyophilization method was chosen to minimize denaturation of the protein / fluorescent conjugate. The prepared pads were stored until use in storage containers under the same conditions as the membrane above.

실시예 5 : Example 5: 당화헤모글로빈Glycated hemoglobin 측정용 형광 면역  Fluorescence Immunity for Measurement 크로마토그라피Chromatography 스트립의 제조 Manufacture of strips

나이트로셀루로즈 막(NC 막)과 샘플 패드, 흡수 패드, 지지대를 460mm의 크기의 스트립을 1회용 카세트에 조립하였다. 포획자인 휴먼 당화헤모글로빈 2mg/ml을 분주기(Bio Dot dispenser)를 사용하여 0.88ul/cm의 양으로 선의 폭을 0.8mm가 되도록 NC 막 위에 분주한 후, RH 35~50%에서 2시간 동안 고정화하였다. 이어 단백질의 안정화와 반응물 사이의 비특이적 반응을 막기 위해 분주된 막을 안정액(1% BSA, 0.05% 트윈 20, 0.1% PVA의 혼합액)에 처리하여 5분 동안 평형화시켰다(위의 안정액 성분 중 BSA는 젤라틴으로, 트윈 20은 트리톤 X-100으로, 수크로즈는 트레할로즈로, PVA는 PEG 나 PVP로 각각 대체하여 사용할 수도 있다). 처리된 막은 표면의 과도한 용액을 제거하고 40℃에서 30분 동안 건조하였다. 시험에 사용할 막은 샘플 패드와 흡수 패드 등을 포개어 붙인 후 절단기를 사용하여 4mm 폭으로 잘라 최종 스트립의 크기가 4 × 60mm이 되도록 하였다. A nitrocellulose membrane (NC membrane), sample pads, absorbent pads and supports were assembled into disposable cassettes of 460 mm in size. 2 mg / ml of human glycosylated hemoglobin, a trapper, was dispensed on the NC membrane in an amount of 0.88 ul / cm using a Bio Dot dispenser, and then immobilized at RH 35-50% for 2 hours. It was. The dispensed membrane was then equilibrated for 5 minutes by treatment with a stabilized solution (a mixture of 1% BSA, 0.05% Tween 20, 0.1% PVA) to stabilize the protein and prevent nonspecific reactions between the reactants (BSA in the above stabilizer component gelatin Tween 20 may be replaced by Triton X-100, sucrose by trehalose, and PVA by PEG or PVP respectively). The treated membrane was removed from excess solution on the surface and dried at 40 ° C. for 30 minutes. The membrane to be used for the test was laminated with a sample pad and an absorption pad, and then cut into 4 mm widths using a cutter so that the size of the final strip was 4 × 60 mm.

NC막 상에 내부 표준 기능으로서 streptavidin(3g/L)의 대조선을 미세분주기(Bio-Dot, Irvine, CA, USA)를 사용하여 두께 1mm에 1㎕/cm 의 양으로 분주하였다. 제조된 스트립은 형광측정장치(laser-fluorescence scanner)의 투입구(holder)에 맞게 제작된 1회용 카세트(16x90 mm)에 조립하여 제습실에서 제습상태로 포장한 후 사용하기 전까지 실온에서 보관하였다. A control line of streptavidin (3 g / L) was dispensed on the NC membrane in an amount of 1 μl / cm at a thickness of 1 mm using a microdispenser (Bio-Dot, Irvine, CA, USA). The prepared strip was assembled into a disposable cassette (16x90 mm) made to fit the holder of a fluorescence scanner (laser-fluorescence scanner), packaged in a dehumidification state in a dehumidification room, and stored at room temperature until use.

실시예 6 : 탐지자 완충용액의 준비Example 6 Preparation of Detector Buffer

기존의 측방 유동 크로마토그라피법에서 사용되는 방식인 탐지자를 결합체 방출 패드에 고정하는 방식 대신 액체 상태로 새로운 튜브에 보관하여 사용하였다. 이는 채취한 혈액의 양이 5㎕에 불과해 전개막 위해서 이동을 유발하기에는 모자라는 부피여서 첨가해야 할 완충용액이 필요하여 이 방식을 활용하였다. 사용된 완충용액으로는 1% BSA가 첨가된 PBS를 사용하였다.Instead of fixing the detector to the binder release pad, which is the method used in the conventional lateral flow chromatography, it was stored and used in a new tube in a liquid state. This is because the amount of blood collected is only 5µl, which is insufficient to cause migration for the developing membrane. As the buffer used, PBS with 1% BSA was used.

실시예 7 : 적혈구 용혈 용액의 제조Example 7 Preparation of Red Blood Cell Hemolysis Solution

10mM Kpi 용액 1L에 포타슘페리시아나이드 50g을 녹인 후 적혈구 용혈을 위 하여 디지토닌을 100mg을 첨가 하여 pH 7.4의 용액을 제조하였다. 제조된 용액을 0.45um 멤브래인 필터를 사용하여 멸균하였으며 사용하기 전까지 냉암소에 보관하였다.A solution of pH 7.4 was prepared by dissolving 50 g of potassium ferricyanide in 1 L of 10 mM Kpi solution, and then adding 100 mg of digitotonin for red blood cell hemolysis. The prepared solution was sterilized using a 0.45um membrane filter and stored in a cool dark place until use.

실시 예 8 : Example 8: LEDLED 검출 시스템을 이용한 헤모글로빈의 표준곡선 작성 Standard Curve Generation of Hemoglobin Using Detection System

헤모글로빈 측정을 위한 표준 물질로는 기존의 헤모글로빈 생화학 측정법으로 농도가 확인된 전혈 검체를 사용하였다. 준비된 용액을 당화헤모글로빈 측정용 스트립에 첨가하여 당화헤모글로빈과 헤모글로빈을 동시에　측정할 수 있도록 제작된 기기에서 헤모글로빈 값을 측정하여 표준 곡선을 작성하였다. 실리콘 다이오드에 의하여 측정된 헤모글로빈 농도는 기존의 생화학 측정법과 비교하였더니 완전히 일치함을 확인할 수 있었다. 농도 의존적인 실험 결과를 도 4에 나타내었다. 측정된 농도값은 기존 방법과 상관도에서 R2 값이 0.98이상으로 거의 완벽하게 일치함을 알 수 있었고 재현성을 보여 주는 CV% 값이 3% 이내로 매우 신뢰성이 높은 방법을 한 번 더 확인해 주었다. As a standard material for measuring hemoglobin, whole blood samples whose concentrations were confirmed by conventional hemoglobin biochemical assays were used. The prepared solution was added to the glycosylated hemoglobin measuring strip to measure the hemoglobin value in a device designed to simultaneously measure the glycated hemoglobin and hemoglobin to prepare a standard curve. The hemoglobin concentration measured by the silicon diode was found to be in perfect agreement with the conventional biochemical measurements. Concentration dependent experimental results are shown in FIG. 4. It was found that the measured concentration was almost completely consistent with the R2 value of 0.98 or more in the correlation with the existing method, and once again the highly reliable method with CV% of reproducibility within 3% was confirmed.

실시 예 9 : Example 9: 면역크로마토그라피Immunochromatography 방법을 이용한  Method 당화헤모글로빈Glycated hemoglobin 표준곡선 작성 Create Standard Curve

당화헤모글로빈 검출 용액은 BSA-biotin 접합체(0.1g/L)와 anti-HbA1c 항체(4ug/ml)로 만들었으며, 당화헤모글로빈 0.25, 0.5, 1, 2 mg/ml 각각을 검출용액과 1:1 비율로 혼합한 후 준비된 카세트의 샘플 투입구에 75㎕를 적하하였다. 혼합 용액이 적하된 카드리지는 실온에서 12분간 반응시킨 후 형광 검출기를 사용하여 형광의 양을 측정하였다. 스트립의 검사선과 대조선에서 측정된 결과를 준비된 프로그램을 사용하여 면적 값(검사선: AT, 대조선: AC)으로 전환 한 다음 AT/AC의 면적 비를 사용하여 측정된 항원들의 농도로 계산한 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 따르면 당화헤모글로빈의 농도에 따른 면적값이 농도의존적으로 비례하였고 이 표준곡선을 사용하여 HbA1c%값을 알아내었다. 시험결과 HbA1c의 농도와 상관성이 R값이 0.99로 아주 높았으며 CV% 값도 5% 정도로 낮았다.The glycosylated hemoglobin detection solution was made of BSA-biotin conjugate (0.1 g / L) and anti-HbA1c antibody (4 ug / ml). After mixing, 75 μl was added dropwise to the sample inlet of the prepared cassette. The cartridge loaded with the mixed solution was reacted for 12 minutes at room temperature, and then the amount of fluorescence was measured using a fluorescence detector. The results measured at the test and control lines of the strip are converted to area values (test line: A T , control line: A C ) using the prepared program and then to the concentration of antigens measured using the area ratio of A T / A C. The calculated result is shown in FIG. According to FIG. 5, the area value according to the concentration of glycated hemoglobin was proportionally dependent on the concentration, and the HbA1c% value was determined using this standard curve. The correlation between HbA1c concentration and Rb value was 0.99 and CV% value was as low as 5%.

실시예 10 : 기존 Example 10: Existing HbA1cHbA1c 측정장치와의 실 검체 비교시험  Real sample comparison test with measuring device

HPLC 측정 방법인 Bio-Rad Variant II 장비로 당화헤모글로빈 값을 확인 한 다음 본 발명에서 준비된 당화헤모글로빈 측정 시스템을 사용하여 실 검체를 측정하여 그 측정 값을 비교하였다. 결과치를 비교한 자료를 도 6에 나타내었다. 본 발명에서 사용한 면역분석법과 HPLC법은 원리적으로는 전혀 다른 방법이지만 상관도 R값은 0.96으로 두 방법이 매우 비슷한 결과를 보여 주었다. After confirming the glycated hemoglobin value with the Bio-Rad Variant II instrument, which is an HPLC measurement method, the actual sample was measured using the glycated hemoglobin measurement system prepared in the present invention, and the measured values were compared. Data comparing the results are shown in FIG. 6. The immunoassay and HPLC method used in the present invention were completely different in principle, but the correlation R value was 0.96, which showed very similar results.

도 1은 본 발명에 따라 혈중 헤모글로빈을 정량하기 위한 일체형 정량 시스템의 모식도이다.1 is a schematic diagram of an integrated quantitation system for quantifying hemoglobin in blood according to the present invention.

도 2는 본 발명에 따른 측방 유동 정량 검정 스트립의 모식도이다.2 is a schematic diagram of a lateral flow quantitative assay strip according to the present invention.

도 3A는 레이져 유발 표면 형광장치를 이용한 당화헤모글로빈 측정용 광학계의 모식도이고, 도 3B는 LED를 이용한 총 헤모글로빈 측정용 광학계의 모식도이다.3A is a schematic diagram of an optical system for measuring glycated hemoglobin using a laser-induced surface fluorescent apparatus, and FIG. 3B is a schematic diagram of an optical system for measuring total hemoglobin using an LED.

도 4는 LED 측정 시스템을 이용한 헤모글로빈 표준곡선이다.4 is a hemoglobin standard curve using the LED measurement system.

도 5는 당화헤모글로빈의 표준곡선이다.5 is a standard curve of glycated hemoglobin.

도 6은 기존의 대형 장비와 본 발명에 따른 정량 시스템의 성능을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.6 is a graph showing the results of comparing the performance of the conventional large equipment and the quantification system according to the present invention.

※ 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명※ Explanation of code for main part of drawing

100 : 측방 유동 정량 스트립 101 : 지지대 100: lateral flow metering strip 101: support

102 : 샘플 패드 103 : 결합체 방출 패드102: sample pad 103: conjugate release pad

104 : 크로마토그래피 매질 105 : 흡수 패드 104: chromatography medium 105: absorption pad

106: 항원분석물 측정지역 107 : 색소분석물 측정지역106: antigen analyte measurement area 107: pigment analyte measurement area

108 : 검사창(window) 109 : 샘플 투입구108: inspection window (109): sample inlet

110: 스트립 하우징110: strip housing

200 : 레이저-유발 표면 형광 검출장치 201 : 레이저 200: laser-induced surface fluorescence detection device 201: laser

202 : 레이저빔 형상 제어용 렌즈 203 : 포집렌즈 202: lens for controlling the laser beam shape 203: collecting lens

204 : 형광필터 205 : 집광렌즈 204 fluorescence filter 205 condensing lens

206 : 공간필터 207 : 광검출기206: space filter 207: photodetector

300 : LED 검출장치 301 : LED 광원 300: LED detection device 301: LED light source

302 : 구경(aperture) 303 : 포토 디텍터302: aperture 303: photo detector

Claims (18)

지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 흡수 패드(absorption pad)를 포함하는 측방 유동 검정 스트립으로서, A lateral flow assay strip comprising a baking card, a sample pad, a chromatography medium, and an absorption pad, wherein 상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 서로 겹치지 않도록 샘플 패드와 흡수 패드가 접착되어 있고; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 그 위에는 상기 샘플 패드로부터 일정한 거리를 두고 시료 내의 분석물 중 하나와 실질적으로 동일한 성분으로 이루어져 시료 내의 분석물과 항원-항체 반응으로 결합하는 물질과 경쟁적 면역반응에 의해 결합하는 물질인 포획자가 분주 고정되어 있으며; 상기 포획자는 당화헤모글로빈인 것을 특징으로 하는 측방 유동 검정 스트립.The support supports the entire constituent of the strip, the sample pad and the absorbent pad being adhered to both ends thereof so as not to overlap each other; The sample pad has an end in the direction in which the absorbent pad is adhered to one end of the chromatography medium, and the sample to be analyzed is first loaded thereon; The other end of the chromatography medium is superimposed on the absorbent pad, on which a certain distance from the sample pad consists of components that are substantially the same as one of the analytes in the sample to bind in an antigen-antibody reaction with the analyte in the sample. The trapping agent, which is a substance that binds to the substance by a competitive immune response, is fixed in a fixed amount; Said trap is glycosylated hemoglobin. 제1항에 있어서, 한쪽 말단은 샘플 패드와 겹쳐지고 다른 쪽 말단은 크로마토그래피 매질에 겹쳐지며, 분석물 중 하나와 항원-항체반응에의해 선택적으로 결합할 수 있는 물질인 탐지자가 흡착된 결합체 방출 패드(conjugate release pad)를 더 포함하는 측방 유동 검정 스트립.The binder-adsorbed conjugate release of claim 1, wherein one end overlaps the sample pad and the other end overlaps the chromatographic medium and the detector adsorbs a conjugate that is a substance capable of selectively binding one of the analytes by an antigen-antibody reaction. A lateral flow assay strip further comprising a conjugate release pad. 삭제delete 제2항에 있어서, 탐지자는 항-당화헤모글로빈 항체인 측방 유동 검정 스트립. The lateral flow assay strip of claim 2, wherein the detector is an anti-glycosylated hemoglobin antibody. 제4항에 있어서, 탐지자가 표면형광 표지된 항-당화헤모글로빈 항체인 측방유동 검정 스트립.The lateral flow assay strip of claim 4, wherein the detector is a surface fluorescently labeled anti-glycosylated hemoglobin antibody. 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 측방 유동 검정 스트립과, 상기 스트립 상의 포획자 고정 위치에서 표면 형광 신호를 검출하기 위한 레이저-유발 표면형광 검출장치, 및 분석물 내 색소를 띄는 분석물을 검출하기 위한 LED 검출 장치를 포함하는, 분석물 중 항원-항체 반응에 의해 검출되는 항원분석물과 색소에 의해 검출되는 색소분석물을 동시에 측정할 수 있는 일체형 정량 검정 시스템.A lateral flow assay strip according to any one of the preceding claims, a laser-induced surface fluorescence detection device for detecting surface fluorescence signals at the capture anchoring position on the strip, and pigmented analysis in the analyte. An integrated quantitative assay system capable of simultaneously measuring an analyte detected by an antigen-antibody reaction and a pigment analyte detected by a pigment in an analyte, comprising an LED detection device for detecting water. 제6항에 있어서, 상기 LED 검출 장치는 458 내지 612 nm의 범위에서 선택되 는 광원을 사용하는 것인 일체형 정량 검정 시스템.7. The integrated quantitative assay system of claim 6 wherein the LED detection device uses a light source selected from the range of 458 to 612 nm. 삭제delete 제6항에 있어서 탐지자는 항-당화헤모글로빈 항체인 일체형 정량 검정 시스템.The system of claim 6, wherein the detector is an anti-glycosylated hemoglobin antibody. 제6항에 있어서, 항원분석물은 당화헤모글로빈이고, 색소분석물은 당화되거나 당화되지 않은 헤모글로빈인 일체형 정량 검정 시스템.The system of claim 6, wherein the analyte is glycosylated hemoglobin and the pigment analyte is glycosylated or unglycosylated hemoglobin. 시료 중의 항원 분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드 상에 항원분석물 및 색소분석물이 함유된 것으로 예상되는 시료를 적하하여 액체 시료가 크로마토그래피 매질을 통해 이동되도록 하되, 시료의 적하 전 시료에 일정량의 탐지자를 도입함으로써 면역반응에 의해 탐지자-항원분석물 결합체를 형성하도록 하고, 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 전개함에 따라 크로마토그래피 매질 상에 분주된 포획자와 상기 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단일체가 경쟁적으로 면역반응에 의해 결합체를 형성하면서 이동하도록 하며, 그 후 크로마토그래피 매질상에 포획자가 고정된 위치에서 레이저-유발 표면형광 검출장치에 의해 포획자에 결합된 탐지자의 농도를 측정하고, 이와 별개로 크로마토그래피매질 상의 색소분석물의 농도를 LED 검출장치에 의해 측정하는 단계를 포함하고,A method for simultaneously detecting the concentrations of antigen analytes and pigment analytes in a sample, the method dropping a sample that is expected to contain an analyte and a pigment analyte on a sample pad of a lateral flow assay strip to chromatograph the liquid sample. Allowed to move through the chromatography medium, introducing an amount of detector into the sample prior to loading of the sample to form a detector-antigen analyte conjugate by an immune reaction, and onto the chromatography medium as the sample develops along the chromatography medium. The capturer and the detector-antigen analyte conjugate and / or the detector monodispensed at are competitively moved to form a conjugate by an immune response, and then the laser-at a fixed position on the chromatography medium. Measure the concentration of detector bound to the trap by the triggered surface fluorescence detector Separately measuring the concentration of the dye analyte on the chromatography medium by means of an LED detection device, 상기 측방 유동 검정 스트립은 지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium) 및 흡수 패드(absorption pad)를 포함하고,The lateral flow assay strip comprises a baking card, a sample pad, a chromatography medium and an absorption pad, 상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 서로 겹치지 않도록 샘플 패드와 흡수 패드가 접착되어 있고; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 그 위에는 상기 샘플 패드로부터 일정한 거리를 두고 시료 내의 분석물 중 하나와 실질적으로 동일한 성분으로 이루어져 시료 내의 분석물과 항원-항체 반응으로 결합하는 물질과 경쟁적 면역반응에 의해 결합하는 물질인 포획자가 분주 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 시료 중의 항원 분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법.The support supports the entire constituent of the strip, the sample pad and the absorbent pad being adhered to both ends thereof so as not to overlap each other; The sample pad has an end in the direction in which the absorbent pad is adhered to one end of the chromatography medium, and the sample to be analyzed is first loaded thereon; The other end of the chromatography medium is superimposed on the absorbent pad, on which a certain distance from the sample pad consists of components that are substantially the same as one of the analytes in the sample to bind in an antigen-antibody reaction with the analyte in the sample. A method for simultaneously detecting the concentration of an analyte and a pigment analyte in a sample, characterized in that the trapping agent, which is a substance that binds to the substance by a competitive immune reaction, is fixed. 시료 중의 항원분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 측방 유동 검정 스트립의 샘플 패드 상에 항원분석물 및 색소분석물이 함유된 것으로 예상되는 시료를 적하하여 시료가 결합체 방출 패드를 통과하는 과정에서 탐지자-항원분석물 결합체를 형성하도록 하고, 시료가 크로마토그래피 매질을 따라 전개함에 따라 크로마토그래피 매질 상에 분주된 포획자와 상기 탐지자-항원분석물 결합체 및/또는 탐지자 단일체가 경쟁적으로 면역반응에 의해 결합체를 형성하면서 이동하도록 하며, 그 후 크로마토그래피 매질상에 포획자가 고정된 위치에서 레이저-유발 표면형광 검출장치에 의해 포획자에 결합된 탐지자의 농도를 측정하고, 이와 별개로 크로마토그래피매질 상의 색소분석물의 농도를 LED 검출장치에 의해 측정하는 단계를 포함하고,A method for simultaneously detecting the concentrations of an analyte and a dye analyte in a sample, the method dropping a sample that is expected to contain an analyte and a dye analyte on a sample pad of a lateral flow assay strip to release the sample. The detector-antigen analyte conjugate is formed during passage through the pad, and the detector and antigen-antigen analyte combination and / or detection are captured on the chromatography medium as the sample evolves along the chromatography medium. The monoliths migrate competitively to form conjugates by immune response, and then measure the concentration of the detector bound to the capturer by means of a laser-induced surface fluorescence detection device at a fixed location on the chromatography medium. Separately, the concentration of the dye analyte on the chromatography medium is measured by the LED detection device. It comprises the steps, 상기 측방 유동 검정 스트립은 지지대(baking card), 샘플 패드(sample pad), 크로마토그래피 매질(chromatography medium), 흡수 패드(absorption pad) 및 결합체 방출 패드를 포함하고,The lateral flow assay strip comprises a baking card, a sample pad, a chromatography medium, an absorption pad, and a conjugate release pad, 상기 지지대는 스트립의 구성물 전체를 지지하되, 그 양 말단에는 서로 겹치지 않도록 샘플 패드와 흡수 패드가 접착되어 있고; 상기 샘플 패드는 흡수 패드가 접착된 방향의 말단이 크로마토그래피 매질의 한쪽 말단에 겹쳐지고, 그 위로 분석하고자 하는 시료가 최초로 적하되며; 상기 크로마토그래피 매질의 다른 쪽 말단은 흡수 패드에 겹쳐지고, 그 위에는 상기 샘플 패드로부터 일정한 거리를 두고 시료 내의 분석물 중 하나와 실질적으로 동일한 성분으로 이루어져 시료 내의 분석물과 항원-항체 반응으로 결합하는 물질과 경쟁적 면역반응에 의해 결합하는 물질인 포획자가 분주 고정되어 있으며; 상기 결합체 방출 패드의 한쪽 말단은 샘플 패드와 겹쳐지고 다른 쪽 말단은 크로마토그래피 매질에 겹쳐지며, 분석물 중 하나와 항원-항체 반응에 의해 선택적으로 결합할 수 있는 물질인 탐지자가 흡착되어 있는 것을 특징으로 하는 시료중의 항원분석물 및 색소분석물의 농도를 동시에 검출하는 방법.The support supports the entire constituent of the strip, the sample pad and the absorbent pad being adhered to both ends thereof so as not to overlap each other; The sample pad has an end in the direction in which the absorbent pad is adhered to one end of the chromatography medium, and the sample to be analyzed is first loaded thereon; The other end of the chromatography medium is superimposed on the absorbent pad, on which a certain distance from the sample pad consists of components that are substantially the same as one of the analytes in the sample to bind in an antigen-antibody reaction with the analyte in the sample. The trapping agent, which is a substance that binds to the substance by a competitive immune response, is fixed in a fixed amount; One end of the conjugate release pad overlaps the sample pad and the other end overlaps the chromatography medium, and a detector is adsorbed, which is a substance capable of selectively binding with one of the analytes by an antigen-antibody reaction. A method for simultaneously detecting the concentration of the antigen analyte and the pigment analyte in the sample. 제11항 또는 제12항에 있어서, 탐지자는 형광물질 표지된 것인 방법.The method of claim 11 or 12, wherein the detector is fluorescently labeled. 제11항 또는 제12항에 있어서, 검출된 색소분석물 농도에 대한 항원분석물 농도의 비율을 산출함으로써 시료 중의 항원분석물을 정량하는 것을 더 포함하는 방법.The method of claim 11 or 12, further comprising quantifying the analyte in the sample by calculating the ratio of the antigen analyte concentration to the detected pigment analyte concentration. 제11항 또는 제12항에 있어서, 항원분석물은 당화헤모글로빈이고, 색소분석물은 당화되거나 당화되지 않은 헤모글로빈인 방법.The method of claim 11 or 12, wherein the analyte is glycosylated hemoglobin and the pigment analyte is glycosylated or unglycosylated hemoglobin. 제15항에 있어서, 탐지자는 항-당화헤모글로빈 항체인 방법.The method of claim 15, wherein the detector is an anti-glycosylated hemoglobin antibody. 제15항에 있어서, 포획자는 당화헤모글로빈인 방법.The method of claim 15, wherein the capture agent is glycated hemoglobin. 제16항에 있어서, 포획자는 당화헤모글로빈인 방법.The method of claim 16, wherein the capture agent is glycated hemoglobin.
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