KR100900249B1 - ＳＩＶｍａｃ239의 면역원성 플라스미드 및 이들을 함유한ＡＩＤＳ ＤＮＡ 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 SIVmac239/레수스(rhesus) 원숭이 모델에서 발현 효율 및 면역효능이 우수한 면역원성 플라스미드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그들 면역원성 플라스미드와 임의로 보조 (adjuvant) 플라스미드를 함유한 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신에 관한 것이다.
AIDS, DNA 백신, 면역원성 플라스미드, SIVmac239, 보조제

Description

ＳＩＶｍａｃ239의 면역원성 플라스미드 및 이들을 함유한 ＡＩＤＳ ＤＮＡ 백신{SIVmac239 Immunogenic Plasmids And AIDS DNA Vaccine Containing The Same}
도 1은 본 발명에 따른 SIVmac239 또는 HIV-1의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 벡터 pGX10의 작제 지도이다.
도 2는 본 발명에 따른 SIVmac239의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 벡터 pGX10(3.6kb)의 유전자 지도이다.
도 3은 본 발명에 따른 SIVmac239의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 벡터로 뉴클레오타이드 3641개로 구성된 벡터 pGX10(3.6kb)의 제한효소 지도이다(여기서, CMV 프로모터는 뉴클레오타이드 3619-3641 및 뉴클레오타이드 1-661; TPL는 뉴클레오타이드 666-1101; SV40 후기 polyA는 뉴클레오타이드 1236-1457; SV40 인핸서는 뉴클레오타이드 1469-1713; 카나마이신 내성 ORF는 뉴클레오타이드 1727-2521; ColE1 오리진은 뉴클레오타이드 2907-3580에 해당한다). 특이적인 제한 부위는 청색 및 밑줄로 표시되어 있다.
도 4는 SIVmac239 클론의 제한효소 지도이다.
도 5는 SIVmac239의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-SIV/GE의 작제 지도이다.
도 6은 SIVmac239의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-SIV/dpol의 작제 지도이다.
도 7은 SIVmac239의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-SIV/VN의 작제 지도이다.
도 8은 SIVmac239의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-SIV/TV의 작제 지도이다.
도 9은 SIVmac239의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-SIV/VNTV의 작제 지도이다.
도 10은 SIVmac239의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-SIV/TVVN의 작제 지도이다.
도 11은 HIV-1의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-HIV/GE의 작제 지도이다.
도 12는 HIV-1의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-HIV/dpol의 작제 지도이다.
도 13은 HIV-1의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-HIV/VN의 작제 지도이다.
도 14는 HIV-1의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-HIV/TV의 작제 지도이다.
도 15는 HIV-1의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-HIV/VNTV의 작제 지도이다.
도 16은 HIV-1의 면역원성 플라스미드로 사용되는 본 발명에 따른 pGX10-HIV/TVVN의 작제 지도이다.
도 17은 본 발명의 AIDS DNA 백신을 위한 보조제(adjuvant)로 사용되는 본 발명에 따른 보조 플라스미드 pGX10-hp35/IRES/hp40 (pGX10-hIL-12m 라고도 한다)의 작제 지도이다.
도 18은 본 발명에 따른 SIVmac239의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 본 발명의 벡터 pGX10과 대조군으로서 사용된 공지 벡터 pTV2 및 pGX1의 사람 성장 호르몬 발현 수준을 비교하여 보여주는 그래프이다.
도 19는 본 발명에 따른 SIVmac239 또는 HIV-1의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 본 발명의 벡터 pGX10과 사람 성장 호르몬 발현 수준을 비교하기 위해 대조군으로 사용된 플라스미드 pTV2/hGH의 작제 지도이다.
도 20은 본 발명에 따른 SIVmac239 또는 HIV-1의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 본 발명의 벡터 pGX10과 사람 성장 호르몬 발현 수준을 비교하기 위해 대조군으로 사용된 플라스미드 pGX1/hGH의 작제 지도이다.
도 21은 본 발명의 AIDS DNA 백신을 위한 보조제로 사용되는 보조 플라스미드 pCAGGSIL-4의 제한효소 지도이다.
도 22은 본 발명의 AIDS DNA 백신을 위한 보조제로 사용되는 보조 플라스미드 pCAGGSIL-12의 제한효소 지도이다.
도 23은 본 발명에 따른 SIVmac239 또는 HIV-1의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 본 발명의 벡터 pGX10과 사람 성장 호르몬 발현을 통한 면역 유 도성을 비교하기 위해 대조군으로 사용된 플라스미드 pGX0/hGH의 작제 지도이다.
도 24는 본 발명에 따른 SIVmac239 또는 HIV-1의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 사람 성장 호르몬 발현을 통한 면역 유도성을 확인하기 위해 사용된 플라스미드 pGX10/hGH의 작제 지도이다.
도 25는 본 발명에 따른 SIVmac239 또는 HIV-1의 면역원성 유전자를 발현시키기 위해 사용된 본 발명의 벡터 pGX10과 대조군으로 사용된 플라스미드 pTV2/hGH 및 pGX0/hGH의 사람 성장 호르몬 발현을 통한 면역유도성 결과를 보여주는 그래프이다.
도 26은 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드의 면역 효능을 평가하기 위한 실험 프로토콜이다.
도 27은 SIVmac239에 감염된 원숭이(rhesus monkey)의 혈액에서 면역세포 수를 측정하여 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드의 면역 효능을 평가한 결과 (즉, SIVmac239의 원숭이 감염 이후 경과한 시간에 따라서 각 시험군 원숭이의 혈액에서 각각 백만 면역세포 (PBMC)중 감염된 면역세포 (Infectious PBMC)의 수를 표시한 것)를 보여주는 그래프이다. x축은 SIVmac239를 감염시키고 경과한 시간(주)를 나타내고, y축은 백만 면역세포중 감염성을 가진 면역세포의 수를 나타내며, 그래프안의 네 자리 또는 다섯 자리 숫자는 각 원숭이의 고유번호이다.
도 28은 SIVmac239에 감염된 원숭이(rhesus monkey)의 혈장에서 SIV RNA의 카피를 측정하여 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드의 면역 효능을 평가한 결과 (즉, SIVmac239의 감염 이후 경과한 시간에 따라서 각 시험군 원숭이에서, 혈장 1ml 속에서 검출되는 SIV RNA의 역가를 표시한 것)를 보여주는 그래프이다. x축은 SIVmac239를 감염시키고 경과한 시간(주)을 나타내고, y축은 혈장 1 ml 당 SIVmac239 RNA의 분자 수를 나타내며, 그래프안의 네 자리 또는 다섯 자리 숫자는 각 원숭이의 고유번호이다.
도 29는 SIVmac239에 감염된 원숭이(rhesus monkey)의 혈액에서 절대 CD4+ 세포의 수를 측정하여 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드의 면역 효능을 평가한 결과 (즉, SIVmac239의 감염 이후 경과한 시간에 따라서 각 시험군 원숭이에서, 각 각 단위 혈액당 절대 CD4+ 세포의 수를 감염시키기 전의 값의 백분율로 나타낸 것)를 보여주는 그래프이다. x축은 SIVmac239를 감염시키고 경과한 시간(주)을 나타내고, y축의 숫자는 혈액 1 ul에 들어있는 CD4+ 면역세포의 수를 SIVmac239를 감염시키기 전의 값을 100%로 변환한 다음 각 시점의 백분율을 나타낸 것이다. 또한, 그래프안의 네 자리 또는 다섯 자리 숫자는 각 원숭이의 고유번호이다.
도 30은 SIV DNA 면역화가 유도하는 gag-특이 T 세포 반응을 측정하여 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드의 면역 효능을 평가한 결과 (즉, SIVmac239의 감염직전 각 시험군의 원숭이에서 면역화에 의해 유도된 T 세포면역반응을 ELISPOT 검정방법으로 측정하여 나타낸 값)를 보여주는 그래프이다. x축은 각 원숭이의 고유번호를 나타내며, y축은 백만 면역세포중 gag 펩타이드의 자극에 의해 IFN-γ를 분비하는 세포의 수를 표시한 것이다.
도 31은 본 발명의 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE 및 pGX10-SIV/dpol 및 대조군으로 사용한 면역원성 플라스미드 pTV2-SIV/GE를 HeLa 세포주에 형질감염시 킨 후 면역블럿팅(immunoblotting)을 이용하여 항원 단백질의 발현을 확인한 그림이다.
도 32는 본 발명의 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE 및 pGX10-SIV/dpol에 대한 대조군으로 사용된 면역원성 플라스미드 pTV2-SIV/GE 및 pTV2-SIV/dpol을 HeLa 세포주에 형질감염시킨 후 면역블럿팅을 이용하여 항원 단백질의 발현을 확인한 그림이다.
도 33은 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/VN 및 pGX10-SIV/VNTV를 HeLa 세포주에 형질감염시킨 후 면역블럿팅을 이용하여 보조 항원 단백질(Vif-Nef)의 발현을 확인한 그림이다.
도 34는 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/TV를 HeLa 세포주에 형질감염시킨 후 면역블럿팅을 이용하여 보조 항원 단백질(Tat-Vpx)의 발현을 확인한 그림이다.
본 발명은 AIDS DNA 백신에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 SIVmac239 및 HIV에 대한 면역원성 플라스미드 및 이들 플라스미드를 함유한 AIDS DNA 백신에 관한 것이다.
DNA 백신은 여러 백신 방법 중 가장 최근에 개발된 방법이다. 이에 관한 공지문헌으로 다음과 같은 것들이 있다. 문헌 [Ertl et al., J. Immunol. 156,3579- 3582(1996)]에는 통상적인 면역화 전략으로 "생균(live)" 백신 또는 "사균(dead)" 백신의 투여하는 방법에 대하여 공개하고 있다. 문헌 [Hassett et al., Trends in Microbiol. 8,307-312(1996)]에서는, 생균 백신은 일반적으로 면역화된 체내에서 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있지만, 생균 백신이 병원성 유기체로 되돌아 갈 수 있고 또는 다른 병원체로 오염될 수 있기 때문에 환자 또는 환축의 면역이 저하된 경우 또는 임신한 경우에는 위험할 수 있음을 경고하였다. 최근에 문헌 [Tang, D. C., et al., Nature(Lond.) 356, 152-154, (1992)]에서는 외래 단백질을 코딩하는 발현 플라스미드를 마우스의 피부 내로 직접 주입한 결과 항체 반응을 유도한다는 사실을 발견하였음을 공개하였는데, 이는 "네이키드(naked)" DNA의 주입이 면역 반응을 일으키는 형태의 항원을 발현한다는 것을 시사하였다. 문헌 [Ulmer, J. B., et al., Science 259, 1745-1749, (1993); Fynan, E. F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11, 478-11, 482,(1993)]에서는 인플루엔자의 핵단백질(nucleoprotein)을 코딩하는 플라스미드 DNA의 근육 내 주입으로 살아있는 인플루엔자 바이러스로 감염된 마우스를 방어할 수 있다는 사실을 발견하여 백신 개발을 위한 새로운 장을 열었다. 또한, 플라스미드 DNA로 면역화시키면 CD4+ T 헬퍼 세포뿐 아니라 항원-특이적 CD8+ 세포독성 T 세포의 생성을 포함하는 체액성 및 세포성 면역 모두를 활성화시킨다는 것이 밝혀졌다 (Donnellym, J. J., et al., Ann Rev. Immunol. 15, 617-648, (1997)). 또한, 문헌 [Felgner et al., USP 5,589,466]에는 포유동물의 근육 내로 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드를 주입하여, 근육 세포의 흡수에 의하여 폴리뉴클레오티드가 체내에서 치료 효과를 나 타내게 하는 분리된 폴리뉴클레오티드의 전달 방법이 개시되어 있다.
DNA 백신으로 달성되는 방어의 수준은 바이러스에 감염되었다가 자연 회복된 경우에 관찰되는 것보다는 일반적으로 낮지만(Manickan et al.,Critical Review Immunol.17,139-154,(1997)), 통상적인 단백질 특이항원 백신 및 사균 또는 약독화된 바이러스 백신에 의해 유도되는 수준과는 비슷한 것으로 알려져 있다. 그런데 네이키드(naked) 플라스미드로 이루어진 DNA 백신은 정제된 또는 재조합 단백질 또는 약독화 생균 또는 재조합 바이러스의 주입에 의존하는 면역화 방법에 비하여 몇 가지 이점을 가진다. (1) 하나 이상의 유전자가 손쉽게 동시에 도입되어, 특정의 종양 항원 및/또는 면역 조절 사이토카인을 코딩하는 유전자들의 동시 도입을 가능하게 한다. (2) 생체 내 및 생체 외에서 바이러스 단백질로부터 면역학적인 방해 없이 단지 원하는 유전자만이 전사된다. (3) 복제-결핍바이러스 벡터(replication-deficient viral vector)를 사용함으로써 생길 수 있는 재조합의 위험이 없다. (4) 외래 DNA의 게놈 속으로의 삽입이 유전자 전이의 일시적 성질(transient nature)때문일 가능성은 적다. (5) 이 방법은 사용되는 DNA 벡터를 손쉽게 제조할 수 있다. (6) 여러 가지 항원에 대한 체액성 및 세포성 면역반응을 동시에 유도할 수 있고 면역조절 사이토카인 또는 보조자극 분자를 코딩하는 유전자를 동시에 전달하여 면역 반응의 특성을 조절하는 것이 가능하다.
후천성면역결핍증(AIDS)은 1981년 최초 진단된 이래 이에 대한 많은 연구가 진행된 질병으로, HIV에 감염되면 CD4 단백을 세포 표면에 가지고 있는 T 세포가 극적으로 감소되어 심각한 면역 손상을 가져오게 되며, 이러한 면역체계의 손상으 로 인한 복합적인 기회감염, 종양(neoplasias)을 일으키는 것이 특징이었다. 지금까지 AIDS를 치료하기 위해 불활성 전체 바이러스(inactivated whole virus) 백신, 생(生)재조합 바이러스(live recombinant virus) 백신, 약독화 바이러스(attenuated viruses) 백신, 특이항원 추출백신(subunit), 합성 펩타이드(synthetic peptide) 백신 및 항-이디오타입항체(anti-idiotype antibody) 등 많은 종류의 백신이 개발되었다. 예를 들면, John Sidney의 미국특허 제5,698,432호에는 불활성 전체 바이러스 백신, Luciw 등의 미국특허 제 6,004,799호에는 약독화 바이러스 백신, Bermann 등의 미국특허 제 6,331,404호, Cotropia의 미국특허 제6,083,504호, 문헌[Dolin et al., Ann Intern Med, 114,119-127, (1991)]에는 특이항원 추출백신, Rubistein 등의 미국특허 제 6,139,843호 및 Sia 등의 미국특허 제5,817,318호에는 합성 펩타이드 백신이 개시되어 있다. 그러나 이러한 백신 방법들은 예를 들면, HIV가 돌연변이를 일으켜 면역반응을 빠져나가는 등의 체내 면역 반응의 회피, 약독화시켜 백신으로 투여된 바이러스 벡터의 병원성 회복 등에 의한 감염의 위험성 등뿐만 아니라, 원하는 정도의 AIDS의 예방 또는 치료를 나타내지 못하였다.
이에 비하여, 플라스미드 DNA는 영장류에 투여되었을 때 우수한 체액성 면역 반응 및 세포 매개 면역반응을 유도하고, 특히 HIV-1과 같은 바이러스의 방어에 중요하다고 알려진 Th1(T 헬퍼-1) 성향(bias)의 면역반응 및 CTL 반응(Cytotoxic T lymphocyte responses)을 작은 동물(small animal), 원숭이, 침팬지, 사람에게서 효과적으로 유도하는 것으로 알려졌다. AIDS에 대한 DNA 백신이 또한 상당 수 보고되어 있다. 예를 들면, EP 0276591에는 바이러스 벡터 및 AIDS 바이러스의 p25단백질을 코딩하는 재조합 DNA로 이루어진 백신이 개시되어 있다. 이 바이러스 벡터는 벡터 바이러스의 게놈의 일부분; 완전한 gag 유전자 또는 이것의 단편의 하나, 특히 HIV 바이러스의 p25 단백질을 코딩하는 유전자 또는 p18 단백질을 코딩하는 유전자; 및 배양에서 세포내에서 이 단백질의 발현을 확실하게 하는 모든 성분들을 포함하는 것을 특징으로 한다. EP 0572737은 Gag 폴리펩타이드의 C-말단에 Env 펩타이드가 융합된 Gag-Env 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 HIV 항원을 공개하고 있다. 프랑스 특허 제2596771호는 AIDS의 원인 바이러스 게놈의 일부분; 원인 바이러스의 외피의 당단백질(gp)의 하나를 코딩하는 유전자; 및 세포에서 이 당단백질의 발현을 확실하게 하는 성분들을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터를 공개하고 있다. WO 9927958은 면역원으로서 HIV-1 Tat에 기초한 AIDS 백신에 관하여 공개하고 있는데, HIV-1 Tat가 DNA 및/또는 재조합 단백질 또는 펩타이드 형태로 투여되거나; 단독으로 또는 다른 유전자 또는 바이러스 유전자 산물(Nef, Rev, Gag) 또는 이들의 일부분과 혼합하여 투여되거나; 다양한 면역 조절 사이토카인(IL-12, IL-15) 또는 면역 조절 사이토카인을 코딩하는 유전자 또는 이들의 일부분과 혼합하여 투여되는 AIDS 백신에 관한 것이다. 이 특허원에서 Tat, Nef, Rev, Gag 및 면역 조절 사이토카인들은 재조합 단백질, 펩타이드 또는 융합 단백질(Tat/Nef, Tat/Rev, Tat/Gag, Tat/IL012, Tat/IL-15)의 혼합물 또는 플라스미드 DNA로 투여된다.
또한, 문헌 [Roger Miller and Nava Sarver, HIV Vif as a Therapeutic Target, DAIDS, NIAID, Sept. 18, 2000]은 vif 유전자-결손 SIVmac239를 레수스 마카쿠(rhesus macaques) 원숭이에 접종한 실험에서, SIVmac239에 대한 낮은 수준의 항체를 형성하고, 그 결손 바이러스는 매우 약독화된 표현형을 나타낸다. 그러나 이 vif-결손 SIV로 면역화된 원숭이는 야생형 SIV의 감염에 대해 방어될 수 없었음을 밝히고 있다. 문헌 [H. Zhang and L. Qiao, 184 HIV Gag DNA Vaccine, ADIS VACCINE , Foundation for AIDS Vaccine Research and Development,(2001)]에는 돌연변이된 Gag가 야생형 Gag에 비해 증가된 세포독성 T 세포를 유도한다는 것이 제시되어 있다. 그러나 이 결과는 돌연변이된 Gag를 코딩하는 DNA 백신을 마우스에 면역화하여 얻은 것이다. 문헌 [AIDSWEEKLY Plus, Monday, (AW) Conference Coverage (Retrovirus), March 24, 1997]에는 Britta Wahren 및 이의 동료들이 HIV-1 nef, rev 및 tat 보조 유전자; p24 구조 단백질 암호화 유전자; 및 gp160 외피 전구체 당단백질 암호화 유전자를 함유한 플라스미드가 세포성 및 체액성 항-HIV 면역 반응을 유도할 수 있음을 밝혔다고 기술되어 있다. 그러나 이 연구 또한 마우스를 대상으로 한 것이다. 문헌 [AIDSWEEKLY Plus, Monday, (AW) Conference Coverage (NCVDG), June 23, 1997]은 Velpandi Ayyavoo 및 이의 동료들이 약독화된 HIV-1 보조 유전자 vif, nef, vpr 및 vpu를 함유한 네이키드(naked) DNA 백신이 세포성 및 체액성 항-HIV 면역 반응을 유도한다는 것을 밝혔음을 기술하고 있다. 문헌 [Amara R. R., et al., Science 292, 69-74, (2001)]에는 다수의 HIV 및 SIV 유전자(HIV-1 외피, tat 및 rev 유전자 및 SIV gag, pol, vif, vpx 및 vpr 유전자)를 함유한 DNA 백신과 함께 HIV 및 SIV 유래의 유전자를 함유한 MVA(Modified Vaccinia Ankara) 부스터 백신으로 영장류를 면역화한 연구가 기술되어 있으며, 이 연구는 레수스 마카쿠 원숭이/SHIV 모델에서의 강력한 백신-유도 면역반응이 바이러스 복제 및 질병을 조절한다는 것을 보여준다.
그러나 선행하는 다양한 연구결과에도 불구하고 여전히 AIDS를 성공적으로 예방 또는 치료할 수 있는 것으로 보고 된 DNA 백신은 없으며, 면역원성 플라스미드의 발현 효율 및 면역 효능의 관점에서 계속적으로 향상된 새로운 면역원성 플라스미드 및 효과적이고 안전한 DNA 백신이 요구되고 있다.
본 발명자들은 SIVmac239/레수스(rhesus) 원숭이 모델 및 AIDS 사람 환자에서 발현 효율 및 면역효능이 우수한 면역원성 플라스미드 및 이들을 함유한 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신을 개발하였다. 본 발명자들은 선행하는 연구(대한민국 특허공개번호 2001-0054338호 및 이의 대응 미국특허공개번호 2001004531)에서 두 가지 종류의 AIDS 용 백신 플라스미드를 개발한 바 있다. 현재 특허 출원 공개된 이들 면역원성 플라스미드 중 제1 면역원성 플라스미드는 DNA 백신용 기본벡터로서 개발된 벡터 pTV2에 SIVmac239 유래의 gag, dpol(프로테아제에 해당함) 및 env 유전자와 보조(regulatory) 유전자 rev를 포함하나, 보조 유전자 tat 및 nef는 포함하지 않은 것이고; 다른 제2 면역원성 플라스미드는 DNA 백신용 기본벡터로서 개발된 벡터 pTV2에 SIVmac239 유래의 역전사효소(RT, Reverse Transcriptase)와 인테그라제(Integrase)를 코딩하는 유전자 pol에 융합된 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV, Herpes Simplex Virus)의 당단백질(gD, glycoprotein D) 시그날 서 열을 포함한다. 이러한 제1 및 제2 면역원성 플라스미드는 기존의 개발된 AIDS DNA 백신들이 생체 외에서 면역반응을 저해 및 교란시키는 것으로 알려진 nef 및 tat 등의 보조 유전자들을 면역원으로 사용한 점(Lindemann et al., J. Exp. Med, 179, 797 (1994) and Viscidi, et al., Science, 246, 1606(1989)) 및 방어 면역에 중요한 것으로 알려진 CTL 에피토프(epitope)가 많이 있는 유전자 pol을 효과적으로 이용하지 못하였던 단점을 보완한 것이었다. 실험결과 이들 제1 및 제2 면역원성 플라스미드는 SIVmac239/레수스(rhesus) 원숭이 모델에서 어느 정도 우수한 발현 효율 및 면역효능을 나타내었다.
그러나 본 발명자들은 상기 자신의 선행 발명을 개량하여 더 우수한 효과를 나타내는 AIDS DNA 백신을 개발하였다. 본 발명의 한 가지 특징은 DNA 백신용 기본 벡터로서 pGX10을 개발하였다는 것이다. 벡터 pGX10은 벡터 pTV2에 비하여 생체 외에서 세포 감염을 통한 발현 강도가 높고, 생체 내(in vivo)에서도(마우스를 면역화하였을 때) 더 우수한 면역반응을 유도할 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명에서는 선행 발명에서 배제하였던 유전자 nef 및 tat를 전체 모든 유전자를 사용하지 않고 일부분의 유전자만을 사용하고 다른 보조 유전자와 융합하여 발현되도록 벡터를 설계 제조하여 보조 유전자의 면역 교란 활성을 최소화하고 삽입되는 유전자의 발현 효율을 증가시키기 위해 코돈을 최적화하였으며 그 결과 종래 발명보다 현저히 증가된 면역원의 발현 효율 및 면역 효능을 보이는 면역원성 플라스미드 및 이들을 함유한 효과적이고 안전한 DNA 백신을 개발하는데 성공하였다.
한 가지 관점으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드의 제조용 기본 벡터로서 벡터 pGX10을 제공한다.
다른 관점으로서, 본 발명은 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 gag, dpol 및 env와 보조 유전자 rev를 포함하는 것을 특징으로 하는 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신 조성물에 함유되는 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 바이러스 SIVmac239 유래의 역전사효소(RT, Reverse Transcriptase)와 인테그라제(INT, Integrase)를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 nef를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 nef 및 (ii) SIVmac239 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 바이러스 HIV-1 유래의 유전자 gag, protease 및 env와 보조 유전자 rev를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/GE를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 바이러스 HIV-1 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성되는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 HIV-1 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 nef를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 HIV-1 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) HIV-1 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 nef 및 (ii) HIV-1 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 AIDS　DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 본 발명에 따른 AIDS DNA 백신에 함유될 수 있는 보조제(adjuvant) 플라스미드 pGX10-hIL-12m를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) 플라스미드 pGX10-SIV/GE와 (ⅱ) 바이러스 SIVmac239 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성된 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물를 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) SIVmac239 유래의 유전자 gag, dpol, env 및 rev를 포함한 플라스미드, (ⅱ) SIVmac239 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열을 포함한 플라스미드, (ⅲ) SIVmac239 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 nef를 포함한 플라스미드 및 (ⅳ) SIVmac239 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 포함한 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) SIVmac239 유래의 유전자 gag, dpol, env 및 rev를 포함한 플라스미드, (ⅱ) SIVmac239 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol을 포함한 플라스미드 및 (ⅲ) (a) SIVmac239 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 당단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 nef 및 (b) SIVmac239 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 5' 말단에 융합된 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 포함한 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) 플라스미드 pGX10-HIV/GE와 (ⅱ) 바이러스 HIV-1 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성된 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) HIV-1 유래의 유전자 gag, dpol, env 및 rev를 포함한 플라스미드, (ⅱ) HIV-1 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열을 포함한 플라스미드, (ⅲ) HIV-1 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 nef를 포함한 플라스미드 및 (ⅳ) HIV-1 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 포함한 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 관점으로서, 본 발명은 (i) HIV-1 유래의 유전자 gag, dpol, env 및 rev를 포함한 플라스미드, (ⅱ) HIV-1 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol을 포함한 플라스미드 및 (ⅲ) (a) HIV-1 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 당단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 nef 및 (b) HIV-1 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 5' 말단에 융합된 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 포함한 플라스미드를 포함하는 것을 특징으로 하는 AIDS 예방 또는 치료용 DNA 백신 조성물을 제공한다.
앞서 개진된 바와 같이 원숭이에서 AIDS 바이러스에 대한 방어효능을 관찰한 보고는 많이 있다. 어떤 백신물질의 효능을 영장류 모델에서 확인하기 위하여 다양한 종의 원숭이를 다양한 바이러스로 감염시켜 방어되는 것을 시험하는데, 이때 사용하는 원숭이 종류(chimpanzee, monkey)와 감염 바이러스의 종류에(HIV-1, HIV-2, SHIV, SIVmne, SIVmac)에 따라 여러 모델이 존재한다. 어떤 것은 방어를 유도하기 매우 쉬우며, 어떤 조합에서는 AIDS가 유도되지 않는 모델도 있다. 결국 모델은 (1) 바이러스 증식과 질병을 유발하는 정도 및 (2) 방어를 유도하는 정도에 따라 여러 가지로 분류되며 다양한 모델에서 백신의 효능연구가 진행되고 있다.
원숭이에서 AIDS를 유도하는 대표적인 모델로는 SHIV89.6P라는 바이러스를 원숭이에 감염시키는 모델이 알려져 있다. 그러나 이 모델에서는 (1) 인위적으로 재조합하여 만든 바이러스를 사용하고, (2) 비정상적으로 빠른 CD4 감소(drop) 및 사망을 유도하며, (3) 면역결핍에 의한 질병의 증상뿐 아니라 감염 자체에 의한 질병양상을 보이며, (4) 이 모델은 SIVmac239와는 달리 아주 최근에 개발된 모델임에도 약독화(attenuated) 바이러스는 물론 DNA, 재조합 바이러스 벡터 등 많은 방어의 성공 사례가 발표되었기 때문에 방어를 유도하기는 SIVmac239/원숭이 모델 보다 더 쉬운 것으로 생각된다. 그러나 약독화 바이러스를 백신으로 사용하면 이 약독화 바이러스는 질병을 일으키는 바이러스로 전이 될 수 있기 때문에 안전성에 문제가 있다. 다른 예로서, DNA로 면역화하고 바이러스 SIVmac251을 혈액 감염시켜 방어를 꾀한 실험이 있었으나 방어에 성공하지 못했다(원숭이의 CD4 감소 및 사망을 유발함).
본 발명은 DNA 백신을 투여하고 바이러스 SIVmac239를 레수스 마카크 원숭이에게 혈액 감염시켜 방어할 수 있는 가를 알아보는 모델을 사용한다. 바이러스 SIVmac239는 바이러스 SIVmac251을 두 번의 생체 내 계대(in vivo passage)를 거친 것으로 염기서열 및 병독성(virulence), 병리성(pathology) 등이 아주 유사하다. 바이러스 SIVmac239의 혈액 감염에 대하여 방어 효능을 보인 DNA 백신은 현재 알려지지 않고 있다. 이 모델의 특징은 일단 AIDS를 유도하고, 바이러스의 감염 경로, 감염 후 나타나는 면역학적 지표(CD4 숫자, CD29+CD4+ T 세포), 바이러스 역가의 정점이 나타나는 시점 등이 사람에게 있어 HIV-1 감염과 유사하다는 점이다. 그러한 이유로 본 발명에서 사용된 이 모델은 사람에게서 HIV-1에 대한 방어면역의 본 질, 즉 어떤 면역반응을 유도해야 HIV-1의 감염을 방어 할 수 있는지를 알기 위한 연구에서도 이용되고 있다. 단점이라면 사람보다 빨리 AIDS가 나타나고 사망한다는 것이다. 그러나 이것은 결과를 빨리 알 수 있다는 측면에서 실험 모델로써 유리하게 작용할 수 있다. 이 모델의 또 다른 특징은 이 모델에서 방어에 성공했던 백신은 약독화 바이러스(attenuated virus)의 면역화 방법 밖에 알려지지 않았을 정도로 방어하기 어렵다는 것이다.
본 발명에 이르러 바이러스 SIVmac239의 혈액 감염으로부터 성공적으로 방어할 수 있는 DNA 백신이 개발되었다. 백신 분야에서의 성공적인 방어 개념은, 백신을 투여한 후 바이러스가 감염되었을 때, (1) 바이러스의 증식이 전혀 발견되지 않고 제거된 경우(살균면역(sterilizing immunity) 유도), (2) 감염 초기에는 바이러스의 증식이 나타나지만 이후 제거되는 경우(물론, 질병도 일어나지 않음), (3) 바이러스의 증식이 오랜 기간 동안 억제되며 질병이 일어나지 않은 경우(전염도 일어나지 않음) 및 (4) 자신은 서서히 질병을 일으키지만 바이러스 역가를 낮게 유지시키며 전염만 예방할 수 있는 경우가 포함된다. 본 발명에서 개발된 DNA 백신의 레수스 마카크 원숭이에서의 방어 효능은 상기 (2) 및 (3)의 경우에 해당한다.
본 발명의 DNA 백신을 사용하여 바이러스 SIVmac239의 혈액 감염으로부터 방어에 성공할 수 있었던 이유는 우수한 백신 벡터의 개발, 코돈의 최적화(codon optimization) 및 보조(조절)유전자의 효과적인 사용에 있는 것으로 믿어진다. 본 발명에서 한 양태로서 개발한 벡터 pGX10은 본 발명자들에 의해 앞서 개발되어 현재 특허 계류 중에 있는 벡터 pTV2 및 공지된 벡터 pTX(Lee A. H., et al., Vaccine 1999, 17: 473-9)를 개량하여 완성한 것으로 시험관 내(in vitro) 발현 정도가 높을 뿐(벡터 pTV2의 10배) 아니라 생체 내(in vivo)에서도 우수한 면역반응을 보인 것으로 확인되었다(벡터 pTX의 10배 항체반응을 유도함). 또한, 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 면역원성 플라스미드는, 분비형 단백질의 시그날 서열(signal sequence), 예를 들면 HSV(herpes simplex virus)의 gD(당단백질 D)의 시그날 서열이 이와 융합된 유전자의 발현 수준을 증가시키고 생체 내에서 면역반응(특히, 세포면역반응)을 증가시키는 것으로 밝혀졌기 때문에(Lee et al., J. Virol 72(10),8430-36(1998); HCV 구조 유전자(ST)의 DNA 면역화에서 ST DNA의 면역화와 비교하여 CTL 반응의 증가를 관찰하였음), 유전자 pol과 보조(조절) 유전자를 분비형 단백질의 시그날 서열과 융합시켜 코돈을 최적화하였다. 또한, 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 면역원성 플라스미드에는 보조유전자가 효과적으로 사용되었다. 즉, 기존에 사용되었던 유전자 gag, pol 및 env 유전자뿐 아니라, 보조유전자 vif, nef, tat 및 vpx를 면역화에 사용하였다. 특정적으로, 보조 유전자중 유전자 vpr은 면역저해 효과가 있는 것으로 알려져(Ayyavoo V., et al., Int Immunol.,14(1),13-22(2002)) 사용하지 않았고, 면역교란 효과가 있을 것으로 예상되어 종래에 사용되지 않았던 유전자 nef 및 tat는 면역교란 활성을 줄이기 위해 (a) 각각 다른 보조 유전자 vif 및 vpx와 융합하여 발현되도록 벡터를 제조하고, 또한 경우에 따라 (b) 유전자 nef 및 tat의 전체 길이를 사용하지 않고 각 서열의 일부분만을 사용하였다.
용어의 정의
본 발명에서 별도로 정의하지 아니한, 모든 기술적 및 과학적인 관련 용어는 이 발명이 속한 기술 분야에서 통상적으로 통용되는 의미를 가진다. 다음의 용어들은 그 의미를 명확히 하고자 다음과 같이 정의한다.
본원에 사용된 "벡터"라는 용어는 외래 유전자를 숙주 세포 내로 안정적으로 운반할 수 있는 운반체로서의 DNA 분자를 말한다. 유용한 벡터가 되기 위해서는 복제될 수 있어야 하며, 숙주 세포 내로 유입할 수 있는 방안을 갖추어야 하고, 자신의 존재를 검출할 수 있는 수단을 구비하여 한다. 여기서, 외래 유전자로는 예를 들면 SIVmac239 및 HIV의 구조 및 보조 유전자가 그에 해당한다.
본원에 사용된 "플라스미드"라는 용어는 일반적으로 외래 유전자가 숙주 세포에서 발현될 수 있도록 벡터에 작동적으로 연결되어 형성된 환상의 DNA 분자를 말한다. 그러나, 플라스미드는 목적하는 유전자를 포함하는 플라스미드를 작제하기 위해 유전자 재조합에 의해 특정한 제한 효소에 의해 분해되고 새로운 유전자를 도입하는 벡터로 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서는 플라스미드와 벡터는 상호교환적으로 사용되며, 유전공학 분야에 통상의 지식으로 가진 자라면 그들의 명칭을 구분하지 않더라도 그 의미를 충분히 이해할 것이다.
본원에 사용된 "면역원성 플라스미드"라는 용어는 항원을 코딩하는 유전자를 포함하여 항원-특이적 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 유도하는 환상의 DNA 분자를 말한다.
본원에 사용된 "보조 플라스미드"라는 용어는 면역조절 분자를 발현하여 면역원성 플라스미드에 의해 유도되는 항원-특이적 체액성 및 세포-매개 면역 반응을 증가시켜 주는 환상의 DNA 분자를 말한다.
본원에 사용된 "구조 유전자"라는 용어는 SIVmac239 및 HIV-1의 구조 단백질을 코딩하는 유전자는 gag, env 및 pol를 가리킨다. 유전자 gag의 산물은 분자량이 55,000(p55), 24,000 (p24), 17,000(p17)과 15,000(p15) 달톤인 단백질들이며, p55 항원은 감염 초기에 만들어져 다른 코어 단백질로 나누어지는 전구물질이다. Gag 단백질은 바이러스 내부 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)에 존재하는데, p17 단백질은 코어와 외피 사이의 기질을 구성하며 외피의 안쪽 부위에 묻혀 있다. p24와 p15 단백질은 핵산을 둘러싸고 있는 코어 피복(core coat)을 구성한다. 유전자 env의 산물은 분자량이 160,000(gp160), 120,000(gp120), 41,000(gp41) 달톤인 당단백질이다. gp160은 외피 당단백질인 gp120 및 gp41의 전구물질로 바이러스의 구성 성분은 아니다. gp41은 내막과 외막사이에 존재하므로 막투과 단백(transmembrane protein)이라고 한다. gp120은 외피에 존재하는 72개의 돌기(놉)를 구성하고 있다. gp41은 gp120과 함께 숙주 세포의 CD4 분자와의 결합에 관여한다. 유전자 pol의 산물은 p66, p51(역전사효소), p31(인테그라제 혹은 엔도뉴클레아제)단백질을 포함한다. 중합효소 성분은 RNA의 DNA로의 역전사, 바이러스 DNA가 세포 DNA로의 통합, 그리고 전구물질을 더 작은 활성 물질로 나누는 작용을 한다. 중합효소 항원은 코어 내부에서 핵산과 연관되어 존재한다. gp160과 p55는 전구물질로 이 전구물질들은 바이러스 복제 과정 중에 혈액 내로 방출되어 항체를 형성하게 되므로 혈청학적 시험법으로 이 전구물질에 대한 항체들을 검출할 수 있다. 본 발명에서는 제1 면역원성 플라스미드에서 구조 유전자 pol은 전체 염기서열을 사용하지 않고 프로테아제에 해당하는 염기서열만을 사용하고 그 부분은 본원에서 dpol로 표시된다. 또한, 제2 면역원성 플라스미드에서도 구조 유전자 pol을 포함하나 전체 염기서열을 사용하지 않고 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 염기서열만을 사용하며 이 부분은 본원에서 RT-INT로 표시된다. RT-INT 부분은 임의로 돌연변이될 수 있다.
본원에 사용된 "조절 유전자" 또는 "보조 유전자"라는 용어는 SIVmac239 및 HIV-1의 조절 단백질을 코딩하는 유전자 nef, vpr, vpu, tat, rev 및 vif를 가리킨다. 이들 조절 유전자의 산물은 바이러스 단백질의 발현과 바이러스의 복제를 변화시키는 작용을 하며 바이러스의 감염능을 조절한다. 이들의 정확한 역할은 알려져 있지 않지만, 대체로 tat(p14)는 전사 활성을 가지며, rev(p19/20)은 바이러스 mRNA 발현을 조절하며, nef(p27)은 CD4 리셉터의 억제와 T 세포 활성에 관여하는 등 다양한 기능을 가지며, vif(p23)은 바이러스의 감염능력을 증가시키며, vpr(p15)는 바이러스 복제를 지원하며, vpu(p16)은 바이러스의 방출에 관여하며, vpx(p15)는 바이러스의 감염능력에 영향을 미친다. 그러나, 본 발명은 상기 조절 유전자중에서 특정적으로 vpr을 사용하지 않는다.
본원에서 사용된 "작동적으로 연결된(operably linked)"이라는 용어는 플라스미드 또는 벡터의 각 구성 성분들이 고유한 작용을 할 수 있도록 형성된 성분들의 배열을 의미한다. 따라서 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 서열(control sequence)은 코딩 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 조절 서열이 코딩 서열의 발현을 지시하도록 작용하는 한 조절 서열이 코딩 서열과 인접해 있을 필요는 없다. 예를 들면, 개재 서열(intervening sequence)이 프로모터 서열과 코딩 서열사이에 존재할 수 있는데, 이 경우 프로모터 서열은 코딩 서열에 "작동적으로 연결"되었다고 할 수 있다.
벡터 pGX10
본 발명자들은 AIDS DNA 백신에 함유되는 면역원성 플라스미드를 위한 기본 벡터를 개발하였으며, 이를 pGX10으로 명명하였다. 본 발명의 벡터 pGX10(서열번호 60)은 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이 SV40 ori, 시미안 바이러스 40 복제원, 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터/인핸서 서열, 아데노바이러스 삼부 리더 서열(TPL), 멀티 클로닝 부위(MCS), 시미안 바이러스 40 폴리아데닐화 서열(SV40PA), 시미안 바이러스 40 인핸서 서열(SV40Eh), 플라스미드가 대장균에서 증식할 수 있도록 ColE1 Ori 및 카나마이신 내성 유전자(KanR)로 구성되어 있는 것을 특징으로 하며, 다수의 특정 제한 부위를 포함하는 3.6kb의 신규한 벡터이다.
본 발명의 벡터 pGX10은 실시예 1 및 도 1에 상세히 기술 및 도해되어 있는 바와 같이 공지된 벡터, 즉 본 발명자들이 이미 발표한 pTX(Lee A. H., et al., Vaccine 17:473-9, (1999))를 기초로 하여 제조되었고 이미 작은 동물(small animal) 연구에서 DNA 백신 벡터로 사용된 바 있는 pTV2 벡터(Lee, et al., J Virol. 72,8430(1998) 와 Cho, et al., Vaccine 17,1136(1999))를 출발 벡터로 사용하여 공지된 방법으로 제조할 수 있으며, 특허의 목적상 부다페스트 협약 하에 2002년 3월 29일에 국제기탁기관 KCTC에 수탁번호 제 10212BP호로 기탁되었다. 기탁증에는 pGX10/XL1blue로 명명되어 있으나 이는 pGX10과 동일한 벡터이다. 한편, 상기 프로모터의 종류 및 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형할 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 프로모터의 경우 바이러스성 프로모터인 RSV 프로모터, 세포성 프로모터인 EF1, MCK(muscle specific promoter), LCK(T cell specific promoter) 등이 사용될 수 있고, 당단백질의 경우는 VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당백질(rotavirus outer capsid glycoprotein), VP7 등으로 대체하여 사용될 수 있다.
본 발명의 벡터 pGX10은 상기한 바와 같이 공지된 벡터 pTX 및 pTV2를 개량한 것으로 시험관 내 발현 정도가 높을(pTV2의 10배 - 도 18 참조)뿐 아니라 생체 내에서도 우수한 면역반응을 보인다. 본 발명의 벡터 pGX10은 pTX의 10배 항체반응을 유도하고 pGX10-HIV/RT(역전사효소)는 pTX10-HIV/RT에 10배 항-RT 항체를 생성하는 것으로 나타났다(데이터 제시되지 않음). 상기 공지 벡터 pTV2는 대한민국 특허 공개 제2001-0054338호(2001년 07월 02일) 및 이의 대응 미국 특허공개번호 2001004531(2001년 06월 21일)에 개시되어 있다.
SIV 면역원성 플라스미드(immunogenic plasmids)
본 발명에 따라 레수스 마카크 원숭이에서 그 효능을 확인할 AIDS DNA 백신으로 사용하기 위해 기본적으로 다음과 같은 네 종류의 면역원성 플라스미드가 작제되었다:
1) 바이러스 SIVmac239 유래의 매트릭스 단백질(matrix protein, MA), 캡시드 단백질(capsid protein, CA) 및 핵캡시드 단백질(nucleocapsid protein, NC)을 코딩하는 유전자 gag, 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 pol 중 프로테아제(protease)를 코딩하는 염기서열 부위 dpol 및 바이러스 SIVmac239 유래의 외피단백질(envelope protein)을 코딩하는 유전자 env와 바이러스 SIVmac239 유래의 단백질 Rev를 코딩하는 보조(regulatory) 유전자 rev를 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성된 것을 특징으로 하는 면역원성 플라스미드(이하 "제1 SIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다);
2) 바이러스 SIVmac239 유래의 역전사효소(RT, Reverse Transcriptase)와 인테그라제(INT, Integrase)를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성된 것을 특징으로 하는 면역원성 플라스미드(이하 "제2 SIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다);
3) 바이러스 SIVmac239 유래의 vif 유전자 및 이의 3' 및 5'에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 nef를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 플라스미드(이하 "제3 SIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다); 및
4) 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 포함하는 것을 특징으로 면역원성 플라스미드(이하 "제4 SIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다).
(1) 제1 SIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS(multi-cloning site)에 바이러스 SIVmac239의 유전자 gag, dpol(프로테아제) 및 env 및 보조 유전자 rev가 작동적으로 연결되도록 도입되어 SIVmac239/레수스 마카크 원숭이 모델에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 8.7kb의 신규한 면역원성 플라스미드를 형성한다. 이 플라스미드의 상세한 작제 과정은 실시예 2 및 도 5에 기술되어 있으며 pGX10-SIV/GE로 명명되었다. 이 플라스미드는 특허의 목적상 부다페스트 협약 하에 2002년 3월 29일에 국제기탁기관 KCTC에 수탁번호 제 10215BP호로 기탁되었다. 기탁증에는 pGX10-SIV/GE/XL1blue로 명명되어 있으나 이는 pGX10-SIV/GE와 동일한 벡터이다.
본 발명의 플라스미드 pGX10-SIV/GE는 본 발명자들에 의해 출원되어 계류 중에 있는 대한민국 특허공개번호 2001-0054338호(2001년 07월 02일) 및 이의 대응 미국특허공개번호 제2001004531호(2001년 06월 21일)에 청구된 10.0kb의 면역원성 플라스미드 pTV-SIV/GE에 비해 발현 효율이 우수하다. 도 31은 pGX10-SIV/GE와 pTV-SIV/GE의 웨스턴 블럿팅 사진으로 그를 증명한다.
(2) 제2 SIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따른 벡터 pGX10의 멀티 클로닝 부위에 바이러스 SIVmac239 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 작동적으로 연결되도록 도입되는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 AIDS DNA 백신에 상기 제1 SIV 면역원성 플라스미드와 함께 함유되는, 제2 SIV 면역원성 플라스미드를 형성한다.
본 발명의 바람직한 한 양태로서, pol 유전자는 인테그라제의 효소활성이 억제되도록 변이될 수 있다. 이와 같이 돌연변이 유전자를 사용하면 DNA 백신의 투여 후 피접종체에서 증식 가능한 바이러스가 생성될 아주 낮은 위험성을 더욱 낮춰 안전성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 인테그라제 부위 중 염기서열 5130-5135 부위는 인테그라아제의 효소활성에 중요한 부위로 알려져 있으므로(Asp 116번에 해당, Fields Virology Third edition p1893, Lippincott-Raven Co., 1996), 숙주세포에서의 증식을 막기 위해 염기서열 5130-5135 부위를 변형시켜 인테그라제의 활성을 억제시킬 수 있다. 구체적으로, 인테그라제 염기서열 5130-5132 부위를 결실시키고 및/또는 인테그라제 염기서열 5133-5135를 세린 코돈으로 치환시키는 것이다. 즉, Asn117 대신 Ser117이 발현되도록 돌연변이시켰다. 자체 실험 결과, 이와 같이 변형시킨 SIVmac239 바이러스는 숙주세포에서 더 이상의 증식을 하지 못하였다. 상기 염기서열의 위치 번호는 진 뱅크 수탁번호(GenBank Accession Number) M33262의 SIVmac239 클론(도 4)을 따랐다.
이 밖에 인테그라제의 활성을 억제할 수 있는 방법으로는 Asp116과 함께 기 타 Asp64, Glu152이 보존되어 있는 서열을 변형시키는 것이며, 이 아미노산들은 활성 부위(active site)에서 2가 금속이온(divalent metal ion)(예, Mg2+)과 결합하여 과도상태(transition state)를 안정화하는 것으로 알려져 있다. HIV-1 인테그라제 경우 His12, His16, Cys40, Cys43은 DNA 결합 구조(binding structure)(metal-finger)를 구성하는데 중요한 아미노산이다(상기 Field virology, p1893).
바이러스 SIVmac239 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol(도 6에서 RT-INT로 표시됨)의 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 역전사효소와 인테그라제의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 멀티 클로닝 부위에 바이러스 SIVmac239 유래의 역전사효소 및 염기서열 5130-5132 부위를 결실시키고 염기서열 5133-5135를 세린 코돈으로 치환시킨 인테그라제-암호화 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus, HSV)의 당단백질(glycoprotein D, gD)의 시그날 서열이 작동적으로 연결되도록 도입되어 형성된 6.3kb의 제2 SIV 면역원성 플라스미드를 형성한다. 상기 유전자 pol은 이 의 3' 말단에 HSV의 gD의 N-말단 33개의 아미노산을 암호화한 시그날 서열이 융합되어 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 되어 역전사효소 및 인테그라제의 발현 강도가 증가한다. 이 플라스미드는 SIVmac239/레수스 마카크 원숭이 모델에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 8.7kb의 제2 SIV 면역원성 플라스미드로서, 이의 상세한 작제 과정은 실시예 3 및 도 6에 기술되어 있으며, pGX10-SIV/dpol로 명명되었다. 이 플라스미드 또한 특허의 목적상 부다페스트 협약 하에 2002년 3월 29일에 국제기탁기관 KCTC에 수탁번호 제 10214BP호로 기탁되었다. 기탁증에는 pGX10-SIV/dpol/XL1blue로 명명되어 있으나 이는 pGX10-SIV/dpol과 동일한 벡터이다.
한편, 상기된 것 이외에 기타 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형할 수 있으며 이러한 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 플라스미드 pGX10-SIV/dpol은 본 발명자들에 의해 출원되어 계류 중에 있는 대한민국 특허공개번호 2001-0054338호 및 이의 대응 미국특허공개번호 2001004531에 청구된 10.0kb의 면역원성 플라스미드 pTV-SIV/dpol에 비해 발현 효율에서 우수하다(데이터 표시되지 않음).
(3) 제3 SIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따라 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 nef가 벡터에 작동적으로 연결된 플라스미드가 작제된다. 벡터는 포유류 세포 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 근육 세포, DC, T 세포 등에서 발현되어 면역반응을 유도하도록 최적화한 DNA 백신 벡터이다. 더욱 바람직한 벡터는 CMV 프로모터와 임의로 TPL 서열 SV40 pA를 가진 벡터이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 구체적인 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 pGX10 및 pTV2는 물론 Invitrogen 사의 pVAX1, pRC/CMV, pREP4 및 pREP10(RSV 프로모터를 포함하지만 가능), pcDNA1, pcDNA1.1, pcDNA3, pcDNA3/CAT, pRC/CMV 및 pRC/CMV2, Stratagene 사의 pCMV-script 및 Promega 사의 pSI, pCI 및 pCI-neo 등이 포함된다. 가장 바람직한 것은 pGX10이다.
이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 SIV 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE와 제2 SIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-SIV/pol)와 함께 전달되어 제1 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다.
또한, 제3 SIV 면역원성 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 SIV 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE, 제2 SIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-SIV/dpol) 및 제4 SIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-SIV/TV)와 함께 전달되어 제1 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다.
본 발명의 한 가지 바람직한 양태로서, 바이러스 SIVmac239 유래의 보조 유전자 vif 및 이의 5' 말단에 융합되는 SIVmac239 유래의 보조 유전자 nef는 자신의 면역교란 작용에 의해 발생될 수 있는 면역저해 효과를 방지하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형 방법은 상당히 다양할 수 있으며 예를 들면 Vif에서 Ser114- Leu150 등이 변형될 수 있고(Fields Virology Third edition, p1901, Lippincott-Raven Co., 1996), Nef는 Arg137 및 Arg138과 함께 Gly2(미리스틸화 관여)가 변형될 수 있다.
바이러스 SIVmac239 유래의 보조 유전자 vif의 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 단백질 Vif와 Nef의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 SIVmac239의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 변형된 SIVmac239 유래의 유전자 nef를 작동적으로 연결되도록 도입한 5.1kb의 다른 신규한 플라스미드를 작제한다. 이 플라스미드는 SIVmac239/레수스 마카크 원숭이 모델에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 제3의 SIV 면역원성 플라스미드이며, 이의 상세한 작제 과정은 실시예 4 및 도 7에 기술되어 있으며 pGX10-SIV/VN으로 명명되었다. 이 플라스미드 또한 특허의 목적상 부다페스트 협약 하에 2002년 3월 29일에 국제기탁기관 KCTC에 의 명칭으로 수탁번호 제 10213BP호로 기탁되었다. 기탁증에는 pGX10-SIV/VN/XL1blue로 명명되어 있으나 이는 pGX10-SIV/VN과 동일한 벡터이다.
구체적으로, 제3 SIV 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/VN은 SIVmac239 유래의 유전자 vif와 nef가 결합한 유전자(VN로 표시될 수 있다)를 포함하고, 또한 유전자 nef의 CD4 의 억제(down regulation) 활성에 중요하다고 알려진 Arg137과 Arg138에 해당하는 유전자를 제거하여(J. Biol. Chem. 270:15307, 1995) nef 단백질이 유도할지 모르는 면역저해 효과를 방지한 것이다. 즉, 유전자 VN의 5' 말단에 HSV의 gD의 N-말단 33개의 아미노산을 암호화한 시그날 서열을 융합시키고 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 Vif-Nef 융합 발현 강도를 증가시키고자 한 것이다.
한편, 상기된 것 이외에 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형될 수 있으며 이들 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
(4) 제4 SIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따라 바이러스 SIVmac239 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 vpx가 벡터에 작동적으로 연결된 플라스미드가 작제된다. 벡터는 포유류 세포 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 근육 세포, DC, T 세포 등에서 발현되어 면역반응을 유도하도록 최적화한 DNA 백신 벡터이다. 더욱 바람직한 벡터는 CMV 프로모터와 임의로 TPL 서열 SV40 pA를 가진 벡터이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 구체적인 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 pGX10 및 pTV2는 물론 Invitrogen 사의 pVAX1, pRC/CMV, pREP4 및 pREP10(RSV 프로모터를 포함하지만 가능), pcDNA1, pcDNA1.1, pcDNA3, pcDNA3/CAT, pRC/CMV 및 pRC/CMV2, Stratagene 사의 pCMV-script 및 Promega 사의 pSI, pCI 및 pCI-neo 등이 포함된다. 가장 바람직한 것은 pGX10이다.
이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 SIV 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE와 제2 SIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-SIV/dpol)와 함께 전달되어 제1 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다. 또한, 이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 SIV 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE, 제2 SIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-SIV/dpol) 및 제3 SIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-SIV/VN)와 함께 전달되어 제1 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다.
SIVmac239 유래의 유전자 tat는 전체 서열이 사용될 수 있으나, 이 유전자의 면역교란 작용 때문에 변형된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 유전자 tat의 변형 가능한 범위는 엑손 1 이외의 모든 부위가 포함된다. 엑손 1도 tat 효소 효능(면역교란)이 있지만, 엑손 1+엑손 2 보다는 떨어지고 엑손 2에 있는 면역 에피토프는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 따라서, 가장 바람직하게는 유전자 tat는 엑손 1 부위만을 사용하는 것이다.
바이러스 SIVmac239 유래의 보조 유전자 tat의 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 단백질 Tat와 Vpx의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤 르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 SIVmac239의 유전자 tat의 엑손 1 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 변형된 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 작동적으로 연결되도록 도입한 4.3kb의 다른 신규한 플라스미드를 작제한다. 이 플라스미드는 SIVmac239/레수스 마카크 원숭이 모델에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 제4 SIV 면역원성 플라스미드이며, 이의 상세한 작제 과정은 실시예 5 및 도 8에 기술되어 있으며 pGX10-SIV/TV로 명명되었다. 이 플라스미드 또한 특허의 목적상 부다페스트 협약 하에 2002년 3월 29일에 국제기탁기관 KCTC에 수탁번호 제 10216BP호로 기탁되었다. 기탁증에는 pGX10-SIV/TV/XL1blue로 명명되어 있으나 이는 pGX10-SIV/TV와 동일한 벡터이다.
구체적으로, 본 발명의 제4 SIV 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/TV는 SIVmac239의 유전자 tat의 엑손 1과 vpx 유전자가 융합한 유전자(TV로 표시될 수 있다)를 포함한다. 즉, 유전자 TV의 5' 말단에 HSV의 gD의 N-말단 33개의 아미노산을 암호화한 시그날 서열을 융합시킨 것이다.
한편, 상기 이외의 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형할 수 있으며 이들 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
(5) SIVmac239 유래의 보조 유전자 vif, nef, tat 및 vpx를 가진 면역원성 플라스미드
본 발명의 바람직한 양태로서, (i) SIVmac239 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 nef 및 (ⅱ) SIVmac239 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu가 한 개의 벡터에 작동적으로 연결된 플라스미드가 작제된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 구체적인 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 pGX10 및 pTV2는 물론 Invitrogen 사의 pVAX1, pRC/CMV, pREP4 및 pREP10(RSV 프로모터를 포함하지만 가능), pcDNA1, pcDNA1.1, pcDNA3, pcDNA3/CAT, pRC/CMV 및 pRC/CMV2, Stratagene 사의 pCMV-script 및 Promega 사의 pSI, pCI 및 pCI-neo 등이 포함된다. 가장 바람직한 것은 pGX10이다. 이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 SIV 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-SIV/pol)와 함께 전달되어 제1 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다. 또한, 이러한 면역원성 플라스미드는 DNA 백신을 위해 제조할 플라스미드 숫자를 줄일 수 있기 때문에 제조원가 절감에 유리하다.
본 발명의 한 가지 바람직한 양태로서, 바이러스 SIVmac239 유래의 보조 유전자 vif 및 이의 5' 말단에 융합되는 SIVmac239 유래의 보조 유전자 nef는 자신의 면역교란 작용에 의해 발생될 수 있는 면역저해 효과를 방지하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형 방법은 상당히 다양할 수 있으며 예를 들면 Vif에서 Ser114-Leu150 등이 변형될 수 있고(Fields Virology Third edition, p1901, Lippincott-Raven Co., 1996), Nef는 Arg137 및 Arg138과 함께 Gly2(미리스틸화 관여)가 변형될 수 있다.
다른 바람직한 양태로서, SIVmac239 유래의 유전자 tat는 전체 서열이 사용될 수 있으나, 이 유전자의 면역교란 작용 때문에 변형된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 유전자 tat의 변형 가능한 범위는 엑손 1 이외의 모든 부위가 포함된다. 엑손 1도 tat 효소 효능(면역교란)이 있지만, 엑손 1+엑손 2 보다는 떨어지고 또한 엑손 2에 있는 면역 에피토프는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 따라서, 가장 바람직하게는 유전자 tat는 엑손 1 부위만을 사용하는 것이다. 상기한 바와 같은 유전자 nef 및 tat는 각각 독립적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 유전자 nef는 변형되지 않고 유전자 tat만 변형되거나, 유전자 tat는 변형되지 않고 유전자 nef만 변형되거나, 유전자 net와 tat 모두가 변형될 수 있다.
바이러스 SIVmac239 유래의 보조 유전자 vif 및 tat의 각 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 각각 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 단백질 Vif와 Nef의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다. 보조 유전자 vif와 tat의 3' 말단에 융합되는 시그날 서열은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 SIVmac239의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 변형된 유전자 nef(Arg137 및 Arg138에 해당하는 코돈이 결실되어 변이)를 작동적으로 연결되도록 도입한 제3 SIV 면역원성 플라스미드에 SIVmac239의 유전자 tat의 엑손 1 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 작동적으로 연결되도록 도입한 7.5kb의 다른 신규한 면역원성 플라스미드를 작제한다. 이렇게 작제된 플라스미드는 SIVmac239/레수스 마카크 원숭이 모델에 대한 본 발명의 DNA 백신에서 제1 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드와 함께 사용되는 제3의 SIV 면역원성 플라스미드에 해당한다. 이의 상세한 작제 과정은 실시예 6 및 도 9에 기술되어 있으며 pGX10-SIV/VNTV로 명명되었다.
다른 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 SIVmac239의 유전자 tat의 엑손 1 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 유전자 vpx를 작동적으로 연결되도록 도입한 제4 SIV 면역원성 플라스미드에 SIVmac239의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 SIVmac239 유래의 변형된 유전자 nef를 작동적으로 연결되도록 도입한 7.5kb의 다른 신규한 면역원성 플라스미드를 작제한다. 이렇게 작제된 플라스미드는 SIVmac239/레수스 마카크 원숭이 모델에 대한 본 발명의 DNA 백신에서 제1 및 제2 SIV 면역원성 플라스미드와 함께 사용되는 제3의 SIV 면역원성 플라스 미드에 해당한다. 이의 상세한 작제 과정은 실시예 7 및 도 10에 기술되어 있으며 pGX10-SIV/TVVN으로 명명되었다.
한편, 상기 이외의 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형될 수 있으며 이러한 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명은 사람의 HIV-1 감염에서도 효과적일 것으로 믿어진다. HIV-1와 SIV는 렌티바이러스(lentivirus) 속으로 구성 유전자의 구조와 기능이 완전히 동일하지는 않지만 매우 유사하다. 또한 gag 같은 유전자는 HIV와 SIV가 높은 상동성(homology)을 가지며 gag에 대한 폴리클로날 항체는 서로 교차반응(cross-reactive)하기도 한다. 그리고 무엇보다도 HIV가 사람에서 일으키는 감염 후 양상과 SIV가 원숭이 감염 후 일으키는 양상들이 유사하다. 이러한 이유로 모델로 사용하며 SIV 유전자를 HIV로 바꾸었을 때 유사한 효능이 있을 것으로 기대 할 수 있다. 물론, 지금까지 사람에서 성공한 AIDS백신이 없기 때문에 SIVmac/원숭이 모델에서의 평가가 사람에게도 완벽하게 맞는다는 보장은 없다. 사람에게는 사람만의 인자(factor)가 작용하여 SIVmac239/원숭이 모델 등과 같은 영장류모델에서 효과가 있는 물질이 사람에게서 효과가 없을 수 있다. 그러나 이런 방법(영장류 모델 사용)이 현재 사람에게서 백신 효능을 살피기(임상시험)기에 앞서 후보물질을 평가하여 임상시험에서 위험 부담을 줄이는 효과적인 방법이며, 생쥐나 고양이 등 비 영장류 모델에서 우수한 효능을 보이는 것보다 영장류에서 우수한 효능을 보이는 것이 사람에게도 적용될 가능성이 크다는 것을 쉽게 예상 할 수 있다.
HIV 면역원성 플라스미드(immunogenic plasmids)
본 발명에 따라 사람에서 그 효능을 확인할 AIDS DNA 백신으로 사용하기 위해 기본적으로 다음과 같은 네 종류의 면역원성 플라스미드가 작제되었다:
1) 바이러스 HIV-1 유래의 매트릭스 단백질(matrix protein, MA), 캡시드 단백질(capsid protein, CA) 및 핵캡시드 단백질(nucleocapsid protein, NC)를 코딩하는 유전자 gag, 유전자 pol중 프로테아제(protease)를 코딩하는 염기서열 부위 dpol 및 외피단백질(envelope protein)을 코딩하는 유전자 env와 바이러스 HIV-1 유래의 단백질 Rev를 코딩하는 보조(regulatory) 유전자 rev를 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성된 것을 특징으로 하는 면역원성 플라스미드(이하 "제1 HIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다);
2) 바이러스 HIV-1 유래의 역전사효소(RT, Reverse Transcriptase)와 인테그라제(INT, Integrase)를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성된 것을 특징으로 하는 면역원성 플라스미드(이하 "제2 HIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다);
3) 바이러스 HIV-1 유래의 vif 유전자의 3' 및 5'에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 nef를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 플라스미드(이하 "제3 HIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다); 및
4) 바이러스 HIV-1 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역원성 플라스미드(이하 "제4 HIV 면역원성 플라스미드"로 약칭될 수 있다).
(1) 제1 HIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS(multi-cloning site)에 바이러스 HIV의 유전자 gag, dpol(프로테아제) 및 env 및 보조 유전자 rev가 작동적으로 연결되도록 도입되어 AIDS 사람 환자에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 8.7kb의 신규한 면역원성 플라스미드를 형성한다. 이 플라스미드의 상세한 작제 과정은 실시예 8 및 도 11에 기술되어 있으며 pGX10-HIV/GE로 명명되었다.
본 발명의 플라스미드 pGX10-HIV/GE는 본 발명자들에 의해 출원되어 계류 중에 있는 대한민국 특허공개번호 2001-0054338호(2001년 07월 02일) 및 이의 대응 미국특허공개번호 제2001004531호(2001년 06월 21일)에 청구 된 11.0kb의 면역원성 플라스미드 pTV-HIV/GE에 비해 발현 효율 및 면역효능이 우수하다.
(2) 제2 HIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따른 벡터 pGX10의 멀티 클로닝 부위에 바이러스 HIV-1 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열이 작동적으로 연결되도록 도입되는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 AIDS DNA 백신에 상기 제1 HIV 면역원성 플라스미드와 함께 함유되는, 제2 HIV 면역원성 플라스미드를 형성한다.
본 발명의 바람직한 한 양태로서, pol 유전자는 인테그라제의 효소활성이 억제되도록 변이될 수 있다. 이와 같이 돌연변이 유전자를 사용하면 DNA 백신의 투여 후 피접종체에서 증식 가능한 바이러스가 생성될 아주 낮은 위험성을 더욱 낮춰 안전성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 인테그라제 부위 중 염기서열 5130-5135 부위는 인테그라아제의 효소활성에 중요한 부위로 알려져 있으므로(Asp 116번에 해당, Fields Virology Third edition p1893, Lippincott-Raven Co., 1996), 숙주세포에서의 증식을 막기 위해 염기서열 5130-5135 부위를 변형시켜 인테그라제의 활성을 억제시킬 수 있다. 구체적으로, 인테그라제 염기서열 5130-5132 부위를 결실시키고 및/또는 인테그라제 염기서열 5133-5135를 세린 코돈으로 치환시키는 것이다. 즉, Asn117 대신 Ser117이 발현되도록 돌연변이시켰다. 자체 실험 결과, 이와 같이 변형시킨 HIV-1 바이러스는 숙주세포에서 더 이상의 증식을 하지 못하였다. 상기 염기서열의 위치 번호는 진 뱅크 수탁번호(GenBank Accession Number) M38429의 HIV-1 JR-CSF 클론을 따랐다.
이 밖에 인테그라제의 활성을 억제할 수 있는 방법으로는 Asp116과 함께 기타 Asp64, Glu152이 보존되어 있는 서열을 변형하는 것이며, 이 아미노산들은 활성 부위(active site)에서 2가 금속이온(divalent metal ion)(예, Mg2+)과 결합하여 과도상태(transition state)를 안정화하는 것으로 알려져 있다. 또한, His12, His16, Cys40, Cys43가 DNA 결합 구조(binding structure)(metal-finger)를 구성하는데 중요한 아미노산이며(상기 Field virology, p1893) 이들을 변형시켜 달성할 수 있다.
바이러스 HIV 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol(도면에서 RT-INT로 표시됨)의 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 역전사효소와 인테그라제의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV (human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 멀티 클로닝 부위에 바이러스 HIV-1 유래의 역전사효소 및 염기서열 5130-5132 부위를 결실시키고 염기서열 5133-5135를 세린 코돈으로 치환시킨 인테그라제-암호화 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 융합된 헤르페스 심플렉스 바이러스 (herpes simplex virus, HSV)의 당단백질(glycoprotein D, gD)의 시그날 서열이 작동적으로 연결되도록 도입되어 형성된 6.2kb의 제2 HIV 면역원성 플라스미드를 형성한다. 상기 유전자 pol은 이의 3' 말단에 HSV의 gD의 N-말단 33개의 아미노산을 암호화한 시그날 서열이 융합되어 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 되어 역전사효소 및 인테그라제의 발현 강도가 증가한다. 이 플라스미드는 SIVmac239/레수스 마카크 원숭이 모델에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 제2 HIV 면역원성 플라스미드로서, 이의 상세한 작제 과정은 실시예 9 및 도 12에 기술되어 있으며, pGX10-HIV/dpol로 명명되었다.
한편, 상기된 것 이외에 기타 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신 호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형할 수 있으며 이러한 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명의 플라스미드 pGX10-HIV/dpol은 본 발명자들에 의해 출원되어 계류 중에 있는 대한민국 특허공개번호 2001-0054338호 및 이의 대응 미국특허공개번호 2001004531에 청구된 7.5kb의 면역원성 플라스미드 pTV-HIV/pol에 비해 발현 효율에서 우수하다.
(3) 제3 HIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따라 바이러스 HIV-1 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 nef가 벡터에 작동적으로 연결된 플라스미드가 작제된다. 벡터는 포유류 세포 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 근육 세포, DC, T 세포 등에서 발현되어 면역반응을 유도하도록 최적화한 DNA 백신 벡터이다. 더욱 바람직한 벡터는 CMV 프로모터와 임의로 TPL 서열 SV40 pA를 가진 벡터이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 구체적인 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 pGX10 및 pTV2는 물론 Invitrogen 사의 pVAX1, pRC/CMV, pREP4 및 pREP10(RSV 프로모터를 포함하지만 가능), pcDNA1, pcDNA1.1, pcDNA3, pcDNA3/CAT, pRC/CMV 및 pRC/CMV2, Stratagene 사의 pCMV-script 및 Promega 사의 pSI, pCI 및 pCI-neo 등이 포함된다. 가장 바람직한 것은 pGX10이다.
이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/GE와 제2 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/pol)와 함께 전달되어 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다.
또한, 작제된 제3 면역원성 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/GE, 제2 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/pol) 및 제4 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/TV)와 함께 전달되어 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다. 본 발명의 한 가지 바람직한 양태로서, 바이러스 HIV-1 유래의 보조 유전자 vif 및 이의 5' 말단에 융합되는 HIV-1 유래의 보조 유전자 nef는 자신의 면역교란 작용에 의해 발생될 수 있는 면역저해 효과를 방지하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형 방법은 상당히 다양할 수 있으며 예를 들면 Vif에서 Ser114-Leu150 등이 변형될 수 있고(Fields Virology Third edition, p1901, Lippincott-Raven Co., 1996), Nef는 Arg137 및 Arg138과 함께 Gly2(미리스틸화 관여)가 변형될 수 있다. 그리고 Nef 69-80 사이의 Pro-Xa-Xa-Pro 모티프의 변형 등이 있다(Fields Virology Third edition, p1904-1908, Lippincott-Raven Co., 1996).
바이러스 HIV-1 유래의 보조 유전자 vif의 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 단백질 Vif와 Nef의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단 백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 HIV-1의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 변형된 HIV-1 유래의 유전자 nef를 작동적으로 연결되도록 도입한 5.1kb의 다른 신규한 플라스미드를 작제한다. 이 플라스미드는 AIDS 사람 환자에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 제3의 HIV 면역원성 플라스미드이며, 이의 상세한 작제 과정은 실시예 10 및 도 13에 기술되어 있으며 pGX10-HIV/VN으로 명명되었다.
구체적으로, 제3 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/VN은 HIV-1 유래의 유전자 vif와 nef가 결합한 유전자(VN으로 표시될 수 있다)를 포함하고, 또한 유전자 nef의 CD4 의 억제 활성에 중요하다고 알려진 Arg137과 Arg138에 해당하는 유전자를 제거하여(J. Biol. Chem. 270:15307, 1995) nef 단백질이 유도할지 모르는 면역저해 효과를 방지한 것이다. 즉, 유전자 VN의 5' 말단에 HSV의 gD의 N-말단 33개의 아미노산을 암호화한 시그날 서열을 융합시키고 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 Vif-Nef 융합 발현 강도를 증가시키고자 한 것이다.
한편, 상기된 것 이외에 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형될 수 있으며 이들 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
(4) 제4 HIV 면역원성 플라스미드
본 발명에 따라 바이러스 HIV-1 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu가 벡터에 작동적으로 연결된 플라스미드가 작제된다. 벡터는 포유류 세포 발현 벡터가 사용될 수 있으며, 바람직하게는 근육 세포, DC, T 세포 등에서 발현되어 면역반응을 유도하도록 최적화한 DNA 백신 벡터이다. 더욱 바람직한 벡터는 CMV 프로모터와 임의로 TPL 서열 SV40 pA를 가진 벡터이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 구체적인 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 pGX10 및 pTV2는 물론 Invitrogen 사의 pVAX1, pRC/CMV, pREP4 및 pREP10(RSV 프로모터를 포함하지만 가능), pcDNA1, pcDNA1.1, pcDNA3, pcDNA3/CAT, pRC/CMV 및 pRC/CMV2, Stratagene 사의 pCMV-script 및 Promega 사의 pSI, pCI 및 pCI-neo 등이 포함된다. 가장 바람직한 것은 pGX10이다. 이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/GE와 제2 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/dpol)와 함께 전달되어 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다.
이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/GE 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/dpol)와 함께 전달되어 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다.
또한, 작제된 제4 HIV 면역원성 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/GE, 제2 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/dpol) 및 제3 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/VN)와 함께 전달되어 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다.
HIV-1 유래의 유전자 tat는 전체 서열이 사용될 수 있으나, 이 유전자의 면역교란 작용 때문에 변형된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 유전자 tat의 변형 가능한 범위는 엑손 1 이외의 모든 부위가 포함된다. 엑손 1도 tat 효소 효능(면역교란)이 있지만 엑손 1+엑손 2 보다는 떨어진다. 다만, 엑손 2에 있는 면역 에피토프는 사용할 수 없다는 단점이 있기 때문에 가장 바람직하게는 유전자 tat는 엑손 1 부위만을 사용하는 것이다.
바이러스 HIV-1 유래의 보조 유전자 tat의 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 단백질 Tat와 Vpx의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 HIV-1의 유전자 tat의 엑손 1 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 작동적으로 연결되도록 도입한 4.3kb의 다른 신규한 플라스미드를 작제한다. 이 플라스미드는 AIDS 사람 환자에 대한 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 제4 HIV 면역원성 플라스미드이며, 이의 상세한 작제 과정은 실시예 11 및 도 14에 기술되어 있으며 pGX10-HIV/TV로 명명되었다.
구체적으로, 본 발명의 제4 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/TV는 HIV-1의 유전자 tat의 엑손 1과 vpu 유전자가 융합한 유전자(TV로 표시될 수 있다)를 포함한다. 즉, 유전자 TV의 5' 말단에 HSV의 gD의 N-말단 33개의 아미노산을 암호화한 시그날 서열을 융합시킨 것이다.
한편, 상기 이외의 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형할 수 있으며 이들 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
(5) HIV-1 유래의 보조 유전자 vif, nef, tat 및 vpu를 가진 면역원성 플라스미드
본 발명의 바람직한 양태로서, (i) HIV-1 유래의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 nef 및 (ⅱ) HIV-1 유래의 유전자 tat의 엑손 1 내지 전체 서열 중 어느 한 유전자 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 분비형 단백질의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu가 한 개의 벡터에 작동적으로 연결된 플라스미드가 작제된다. 본 발명에서 사용될 수 있는 벡터의 구체적인 예로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 pGX10 및 pTV2는 물론 Invitrogen 사의 pVAX1, pRC/CMV, pREP4 및 pREP10(RSV 프로모터를 포함하지만 가능), pcDNA1, pcDNA1.1, pcDNA3, pcDNA3/CAT, pRC/CMV 및 pRC/CMV2, Stratagene 사의 pCMV-script 및 Promega 사의 pSI, pCI 및 pCI-neo 등이 포함된다. 가장 바람직한 것은 pGX10이다. 이렇게 작제된 플라스미드는 상기 본 발명의 제1 HIV 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/GE 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드(예, pGX10-HIV/dpol)와 함께 전달되어 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드가 유도하는 방어 효능을 증가시킨다. 또한, 이러한 면역원성 플라스미드는 DNA 백신을 위해 제조할 플라스미드 숫자를 줄일 수 있기 때문에 제조원가 절감에 유리하다.
본 발명의 한 가지 바람직한 양태로서, 바이러스 HIV-1 유래의 보조 유전자 vif의 5' 말단에 융합되는 HIV-1 유래의 보조 유전자 nef는 자신의 면역교란 작용에 의해 발생될 수 있는 면역저해 효과를 방지하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 변형 방법은 상당히 다양할 수 있으며 예를 들면 Vif에서 Ser114-Leu150 등이 변형될 수 있고(Fields Virology Third edition, p1901, Lippincott-Raven Co., 1996), Nef는 Arg137 및 Arg138과 함께 Gly2(미리스틸화 관여)가 변형될 수 있다. 그리고 Nef 69-80 사이의 Pro-Xa-Xa-Pro 모티프가 변형될 수 있다(Fields Virology Third edition, p1904-1908, Lippincott-Raven Co., (1996)).
다른 바람직한 양태로서, HIV-1 유래의 유전자 tat는 전체 서열이 사용될 수 있으나, 이 유전자의 면역교란 작용 때문에 변형된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 유전자 tat의 변형 가능한 범위는 엑손 1 이외의 모든 부위가 포함된다. 엑손 1도 tat 효소 효능(면역교란)이 있다. 그러나, 엑손 1+엑손 2 보다는 떨어지고 엑손 2에 있는 면역 에피토프는 사용할 수 없다는 단점이 있다. 따라서, 가장 바람직하게는 유전자 tat는 엑손 1 부위만을 사용하는 것이다. 상기한 바와 같은 유전자 nef 및 tat는 각각 독립적으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 유전자 nef는 변형되지 않고 유전자 tat만 변형되거나, 유전자 tat는 변형되지 않고 유전자 nef만 변형되거나, 유전자 nef와 tat 모두가 변형될 수 있다.
바이러스 HIV-1 유래의 보조 유전자 vif 및 tat의 각 3' 말단에는 분비형 단백질의 시그날 서열이 각각 융합된다. 이러한 융합은 CMV 프로모터의 직접 전사 조절을 받게 함으로써 단백질 Vif와 Nef의 발현 강도를 증가시킨다. 바람직하게는 분비형 단백질의 시그날 서열로서 당단백질의 시그날 서열이 사용된다. 당단백질의 예로는 헤르페스심플렉스 바이러스 유래의 당단백질 gD, VZV(varicella zoster virus) gB, HCMV(human cytomegalovirus) gH, gL, gO, VSV(vesicular stomatitis virus) G 단백질, 로타바이러스 외막 캡시드 당단백질, VP7 등을 들 수 있다. 보조 유전자 vif와 tat의 3' 말단에 융합되는 시그날 서열은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 HIV-1의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 변형된 유전자 nef(Arg137 및 Arg138에 해당하는 코돈이 결실되어 변이)를 작동적으로 연결되도록 도입한 제3 HIV 면역원성 플라스미드에 HIV-1의 유전자 tat의 엑손 1 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 작동적으로 연결되도록 도입한 7.5kb의 다른 신규한 면역원성 플라스미드를 작제한다. 이렇게 작제된 플라스미드는 AIDS 사람 환자에 대한 본 발명의 DNA 백신에서 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드와 함께 사용되는 제3의 HIV 면역원성 플라스미드에 해당한다. 이의 상세한 작제 과정은 실시예 12 및 도 15에 기술되어 있으며 pGX10-HIV/VNTV로 명명되었다.
다른 양태로서, 본 발명에 따른 벡터 pGX10의 MCS에 HIV-1의 유전자 tat의 엑손 1 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 유전자 vpu를 작동적으로 연결되도록 도입한 제4 HIV 면역원성 플라스미드에 HIV-1의 유전자 vif 및 이의 3' 및 5' 말단에 각각 융합된 HSV의 gD의 시그날 서열과 HIV-1 유래의 변형된 유전자 nef를 작동적으로 연결되도록 도입한 7.5kb의 다른 신규한 면역원성 플라스미드를 작제한다. 이렇게 작제된 플라스미드는 AIDS 사람 환자에 대한 본 발명의 DNA 백신에서 제1 및 제2 HIV 면역원성 플라스미드와 함께 사용되는 제3의 HIV 면역원성 플라스미드에 해당한다. 이의 상세한 작제 과정은 실시예 13 및 도 16에 기술되어 있으며 pGX10-HIV/TVVN으로 명명되었다.
한편, 상기 이외의 돌연변이 방법, 프로모터의 종류, 당단백질 신호서열의 종류 및 길이 등은 상기한 바와 같이 본 발명의 실시 목적에 따라 다양하게 변형될 수 있으며 이러한 변형은 당업자에게 자명할 것이다.
DNA 백신
본 발명의 시험예들에 의하면, 본 발명자의 이전 발명의 면역원성 플라스미드인 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol을 DNA 백신으로 이용하여 레수스 원숭이에 투여하는 경우 보다 조절 유전자를 포함할 뿐 아니라 발현강도가 우수한 벡터 pGX10을 사용한 pGX10-SIV/GE와 pGX10-SIV/dpol을 병용 투여하거나 pGX10-SIV/GE, pGX10-SIV/dpol, pGX10-SIV/VN 및 pGX10-SIV/TV을 병용 투여했을 때 레수스 원숭이에서 SIVmac239의 증식억제뿐만 아니라 SIVmac239의 감염에 의한 AIDS 진행의 전형적인 증상인 CD4+ 세포수 감소 현상의 억제효능이 우수한 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명의 면역원성 플라스미드를 함유한 조성물은 AIDS의 예방용 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.
면역치료법(immunotherapy)이란 바이러스 증식에 필요한 효소들(예, 역전사효소 및 프로테아제)의 억제효과가 있는 화학물질을 처리하는 것이 아니라, 바이러스에 대한 면역반응을 증가시킴으로써 바이러스 증식을 억제하는 방법이다. DNA 면역화 방법도 HIV 감염된 침팬지 (Boyer JD, et al., AIDS 14:1515-22, (2000) ; Boyer JD, et al.,J. Infect. Dis. 176:1501-9, (1997))나 HIV 감염된 사람(MacGregor RR J. Infect. Dis. 178:92-100, 1998)을 대상으로 치료용 면역화가 시도되고 있다. 치료용 백신의 효능은 바이러스의 증식을 억제할 수 있는 면역반응을 유도할 수 있는 능력과 상관관계가 있으므로 따라서 예방용으로 우수한 효능을 보이는 백신을 치료용으로 이용 할 수 있음은 당업계에 일반적으로 받아들여지고 있다. 따라서 본 발명의 면역원성 플라스미드를 함유한 조성물은 AIDS의 치료용 백신으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 AIDS 예방용 DNA 백신의 투여 방법 및 제형은 일반적인 백신, 특히 DNA 백신의 투여 방법 및 제형을 따른다. 치료용 백신의 경우에도 그 목적은 바이러스에 대한 면역반응을 증가시키기 위한 것이므로 예방용의 경우와 투여 방법 및 제형은 같다.
본 발명의 DNA 백신은 바람직하게는 직접적인(생체 내) 유전자의 전달에 의 해 투여된다. 네이키드(naked) DNA가 근육 내, 피내, 피아, 정맥 내, 동맥 내 또는 협측 주사에 의해 투여될 수 있다. 플라스미드 DNA는 금 입자상에 피복하고 유전자-총을 사용하여 피부의 상피 또는 구강 또는 질 점막내로 주입할 수 있다(Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478, (1993); Tang et al., Nature 356:152, (1992); Fuller, et al., J. Med. Primatol. 25:236, (1996); and Keller et al., Cancer Gene Ther., 3:186, (1996)). DNA 백신 벡터는 또한 여러 전달 시스템에 접합시켜 사용할 수 있다. 근육 내 주사에 의해 DNA 백신을 전달하거나 (Gregoriadis et al., FEBS Lett.402:107, 1997) 비 내 흡입과 같은 비-침입성 수단에 의해 DNA 백신을 호흡계로 전달하는데(Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478, 1993) 리포좀이 사용될 수 있다. 다른 가능한 전달 시스템으로 마이크로캡슐(Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11478, 1993) 또는 보조킬레이트(cochleates)(Mannino et al., 1995, Lipid matrix-based vaccines for mucosal and systemic immunization. Vaccine Designs: The Subunit and Adjuvant Approach, M. F. Powell and M. J. Newman, eds., Pleum Press, New York, 363-387)이 포함되며 이들은 비경구, 비내(예, 비강 스프레이) 또는 경구(예, 액체, 젤라틴 캡슐, 식품중 고체) 전달을 위해 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA 백신은 림프 조직내로 직접 주사할 수 있다. 또한, 면역원성 및 보조 플라스미드는 항원-제공 세포(APC)와 같은 특정 세포 유형을 표적으로 전달할 수 있도록 제형할 수 있다. APC(예, 가지 세포)로의 표적화는 만노스 잔기의 결합을 통해(가지 세포는 고밀도의 만노스 수용체를 갖고 있다) 또는 APC상에 우점적으로 존 재하는 다른 수용체중 하나에 대한 리간드를 통해서 가능할 수 있다. 형질감염된 세포가 항원을 발현하여 면역 반응을 유도하는 한 DNA 백신의 전달 경로나 제형 방식에 제한은 없다.
본 발명의 DNA 백신은 점막에 투여하는 경우 약제학적으로 허용되는 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로 설정할 수 있다. 적합한 매질로는 염수 및 리포좀 제제가 포함된다. 보다 특정적으로, 본 발명의 DNA 백신에 사용되는 바람직한 약제학적으로 허용되는 담체로는 섭취, 흡입 또는 좌제에 의한 직장 또는 질로의 투여를 위해 적합한 멸균된 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 에멀젼이 포함될 수 있다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성유(예, 올리브유) 및 특정 유기 에스테르(예, 에틸 올레에이트)를 들 수 있다. 수성 담체로는 물, 알콜성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액(염수 및 완충된 매질을 포함)이 포함된다. 또한, 보존제 및 기타 첨가제, 예를 들면 항균제, 항산화제, 킬레이트화제 및 불활성 가스 등이 존재할 수 있다. 추가로, 본 발명의 DNA 백신은 본 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여 동결 건조시킨 후 흡입에 의해 에어로졸로 투여할 수 있거나 이후에 재구성하여 주사할 수 있다.
본 발명의 DNA 백신에 함유되는 발현 플라스미드의 최대 흡수를 위해 바람직한 매질은 등장성 완충액이다. 또한, DNA 백신이 유입점을 점막 유도체 부위에 인접해 있거나 그러한 부위를 함유한 조직과 접촉하도록 DNA 백신의 전달을 강화하기 위해 흡수 촉진제, 세정제 및 순한 화학 자극제를 사용하는 것이 바람직하다. 유기 및 펩타이드-기재 약물의 점막 전달을 위해 성공적으로 사용되어 온 촉진제 및 세정제에 관한 일반적인 원리는 문헌[Chien, Novel Drug Delivery Systems, Ch. 4 (Marcel Dekker, 1992)]에 기술되어 있다. 비내 약물 전달의 수단 및 원리에 관한 특정 내용은 또한 상기 Chien의 문헌에서 찾아 볼 수 있다. 적합한 비내 흡수 촉진제의 예는 상기 Chien의 문헌 Ch. 4, 표 2 및 3에 기술되어 있으며, 바람직한 것은 보다 순한 물질이다. 피부를 통한 약물의 흡수를 증강시키는 것으로 알려진 적합한 물질은 문헌[Sloan, Use of Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe Partitioning-Driven Processes, Ch. 5, "Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery" (Marcel Dekker, 1992)]에 기술되어 있다. 상기 사용된 용어 "세정제/흡수 촉진제"는 특정 소 분자뿐만 아니라 펩타이드의 흡수 및 형질감염을 촉진하는 것으로 본 분야에 알려진 화학 물질을 가리킨다. 용어 "점막"은 신체에 존재하는 모든 점막 조직을 가리키며, 예를 들면 호흡기(기관지기도, 폐상피 및 비내 상피를 포함), 생식기(질, 음경 및 항문 점막을 포함), 비뇨기(예, 요도 및 방광), 구강, 안구 및 성대가 포함된다. 용어 "유입점"은 근접한 조직을 포함하여 숙주내로 폴리뉴클레오타이드가 유입되는 부위를 가리킨다. 용어 "점막 유도체 부위"는 DNA 백신이 점막으로 흡수되는 부위로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 왈데어환, 페이어판, 장-연관된 림프 조직, 기관지-연관된 림프 조직, 비-연관된 림프 조직, 생식기-연관된 림프 조직 및 편도선이 포함된다.
본 발명에 따른 DNA 백신의 투여량은 투여 방법, 백신이 투여되는 조직(예, 골격근, 피부), 목적하는 항체 역가, 면역화 대상자의 특정한 치료 요건 등에 의해 다양할 수 있다. 본 발명의 DNA 백신에 포함되는 각 플라스미드의 유효용량은 0.01 내지 0.2 mg/체중 kg이고, 바람직하게는 0.02 내지 0.1 mg/체중 kg이다. 피복된 미세발사체를 사용하는 경우 보다 적은 양의 백신을 투입할 수 있다.
DNA 백신의 동결건조
본 발명의 DNA 백신 조성물은 실온에서의 안정성을 증가시키고, 값비싼 저온 저장의 필요성을 줄이며, 저장 수명(shelf-life)을 연장하기 위해 동결 건조시킬 수 있다. 동결건조 공정은 동결, 일차 건조 및 이차 건조의 연속 단계로 이루어질 수 있다. 조성물을 동결시킨 후의 일차 건조 공정은 압력을 강하하고 수증기의 승화를 위해 가열하는 것이다. 이차 건조 단계는 건조물로부터 흡수된 잔여 수분을 증발시키는 것이다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 DNA 백신의 동결건조 방법은 다음의 순서와 같다: (1) 동결건조 현미경 분석법을 사용하여 제제의 붕괴 온도(collapse temperature)를 결정한다(Pikal, M. J., et al., Int. J. Pharm. 62, 165-186, 1990); (2) 바이알을 실온하의 동결-건조기 선반에 놓고 이후에 -1℃에서 약 30분 동안 평형시킨다. (3) 선반을 -55℃로 냉각시키고 이 온도를 2시간동안 유지한다. (4) 약 -32℃의 생성물 온도 또는 붕괴 온도보다 5℃ 낮은 온도에서 이차 건조를 실시한다. (5) 35℃에서 이차 건조를 실시한다. 챔버 압력을 55 내지 120 ㎛mHg로 조절한 후 건조를 완성한다. (6) 동결-건조기의 진공 하에서 바이알을 마개로 막고 동결 건조된 바이알을 크림프-밀봉하여 2 내지 8℃에 저장한다.
동결 건조된 DNA 백신 제제를 위해 부형제(excipients) 및 동결 건조보호제(lyoprotectant)가 사용된다. 부형제로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 0.9% NaCl과 10 mM 인산나트륨(pH 7.0) 또는 10 mM 나트륨 시트레이트(pH 7.0)의 완충액이 포함된다. 동결 건조 보호제는 동결 및 건조 공정동안에 생물학적 분자를 보호하고 최종 산물에 기계성(mechanical support)을 부여하는 역할을 하며 이들의 예로는 PBS(pH 7.0), PBS/4%, 12% 또는 15% 트레할로즈, PBS/12% 또는20% 만니톨, PBS/15% 또는 20% 락토즈, PBS/4% 수크로즈, PBS/2% 솔비톨, PBS/2% PEG(폴리에틸렌 글리콜), PBS/4% 트레할로즈/1% PEG/1% PVP(폴리비닐 피롤리돈), PBS/4% 만니톨/1% PEG/1% PVP, PBS/4% 락토즈/2% PEG 및 PBS/12% 락토즈/0.9% 벤조일 알코올을 들 수 있다.
보조제 (adjuvant)
본 발명의 DNA 백신은 사이토킨 단백질과 같은 면역조절 분자를 발현하는 보조 플라스미드 (adjuvant plasmids)를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 보조제 플라스미드로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, IFN-감마 및 GM-CSF를 발현하는 플라스미드를 들 수 있다. IL-4 발현 플라스미드의 예로는 플라스미드 pCAGGSIL-4(도 21)를 들 수 있다. IL-12 발현 플라스미드의 예로는 플라스미드 pCAGGSIL-12(도 22) 및 플라스미드 pGX10-hIL-12m(도 17)을 들 수 있다.
본 발명의 DNA 백신에 특히 바람직하게 사용되는 보조제 플라스미드는 본 발명자들에 의해 개발된 플라스미드 pGX10-hIL-12m이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 좀더 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
실시예
제한효소의 처리 : 하기 실시예에서 모든 제한효소의 처리는 다음과 같이 수행하였다. 플라스미드 DNA 또는 정제된 PCR 산물 2ug (1ug/ul)을 제한효소(모든 제한효소는 Takara Shuzo Co.,Ltd 및 New England Biolab, Inc의 제품을 사용함) 20 unit (2ul)으로 처리하였으며 상기 제한효소 제조회사가 공급한 완충용액 (10배 농축액)을 함께 첨가한 후 최종 부피가 50ul 되도록 증류수를 넣어 37℃ 항온기에서 2시간 동안 반응시켰다.
DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질전환 : 제한효소로 처리한 DNA 용액을 0.8% 아가로즈 겔 (GIBCO-BRL)에서 전기영동하였으며 목적하는 크기의 DNA 절편을 포함하는 아가로즈 조각을 잘라 QIAEN사의 겔 추출 키트(Gel Extraction Kit)를 사용하여 순수 분리하였다. DNA 절편들을 T4 DNA 리가제 (Takara)와 제조사가 제공한 완충용액을 넣고 16℃ 항온기에서 10시간 접합시켰다. 접합시킨 DNA는 Sambrook 등의 Molecular Cloning(2판)에 소개된 방법(1.74)으로 대장균에 형질전환하였다.
형질전환된 대장균에서 접합된 플라스미드를 가진 DNA의 확인 : 형질전환한 대장균에서 Sambrook 등의 Molecular Cloning(2판)에 소개된 방법(1.25)으로 DNA를 소량 정제한 후 목적한 플라스미드가 접합된 것인지를 목적한 DNA의 제한효소지도를 바탕으로 제한효소로 잘라서 그 크기를 확인하는 방법을 사용하였다.
플라스미드 DNA의 순수 정제 : Sambrook 등의 Molecular Cloning(2판)에 소개된 방법 (1.3-1.4)으로 순수한 DNA를 대량으로 얻었다.
PCR 증폭 : 모든 PCR 증폭은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 두 가지 올리고뉴클레오타이드 (프라이머)를 각 200 pmol, 주형 DNA 20 ng, Takara exTaq (폴리머라제) 10 unit, Takara exTaq 10x 완충용액 5 ul, 2.5 mM dNTP 혼합물 5 ul 와 증류수를 넣고 최종 부피가 50 ul가 되도록 하였다. PCR 방법은 모든 PCR에서 예비변성(predenaturation) 94℃ 4분, 변성 94℃ 1분, 어닐링(annealing) 52℃ 1분, 중합(polymerization) 72℃에서 목적 증폭산물 크기 kb당 1분 (0.5kb 증폭시 0.5분, 3kb 증폭시 3분), 변성에서부터 중합까지 30회(cycle), 그리고 최종 연장(extension)을 72℃에서 5분간 수행하였다. PCR 기계는 Perkin Elmer 사의 GeneAmp PCR system 2400 기종을 사용하였다. 얻어진 PCR 산물은 아가로즈 전기영동 후 QIAGEN 사의 겔 추출 키트를 사용하여 제품에서 제공하는 방법으로 정제하였 다. 이후 생성물을 상기 제한효소 처리과정에서와 같이 제한효소로 잘라 다른 절편 DNA나 또 다른 PCR 생성물과 접합하는 클로닝 작업에 사용하였다.
기타, 유전자 재조합에 관한 실험들로서 하기에 특별히 명시되지 않은 것들은 Sambrook 등의 Molecular Cloning(2판)에 소개된 방법들에 최소한의 변형을 가하여 실시하였다.
실시예 1
DNA 백신 벡터 pGX10(서열번호 60)의 제조 (도 1)
A. 벡터 pTV-3의 작제 (도 1a)
벡터 pMT-3(Sambrook, et al., Molecular cloning 2nd Ed., 3권 16.20; Kaufman RJ, et al., Mol. Cell Biol. 9,946-958, (1989)) 2 ug을 HpaI (20 unit) 및 NheI (20 unit)으로 위의 제한 효소처리 법으로 잘라내고 클레노우(Klenow) 단편 (New England Biolabs)(5 unit)과 최종 100 μM이 되도록 dNTP (Takara)를 넣은 후 25℃에서 30분 처리하여 평활말단(blunt end)을 만들었다. 아가로즈 겔 전기영동 한 후 0.7kb 단편(VAI 전체와 SV40 polyA 일부를 포함)을 벡터 pTV-2(Lee, et al., J. Virol., 72,8430-36, (1998))의 SV40 polyA 부분의 독특한 Hpa I 부위에 삽입 접합하여 5.3kb의 벡터 pTV-3을 제조하였다.
B. 벡터 pGX-1의 작제 (도 1a)
상기 작제된 벡터 pTV-3을 주형으로 하여 하기 프라이머로 중합효소 연쇄반응(PCR)하고 PCR 산물 (2.0kb)을 NruI으로 앞서 기재한 제한효소의 처리 방법에 따라 절단하였다:
CMV5 (TCG CGA CCC GGG CGA CGG CCA GTG AAT TGT ACC G): 서열번호 1 (센스)
VA3 (TCG CGA GGC GCG CCA CGA GCC GCC GCG CCT GGA AGG): 서열번호 2 (안티센스)
또한, 벡터 pZero-2 (Invtrogen)을 주형으로 하여 하기 프라이머로 앞에 기재된 PCR 증폭방법으로 PCR하고 그 증폭된 산물을 SspI으로 분해시킨 다음 DNA 단편 (1.8kb)을 위의 단편 (2.0kb)과 연결하여 3.8kb의 벡터 pGX-1을 제조하였다:
Zero5 (AAT ATT GTC GAC TTC AGA AGA ACT CGT CAA GAA G): 서열번호 3 (센스)
Zero3 (AAT ATT GGG CCC GAA CAT GTG AGC AAA AGG CCA G: 서열번호 4 (안티센스)
C. 벡터 pGX10의 작제 (도 1b)
벡터 pGX-1을 제한효소 XbaI 및 SalI으로 자른 후 두 개의 절편 중 큰 크기(3.1kb)의 DNA를 상기 DNA 절편의 접합 및 대장균의 형질전환 방법에서와 같이 분리하였다. 벡터 pGL3-Enhancer(Promega)를 제한효소 XbaI 및 SalI으로 잘라서 생성되는 두 개의 절편 중 작은 절편 (0.5kb)을 위와 같은 방법으로 분리하였 다. 두 분리된 절편을 결합하여 벡터 pGX10을 얻었다.
도 2 및 도 3은 각각 상기와 같이 작제된 본 발명의 벡터 pGX10(3.5kb)의 유전자 지도와 전체 3641개의 뉴클레오타이드 서열 위치를 보여준다.
실시예 2
SIV의 면역원으로 사용되는 플라스미드 pGX10-SIV/GE의 제조 (도 5)
A. 벡터 pTV-SIV/GE의 작제 (도 5)
(a) 각각 KpnI과 XbaI의 서열을 가진 다음의 올리고뉴클레오타이드 1193Kpn과 3464Xba를 합성하였다:
1193Kpn (cgggtcggtaccagacggcg): 서열번호 5 (센스)
3464Xba (atctagaggtatggagaaatat): 서열번호 6 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 PCR 프라이머로 사용하고 SIVmac239 DNA클론 (GeneBank Accession No. M33262; Regier, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 6,1221-1231, (1990))을 주형으로 하여 앞에서 기재한 PCR 증폭 방법으로 증폭한 후 그 증폭한 산물을 Kpn과 XbaI으로 절단하였다. 이중 SIVmac239 DNA의 뉴클레오타이드 1193 내지 3464(프라이머 끝의 제한효소로 잘려진 자리부터 Gene Bank의 지정번호를 기초로 하여 나타낸 것임)의 서열을, pBluescript SK+(Stratagene)을 SalI 및 XbaI으로 자르고 실시예 1의 A항에서와 같은 방법으로 클로노우 단편를 처리하여 평활 말단을 만든 부위에 삽입하여 벡터 pSK-SIVgag(5.3kb)를 제조하였다.
(b) 각각 XbaI 및 NotI 서열을 가진 다음의 올리고뉴클레오타이드 6695Xba 및 9641NotI을 합성하였다:
6695Xba (gccctctaga agcatgctat): 서열번호 7 (센스)
9641NotI (ggaagcggcc gcctcactga tacccctacc aa): 서열번호 8 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 PCR 프라이머로 사용하고 SIVmac239 DNA 클론 (GeneBank Accession: M33262)을 주형으로 하여 증폭한 산물을 제한효소 NotI 및 XbaI으로 잘랐다. 벡터 pSK-SIVgag을 제한효소 NotI 및 XbaI으로 부분 절단하고 그 부위에 상기 증폭하고 절단한 서열을 삽입하여 벡터 pSK-SIV/ge-1 (8.2kb)을 제조하였다.
(c) 아래의 올리고뉴클레오타이드 8328Cla 및 9535Xho를 합성하였다:
8328Cla (actgtatcgattggaattgg): 서열번호 9 (센스)
9535Xho (ctccctcgagtattcatatactgtccctga): 서열번호 10 (안티센스)
SIVmac239 클론 DNA (GeneBank Accession: M33262)을 주형으로 하고 상기 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하여 PCR 방법으로 증폭한 다음, 그 산물을 pBluescript SK+(Stratagene)의 SmaI 위치에 삽입하여 벡터 pSK-SIVenv3(4.2kb)를 만들었다.
(d) 벡터 pSK-SIV/ge-1을 제한효소 ClaI 및 NotI으로 잘라 벡터를 포함한 부분(6.7kb)을, pSK-SIVenv3을 제한효소 ClaI 및 NotI으로 자른 벡터를 포함하지 않은 부분(1.2kb)과 결합시켜 벡터 pSK-SIV/ge (7.9kb)를 제조하였다. 제조된 pSK-SIV/ge DNA의 KpnI과 NotI을 잘라 벡터 pTV2(Lee SW 등, J. Virol., 72:8430-36, 1998)의 KpnI/NotI 자리에 삽입하여 플라스미드 pTV-SIV/GE(10.0kb)를 제조하였다.
제조된 플라스미드 pTV-SIV/GE로 형질전환된 대장균 DH5＠는 특허의 목적상 부다페스트 협약 하에 1999년 11월 27일에 국제기탁기관 KCTC에 수탁번호 제 0702BP호로 기탁되었다.
B. 플라스미드 pGX10-SIV/GE의 작제 (도 5)
플라스미드 pTV-SIV/GE를 제한효소 MluI과 XhoI으로 잘라 CMV 프로모터, TLP 서열, SIV 유전자가 포함된 부분 (6.1kb)을 얻은 다음, pGX10 벡터를 제한효소 MluI과 XhoI으로 자른 후 CMV 프로모터, TLP 서열을 갖지 않은 DNA 단편 (2.6kb)과 결합시켜 플라스미드 pGX10-SIV/GE (8.7kb)를 제조하였다.
실시예 3
SIV의 면역원으로 사용되는 플라스미드 pGX10-SIV/pol의 제조 (도 6)
A. 벡터 pTV-SIV/dpol의 작제 (도 6)
(a) BamHI과 XhoI 부위를 가진 아래 합성 올리고뉴클레오타이드를 제조하였다:
BamHI (aatggatcca tagctaaagt agag): 서열번호 11 (센스)
XhoI (atttctcgag gctatgccac ctctc): 서열번호 12 (안티센스)
이들 합성 올리 고뉴클레오타이드를 PCR 프라이머로 사용하여 SIVmac239 DNA 클론 (GeneBank Accession: M33262)의 뉴클레오타이드 3105 내지 5668의 서열을 증폭한 후 제한효소 BamHI과 XhoI로 자른 다음, 제한효소 BglI과 XhoI로 E2를 제거한 pSK-gDs/E2t(Lee, et al., J. Virol., 72,8430-6, (1998))에 상기 PCR 증폭된 BamHI/XhoI 단편(2.6kb)을 삽입하여 플라스미드 pSK-gDsSIV/pol(5.7kb)을 제조하였다.
(b) 플라스미드 pSK-gDsSIV/pol의 인테그라제 부위중 뉴클레오타이드 5130-5132의 서열을 제거하고 뉴클레오타이드 5133-5135의 서열은 Asn117대신 Ser117이 발현되도록 돌연변이화 시켜 pSK-gDsSIV/polm(5.7kb)을 제조하였다. pol 유전자의 돌연변이화를 위하여 pSK-gDsSIV/pol을 주형으로 하고 아래 두 가지 합성 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다:
(agtggtgcta actttgcttc gcaa): 서열번호 13 (센스)
(tgtgtgtaga tgtgtaatag gcc): 서열번호 14 (안티센스)
증폭 산물을 최종 100 uM이 되도록 ATP와 10 unit의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(New England BioLabs)를 37℃에서 1시간 처리하여 자체 결합시켜(self-ligation) 상기 DNA 절편을 접합 한 후 대장균의 형질전환 방법으로 정제하고 벡터 pSK-gDsSIV/polm(5.7kb)을 제조하였다.
(c) 벡터 pSK-gDsSIV/polm를 제한효소 NotI과 XhoI로 잘라 pTV2(Lee 등, J. Virol., 72:8430, 1998)의 같은 제한효소 부위에 삽입시켜 플라스미드 pTV-SIV/dpol(7.6kb)을 제조하였다.
제조된 플라스미드 pTV-SIV/dpol로 형질 전환된 대장균 DH5＠는 특허의 목적상 부다페스트 협약 하에 1999년 11월 27일에 국제기탁기관 KCTC에 수탁번호 제 0703BP호로 기탁되었다.
B. 플라스미드 pGX10-SIV/dpol의 작제 (도 6)
플라스미드 pTV-SIV/dpol을 제한효소 NotI과 XhoI으로 잘라 SIV 유전자를 포 함하고 있는 단편(2.7kb)을 같은 제한효소로 자른 벡터 pGX10(3.6kb)에 삽입시켜 플라스미드 pGX10-SIV/dpol (6.3kb)을 제조하였다.
실시예 4
SIV의 면역원으로 사용되는 플라스미드 pGX10-SIV/VN의 제조 (도 7)
A. pGX10-gDs의 작제 (도 7a)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
PstIgDs (CAA CTGCAG ATG GGG GGG GCT GCC G): 서열번호 15 (센스)
gDsAscINotI (ATT GCG GCC GCA GGC GCG CCG ATC TGA GAG AGG CAT CC): 서열번호 16 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 상기 작제된 벡터 pGX10-SIV/pol을 주형으로 하여 PCR한 후 그 생성물(0.1kb)을 제한효소 PstI과 NotI으로 자른 벡터 pBluescriptSK (Stratagene)(3.0kb)에 삽입하여 플라스미드 pSK-gDs(3.1kb)를 제조하였다.
B. pSK-gDs/Vif의 작제 (도 7b)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
AscI5'vif (T ATG GCG CGC CTG GAG GAG GAA AAG AGG): 서열번호 17 (센스)
vif3'XbaINotI (AAAGCGG CCGC AAT CT AGA TCATGCCAG TATTCCCAAG): 서열번호 18 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 SIVmac239 클론(GenBank Accession No. M33262)을 주형으로 하여 PCR한 후 그 산물 을 제한효소 AscI과 NotI으로 자르고 생성된 절편(0.6kb)을 같은 제한효소로 자른 pSK-gDs(3.1kb)에 삽입하여 플라스미드 pSK-gDs/Vif(3.7kb)를 제조하였다.
C. pSK-5nef의 작제 (도 7b)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
BH5'nef (TAC GGA TCC ATG GGT GGA GCT ATTT T): 서열번호 19 (센스)
5'SpeI (TCT ACT AGT ACT GTA ATA AAT CCC TTC): 서열번호 20 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 SIVmac239 클론(GenBank Accession No. M33262)을 주형으로 하여 PCR한 다음 그 산물을 pBluscriptSK+ (Stratagen)의 BamHI, SpeI 위치에 삽입하여 플라스미드 pSK-5nef(3.0kb)를 만들었다.
D. pSK-nefM의 작제 (도 7b)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
Spe5'nef (AGA ACT AGT AGA ATC TTA GAC ATA TA): 서열번호 21 (센스)
3'nefNotI (AAA GCGGCCGC TGT TTC AGC GAG TTT): 서열번호 22 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 SIVmac239 클론(GenBank Accession No. M33262)을 주형으로 하여 PCR한 다음 그 생성물을 제한효소 SpeI과 NotI으로 자르고 얻은 절편(0.4kb)을 제한효소 SpeI과 NotI으로 자른 pSK-5nef(3.4kb)에 삽입하여 플라스미드 pSK-nefM (3.8kb)을 만들었다.
E. pSK-SIV/VN의 작제 (도 7b)
벡터 pSK-nefM을 주형으로 하여 아래의 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 PCR한 후 제한효소 NotI과 XbaI으로 절단한 산물(0.8kb)을 제한효소 NotI과 XbaI으로 절단한 pSK-gDs/Vif(3.7kb)에 삽입하여 플라스미드 pSK-SIV-VN(또는 pSK-VN)(4.5kb)을 제조하였다:
Xba5'nef (ACC TCT AGA ATG GGT GGA GCT ATT T): 서열번호 23 (센스)
3'nefNotI (AAA GCGGCCGC TGT TTC AGC GAG TTT): 서열번호 22 (안티센스)
F. pGX10-SIV/VN의 작제 (도 7c)
벡터 pSK-VN을 제한효소 AscI과 NotI으로 절단한 후 작은 크기의 DNA 절편(1.4kb)을 pGX10-SIV/TV(이것은 중간산물인 pSK-gDs/Vif와 pGX10을 이용하여 먼저 만들 수 있음)을 제한효소 AscI과 Not I로 자른 후 생성되는 DNA 절편(3.7kb)와 결합하여 플라스미드 pGX10-SIV/VN (5.1kb)을 제조하였다.
실시예 5
SIV의 면역원으로 사용되는 플라스미드 pGX10-SIV/TV의 제조 (도 8)
A. pSK-gDs/tat의 작제 (도 8a)
SIVmac239 클론(GenBank Accession No. M33262)을 주형으로 하여 아래 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 PCR한 후 그 산물을 제한효소 AscI과 NotI으로 처리하여 얻은 유전자 tat의 엑손 1 (0.3kb)을 같은 제한효소로 자른 pSK-gDs/Vif(3.1kb)에 삽입하여 플라스미드 pSK-gDs/tat(3.4kb)을 제조하였다:
AscI5'tat (TAT GGCG CGCC TGG AGA CAC CCT TGA GG): 서열번호 24 (센스)
tat3'NheNotI (AAA GCGG CCG CAA TCT AGA GTT TGA TGC AGA AGA TGT A): 서열번호 25 (안티센스)
B. pSK-SIV/TV의 작제 (도 8a)
SIVmac239 클론(GenBank Accession No. M33262)을 주형으로 하여 아래 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 PCR한 후 생성물을 제한효소 NotI과 XbaI으로 절단한 DNA(0.3kb)를 제한효소 NotI과 NheI으로 절단한 pSK-gDs/tat에 삽입하여 pSK-SIV/TV(3.7kb)을 만들었다.
Xba5'vpx (aaa TCTAGA atg tca gat ccc agg gag): 서열번호 26 (센스)
3'vpxNoI (aaaa gcgg ccgc tta tgc tag tcc tgg agg): 서열번호 27 (안티센스)
C. 플라스미드 pGX10-SIV/TV의 제조 (도 8b)
플라스미드 pSK-SIV/TV을 제한효소 PstI과 NotI으로 절단한 후 작은 크기의 DNA 절편 (0.7kb)을 pGX10을 동일한 제한효소 PstI과 NotI으로 자른 부위에 삽입하여 플라스미드 pGX10-SIV/TV(4.3kb)을 제조하였다.
실시예 6
pGX10-SIV/VNTV의 작제 (도 9)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
Sal5CMV (CCCG GTCGAC GGCCAG TGA ATT G): 서열번호 28 (센스)
Sal3enh (CTT CTG AA GTCGAC GGA TCC GC): 서열번호 29 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 플라스미드 pGX10-SIV/TV를 주형으로 하여 PCR한 후 제한효소 SalI으로 절단한 산물(2.4kb)을 같은 제한효소 SalI으로 절단한 pGX10-SIV/VN에 삽입하여 플라스미드 pGX10-SIV/VNTV를 제조하였다.
실시예 7
pGX10-SIV/TVVN의 작제 (도 10)
플라스미드 pGX10-SIV/VN를 주형으로 하여 실시예 6에서 사용한 것과 동일한 합성 올리고뉴클레오타이드 Sal5CMV(센스)와 Sal3enh(안티센스)를 프라이머로 PCR한 후 제한효소 SalI 으로 절단한 산물(3.2 kb)을 동일한 제한효소 SalI으로 절단한 pGX10-SIV/TV에 삽입하여 플라스미드 pGX10-SIV/TVVN를 제조하였다.
다음의 실시예는 SIVmac239 유전자를 상응하는 HIV-1 유전자로 치환하여 수득한 HIV 백신용 면역원성 플라스미드의 예시이다. HIV-1 유전자로 HXB2 및 JRCSF를 사용하였지만 다른 종의 HIV을 이용하여 같거나 유사한(사용하는 제한효소 자리가 HIV 유전자에 있을 경우 다른 제한 효소를 사용하는) 방법으로 제조하였다.
실시예 8
pGX10-HIV/GE의 제조(도 11)
플라스미드 pTX(Lee A H 등, Vaccine 17:473-9, 1999)은 HIV 유전자로 HXB2(Gene Bank Accession No. K03455)의 유전자 gag, env 및 rev를 가지고 있으며 유전자 vpr과 tat는 발현되지 않는다. 플라스미드 pTX를 제한효소 HpaI과 MluI으로 잘라 7.5kb의 DNA 단편(CMV 프로모터, TPL 서열, HIV 유전자, SV40 polyA의 일부를 포함)을 pGX10을 같은 제한효소로 처리하고 분리한 2.2kb의 DNA 단편(복제원 및 카나마이신 내성 유전자를 포함)과 결합시켜 플라스미드 pGX10-HIV/GE (9.7kb)를 제조하였다.
실시예 9
pGX10-HIV/dpol의 제조 (도 12)
A. pSK-polMjr의 제조 (도 12a)
(a) 다음의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
BH5pol(AAT GGA TCC ATT AGT CCT ATT GA): 서열번호 30 (센스)
PstIN (GCC CTG CAG TGT ATG TAT TGT TGT TA): 서열번호 31 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 HIV-1 JR-CSF(Gene Bank Accession No. M38429)의 프로바이러스(proviral) 유전자(pYK-JRCSF, NIH, AIDS 리써치 앤드 레퍼런스 리젠트 프로그램)를 PCR 주형으로 하여 PCR 증폭하였다. 이로부터 얻은 산물을 제한효소 BamHI과 PstI으로 절단하여 얻은 2.0 Kb의 DNA 절편을 pBluescriptSK+ (Stratagen)을 동일한 제한효소 BamHI과 PstI으로 절단한 부위에 삽입하여 플라스미드 pSK-5pol(5.0kb)을 만들었다.
(b) 다음의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
Pst3pol (ACA CTG CAG GGC AGC AAT TTC ACC): 서열번호 32 (센스)
polClaI (CTT ATC GAT GTT CTA ATC CTC ATC): 서열번호 33 (안티센스)
이들 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 HIV-1 JR-CSF 클론을 주형으로 하여 PCR 증폭하여 얻어지는 산물을 제한효소 PstI과 ClaI으로 절단하여 플라스미드 pSK-5pol을 동일한 제한효소 PstI과 ClaI으로 절단한 부위에 삽입하여 pSK-polMjr(5.5bk)을 얻었다.
(c) pSK-polMjr을 제한효소 BamHI과 NaeI으로 잘라 HIV-1 pol 유전자가 포함된 DNA 단편 (2.8kb)과, pSK-gDs/E2t(Lee 등, J. Virol., 72:8430, 1998)를 같은 제한효소 BamHI과 NaeI으로 자른 DNA(2.8kb)를 연결하여 플라스미드 pSK-gDs/polMjr(5.6kb)을 수득하였다.
B. pGX10-HIV/dpol의 제조 (도 12b)
pSK-gDs/polMjr을 제한효소 NotI과 XhoI으로 잘라 2.6kb의 DNA 조각을 벡터 pGX10의 NotI과 XhoI 부위에 삽입하여 pGX10-HIV/dpol(6.2kb)을 제조하였다.
실시예 10
pGX10-HIV/VN의 제조 (도 13)
A. pSK-gDs/Vifjr의 작제 (도 13a)
하기 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
AscIvif (ATC GGCGCGC CTG GAA AAC AGA TGG CAG GT): 서열번호 34 (센스)
VifXbaI (CAT TCT AGA GTG TCC ATT CAT TGT ATG GC): 서열번호 35 (안티센스)
상기 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 HIV-1 JR-CSF 클론(Gene Bank Accession No. M38429)을 주형으로 하여 PCR 증폭하여 얻은 산물을 제한효소 AscI과 XbaI으로 자르고 pSK-gDs/Vif (도 6a)를 역시 같은 제한효소 AscI과 XbaI으로 잘라 SIV의 vif 유전자를 제거한 자리에 삽입하여 pSK-gDs/Vifjr(3.7kb)을 제조하였다.
B. pSK-nefMjr의 작제 (도 13b)
(a) 아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
BH5'nef-HIV (TAC GGA TCC ATG GGT GGC AAG TGG TCA): 서열번호 25 (센스)
5'SpeI (ATC ACT AGT TGA GTA AAT TAG CCC TTC): 서열번호 36 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 HIV-1 JR-CSF 클론(GenBank Accession No. M38429)을 주형으로 하여 PCR한 다음, 산물을 제한효소 BamHI과 SpeI로 처리하여 얻은 DNA 단편(0.3kb)을 pBluscriptSK+ (Stratagen)의 제한효소 BamHI과 SpeI 위치에 삽입하여 벡터 pSK-5nefjr(3.3kb)를 제조하였다.
(b) 아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
Spe5'nef-HIV (TCA ACT AGT GAT ATC CTT GAT CTG TGG): 서열번호 37 (센스)
3'nefNotI-HIV (GAT GCGGCCGC TCA GCA GTC CTT GTA GTA): 서열번호 38 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 HIV-1 JR-CSF 클론(GenBank Accession No. M38429)을 주형으로 하여 PCR한 다음 그 생성물을 제한효소 SpeI과 NotI으로 자르고 얻은 절편(0.3kb), 동일한 제한효소 SpeI과 NotI으로 자른 pSK-5nefjr에 삽입하여 플라스미드 pSK-nefMjr(3.6kb)을 제조하였다.
C. pSK-VNjr의 작제 (도 13b)
하기 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 pSK-nefM을 주형으로 하여 PCR한 후 제한효소 NotI과 XbaI으로 절단한 산물(0.6kb)을 제한효소 XbaI과 NotI으로 절단한 pSK-gDs/vifjr에 삽입하여 pSK-VNjr(4.3kb)을 제조하였다:
Xba5'nef (CAC TCT AGA ATG GGT GGC AAG TGG TCA): 서열번호 39 (센스)
3'nefNotI-HIV (GAT GCGGCCGC TCA GCA GTC CTT GTA GTA): 서열번호 38 (안티센스)
D. pGX10-HIV/VN의 작제 (도 13c)
벡터 pSK-VNjr을 제한효소 AscI과 NotI으로 절단한 후 작은 크기의 DNA 절편(1.2kb)을 플라스미드 pGX10-HIV/TV을 제한효소 PstI과 NotI으로 자른 DNA 절편(3.7kb)와 결합시켜 플라스미드 pGX10-HIV/VN(4.9kb)을 제조하였다.
실시예 11
pGX10-HIV/TV의 제조 (도 14)
A. pSK-gDs/tatjr의 작제 (도 14a)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
AscI5'tat-HIV (ATC GGCG CGCC TGG AGC CAG TAG ATC CT): 서열번호 40 (센스)
tat3'XbaI-HIV (CCC TCT AGA CTT TGG TAG AGA AAC TTG): 서열번호 41 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 HIV-1 JR-CSF 클론(GenBank Accession No. M38429)을 주형으로 하여 PCR한 후 그 산물을 제한효소 AscI과 NotI으로 자른 DNA(유전자 tat의 exon 1, 0.2kb)를, pSK-gDs/Vif를 같은 제한효소로 자르고 생성된 DNA (3.1kb)와 결합시켜 플라스미드 pSK-gDs/tatjr(3.3kb)를 제조하였다.
B. pSK-TVjr의 작제 (도 14a)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
Xba5'vpu (CCC TCT AGA ATG CAA CCT TTA CAA AT): 서열번호 42 (센스)
3'vpuNotI (CGA GCGGCCGC CTA CAG ATC ATT AAT GTC): 서열번호 43 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 HIV-1 JR-CSF 클론(GenBank Accession No. M38429)을 주형으로 하여 PCR한 후 제한효소 NotI과 XbaI으로 절단한 DNA (0.2kb)를 동일한 제한효소 NotI과 XbaI으로 절단한 pSK-gDs/tatjr에 삽입하여 플라스미드 pSK-TVjr (3.5kb)을 제조하였다.
C. 플라스미드 pGX10-HIV/TV의 제조 (도 14b)
플라스미드 pSK-TVjr을 제한효소 AscI과 NotI으로 절단한 후 작은 크기의 DNA 절편 (0.5kb)을 pGX10-HIV/TV을 동일한 제한효소 AscI과 NotI으로 자른 후 생성되는 DNA 절편 (3.7kb)과 결합시켜 pGX10-HIV/TV (4.2kb)를 제조하였다.
실시예 12
pGX10-HIV/VNTV의 제조 (도 15)
아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
Sal5CMV (CCCG GTCGAC GGCCAG TGA ATT G): 서열번호 28 (센스)
Sal3enh (CTT CTG AA GTCGAC GGA TCC GC): 서열번호 29 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 플라스미드 pGX10-HIV/TV를 주형으로 하여 PCR한 후 제한효소 SalI으로 절단한 산물(2.3kb)을 동일한 제한효소 SalI으로 절단한 플라스미드 pGX10-HIV/VN에 삽입하여 플라스미드 pGX10-HIV/VNTV를 제조하였다.
실시예 13
pGX10-HIV/TVVN의 작제 (도 16)
아래의 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 플라스미드 pGX10-HIV/VN를 주형으로 하여 PCR한 후 제한효소 SalI으로 절단한 산물(3.0kb)을 동일한 제한효소 SalI으로 절단한 플라스미드 pGX10-HIV/TV에 삽입하여 플라스미드 pGX10-HIV/TVVN를 제조하였다:
Sal5CMV (CCCG GTCGAC GGCCAG TGA ATT G): 서열번호 28 (센스)
Sal3enh (CTT CTG AA GTCGAC GGA TCC GC): 서열번호 29 (안티센스)
실시예 14
pGX10-hIL-12m(pGX10-hp35/IRES/hp40)의 제조 (도 17)
A. pSK-hp35와 pSK-hp40을 제조 (도 17a)
PMA(phorbol myrystic acetate)에 의해 활성화된 사람 B 세포인 NC37 세포로부터 상보적 프라이머를 이용한 RT-PCR(역전사효소-중합효소 연쇄 반응)(PCR System 2400, Perkin Elmer사) 방법을 이용하여 820 bp인 사람 p35 소단위체와 1050 bp인 p40 소단위체의 cDNA를 클로닝하고 PCR로 증폭하였다. 사람 p35 소단위체 증폭을 위해 사용된 상보적 프라이머는 다음과 같다:
hp35 (5'-CCCGGGAAAGTCCTGCCGCGCCTCG-3'): 서열번호44 (센스)
hp35 (5'-ACAACGGTTTGGAGGGA-3'): 서열번호 45 (안티센스)
사람 p40 소단위체 증폭을 위해 사용된 상보적 프라이머는 다음과 같다:
hp40 5'-AGAGCACCATGGGTCACCAGCAGTTGG-3': 서열번호 46 (센스)
hp40 5'-CGATGCGGCCGCACCTAACTGCAGGG-3': 서열번호 47 (안티센스)
증폭된 cDNA를 각각 출발벡터인 pBluescriptSK+ (Stratagene)에 삽입(subcloning)하고, p35 및 p40 소단위체 유전자 모두 벡터 pBluescriptSK+ (Stratagene)의 SmaI 부분에 각각 삽입함으로써 pSK-hp35(3.8kb)와 pSK-hp40(4.0kb)을 제조하였다.
B. pSK-IRES의 제조 (도 17a)
p35와 p40 소단위체를 코딩하는 유전자를 함께 발현하는 벡터(bicistronic vector)를 제작하기 위하여, 먼저 EMCV의 IRES 유전자를 RT-PCR을 통해 얻고 이를 EcoRV로 절단한 후 벡터 pBluescriptSK+ (Stratagene)의 EcoRV 제한효소 부위에 삽입하여 벡터 pSK-IRES(3.5kb)를 제조하였다. 이때 사용된 상보적 프라이머는 다음과 같다:
IRES 5'-AAGATATCGAATTCCCCCTC-3': (서열번호 48;센스)
IRES 5'-TTGCCATGGCCATATTTATCA-3': (서열번호 49;안티센스)
C. pSK-hp35/IRES/hp40 (도 17a)
벡터 pSK-IRES를 제한효소 EcoRV로 절단하고 얻은 DNA 절편(3.5kb)에 pSK-hp35를 제한효소 SmaI과 NotI으로 절단한 후 T4 DNA 중합효소로 채워 얻어진 hp35 단편(0.8kb)을 삽입함으로써 pSK-hp35/IRES(4.3kb)를 제조하였다. pSK-hp40을 NcoI과 NotI으로 절단하여 얻어진 hp40 단편(1.0kb)은 pSK-hp35/IRES를 동일한 제한효소로 절단한 부위에 삽입함으로써 p35와 p40 소단위체를 코딩하는 유전자를 함께 발현하는 벡터를 제조하였다. 이 벡터를 제한효소 SmaI과 ClaI을 처리한 후 리가제를 이용하여 재봉합시킴으로써 hp35 앞쪽 제한효소 부위를 일부 제거하였고 이렇게 제조된 벡터를 pSK-hp35/IRES/hp40라 명명하였다.
D. pSK-hp40-N222L (도 17b)
hp40의 222번째 아미노산인 아스파라긴산을 루신으로 치환하기 위하여 pSK-hp40을 주형으로 하고 T7 프라이머와 hp40-N222L 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. 이와 유사하게, T3 프라이머와 hp40-N222L 센스 프라이머를 사용하여 이차 PCR을 수행하였다. 이로부터 돌연변이 지점(mutational point)을 포함하는 공통 부위(common site)를 공유하는 두 개의 PCR 단편들이 형성되었다. 이차 PCR은 상기 단편들의 혼합물을 주형으로 하고 플랭킹 프라이머 (flanking primer)들을 사용하여 수행하였으며, 그 결과로 이들의 융합 단편(fusion product)이 형성되었고 상기 단편을 제한효소 NcoI과 NotI으로 절단한 후 제한효소 SmaI으 로 절단한 벡터 pBluescriptSK+ (Stratagene)(3.0kb)에 삽입함으로써 플라스미드 pSK-hp40-N222L(4.0kb)을 제조하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:
T7 (5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3'): 서열번호 50 (센스)
hp40-N222L (5'-TAT GAGCTC TACACCAGCAGC-3'): 서열번호 51 (안티센스)
T3 (5'-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3'): 서열번호 52 (안티센스)
hp40-N222L (5'-GGTGTA GAGCTC ATACTTGAG-3'): 서열번호 53 (센스)
볼드체로 표시된 부분은 야생형 hp40과 바뀌어진 염기서열이며 밑줄친 부분은 돌연변이화에 의해서 생성된 SacI 제한효소 부위를 나타낸다.
E. pSK-hp35/IRES/hp40-N222L의 제조 (도 17b)
제한효소 NcoI과 NotI를 이용하여 플라스미드 pSK-hp40-N222L의 hp40-N222L 단편을 플라스미드 pSK-hp35/IRES/hp40의 hp40 단편과 치환시켜 플라스미드 pSK-hp35/IRES/hp40-N222L (5.3kb)을 제조하였다.
F. pGX10-hp35/IRES/hp40-N222L의 제조 (도 17c)
포유동물 세포에서 발현 가능한 벡터로 hp35/IRES/hp40-N222L 단편을 옮기기 위해 아래의 올리고뉴클레오타이드를 합성하였다:
hIL-12 (5'-AACTCGAGGTCGACGGTATC-3'): 서열번호 54 (센스)
hIL-12 (5'-TTCTCGAGCGGCCGCACCT-3'): 서열번호 55 (안티센스)
이들 합성 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 사용하고 벡터 pSK-hp35/IRES/hp40-N222L을 주형으로 하여 증폭시켜 hp35/IRES/hp40-N222L 단편을 얻었다. 얻어진 단편에 제한효소 XhoI를 처리한 후 벡터 pGX10을 제한효소 XhoI으로 절단한 부위에 삽입하여 플라스미드 pGX10-hp35/IRES/hp40-N222L(또는 pGX10-hp35/IRES/hp40)(5.9kb)를 제조하였다.
실험실시예 1
벡터 pGX10의 발현
아래 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 pGX-10 벡터의 멀티 클로닝 부위(multi-cloning site)에 사람 성장 호르몬(hGH) 유전자를 삽입하여 hGH 발현수준을 대조 벡터와 비교하여 확인하였다. 이의 실험 결과는 도 18에 그래프로 도시되어 있다.
A. hGH를 발현하는 플라스미드의 제작
pTV2/hGH의 작제 (도 19): 사람 성장 호르몬의 유전자를 가진 DNA(GeneBank Accession No. K02382; Ikehara M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 81,5956-60, (1984))를 주형으로 하고 하기된 hGHF(AAGAA TTC GAT ATG TTCCCAA CTAT TC : 서열번호 56 센스)와 hGHR(TTT TCT AGA ATTA GAAgCC ACAC GACC : 서열번호 57 안티센스)을 프라이머로 사용해서 PCR을 증폭하고 그 산물을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 잘라 pTV2를 EcoRI과 XbaI으로 자른 부위에 삽입하여 제조하였다.
pGX1/hGH의 작제 (도 20): pTV2/hGH를 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 잘라 0.6kb 크기의 DNA 단편을 벡터 pGX1을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 자른 부위에 삽입하여 제조하였다.
pGX10/hGH의 작제 (도 24): pTV2/hGH를 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 잘라 0.6kb 크기의 DNA 단편을 벡터 pGX10을 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 자른 부위에 삽입하여 제조하였다.
pGX0/hGH의 작제 (도 23): pZero-2(Invitrogen)을 주형으로 하여 KanXmF(TTG GAA AAC GTT CTT CGG GCG GCC TAT TGG TTA AAA AAT GAG C : 서열번호 58 센스)와 KanXmR(CTT GAA CGT TTT CCT TTT CAC GTA GAA AGC : 서열번호 59 안티센스)를 프라이머로 하여 PCR 증폭한 후 산물을 제한효소 XmnI으로 잘라 벡터 pTV2를 제한효소 XmnI으로 자른 부위에 삽입하여 벡터 pGX0을 제조하였다. pGX0/hGH는 pTV2/hGH를 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 잘라 0.6kb 크기의 DNA 단편을 벡터 pGX0을 동일한 제한효소 EcoRI과 XbaI으로 자른 부위에 삽입하여 제조하였다.
B. HeLa 세포에 형질감염
(a) 각 2.0x105 세포를 6-웰 평판의 각 웰에 깔고 DMEM(10% FCS) 배지 2ml을 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 18시간동안 배양했다. (b) 8ug의 hGH를 발현하는 플라스미드 DNA를 0.2M CaCl2 용액 100ul와 혼합하여 잘 섞어 주었다. (c) (b)의 용액을 100ul 2X HBS 용액에 한 방울씩 떨어뜨리고 15분간 상온에서 방치했다. (d) (c)의 용액을 피펫으로 가볍게 섞어주어 (a)에서 배양했던 세포에 뿌려주었다. (e) (a)의 조건과 같은 조건에서 12시간 배양 후, 배지를 갈아 주고 24시간 더 배양한 뒤 배지의 hGH를 정량했다.
C. hGH 정량법
형질감염한 세포를 배양한 배지를 이용했다. 로슈(Roche) 사의 hGH ELISA 키트(제품번호 1585878)를 이용하여 첨부된 샘플 완충액으로 배지를 200배 희석하여 사용했고 기타 방법은 첨부된 매뉴얼에 따랐다.
도 18에 나타낸 값들은 pTV2/hGH의 hGH 발현정도를 100 이라고 정의하였을 때 각 벡터의 상대적인 발현정도(배양액의 hGH 농도)를 표시한다. 즉 값이 클수록 벡터 DNA의 세포감염 후 배양액 속의 hGH 발현 정도가 높음을 의미한다. 따라서, 도 18로부터 본 발명의 벡터 pGX10은 대조군 벡터 pTV2와 비교하여 3배 이상 높은 hGH 발현 강도를 보이고 있음을 알 수 있다.
실험실시예 2
벡터 pGX10의 면역유도성
실험실시예 1에서 작제되고 정제된 hGH 발현 플라스미드 DNA(pTV-2/hGH, pGX-0/hGH 및 pGX-10/hGH)를 1ug/ul 되도록 생리식염수에 녹인 용액을 8주령된 암컷 BALB/c 마우스 한 마리에 100ul 씩 다리근육(전경골근, Tibialis Anterior Muscle)에 주사하여 면역반응을 관찰했다. 주사 3주 후 마우스의 안하정맥에서 혈액을 채취하여 항체 ELISA를 수행했다. 항체 ELISA는 문헌[Song et al., J. Virol, 74, 2920,(2000)]에 기술된 방법에 따라 실시하였다. 9주째 100ug의 DNA를 다시 같은 방법으로 주사하여 11주째에 전과 동일한 방법으로 마우스의 혈액을 채취하여 상대적인 IgG 양을 450 nm에서 흡광도를 측정하여 알아보았다. 이의 결과는 도 25에 나타나 있다.
도면 25에서 각 플라스미드의 값들 중 가장 왼쪽의 값들은 면역화 하기전의 hGH 항체량을 O.D(흡광도) 값으로 표시한 것이고, 중앙의 값들은 면역화한 지 3주 시점에서 채혈한 혈청에서 항 hGH의 O.D 값을 나타낸 것이고, 오른쪽의 값은 면역화한 지 9주 시점에서 채혈한 혈청에서 항 hGH의 O.D 값을 나타낸 것이다. O.D 값이 높을수록 강한 hGH 항체 반응이 유도됨을 의미한다. 따라서 도 25로부터 본 발명에 따른 pGX10-hGH의 면역화가 대조군 pTV-hGH의 면역화의 경우와 비교하여 3주 시점 및 9주 시점에서 모두 높은 항체반응을 유도하였음 알 수 있다.
지시유전자로 hGH를 사용하여 시험관내 발현 정도와 면역화 후의 항체 생성 정도를 비교하여 본 실험실시예 1 및 2의 결과는 본 발명의 벡터 pGX10이 대조군 벡터 pTV 보다 우수하고 개량된 것임을 증명한다.

실험실시예 3
본 발명의 플라스미드의 면역 효능 평가 I
A. 면역원성 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
대조군으로 플라스미드 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol을 식염수(0.85% NaCl)에 1mg/ml의 농도로 녹인 다음 시험군 원숭이(rhesus macaque monkey) 한 마리 당 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol을 각각 400ug 씩 총 800ug을 원숭이 다리에 총 네 군데 근육주사 하였다(전체 3마리)(그룹 2 및 그룹 5).
시험군으로 본 발명의 플라스미드 pGX10-SIV/GE, pGX10-SIV/dpol, pGX10-SIV/VN과 pGX10-SIV/TV를 각각 400ug(2 mg/ml) 씩 총 1.6 mg을 원숭이(rhesus macaque monkey) 다리에 총 네 군데 근육주사 하였다(전체 3마리)(그룹 3).
B. 면역원성 및 보조 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
또 다른 시험군 원숭이(rhesus macaque monkey)(전체 3마리)에서는 pGX10-SIV/GE, pGX10-SIV/dpol, pGX10-SIV/VN과 pGX10-SIV/TV와 함께 본 발명의 또 다른 보조 플라스미드(adjuvant plasmid) pGX10-hIL-12m 역시 각각 400ug(2.5mg/ml) 씩 총 2mg의 DNA를 같은 방법으로 접종하였다 (그룹 4).
최초 면역화 후 8주, 17주, 25주, 44주째 되는 날에 각 군의 원숭이를 처음 면역화한 것과 같은 DNA를 사용하여 같은 방법으로 주사하였다.
C. 혈액에서 SIVmac239에 감염된 면역세포 수의 측정
각종 플라스미드 DNA에 의한 면역화가 원숭이에서 어느 정도로 바이러스 SIVmac239의 증식을 억제하는 면역반응을 유도하였는지를 알아보기 위해 혈액의 면역세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cells)의 SIVmac239 감염 정도를 조사하였다. 감염정도는 혈액의 면역세포 중에서 감염성이 있는 (infectious) 면역세포의 비율을 조사함으로써 측정하였다.
최종 면역화 후 2주 후(처음 면역화 한지 46주) 미리 정해진 MID50(monkey infectious dose)의 10배량의 SIVmac239(영장류센터, Deutsches Primatenzentrum, 독일; 투여량 1ml)를 정맥 주사하여 감염시켰다. SIVmac239의 감염 뒤 2주, 4주, 8주, 12주, 16주, 20주, 24주째 되는 시점에서 대조군 및 시험군 원숭이 혈액의 면역세포(PBMC)를 분리하여 100만개의 PBMC 중 SIV에 감염된 PBMC의 수를 절대희석배양(limitting-dilution cocultivation) 방법으로 측정하였다(Lu 등, J. Virol. 70:3978, 1996). 이 방법을 간단히 설명하면, 원숭이 혈액(구연산을 처리한 혈액) 6 ml을 Ficoll-hypaque(Pharmacia) 3 ml을 미리 담은 튜브(lympho-prep, Greiner사)에 넣고 20℃, 1200xg에서 20분간 원심 분리하여 적혈구와, PBMC 그리고 혈장을 분리하였다. 분리된 PBMC를 1 x106 세포수로부터 1/2 씩 줄이는 연속희석을 수행하고 여기에 105 수의 C8166을 적중세포로 넣고 함께 배양하였다(배양액 RPMI1640 + 10% fetal bovine serum). 3-4일이 지난 후 세포를 포함한 배양액의 절반을 줄이고 나머지를 새로운 배양액을 채우는 방법으로 2주간 배양하였다. 배양이 끝난 후(800 xg에서 10분간 원심분리 한 다음) 상층액을 취해 p27 항원 검출 ELISA를 Coulter사의 키트를 사용하여 제조사가 제공하는 방법으로 수행하여 양성반응을 보이는 최후의 PBMC 희석비율을 확인하여 일백만 PBMC 세포중에 감염성을 가진 세포의 비율을 측정하였다. 만약 2.5 X 105 PBMC에서 p27 양성반응을 보이고 다음 희석(1.25X105)에서는 p27 음성을 나타냈다면 이 PBMC의 감염성 세포의 수는 일백만(million) 세포수당 4가 된다.
이의 결과는 도 27에 나타나 있다. 감염성이 있는 면역세포의 비율이 감소했다는 것은 SIVmac239가 증식 가능한 세포의 비율이 낮아졌다는 뜻으로 원숭이의 체내에서 SIVmac239의 증식이 더 잘 억제됨을 의미한다.
도 27은 각 원숭이 그룹에서 SIVmac239의 혈액 감염 후 0, 2, 4, 8, 12, 16주가 지난 시점에서 1백만 PBMC 당 감염성의 세포수를 나타낸 것이다. 도 27에서 보듯 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol을 면역화한 원숭이(그룹 2+5)는 감염 후 8주 이후 감염면역세포수가 0.13% (128/1000000) 이하로 떨어지다가 이후 24 주에는 다섯 마 리 중 2마리는(백만개 면역 세포 중) 1 미만(감염 세포 수)의 값을, 한 마리는 16의 값을 보여 이 시점에서 벡터로 면역한 원숭이(그룹1) 1024-2048 과 비교하여 약 100-1000 배 정도 바이러스 증식을 억제하는 것으로 확인되었다. 그러나 그룹 2+5의 5마리 중 나머지 2마리는 24주에 128-256의 값을 보여 그룹 1과 비교하여 8배 정도만 바이러스 증식이 억제된 것으로 나타났다. 본 발명에 따라 플라스미드 pGX10-SIV/GE와 pGX10-SIV/dpol과 함께 플라스미드 pGX10-SIV/VN과 pGX10-SIV/TV를 면역화한 원숭이 세 마리(그룹 3)는 감염 후 12주 이후 24주까지 1백만 PBMC 당 감염성의 세포 수는 16 개 이하의 낮은 값을 보였으며, 이것은 이 그룹에서 사용한 DNA 백신이 유도하는 바이러스의 증식에 방어하는 효능이 대조 플라스미드 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol의 면역화 보다 더 우수함을 의미한다.
본 발명에 따라 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE, pGX10-SIV/dpol, pGX10-SIV/VN과 pGX10-SIV/TV와 함께 보조 플라스미드(adjuvant plasmid) pGX10-hIL-12m을 면역화한 원숭이 (그룹 4)에서 1백만 PBMC 당 감염 세포수는 감염 후 2주시점에서 다른 그룹(그룹 1, 그룹 2+5, 그룹 3)과 비교하여 평균 10배 정도 낮은 값(4-512)을 보이는 것으로 보아 감염 초기 바이러스의 가장 왕성한 증식이 일어나는 2주 시점에서 증식 억제 효과가 탁월한 것으로 판단된다. 그러나 감염 후 12-24 주가 경과하면 세 마리 원숭이 중 한 마리의 감염세포수가 서서히 증가하는 것으로 관찰된다. 이 원숭이는 감염 후 2주 시점에서의 감염 세포 수가 매우 낮았기 때문에 바이러스 역가의 최고점(감염 후 2주)에서 차차 감소되는 정도(viral loads decline)가 낮았기 때문에 20주 이후 감염세포수가 차차 증가하는 것으로 나타났 다. 이것은 바이러스 역가의 감소 속도가 바이러스 역가의 안정화 시기(set-point) 역가를 결정하는데 중요하다는 기존의 보고(Staprans SI J. Virol 73,4829)와 일치하였다. 그러나 이 그룹의 나머지 두 마리는 24주에서도 1백만 PBMC 당 8개 이하의 낮은 감염세포만 나타내는 것으로 보아 그룹 2+5 보다 우수한 방어 효능을 나타내는 것으로 판단 할 수 있다. 그룹 3 및 4의 결과와 그룹 2+5의 결과를 비교하여 볼 때 보조 플라스미드를 함께 면역화한 백신은 혈액 내의 SIVmac239 감염성 세포수를 명백히 줄여주는 것으로 보아서 본 발명에 따른 보조 플라스미드를 가진 DNA 백신의 면역화가 AIDS 바이러스 감염 후 바이러스 증식억제에 탁월한 효능을 보임을 암시한다.
실험실시예 4
본 발명의 플라스미드의 면역 효능 평가 Ⅱ
A. 면역원성 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
실험 실시예 3의 A와 동일한 방법으로 면역원성 플라스미드를 사용하여 원숭이를 면역화하였다.
B. 면역원성 플라스미드과 보조 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
실험실시예 3의 B와 동일한 방법으로 면역원성 플라스미드를 사용하여 원숭이를 면역화하였다.
C. 혈장에서 SIVmac239 RNA 카피의 측정
혈장에서 RNA 카피수의 측정은 네덜란드의 Biomedical Primate Research Centre (BPRC)에서 Quantitative Competitive RT-PCR (Reverse Transcription PCR) 방법으로 수행하였다. 이 방법의 원리는 이미 알고 있는 표준 SIVmac239 RNA와 함께 혈장에서 분리한 RNA를 섞어서 주형으로 하고 유전자 gag와 같이 보존되어 있는 서열을 가진 프라이머로 RT-PCR을 수행하는 것이다. 만약 혈장의 RNA의 카피수가 표준 RNA의 카피수와 비교하여 높은 경우 PCR 생성물은 혈장의 RNA가 증폭되어 나타나게 되며 반대의 경우는 표준 RNA가 증폭되어 생성물이 형성된다. 이를 아가로즈 겔 전기영동하여 크기를 확인한다. 표준 RNA는 같은 프라이머를 사용해도 PCR 생성물이 원래 SIVmac239 RNA 것보다 작거나 크도록 조작된 것을 사용하며, 따라서 생성물의 크기가 다르기 때문에 생기는 차이는 보정을 해주게 된다. 이 방법에 대한 자세한 설명은 Watson 등(J. Virol 71,284-290, (1997))의 논문에 설명되어 있다.
혈장에서 RNA 카피수의 측정은 바이러스의 감염정도를 측정하는 또 다른 지표이다. SIV가 왕성히 증식하게 되면 RNA를 혈장으로 분비하게 되고 만약 혈장의 RNA 카피수가 낮다면 바이러스의 숙주 (원숭이)가 RNA의 증식을 잘 억제하고 있음을 나타내었다. 이의 결과는 도 28에 나타나 있다.
도 28에서 보면 대조군으로서 그룹1의 감염된 원숭이(모든 원숭이)는 감염 후 4-24 주 시점에서 1ml의 혈장에서 오십만 카피 이상의 SIV RNA 역가를 보였다. 또한 본 발명에서 대조군으로 사용한 플라스미드 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol을 면역화한 원숭이(그룹 2+5) 5 마리 중 3마리는 감염 후 12주에서 십만 카피 미만으로 감소했다가, 이후(16주 및 24주)에도 좀 더 감소가 이루어진 것으로 관찰되었다. 그러나 나머지 두 마리는 12주에서는 감염된 원숭이들 (그룹1) 보다는 낮은 바이러스 카피를 보이지만 이후 16주에서는 10만 카피 이상의 높은 값으로 증가하여 감염된 원숭이 (그룹 1)와 큰 차이가 나지 않게 되는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 따라 보조 유전자(regulatory gene)를 함께 사용한 그룹 3에서는 세 마리 모두 12주와 16주에서 10,000 내지 100,000 사이의 역가를 보이는 것으로 확인되어 같은 시점에서 감염된 원숭이(그룹 1)와 비교하여 100배 이상 낮은 역가를 보임을 알 수 있었다.
결과적으로 혈장의 바이러스 역가를 살펴보면 감염세포수의 결과와 마찬가지로 면역원성 플라스미드 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol을 면역화한 경우 보다는 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE 및 pGX10-SIV/dpol과 함께 보조 유전자를 추가하여 면역화한 경우가 감염 후 바이러스 증식을 억제하는데 있어서 가장 우수한 효능을 보이는 것으로 판단할 수 있었다.
보조 유전자와 보조 플라스미드 pGX10-IL-12m DNA를 함께 면역화한 원숭이(그룹 4)에서는 감염 후 2주에서는 모든 그룹과 비교하여 가장 낮은 혈장내의 카피수를 보이며 이후 그룹 3의 원숭이들과 비슷한 값을 보였다. pGX10-hIL-12m을 함 께 투여한 그룹의 한 마리는 2주째 바이러스 역가가 매우 낮았고 16주에서 증가된 역가를 보였다.
실험실시예 5
본 발명의 플라스미드의 면역 효능 평가 Ⅲ
A. 면역원성 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
실험실시예 3의 A와 동일한 방법으로 면역원성 플라스미드를 사용하여 원숭이를 면역화하였다.
B. 면역원성 플라스미드과 보조 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
실험실시예 3의 B와 동일한 방법으로 면역원성 플라스미드를 사용하여 원숭이를 면역화하였다.
C. 혈액에서 절대 CD4+ 세포의 수 측정
원숭이 및 사람에게서 AIDS의 진행을 판단하기 위한 가장 일반적인 방법으로서, 단위 혈액 당 절대 CD4+ 세포의 수를 측정하였다. SIVmac239가 원숭이에 감염되면, 주 감염세포인 CD4+ 세포는 아폽토시스(apoptosis)를 일으켜 그 숫자가 점진 적으로 감소하게 된다. CD4+ 세포의 감소는 원숭이의 면역능력을 감소시키게 되고 이것 때문에 원숭이는 AIDS와 연관된 질병 (AIDS-associated disease)를 일으켜 사망하게 된다. 즉, 절대 CD4+ 세포수가 감소한다는 것은 숙주의 면역능력의 저하를 표시하는 것이며 SIVmac239의 감염에 대하여 잘 방어하지 못했음을 의미한다.
SIVmac239의 감염 뒤 1주, 2주, 4주, 6주, 8주, 12주, 16주, 20주, 24주, 28주째 되는 시점에서 원숭이 혈액의 말초혈 임파구(PBL, peripheral blood lymphocytes)중 CD4+ 세포의 수를 FACS(fluorescent automated cell sorter; Becton-Dickinson, FACScan)를 사용하여 측정하였다 (Bjorn, et al., J. Virol. 72,7846,(1998)). 이의 결과는 도 29에 나타나 있다.
도 29는 감염하기 전의 프리밸류(prevalue)를 100%로 하여 각 시점의 혈액 1ul 당 절대 CD4+ T 세포의 수를 백분율로 나타낸 것이다. 프리밸류 CD4+ T 세포수는 SIV를 감염하기 전 최소 두 시점에서 채혈하여 측정하였다. 도 29에서 그룹 1의 한 마리는 완만하게 감소하여 감염 후 28주에서는 프리밸류 값의 50% 미만을 보였다. 면역원성 플라스미드 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/dpol로 면역화한 원숭이는 다섯 마리중 한 마리가 이 시점(28주)에서 50% 미만의 절대 CD4+ T 세포 수를 보였다. 그러나 본 발명에 따라 보조 유전자를 사용한 그룹 3과 그룹 4는 모두 정상적인 CD4+ 세포 수를 보였다. 이것은 본 발명에 따라 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE 및 pGX10-SIV/dpol와 함께 보조 유전자를 면역화하여 주는 것이 SIVmac239 감염에 의한 CD4+ 세포 수의 감소를 가장 잘 예방 할 수 있음을 의미한다.
실험실시예 6
본 발명의 플라스미드의 면역 효능 평가 Ⅳ
A. 면역원성 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
실험실시예 3의 A와 동일한 방법으로 면역원성 플라스미드를 사용하여 원숭이를 면역화하였다.
B. 면역원성 플라스미드과 보조 플라스미드를 사용한 원숭이의 면역화 (참조: 도 26-실험 프로토콜)
실험실시예 3의 B와 동일한 방법으로 면역원성 플라스미드를 사용하여 원숭이를 면역화하였다.
C. SIVmac239 DNA 면역화가 유도하는 gag 특이 T 세포 반응의 측정
SIV DNA 백신이 유도하는 T 세포 면역반응을 측정하기 위해 PBMC를 gag 펩타이드 풀 (pool)로 자극시킨 후 INF-γ를 분비하는 PBMC 수를 측정하는 ELISPOT 검정 방법을 사용하였다.
96 웰 평판 (U-cytech 사의 제품)에 웰당 5ug (PBS중의 100 ul)의 항-IFN-γ mAb를 4에서 15시간 방치한 후 PBST(PBS + 0.05% Tween-20)로 6번 씻어주었다. 웰당 200ul의 2% BSA/PBS를 넣어주고 37℃에서 한 시간 동안 mAb가 결합하지 않은 곳을 차단(blocking) 한 다음, 여기에 2 x 105 PBMC(PBMC의 정제 방법은 실험실시예 3의 B에 기술되어 있음)가 포함된 ELISPOT 검정 매질(45% RPMI1640, 45% X-VIVO, 10% fetal bovin serum, 1% 항생물질)을 웰당 100ul씩 넣은 후, SIV gag p15와 p26 중첩(overlapping) 펩타이드(NIBSC, cat. number ARP714.1-22 와 EVA776.1-776.14,)를 각 펩타이드의 최종 농도가 1ug/ml이 되도록 10ul ELISPOT 검정 매질에 넣어 첨가하였다. 24시간 동안 평판을 CO2 배양기에서 방치한 후 배양액을 제거하고 평판 바닥에 붙은 세포를 200ul의 찬 증류수(ice-cold deionized water)를 넣어 용해(lysis)시켰다. 평판을 PBST로 10회 씻어준 후 각 웰당 1ug(PBS+1% BSA중의 100ul)의 토끼 폴리클로날 바이오티닐화 항-IFN-γ 검출 항체(rabbit polyclonal biotinylated anti-IFN-gamma detector Ab, U-cytech)을 넣고 37℃에서 한시간 방치한 후 PBST로 7회 씻어주었다. 평판에 웰당 50ul의 금-표지 항-바이오틴 IgG (gold-labeled anti-biotin IgG, U-cytech)을 넣고 37℃에서 한시간 방치 후 PBST로 10회 씻어주었다. 각 웰당 35ul의 활성화제(activator) 혼합물(U-cytech)을 넣고 30분간 방치하여 스팟(spot)을 생성시켰다. 물로 평판을 씻어준 후 48시간이내 스팟의 수를 측정하였다.
이의 결과는 도 30에 나타나 있다. 도 30은 1백만 PBMC 중에 gag 펩타이드의 자극에 의해 IFN-γ를 분비하는 T 세포수를 나타내었다. 이것은 SIVmac239 gag에 대하여 특이적인 T 세포수를 표시하는 것으로 값이 높을수록 강력한 gag 특이 T 세포면역반응이 유도되었음을 뜻한다.
도30에서 보듯, 대조군 면역원성 플라스미드 pTV-SIV/GE와 pTV-SIV/pol을 면역화한 그룹 (그룹 5)과 본 발명에 따른 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE, pGX10-SIV/pol, pGX10-SIV/VN와 pGX10-SIV/TV를 면역화한 그룹(그룹3)에서 gag 특이면역반응을 유도했으나 그 강도는 차이가 없었다. 그것은 pTV2와 pGX10 벡터는 원숭이에서 T 세포 면역반응을 유도하는데 있어 큰 차이를 보이지 않는다는 것을 의미하며, gag 특이 세포면역반응이 유사하므로 따라서 본 발명에 따라 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/GE, pGX10-SIV/dpol, pGX10-SIV/VN와 pGX10-SIV/TV로 면역화한 그룹에서 관찰된 우수한 바이러스증식 억제 효과는 벡터 pGX10의 차이라기 보다는 보조 유전자의 면역화를 함께 면역하였기 때문으로 예상된다.
또한 그룹 5와 3의 gag 특이 T 세포 반응의 차이가 발견되지 않으므로, 본 발명에서는 면역화한 DNA의 양(dose)의 차이에서 발생하는 CpG 모티프와 같은 면역활성 서열의 양적 차이가 면역반응을 증가시켜 방어 효율의 차이를 보였다는 가정(Cafaro A., et al., Vaccine 19,2867,(2001))을 배제 할 수 있다. 한편 보조 플라스미드 pGX10-hIL-12m DNA를 함께 면역화 했을 경우 이를 함께 투여하지 않은 그룹 (그룹 3) 보다 높은 gag 특이 세포면역반응을 보인다.
실험실시예 7
본 발명의 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/pol 및 pGX10-SIV/GE의 발현 확인 (도 31)
각 3.0x105 HeLa 세포를 60 mm 평판접시(Felcon) 깔고 DMEM(10% FCS) 배지 4.5ml을 넣고 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 12시간동안 배양했다. 10ug의 각 DNA (pGX10, pTV2, pGX10-SIV/GE, pGX10-SIV/pol, pTV2-SIV/GE)를 0.2M CaCl2 용액 250ul와 혼합하여 잘 섞어 주었다. 이 용액을 250ul 2X HBS 용액에 한 방울씩 떨어뜨리고 15분간 상온에서 방치한 후 피펫으로 가볍게 섞어주어 배양했던 HeLa 세포에 뿌려주었다. 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 60시간 더 배양한 뒤 배지를 버리고, PBS로 한번 세척한 후 세포(cell)를 긁어모아 SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophorsis)를 수행하였다. PAGE가 끝난 후 겔(gel)의 단백질(protein)을 니트로셀루로오스 막(nitrocellulose membrane)(Schleicher & Schuell)에 옮겼다(transfer)(옮기는 조건 및 완충용액(buffer) 조성은 molecular cloning,18.64-66 참조). 막(Membrane)을 블록킹 용액(blocking solution)(5% skim milk/TBS)으로 상온에서 2시간 블록킹(blocking) 해주고 세정 완충용액(washing buffer)(TBS + 0.05% tween-20)로 5분 간격으로 3회 세이커(shaker)에서 세정(washing)하였다. SIVmac 항-혈청(NIBSC APR416)을 1/3000 (v/v) 넣은 블록킹 완충 용액(blocking buffer)을 상온에서 3 시간 반응시키고, 다시 10분 간격으로 세정 완충 용액(washing buffer)으로 3회 세정(washing)하였다. HRP-결합된 항-사람 IgG(HRP-conjugated anti-human IgG)(Sigma)를 1/3000 (v/v) 넣은 블록킹 완충 용액(blocking buffer)을 상온에서 2 시간 반응시키고 다시 10분간 세정 완충 용액(washing buffer)으로 4회 세정(washing)하였다. 막(membrane)을 증류수로 5회 세척한 다음, 여기에 Luminol/Enhancer solution(Pierce)과 Stable Peroxide Solution(Pierce)을 1:1 로 섞은 용액을 10ml 부어 과산화 효소(peroxidase) 반응을 시키고 X-ray 필름(film)위에 10분간 노출시킨 다음 현상하여 발현 사진을 얻었다.
도 31에서 보듯, pGX10-SIV/GE는 SIV의 Env와 Gag 단백질을, pGX10-SIV/dpol은 RT-INT 폴리단백질(polyprotein)을 잘 발현하였다. 또한, 도 31 및 32에서 보듯, pTV2-SIV/GE 및 pTV2-SIV/dpol의 경우는 pGX10-SIV/GE 및 pGX10-SIV/dpol과 비교하여 Gag 및 Env 단백질 및 RT-INT 폴리단백질의 발현정도가 현저히 낮았다. 이 결과는 벡터 pGX10이 생체 외(in vitro)에서 pTV2 보다 발현 효율이 우수함을 의미한다.
실험실시예 8
본 발명의 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/VN 및 pGX10-SIV/VNTV의 발현 확인(도 33)
플라스미드pGX10, pGX10-SIV/VN, pGX10-SIV/VNTV를 HeLa 세포에 도입(tansfection)해 주었으며, Vif-Nef 단백질을 검출하기 위하여 SIV Nef 폴리클로날 Ab(NIBSC APR444)를 사용하였고, 이차 항체로 HRP-결합된 항-토끼 IgG를 사용하였다. 나머지 실험방법은 실험실시예 7과 같다.
도 33에서 보듯, pGX10-SIV/VN 과 pGX10-SIV/VNTV는 Vif-Nef 단백질을 HeLa 세포에서 잘 발현하였다.
실험실시예 9
본 발명의 면역원성 플라스미드 pGX10-SIV/TV의 발현 확인(도 34)
플라스미드 pGX10, pGX10-SIV/TV를 HeLa 세포에 도입(tansfection)해 주었으며 Tat-Vpx 단백질을 검출하기 위하여 SIV Tat 폴리클로날 Ab(NIBSC APR4006)를 사용하였고, 이차항체로 HRP-결합된 항-토끼 IgG를 사용하였다. 나머지 실험방법은 실험실시예 7과 같다.
도 34에서 보듯, pGX10-SIV/TV는 Tat-Vpx 단백질을 HeLa 세포에서 잘 발현하였다.
독성 실험 실시예 1
침팬지에서 HIV DNA 백신의 투여
HIV-1 (HIV IIIB)이 감염된 침팬지에 본 발명의 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/dpol, pGX10-HIV/GE와 pGX10-HIV/VNTV 및 보조 플라스미드 pGX10-hIL-12m를 함유한 본 발명의 HIV DNA 백신을 각 구성물 당 2 mg 씩 근육주사(대둔근(Gluteus maximus) 또는 삼각근(Deltoid muscle)) 방법으로 투여하였다. 한 마리의 침팬지에서는 한달 간격으로 4번, 다른 한 마리의 침팬지에는 한달 간격으로 4회 투여 후, 4개월의 간격을 둔 다음 다시 한달 간격으로 5회 투여를 실시하였다.
처음 면역화 후 일년간 질병 유무(clinical sign), 체중, 체온 등 외관(physical examination), 혈액세포의 이상(haematology), 배설물의 이상(urinalysis)을 관찰하였으나 모두 정상치의 값을 나타냈다.
독성 실험실시예 2
인간에서 HIV DNA 백신의 투여
HIV-1에 감염된 8명의 우크라이나인에게 본 발명의 면역원성 플라스미드 pGX10-HIV/dpol, pGX10-HIV/GE와 pGX10-HIV/VNTV 및 보조 플라스미드 pGX10-hIL-12m를 함유한 본 발명의 HIV DNA 백신을 각 구성물 당 1회에 1 mg 씩 투여하였다. 네명의 사람에게는 2개월 간격으로 6회, 두 사람에게는 2개월 간격으로 5회, 다른 두 사람에게는 2개월 간격으로 4회 근육주사 방법으로 투여하였다. 각 투여의 경로는 비경구 근육주사 방법을 채택하였으며 각 회차에 대둔근과 삼각근에 교차로 투여하였다.
면역화하는 기간 동안, 질병 유무 (clinical sign), 체중, 체온 등 외관 (physical examination), 혈액세포의 이상 (haematology), 배설물의 이상 (urinalysis)을 관찰하였으나 모두 정상치의 값을 나타냈다.
본 발명은 SIVmac239/레수스(rhesus) 원숭이 모델에서 발현 효율 및 면역효능이 우수한 면역원성 플라스미드에 관한 것으로 본 발명의 면역원성 플라스미드와 임의로 보조 (adjuvant) 플라스미드를 함유한 DNA 백신은 AIDS 예방 또는 치료에 매우 효과적이다.
<110> POSTECH FOUNDATION Genexine Inc. <120> DNA Vaccine <160> 60 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcgcgacccg ggcgacggcc agtgaattgt accg 34 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tcgcgaggcg cgccacgagc cgccgcgcct ggaagg 36 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aatattgtcg acttcagaag aactcgtcaa gaag 34 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aatattgggc ccgaacatgt gagcaaaagg ccag 34 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cgggtcggta ccagacggcg 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atctagaggt atggagaaat at 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gccctctaga agcatgctat 20 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggaagcggcc gcctcactga 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atgcgctgcg aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga 1800 ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta 1860 tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc 1920 cattttccac catgatattc ggcaagcagg catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc 1980 cgtcgggcat gctcgccttg agcctggcga acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct 2040 cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga 2100 tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc 2160 gcattgcatc agccatgatg gatactttct cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat 2220 cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga 2280 gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg ccagccacga tagccgcgct gcctcgtctt 2340 gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg 2400 ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc 2460 cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca 2520 tgcgaaacga tcctcatcct gtctcttgat cagatcttga tcccctgcgc catcagatcc 2580 ttggcggcga gaaagccatc cagtttactt tgcagggctt cccaacctta ccagagggcg 2640 ccccagctgg caattccggt tcgcttgctg tccataaaac cgcccagtct agctatcgcc 2700 atgtaagccc actgcaagct acctgctttc tctttgcgct tgcgttttcc cttgtccaga 2760 tagcccagta gctgacattc atccggggtc agcaccgttt ctgcggactg gctttctacg 2820 tgaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 2880 agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 2940 ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 3000 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 3060 cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 3120 ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 3180 gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 3240 ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 3300 aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 3360 cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 3420 ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 3480 gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 3540 ttttacggtt cctgggcttt tgctggcctt ttgctcacat actcgggccc aatcgacccg 3600 ggcgacggcc agtgaattgt accgatgtac gggccagata t 3641

Claims (86)

  1. 서열번호 60의 염기서열을 가지는 벡터 pGX10.
  2. 도5에 나타낸 플라스미드 pGX10-SIV/GE.
  3. 바이러스 SIVmac239 유래의 역전사효소와 인테그라제를 코딩하는 유전자 pol 및 이의 3' 말단에 연결된 분비형 단백질의 시그날 서열이 벡터 pGX10에 작동적으로 연결되어 구성된 플라스미드.
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  8. 제3항에 있어서, 도6에 나타낸 pGX10-SIV/dpol인 플라스미드.
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  58. 도17에 나타낸 플라스미드 pGX10-hIL-12m(pGX10-hp35/IRES/hp40).
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