KR100909372B1

KR100909372B1 - 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용한조기폐경 진단방법

Info

Publication number: KR100909372B1
Application number: KR1020070136277A
Authority: KR
Inventors: 곽규범; 강현준; 이승구; 차광렬; 이숙환
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-24
Filing date: 2007-12-24
Publication date: 2009-07-24
Also published as: KR20080011151A

Abstract

본 발명은 BCKDHB (Branched Chain Keto acid DeHydrogenase E1, Beta polypeptide) 유전자로부터 유래된 단일염기다형(Single-Nucleotide Polymorphism; SNP)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드는 조기폐경(Premature Ovarian Failure; POF)의 임상적 진단의 표지 인자로서, 사용될 수 있다.

조기폐경 , 단일염기다형, BCKDHB

Description

단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단방법{Methods for diagnosing premature ovarian failure using polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism}

본 발명은 조기폐경과 관련된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드; 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 조기폐경 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 조기폐경 진단용 프로브; 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이; 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단 방법에 관한 것이다.

인간의 게놈은 모두 22쌍의 상동염색체와 두개의 성염색체로 이루어져 있다. 그러나 모든 인간이 각기 다른 외모와 성격을 갖는다. 이는 개개인이 같은 수의 염색체를 가지고 있기는 하지만, 그 염색체로부터 발현되는 유전자들에 의한 표현형이 모두 다르기 때문이다. 개개인의 이러한 유전자 발현의 다양성은 곧 유전자를 가지고 있는 게놈의 유전적 다양성 때문이다. 이러한 유전적 다양성은 많은 연구가 수행되어 왔으며, 최근 인간게놈프로젝트의 완성으로 그 구조가 모두 밝혀졌다.

게놈에서의 유전적 다양성을 대표하는 것으로는 Transposable element, STR (short tandem repeats), VNTR (variable number tandem repeat), SNP(single nucleotide polymorphism : 단일염기다형) 등이 알려져 있다. 이중 SNP는 단일염기다형으로서, 인간 게놈 상에서 약 1000개의 뉴클레오티드 중 1개의 빈도로 나타나며 동일한 종의 개체 사이의 단일뉴클레오티드 변이의 형태를 취한다. 이러한 단일염기다형이 나타내는 유전학적 의미는 그 위치에 따라 각 개체에 큰 차이를 가져온다. 예를 들면, 단일염기다형이 단백질을 암호화하고 있는 위치에 존재할 경우, 단백질의 구조에 영향을 미칠 수 있게 되어 단백질 기능이 달라질 수 있게 되며, 질병과도 연관될 수 있다. 다른 예로 단일염기다형이 단백질을 암호화하지 않는 다른 유전자상에서 존재할 경우, 즉 프로모터(promoter) 또는 인트론(intron)에 존재할 경우, 각각에 대하여 단백질의 발현 수준에 차이를 가져와 그 단백질의 전체적인 활성이 줄어들 수 있고, 변성적인 인트론 제거 과정(alternative splicing)을 통하여 단백질이 비정상적으로 발현될 수도 있다.

이러한 단일염기다형의 발견을 위한 종래 기술로는 제한효소를 이용한 제한 단편화 길이 다형성(Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP), 대립형질 특이적 혼성화(Allele-specific hybridization)를 이용한 TaqMan^TM 프로브 방법, 용융온도(melting temperature; Tm)을 이용한 역동적 대립형질 특이적 혼성화(Dynamic Allele-Specific Hybridization; DASH)방법, 중합반응을 이용한 pyrosequencing등이 있다. 최근, 마이크로어레이 기술은 대립형질 특이적 신장(Allele-Specific Extension)이라는 원리를 이용한 프로브들을 조그만 기판위에 집적화시켜 심은 후, 목적 DNA들과의 혼성화와 신장(Extension)을 시킴으로써 단일염기다형을 발견해 내고 있다.

한편, 여성이 나이가 들면 난소의 기능이 중단되어 에스트로겐의 생성이 줄고, 월경이 멈추는데, 이를 폐경이라 한다. 정상적으로 폐경은 약 42세에서 56세 사이에 일어나지만, 약 1%의 여성에게서 조기 폐경, 즉 조기 난소 부전이 발생한다. 따라서, 조기폐경 환자에 특이적으로 나타날 수 있는 단일염기다형을 찾아낼 경우, 조기폐경을 진단할 수 있는 있을 것이다.

현재, 조기폐경과 관련된 단일염기다형은 여포자극호르몬수용체(Follicle Stimulating Hormone Receptor; FSHR), 인히빈 알파 단위체(Inhibin alpha subunit; INHα)에서 몇 개의 단일염기다형 부위가 확인된 바 있다. 그러나, 이들 대부분은 이미 조기폐경으로 진단된 환자의 유전자형을 확인하는 수준에서 사용되며, 대조군과의 유의성 있는 차이를 보이지 못하고 있다. 따라서, 조기폐경과 관련된 새로운 단일염기다형 부위를 찾아내는 것이 당업계에 요구된다.

본 발명자들은 여성, 특히 한국인 여성에 있어서 조기폐경에 특이적으로 나타나는 단일염기다형을 찾아내고자 연구를 거듭한 결과, BCKDHB (Branched Chain Keto acid DeHydrogenase, E1-beta subunit) 유전자로부터 조기폐경 환자에 특이적으로 나타나는 단일염기다형 부위를 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 조기폐경과 관련된 단일염기다형을 포함하는 폴리뉴클레 오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 조기폐경 진단을 위한 증폭용 프라이머 또는 조기폐경 진단용 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는 마이크로어레이를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형을 분석하는 방법으로서, 상기 단일염기다형은 서열번호 1의 DNA 서열의 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (a)"라 함), 서열번호 2의 DNA 서열의 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (b)"라 함), 서열번호 3의 DNA 서열의 131번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (c)"라 함), 서열번호 4의 DNA 서열의 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (d)"라 함), 서열번호 5의 DNA 서열의 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (e)"라 함), 서열번호 6의 DNA 서열의 805번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (f)"라 함), 서열번호 7의 DNA 서열의 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (g)"라 함), 서열번호 8의 DNA 서열의 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (h)"라 함), 서열번호 9의 DNA 서열의 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (i)"라 함) 및 서열번호 10의 DNA 서열의 501번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (j)"라 함)로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는, 서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형을 분석하는 방법이 제공된다.

또한, 본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 폴리뉴클레오티드를 이용한 조기폐경 진단 방법이 제공된다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드는 조기폐경의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드로 이루어진 프라이머 또는 프로브, 및 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 키트는 조기폐경의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 진단 방법은 조기폐경을 효과적으로 진단할 수 있다.

본 발명은 조기폐경과 관련되는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드를 제공한다.

상기 서열번호 1 내지 10의 DNA 서열은 조기폐경 환자군과 정상인군에서 통계학적으로 유의성 있는 차이(유의수준 p value < 0.05)를 보이는 단일염기다형으로서, 이들은 BCKDHB (Branched Chain Keto acid DeHydrogenase, E1-beta subunit)유전자에 존재한다. BCKDHB는 단백질을 이루는 아미노산 분해과정에 작용하는 효소로서, 상기 단일염기다형이 조기폐경과 관련되는 것은 매우 놀라운 것이다.

본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드의 길이는 10 내지 100 뉴클레오티드, 바람직하게는 20 내지 60 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 40 내지 60 뉴클레오티드이다.

본 발명에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 다형성 서열이다. 다형성 서열 (polymorphic sequence)이란 뉴클레오티드 서열 중에 단일염기다형을 나타내는 다형성 부위 (polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다. 다형성 부위 (polymorphic site)란 다형성 서열 중 단일염기다형이 일어나는 부위를 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드는 조기폐경에 관련된다. 이는 조기폐경 환자와 정상인으로부터 유래한 혈액 시료로부터 얻어진 DNA에서 각 단일염기다형에서 나타나는 대립형질(allele)의 유전자형을 분석한 결과를 통하여 확인할 수 있었다. 본 발명에 있어서, 정상인 및 환자군은 각각 16명씩 참여하였으며, 이는 다시 나이, 체질량지수(Body Mass Index; BMI) 등의 역학적 조사와 함께 데이터 분석에 활용하였다. 유전자형 분석에 사용된 군집의 크기는 다음 표 1과 같다.

그룹	정상인	환자군	총합계
조사인원	16	16	32

하기 표 2a, 표 2b, 및 표 3는 서열번호 1 내지 10의 DNA 서열의 조기폐경과의 연관성 및 상기 다형성 서열의 특성을 나타낸 것이다.

표 2a 및 2b 에 있어서, 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.

ㆍSNP는 단일염기다형성 부위에서 관찰되는 염기를 나타낸 것으로, 여기서 A1과 A2는 일루미나(Illumina)사의 Infinium^TM Assay 기법에 의하여 유전자형 분석을 하는 과정에서 질량이 큰 대립인자(major allele)를 A1 그리고 질량이 작은 대립인자를 A2(minor allele)로 임의적으로 실험의 편의상 명명한 것이다.

ㆍ서열번호는 각 단일염기다형을 나타내는 서열번호이다.

ㆍ분석방법은 Illumina사의 Infinium^TM Assay 방법을 사용하였으며, 환자군(case)와 정상인군(control)을 각각 16씩, 합계 32명의 지원자의 동의서를 받아 수행되어졌다.

ㆍ대립 인자 빈도 (allele frequency) 란에서 cas_A2, con_A2 및 Delta는 각각 질병 군 (case sample)에서의 A2 대립 인자의 빈도, 정상군 (normal sample)에서의 A2 대립 인자의 빈도 및 상기 cas_A2와 con_A2의 차이의 절대값을 나타내는 것이다. 인간의 염색체는 아버지로부터 한 개 그리고 어머니로부터 한 개씩 물려받기 때문에 한 쌍을 이루게 되어, 각각의 대립형질은 2개가 존재하게 된다. 따라서 한 사람이 두개의 대립형질을 가지게 되므로 대립인자의 빈도를 구할 때는 ‘1사람x2’가 된다. 여기서 cas_A2는 질병 군에서 (A2A2 유전자형의 빈도x2 + A1A2 유전형의 빈도)/(질병군의 샘플 수x2)이고, con_A2는 정상군에서 (A2A2 유전자형의 빈도x2 + A1A2 유전자형의 빈도)/(정상군의 샘플 수 x2)이다.

ㆍ유전자형의 빈도 (genotype frequency)는 각 유전자형의 빈도를 나타내는 것으로, cas_A1A1, cas_A1A2 및 cas_A2A2 및 con_A1A1, con_A1A2 및 con_A2A2는 각각 질병군과 정상군에서 A1A1, A1A2 및 A2A2 유전자형을 갖는 사람의 수를 나타낸다.

ㆍ카이제곱(chi-square)은 두 개의 대립형질이 환자군과 정상인군에서 나타나는 빈도가 통계적으로 유의성 있는 차이를 갖는지를 분석하기 위해서 사용되었다. 이를 질병에 연관된 대립형질에 대한 환자군-정상인군 연구(case-control study)라고 한다. 여기서는 유의 수준(기각역)을 p_value < 0.05로 정하였고, 각 단일염기다형의 대립형질들이 환자군과 정상인군에서 나타나는 빈도가 카이제곱 검정결과 p_value < 0.05로 나타남으로써 유의성 있는 차이를 보이고 있다고 판단하였다. 특히 서열번호 1에서 8에 해당하는 단일염기다형의 경우는 p_value < 0.01로 나타나고 있으며, 이는 매우 유의성 있는 차이를 보이고 있다는 뜻으로 환자군과 정상인군을 나누는 강력한 기준점으로 작용할 수 있다.

여기서 카이제곱 추출 p_value (chi-exact-p_value)는 자유도(degree of freedom; df)가 2인 카이제곱 분포표로부터 얻어진 값이다. 카이제곱 검정에서 기대빈도가 5보다 작을 경우 일반 카이제곱 검정 결과가 부정확할 수 있으므로, Fisher's exact test를 통해 보다 정확한 통계적 유의성을 검정하는데 사용되는 변수이다.

ㆍ위험 대립 인자 (risk allele)는 두 개의 대립형질 중에서 정상군에 비해 환자군에서 현저하게 높은 빈도로 나타나는 대립인자를 말하는 것으로, 여기서는 10개의 단일염기다형 모두에서 A2가 선정되었다.

ㆍ오즈 비율 (odds ratio)은 환자군 중에서 위험 대립인자를 가질 확률에 대한 정상군 중에서 위험 대립인자를 가질 확률의 비율을 나타낸다. 본 발명에서는 Mantel-Haenszel odds ratio 방법을 사용하였다. CI는 오즈 비율의 95% 신뢰구간을 나타내는 것으로, (하한 신뢰구간, 상한 신뢰구간)을 나타낸다. 신뢰구간은 1을 포함하는 경우에는 질병과의 연관성을 유의하다고 판단할 수 없다.

ㆍHWE 상태는 하아디-와인버그 평형 (Hardy-Weinberg Equilibrium)의 상태를 나타내는 것으로, con_HWE 및 cas_HWE는 정상군 및 질병군에서 하아디-와인버그 평형 여부를 나타내는 것이다. 카이제곱 (df=1) 검정에서 chi-value = 3.84(p-value=0.05, df=1)을 기준으로, 3.84보다 큰 경우에는 하아디-와인버크 평형 HWE (Hardy-Weinberg Equilibrium)으로 판단하고, 3.84보다 작은 경우에는 하아디-와인버그 비평형 (Hardy-Weinberg Disequilibrium)으로 판단하였다.

표 3에 있어서 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다. 여기서 염색체, 밴드, 유전자, 설명, 단일염기다형(SNP) 역할, 아미노산 변화 등의 칼럼들은 각각의 단일염기다형에 대한 항목별 설명(Annotation)이다.

ㆍ마커명칭은 발견된 상기 단일염기다형에 대하여 편의상 붙인 번호이다.

ㆍrs는 표준염기서열(Reference Sequence; rs)을 의미하며, 이는 인간게놈프로젝트 후, 미국 국립보건원 산하 생물공학정보연구소(NCBI)의 데이터베이스에서 각 단일염기다형을 구분하기 위하여 붙인 이름이다.

ㆍ염색체란에서는 상기 단일염기다형들이 위치하고 있는 염색체의 번호이다.

ㆍ위치란은 6번 염색체를 이루고 있는 전체 뉴클레오티드 염기에 번호를 붙였을 때, 상기 단일염기다형들이 몇 번째 염기에 위치하는지를 나타낸다.

ㆍ밴드는 염색체를 특정 기법으로 염색했을 때 색깔에 따라 나누어지는 단위를 나타내고 있다. 이는 일명 G-band라고 불리고 있다.

ㆍ유전자는 상기 단일염기다형들이 위치하고 있는 유전자를 나타내며, 여기서는 BCKDHB라는 유전자에 위치하고 있다.

ㆍ설명은 BCKDHB라는 유전자의 생화학적ㆍ물질대사적 활성에 대한 설명으로, 이 유전자의 주요 기능을 나타내고 있다. 이를 토대로 질병에 대해 어떠한 식으로 영향을 미치는지를 알아낼 수 있다.

ㆍSNP 역할은 상기 단일염기다형들이 유전자(BCKDHB)상에서 어디에 위치하고 있는지를 나타내주고 있다. 따라서 각각의 단일염기다형들이 유전자의 발현과 기능에 있어서 어떻게 작용하는지를 알 수 있다.

ㆍ아미노산의 변화는 상기 단일염기다형들이 유전자가 발현되어 단백질을 생성할 때, 그 단백질을 이루는 아미노산에 변화를 주고 있는지에 대한 설명이며, 여기서는 상기 단일염기다형들이 모두 단백질을 암호화하고 있는 부위(exon)에 존재하지 않기 때문에, 아미노산의 변화와는 무관하다.

표 4에 있어서 각 칼럼이 의미하는 바는 다음과 같다.

ㆍSNP는 각 단일염기다형에 대한 고유번호와 그 대립형질을 나타내고 있다.

ㆍAllele;OR(95%C.I), Allele;p-value는 대립형질들이 환자군가 정상인군 사이에서 출현되는 빈도수의 비율을 통하여 위험 대립인자가 질병에 어느 정도의 위험도(Odds ratio; OR)를 주는지와 이 결과에 대한 95% 신뢰구간(Confidence Interval; C.I.)을 보여준다. 95% 신뢰구간에서는 숫자 1을 포함하고 있지 않기 때문에 이 결과는 유의성이 있음을 보여주고 있으며, 표본으로부터 모집단을 추정(inference)할 때, 모집단에서의 유의수준(p-value=0.0078∼0.0182)도 < 0.05 임을 나타낸다.

ㆍCo-dominant에 대한 결과는 대립인자 분석결과로부터 위험대립인자(A2라 하면)가 정해지고, 이 위험대립인자가 그 상대 대립인자(A1이라하면)와 유전자 발현에 있어 두 대립인자가 같이 우성적으로 작용하면 공동 우성(Co-dominant)라 하며, 위험도를 구하기 위한 유전자형의 독립변수는 A1A1 : A1A2 : A2A2가 된다. 위험도와 95%신뢰구간, 유의수준에 대해서는 대립인자 분석란과 같이 해석한다.

ㆍDominant에 대한 결과는 대립인자 분석결과로부터 위험대립인자(A2라 하면)가 정해지고, 이 위험대립인자가 그 상대 대립인자(A1이라하면)와 유전자 발현에 있어 우성적으로 작용하면 우성(Dominant)이라 하며, 위험도를 구하기 위한 유전자혀의 독립변수는 A2A2+A1A2 : A1A1이 된다.

ㆍRecessive에 대한 결과는 대립인자 분석결과로부터 위험대립인자(A2라 하면)가 정해지고, 이 위험대립인자가 그 상대 대립인자(A1이라하면)와 유전자 발현에 있어 열성적으로 작용하면 열성(Recessive)이라 하며, 위험도를 구하기 위한 유전자형의 독립변수는 A2A2 : A1A2+A1A1이 된다.

표 2a, 표 2b, 표 3, 및 표 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 서열번호 1 내지 10의 다형성 마커는 대립 인자 출현빈도의 기대치와 관찰치 사이의 카이제곱 분석 결과, 95% 신뢰도에서 0.0078∼0.0182의 범위로서 모두 대조군과 유의성 있게 달랐으며, 오즈 비율 (odds ratio)의 범위가 5.4∼5.8로서 조기폐경과 연관성이 있다는 것을 알 수 있다.

서열번호 1 내지 10의 단일염기다형은 조기폐경 환자군과 정상인에서 유의성 있는 출현 빈도를 나타내었다. 따라서 본 발명의 단일염기다형은 조기폐경과 관련되는 진단 또는 치료에 효과적으로 이용될 수 있다. 구체적으로는 조기폐경의 진단을 위한 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 다형성 부위를 포함한 서열번호 1 내지 10의 DNA서열로부터 유래한 10개 이상의 연속적 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드와 혼성화하는 조기폐경 진단용 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 상기 대립형질 특이적 (allele-specific) 폴리뉴클레오티드란 각 대립형질에 특이적으로 혼성화하는 것을 의미한다. 즉, 상기 단일염기다형이 나타내는 대립형질 중 하나에 특이적으로 혼성화 할 수 있음을 뜻하여, 여기서 혼성화란, RA1 solution (Illumina's InfiniumTM Assay kit) 하에서 48℃에서 수행되어 질 수 있다.

본 발명은 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단을 위한 증폭용 대립형질 특이적 프라이머를 포함한다. 여기서 "프라이머(primer)"란 적절한 버퍼 중의 적절한 조건 (예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트(ATP,GTP,CTP,TTP) 및 DNA 폴리머라제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다. 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 10 내지 100, 바람직하게는 10 내지 80 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화 할 정도로 충분히 상보적이어야 한다. 상기 프라이머는 3'-말단이 서열번호 1 내지 10의 단일염기다형과 정렬하는 것이 바람직하다. 상기 프라이머는 다형성 부위를 포함하는 표적 DNA에 혼성화하고, 상기 프라이머가 완전한 상동성을 보이는 대립형질 형태의 DNA에서 증폭을 개시한다. 이 프라이머는 반대편에 혼성화하는 제2 프라이머와 쌍을 이루어 사용된다. 증폭에 의하여 두 개의 프라이머로부터 산물이 증폭되고, 증폭된 산물만을 특이적으로 염색하여 시각화한다. 이는 특정 대립형질 형태가 존재한다는 것을 의미한다. 여기서 사용되는 대립형질 특이적 폴리뉴클레오티드들이 다른 변성화 과정을 거치게 되면, Infinium^TM Assay 뿐만 아니라 다른 방법들에 의해서도 사용될 수 있다.

본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드로 이루어진, 조기폐경 진단용 프로브 및 이를 포함하는 조기폐경 진단용 마이크로어레이를 포함한다. 또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조기폐경 진단용 키트를 포함한다.

본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드 중의 하나 이상의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 상기에서 정의한 바와 같다)를 포함하는 조기폐경 진단 방법을 포함한다.

여기에서 , 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계는 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j) 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계 및 얻어진 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법의 또 다른 구체예에는, 상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과, 서열번호 1 내지 10의 다형성 부위의 염기가 각각 C, C, T, A, T, G, T, A, C, 및 A (위험 대립인자)인 것이 하나 이상 존재하는 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군에 속하는 것으로 판정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 위험 대립 인자를 갖는 핵산 서열이 하나의 검체에서 많이 검출되면 될수록 위험군에서 속하는 확률은 더 높은 것으로 판단할 수 있다.

본 발명은 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계 및 서열번호 1 내지 10의 DNA 서열을 포함하는 BCKDHB (Branched Chain Keto acid DeHydrogenase E1, Beta polypeptide) 유전자에 있어서 반수체형(haplotype)의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법을 포함한다.

즉, 본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 1 내지 서열번호 10의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 분석된 반수체형(haplotype)이 TCCAAGGGCT인 경우, 정상인으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에서, 서열번호 1 및 서열번호 3의 DNA 서열의 다형성 부위가 표지 단일염기다형(Tagging SNP)으로서 T 및 C로 나타나는 경우, 정상인으로 판정할 수도 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 구체예에 따라, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 1 내지 서열번호 10의 DNA 서열의 다형성 부위로부터 분석된 반수체형이 CATTGCAATC인 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군으로 판정하는 단계를 포함하는 조기폐경 유무의 진단 방법이 제공된다. 또한, 상기 방법에서, 서열번호 1 및 서열번호 3의 DNA 서열의 다형성 부위가 표지 단일염기다형(Tagging SNP)으로서 C 및 T로 나타나는 경우, 조기폐경에 걸릴 확률이 높은 위험군으로 판정할 수도 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

1. 환자군(Subjects)

본 실험은 한국 차 병원으로부터 임상적으로 조기폐경으로 진단받은 16명의 환자들과 그에 상응하는 16명의 정상인들부터 동의를 받아서 수행되었고, 이들은 모두 46, XX인 핵형(karyotype)을 가지고 있다. 정상인들은 모두 자녀가 있는 사람들 중에서 선발하였다. 조기폐경의 임상적 진단 기준은 혈중 여포자극호르몬 수준(FSH level)이 40mIU/mL 이상으로 정하였다. 그리고 신장(cm), 체중(Kg), 체질량지수(BMI(Kg/m²)), 황체형성호르몬(LH(mIU/mL)), 에스트라디올(E₂(pg/mL)), 프로락틴(PRL(ng/mL)), 남성호르몬(testosterone(ng/mL)), 갑상선자극호르몬(TSH(mIU/mL)) 등을 조사하였다. 16명의 조기폐경 환자 집단에서 5명은 체외수정(Invitro Fertilization; IVF) 시술을 받은 적이 있었고, 그 중 1명은 체외수정 시술에 실패하였다. 또한 가족력 조사에서 어머니나 형제들 중 무월경(amenorrhea)을 나타내는 환자가 2명이 있었다.

2. 게놈 DNA의 준비

게놈 DNA(genomic DNA; gDNA)를 준비하기 위하여 16명의 조기폐경 환자와 16명의 정상인 여성으로부터 혈액을 채취하였다. 전체 정맥혈의 5ml은 각 지원자들의 전주정맥으로부터 얻었고 15% EDTA가 들어있는 Vacutainer tube로 옮겨졌다. 게놈 DNA를 추출하기 위하여, 혈액을 원심분리 실험관으로 옮기고 낮은 농도의 염 성분 완충용액(low-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, and 2mM EDTA))을 5ml 첨가 하였다. 그리고 Nonidet P-40을 첨가하였다. 얻어진 용액을 잘 섞어준 후, 상온에서 10분간 2,200 rpm으로 원심분리 하였다. 이 때 얻어진 덩어리는 고농도의 염 성분 완충용액(high-salt buffer solution(10mM Tris-HCl [pH 7.6], 10mM KCl, 10mM MgCl₂, 0.4M NaCl, and 2mM EDTA))으로 재현탁 하였다. 이 게놈 DNA는 50ul의 10% SDS와 섞은 후, 55℃에서 밤새 반응시켰다.

반응 후에, 각 게놈 DNA들은 1.5ml 용량의 원심분리 실험관으로 옮겨, 6M NaCl을 0.3ml 첨가하였다. 게놈 DNA들을 잘 섞어준 후, 12,000rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후, 게놈 DNA가 들어있는 상층을 모아서 새로운 실험관으로 옮기고, 상온에서 동량의 100% 에탄올을 첨가하였다. 게놈 DNA들이 침전될 때까지 잘 섞어 주고, 침전이 되면 70% 에탄올로 게놈 DNA들을 세척하였다. 이 과정이 끝나면 실험관 뚜껑을 열어, 용액성분이 마르도록 놓아둔다. 그리고 TE 완충용액(pH 8.0)을 넣어 게놈 DNA를 재현탁하였다.

준비된 게놈 DNA는 Infinium^TM Assay를 위해 Quant-iT^TM PicoGreen dsDNA reagent (Molecular Probes, Invitrogen)을 사용하여 750ng/15uL의 농도로 조정하였다.

3. 전체 게놈의 유전자형 분석 - Infinium^TM Assay

Infinium ^TM Assay 에 대한 설명 Infinium^TM Assay는 Sentrix^R BeadChip (Illumina)을 이용한 마이크로어레이로서 각 단일염기다형에 대한 대립형질(allele A and allele B)를 구별할 수 있는 프로브들이 하나의 bead에 심어져 있다. 이들 프로브들은 약 75개의 뉴클레오티드로 이루어져 있으며, 그 중 5' 쪽의 25개의 뉴클레오티드들은 각각의 단일염기다형들을 구분할 수 있도록 되었으며, 나머지 50개의 뉴클레오티드들은 각 단일염기다형에 대한 대립형질들을 구분할 수 있도록 만들어져 있다.

전체 게놈의 증폭( Whole - genome amplification ( WGA )) 게놈 DNA (750ng/15uL)를 상온(22℃)에서 녹인 후, 0.8mL micotiter plate의 각 well에 옮겼다. 0.1N NaOH를 15uL 첨가하고 상온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 끝나면 270uL의 MP1 용액과 300uL의 AMM 용액을 차례로 첨가한 후, 뒤집어가며 잘 섞어준다. 280g에서 원심분리하여 37℃ 오븐에서 20시간 동안 반응시켰다.

증폭된 게놈 DNA 의 단편화와 정제 전체 게놈 DNA 증폭 단계가 끝나면 50g에서 1분간 원심분리 한 후, 150uL 씩 3개의 여분의 well로 옮겼다. 결과적으로 4개의 well이 같은 게놈 DNA가 된다. 각 well에 FRG 용액을 50uL 첨가한 후, 1600rpm으로 1분 동안 와동(vortex)하였다. 상온에서 50g로 원심분리한 다음, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 게놈 DNA을 50g에서 원심분리 하고, PA-1 용액을 100uL 첨가하고 1600rpm으로 와동하여, 상온에서 50g로 원심분리 한 후, 37℃에서 5분 동안 방치하였다. 상온에서 50g로 1분 동안 원심분리하고, 100% 아이소프로판올을 300uL 첨가하여 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 4℃에서 3000g로 20분 동안 원심분리하고 게놈 DNA 덩어리를 확인한 다음, microtiter plate를 뒤집어 상층을 제거하였다. 상온에서 1시간 동안 게놈 DNA를 말린 다음, RA1 용액을 42uL 넣고, 48℃ 오븐에서 1시간 동안 반응시켰다.

Sentrix ^R BeadChip 의 준비와 활성화 증폭된 게놈 DNA를 RA1 용액에서 재현탁하는 동안, (Sentrix^R) BeadChip을 준비하였다. BeadChip을 꺼내어 100% 에탄올에서 20번 정도 위 아래로 흔들어 주고 5분과 10분의 반응 시간간격을 두고 흔들어 주었다. 100% 에탄올에서의 반응이 끝나면, BeadChip을 PB1 용액으로 옮겨 흔들어 주고, 100% 에탄올에서와 같은 방법으로 2.5분, 5분의 시간 간격을 두고 흔들어 주었다. 상온에서 280g로 1분 동안 원심분리를 한 후, 추천된 순서(Illumina사로부터)에 따라 조립하여 BeadChip Chamber (called Flow through chamber)를 제조하였다. 100% 포름아마이드 150uL를 BeadChip Chamber에 통과시키고, RA1 용액 150uL를 두 번 반복하여 통과시켰다. 게놈 DNA를 첨가하기 전까지 BeadChip Chamber를 PB2 용액이 든 혼성화 챔버(Hybridization chamber)에 넣어 두었다.

혼성화 증폭된 게놈 DNA의 재현탁 (48℃, 1시간 반응)이 끝나면, 1800rpm으로 1분 동안 와동하고 280g에서 원심분리한 다음, 95℃ heat block에서 20분 동안 증폭된 게놈 DNA를 변성화 한 후, 280g로 원심분리하였다. 4개의 well로 나누어진 게놈 DNA를 하나의 well로 모으고, 280g로 원심분리하였다. 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)로부터 BeadChip Chamber를 꺼내어 게놈 DNA를 넣어준 다음, BeadChip Chamber를 다시 혼성화 챔버(Hybridization Chamber)에 넣고, 48℃에서 18시간 동안 적정속도로 흔들어가면 반응시킨다.

대립형질 특이적 프라이머 신장( Allele - Specific Primer Extension ; ASPE )에 의한 염색 18시간의 혼성화가 끝나면, BeadChip chamber를 꺼내어 450uL의 RA1 용액을 4차례 흘려 보냈다. XB1 용액 450uL와 XB2 용액 450uL, EMM 용액 200uL에 차례로 각각 10분, 5분, 15분 동안 반응시키고, 450uL의 95% 포름아마이드/1mM EDTA를 흘려 보냈다. 450uL의 XB3 용액을 흘려보내고, Illumina’s 프로토콜에 따라 LMM과 ASM 용액으로 게놈 DNA을 염색하였다. BeadChip chamber를 분해하여 BeadChip을 PB1 용액으로 씻어준 다음, 280g에서 1분 동안 원심분리하여 말린 후, Illumina BeadArray reader을 사용하여 스캔함으로써 각 BeadChip에 대한 이미지 파일을 저장하였다.

유전자형 분석 이미지 파일로부터 유전자형의 분석은 Illumina’s GenCall software (version 6.2.0.4)를 사용하여 각 단일염기다형에 대한 유전자형를 정하였다. GenCall은 두 개의 대립인자를 인식하는 프로브들 사이의 발색의 세기에 대한 비율을 가지고 전형적인 유전자형의 패턴을 나타나며, GenCall score로 기록된다.

4. 통계학적 분석

각각의 단일염기다형들에 대한 유전자형은 Haploview software (version 5.0) 와 HapAnlayzer (version 1.1)를 사용하여 분석하였다. 먼저 각각의 단일염기다형 결과로부터 작은 대립인자 빈도(Minor Allele Frequency ;MAF)>0.1 이상으로 기준을 두었으며, HapAnalyzer로 하아디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg Equilibrium ; HWE) 검정을 시행하여 유의수준(p value)>0.05 이상을 나타내는 단일염기다형들을 선택하였다. 여기서 선택된 결과로부터 대립형질(alleles)과 유전형질(genotypes)에 대하여 질병에 대한 연관성을 분석하여, 각각에 대한 위험도(Odds Ratio; OR)를 구하였고 유의수준으로부터 두 집단 간의 유의성 있는 차이(< 0.05)를 나타내는지를 조사하였다. 또한 Haploview를 사용하여 유전자 단위에서 밀접한 연관성을 나타내는 단일염기다형들간의 연관비평형 검정(Linkage disequilibrium; LD)을 시행하였으며(도 1, 표5), 이로부터 얻어지는 반수체형(haplotype)이 질병에 어떻한 연관성을 갖는지도 검정하였다(도 2).

하이디-와인버그 검정과 반수체형에 대한 연관성 검정에서는 카이제곱 검정을 사용하였으며, 위험도와 95% 신뢰구간(confidence interval; CI)에 대한 분석에서는 로지스틱 회귀분석(logistic regression)을 사용하였다. 또한 연관비평형 검정에 의한 각 단일염기다형들의 연관성에 대해서는 Lewontin’s D’ and R² 측정을 사용하였다.

5. 단일염기다형의 분석에 대한 관찰

각 단일염기다형의 결과로부터 특정 단일염기다형들은 서로 밀접한 연관성을 지니고 하나의 블록단위를 형성하는 것을 알 수 있고, 이러한 블록단위를 연관비평형 블록이라 부르는데, 블록을 형성하는 단일염기다형들은 감수분열 동안 일어나는 염색체 교차(crossing over)에서 같이 움직이는 것을 예상할 수가 있다. 또한 관찰된 유전자형을 분석함으로써 연관비평형 블록의 반수체형을 알아낼 수가 있다(도 1 및 표 5).

표5는 도 1에 나타난 각 단일염기다형끼리의 연관비평형 블록의 조밀함을 수치화하여 나타낸 것으로 사선의 밑 부분은 D' 값을 나타내고 있다. 이 D' 값이 0.8 이상이 될 때, 각 단일염기다형들은 연관비평형 관계에 있다고 판단하며, 도 1에서 보듯이 붉은 색으로 표시된다. 이러한 D' 값의 범위는 0 ∼ 1까지 이다. 또한 R² 값은 각 단일염기다형들 간의 상관관계를 나타내는 것으로 R² 값이 0.5 이상이면 그 값에 해당하는 단일염기다형들이 매우 조밀하게 묶여있다는 것을 뜻한다. 이는 앞서 언급한 도 1과 표 5에서 뜻하는 바는 상기 10개의 단일염기다형들이 서로 밀접하게 연관되어 있어 유전적 단위체를 형성한다는 것이다. 또한 이렇게 형성된 단위체들은 다음 세대로 유전될 때, 같이 묶여서 전달 되게 된다. 따라서 연관비평형 블록들이 환자군 특이적으로 나타나 질병을 일으키는데, 많은 영향을 미칠 경우, 그 블록 자체가 다음 세대로 전달되기 때문에, 다음 세대의 자손에 대한 질병이 일어날 수 있는 빈도를 예측할 수 있다.

연관비평형 블록들로부터 형성되는 유전적 단위체는 각 단일염기다형의 유전자형 분석으로부터 그 유형이 결정되는데, 이를 반수체형(haplotype)이라고 한다 (도 2).

도 2는 도 1로부터 형성된 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 반수체형이다. 세가지 형태의 반수체 형이 나타나는데, 그 중 상위 두 가지 형태인 'TCCAAGGGCT'와 'CATTGCAATC'가 나타나는 빈도수가 가장 많다. 반수체형은 다음 세대로 유전되기 때문에, 이러한 반수체형이 질병과 연관되는지를 분석할 필요가 있다. 총체적으로 연관비평형블록과 반수체형에 대한 질병관련 분석은 지금 세대에서의 질병의 진단 뿐 만아니라, 그 질병의 다음 세대로의 전달까지 예측할 수 있게 한다. 또한 각 반수체형의 첫 번째와 세 번째 염기서열에 조그마한 역삼각형의 부호가 표시되어 있는데, 이는 그 부위에 존재하는 단일염기다형이 그에 해당하는 반수체형을 대표한다는 것을 나타낸다. 예를 들면, 제일 상위의 반수체형을 전부 분석하지 않아도, 첫 번째와 세 번째의 위치에 있는 단일염기다형이 T와 C로 나타난다면, 그 결과가 제일 상위의 반수체형이 나타나는 것으로 판단할 수 있다는 뜻이다. 이렇게 반수체형을 대표할 수 있는 단일염기다형들을 표지 단일염기다형(tagging SNP)라고 한다.

표 6은 연관비평형블록으로부터 결정된 세가지 유형의 반수체형이 환자군과 정상인군에서 유의한 차이를 두고 나타나는지에 대한 분석을 카이제곱 검정을 통하여 나타낸 결과이다. 이 결과로부터 제일 상위의 반수체형은 정상인군에서 유의성(p value < 0.0034) 있게 높게 나타남을 알 수 있다. 그리고 두 번째 형태의 반수체형은 전체 빈도수는 낮지만 정상인군에 비해 환자군에서 유의하게(p value < 0.0079) 높게 나타나고 있음을 보여주고 있다.

상기와 같은 분석의 결과 볼 때, 각 대립인자는 각 개체에 있어서 동형접합자 (homozygote) 또는 이형접합자 (heterozygote)의 형태로 존재할 수 있다. 멘델의 유전법칙과 하디-와인버그 (Hardy-Weinberg) 법칙에 의하면, 집단을 구성하는 대립인자의 조성은 일정한 빈도로 유지되며, 통계적으로 유의한 경우 생물학적 기능상의 의미를 부여할 수 있다. 본 발명의 단일염기다형은 조기폐경 환자에게서 통계적으로 유의한 수준으로 출현되어, 더불어 이들 단일염기다형으로부터 유전적 단위까지 조기폐경의 진단과 더 나아가 예측에까지 사용될 수 있음을 알 수 있다.

도 1은 연관비평형 블록의 반수체형을 나타내는 도면이고,

도 2는 연관비평형 블록으로부터 유전자형의 분석결과와 대비하여 형성된 바수체형을 나타낸다.

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Methods for diagnosing premature ovarian failure using polynucleotides comprising single nucleotide polymorphism <130> PN0155 <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actttatacc attgtttcaa cttcaacctt tatttttgta tatatttttt cagctactta 60 aactgttcat gaataggcgt actttctgta tttaaaaatg gcccctcaag caccgttaat 120 ttacattcca gttatttaca tgataattca tgacattctg aaacttgcct gtatattatc 180 tgaaaaatgg atttcttgag saaaagatct gtttattgta tgtaaggaaa aattttacct 240 gaaaacaaac aaacaaaccc taaaactcag caccactacc atttccagaa gcttttttaa 300 caagtgaata ttttttacat aatggataat aaatggtatt tattcatcat gattttctaa 360 gtaatgctta tcagcccctt cagtggtgtt attctaacaa a 401 <210> 2 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 aaaacaactc caatatgcta aaagttaaat atggtattta agaaaatagt catgtatgca 60 attgagaaag tctataattt attttacaga aaagctggaa gattatgact agatatggaa 120 atattttttc tgaatttttt tttatatttc ctccgactta cctctttttg aaaagagagt 180 ttttattaag 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ttgacttttg tgtatgggta gtaaatctag ctcactgaaa atcagagtga 60 aacgccttta catttgtgcg gatagagaag ttaactctcc ctcatatgtc actgtgctac 120 cataatccct acattttctg tctgttctag tctaagaata ttgttataga tggaagttag 180 gaccattagc ccacagatgc rtgtattctc tcagacatac cggtgtagat gctatatttc 240 tgatgtcttc ttaatgtctg tgaaagcaac tggcatctac aataaatcac acttagagct 300 ggttagagga ctccttcact tttgttgtcc atgtggttcc cttccgtgga ccagccgtaa 360 taaagagcca aggtagtgat ggtggccacg tgcctcgttg c 401 <210> 9 <211> 401 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 acattttctc tgctgtccca gaaagttggc tttcaatatc ttaaccctgt tttatctttt 60 ttaaccttaa aaaatatacc ccaaaaaaga aatagagaaa tatgaatcat gctaagtggt 120 gaaagcagtt gtacctcaaa cttaggtgat ctcagtttaa acaacccaag gcactggtaa 180 tttgatacag gtttcactta yaatatggaa caaggctttc catagagagg aagctcaata 240 caggatattg catagttgaa tatctgcatg aaagagttac tgaaaggtat attttattac 300 tcagattact caaaattata tgggaaaatt atcaatgaaa aaaaattttt caagtgtcta 360 gttttttttc taatcttctt tatcagtaga taaaagccat a 401 <210> 10 <211> 701 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ccctcaatag gctaggcatt gaaggaacat acctcaaaac aataaaagcc atctatgaca 60 aacccacagc taacatcata ctgaatgagc aaaagctgga accattccac ttgagaaccg 120 gaacaagaca aggataccca ctctcaccaa tcctattcaa gatagtactg gaagtcctgg 180 ccagagcaat caggcaagag aaagaaataa aaggcattca aataagaaat gaagaaatca 240 aactggctct cttcattaaa aatatgattt tatacttaga aaaccctaca gactctgcca 300 aaaggctact agaactgata aacaatttta gcaaggtttc aggatacaaa atcaatgtac 360 aaaaatcagt agcatttcta tatacagtaa tgtctaattg aaatatatac taaattattt 420 ttaaaacaac ttttagattt tttcttacaa atttttgcaa tgatgttgtg aggatgcttt 480 ccttttgcaa aaggcttatt mcataccttt tccttttgca aaatgtttag ttctgtaatc 540 atgacataat caacatgaga catgttagag gattggatgt tcaaaatgct gactttcctg 600 gcaaaaccta tgttgtcaag taggtgataa aagtgttttc taataaaaca agcacagtgc 660 ttatttgtta tatgtcagtg caaaccaaat gagcttgagt t 701 <210> 11 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 11 tccaagggct 10 <210> 12 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> haplotype <400> 12 cattgcaatc 10

Claims

서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 주형으로 하는 프라이머 또는 프로브를 이용하여 서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형을 분석하는 방법으로서,

상기 단일염기다형은 서열번호 1의 DNA 서열의 201번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (a)"라 함), 서열번호 2의 DNA 서열의 201번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (b)"라 함), 서열번호 3의 DNA 서열의 131번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 131번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (c)"라 함), 서열번호 4의 DNA 서열의 201번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (d)"라 함), 서열번호 5의 DNA 서열의 201번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (e)"라 함), 서열번호 6의 DNA 서열의 805번째 염기(다형성 부위)가 G이고, 상기 805번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (f)"라 함), 서열번호 7의 DNA 서열의 201번째 염기(다형성 부위)가 T이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (g)"라 함), 서열번호 8의 DNA 서열의 201번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (h)"라 함), 서열번호 9의 DNA 서열의 201번째 염기(다형성 부위)가 C이고, 상기 201번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (i)"라 함) 및 서열번호 10의 DNA 서열의 501번째 염기(다형성 부위)가 A이고, 상기 501번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속된 DNA 서열 (이하, "폴리뉴클레오티드 (j)"라 함)로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는,

서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형을 분석하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 DNA 서열의 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드의 단일염기다형을 분석하는 방법.
조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 1 내지 10의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상의 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계 (단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 201번째 염기로서 상기 염기가 C이고, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 201번째 염기로서 상기 염기가 C이고, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 131번째 염기로서 상기 염기가 T이고, 서열번호 4의 DNA 서열의 경우 201번째 염기로서 상기 염기가 A이고, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기로서 상기 염기가 T이고, 서열번호 6의 DNA 서열의 경우 805번째 염기로서 상기 염기가 G이고, 서열번호 7의 DNA 서열의 경우 201번째 염기로서 상기 염기가 T이고, 서열번호 8의 DNA 서열의 경우 201번째 염기로서 상기 염기가 A이고, 서열번호 9의 DNA 서열의 경우 201번째 염기로서 상기 염기가 C이고, 및 서열번호 10의 DNA 서열의 경우 501번째 염기로서 상기 염기가 A이다)를 포함하는 검체 중의 단일염기다형을 분석하는 방법.
제3항에 있어서,상기 다형성 부위의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 단계가 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j) 로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드가 고정된 마이크로어레이에 상기 핵산 시료를 혼성화시키는 단계(단, 상기 폴리뉴클레오티드 (a) 내지 (j)는 제1항에서 정의한 바와 같다); 및 얻어진 혼성화 결과를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 검체 중의 단일염기다형을 분석하는 방법.
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조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 1 내지 10의 DNA 서열의 다형성 부위(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 131번째 염기, 서열번호 4의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 6의 DNA 서열의 경우 805번째 염기, 서열번호 7의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 8의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 9의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 및 서열번호 10의 DNA 서열의 경우 501번째 염기를 각각 의미한다)로부터 결정되는 반수체형으로서, 상기 반수체형이 TCCAAGGGCT 인지 여부를 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 분석하는 방법.
조기폐경 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 검체로부터 핵산 시료를 얻는 단계; 및 서열번호 1 내지 10의 DNA 서열의 다형성 부위(단, 상기 다형성 부위는 서열번호 1의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 2의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 3의 DNA 서열의 경우 131번째 염기, 서열번호 4의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 5의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 6의 DNA 서열의 경우 805번째 염기, 서열번호 7의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 8의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 서열번호 9의 DNA 서열의 경우 201번째 염기, 및 서열번호 10의 DNA 서열의 경우 501번째 염기를 각각 의미한다)로부터 결정되는 반수체형으로서, 상기 반수체형이 CATTGCAATC 인지 여부를 분석하는 단계를 포함하는, 검체 중의 단일염기다형을 분석하는 방법.