KR100902338B1 - 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서분리한 화합물들을 유효성분으로 함유하는 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 민둥아까시(Robinia pseudo - acacia var . umbraculifera) 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼(Amorphastilbol) 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논(5,7-Dihydroxy-6-geranyl flavanone), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, PPAR)를 활성화시켜서 비만, 당뇨, 염증, 피부노화, 주름 등의 예방 및 치료에 효과가 있으므로 의약료, 식음료 또는 피부 외용제의 유효성분으로 사용될 수 있다.
민둥아까시, 아몰파스틸볼, 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논, PPARα 활성화, PPARγ 활성화, TNFα, 염증, 주름, 보습

Description

민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물들을 유효성분으로 함유하는 조성물{A composition that is comprising extracts, fractions or isolated single compounds of Robinia pseudo―acacia var. umbraculifera}
본 발명은 민둥아까시(Robinia pseudo - acacia var . umbraculifera) 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출되는 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼(Amorphastilbol) 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논(5,7-Dihydroxy-6-geranyl flavanone), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
오늘날 생활수준의 향상과 생활습관의 변화로 인해 고지혈증, 당뇨병, 비만 등의 대사기능 이상에 기인한 병들이 점점 증가하고 있는 추세이며 이러한 병들은 유전적인 요소와 영양학적인 요소를 포함한 복잡한 원인들을 가지고 있다.
퍼옥시좀(Peroxisome)은 이러한 대사기능 이상의 원인이 되는 세포 내 소기관 중 하나로 오랫동안 세포 기능상에 있어 마이너(minor)한 역할을 하는 것으로 여겨져 왔으나 최근의 많은 연구를 통해 산소, 포도당, 지질, 호르몬의 대사 등에 있어 중요한 역할을 담당하며, 또한, 세포증식/분화의 조절, 염증 매개체들의 조절에도 폭 넓은 영향을 가지는 것으로 보고 되어지고 있다. 지질대사와 포도당대사를 통하여 퍼옥시좀은 인슐린 감수성뿐만 아니라 세포막과 비만세포(adipocyte) 형성에 영향을 주고 산화적 스트레스에 대한 영향을 통해서 노화 및 종양발생(tumorigenesis)에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다(smith. KJ et.al., J Cutan Med Surg 5(3):231-43, 2001; smith. KJ et.al., J Cutan Med Surg 5(4):315-22, 2001).
이러한 부분에 대한 지난 10 여년 간의 집중적 연구는 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)라는 핵 호르몬 수용체가 이들 병들의 약리학적 접근의 좋은 표적(target)이 될 것이라는 증거들을 내어 놓았다. 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체들(PPARs)은 48가지의 핵수용체(nuclear receptors)중 하나이며 리간드(ligand) 결합에 의해 유전자 발현을 조절한다. 핵수용체중 하나인 파르네소이드 X 수용체(farnesoid X receptor)는 담즙산과 결합하고, 리버 X 수용체(liver X receptor)는 옥시스테롤(oxysterols)과 결합하는 반면 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체들(PPARs)는 다양한 지방산이 내생의 리간드(endogenous ligand)로 작용한다. PPAR 형의 수용체에 관련된 다수의 서지학적 참조문들이 열거되어 있는 간행물(Michel Rivier, et.al., J. Invest . Dermatol 111, p.1116∼1121, 1998)을 언급할 수 있고, 또한 보고서(Timothy M et.al., Med . Chem., Vol. 43, p. 527∼550, 2000)을 언급할 수 있다.
현재까지 밝혀진 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체들(PPARs)은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 알파(PPARα), 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 베타(PPARβ/δ) 및 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체 감마(PPARγ)의 3가지이며, 각각에 대해 살펴보면, PPARα는 주로 혈관벽, 간, 심장, 근육, 신장, 갈색지방조직에서 발견된다. 페노피브레이트(Fenofibrate), 벤자피브레이트(bezafibrate), 시프로피브레이트(ciprofibrate), 젬피브로질(gemfibrozil)등의 피브레이트(fibrate)류는 PPARα의 작용제(agonist)으로서 쥐와 사람의 동맥경화증을 예방하거나 발병을 지연시키는 작용, 지방산화촉진을 통한 항비만작용을 가진다. 또한 이들은 피부의 표피에서 각질형성세포 분화촉진/증식 억제, 지질대사를 통한 피부장벽 형성 촉진, 염증의 억제, 상처회복에 있어 중요한 기능을 하고 있으며, PPARα의 자외선에 의한 염증매개체의 생성억제와, 홍반생성억제작용도 보고되었다(Kippenberger S, et.al., JID 117(6): 1430-6, 2001).
PPARδ는 PPARβ라고도 하며 많은 조직에 분포하며 특히 피부, 뇌, 지방조직에서 많이 발견된다. 콜레스테롤 역수송, 유수화(myelination), 상처회복에 관여하며, 지방산 대사와 에너지 생체항상성(homeostasis)에 매우 중요한 조절자로서 작용한다(황후상 등, 대한내분비학회지, 19(3): 250, 2004).
PPARγ는 지방조직에 가장 많이 나타나며, 혈관내피, 대식세포, 췌장 β-세포에서 발견된다. 간, 심장, 골격근과 같이 주로 PPARα가 발견되는 조직에서는 덜 발견된다. PPARγ는 3가지 서브타입 중에서 가장 광범위하게 연구되고 있다. PPARγ의 중대한 역할은 그것이 많이 발현되는 곳인 지방 세포의 분화를 조절하고 전신 지질 항상성에 결정적인 역할을 한다. 특히, 특허 출원 WO 96/33724에서는, PPARγ의 선택성 화합물, 예컨대 프로스타글란딘 J2 또는 D2 가 비만증 및 당뇨병의 치료를 위한 잠재적 활성제라고 기술되어있다. 특허 출원 FR 98/02894에서, 제약학적 조성물로서, 표피 세포 분화 이상과 관련된 피부장애를 치료하고자 하는 제약학적 조성물의 제조에서 PPARγ 활성화제 화합물의 용도를 기술하였다. PPARγ 활성을 전체적 또는 부분적 활성화 화합물은 지방세포 분화를 억제하여 비만에 대한 효과적인 치료법을 구성한다. 더욱이, 부분적 활성화 화합물은 비만 치료뿐만 아니라 고혈당증을 조절하는데 효과적이다. 따라서, PPARγ 전체적/부분적 활성화 화합물들은 비만 치료 및 글루코오스, 트리글리세라이드 및 인슐린의 상승된 혈장 수준과 같은 비인슐린 의존성 당뇨병에서 일반적으로 발생하는 기타 증상의 치료에 효과적이다(WO 01/30343, WO 02/08188, WO 2004/020408)(Berger et al., Trends Pharmacol. Sci ., vol. 26, p.244-51, 2005). 1997년 1월 치아졸리딘다이온(thiazolidinediones)은 미국에서 제2형 당뇨환자의 혈당저하치료제로 승인되었으나 그 중 트로글리타존(troglitazone)은 간독성 때문에 시장에서 회수되었다. 현재 사용중인 PPARγ 작용약(agonist)은 로지글리타존(rosiglitazone)과 피오글리 타존(pioglitazone)이며 1999년 미국에서 승인받았다.
PPARs에 대한 특허들을 살펴보면 주로 PPARγ에 대한 활성화제 즉 신물질에 대한 특허와 검색방법에 대한 특허, 당뇨 비만 등에 대한 용도 특허들로 구성이 되어 있다. 신물질에 대한 특허는 PPARγ에 대한 효능제 활성을 갖는 치환된 4-히드록시-페닐알카논산 유도체(대한민국 등록특허 제474202호), PPAR 매개 질환의 치료에 유용한 신규 화합물(대한민국 공개특허 제 2005-0055790), 키랄 옥사졸-아릴프로파이온산 유도체 및 PPAR 작용제로서 그의 용도(대한민국 공개특허 제 2005-0055750), 체액 잔류, 부종 또는 울혈심부전증을 유발하지 않는 신규 PPAR 리간드(대한민국 공개특허 제 2005-0055701), 당뇨병 치료에 유용한 PPAR 작용제로서 Ｎ- 치환된-1Ｈ-인돌-5-프로파이온산 화합물(대한민국 공개특허 제 2005-0042809), PPARγ와 PPARα의 활성을 항진시키는 신규화합물, 그것의 제조 방법, 및 그것을 함유한 약제 조성물(대한민국 공개특허 제 2005-0040746), PPARγ와 PPARα의 조절물질로서 벤조산 유도체(대한민국 공개특허 제 2005-0014014), 경구용 항당뇨병제(대한민국 공개특허 제 2004-0044515) 등이 있고, 검색방법에 대한 특허는 비만 및 당뇨 조절물질의 검색 방법(대한민국 등록특허 제 468046), βGK유전자의 퍼옥시좀 증식 반응 요소(대한민국 등록특허 제 4434948), PPARα에 대한 단일클론 항체, 특이항체분비 융합세포주 및 항체를 이용한 염증, 암, 대사성 질환과 같은 질병 관련 조절인자를 검색하는 방법(대한민국 공개특허 제 2005-0027808) 등이 있고, 용도특허로는 육두구에서 추출한 메이스리그난 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPARα에 의해 매개되는 질환의 예방 또는 치료용 조성물 (대한민국공개특허 제 2007-0033938), 카테킨 및 캄페롤 성분을 함유하는 피지억제용 화장료 조성물(대한민국 공개특허 제 2007-0028902), PPARγ수용체의 활성화에 기인한 자가면역질환 및 알츠하이머병의 치료에 유용한, 천심련으로부터 추출된 랍단 디테르펜을 포함하는 조성물(대한민국 공개특허 제 2007-0026398), 녹나무 잎 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병 예방 및 치료용 조성물(대한민국 공개특허 제 2007-0019344), PPARγ 작용제(agonist)로서의 인삼 PPT(대한민국 공개특허 제 2006-0131012), 항지방화 및 항비만 활성을 갖는 박과 식물 추출물 또는 이로부터 분리한 정제물을 포함하는 조성물(대한민국 공개특허 제 2005-0054009, 2005-0054006), 지질대사 개선용 조성물 및 식품(대한민국 공개특허 제 2004-0084908), 심장 인슐린 내성 관련 증상의 치료 및 예방(대한민국 공개특허 제 2003-0019434), 뼈 형성의 조절(대한민국 공개특허 제 0093808), 진성 당뇨병 치료를 위한 벤조산 유도체(대한민국 공개특허 제 2002-0087382), 피부 관리 조성물(대한민국 공개특허 제 2002-0047101), 심혈관 질환 치료용 ＰＰＡＲ 델타 억제제(대한민국 공개특허 제 2002-0012323), 알쯔하이머병, 중추신경계 손상 및 염증성 질환의치료용 조성물 및 치료 방법(대한민국 공개특허 제 2001-0101085), 증후군 X의 치료를 위한 PPAR - 알파 및 PPAR - 감마 길항제의 용도(대한민국 공개특허 제 1999-0077099) 등이 있다.
민둥아까시나무는 학명이 Robinia pseudo - acacia var . umbraculifera로서 콩과에 속하는 식물로 북아메리카 원산의 귀화식물이고, 한국 전역에 분포하여 산과 들에서 자란다. 높이 약 25 m로 나무껍질은 노란빛을 띤 갈색이며 세로로 갈라진다. 작은 가지는 털과 가시가 없다. 잎은 어긋나고 깃꼴겹잎이다. 작은 잎은 9 ∼ 19개로서 타원 모양이거나 달걀 모양이고 길이 2.5 ∼ 4.5 cm이다. 양끝이 둥글고 밋밋하며 작은 잎자루는 길이 2 ∼ 4 mm이다. 꽃이 피지 않으며 가시도 없으며 수관(樹冠)이 둥글다. 번식은 꺾꽂이·포기나누기 등으로 한다(두산세계대백과 엔싸이버).
민둥아까시나무를 이용한 특허는 전무하며, 아까시나무를 이용한 특허는 숙취해소 및 간기능 회복에 효과가 있는 천연차(대한민국공개특허 제 2004-0005848), 아까시 유래 렉틴의 식품 용도(유럽특허 1009418), 기타 사료제조에 사용된 아까시 나무(대한민국공개특허 제 2001-0063743) 등이 공개되어 있다. 본 특허에 명시된 아모파스틸볼(amorphastilbol)은 항균효과(Mitscher, LA., et.al., Phytochemistry, 27(4): 1481-83, 1985)가 알려졌을 뿐이고, 또한 5,7-디하이드록시-6-게라닐 플라바논(5,7-dihydroxy-6-geranyl flavanone)도 비만/당뇨, 피부노화에 대한 효과는 전혀 보고되어 있지 않았다.
이에, 본 발명자들은 이들 PPARs의 생물학적인 개략적 정보와 PPARs의 효능과 작용 기작, 특히 비만, 당뇨, 피부노화 및 보습과의 관련성 등에 대해 살펴보고, 리간드(ligand)들을 찾던 중 고랭지에서 자생하고 있던 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물로부터 분리한 단일 성분들 중 일부가 PPARα및 PPARγ의 활성화 효과를 나타내어 비만, 당뇨, 피부노화, 피부주름 또는 피부보습의 예 방 및 치료제로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 조성물은 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, PPAR)를 활성화시켜서 PPARγ 또는 PPARα 작용에 의해 조절되는 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 민둥아까시 추출물을 유효성분으로 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 민둥아까시 추출물에 유기용매를 추가로 가하여 추출한 분획물을 유효성분으로 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에서 물에 대한 아세토니트릴의 농도가 60 %에서 100 %로 10 %씩 증가하는 단계 농도구배에서 80 %일 때 얻을 수 있는 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 아몰파스틸볼(Amorphastilbol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Figure 112007054372754-pat00001
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시되는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논(5,7-Dihydroxy-6-geranyl flavanone) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
Figure 112007054372754-pat00002
상기식에서,
R1 , R2 및 R3은 서로 독립적으로 H, OH 또는 OCH3이다.
또한, 본 발명은 상기 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 PPARγ 작용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 PPARα 작용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 피부노화, 저탄력, 주름, 피부건조 및 각질형성으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 증상 예방 및 개선용 피부 외용제를 제공한다.
본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 PPAR를 활성화하여 비만과 당뇨를 예방 및 치료할 수 있고, 종양괴사인자 알파(TNF α)를 억제하여, 매트릭스 메탈로프로테이나제(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1)의 생합성을 억제하여 피부노화와 주름 개선용 피부외용제로서 매우 우수한 효과를 나타낼 수 있으므로 상기 질환 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 유효성분인 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물은 하기의 단계들을 포함하는 분리정제 방법에 의해 제조된다.
1) 민둥아까시를 추출용매로 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 민둥아까시 추출물을 여과 및 농축하는 단계;
3) 단계 2)의 농축물을 추가적으로 유기용매로 추출하는 단계;
4) 단계 3)의 분획물을 컬럼 크로마토그래피 방법을 통해 활성 분획물을 수득하는 단계; 및
5) 단계 4)의 활성 분획물을 HPLC 방법을 통해 활성 화합물을 수득하는 단계,
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 민둥아까시는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 나무의 지상부, 뿌리, 종자를 모두 사용할 수 있다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 한다. 상기 알코올로는 C1 내지 C4 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출시 용매를 민둥아까시 분량의 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 용매를 가한 후 환류 냉각하여 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 추출시 용매의 온도는 60 ~ 100℃인 것이 바람직하며, 80℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 2 ~ 4 시간이 바람직하며, 3 시간이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아 니다. 상기 방법에 의하여 민둥아까시를 추출, 여과한 뒤 여과액을 농축 및 동결건조하여 추출물을 수득하였다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 3)의 유기용매는 헥산, 디클로로메탄, 아세톤 또는 아세토니트릴등이 사용될 수 있으며, 디클로로메탄을 가한 후 가용층을 버리고 다시 메탄올로 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 4)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄(Toyopearl) 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분리 및 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에서 충진제로서 실리카겔을 이용하였으며 물에 대한 아세토니트릴의 농도가 60 %에서 100 %로 10 %씩 증가하는 단계 농도구배에서 80 %일 때 활성 분획물을 수득할 수 있었다.
상기 제조방법에 있어서, 단계 5)의 HPLC(Phenomenex Luna 10μ m C18 컬럼)에서 물에 대한 아세토니트릴의 농도가 10%에서 100%로 10%씩 증가하는 단계 농도구배의 조건으로 60분 동안 조제(preparation)하여 26분대에 분리되어 나오는 물질 및 29분대에 분리되어 나오는 물질을 통해 활성 화합물을 수득할 수 있었다. 상기 26분대 및 29분대에 분리되어 나오는 물질을 핵자기공명(nuclear magnetic resonance, NMR)으로 그 구조를 확인한 결과, 26분대에 분리되어 나오는 물질은 화학식 1로 표시되는 아몰파스틸볼(Amorphastilbol)이며, 29분대에 분리되어 나오는 물질은 화학식 2로 표시되는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논(5,7-Dihydroxy-6-geranyl flavanone)로 밝혀졌다.
본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 PPAR작용에 의해 조절되는 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 PPARγ 작용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 PPARα 작용제를 제공한다.
상기 PPAR 작용에 의해 조절되는 대사성 질환은 당뇨, 고지질혈증, 고인슐린혈증, 고요산혈증, 고콜레스테롤혈증, 고중성지방혈증, 대사증후군(Syndrome X) 및 내피기능장애로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 고콜레스테롤혈증은 저 HDL-콜레스테롤증, 고 LDL-콜레스테롤증, 고트리글리세라이드혈증로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 PPAR 작용에 의해 조절되는 심혈관계 질환은 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증 및 아테롬성 경화증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 PPAR 작용에 의해 조절되는 피부질환은 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 지방 및 당대사에 관여하는 PPAR γ의 활성화에 미치는 영향을 루시퍼라아제(luciferase) 에세이 시스템을 이용하여 측정하였다. 그 결과 PPAR γ의 활성화 정도는 PPAR γ 작용제로 알려진 트로글리타존 양성 대조군을 처리했을 때와 비교해볼 때 동등하거나 더욱 우수하였으며, 처리량이 높을수록 수치가 더 높아졌음을 확인하였다(표 1 및 도 1 참조).
또한, 본 발명에서는 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 지방세포분화에 미치는 영향을 알아보았다. 당이나 지방대사의 개선을 위해 사용되는 글리타존류의 약물들은 기전이 핵수용체이자 전사인자인 PPAR γ를 활성화시켜 지방대사 관련 유전자들이 활성화되어 지방세포 내로 당의 유입을 촉진시켜 지방으로 축적되게 하고 이로 인해 지방세포의 분화가 촉진하게 되는 것이다. 지 방세포를 각 시험물질을 함유한 배지에서 배양함으로써 분화정도를 측정한 결과 지방축적효능은 PPAR γ 작용제로 알려진 트로글리타존 양성 대조군을 처리했을 때와 비교해볼 때 동등하거나 더욱 우수하였다. 따라서 본 발명의 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 지방세포의 분화를 촉진함을 확인함으로써 지방대사 개선에 아주 유효한 성분임을 알 수 있었다(도 2 참조).
또한, 본 발명에서는 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 PPARγ 및 지방세포분화에 관련된 유전자들의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 통해 PPARγ 및 지방세포와 관련된 유전자 C/EBPα(CCAAT Enhancer Binding Protein Alpha), Ap2(Adipocyte fatty acid-binding protein 2), 아디포넥틴(Adiponectin), 지방산 합성효소(fatty acid synthase, Fas), 글루코즈 트랜스포터 4(Glucose transporter 4, GLUT4) 및 레지스틴(Resistin)의 발현정도를 조사한 결과 PPAR γ 작용제로 알려진 트로글리타존 양성 대조군을 처리했을 때만큼 발현이 증가함을 확인하였다(도 3 참조). 따라서 본 발명의 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 PPAR γ 작용제로 기능하며 지방대사 개선에 유효한 성분임을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 PPAR α의 활성화에 미치는 영향을 루시퍼라아제(luciferase) 에세이 시스템을 이용하여 측정하였다. 그 결과 PPAR α의 활성화 정도는 PPARα의 작용제로 잘 알려진 Wy-14,643 양성대조군을 처리했을 때와 비교해볼 때 동등하거나 더욱 우수하였으며, 처리량이 높을수록 수치가 더 높아졌음을 확인하였다(표 2 및 도 4 참조). 따라서 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 PPAR α 작용제로 기능할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 PPARα 및 지방산 산화에 관련된 유전자들의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 통해 PPARα 및 지방산 산화에 관련된 유전자 CPT1α(Carnitine Palmitoyl Transferase I alpha), ACO2(Acyl-CoA Oxidase 2)의 발현 정도를 조사한 결과 PPAR α의 작용제로 알려져 있는 Wy-14,643를 처리하였을 때만큼 발현이 증가함을 확인하였다(도 3 참조). 따라서 본 발명의 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 PPARα 작용제로 기능하며 지방산 산화에 유효한 성분임을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 자외선에 의한 종양괴사인자 알파(TNF α)의 생합성을 억제하는 효과를 알아보기 위해 인체 각질형성세포에 자외선을 조사한 후 각 시험물질을 포함한 배지로 배양하여 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 그 결과 TNF α의 생합성의 양은 어떤 물질도 처리하지 않은 음성대조군에 비해서 적은 양이 합성되었으며, 양성대조군인 Wy-14,643를 처리하였을 때와 비교해볼 때 동등하거나 높은 양이 합성되었으며, 시험물질의 처리량이 높을수록 TNF α의 생합성의 양은 더 적어졌음을 확인하였다(표 3 참조). 따라서, 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 TNF α의 생합성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 본 발명에서는 종양괴사인자 알파(TNF α)와 자외선에 의한 타입 I 콜라게나제인 메탈로프로테아즈-1(Metalloelastase-1, MMP-1)의 생합성량의 관계를 알아보기 위해 인체 섬유아세포에 자외선을 조사한 후 각 시험물질을 포함한 배지에 배양하였고 그 후 TNF α 항체와 TNF α를 각각 처리하여 ELISA 방법을 통해 측정하였다. 그 결과 MMP-1의 생합성량은 TNF α의 항체를 처리하였을 때 감소하였고 TNF α를 처리하였을 때 증가함을 확인함으로써 서로 상관관계가 있음을 알 수 있었다(표 4 및 표 5 참조). 따라서 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 TNF α의 생합성을 감소시키므로 결국 타입 I 콜라게나제의 생합성을 감소시킬 수 있음을 알 수 있었다.
주름생성 및 탄력저하의 가장 큰 기전이 MMP-1의 생합성 증가로 인한 기질물질인 콜라젠의 감소이다. 자외선에 의한 TNF α의 생합성을 감소시키면 MMP-1의 생합성이 감소하므로 피부 염증, 피부 기질 물질의 감소, 탄력 저하 및 주름 형성 등을 효과적으로 예방 및 개선을 할 수 있음을 알 수 있다(Obayashi K, et.al., J Cosmet Sci . 56(1): 17-27. 2005). 따라서 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 피부 염증, 피부 기질 물질의 감소, 탄력 저하 또는 주름 형 성 예방 및 개선용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에서는 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 피부 보습 및 수화에 관련된 유전자들의 발현에 미치는 영향을 알아보았다. 필라그린(filaggrin)과 인볼루크린(Involucrin)이 피부 보습 및 수화에 관련된 내용은 출원번호 10-2000-7010163(국제출원번호 PCT/US1999/05413)에 기재되어 있다. 인체 각질형성세포에 각 시험물질을 처리하여 배양한 후 웨스턴블랏(Western Blot) 방법을 사용하여 필라그린(filaggrin)과 인볼루크린(Involucrin)의 생합성의 정도를 조사하였다. 그 결과 어떤 물질들을 처리하지 않은 음성대조군에 비해 시험물질을 처리했을 때 상기 유전자의 발현 정도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다(표 6 참조). 따라서 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논이 피부 보습 및 수화를 증진시킬 수 있음을 알 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 유리산(free acid)에 의해 형성된 부가염이 유용하다. 적합한 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산 및 인산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 구연산(citric acid), 초산, 젖산, 주석산(tartariac acid), 말레인산, 푸마르산(fumaric acid), 포름산, 프로피온산(propionic acid), 옥살산, 트리플루오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메탄술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산 또는 아스파르트산 등을 사용할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 약학적으로 허용가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 조제될 수 있는 모든 염, 수화물 및 용매화물을 모두 포함할 수 있다.
본 발명의 PPARγ 및/또는 PPARα 작용에 의해 조절되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물은 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논에서 하나 이상을 선택적으로 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 PPARγ 및/또는 PPARα 작용에 의해 조절되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 약학적 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 PPARγ 및/또는 PPARα 작용에 의해 조절되는 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물은 비경구 투여시 피하주사, 정맥주사 또는 근육내 주사를 통할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물을 랫트에 경구 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 경구 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되며, 개별 투약량은 해당 질병에 대해 의사가 처방하는 범위에서 달라질 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 PPARγ 및/또는 PPARα 작용에 의해 조절되는 질환 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 유효성분으로 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 당뇨, 비만, 대사성 질환, 심혈관계 질환 및 피부질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 약학적 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천 연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
아울러, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 유효성분으로 함유하는 PPAR 작용에 의해 조절되는 피부노화, 저탄력, 주름, 피부건조 및 각질형성으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하 나의 질환 예방 및 개선용 피부 외용제를 제공한다.
상기 피부외용제에는 상기 필수성분 이외에 통상 화장품이나 의약품등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예컨대 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제등을 필요에 따라서 적절하게 배합할 수 있다.
그밖에, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대일 수 있다.
상기 피부외용제는 임상 투여시에 약제학적으로 허용가능한 통상의 담체, 부형제, 결합제, 붕해제, 가용화제, 현탁화제, 보존제 또는 증량제 등을 사용하여 조제할 수 있다. 상기 피부외용제에서, 본 발명의 조성물의 유효용량은 0.01 내지 300 mg/cm2이고, 바람직하게는 10 내지 50 mg/cm2이며, 하루 1 ~ 4 회 투여될 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제제예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것이며, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 민둥아까시 지상부 추출물의 제조
본 발명에서 사용된 민둥아까시나무는 대관령 고랭지에서 자생하고 있는 것을 사용하였으며, 지상부, 뿌리, 종자부분을 나누어서 추출하여 사용하였다.
<1-1> 민둥아까시 지상부의 메탄올 추출물의 제조
잎과 잔가지, 줄기를 포함한 민둥아까시나무 지상부 100 g을 100 % 메탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 12.5 g을 얻었다.
<1-2> 민둥아까시 지상부의 물 추출물의 제조
잎과 잔가지, 줄기를 포함한 민둥아까시나무 지상부 100 g을 물 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 9.5 g을 얻었다.
<1-3> 민둥아까시 지상부의 에탄올 추출물의 제조
상기 민둥아까시나무 지상부 100 g을 100 % 에탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 10.5 g을 얻었다.
< 실시예 2> 민둥아까시 뿌리 추출물의 제조
<2-1> 민둥아까시 뿌리의 메탄올 추출물의 제조
민둥아까시나무 뿌리 100 g을 100 % 메탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 11.2 g을 얻었다.
<2-2> 민둥아까시 뿌리의 물 추출물의 제조
민둥아까시나무 뿌리 100 g을 물 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 9.3 g을 얻었다.
<2-3> 민둥아까시 뿌리의 에탄올 추출물의 제조
민둥아까시나무 뿌리 100 g을 100 % 에탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 10.0 g을 얻었다.
< 실시예 3> 민둥아까시 종자 추출물의 제조
<3-1> 민둥아까시 종자의 메탄올 추출물의 제조
잘 익은 민둥아까시나무 종자 100 g을 100 % 메탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 14.7 g을 얻었다.
<3-2> 민둥아까시 종자의 물 추출물의 제조
잘 익은 민둥아까시나무 종자 100 g을 물 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 10.7 g을 얻었다.
<3-3> 민둥아까시 종자의 에탄올 추출물의 제조
잘 익은 민둥아까시나무 종자 100 g을 100 % 에탄올 1 L에 담구어 3 시간 동안 환류 추출하였다. 이를 3회 반복하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 농축물 12.7 g을 얻었다.
< 실시예 4> 민둥아까시 추출물로부터 분획물의 제조
<4-1> 분획물의 제조
상기 실시예<3-1>의 추출물을 디클로로메탄으로 2회 환류 추출한 후, 디클로로메탄 가용층을 버리고, 다시 메탄올로 2회 환류 추출하여 얻은 추출액을 감압건조하여 농축하여 분획물 11 g을 수득하였다.
<4-2> 활성 분획물의 제조
상기 분획물 중 7 g을 이산화규소 7 g과 흡착하여 플래쉬 컬럼(flash column)크로마토그래피(직접 제작)를 실시하였다. 상기 플래쉬 컬럼크로마토그래피는 충진제로는 Lichroprep RP-18(40-63 μm, MERCK, USA)을 사용하였으며, 시료는 celite(Diatomaceous earth, approx. 95%, Sigma, USA)에 흡착하여 적재(loading)하였다. 물에 대한 아세토나이트릴의 농도 60 %를 초기용매로 하여 100 %까지 10 %씩 농도구배(gradient)에서 중력에 의한 유속으로 각 분획물을 얻었다. 상기 각 조건의 분획물 중 농도구배 80 %일 때 분획물의 활성이 우수했다.
< 실시예 5> 아몰파스틸볼의 분리
상기 아세토니트릴 농도구배 80 %에서 수득한 분획물을 HPLC(분석용 HPLC, Waters 2996 Photodiode Array Detector, UV 210nm)로 분석하였다. 물에 대한 아세토나이트릴의 농도 10 %로부터 100 %의 농도구배 조건으로 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 10 μm C18 컬럼으로 평균유속 분당 1ml로 하여 60 분 동안 조제(preparation)하여 26 분대에 분리되어 나오는 화합물을 수득하였다(도 6 참조).
상기 화합물을 NMR(1H 및 13C-NMR, Varian 500MHz spectrometer, Varian USA)로 그 구조를 확인한 결과 26 분대에 분리되어 나오는 화합물은 아몰파스틸볼(Amorphastilbol)임을 확인되었다.
< 실시예 6> 5,7- 디하이드록시 -6- 게라닐 플라바논의 분리
상기 아세토니트릴 농도구배 80 %에서 수득한 분획물을 HPLC(분석용 HPLC, Waters 2996 Photodiode Array Detector, UV 210nm)로 분석하였다. 물에 대한 아세토나이트릴의 농도 10 %로부터 100 %의 농도구배 조건으로 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) 10 μm C18 컬럼으로 평균유속 분당 1ml로 하여 60 분 동안 조제(preparation)하여 29 분대에 분리되어 나오는 화합물을 수득하였다(도 6 참조).
상기 화합물을 NMR(1H 및 13C-NMR, Varian 500MHz spectrometer, Varian USA)로 그 구조를 확인한 결과 29 분대에 분리되어 나오는 화합물은 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논(5,7-Dihydroxy-6-geranyl flavanone)임을 확인하였다.
< 실험예 1> 지방 및 당대사에 관여하는 PPAR γ( Peroxisome Proliferator Activated Receptor gamma ) 활성화 실험
플라스미드(Plasmid)는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버셜 프로모터(universal promoter) 뒤에 PPARγ 유전자를 지닌 것, 리간드 결합형의 PPARγ가 결합하여 활성화되는 PPRE(PPARs Response Element)를 프로모터로 가지고 뒤에 리 포터로서 역할을 하는 반디불 루시퍼라아제(firefly luciferase) 유전자를 지닌 것 그리고 레퍼런스(reference)로 사용될 유니버셜 프로모터에 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase) 유전자가 결합된 플라스미드(pRL-SV40, Promega, USA)가 사용되었다(KLIEWER SA., Proc . Nadl . Acad . Sci . USA, 91: 7355-7359, 1994).
CV-1 세포(CCL-70, ATCC)를 5x104의 농도로 24-웰(well)형 플레이트에 깐 후 24 시간 배양 후 상기 세 종류의 플라즈미드 유전자를 일시적 주입법(transient transfection) 하였다. 이후 24시간 동안 배양한 후 1 x 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척하였다. 하기 후보물질들을 농도별로 처리 24시간 배양한 후 1 x PBS로 세척한 후 1 x 수동 라이시스 버퍼(Passive Lysis Buffer, PLB)로 세포를 깬 후 듀얼-루시퍼라아제 수용체 분석 시스템 키트(dual-LuciferaseR Reporter Assay System kit, Promega, USA)를 사용하여 샘플과 레퍼런스의 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 측정하였다. 본 실험에서 양성대조군은 PPARγ의 리간드 중 하나로 알려진 트로글리타존(Troglitazone)을 사용하였고 음성대조군은 무처리군으로 하였다. 음성 대조군의 활성화 정도를 100으로 하여 비교치를 나타내었다.
민둥아까시 추출물, 이의 분획물 , 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물의 PPAR γ에 대한 활성화 정도
시료 농도 활성화 정도
무처리군 100
트로글리타존 10 uM 420
실시예<1-1> 100 ug/ml 375
30 ug/ml 320
10 ug/ml 221
3 ug/ml 155
1 ug/ml 107
실시예<2-1> 100 ug/ml 370
30 ug/ml 316
10 ug/ml 218
3 ug/ml 153
1 ug/ml 106
실시예<3-1> 100 ug/ml 445
30 ug/ml 380
10 ug/ml 262
3 ug/ml 184
1 ug/ml 127
실시예<3-2> 100 ug/ml 400
30 ug/ml 330
10 ug/ml 202
3 ug/ml 154
1 ug/ml 127
실시예<4-1> 100 ug/ml 450
30 ug/ml 385
10 ug/ml 302
3 ug/ml 224
1 ug/ml 176
실시예<4-2> 30 uM 405
10 uM 279
3 uM 196
실시예 5 30 uM 425
10 uM 249
3 uM 172
실시예 6 30 uM 250
10 uM 198
3 uM 163
그 결과 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 상기 물질들을 처리하지 않은 대조군에 비해 처리하였을 때 PPAR γ의 활성화 정도가 더욱 높은 수치를 나타내었으며, 처리량이 높을수록 수치가 더 높아졌음을 확인하였다. 따라서 본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물은 PPAR γ를 활성화시키는 경향을 보였으므로 지방 및 당 대사 개선 역할을 하는 우수한 성분들임을 알 수 있었다.
< 실험예 2> 지방세포분화실험
마우스 전지방세포(preadipocyte)인 3T3L1 세포(CL-173, ATCC)를 6-웰 플레이트(well plate)에 well 당 3 X 105 개의 농도로 깔고, 48 시간 후 최종농도가 덱사메타손(dexamethasone) 1 uM, 인슐린(insulin) 10 ug/ml, 이소부틸메틸크산틴(isobutylmethylxantine, IBMX) 500 uM을 함유한 분화배지(differentiation media)로 교환해주었다. 이때, 분화군은 분화만 시킨 군이고, 양성대조군은 트로글리타존(troglitazone) 및 화합물은 각각 10 uM 농도로 동시에 처리하였다. 48 시간 후에 인슐린(insulin) 10 ug/ml와 양성대조군 및 실험에 사용한 시료를 함유한 배지로 교환해주었다. 이후 48 시간마다 배지를 교체해주며, 분화의 진행정도를 체크하였다. 분화가 진행된 후 진행된 정도는 오일 레드 O(Oil red O) 염색을 통해 확인하였다. 상기 오일 레드 O 염색은 분화된 세포를 37 ℃의 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS)으로 2 회 세척하고 3.7% 포르말린(in PBS)으로 상온에서 30 분간 고정하였다. 그 후 포르말린을 제거하고 고정된 세포를 PBS로 2회, 70 % 에탄올로 1회 씻어 준 후 오일 레드 O(이소프로판올에 0.5 %로 제조한 후 사용할 때마다 stock : DDW = 6 : 4로 희석하여 사용)로 상온에서 30 분 동안 염색한 후 현미경을 사용하여 염색된 정도를 관찰하였다.
그 결과 도 2에서 나타나는 바와 같이 아몰파스틸볼과 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논를 처리한 각 군은 트로글리타존(troglitazone)을 처리한 만큼의 지방축적효능을 보였으므로 지방대사 개선에 아주 유효한 성분임을 알 수 있었다(도 2 참조).
< 실험예 3> PPAR γ 및 지방세포분화에 관련된 유전자들의 발현
마우스 전지방세포(preadipocyte)인 3T3L1 세포를 60 파이 디쉬(dish)에 5 X 105 개의 농도로 깔고, 48 시간 후 최종농도가 덱사메타손(dexamethasone) 1 uM, 인슐린(insulin) 10 ug/ml, IBMX 500 uM을 함유한 분화배지(differentiation media)로 교환해주었다. 이때, 분화군은 분화만 시킨 군이고, 양성대조군은 트로글리타존(troglitazone) 10 uM, 나머지는 아몰파스틸볼과 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 각 10 uM씩 동시에 처리하였다. 48시간 후에 인슐린(insulin) 10 ug/ml와 양성대조군 및 실험에 사용한 시료를 함유한 배지로 교환해주었다. 이후 48 시간마다 배지를 교체해주며, 분화의 진행 정도를 체크하였다. 분화가 진행된 후 트리졸(trizol)을 이용하여 전체 RNA를 추출하고, RT-PCR을 통해 지방세포 분화 관련 유전자들의 발현정도를 확인하였다. 상기 RT-PCR에서 역전사(reverse transcription)는 시중에 판매되는 키트(reverse transcription system, Promega)를 사용하여 수행하였으며, PCR은 변성(denaturation)은 94℃, 1분, 풀림(annealing)은 54℃, 1분, 연장(extension)은 72℃, 1분씩 총 30 사이클(cycle)로 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머(primer)들은 아래와 같다.
PPAR γ
포워드(forward) 5' ttcgctgatgcactgcctat 3'(서열번호 1)
리버스(reverse) 5' gccaacagcttctccttctc 3'(서열번호 2)
C/ EBP α
포워드(forward) 5' aggtgctggagttgaccagt 3'(서열번호 3)
리버스(reverse) 5' cagcctagagatccagcgac 3'(서열번호 4)
Ap2
포워드(forward) 5' atgtgtgatgcctttgtggga 3'(서열번호 5)
리버스(reverse) 5' tgccctttcataaactcttgt 3'(서열번호 6)
Adiponectin
포워드(forward) 5' agcctggagaagccgcttat 3'(서열번호 7)
리버스(reverse) 5' ttgcagtagaacttgccagtgc 3'(서열번호 8)
Fas
포워드(forward) 5' ctgcgtggctatgattatggc 3'(서열번호 9)
리버스(reverse) 5' cgtgaggttgctgtcgtctgt 3'(서열번호 10)
GLUT4
포워드(forward) 5' tcgtcattggcattctggtt 3'(서열번호 11)
리버스(reverse) 5' ggtcatcaagatggcacagc 3'(서열번호 12)
Resistin
포워드(forward) 5' tcaactccctgtttccaaatgc 3'(서열번호 13)
리버스(reverse) 5' tcttcacgaatgtcccacga 3'(서열번호 14)
GAPDH
포워드(forward) 5' accacagtccatgccatcac 3'(서열번호 15)
리버스(reverse) 5' tccaccaccctgttgctgta 3'(서열번호 16)
그 결과 도 3에서 보이는 것처럼 PPARγ및 이와 관련 유전자인 C/EBPα(CCAAT Enhancer Binding Protein Alpha), Ap2(Adipocyte fatty acid-binding protein 2), 아디포넥틴(Adiponectin), 지방산 합성효소(fatty acid synthase, Fas), 글루코즈 트랜스포터 4(Glucose transporter 4, GLUT4), 레지스틴(Resistin)은 아몰파스틸볼과 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 처리한 각 군에서 양성대조군으로 사용한 트로글리타존(Troglitazone) 만큼 증가함을 확인함으로써, 당 및 지방 대사에 관여함을 알 수 있었다.
< 실험예 4> 피부세포 분화촉진/증식억제 및 지질 생합성 촉진과 항염에 있어 역할을 하는 PPAR α( Peroxisome Proliferator Activated Receptor alpha ) 활성화 시험
플라즈미드(Plasmid)는 PPARγ 대신 PPARα를 사용하고 상기 실험예 1에서 사용한 것과 동일한 것을 사용하였다.
CV-1 세포를 5x104의 농도로 24-웰(well)형 플레이트에 깐 후 24시간 배양 후 상기 세 종류의 플라즈미드 유전자를 일시적 주입(transient transfection) 하였다. 이후 24시간 배양 후 1 x 인산완충식염수(Phosphate Buffered Saline, PBS)로 세척한 후, 본 발명의 물질들을 농도별로 처리 24시간 배양 후 1xPBS로 세척 후 1xPLB로 세포를 깬 후 듀얼-루시퍼라아제 수용체 분석 시스템 키트(Dual-Luciferase® Reporter Assay System kit, Promega, USA)를 사용하여 사용자 지시서에 따라 샘플과 레퍼런스(reference)의 루시퍼라아제 활성(luciferase activity)을 측정하였다. 본 실험에서 양성대조군은 PPARα의 리간드 중 가장 강력한 것으로 알려진 Wy-14,643(Sigma, USA)을 사용하였고 음성대조군은 무처리군으로 하였다.
민둥아까시추출물 및 성분의 PPAR α에 대한 활성화 정도
시료 농도 활성화 정도
무처리군 100
Wy-14,643 10 uM 771
실시예<1-1> 100 ug/ml 392
30 ug/ml 196
10 ug/ml 114
3 ug/ml 108
1 ug/ml 104
실시예<2-1> 100 ug/ml 355
30 ug/ml 178
10 ug/ml 103
3 ug/ml 102
1 ug/ml 101
실시예<3-1> 100 ug/ml 733
30 ug/ml 366
10 ug/ml 212
3 ug/ml 184
1 ug/ml 143
실시예<3-2> 100 ug/ml 533
30 ug/ml 306
10 ug/ml 182
3 ug/ml 134
1 ug/ml 113
실시예<4-1> 100 ug/ml 743
30 ug/ml 406
10 ug/ml 282
3 ug/ml 204
1 ug/ml 173
실시예<4-2> 30 uM 555
10 uM 404
3 uM 202
실시예 5 30 uM 650
10 uM 482
3 uM 253
실시예 6 30 uM 583
10 uM 354
3 uM 189
그 결과 표 2 및 도 4에 나타나는 바와 같이 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 상기 물질들을 처리하지 않은 대조군에 비해 처리하였을 때 PPAR α의 활성화 정도가 더욱 높은 수치를 나타내었으며, 처리량이 높을수록 수치가 더 높아졌음을 확인하였다.
< 실험예 5> PPAR α 및 지방산 산화에 관련된 유전자들의 발현
사람의 간암세포주인 HepG2 세포(HB-8065, ATCC, USA)를 60 파이 디쉬(dish)에 1 X 106 개의 농도로 깔고, 24시간 후 최종농도가 10 uM이 되게 양성대조군인 Wy-14,643, 아몰파스틸볼과 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 각각 처리하였다. 24시간 후에 트리졸(trizol)을 이용하여 전체 RNA를 추출하고, RT-PCR을 통해 지방산 산화 관련 유전자들의 발현 정도를 확인하였다. 상기 RT-PCR에서 역전사(reverse transcription)는 시중에 판매되는 키트(reverse transcription system, Promega)를 사용하여 수행하였으며, PCR은 변성(denaturation)은 94℃, 1분, 풀림(annealing)은 54℃, 1분, 연장(extension)은 72℃, 1분씩 총 30 사이클(cycle)로 수행하였다. PCR에 사용된 프라이머(primer)들은 아래와 같다.
PPAR α
포워드(forward) 5' acggaaagcccactctgccccctctc 3'(서열번호 17)
리버스(reverse) 5' cttgtccccgcagattctacattcg 3'(서열번호 18)
CPT1 α
포워드(forward) 5' agacggtggaacagaggctgaag 3'(서열번호 19)
리버스(reverse) 5' tgagaccaaacaaagtgatgatgtcag 3'(서열번호 20)
ACO2
포워드(forward) 5' gcggacatggctactcaaagc 3'(서열번호 21)
리버스(reverse) 5' gcagtgcaccttagcagcctg 3'(서열번호 22)
GAPDH
포워드(forward) 5' accacagtccatgccatcac 3'(서열번호 23)
리버스(reverse) 5' tccaccaccctgttgctgta 3'(서열번호 24)
그 결과 도 5에서 나타나는 바와 같이 PPARα 및 이와 관련된 유전자인 CPT1α(Carnitine Palmitoyl Transferase I alpha), ACO2(Acyl-CoA Oxidase 2)는 아몰파스틸볼과 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 처리한 각 군은 양성대조군으로 사용한 Wy-14643을 처리한 군만큼 증가함을 확인함으로써, 지방산 산화에 관여함을 알 수 있었다.
< 실험예 6> 자외선에 의한 종양괴사인자 알파( TNF α)의 생합성 억제 효능 측정
신생아 포피에서 직접 분리한 인체 각질형성세포를 105 개의 농도로 12공 평판배양기에 배양하고, 자외선 B를 30 mJ/cm2로 조사한 후, 각 시험물질을 10 uM, 추출물의 경우는 10 ppm 포함한 배지로 교체하였다. 배양 6 ~ 24 시간 후 세포를 수확(harvest)해서 ELISA(Pharmingen 555212) 방법을 사용하여 생성된 종양괴사인자 알파(TNF α)의 양을 정량하였다. 그 값은 자외선 대조군을 100으로 하여 비교치를 표 3에 나타내었다.
민둥아까시 추출물 및 성분의 자외선에 의한 TNF α의 생합성 억제 효과
시료 농도 TNF α 생합성(%)
무처리군 100
Wy-14,643 10 uM 30
실시예<1-1> 100 ug/ml 35
30 ug/ml 48
10 ug/ml 63
3 ug/ml 75
1 ug/ml 88
실시예<2-1> 100 ug/ml 50
30 ug/ml 68
10 ug/ml 82
3 ug/ml 92
1 ug/ml 98
실시예<3-1> 100 ug/ml 5
30 ug/ml 20
10 ug/ml 35
3 ug/ml 48
1 ug/ml 58
실시예<3-2> 100 ug/ml 30
30 ug/ml 42
10 ug/ml 58
3 ug/ml 70
1 ug/ml 81
실시예<4-1> 100 ug/ml 5
30 ug/ml 24
10 ug/ml 35
3 ug/ml 45
1 ug/ml 50
실시예<4-2> 30 uM 5
10 uM 24
3 uM 40
실시예 5 30 uM 5
10 uM 28
3 uM 43
실시예 6 30 uM 15
10 uM 34
3 uM 61
그 결과 표 3에 나타나는 바와 같이 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 자외선에 의한 종양괴사인자 알파의 생합성을 감소시켰음을 알 수 있다.
< 실험예 7> 자외선에 의한 타입 I 콜라게나제인 메탈로프로테아즈 -1(Metalloelastase-1, MMP -1)의 생합성 억제 효능 측정
<7-1> TNF α와 MMP -1의 관계측정
신생아 포피에서 직접 분리한 1차세포(primary cell)인 인체 섬유아세포를 104 개의 농도로 48공 평판배양기에 배양하고, 24시간 후에 자외선 A를 15 J/cm2로 조사한 후, 종양괴사인자 알파에 대한 항체를 1 ug/ml 농도로 가하였다. 배양 2일째 상등액을 수확(harvest)해서 ELISA(AP biotech RPN2610) 방법을 사용하여 생성된 타입 I 콜라게나제의 양을 정량하였다. 그 값은 아무처리도 하지 않은 대조군을 100으로 한 비교치로 나타내었다.
TNF α에 대한 항체와 타입 I 콜라게나제 생합성량 관계
시험군 타입 I 콜라게나제 생합성량(%)
항체 비처리군 TNF α항체 처리군
자외선 A 조사군 210 134
TNF α처리군 250 -
대조군 100 100
그 결과 표 4에 나타나는 바와 같이, 자외선 A와 염증 매개 인자인 TNF α 처리시 타입 I 콜라게나제의 생합성이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 자외선에 의한 타입 I 콜라게나제의 증가는 TNF α에 대한 항체를 처리 시 감소됨을 알 수 있다. 즉 자외선 A에 의해 염증 매개 인자인 TNF α가 증가하여 이로 인해 타입 I 콜라게나제가 증가하고, 중간 염증 매개 인자의 차단시 타입 I 콜라게나제의 생합성이 감소됨을 알 수 있었다. 신생아 섬유아세포에 PPARα 활성화제인 아래 시험물질 처리시 타입 I 콜라게나제의 생합성이 감소됨을 보았으며, 이는 다시 염증 매개인자인 TNF α 처리시 원래대로 회복됨을 보았다.
<7-2> 각 시험물질과 TNF α의 관계
신생아 포피에서 직접 분리한 1차세포(primary cell)인 인체 섬유아세포를 104개의 농도로 48공 평판배양기에 배양하고, 24시간 후에 자외선 A를 15 J/cm2로 조사한 후, 각각의 시험물질 10 uM 또는 10 ppm씩을 함유한 배지로 갈아준 후 TNF α 10 ng/ml씩을 가하였다. 배양 2일째 상등액을 수확(harvest)해서 ELISA(AP biotech RPN2610) 방법을 사용하여 생성된 타입 I 콜라게나제의 양을 정량하였다. 그 값은 자외선 조사군을 100으로 한 비교치를 나타내었다.
TNF α와 타입 I 콜라게나제 생합성량 관계
실시예 타입I 콜라게나제 생합성(%)
자외선 A 조사군 TNF α처리군
<1-1>(10 mg/ml) 42 88
<2-1>(10 mg/ml) 48 86
<3-1>(10 mg/ml) 35 87
<3-2>(10 mg/ml) 45 86
<4-1>(10 uM) 38 89
5(10 uM) 45 86
그 결과 표 4 및 5에 나타난 바와 같이, 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 자외선에 의한 타입 I 콜라게나제의 생합성을 감소시키고, 이는 PPARα를 활성화시켜 염증 매개 인자의 생합성 감소에 영향을 줄 수 있음을 알 수 있었다.
< 실험예 8> 피부 보습 및 수화에 관련된 유전자들의 발현
신생아 포피에서 직접 분리한 인체 각질형성세포를 106개의 농도로 100 파이 디쉬(dish)에 배양하고, 각 시험물질을 10 uM, 추출물의 경우는 10 ug/ml 포함한 배지로 교체하였다. 배양 24 시간 후 세포를 수확(harvest)해서 단백질을 얻었으며 단백질량은 BCA 키트(Pierce Biotechnology, USA)를 사용하여 정량하였다. 웨스턴블랏(Western Blot) 방법을 사용하여 생성된 필라그린(filaggrin)과 인볼루크린(Involucrin)의 양을 정량하였다. 상기 웨스턴블랏은 레인(lane) 당 30 ug의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 적재(loading)하여 전기영동한 후 단백질 이동키트(transfer kit)(Invitrogen, USA)을 사용하여 PVDF 막(membrane)(Amersham, USA)으로 단백질을 이동시켰다. 이동 후 1차 항체로 각각 필라크린과 인볼루크린에 대한 항체(Santacruz Biotechnology, USA)를 37℃에서 1시간 정도 붙여주고, PBS로 3회 세척한 후 HRP가 붙은 2차 항체를 37℃에서 1시간 정도 붙여주고, PBS로 3회 세척 후 ECL 키트을 사용하여 그 발광정도를 필름에 노출시키고, 밴드의 강도를 덴시토미터(densitometer)를 사용하여 정량하였다. 그 값은 자외선 대조군을 100으로 하여 비교치를 나타내었다.
민둥아까시추출물 , 이의 분획물 , 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물의 보습인자 생합성 효과
시료 농도 필라그린 합성(%) 인볼루크린생합성(%)
무처리군 100 100
Wy-14,643 10 uM 230 225
실시예<1-1> 10 ug/ml 235 221
실시예<2-1> 10 ug/ml 180 186
실시예<3-1> 10 ug/ml 280 276
실시예<3-2> 10 ug/ml 240 230
실시예 <4-1> 10 uM 275 268
실시예 5 10 uM 282 253
실시예 6 10 uM 246 228
그 결과 표 6에 나타난 바와 같이, 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 또는 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논은 각질형성세포에서 천연보습인자인 필라그린 및 인볼루크린의 생합성량을 증가시킴으로서 피부보습을 증진할 수 있음을 알 수 있었다.
< 실험예 9> 민둥아까시 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 경구투여 급성 독성실험
본 발명자들은 민둥아까시 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성 독성실험을 실시하였다. 민둥아까시의 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물을 각각 0.5% 메틸셀룰로오스 용액에 현탁하여 5 g/kg/15 ㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 실험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상, 체중 변화를 관찰하여 혈액학적 검사와 혈액 생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다.
실험 결과, 실험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학검사, 부검소견 등에서도 독성 변화는 관찰되지 않았다.
그 결과, 랫트에서 5 g/kg까지 독성 변화를 나타내지 않으며, 경구 투여 최소 치사량 (LD50)은 5 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
< 제제예 1> : 약학적 제제의 제조
1. 산제의 제조
실시예<1-3>의 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
실시예<1-3>의 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
실시예<2-3>의 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 환의 제조
실시예<2-3>의 추출물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1 환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
5. 과립의 제조
실시예<2-3>의 추출물 150 ㎎
대두 추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
< 제제예 2> : 식품의 제조
본 발명의 민둥아까시 추출물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.
1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 실시예<1-2>의 추출물 20~95 중량부로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
2. 토마토 케찹 및 소스의 제조
본 발명의 실시예<1-2>의 추출물 0.2~1.0 중량부를 토마토 케찹 또는 소스에 첨가하여 건강 증진용 토마토 케찹 또는 소스를 제조하였다.
3. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 실시예<1-2>의 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
4. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 실시예<2-2>의 추출물 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
5. 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 실시예<2-2>의 추출물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
6. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 실시예<2-2>의 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
7. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
본 발명의 실시예<1-2>의 추출물을 진공 농축기에서 감압농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 실시예<3-2>의 추출물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
실시예<3-2>의 추출물에서 분리한 화합물의 건조분말(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
< 제제예 3> : 음료의 제조
1. 건강음료의 제조
실시예<3-2>의 추출물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용 용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
2. 야채쥬스의 제조
본 발명의 실시예<3-2>의 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.
3. 과일쥬스의 제조
본 발명의 실시예<3-2>의 추출물 1 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖ 에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.
< 제제예 4> : 연고의 제조
본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물 유효성분으로 함유하는 피부용 외용제를 제조할 수 있다. 본 발명자들은 민둥아까시 추출물을 함유하는 일반 연고를 제조하였다.
연고의 성분
성분 함량(중량 %)
카프린/카프릴 트리글리세리드 10.0
액상 파라핀 10.0
솔비탄세스퀴올리에이트 6.0
옥틸도데세스-25 9.0
세칠에칠헥사노에이트 10.0
스쿠알란 1.0
살리실산 1.0
글리세린 15.0
솔비톨 1.0
실시예<3-3>의 추출물 50
< 제제예 5> : 화장품의 제조
본 발명의 민둥아까시 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물에서 분리한 화합물 유효성분으로 함유하는 기능성 화장품을 제조할 수 있다. 본 발명자들은 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 함유하는 기능성 화장품으로 영양화장수, 크림, 에센스 등의 유화 제형의 화장품 및 유연화장수 등의 가용화 제형의 화장품을 제조하였다.
<5-1> 유화 제형의 화장품 제조
표 8에 기재된 조성으로 유화제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.
1) 1 내지 9의 원료를 혼합한 혼합물을 65∼70℃로 가열하였다.
2) 10의 원료를 상기 단계 1)의 혼합물에 투입하였다.
3) 11 내지 13의 원료의 혼합물을 65∼70℃로 가열하여 완전히 용해시켰다.
4) 상기 단계 3)을 거치면서, 상기 2)의 혼합물을 서서히 첨가하여 8,000 rpm에서 2∼3분간 유화시켰다.
5) 14의 원료를 소량의 물에 용해시킨 후 상기 단계 4)의 혼합물에 첨가하고 2분간 더 유화시켰다.
6) 15 내지 17의 원료를 각각 평량한 후 상기 단계 5)의 혼합물에 넣고 30초간 더 유화시켰다.
7) 상기 단계 6)의 혼합물을 유화 후 탈기과정을 거쳐 25∼35℃로 냉각시킴으로서 유화제형의 화장품을 제조하였다.
유화 제형 1, 2, 3의 조성
조성 유화제형 1 유화제형 2 유화제형 3
1 스테아린 산 0.3 0.3 0.3
2 스테알리 알콜 0.2 0.2 0.2
3 글리세릴 모노스테아레이트 1.2 1.2 1.2
4 밀납 0.4 0.4 0.4
5 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노라우린산 에스테르 2.2 2.2 2.2
6 파라옥시안식향산 메틸 0.1 0.1 0.1
7 파라옥시안식향산 프로필 0.05 0.05 0.05
8 세틸에틸헥사노에이트 5 5 5
9 트리글리세라이드 2 2 2
10 사이클로메티콘 3 3 3
11 증류수 to 100 to 100 to 100
12 농글리세린 5 5 5
13 트리에탄올아민 0.15 0.15 0.15
14 폴리아크릴산 중합체 0.12 0.12 0.12
15 색소 0.0001 0.0001 0.0001
16 향 0.10 0.10 0.10
17 실시예 5의 화합물 0.0001 1 10
<5-2> 가용화 제형의 화장품 제조
표 9에 기재된 조성으로 가용화 제형의 화장품을 제조하였다. 제조 방법은 하기와 같다.
1) 2 내지 6의 원료를 1의 원료(정제수)에 넣고 아직믹서를 이용하여 용해시켰다.
2) 8 내지 11의 원료를 7의 원료(알코올)에 넣고 완전용해시켰다.
3) 상기 단계 2)의 혼합물을 상기 단계 1)의 혼합물에 서서히 첨가하면서 가용화시켰다.
가용화 제형 1, 2, 3의 조성
조성 가용화 제형 1 가용화 제형 2 가용화 제형 3
1 정제수 to 100 to 100 to 100
2 농글리세린 3 3 3
3 1,3-부틸렌글리콜 2 2 2
4 EDTA-2Na 0.01 0.01 0.01
5 색소 0.0001 0.0002 0.0002
6 실시예 6의 화합물 0.1 5 5
7 알코올(95%) 8 8 8
8 파라옥시안식향산 메틸 0.1 0.1 0.1
9 폴리옥시에틸렌 하이드로 제네이디트 에스테르 0.3 0.3 0.3
10 향 0.15 0.15 0.15
11 사이클로메티콘 - - 0.2
도 1은 민둥아까시 지상부, 뿌리, 종자의 메탄올 추출물, 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논의 PPARγ에 대한 활성화 정도를 나타낸 그래프이고,
도 2는 상기 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논의 지방세포에 대한 분화 정도를 나타낸 그림이고,
도 3은 상기 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논의 PPARγ관련 유전자들의 발현정도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이고,
도 4는 민둥아까시 지상부, 뿌리, 종자의 메탄올 추출물, 상기 분획물에서 분리한 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논의 PPARα에 대한 활성화 정도를 나타낸 그래프이고,
도 5는 상기 화합물인 아몰파스틸볼 또는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논의 PPARα관련 유전자들의 발현정도를 RT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 그림이고,
도 6은 상기 화합물인 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논을 나타낸 HPLC 크로마토그램이다.
<110> Korea Institute of Science and Technology <120> A composition that is comprising extracts, fractions and/or isolated single compounds of Robinia pseudo-acacia var. umbraculifera <130> 7p-06-37 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> PPAR gamma forward primer <400> 1 ttcgctgatg cactgcctat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> PPAR gamma reverse primer <400> 2 gccaacagct tctccttctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> C/EBP alpha forward primer <400> 3 aggtgctgga gttgaccagt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> C/EBP alpha reverse primer <400> 4 cagcctagag atccagcgac 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Ap2 forward primer <400> 5 atgtgtgatg cctttgtggg a 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Ap2 reverse primer <400> 6 tgccctttca taaactcttg t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Adiponectin forward primer <400> 7 agcctggaga agccgcttat 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Adiponectin reverse primer <400> 8 ttgcagtaga acttgccagt gc 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Fas forward primer <400> 9 ctgcgtggct atgattatgg c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Fas reverse primer <400> 10 cgtgaggttg ctgtcgtctg t 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> GLUT4 forward primer <400> 11 tcgtcattgg cattctggtt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> GLUT4 reverse primer <400> 12 ggtcatcaag atggcacagc 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Resistin forward primer <400> 13 tcaactccct gtttccaaat gc 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Resistin reverse primer <400> 14 tcttcacgaa tgtcccacga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> GAPDH forward primer <400> 15 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> GAPDH reverse primer <400> 16 tccaccaccc tgttgctgta 20 <210> 17 <211> 26 <212> DNA <213> PPAR alpha forward primer <400> 17 acggaaagcc cactctgccc cctctc 26 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> PPAR alpha reverse primer <400> 18 cttgtccccg cagattctac attcg 25 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> CPT1 alpha forward primer <400> 19 agacggtgga acagaggctg aag 23 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> CPT1 alpha reverse primer <400> 20 tgagaccaaa caaagtgatg atgtcag 27 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> ACO2 forward primer <400> 21 gcggacatgg ctactcaaag c 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> ACO2 reverse primer <400> 22 gcagtgcacc ttagcagcct g 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> GAPDH forward primer <400> 23 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> GAPDH reverse primer <400> 24 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (18)

  1. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 민둥아까시 추출물을 유효성분으로 함유하는, 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(Peroxisome Proliferator-Activated Receptor, PPAR) 작용에 의해 조절되는 비만, 당뇨, 고지질혈증, 고인슐린혈증, 고요산혈증, 저 HDL-콜레스테롤증, 고 LDL-콜레스테롤증, 고트리글리세라이드혈증, 고중성지방혈증, 대사증후군(Syndrome X), 내피기능장애, 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증, 아테롬성 경화증성 질환, 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 알코올은 C1 내지 C4 저급 알코올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 PPAR는 PPARγ 또는 PPARα인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 민둥아까시 추출물을 추가적으로 유기용매를 가하여 추출한 분획물을 유효성분으로 함유하는, PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 당뇨, 고지질혈증, 고인슐린혈증, 고요산혈증, 저 HDL-콜레스테롤증, 고 LDL-콜레스테롤증, 고트리글리세라이드혈증, 고중성지방혈증, 대사증후군(Syndrome X), 내피기능장애, 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증, 아테롬성 경화증성 질환, 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 분획물은 민둥아까시 추출물에 유기용매로서 디클로로메탄을 첨가하여 수득된 디클로로메탄 가용층을 버리고 다시 메탄올을 첨가하여 얻은 메탄올 가용층인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제 6항의 민둥아까시 분획물을 컬럼 크로마토그래피에서 실리카겔에 흡착시키고 물에 대한 아세토니트릴의 농도가 60 부피%에서 100 부피%로 10 부피%씩 증가하는 단계 농도구배에서 80 부피%일 때 얻을 수 있는 활성 분획물을 유효성분으로 함유하는, PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 당뇨, 고지질혈증, 고인슐린혈증, 고요산혈증, 저 HDL-콜레스테롤증, 고 LDL-콜레스테롤증, 고트리글리세라이드혈증, 고중성지방혈증, 대사증후군(Syndrome X), 내피기능장애, 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증, 아테롬성 경화증성 질환, 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. 하기 화학식 1로 표시되는 아몰파스틸볼(Amorphastilbol) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, PPAR 작용에 의해 조절되는 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증, 아테롬성 경화증성 질환, 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
    <화학식 1>
    Figure 112009003583002-pat00003
  9. 하기 화학식 2로 표시되는 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논(5,7-Dihydroxy-6-geranyl flavanone) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 당뇨, 고지질혈증, 고인슐린혈증, 고요산혈증, 저 HDL-콜레스테롤증, 고 LDL-콜레스테롤증, 고트리글리세라이드혈증, 고중성지방혈증, 대사증후군(Syndrome X), 내피기능장애, 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증, 아테롬성 경화증성 질환, 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
    <화학식 2>
    Figure 112009003583002-pat00004
    상기식에서,
    R1, R2 및 R3은 서로 독립적으로 H, OH 또는 OCH3이다.
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  16. 물, 에탄올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 민둥아까시 추출물, 이의 분획물 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는, PPAR 작용에 의해 조절되는 비만, 당뇨, 고지질혈증, 고인슐린혈증, 고요산혈증, 저 HDL-콜레스테롤증, 고 LDL-콜레스테롤증, 고트리글리세라이드혈증, 고중성지방혈증, 대사증후군(Syndrome X), 내피기능장애, 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증, 아테롬성 경화증성 질환, 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 개선용 건강식품.
  17. 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출된 민둥아까시 추출물, 이의 분획물, 아몰파스틸볼 및 5,7-디하이드록시-6-게라닐플라바논으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 함유하는, PPAR 작용에 의해 조절되는 피부노화, 저탄력, 주름, 피부건조 및 각질형성으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 증상 예방 및 개선용 피부 외용제.
  18. 아몰파스틸볼을 함유하는 고혈압, 응집전 상태(precoagulant state), 이상 지질혈증, 아테롬성 경화증성 질환, 피부장벽강화, 아토피, 접촉성 피부염 및 염증성 질환으로 구성되는 군으로부터 선택된 어느 하나의 질환 예방 및 개선용 건강식품.
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