KR100910199B1 - 바이러스 단백질 ｇｐ120에 대하여 친화성을 갖는 펩티드및 그 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 gp120 바이러스 단백질에 대하여 높은 친화성 및 특정성을 나타내는 펩티드 패밀리, 상기 펩티드를 제조하는 방법, 및 상기 펩티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는 하기 서열 (A)를 포함하며: TPA - P1 - Cys - P2 - Cys - P3 - Cys - Ala 또는 Gln - Gly 또는 (D) Asp 또는 Ser - Ser 또는 His 또는 Asn - Xaaj - Cys - Thr 또는 Ala - Cys - Xaak - NH2, 상기 서열에서, TPA는 티오프로피온산을 나타내고, Xaaj는 β-나프틸알라닌, 페닐알라닌 또는 디페닐알라닌을 나타내고, Xaak는 Gly, Val 또는 Ileu를 나타내고, P1은 3 내지 6개의 아미노산을 나타내고, P2는 2 내지 4개의 아미노산을 나타내고, P3는 6 내지 10개의 아미노산을 나타내고, P1, P2 및 P3 중의 아미노산들은 천연 또는 비천연이고, 동일하거나 또는 다르며, P1, P2 및 P3 는 공통된 서열을 가질 수도 있고, 상기 펩티드는 서열 (A)의 Ala 또는 Gln - Gly 또는 (D) Asp 또는 Ser - Ser 또는 His 또는 Asn - Xaaj 아미노산 잔기들에 의하여 형성된 β턴을 포함하는 β-헤어핀 구조를 나타내는 것을 특징으로 한다. 상기 펩티드는 의약, 백신, 크로마토그래피 컬럼을 제조하는 데에 사용될 수 있으며, 스크리닝에 사용될 수 있다.
HIV 바이러스, gp120 바이러스 단백질 (gp120 viral protein), CD4 수용체 (CD4 receptor)
Description
본 발명은 바이러스 단백질 gp120에 대하여 고친화성 및 특이성을 나타내는 펩티드 패밀리, 이러한 펩티드들을 제조하기 위한 방법, 및 이러한 펩티드들의 용도에 관한 것이다.
바이러스 단백질 gp120은 면역결핍 바이러스 (immunodeficiency virus)의 외피 (envelope)의 글리코단백질 (glycoprotein)이다. gp120은 바이러스 복제 사이클의 제1 단계, 즉 바이러스 외피에 의한 림프구 막 CD4 단백질의 인식 및 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid)를 받아들이기 위한 막 융합으로 이루어지는 단계에 관여한다. 실제로 gp120은 바이러스 외피에 의한 CD4 단백질의 인식을 위한 부위의 가장 바깥쪽 단백질이다.
바이러스 단백질 gp120과 유사한 외피 단백질을 포함하는 많은 면역결핍 바이러스들이 존재한다. 이들 중에서, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 유인원 (simian) 면역결핍 바이러스 (SIV), 양 (ovine) 면역결핍 바이러스 (VISNA), 소 (bovine) 면역결핍 바이러스 (BIV) 및 고양이 (feline) 면역결핍 바이러스 (FIV)를 예로 들 수 있다.
본 발명의 일부 펩티드들은 바이러스 외피의 바이러스 단백질 gp120에 부착 할 수 있으며, 그 서열에 따라서 0.1 내지 400 nM 사이의 IC50 수치로 바이러스 단백질 gp120이 CD4 수용체에 부착되는 것을 저해한다. 이러한 분자들 중 일부는, 예를 들어 100 내지 900 nM의 ED50 (50% 유효 투여량)으로, HIV 바이러스에 의한 T 림프구 감염을 저해할 수 있다. 부가하여, 이러한 분자들의 재조합 단백질 gp120에의 부착은, 용해성 CD4 분자와 동일한 효율성으로, gp120 내부의 구조적 변형 (conformational variation)을 유도하여 새로운 에피토프들 (epitopes)을 드러내게 한다.
본 발명의 펩티드들은 치료 및 백신용으로 응용될 수 있다. 그들은 또한, 예를 들어 HIV 외피 단백질의 검출 및 정제에 이용될 수 있으며, 새로운 항-AIDS 약물을 발견하는 데에 이용될 수 있는 새로운 분자들을 고안하는 것을 가능하게 한다.
면역결핍 바이러스, 특히 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염에 대한 효과적인 치료법 및 감염 예방 수단을 발견하기 위하여 많은 연구들이 수행되고 있다. 주된 난점들은 효과적인 백신류 및 면역치료요법의 개발에 관한 것들이다. 이는, 특히, 바이러스가 다양하다는 점 및 바이러스가 표적 세포에 진입하는 메카니즘과 상기 바이러스에 의한 감염에 대항하여 세포를 보호하기 위하여 요구되는 면역 반응의 메카니즘을 이해하는 데에 난점이 있기 때문이다.
하기 서술에서, 각진 대괄호 (square brackets) 안의 참조번호는 첨부된 참 조문헌 리스트 중의 문헌번호를 의미한다.
CD4-gp120 복합체의 3차원적 구조 분석에 의해서 설명되는 바와 같이 [1] (첨부된 참조문헌 참고), 바이러스 글리코단백질 gp120에 결합하는데 필수적인 CD4의 구조적 요소들은, CD-4의 36-47 영역에 포함되는 Gly 38, Gln 40, Gly 41, Ser 42, Phe 43 및 Thr 45, 및 아르기닌-59 아미노산들을 포함한다. CD4의 36-47 영역은 면역글로불린의 CDR2 영역에 비교되어 왔으며, 정돈된 헤어핀 (hairpin) 구조를 나타낸다. 이러한 구조는 36-40 서열에 해당되는 β-스트랜드 (β-strand) (C')에, 제2 β-스트랜드가 제1 β-스트랜드와 역-평행 (anti-parallel) β-구조를 형성하는 것을 가능하게 하는 40-43 서열에 해당되는 턴 (turn), 및 43-47 서열에 해당되는 제2 β-스트랜드 (C")로 이루어져 있다. 이러한 구조는 각각, 제1 β-스트랜드의 Gly 38, Gln 40, Phe 43, Thr 45 및 Gly 47 잔기들의 아미드 질소 (amide nitrogen)와 제2 β-스트랜드의 Thr 45, Phe 43, Gln 40, Gly 38 및 Ile 36 잔기들의 카르보닐 산소 (carbonyl oxygen) 사이의 수소 결합들에 의하여 안정화된다. 이러한 헤어핀 구조는 CD4와 바이러스 단백질 gp120과의 상호작용에 중추적인 역할을 하며, 이중의 기능을 수행한다. 먼저, 그것은 Gly 38, Gln 40, Gly 41, Ser 42, Phe 43 및 Thr 45 아미노산들이 바이러스 단백질 gp120의 상호작용 표면에 상보적인 분자 표면을 형성하는 것을 가능하게 하며, 특히, Phe 43의 곁사슬이 바이러스 단백질 gp120의 분자 표면 중에 있는 소수성 공동 (hydrophobic cavity)의 입구 내로 삽입되는 것을 가능하게 하며; 둘째로, 그것은 CD4의 β-스트랜드 (C")의 폴리펩티드 골격과 바이러스 단백질 gp120의 β15 스트랜드 (잔기 365-368) 사이의 β-시트 (β-sheet) 타입의 상호작용을 가능하게 한다. 아르기닌 59 (Arg 59) 또한 CD4-gp120 상호작용에서 필수적인 역할을 수행하는데, 이는 그 곁사슬의 구아니디늄기 (guanidinium group)가 바이러스 단백질 gp120의 Asp 368 잔기의 곁사슬과 이중 수소 브릿지를 형성함으로써, CD4의 C" 스트랜드와 바이러스 단백질 gp120의 β15 스트랜드 사이의 β-구조-타입 상호작용을 안정화시키는 것을 가능하게 하기 때문이다. 특정부위 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis) 실험들은 CD4의 이러한 모든 잔기들이 바이러스 단백질 gp120과의 상호작용에서 필수적인 역할을 한다는 것을 보여주었다 [2], [3].
이러한 정돈된 헤어핀 구조 및 그 잔기들의 곁사슬 구조를 재생하는 것은, CD4의 상호작용 부위에서 바이러스 단백질 gp120에 부착되어야 하는 분자에게는 필수적인 사항이다. CD4의 37-53 서열에 해당되는 선형 펩티드 (linear peptide) 및 37-46 서열에 해당되는 시클릭 펩티드 (cyclic peptide)와 같은 간단한 펩티드 구조물들이 바이러스 단백질 gp120에 대하여 측정가능한 친화도를 갖지 않는다는 사실은 이러한 사항을 설명해준다 [4].
HIV에 의한 CD4 세포 감염은 바이러스 외피와 CD4 사이의 고친화성 상호작용에 의하여 매개된다. 돌연변이 유발 및 항체들과의 경쟁으로 이루어지는 실험들은, 바이러스 외피의 gp120 단백질과의 접촉 표면을 CD4의 D1 도메인에 위치시키는 것을 가능하게 하였다. 기능을 수행할 수는 있지만, V1-V2-V3 루프들 및 N- 및 C- 말단 영역들이 결실되어 있고, CD4의 D1D2 도메인들 및 단일클론 항체의 Fab 단편과 복합체를 형성하고 있는, gp120 글리코단백질의 재조합 형태에 대한 3차 구조는 최근에 크리스탈로그래피 (crystallography)에 의하여 분석된 바 있다 [1]. 이러한 구조에서, CD4는 면역글로불린의 CDR2 영역과 비교되는 영역 주변에 중심을 둔 큰 분자 표면 (742 Å2)을 사용하여, 바이러스 단백질 gp120의 분자 표면 (800 Å2)에 존재하는 큰 함몰부 (depression)와 상호작용한다. "Phe 43 공동"으로 불리는, 좁고 깊은 공동이 바이러스 단백질 gp120의 분자 함몰부의 중심에서 열리며, Phe 43의 곁사슬이 CD4의 CDR2 영역의 상단에서 Phe 43 공동의 입구를 차지한다. 이러한 구조의 분석은 돌연변이 유발에 대한 선행 데이터 (preceding data)를 확인해주며, 이는 잔기 Phe 43 및 전체 CDR2 루프가 기능적으로 매우 중요하다는 것을 나타내고, 후자가 HIV-1 비리온 (virion)이 세포에 부착하는 것을 저해하기 위한 가능한 표적이 될 수 있다는 것을 제안한다. gp120-CD4 상호작용은 바이러스가 표적 세포들의 막에 부착하는 것을 가능하게 하며, 감염 메카니즘에서 첫 번째 단백질-단백질 상호작용을 나타낸다. 그러나, HIV가 세포내로 효율적으로 진입하기 위해서는 다른 공-수용체 (co-receptor)들이 필요하다. 이들은 림프구 친화성 (lymphotrophic) 바이러스 균주 (X4)의 진입에 관여하는 CXCR-4 [5], [6], 및 M-향성 균주 (M-tropic strains) (R5) 및 대부분의 일차 분리주들 (primary isolates)의 진입에 관여하는 CCR-5 [7], [8]이다. 몇몇 증거들은 바이러스 단백질 gp120의 CD4에의 부착이 외피 글리코단백질에서 구조적 변형을 야기하며, 이는 CD4i로 불리는 특정 항체들에 의하여 검출가능한 새로운 부위들을 노출시키고, 진입을 위한 공-수용체들인 케모킨 (chemokine) 수용체들 [9], [10]과 외피의 친화성을 증가시 킨다는 것을 보여준다. 바이러스 단백질 gp120에 의한 CD4 및 공-수용체의 부착 이후에, 다른 구조적 변형들이 gp41의 구조적 재구성을 일으키고, 이는 그 융해성 (fusogenic) 펩티드의 노출, 이어서 바이러스 및 세포 막의 융합, 최종적으로 바이러스 내용물의 세포 내로의 진입을 야기하게 된다.
CD4와 복합체를 형성하는 바이러스 단백질 gp120의 크리스탈로그래피 구조는, 면역 반응에 침투하기 위해서 HIV에 의하여 사용되는 메카니즘들 중의 하나를 추론해내는 것을 가능하게 한다. gp120 외피 단백질이 고가변성 (hypervariable)이며 높은 정도로 글리코실화된 (glycosylated) 영역들을 갖는다는 것은 기지의 사실이다. 크리스탈로그래피 구조는 실제로, 고가변성 영역들 및 높은 정도로 글리코실화된 영역들이 바이러스 단백질 gp120의 노출된 분자 표면을 형성하고, 이는 또한 비리온의 접근가능한 표면에 해당된다는 사실을 보여준다. 바이러스 단백질 gp120의 분자 표면 중 오직 소수의 영역들만이 보존되어 있으며, 항체들에 대한 표적이 될 수 있다. 이러한 영역들은 일반적으로 접근가능하지 않으며, 아마도 결정화된 단백질 중에서는 결실되어 보이지 않는 고가변성 루프들 (V1-V2-V3)에 의하여 보호되는 것으로 보인다. 이러한 영역들 중의 하나는, 외피가 CD4에 부착된 이후에, 케모킨 수용체들에 대한 상호작용 부위에 근접하고, CD4i 항체들에 접근가능한 표면이다. CD4-결합 부위는 노출되고 보존된 또 다른 표면이지만; 이러한 표면은 바이러스 단백질 gp120의 공동에 존재하며, 따라서 항체들에는 접근가능하지 않지만, 분자 인식을 위하여 두 개의 도메인들을 사용하는 항체들과는 달리 단일 면역글로불린 도메인을 갖는 CD4를 수용할 수 있다.
외피 단백질 (gp120)을 인식하기 위하여 현재 사용가능한 도구들은 제한되어 있다. 이들은 넓은 범위의 일차 외피들에 부착할 수 있는 CD4i 항체들이지만 [11], [12], [13]; 그들의 바이러스 외피에 대한 친화도는 낮으며, 오직 CD4의 존재 하에서만 증가하고, 이는 그들이 용이하게 사용될 수 없다는 것을 의미한다. IgG1b12, F105 또는 15e와 같은 다른 항체들은 모든 일차 분리주들을 인식할 수 있지는 않은 것으로 여겨진다. 비오틴 (biotin)으로 표지된 CD4 분자 또한 해법을 제공할 수도 있다. 이러한 분자는 상업적으로 이용가능하다 (Intracell). 그러나 불행하게도, 이는 고가이며, 바이러스 단백질 gp120과의 부착에 대한 기능적 특성들이 비오틴화 반응에 의하여 크게 감소하여 (100 배), 그 용도가 매우 제한된다.
바이러스 단백질 gp120과, 진입을 위한 주된 수용체인 CD4, 재조합 가용성 CD4 및/또는 CD4 도메인들을 포함하는 면역글로불린 키메라 (chimere)와의 상호작용의 저해는 제안된 첫 번째 치료적 접근법들 중의 하나이었으며, HIV-1에 의한 감염을 저해하는 것에 대하여 실험적으로 연구되었다. 이러한 분자들은, 실험실-적응된 균주들의 경우에서만, 생체외 (in vitro) 바이러스 감염의 저해에 효과적이며, 많은 일차 분리주들의 경우에는 효과적이지 않다. 이러한 CD4-유래 구조물들의 빠른 생체내 (in vivo) 분해 및 일차 분리주들의 바이러스 외피에 대한 그들의 낮은 친화도는 이러한 비효율성의 주된 원인들로 제안되어 왔다. 그러나, 특정 일차 분리주들의 재조합 모노머 gp120들의 CD4에 대한 친화도는, 실험실 균주들로부터 유래된 gp120들의 그것과 현저하게 다르지는 않다는 점이 연구들에 의하여 밝혀졌다. 바이러스 표면에서의 바이러스 단백질 gp120의 올리고머적 성질, 증식허용 성 (permissive) 세포들의 표면에서 CD4의 밀도 및 구조, 및 아직 명확히 밝혀지지 않은 기타 분자적 상호작용들의 존재가능성 또는 진입을 위한 다른 이차적 분자들의 존재가능성이 진입 메카니즘에서 중요한 역할을 담당할 수도 있으며, 진입 길항제로서의 가용성 CD4 단백질들의 비효율성에 대한 다른 원인들을 나타낼 수도 있다. 외피 단백질의 높은 유전적 다양성으로 인하여, 바이러스 단백질 gp120을 표적으로 하는 항바이러스성 시약들을 개발하는 것은 주된 과제이며, 이러한 유전적 다양성은 바이러스 단백질 gp120에 대한 많은 저해제들의 비효율성을 설명해 주는 요인이 될 수 있다. 그러나, CD4에 대한 바이러스 단백질 gp120의 결합 부위의 중심을 형성하는데 기여하는 잔기들이 매우 보존된 잔기들로 이루어져 있다는 사실은, 바이러스 단백질 gp120의 저해제들이 다양한 범위의 HIV-1 분리주들에 대하여 효과적일 수 있다는 것을 암시한다.
CD4-유래 펩티드 구조물들은 바이러스 감염의 저해제들로서 제안되어 왔으며: 그들은 Phe 43을 모방한 페닐기를 포함하는, CD4의 CDR2 루프의 구조적 유사 펩티드 (structural mimetic peptide) [14] 및 CD4의 CDR3 루프에 해당되고 부가적인 방향족 잔기들을 포함하는 시클릭 펩티드 [15]이다. 그러나, 이러한 구조물들은 실험실 분리주에 제한되는 낮은 항바이러스 활성을 나타내며, 비록 그들이 초기에는 CD4의 구조적 의사체들 (mimetics)로서 고안되었다 할지라도, 진입 단계에서는 활성을 갖지 않는다 [16].
현재, gp120-CD4 상호작용에 대한 몇몇 저해제가 제안되어 임상적으로 응용된 바 있다. 그들은, 예를 들어, CD4의 D1D2 도메인과 IgG2 면역글로불린의 불변 도메인과의 유전적 융합에 의하여 형성된 커다란 재조합 단백질이다 [17]. 이러한 PRO542 구조체는 임상적 단계 Ⅰ/Ⅱ에 있다. 이러한 커다란 재조합 단백질은 인체에 상당히 적합한 것으로 보이지만, 그 효과는 높은 순환량 (high circulating dose)에 의존하며, 이는 달성하기 어려운 문제이다. 더 작은 분자들이 CD4-gp120 상호작용의 저해제들로서 제안된 바 있으며, 임상적 시험 단계에 있다. 그들은: 조합적 접근법 (combinatorial approach)에 의하여 확인된 비스아조 (bisazo) 염료 FP21399 [18], 포스포로티오에이트 (phosphorothioate) 올리고뉴클레오티드 진테비르 (zintevir) (AR177) [19], 나프탈렌설포네이트계 폴리머인 PRO2000 [20] 및 전분 유도체인 덱스트린 2-설페이트 (D2S) [21]이며, 이들은 세포 배양물 중의 HIV-1 화학적 분리주들을 저해하지만, 고농도를 필요로 한다. 진입 저해제들 중에서, 또한 다중분지된 합성 펩티드 구조체인 SPC3가 있으며 [22], 이는 처음에는 CD4-gp120 상호작용의 저해제로 제안되었지만, 세포들에의 비리온 부착 이후의 단계에서 활성을 갖는 것으로 입증되었다. 그 밖의 작은 분자들: 비시클람 (bicyclam) AMD3100 [23], NSC651016 [24], 펩티드 T22 [25] 및 그것의 보다 최근 형태인 T134 또는 T140 [26], 및 TAK779 [27]도 진입 저해제로 제안되었다. 이러한 분자들은 바이러스 진입의 저해제들이며, 이들은 공-수용체들인 CXCR4 및 CCR5에 대해 활성을 가지지만, CD4-gp120 상호작용에는 활성을 갖지 않는다. gp41 단백질의 C-말단 영역의 서열로부터 유도된 펩티드들인, 펩티드 T20 (또는 DP178) [28] 및 그것의 보다 최근의 개선된 형태인 DT1249 [29]는, 바이러스 외피의 CD4 부착 다음 단계이며 바이러스 세포 막 융합 이전 단계인, 진입의 일시적 단계 (transient phase)를 표적으로 하는 감염의 저해제들이며: 이러한 펩티드들은 gp120-CD4 상호작용에 있어서 비활성이다. 이러한 생성물들의 대부분은 현재 임상적 시험 단계 Ⅰ/Ⅱ에 있지만, 그들의 치료 효과는 아직 입증되어야 할 과제로 남아 있다.
현재 임상적으로 사용되는 항-AIDS 치료요법인 삼중치료법 (tritherapy)은, 두 개의 바이러스 효소인, 역전사 효소 및 단백질 분해 효소를 표적으로 하는 3가지 저해제의 조합을 포함한다. 비록 삼중치료법이 많은 환자들에서 바이러스의 양을 현저히 감소시키는 데에는 성공하였지만, 가장 바람직한 경우조차도, 감염의 잠복 저장고 (dormant reservoirs)가 여전히 잔존하기 때문에 질병을 완치시킬 수는 없다 [30]. 한편으로는 삼중치료법이 부분적으로 성공하였다는 점 및 다른 편으로는 현재 치료 프로토콜로는 AIDS 감염을 중지시킬 수 없다는 점은, 다른 바이러스 표적들에 대해서 활성을 가질 수 있으며, 현재 임상적 약물들의 지식 축적량 및 효과를 증가시킬 수 있는 새로운 약물들에 대한 요구를 증가시켜 왔다.
J.H. Nunberg (Montana Biotechnology Center, The University of Montana, Missoula, USA)의 실험실 연구들은, 바이러스-세포 융합 이전 단계에 존재하는 단백질 형태들의 화학적 브릿지화 (chemical bridging)는 바이러스-중화 (virus-neutralizing) 항체들의 형성을 유도할 수 있는 새로운 면역원들 (immunogens)을 제공한다는 것을 보여 주었다. 따라서, 바이러스 외피와 진입 수용체들과의 예비-융합 복합체 (pre-fusion complex)는, 현재 커다란 관심을 끄는 구조를 제공하는데, 이는 이러한 구조가 AIDS에 대한 백신의 제조에 있어서 단백질 형성의 가장 중요한 성분을 제공할 수 있기 때문이다. A. DeVico (Institute of Human Virology, University of Maryland, Baltimore, USA)의 실험실 연구들은, 화학적 브릿지화에 의하여, 또는 재조합 융합 단백질로서 안정화된 gp120-CD4 복합체가 바이러스 단백질 gp120의 숨은 항원성 부위들 (cryptic antigen sites)을 노출시키며, 중화 항체들을 유도할 수 있는 거대분자 형태를 제공한다는 것을 보여 주었다 [32], [33]. 화학적 브릿지화에 의하여 이러한 항원성 복합체를 얻는 것은, 그것이 균질하지 않으며 재생하기 힘들기 때문에 만족스럽지 못하다. 재조합 단백질로서 그것을 얻는 것은 구조적으로 안정하고 효과적인 형태를 야기하지 않는다. 또한, 특히, 이러한 제제들 중의 CD4의 존재는 이미 면역억제된 (immunisuppressed) 유기체 중에서 자가면역 반응 (autoimmune response)을 유도하는 위험성을 제기할 수도 있다.
더욱이, 재조합 모노머 형태 (gp120) 또는 천연 트리머 형태 (gp140 또는 유사체들 (analogues))의 바이러스 외피의 제조는, 백신화를 위하여 사용될 수 있는 재조합 형태들을 검색하고 이를 대량으로 생산하는 데에 매우 커다란 가치가 있다. 이러한 재조합 형태들의 정제는 쉽지 않으며, 리간드들, 특히 외피 단백질에 대하여 그다지 특이적이지 않은 렉틴류 (lectins)로 작용화된 크로마토크래피 지지체들을 사용하는 것을 포함한다. 공유적으로 부착된 재조합 CD4를 포함하는 크로마토그래피 지지체를 사용하는 것은, 바이러스 단백질 gp120을 정제하기에 더욱 특이적이고 효과적인 단계를 도입하지만, 그와 같은 지지체는 매우 고가일 것이며, 이러한 단백질은 사용시의 모든 조건들 하에서 충분히 안정하지 않을 것이다.
본 발명은 CD4와 유사하며, 앞서 서술한 종래 기술의 문제점들을 극복한 펩 티드 패밀리를 제공한다. 구체적으로는, 본 발명은 AIDS 바이러스의 외피, 특히 gp120 단백질에 대하여 매우 높은 친화성을 나타내는 안정한 펩티드를 제공한다.
본 발명의 펩티드는 하기 서열 (A)를 포함하며:
TPA - P1 - Cys - P2 - Cys - P3 - Cys - Ala 또는 Gln - Gly 또는 (D) Asp 또는 Ser - Ser 또는 His 또는 Asn - Xaaj - Cys - Thr 또는 Ala - Cys - Xaak - NH2
상기 서열에서, TPA는 티오프로피온산을 나타내고, Xaaj는 β-나프틸알라닌, 페닐알라닌 또는 디페닐알라닌을 나타내고, Xaak는 Gly, Val 또는 Ileu를 나타내고, P1은 3 내지 6개의 아미노산을 나타내고, P2는 2 내지 4개의 아미노산을 나타내고, P3는 6 내지 10개의 아미노산을 나타내고, P1, P2 및 P3 중의 아미노산들은 천연 또는 비천연이고, 동일하거나 또는 다르며, P1, P2 및 P3 는 공통된 서열을 가질 수도 있고, 상기 펩티드는 서열 (A)의 Ala 또는 Gln - Gly 또는 (D) Asp 또는 Ser - Ser 또는 His 또는 Asn - Xaaj 아미노산 잔기들에 의하여 형성된 β턴을 포함하는 β-헤어핀 구조를 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 펩티드는 하기 서열 (Ⅰ)을 포함하며:
TPA - Xaaa - Xaab - Ala 또는 Gln 또는 His - Arg 또는 Phe - Cys - Xaac - Xaad - Arg - Cys - Lys - Xaae - Xaaf - Xaag - Xaah
- Leu 또는 Lys - Xaai - Lys - Cys - Ala 또는 Gln - Gly 또는 (D)Asp 또는 Ser - Ser 또는 His 또는 Asn - Xaaj - Cys - Thr 또는 Ala - Cys - Xaak - NH2
상기 서열에서, TPA는 티오프로피온산을 나타내고, Xaaa, Xaab, Xaac, Xaa
d, Xaae, Xaaf, Xaag, Xaah, 및 Xaai는 천연 또는 비천연이고, 동일하거나 또는 다른 아미노산들이며, Xaaj는 Nal, Phe 또는 Dip를 나타내고, Xaak는 Gly, Val 또는 Ile을 나타내는 것을 특징으로 한다.
잔기 (D)Asp는 아스파르트산의 D 광학 이성체를 나타내고, Nal은 β-나프틸알라닌을 나타내고, Dip는 디페닐알라닌을 나타낸다.
본 발명자들은 서열번호 (Ⅰ)에 의하여 한정되며, 상기 서열의 1번 위치에 티오프로피온산, 상기 서열의 23번 위치 (Xaaj)에 Phe, Nal 또는 Dip 잔기, 및 상기 서열의 27번 위치 (Xaak)에 Gly, Val 또는 Ile을 포함하는 본 발명의 펩티드가, 면역결핍 바이러스의 바이러스 외피의 gp120 단백질에 대하여 고친화성 및 높은 결합 특이성을 나타낸다는 것을 입증하였다.
이러한 펩티드는 단지 27개 또는 28개의 잔기들을 포함하며, 2개의 역평행 β스트랜드들이 4개의 잔기로 이루어진 β-턴에 의하여 연결된 헤어핀 구조를 갖는다. 2개의 역평행 스트랜드들은, 분자간 수소 브릿지 상호작용을 일으킬 수 있는 거리만큼 그들이 서로에 대하여 떨어져 있기 때문에, 구조를 안정화시킨다. 특히, 펩티드 결합의 아미드 질소와 카르보닐 산소 원자들 사이의 거리는 2.5 내지 3.6 Å이다. 이러한 명확하게 한정되고 안정한 구조는, CD4가 gp120 글리코단백질에 결합하는데 필수적인 구조적 요소들을 재생한다.
본 발명의 펩티드에 대한 3차원 구조는 핵 자기 공명 (NMR)에 의하여 실험적으로 결정되었다. 이러한 분석은 상기 펩티드의 3차원 구조가 CD4의 헤어핀 구조의 펩티드 골격을 재현하고, 상기 펩티드의 영역 37-46이 단지 1.05 Å의 rms 편차로 CD4의 36-37 영역과 중첩될 수 있다는 점을 보여준다. 부가적으로, Ala 또는 Gln 20, Ser 22, XaaJ 23 (Nal, Phe 또는 Dip), 및 Thr 또는 Ala 25 잔기들의 곁사슬들은 대응되는 CD4의 잔기들, 즉 Gln 40, Ser 42, Phe 43 및 Thr 45의 배향에 필적하는 배향을 갖는다. 구체적으로, XaaJ 23의 곁사슬은, 바이러스 단백질 gp120의 소수성 공동의 입구 내로 삽입되어 gp120과의 연결을 강화하기 위해서, CD4의 Phe 43의 곁사슬과 유사한 구조로 헤어핀 모티프로부터 돌출된다. 9번 및 18번 위치의 Arg 및 Lys은 CD4 단백질의 Arg 59 및 Lys 35 잔기들과 위상학적으로 (topologically) 균등하다.
펩티드의 TPA 및 5개의 Cys는, 1-3, 2-4 및 3-6 형태의 쌍을 나타내며 헤어핀 구조를 안정화시키는 디설파이드 브릿지들을 형성한다.
헤어핀 구조 모티프는 용매 및/또는 단백질과 같은 더 큰 분자에 접근가능한 표면을 갖는데, 이는 바이러스 외피 단백질과의 그 상호작용을 증진시킨다.
이러한 모티프의 용매 접근가능한 표면의 아미노산들의 곁사슬들은 공간적으로 근접하며, CD4-gp120 결합에 중요한 몇몇 잔기들의 구조를 재현하는 연속된 분자적 표면을 형성한다.
헤어핀 구조 모티프를 포함하는 구조적 플랫폼은 또한, 헤어핀 구조 모티프에 대하여 명확하게 한정된 공간적 위치에 부가적인 화학적 작용기들을 수용할 수 있는 다른 구조적 영역들을 포함하며, 따라서 이들은 그 결합의 생물학적 기능을 강화 및/또는 표지기들 (labelling groups)을 제공할 수 있다. 예를 들어, 비오틴(biotin) 기 또는 플루오레신 (fluorescein)기가 유도체의 생물학적 활성에 어떠한 손실도 초래함 없이 라이신 11의 곁사슬에 통합된다. 이러한 기들의 통합은, 하기 서술하는 바와 같이, 외피 단백질과의 상호작용을 분석하는데 이러한 유도체들을 사용하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따르면, 서열 (Ⅰ)은 또한 Xaak 잔기에 결합된 프롤린 잔기를 포함할 수도 있다. 28번 위치에 부가된 프롤린 잔기는 C-말단을 안정화시키며, 헤어핀 구조적 모티프의 C-말단 β-스트랜드의 가요성을 감소시킨다.
본 발명에 따르면, 서열 (Ⅰ)에서, Xaai는 Gly일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 펩티드는 첨부된 서열 목록의 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로부터 선택된 서열을 포함할 수도 있다.
본 발명의 펩티드는 고상 화학적 합성 (solid-phase chemical synthesis) 또는 유전적 재조합에 의하여 얻어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은, 본 발명에 따른 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 펩티드의 고상 화학적 합성을 포함한다. 상기 화학적 합성은, 예를 들어 Applied Biosystems, mod. 433A 타입의 자동 펩티드 합성기로 수행될 수 있다. 이는, 예를 들어 아미노산들의 α-아미노기의 일시적 보호를 위해 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (fluorenylmethyloxycarbonyl)기를 사용하는 Fmoc 화학에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 또한:
a) 본 발명의 펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 발현 벡터 내로 통합하는 단계,
b) 상기 핵산 서열을 포함하는 상기 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 단계,
c) 상기 핵산 서열을 포함하는 상기 숙주 세포를, 상기 펩티드의 합성이 가능한 배양 조건 하에서 배양하는 단계,
d) 합성된 펩티드를 회수하는 단계, 및
e) C-말단 위치에서 TPA를 접합시키는 단계
를 포함하는 방법에 의해서도 제조될 수 있다.
이러한 펩티드 합성의 방법을 수행하기 위한 기술적 요소들은 당업계에 공지되어 있다. 그들은, 예를 들어, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd edition에 개시되어 있다. 펩티드 N-말단 위치에서의 TPA의 접합 (grafting)은 펩티드에 적용가능한 유기화학의 통상적인 방법에 의하여 수행될 수 있다.
본 발명자들은, 돌연변이 유발 및 크리스탈로그래피 분석 결과들에 의하여 밝혀진 바와 같이, CD4가 바이러스 단백질 gp120에 결합하는 데에 필수적인 영역들 중에서, 면역글로불린의 CDR2 영역과 유사한 CD4 영역의 구조 부분을 재현하는 펩티드들의 패밀리를 합성하였다. 본 발명의 펩티드들은, CD4와 상호작용하며, HIV-1이 CD4 표적 세포들로 진입하기 위한 주된 수용체인, gp120 글리코단백질의 영역에 부착할 수 있다.
그들은 저해제 패밀리를 구성하며, 재조합 모노머 바이러스 글리코단백질 gp120에 대한 그 친화도는 0.1 nM 내지 400 nM 범위의 IC50 수치를 갖는다. 그들은 CD4 구조에 기초하는 CD4-gp120 상호작용의 특이적이고 강력한 저해제들을 나타낸다. 재조합 바이러스 단백질 gp120과의 결합은 가용성 CD4와 경쟁적으로 발생하며, 정확히 구조화된 형태에 대하여 특이적이다.
CD4와의 구조적 및 기능적 유사성으로 인하여, 이러한 펩티드들은 하기 서술된 다양한 분야들에서 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 ELISA 분석에 의하여 입증되는 바와 같이, 그 재조합 형 태로 HIV-1 외피에 부착할 수 있다. 이러한 펩티드들은, 적당한 형광 또는 방사능 프로브로 표지되면, 용액 중 또는 세포의 표면에서 HIV-1 외피의 존재를 검출하는 것을 가능하게 하며, 따라서 감염된 세포 및 HIV-1 감염 존재 여부를 검출하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 펩티드들은 생체외에서 재조합 CD4-gp120 단백질 사이의 상호작용을 저해하며, 이를 통하여, 그들은 또한 HIV-1LAI 바이러스 (일차 분리주) 및 HIV-1LEN 바이러스 (임상적 분리주)가 순환하는 림프구 내로 진입하는 것을 막을 수도 있다. 본 발명의 가장 강력한 펩티드들은, 실제로는, 100 내지 900 nM의 ED50 수치로 림프구 감염을 저해할 수 있다. 이러한 분자들은 따라서, 임상적 응용성을 가진 항바이러스성 제제들을 나타낸다. 그들의 펩티드 성질로 인하여, 그들은 주사 (ijection) 또는 주입 (infusion)으로, 또는 외부 국부 적용 방법으로 사용될 수 있다.
바이러스 단백질 gp120이 CD4에 결합하는 것을 저해하는 본 발명의 펩티드들의 능력은, 이러한 펩티드들의 바이러스 감염 저해 능력을 입증하는 것인데, 이는 그들이 바이러스 진입의 첫 번째 단계들 중의 하나를 막기 때문이다. 이러한 진입 저해제들은 따라서 항바이러스성 작용을 갖는 요소들이다. 그러므로, 본 발명의 펩티드들은 항-HIV 치료법에 사용될 수 있는 분자들을 나타낸다.
본 발명의 펩티드들은 재조합 바이러스 단백질 gp120 및 외피의 구조에 변형을 유도할 수 있으며, 이는 CD4i로 불리는, CG10, 17b 및 48D와 같은 특정 단일클 론 항체들에 의하여 검출되는 것을 가능하게 한다. 따라서, 이러한 구조적 변형은 CD4의 결합에 의하여 유도되는 것들과 명백하게 유사하다. 재조합 바이러스 단백질 gp120 및 바이러스 외피에 대한 본 발명의 펩티드들의 결합은, 따라서 CD4가 없이는 일반적으로 접근가능하지 않은 외피 에피토프들을 노출시킨다. 이러한 에피토프들은 HIV-1 중화 항체들을 개발하는데 잠재적으로 매우 중요한 새로운 항원성 부위들을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 펩티드들은 백신용으로도 사용될 수 있으며, 특히 바이러스의 외피 단백질과 그와의 복합체를 포함하는 제제로 사용될 수도 있다.
본 발명의 일부 펩티드들은 다른 것들에 비해 재조합 바이러스 gp120 단백질에 대하여 낮은 친화도를 나타낸다. 이러한 펩티드들은 또한 기능을 나타내는 형태의 바이러스 외피를 정제하는데 있어서 매우 큰 실용적 용도를 갖는다. 구체적으로, 바이러스 단백질의 이러한 펩티드들에 대한 부착은 더욱 용이하게 가역적이다. 이를 입증하기 위해서, 본 발명자들은, 분자의 활성 표면 반대편 상에 부착된 가요성 아암 (arm)을 사용하여, 이러한 펩티드들 중의 하나를 친수성 폴리머 지지체 (Sepharose 4B)에 공유적으로 부착시켰다. 이러한 방식으로 부착된, 상기 분자는 재조합 바이러스 단백질 gp120과 여전히 상호작용할 수 있고, 폴리머 매트릭스 상에 이러한 바이러스 단백질을 보유할 수 있다. 이는 배지의 산성화에 의하여 분리될 수 있다. 위와 같이 작용화된 지지체는 따라서 대량 제조에 있어서, 재조합 바이러스 단백질 gp120, 선택적으로 다른 형태의 바이러스 외피들, 및 심지어는 전체 바이러스까지 정제하는 것을 가능하게 한다.
부가적으로, 본 발명의 펩티드들은, 바이러스 외피 단백질 gp120에 결합하는 친화도에 변화가 없이, 예를 들어 플루오레신 또는 비오틴으로 표지되거나, 또는 방사능표지될 수 있다. 이렇게 표지된 펩티드들은, gp120에 대한 그들의 결합 경쟁에 대한 실험들에서, 예를 들어 분자 스크리닝을 수행하기 위해서, 추적자 (tracer)로 사용될 수 있다. 사용가능한 방법들은, 분자적 상호작용들의 연구와 관련된 문헌에서 당업자가 접근가능한 것들이다 (예를 들어, [37, 38, 39 및 40] 참조). 스크리닝 방법에서, 본 발명의 펩티드와 gp120 바이러스 단백질 사이의 상호작용을 저해할 수 있는 임의의 분자는 CD4-gp120 상호작용의 저해제가 되며, 따라서 바이러스 감염의 저해제가 된다. 그러므로, 본 발명의 펩티드들을 이용하면 gp120 단백질 또는 gp120에 유사한 단백질과 상호작용할 수 있는 임의의 단백질, 특히 항바이러스 활성을 갖는 분자들 또는 의약적 제품을 제조하는데 유용한 분자들을 스크린할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한, 의약적 제품을 제조하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 항바이러스 시약을 제조하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 펩티드와 바이러스의 외피 단백질의 복합체를 포함하는 백신에 관한 것이다. 상기 바이러스는 상기 언급된 바와 같은 AIDS 바이러스일 수 있다.
본 발명은 또한, 진단용 제품, 예를 들어 AIDS를 진단하는 제품을 제조하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, HIV의 바이러스 외피의 분자들을 검출하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, gp120 분자들 또는 그 유사체들과 CD4 분자와의 상호작용을 저해하는 분자들을 스크리닝하고, 항바이러스 활성을 갖는 분자들을 스크리닝하고, 의약적 제품을 제조하는 데에 유용한 분자들을 스크리닝하기 위한, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 크로마토그래피 매트릭스를 작용화하기 위한 고정된 리간드로서의, 상기 정의된 바와 같은 본 발명에 따른 펩티드의 용도에 관한 것이다.
서열 목록 및 첨부 도면들을 참조하여 하기 실시예들을 읽음으로써 더욱 많은 잇점들이 명백해질 것이다.
서열 목록에 대한 간단한 설명
첨부된 서열 목록은 하기 펩티드 서열들을 제공하며:
- 서열번호 1은 sCD4 서열이고,
- 서열번호 2는 실라톡신 (scyllatoxin, ScTx)의 서열이고,
- 서열번호 3은 실라톡신으로부터 유래되고, 서열의 1번 위치에 TPA를 갖지 않는 펩티드인 CD4M9 서열이고,
- 서열번호 4-16은 본 발명에 따라서 각각 CD4M9T, CD4M26, CD4M27, CD4M27A, CD4M27B, CD4M27C, CD4M30, CD4M31, CD4M32, CD4M33, CD4M35, K15 및 K16으로 명명된 서열이고,
- 서열번호 17은 실라톡신으로부터 유래되고, 서열의 1번 위치에 TPA를 갖지 않는, CD4M3로 명명된 서열이고,
- 서열번호 18은 카립도톡신 (charybdotoxin)으로부터 유래되고, CD4MO로 명명된 서열이다.
- 도 1은 경쟁적 ELISA에 의하여 얻어진, 본 발명에 따른 펩티드들에 의한, CD4의 바이러스 단백질 gp120에 대한 결합의 저해 곡선이다. 테스트되어진 펩티드들은: CD4M9, CD4M9T, CD4M27, CD4M32, CD4M33 및 CD4M35이었다. 실험 데이터는 펩티드 농도의 함수로서 결합 백분율 (%F)로 주어졌다.
- 도 2는 경쟁적 ELISA에 의하여 얻어진, 표지된 펩티드 CD4M33-플루오레신인, CD4M33-F에 의한, CD4의 바이러스 단백질 gp120에 대한 결합의 저해 곡선이다. 비교를 위하여 CD4M9 (서열번호 3), CD4M33 (서열번호 13) 및 CD4M35 (서열번호 14) 펩티드들에 대한 곡선들도 도시되어 있다. 실험 데이터는 펩티드 농도의 함수로서 결합 백분율 (%F)로 주어졌다.
- 도 3은 재조합 바이러스 단백질 gp120-HXB2의, 표면 플라즈몬 공명 기기 (surface plasmon resonance instrument)의 칩 표면에 부착된 CD4M33 (서열번호 13) 펩티드와의 상호작용 곡선이다. 결합 (0-300 s) 및 해리 (300-800 s) 곡선들은 바이러스 단백질 gp120을, 13.2 (1), 19.8 (2), 29.6 (3), 44.4 (4), 66.6 (5) 및 100 (6) nM의 농도로 주사한 이후에 기록되었다. 데이터는 초 단위 시간 (t)의 함수로서 공명 단위 (resonance units, RU)로 주어졌다.
- 도 4a 및 도 4b는 AT-2 [34]로 불활성화된 HIV-1과, 표면 플라즈몬 공명 기기의 칩의 표면에 부착된 항체 48d [11] (A) 및 CG10 [35] (B)과의, CD4M33 펩티드의 존재 하 (10 ㎍/ml), 불활성 펩티드 (Ala 23) CD4M9 (CD4M9의 펩티드 서열 중에서 Phe 23이 Ala으로 치환)의 존재 하 (10 ㎍/ml), 및 펩티드의 부존재 하에서의 상호작용 곡선이다. 결합 (0-180 s) 및 해리 (180-600 s) 곡선들은, 펩티드들과 함께 20℃에서 1시간 동안 사전 배양된, HIV-1의 주사 이후에 기록되었다. 데이터는 초 단위 시간 (t)의 함수로서 공명 단위 (RU)로 주어졌다.
- 도 5a 내지 도 5c는, CD4M30 (서열번호 10) (도 5a), CD4M33 (서열번호 13) (도 5b) 및 CD4M35 (서열번호 14) (도 5c) 펩티드들이, PHA-P로 활성화된 PBMCs 중에서 HIV-1LAI 균주의 복제에 미치는 효과를 나타낸 것이다. 데이터는 펩티드 농도 (nM)의 함수로서 배양 상등액 중의 역전사 효소 (RT) 활성의 저해 백분율 (%I)로 주어졌다.
도 6a 및 도 6b는, 가용성 CD4의 존재 및 본 발명의 펩티드들의 존재가, 재조합 바이러스 단백질 gp120HXB2와, 표면 플라즈몬 공명 기기의 칩 표면에 부착된 항체 CG10 (A) 및 48d (B)와의 상호작용에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 결합 (0-180 s) 및 해리 (180-400, 180-450 s) 곡선들은, 바이러스 단백질 gp120 단독, 및 CD4M27 (1.5 당량, 서열번호 6)의 존재 하, CD4M9 (1.5 당량)의 존재 하, 불활성 돌연변이 (Ala 23) CD4M9 (1.5 당량)의 존재 하, 및 가용성 CD4 (1.5 당량)의 존재 하에서 바이러스 단백질 gp120에 대하여 주어졌다. 데이터는 초 단위 시간 (t)의 함수로서 공명 단위 (RU)로 주어졌다.
- 도 7은, 아미노산 잔기들에 대하여 단일 문자 코드로 표현한 본 발명의 펩티드 서열들의 예들이다. TPA 및 B는, 각각 티오프로피온산 및 디페닐알라닌을 나타내며, "d"는 아스파르트산의 D 광학 형태를 나타낸다.
- 도 8은, 본 발명의 펩티드인 CD4M9 (서열번호 3)으로 작용화된 세파로오즈 4B 컬럼 (1.2 ×4 cm) 상에서 재조합 단백질 gp120HXB2를 정제하는 크로마토그래픽 프로필을 나타낸 것이다. 데이터는, 0.5 M 아세트산을 첨가해준 후, 시간 (min)의 함수로서 280 nm에서의 흡광도로 주어졌다.
실시예
실시예 1: 본 발명의 펩티드들의 합성
본 실시예에서는, Applied Biosystems 자동 펩티드 합성기를 이용한 고상 화학 합성법, 및 아미노산들의 α-아미노기의 일시적 보호를 위하여 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)기를 이용한 Fmoc 화학에 의하여, 본 발명의 펩티드들을 제조하였다. 이러한 Fmoc 방법에서, 아미노산 측쇄들 (lateral chains)의 부반응들을 방지하기 위하여 사용된 보호기들은, Ser, Thr 및 Tyr 잔기들에 대해서는 tert-부틸 에테르 (tBu)였고; Asp, Glu에 대해서는 tert-부틸 에스테르 (OtBu)였고; Gln, Asn, Cys, His에 대해서는 트리틸 (Trt)이었고; Lys에 대해서는 부틸옥시카르보닐 (Boc)이었고; Arg에 대해서는 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-설포닐 (Pmc)이었다.
커플링 반응은 레진 (0.1 mmol)에 대하여 10배 당량 과량의 아미노산 (1 mmol)으로 이루어졌다. 보호된 아미노산은 N-메틸피롤리딘 (NMP) 1ml, 및 NMP 용매 중의 1 M 1-N-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt)의 용액 1 ml에 용해되었다. 다음으로, 1 M N,N'-디시클로헥실카르보노디이미드 (DCC)의 용액 1 ml를 첨가하였다. 40 내지 50분 동안 활성화시킨 후에, 형성된 활성 에스테르를, 레진을 포함하는 반응기로 옮겼다. 이렇게 옮기고 커플링시키는 단계 이전에, NMP 중의 20% 피페리딘의 용액으로, 레진을 그의 Fmoc기에 대하여 탈보호시켰다. 과량의 피페리딘은 약 5 내지 10분 후에, NMP로 세척함으로써 제거하였다.
탈보호 동안, 305 nm에서의 디벤조풀벤-피페리딘 (dibenzofulvene-piperidine) 부가생성물의 검출은 합성이 올바르게 진행되도록 하는 것을 가능하게 한다. 구체적으로, 부가생성물의 정량은 Fmoc기의 탈보호 및, 결과적으로, 통합된 최종 아미노산의 커플링의 효과를 평가하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 펩티드들에 통합된 화학적 변형들
형광 프로브 및 비오틴기가 또한, 연구된 본 발명의 펩티드들 중 2개인, CD4M9T (서열번호 4) 및 CD4M33 (서열번호 13)에 커플링되었다. 이러한 두 가지 화합물들 상에의 통합은, 바이러스 단백질 gp120의 결합을 위한 부위 반대편 상의 라이신 11 잔기 상에서 발생하였다. 이러한 라이신의 선택은, 1-(4,4-디메틸-2,6-디옥소시클로헥실리덴)에틸기와 같은, 오르쏘고날 (orthogonal)로 명명된, 보호기로 그 곁사슬을 보호할 수 있다는 가능성에 의하여 조절되었다. 실제로, 그와 같은 기는 Fmoc기를 탈보호시키는데 사용되는 20% 피페리딘 처리에 대해서는 안정하지만, 2% 히드라진 용액 처리에 의해서는 특이적으로 절단된다. Dde기가 제거된 후에는, 플루오레신 및 비오틴을 커플링시키는 것이 가능하였다.
플루오레신의 도입. 형광기는, 각각 본 발명의 펩티드인 CD4M33의 라이신 11의 곁사슬, 및 본 발명의 펩티드인 K15 (서열번호 15) 또는 K16 (서열번호 16) 펩티드의 라이신 15 또는 16의 곁사슬 상에 도입되었다. Dde기는 펩티드 합성 동안에 라이신 곁사슬을 보호하기 위하여 사용되었으며, 디메틸포름아미드 (DMF) 중의 2% 히드라진으로 5분 동안 2회 처리함으로써 방출되었다. 플루오레신 분자는, 합성된 펩티드에 직접적으로 커플링되거나, 또는 부피가 큰 분자로서 결합 활성을 방해할 수도 있는 플루오레신에 거리를 두기 위한 아암을 통하여 합성된 펩티드에 커플링되었다. 후자의 경우에, 아암이 도입되는 것을 가능하게 하는 분자는 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산이었다. 17 당량의 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, 60 당량의 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 및 17 당량의 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸유로늄 (tetramethyluronium) 헥사플루오로포스페이트 (HBTU)를 1 당량의 레진에 첨가하였다. 주위 온도에서 1시간 동안 커플링시킨 후에, Fmoc기를 20% 피페리딘으로 탈보호시켰다. 다음으로, N-히드록시숙신이미딜 플루오레신 5(6)-카르복실레이트 에스테르를 사용하여 프로브의 커플링을 수행하였다. 이를 위하여, 14 당량의 디이소프로필에틸아민 (DIEA)의 존재 하에서, 플루오레신의 활성화된 에스테르 4 당량을 1 당량의 레진에 첨가하였다. 반응은 NMP 용매 중에서 밤새도록 진행되었다. 최종 탈보호를 수행하였다.
비오틴의 도입. 제1 단계에서, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄 스페이서 아암을 사전에 Dde 기에 대하여 탈보호된 라이신 11 상에 첨가하였다. 반응은 이전 단락 에 서술된 것과 유사하였다. 다음으로, 비오틴을 N-히드록시숙신이미딜 비오틴아미도카프로에이트 (biotinamidocaproate) 에스테르의 형태로 통합시켰으며: 따라서 14 당량의 디이소프로필에틸아민 (DIEA) 존재 하에서, 1 당량의 레진에 4 당량의 비오틴의 활성화된 에스테르를 첨가하였다. 반응은 주위 온도에서 밤새도록 진행되었다. 다음으로, 최종 탈보호 용액으로 처리하기 전에 레진을 세척하였다.
티올기의 도입. 상기 서술된 방법에 따라서, 11번 위치의 라이신이 곁사슬에 대한 보호기로서 Dde기를 갖는 펩티드 CD4M9를 합성하였다. 펩티드의 합성 이후에, 펩티드-레진을 DMF 중의 2% 히드라진 용액으로 5회 처리하였다. 링커 아암의 커플링은 10 당량의 Fmoc-8-아미노-3,6-디옥사옥탄산을 포함하는 DMF 중에서, 디이소프로필에틸아민의 존재 하에 시약 HBTU를 사용하여, 실온에서 1시간 동안 수행되었다. 다음으로, Fmoc기는 DMF 중의 20% 피페리딘으로 탈보호되었다. 펩티드-레진을, DIEA의 존재 하에서, 10 당량의 Traut's reagent (2-이미노티오란 히드로클로라이드 (Sigma))로 연이어 처리하였다. 최종적으로 펩티드를 방출하고, 하기 서술된 바와 같이 탈보호시켰다.
레진의 최종 탈보호
레진 및 곁사슬들에 존재하는 보호기들의 절단은, 레진에 결합된 펩티드를 트리플루오로아세트산 (TFA)로 처리함으로써 동시에 수행되었다. 절단을 수행하기 전에, 레진을 디클로로메탄 (DCM)으로 수회 세척하고, 최종적으로 건조시켰다. 절단에 사용된 시약은 81.5%의 TFA, 스캐빈져 페놀 (5%), 티오아니솔 (5%), 물 (5%), 에탄디티올 (2.5%) 및 트리이소프로필실란 (1%)을 포함하는 산 혼합물이었다. 레 진을, 레진 1g 당 100ml 용액의 비율로, 3시간 동안 주위 온도에서 진탕하면서 상기 혼합물로 처리하였다. 용액 중의 유리 펩티드는 여과에 의하여 회수하였다. 다음으로 펩티드를 침전시키고, 디이소프로필 에테르 중의 냉각 조건 하에서 세척하고, 20% 아세트산에 용해시키고, 동결건조시켰다.
디설파이드 브릿지 (disulphide bridges) 형성에 의한 본 발명의 펩티드들의 폴딩 (folding)
동결건조 이후에 회수된 펩티드인 합성 조생성물은, 환원된 형태, 즉 사슬간 디설파이드 브릿지들이 형성되지 않은 상태이다. 이러한 공유 결합들의 형성은 산화환원 커플 (redox couple)인 시스타민/시스테아민 (cystamine/cysteamine)을 사용하여 수행되었다. 합성 조생성물을 물에 넣고, 그 용해를 용이하게 하기 위해서 0.1% (v/v) TFA 및 6M 구아니디늄 클로라이드를, 2.0 mg/ml-1만큼 첨가하였다. 이 용액을 100 mM Tris/HCl, pH 7.8 및 5 mM 시스테아민으로 이루어진 환원 완충용액에 적가하여, 0.2 mg/ml-1로 희석시켰다. 주위 온도에서 45분 동안 반응시킨 후에 최종 농도 0.5 mM의 시스타민 (산화제)을 첨가하였다. 30분 후에 매질의 pH를 3.0으로 맞추었다.
시스테아민은 펩티드 상의 티올기를 환원시킬 수 있다. 공기 중에 개방된 상태에서, 그것은 산화되고, 시스테인을 산화시키며, 따라서 사슬간 디설파이드 브릿지들의 형성에 의하여 펩티드의 폴딩을 가능하게 한다. 조작의 종결시에 첨가된 시스타민은, 폴딩을 완성시키는 것을 가능하게 한다. 산화의 올바른 진행은, 조생 성물과 산화된 산물의 머무름 시간을 비교하는 분석 크로마토그래피에 의하여 확인되는데, 이는 조생성물의 머무름 시간이 더 길다.
11번 위치에 티올기를 갖는 CD4M9 펩티드의 산화는, 상기 단락에 서술된 것과 약간 다르다. 200 mM NaCl을 포함하는 20 mM 포스페이트 완충용액으로 이루어지며, pH 7.8로 조정된 폴딩 반응 매질은, 상당 시간 동안 아르곤으로 탈기체화시키고, 시스테아민 5 mM 및 시스타민 5 mM을 첨가한다. 다음으로, 7개의 유리 SH 작용기들을 포함하는 펩티드가 첨가되고, 단지 10분 후에 산을 첨가함으로써 산화 반응이 정지되는데, 이러한 시간은 폴딩 및 3개의 천연 디설파이드 브릿지들을 형성하는 데에는 충분히 긴 시간이지만, 더 높은 산화 상태들에 해당되는 부산물들의 형성을 제한할 정도로 충분히 짧은 시간이다.
본 발명의 펩티드들의 정제
본 발명의 펩티드들을 Vydac C18 프렙 컬럼 (preparative column) (1.0 ×25.0 cm) 상에서 역-상 고성능 액체 크로마토그래피에 의하여 정제하였다. 90분 동안, 0.1% 수성 트리플루오로아세트산 용액 중의 0-60% 선형 농도구배 아세토니트릴을 사용하였다. 주된 피크의 분획들을 분석급 HPLC에 의하여 분석하였으며; 하나의 피크만을 나타내는 분획들을 수집하고 동결건조시켰다. 이렇게 얻어진 산물을 질량 스펙트로메트리에 의하여 분석하였다.
실시예 2: 간접 ELISA에 의한 경쟁 분석
간접 ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)에 의하여 rgp120-CD4 상호작용의 저해를 측정하였다. 웰 당 50 ng의 항-gp120 항체인, D7324를 96-웰 플레 이트 (Maxisorb, Nunc) 상에, 4℃에서 밤새도록 고정시켰다. 소 혈청 알부민으로 패시베이션 (passivation)시키고, 세척 완충용액 (10 mM Tris, pH 7.8, 0.05% Tween 20)으로 3회 세척한 후에 웰 당 15ng의 rgp120HXB2를 첨가하였다. 다양한 농도의 경쟁인자들을 첨가하고, 3회 세척한 후에, 또한 웰 당 0.4 ng의 가용성 CD4를 첨가하였다. 오직 가용성 CD4만을 포함하는 100% 대조군을 제조하였다. 4℃에서 밤새도록 배양 및 3회 세척한 후에, 웰 당 5 ng의 생쥐 항-CD4 항체 L120.3을 첨가하고, 이어서 퍼옥시다아제-커플링된 염소 항-생쥐 IgG 항체 (GAMPO)를 첨가하였다. 검출은 퍼옥시다아제에 대한 형광 기질인, 3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘을 첨가함으로써 수행되었다. 반응은 2M 황산을 첨가함으로써 30분 후에 정지되었다. rgp120-CD4 상호작용의 저해는 450 nm에서의 흡광도 A를 판독함으로써 계산되었다. 경쟁인자가 없는 대조군들은 흡광도 A100%를 결정하는 것을 가능하게 하였다 (경쟁인자의 부존재시 흡광도). 본 발명의 펩티드의 각 농도에 대한 백분율 저해도를 하기 식을 사용하여 계산하였다:
저해도 (%) = 100 ×(A100%-A)/A100%.
분석은 중복적으로 수행되었으며, 결과들은 실험 중복치들의 평균으로서 표현되었다.
카립도톡신으로부터 유래된 CD4MO 펩티드 (서열번호 18) 및 실라톡신으로부터 유래된 CD4M3 펩티드 (서열번호 17)의 생물학적 활성들을 간접 ELISA 분석에 의하여 분석하였다. 이러한 펩티드들은 rgp120LAI-가용성 CD4 상호작용을, 각각 4.0 ×10-5 M 및 2.0 ×10-5 M의 50% 저해 농도 (또는 IC50)로 저해하는 능력을 보여 주었다 (표 1) [4]. 이러한 수치들은 가용성 CD4 (IC50 = 4.0 ×10-9 M)에 의하여 주어진 IC50 보다 10,000배 더 높은 값이다 [4].
첨부된 도 1은 본 발명의 펩티드들을 사용하여 본 실시예에서 얻어진 결과들을 모아 놓은 것이다.
그들은 경쟁인자, 즉 본 발명의 펩티드의 몰 농도 (C (M))의 함수로서, 바이러스 단백질 gp120HXB2-CD4의 부착 백분율 (%F)을 표현한 것이다. 이러한 수치는 CD4-gp120HXB2 상호작용의 저해를 보여준다. CD4M9 (서열번호 3)은 ELISA 상에서의 경쟁에 의하여 분석되었다. 그 결과, 50% 저해농도 (IC50) 값이 4 ×10-7 M (표 1)로서 rgp120LAI-가용성 CD4 상호작용을 저해하는 능력을 보여주며, 이는 본 발명의 펩티드 CD4M3 (서열번호 17)와 비교할 때에 저해 성능에 있어서 50배 증가된 것이다. 본 발명의 펩티드인 CD4M9 역시, 경쟁적 ELISA 분석에서, CD4가 T- 및 M- 향성 바이러스: HIV-1ⅢB, HIV-1MN, HIV-1Ba-L, HIV-1JR-FL, HIV-1
W61D로부터 유래된 다른 재조합 gp120 단백질들과 상호작용하는 것을, 0.1 내지 1.0 ×10-6 M (IC50)로 저해할 수 있다 [4].
이러한 펩티드는 gp120HXB2-가용성 CD4 상호작용을 9 ×10-8 M의 IC50으로 저해 한다 (도 1, 표 1).
CD4M9의 C-말단 서열 Gly-Pro이 Val으로 치환된 것을 포함하는, 돌연변이 CD4MV는, gp120LAI-CD4 상호작용의 저해에 있어서 3.0 ×10-7 M의 IC50 수치를 나타내며 (표 1), 이는 저해 성능에 있어서 약간의 증가를 나타낸다. 돌연변이 CD4M9Dip는 CD4M9과 비교하여 치환체 Phe23Dip를 포함하며; 이러한 펩티드는 gp120LAI-CD4 상호작용의 저해에 있어서 1.0 ×10-7 M의 IC50 수치를 나타내며 (표 1), 이는 저해 성능에 있어서 더 증가된 것을 나타낸다. N-말단 Cys 아미노산에 대한 치환체로서 티오프로피온산을 포함하는 돌연변이 CD4M9T (서열번호 4)는, gp120LAI-CD4 상호작용의 저해에 있어서 3.0 ×10-8 M의 IC50 수치를 나타내며 (도 1; gp120HXB2 상호작용에 있어서의 IC50은 1.1 ×10-8 M, 표 1), 이는 CD4M9과 비교할 때에 10배에 가까운 증가를 나타내는 것이다.
하기 돌연변이들은 모두, 각각, N- 및 C- 말단 위치에서 티오프로피온 (TPA) 및 발린 (Val 또는 Ile) 잔기를 나타내며, 모두 T-향성 바이러스들인 HIV-1HXB2 및 HIV-1LAI로부터 유래된 gp120으로 테스트되었다.
본 발명의 펩티드인 CD4M27 (서열번호 6)은 돌연변이 Arg5Phe (필수적이지 않은 아르기닌을 제거하고, 디설파이드 브릿지 6-24를 보호함) 및 Gly27Val, 및 C- 말단 프롤린 잔기의 결실 (β-구조에 더 나은 안정성을 부여함)을 포함한다. 그것은 CD4-gp120HXB2 결합을 저해하는 능력에 있어서 증가를 나타내며, 7 ×10-9 M의 IC50을 갖는다 (도 1, 표 1). 펩티드 CD4M27 A, B 및 C는, 각각, CD4M27로 시작하여 돌연변이 Gly21Ser (a), Ser22His (b) 및 Ser22Asn (c)에 의하여 얻었다. 그들은 펩티드 CD4M27의 그것과 비교할만한 저해 성능을 나타내었다.
본 발명의 펩티드 CD4M32 (서열번호 12)는, CD4M9T와 비교하여, C-말단 프롤린 잔기의 결실, 돌연변이 Gly27Val 및 디페닐알라닌 (Dip)으로의 Phe23의 돌연변이를 포함하며: 돌연변이 Phe23Dip는 Phe23의 곁사슬에 소수성 연장을 초래함으로써, 바이러스 단백질 gp120의 소수성 공동과의 상호작용을 증가시킨다. CD4M32는 CD4-gp120HXB2 결합의 저해에 있어서 증가를 나타낸다 (8 ×10-10 M의 IC50, 도 1). CD4M32와 비교하여, 돌연변이 CD4M30 (서열번호 10)은, 분자의 용해도를 증가시키기 위하여 돌연변이 Arg5Phe (CD4M27에 이미 도입) 및 Ala4Gln을 포함한다. 본 발명의 이러한 펩티드는, CD4-gp120LAI 상호작용의 저해 분석에 있어서, 3.0 nM의 IC50을 나타낸다. 돌연변이 CD4M33 (서열번호 13)은 앞선 2개의 펩티드들에 존재하는 돌연변이들을 포함하며, 특히 Cys1TPA, Arg5Phe, Phe23Dip, Gly27Val, C-말단 위치 중 잔기의 결실, 및 부가적으로, 돌연변이 Ala4His (분자의 용해도를 증가시킴)를 포함한다. 이러한 돌연변이들은 부가적인 효과를 가지며, 본 발명의 펩티드 CD4M33이 CD4-gp120HXB2 및 CD4-gp120LAI 상호작용들을, 1.2 ×10-10 M 및 2.5 ×10-10 M의 IC50으로 저해하는 것을 가능하게 하며, 이는 CD4M9과 비교하여 CD4-gp120 결합을 저해하는 능력에 있어서 1000배 증가된 것이다. 부가적인 펩티드인, CD4M35 (서열번호 14)가, 본 발명의 펩티드 CD4M33과 비교하여, 돌연변이 Val27Ile 및 Gly21(D)Asp를 갖도록 합성되었다. 이러한 돌연변이들은 본 발명의 펩티드가 CD4-gp120HXB2 상호작용을 7.0 ×10-11 M의 IC50으로 저해하는 것을 가능하게 한다 (도 1, 표 1).
2개의 다른 펩티드들, K15 (서열번호 15) 및 K16 (서열번호 16)이 합성되었으며: 그들은, 본 발명의 펩티드 CD4M33과 비교하여, Gln7Val, Leu8Gln 및 Lys11His 치환들을 포함하며, 각각 15 또는 16번 위치에 Lys 잔기를 갖는다. 다음으로, 실시예 1에 서술된 프로토콜에 따라서, 플루오레신 형광기가 이러한 라이신 잔기의 곁사슬에 공유적으로 부착되었다. 형광 K15 및 K16 펩티드들은 gp120LAI-CD4 상호작용의 저해에 있어서 5.0 ×10-8 M 및 6.0 ×10-9 M의 IC50을 나타내며, 이는 표지화에 의하여 바이러스 단백질 gp120에 대한 친화도가 변화되지 않았음을 의미한다.
결론적으로, 본 발명은, CD4-gp120 상호작용의 강력한 저해제들이 되는 펩티드 패밀리를 제공한다.
| 명칭 | 서열번호 | IC50 (gp120LAI) | IC50 (gp120HXB2) |
| CD4M0 CD4M3 CD4M9 CD4M9V CD4M9T CD4M9Dip CD4M27 CD4M30 CD4M32 CD4M33 CD4M35 K15FR K16FR | 18 17 3 - 4 - 6 10 12 13 14 15 16 | 40 μM 20 μM 400 nM 300 nM 30 nM 100 nM 10 nM 3.0 nM 2.0 nM 250 pM - 50 nM 6 nM | - - 90 nM - 11 nM - 7 nM - 800 pM 120 pM 70 pM - - |
실시예 3: 표면 플라즈몬 공명 실험들
표면 플라즈몬 공명 실험들을 Biacore 2000 시스템 (Biacore, Uppsala, Sweden)으로 수행하였다. 테스트되어진 펩티드들은 비오틴에 커플링된 다음 (상기 서술한 바와 같이), 스트렙타비딘 (streptavidin)이 미리 부착된 칩 상에 고정되었다.
스트렙타비딘은 하기와 같이 칩 상에 고정되었다: 칩의 표면을, 제조업자에 의하여 공급되고 아미드 결합을 형성할 수 있는 커플링 시약 50 ㎕를 주입시켜 먼저 활성화시키고: N-에틸-N'-(디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC)/N-히드록시-숙신이미드 (NHS), 50/50; 다음으로, 10 mM 소듐 아세테이트, pH 4.5 중의 20 ㎕ 스트렙타비딘, 0.2 mg/ml을 5 ㎕/min의 속도로 주입하고, 이어서 활성화된 카르 복실기를 pH 8.5의 1.0 M 에탄올아민 2 ×20 ㎕로 중화시켰다. 다음으로, 비오틴화된 분자들을 칩의 4개 레인들 중 3개 상에 주입 (pH 7.4의 0.3 M NaCl을 포함하는 10 mM Hepes 완충용액 중에서 10 ㎕/min의 속도로 주입)하였다. 첫 번째 레인 상에는, CD4M9 (10-7 M)을 RU (공명 단위) 수치 100까지 고정화시키고; 두 번째 레인은 미사용인 채로 방치하고 (대조군); 세 번째 레인은 450 RU까지 가용성 CD4 (10-7 M)로 덮고; 네 번째 레인 상에는 CD4M33 (10-7 M)을 100 RU의 수치로 고정시켰다. 각각의 분석을 위하여, 여러가지 농도의 다양한 gp120들 (균주 HXB2, BAL 및 JRFL)을, 25 ℃에서, 50 ㎕/min의 속도로, 4분의 결합 (association) 시간동안 주입하였다. 해리 상을 분석하기 위하여, 칩을 유동 완충용액인, 150 mM NaCl, 3.4 mM EDTA 및 0.05% P20을 포함하는, pH 7.4의 10 mM Hepes로 세척하였다. 각각의 실험 후에, 칩을 25 ㎕의 1.0 M 포름산으로 재생시켰다. 해리 상수들은 Bia-평가 3.0 소프트웨어에 의하여 결정된 동적 상수들로부터 계산하였다.
실시예 4: CD4 의사체들의 항바이러스 활성
감염성 물질의 취급은 L3-타입 고안전 실험실에서 수행되었다. 병리생리학적 조건들에 가능한 한 근접하기 위하여, 연구는 인간 말초 혈액 단핵 세포들 (human peripheral blood mononucler cells, PBMCs)의 일차 배양물을 사용하여 수행되었다. 모든 실험들에서, 새로운 분자들의 효과들은 AZT의 그것과 비교되었다.
세포의 분리, 배양 및 활성화
배양 배지
배지 A는, 56℃에서 30분 동안 열-탈보충된 (heat-decomplemented) 태아 송아지 혈청 (foetal calf serum) (SVF, Roche Product), 2 mM L-글루타민 (Roche Product) 및 세 가지 항생제 100 ㎍/ml 용액 (페니실린, 스트렙토마이신, 네오마이신; PSN, Life Technologies) 10%로 보충된, RPMI 1640 세포 배양 배지 (Life Technologies)로 이루어졌다. 배지 B는 재조합 인간 IL-2 (Roche Product) 20 UI/ml로 보충된 배지 A로 이루어졌다.
PBMCs의 분리 및 활성화
PBMCs는 피콜 (ficoll) (MSL 2000, Eurobio) 농도구배 원심분리에 의하여 혈액의 다른 성분들로부터 분리되었으며: 3분의 1로 희석된, 건강한 공여자로부터의 혈액 30 ml를 20 ml 피콜 쿠션 상에 침적시켰다. 850 g에서 20분 동안 원심분리시킨 후에, PBMCs의 고리를 제거하고, 750 g에서 10분 및 400 g에서 5분 동안 원심분리시킨 후에, RPMI 1640으로 2회 세척하였다. 다음으로, PBMCs를 1 ㎍/ml의 피토헤마글루티닌-P (PHA-P; Difco Laboratories)로 48시간 동안 활성화시켰다. PBMCs를 5% CO2 하의 습기로 포화된 대기 중에서 +37℃로 배양하였다. 48시간 동안의 세포 분열 활성화 (mitogenic activation) 종결 시점에서, 그들을 배지 B에서 배양하였다. 배양 내내, 배양 상등액을 샘플링하고, 배양 배지는 매 3 내지 4일마다 새롭게 해주었다. 배양 배지를 매번 새롭게 해줄 때마다, 세포 생존도를 현미경 관찰에 의하여 평가하였다.
분자들의 항레트로바이러스 활성에 대한 평가
본 발명의 화합물 CD4M30, CD4M33 및 CD4M35를 주사 제제를 위한 살균수 (Aguettant) 중에 용해시키고, 분액화하고 (aliquoted), 이어서 -20℃에서 저장하였다. 화합물 SAH-CD4 (Aventis (Vitry-sur-Seine)에 의하여 제공된 인간 혈청 알부민과 커플링된 가용성 CD4)를, 사용될 때까지, -80℃에서 보관하였다. 이어서, 용액 및 희석액을 배지 A 중에서 즉석으로 제조하였다. PBMCs를 화합물로 1시간 동안 전처리하고, 림프구 향성 (lymphocytic tropism)을 갖는 대조 분리주인 HIV-1LAI, 또는 임상적 분리주인 HIV-1LEN으로 감염시켰다.
이러한 분리주의 생물학적 특성들은: 빠르고/높은, 합포체 유도 (scyncitia inducing, SI), X4이며: 따라서 바람직하게는 림프구를 감염시킬 수 있다. 바이러스 스톡은 이러한 균주를, 1 ㎍/ml의 PHA-P로 미리 활성화시키고, 배지 B에서 배양된 탯줄 혈액 단핵 세포들 (UCBMCs)을 사용하여, 생체외에서 증폭시킴으로써 제조되었다. 싸이토카인과 같은 가용성 인자들을 제거하기 위하여, 배양 상등액을 360,000 g에서 5분 동안 초원심분리하였고, 침전물을 RPMI 1640에 재현탁시켰다. 이렇게 제조된 바이러스 스톡을 PHA-P-활성화된 PBCMs를 사용하여 적정하였다. Karber 공식을 사용하여 TCID50 (50% Tissue Cultured Infectious Dose)을 계산하였다. PBMCs를 다양한 바이러스 투여량으로, 즉 10-100 TCID50의 균주 HIV-1LAI 및 50 TCID50의 균주 HIV-1LEN으로 감염시켰다 (감염의 배수 (multiplicity of infection, MOI = 0.001).
배양 상등액 중에서의 바이러스 복제 분석
Innovagen 사의 권장사항에 따라서 RetroSys (등록 상표) 분석 키트를 사용하여 배양 상등액 중의 역전사 효소 활성을 분석함으로써, 배양 7일 째에, 바이러스 복제를 측정하였다.
결과들의 분석 및 50% 유효 투여량의 결정
J. Chou 및 T.C. Chou에 의하여 개발된 "Dose-effects analysis with microcomputers" 소프트웨어를 사용하여 50% 유효 투여량 (ED50)을 계산하였다.
실시예 5. 재조합 바이러스 단백질 gp120을 제조하기 위한 프로토콜
BamHⅠ (바이러스 단백질 gp120의 KpnⅠ 부위 상류) 및 PstⅠ (바이러스 단백질 gp120의 말단에 첨가된 정지 코돈의 하류) 부위들을 포함하는 단편을 생성할 수 있는 2개의 프라이머들을 사용하여, 플라스미드 HIVⅢB/HXB2R 중에서 PCR에 의하여 바이러스 단백질 gp120 (아미노산 V12 내지 R481)을 코딩하는 단편을 증폭하였다. 이렇게 얻어진 BamHⅠ/PstⅠ 단편을 Bluescript 벡터 (pBS, Stratagene) 내로 클로닝하여, 플라스미드 pBSm1을 제조하였다. 바이러스 단백질 gp120의 N- 말단을 코딩하는 서열 (T1 내지 G11) 및 오토그라파 칼리포니카 바쿨로바이러스 (Autographa californica baculovirus)의 엑디스테로이드 글리코실전이효소 (ecdysteroid glycosyltransferase)의 시그날 펩티드를 코딩하는 서열을, pBSm1의 BamHⅠ과 KpnⅠ 부위 사이에 삽입하여 pBSm2를 제조하였다.
다음으로, pBSm2의 BamHⅠ-PstⅠ 단편을, 바쿨로바이러스 P10의 전달 벡터 p119P의 BglⅡ-PstⅠ 부위 사이에 삽입시켰다. Sf9 곤충 세포들을, 변형된 바쿨로 바이러스 AcSLP10의 정제된 바이러스 DNA 및 재조합 벡터 p119P gp120의 DNA로 트랜스펙션시켰다. 재조합 바이러스들은 표준 방법에 의하여 정제하였다.
Sf9 scla 세포들 (혈청 없이 성장할 수 있게 된 세포주로서, Pasteur Institute에 기탁됨)을 무혈청 배지 중의 스피너 (spinner) 중에서 보관하였다. 이러한 세포들 (5 ×105 세포들/mL)을 세포 당 1 PFU (Plaque-forming unit) (플라크-형성 단위)의 MOI로 재조합 바이러스들에 감염시키고, 28℃에서 배양하였다. 감염 6일 후에, 세포들을 원심분리하고 (500 g), 야생형 gp120 바이러스 단백질을 농축시키고, 항-gp120 항체 D7324에 커플링된 브로모아세틸화된 세파로오즈 컬럼 상에서 친화 크로마토그래피에 의하여 배양 상등액으로부터 직접적으로 정제하였다.
실시예 6: 바이러스 외피의 부착
그 생물학적 활성을 더욱 철저하게 특징 짓기 위해서, 본 발명의 펩티드인 CD4M33 (서열번호 13)을, 실시예 1에 서술된 바와 같이, 본 발명의 펩티드 CD4M33의 활성 표면과 반대편 표면 상에 위치한 Lys-11 상에서, 비오틴 및 플루오레신 형광 프로브로 표지하였다. 그 활성은 ELISA 분석에서 불변인 상태로 유지되었다 (도 2).
도 2는 본 실시예에서 얻어진 결과들을 함께 모아 놓은 것이다. 이들은, 본 발명의 펩티드들의 몰 농도의 함수로서 (C(M)), 이러한 펩티드들의 바이러스 단백질 gp120HXB2와의 부착 백분율 (%F)의 변화 과정을 보여주는 곡선들이다.
이러한 결과들은 펩티드 CD4M33이 그 생물학적 활성이 변화되지 않고 표지기를 포함할 수 있다는 것을 보여준다.
본 발명의 펩티드인 CD4M33의 바이러스 단백질 gp120에 대한 친화도에 대한 첫 번째 평가 결과를 얻기 위하여, 표면 플라즈몬 공명에 의한 검출에 기초한, 생특이적 상호작용의 분석 (실시예 3에 서술)을 사용하였다. 이러한 기법에서, 본 발명의 비오틴화된 펩티드 CD4M33 (실시예 1에서 제조)은, 스트렙타비딘이 미리 접합된 칩의, 카르복실화된 덱스트란 매트릭스에 특이적으로 부착되었다. 다음으로, 다양한 재조합 gp120 단백질의 용액들 (gp120HXB2, gp120BAL 및 gp120JRFL)을 이러한 매트릭스 상에 주입하고, 특이적이고 고친화성 결합을 나타내는 신호를 검출하였다. 도 3은 시간의 함수로서, gp120HXB2 단백질 (다른 농도들에서)의 본 발명의 펩티드 CD4M33과의 상호작용 이후의, 플라즈몬 공명 신호의 변화 과정을 보여주는 것이다.
얻어진 결합 및 해리 곡선들의 비선형 회귀 (non-linear regression)이후에, 바이러스 단백질 gp120HXB2에 대하여 2.4 ×10-9 M, 바이러스 단백질 gp120BAL
에 대하여 7.4 ×10-9 M, 바이러스 단백질 gp120JRFL에 대하여 8.5 ×10-9 M의 해리 상수 KD 값이 얻어졌다. 이러한 수치들은 CD4-gp120 상호작용에 대하여 보고된 참고문헌 [34]의, KD=1.9 ×10-8 M과 필적되는 것들이다. 표면 플라즈몬 공명에 의한 검출에 기초한 동일한 기법이, 본 발명의 펩티드 CD4M33이 그 천연의 형태로 바이러스 외 피에 부착될 수 있는지 여부를 확인하는데 또한 사용되었다. 이를 수행하기 위해서, 알드리티올-2 (aldrithiol-2) [35]로 불활성화된 바이러스 입자들의 현탁액이, 항체 48d 및 CG10이 접합된 동일한 칩 상에 주입되었다. 상기 현탁액이 본 발명의 펩티드 CD4M33과 함께 배양된 경우에, 특이적이고 고친화적인 상호작용에 대한 신호가 명확히 검출되었으나, 바이러스 현탁액이 훨씬 덜 활성을 띄는 펩티드 CD4M9과 함께 배양되거나, 펩티드의 부존재 하에서 배양된 경우에는, 그렇지 않았다 (도 4).
도 4는 CD4M33의 존재가, 바이러스 외피와 바이러스 외피-특이적 항체들인 48d 및 CG10과의 상호작용에 필수적이며, 그 부존재 하에서는 HIV-1이 항체들에 부착하지 않는다는 사실을 보여주며: 이는 펩티드 CD4M33이 HIV-1의 바이러스 외피에 부착된다는 사실에 대한 간접적인 증거이다.
이러한 실험들은, 표지된 또는 비표지된, 본 발명의 펩티드 CD4M33이, 분리되고 정제된 재조합 형태 및 바이러스 표면에 존재하는 천연의 형태 양자 모두에서 HIV 바이러스 외피에 부착할 수 있는 능력을 가진다는 것을 설명해 준다.
실시예 7: HIV-1으로의 감염 저해
본 발명의 펩티드들의 항바이러스 성능을 평가하기 위해서, 본 발명자들은 인간 말초 혈액 단핵 세포들 (PBCMs)의 일차 배양물들을, HIV-1LAI 바이러스 및 화학적 분리주 HIV-1LEN으로 감염시키는 것으로 이루어지는 실험들을 수행하였다. 모든 실험들에서, 새로운 분자들의 효과는 AZT의 그것과 필적하는 것이었다. HIV-1LAI 바 이러스는, 다양한 농도의 CD4M30, CD4M33, CD4M35 및 SAH-CD4의 존재 하에서, 다양한 바이러스 투여량으로 (10-100 TCID50, 표 2) 첨가되었다. HIV-1LEN 바이러스는 CD4M33의 존재 하에서, TCID50 (표 4) 값으로 첨가되었다. 또한, CD4 유사 독성 테스트들을 동일한 세포들에 대하여 수행하였다.
a. CD4 의사체들의 독성. 테스트되어진 투여량들에서, AZT, SAH-CD4 또는 항-CD4 의사체들 중 어느 화합물도 PHA-P-활성화된 PBMCs의 생존가능성을 감소시키지 않았다.
b. CD4 의사체들의 항-HIV-1
LAI
활성
b.1. PBMCs 중에서 HIV-1 LAI 균주의 복제. HIV-1LAI 균주는 PHA-P-활성화된 PBMCs 중에서 높은 수준으로 복제된다. 바이러스 복제의 피크는 배양 7일째였으며, 펩티드 CD4M30, CDM33 및 CD4M35의 효과들은 감염후 이 시점에서 정량되었다.
b.2. PBMCs 중에서 HIV-1 LAI 균주의 복제에 대한 AZT의 효과. AZT는 PHA-P-활성화된 PBMCs 중에서 HIV-1LAI 균주의 복제를 강력하게 저해한다 (표 2). ED50은 3-14 nM에 해당된다.
b.3. PBMCs 중에서 HIV-1 LAI 균주의 복제에 대한 화합물 SAH-CD4의 효과. PHA-P로 활성화되고, HIV-1LAI 균주로 감염된 PBMCs에 대한 화합물 SAH-CD4의 항레트로바이러스 활성은 2.5 μM의 농도에서 바이러스 복제를 85 ±15% 저해하는 결과를 보였다.
b.4. PBMCs 중에서 HIV-1 LAI 균주의 복제에 대한 CD4 의사체들의 효과. 본 발명의 펩티드들인 CD4M30, CD4M33 및 CD4M35는, PHA-P로 활성화되고, HIV-1LAI 균주로 감염된 PBMCs의 배양물 중에서 항레트로바이러스 활성 (표 3)을 나타내었다. 화합물 CD4M33은 테스트되어진 다양한 바이러스 투여량들 중에서 3가지 중 가장 항바이러스성을 나타내었다. 그 활성은 AZT의 그것보다 작았지만: ED50 = 100-500 nM vs. AZT: ED50 = 3 nM (하기 표 3), CD4 수용체 유도체인 SAH-CD4의 그것보다 10배 만큼 더 컸다.
도 5a-c는 얻어진 결과들을 함께 모아 놓은 것이다: nM 단위의 펩티드 농도의 함수로서 저해 백분율 (%I).
c. 임상적 분리주 HIV-1
LEN
에 대한 화합물 CD4M33의 항레트로바이러스 활성
c.1. PBMCs 중의 분리주 HIV-1
LEN
의 복제에 대한 AZT의 효과
AZT는 PHA-P로 활성화되고, 분리주 HIV-1LEN으로 감염된 PBMCs 중에서 HIV-1LEN 균주의 복제를, 2.2 nM에 해당되는 ED50으로, 강력하게 저해한다 (표 4). 저해의 정도는 림프구 향성을 갖는 대조 균주, HIV-1LAI에 대하여 관찰된 것과 동일하였다.
c.2. PBMCs 중의 임상적 분리주 HIV-1
LEN
의 복제에 대한 의사체 CD4M33의 효과
PHA-P로 활성화되고, 분리주 HIV-1LEN으로 감염된 PBMCs에 대한 의사체 CD4M33의 레트로바이러스 활성은, 바이러스 복제에 있어서의 투여량-의존적 감소에 관련이 있으며, ED50은 367 nM에 해당된다 (표 4). 그러므로, 의사체 CD4M33은, 비록 그것이 HIV-1LAI 균주에 대하여 관찰된 것과 비교할 때에 약간 낮은 것으로 관찰된다 할지라도, 현저한 항-HIV-1 활성을 보존한다.
이러한 실험들은 본 발명의 이러한 펩티드들이, 매우 높은 바이러스 투여량에서도, 900-35 nM의 ED50 수치로 (하기 표 3), 세포들의 감염을 저해할 수 있다는 것을 보여준다. 본 발명의 펩티드인 CD4M33은 가장 항바이러스성이며, 그 ED50은 감염을 위한 표준 바이러스 투여량에 대해서 대략 100 nM이었다 (도 4 a-c, 하기 표 3).
부가하여, CD4M33 펩티드는, 다른 CD4 수용체 유도체인 SAH-CD4에 대하여 관찰된 그것보다 10배만큼 더 큰 항레트로바이러스 활성을 보유하였으며, 특히 임상적 분리주에 대하여 현저한 항-HIV 활성을 나타내었다 (표 4).
결론적으로, 재조합 바이러스 단백질 gp120에 2.4-8.0 nM의 Kd 값으로 부착할 수 있으며 (표면 플라즈몬 공명 실험들), CD4와 ELISA에서의 gp120 재조합 단백질들 사이의 상호작용을 120-250 pM의 IC50으로 저해할 수 있는, 본 발명의 펩티드인 CD4M33은 또한, 인간 세포들의 일차 배양물 중에서의 이러한 상호작용을 저해하고, 진입의 초기 단계를 저해하고, 따라서 HIV-1 임상적 분리주의 감염을 차단할 수 있 는 능력을 나타낸다.
| AZT (nM) | % 저해도 |
| 1 10 100 100 10,000 | 39 + 10% 59 + 28% 87 ±18% 100 ±0% 100 ±0% |
| ED50 (nM) | |||
| 서열 | 100 TCID50 | 50 TCID50 | 10 TCID50 |
| CD4M30 CD4M33 CD4M35 AZT | 894 534 154 14 | 235 133 428 3 | 253 118 266 5 |
| HIV-1LEN | AZT | CD4M33 |
| ED50 (nM) ED70 (nM) ED90 (nM) | 2.2 4.8 16.5 | 367 542 1006 |
실시예 8: 외피의 항원 부위들의 노출
항체들을 중성화시키는 데에 민감한 에피토프들의 노출을 특징으로 하는, gp120 단백질에 있어서의 구조적 변형을 유도하는, 본 발명의 펩티드인 CD4M33의 능력을 평가하기 위하여, CD4M33 및, 대조군으로서, 재조합 CD4의 존재 하에서, 48d 및 CG10과 같은 인간 항체들의, HIV 외피와의 상호작용을, 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 측정하였다. 항체 48d 및 CG10은 칩 (바이오칩)의 표면에 공유적으로 부착되며, CD4 부존재, 및 과량의 CD4 및 CD4M33 존재 하에 gp120의 용액을 주입하였다. CD4M33이 1.5배 및 20배 몰 과량으로 바이러스 단백질 gp120HXB2에 첨가되는 경우에, 바이러스 단백질은 항체들과 강한 상호작용을 나타내었으며 (도 6a-b); 반면에, 그 부존재 하에서는 (또한 가용성 CD4의 부존재 하에서), 외피 단백질은 항체들과 매우 약하게 상호작용하였다 (도 6a-b). 부가하여, 항체들에 대한 바이러스 단백질 gp120의 상호작용의 친화도 증가에 대하여, CD4M33의 첨가가 미치는 효과는, 균등량의 가용성 CD4를 첨가함으로써 얻어지는 효과와 필적할만한 것이었다.
본 발명자들은 또한, HIV-1, 균주 HXB2를 직접적으로 사용하여 유사한 플라즈몬 공명 실험들을 수행하였다. 도 4는 이러한 실험들에서 얻어진 결과들을 나타낸 것이며, HIV-1HXB2 바이러스 입자 현탁액과 고정화된 항체들인 48d 및 CG10을 나타내는 칩과의 상호작용 이후에, 시간의 함수로서 플라즈몬 공명 신호의 변화 과정을 나타낸 것이다: HIV-1은 본 발명의 펩티드인 CD4M33과 함께 배양한 후에만 항체들과 상호작용하였으며, 반면에, 그 부존재 하, 또는 불활성 펩티드인 [Ala23]CD4M9의 존재 하에서는 상호작용은 실질적으로 0이었다.
그러므로, 표면 플라즈몬 공명 기술은, CD4M33의 외피 단백질 gp120에의 결합이 바이러스 단백질의 변형을 유도할 수 있으며, 이는 이어서 HIV-1에 감염된 개체들로부터 분리된 중화 항체들 (17b, CG10)을 특정 분자 표면들에 노출시킬 수 있다는 것을 설명하는 것이 가능하다 [11], [12], [13].
본 발명의 펩티드인 CD4M33에 의하여 야기되는, 이러한 숨은 에피토프들의 노출은, 재조합 형태의 외피 단백질 및 비리온들의 외피 양자 모두에 있어서 효과적이다. 부가적으로, CD4와 복합체화된 gp120 단백질이 중화 항체들의 형성을 유도할 수 있는 분자적 형태일 수 있다는 것을 보여주는 최근 연구들을 고려하면 [31], [32], [33], CD4M33-gp120 복합체는 따라서, 중화 항체들을 유도하기 위한 면역원, 특히 백신 용도에 있어서의 면역원으로서 매우 유리한 후보물질이 될 수 있다.
CD4M33은, CD4에 대한 면역반응을 유도하지 않고, 부가적으로, 그 작은 크기로 인하여, 바이러스 단백질 gp120의 드러난 에피토프들에 더욱 용이하게 접근하는 것이 가능하다는 잇점을 가지면서, 가용성 CD4가 그러한 것처럼, 바이러스 단백질 gp120의 에피토프들을 노출시킬 수 있는 특성을 갖는다.
실시예 9: HIV 바이러스 외피를 정제하기 위한 크로마토그래피 지지체의 합성
바이러스 단백질 gp120을 정제하기 위한 크로마토그래피 매트릭스를 작용화시키기 위한 고정화된 리간드로서 본 발명의 CD4 의사체 펩티드의 사용가능성을 평가하기 위해서, 친수성 폴리머 지지체인 세파로오즈 4B (Pharmacia, Uppsala, Sweden)를 본 발명의 CD4 의사체들 중의 하나로 작용화시키고, 바이러스 단백질 배양 배지로부터 직접적으로 바이러스 단백질 gp120을 부착시키는 데에 사용하였다. 지지체로부터 gp120 단백질을 용출시키는 동안 너무 극단적인 조건들을 사용하는 것을 피하고, 따라서 변성의 가능성들을 제한하기 위해서, 바이러스 단백질 gp120에 대하여 더 낮은 친화도를 갖는 리간드를 선택하였다. ELISA에 의하여, 바이러스 단백질 gp120에 대하여, HIV-1 분리주에 따라서 0.1 μM 내지 1.0 μM 사이의 친화도 (IC50)를 나타내는 것은 CD4M9이었다. CD4M9는, 앞서 표지화에서 사용되었던, Lys11의 위치에서 변형되어, 부가적인 티올기를 포함하게 되었으며 (실시예 1에서 서술), 하기 서술하는 바와 같이 세파로오즈 4B 지지체 상에 그 공유적 고정화를 위하여 사용되었다.
건조 레진 ml 당 7 내지 12 μmol의 일차 아민 작용기들을 포함하는 EAH 세파로오즈 (상표명) (Pharmacia Biotech에 의하여 판매) 레진을, 말레이미드 (maleimide) 기로 작용화시켰다. 이를 위하여, 24 ml의 물 중에 사전 평형화된 12 ml의 레진을, pH를 대략 4.5로 유지하면서, 12시간 동안 1.05 mg의 술포-SMCC 시약 (4-(N-말레이미도에틸)-시클로헥산-1-카르복실산의 3-술포-M-히드록시숙신이미드 에스테르 (Sigma))으로 처리하였다. 예상되는 치환 정도는 건조 레진 ml 당 200 nmol의 말레이미드 작용기였다. 다음으로, 과량의 시약을 pH 8.0의 100 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl으로 연속적으로 세척하고, 다음으로 pH 4.0의 500 nM NaCl을 포함하는 소듐 아세테이트 완충용액으로 세척하여 제거하였다. 잔류 유리 아민 작용기들을 1% 아세트산 무수물 용액으로 2회 처리함으로써 아세틸화하였다. 3.8 mg의 티올화된 펩티드 CD4M9을 말레이미드로 작용화된 레진에 첨가하였다. 반응물을 4℃에서 12시간 동안 진탕하였다. 레진을 세척하고, pH 7.4의 20 mM 소듐 포스페이트, 100 mM NaCl 완충용액을 사용하여 평형화시켰다. 대략 0.1 mg/ml의 고정화된, 본 발명에 따른 펩티드 CD4M9을 포함하는 이러한 매트릭스로 6.0 ml의 크로마토그래피 컬럼을 제조하였다. 이러한 컬럼에 gp120 배양 배지를 주입하고, 컬럼 상에 머무르는 바이러스 단백질을 0.5 M 아세트산 처리에 의하여 컬럼으로부터 용출시켰다. 아세트산으로 용출된 부분들을 SDS-PAGE로 분석하고 동결건조시켰다. 이러한 부분들의 분석은 그들이 바이러스 단백질 gp120을 포함하고 있다는 사실을 보여주었다.
도 8은 본 실시예에서 얻어진 크로마토그래피 프로필을 나타낸 그래프이다: 시간 (t(분))의 함수로서의 280 nm에서의 흡광도 (A280).
도 8의 크로마토그래피 프로필은 여러 외피 단백질 용출 피크들을 보여준다. 본 발명자들은, 다양한 피크들이 컬럼으로부터의 용출에 사용된 아세트산에 의하여 다양한 변성 정도를 갖는 바이러스 단백질 gp120을 나타내는 것으로 생각한다.
실시예 10: 스크리닝
본 발명의 분자들을, 바이러스 단백질 gp120에 대한 결합 친화도를 변형시키지 않고, 플루오레신 또는 비오틴으로 표지하였다.
본 실시예에서, 표지화는 형광 란탄계 금속들 또는 방사능 동위원소들을 사용하여, 바이러스 단백질 gp120에 대한 본 발명의 펩티드들의 결합 활성을 변화시키지 않으면서 수행하였다. 이렇게 표지된 펩티드들을, 이러한 펩티드들과 바이러스 단백질 gp120과의 상호작용을 경쟁에 의하여 스크리닝하는 것으로 이루어지는 실험들에서, 추적자로 사용하였다.
첫 번째 실험에서, 바이러스 단백질 gp120은 96-웰 미세플레이트 중에 고정되었으며, 란탄계 유로피움 (lanthanide europium) (Ⅲ)으로 표지된 CD4M33 펩티드를, CD4M33 펩티드와 gp120 사이의 상호작용을 가능하게 하는 조건들 하에서, 이러한 단백질과 접촉시켰다. 신호 측정 (예를 들어 시간-분해된 형광 측정)은 스크린된 분자들이 표지된 펩티드들을 분리시키는 능력을 정량하는 것을 가능하게 한다.
두 번째 실험에서, CD4M33 펩티드는 플루오레신으로 표지되었으며, 바이러스 단백질 gp120에 결합되었고, 소형화된 시스템 중에서 용액 중의 형광 극성화를 측정함으로써 보호되었다.
CD4-gp120 상호작용을 저해할 수 있는 분자들을 스크린하는 데에 사용되는, 이러한 두 가지 시스템들에 제한이 있는 것은 아니다. 이러한 스크리닝에 의하여 검출된 분자들은 CD4-gp120 상호작용의 저해제들을 의미하며, 따라서 바이러스 감염의 잠재적인 저해제들이다.
실시를 위하여 본 실시예에서 사용된 기술들은 문헌, 특히 참조문헌 [37, 38, 39 및 40]에 서술되어 있다.
참조문헌
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Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
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<212> PRT
<213> scorpion
<400> 2
Ala Phe Cys Asn Leu Arg Met Cys Gln Leu Ser Cys Arg Ser Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Gly Lys Cys Ile Gly Asp Lys Cys Glu Cys Val Lys His
20 25 30
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derived from scyllatoxin
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<223> Description of Artificial Sequence: sequence
derived from charybdotoxin
<400> 18
Val Ser Cys Thr Thr Ser Lys Glu Cys Trp Ser Val Cys Gln Arg Leu
1 5 10 15
His Asn Thr Ser Lys Gly Gly Cys Gln Gly Ser Phe Cys Thr Cys Gly
20 25 30
Pro
Claims (14)
- 하기 서열 (Ⅰ)로 구성되며:TPA - Xaaa - Xaab - Ala 또는 Gln 또는 His - Arg 또는 Phe - Cys - Xaac - Xaad - Arg - Cys - Lys - Xaae - Xaaf - Xaag - Xaah - Leu 또는 Lys - Xaai - Lys - Cys - Ala 또는 Gln - Gly 또는 (D)Asp 또는 Ser - Ser 또는 His 또는 Asn - Xaaj - Cys - Thr 또는 Ala - Cys - Xaak - NH2,상기 서열에서, TPA는 티오프로피온산을 나타내고, Xaaa, Xaab, Xaac, Xaad, Xaae, Xaaf, Xaag, Xaah, 및 Xaai는 천연 또는 비천연이고, 동일하거나 또는 다른 아미노산들이며, Xaaj는 Nal, Phe 또는 Dip를 나타내고, Xaak는 Gly, Val 또는 Ile을 나타내는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항에 있어서, 상기 서열 (Ⅰ)은 Xaak 잔기에 결합된 프롤린 잔기를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Xaai는 Gly인 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 첨부된 서열 목록의 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 16으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 서열로 구성되는 펩티드.
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 상기 펩티드의 고상 화학 합성법 (solid-phase chemical synthesis)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 삭제
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는, AIDS 바이러스에 대한 항바이러스제.
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 AIDS 치료용 의약적 제품.
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드와 HIV(Human Immunodeficiency Virus)의 gp120 글리코단백질의 복합체를 포함하는 백신.
- 삭제
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, HIV의 바이러스 외피 단백질을 검출하는 방법.
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드를 유효성분으로 포함하는 AIDS 진단용 조성물.
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드를 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정화시켜 고정화된 펩티드를 형성하는 단계 및 바이러스 단백질 gp120을 포함하는 시료를 상기 고정화된 펩티드와 접촉시키는 단계를 포함하는, 바이러스 단백질 gp120을 정제하는 방법.
- 제1항 또는 제4항에 따른 펩티드를 시료와 접촉시키는 단계를 포함하는, gp120과 상호작용할 수 있는 분자를 스크리닝하는 방법.
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