KR100899847B1 - Cosmetic compositions for skin-whitening - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부미백효과를 갖는 양춘백설고를 함유하는 미백화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a whitening cosmetic composition containing Yangchun white snow has a skin lightening effect.
조성물, 미백화장료, 양춘백설고 Composition, whitening cosmetic, Yangchun white snow
Description
본 발명은 미백 효과를 지닌 추출물에 관한 것으로, 백봉령, 마, 연자, 검실 혼합추출물을 제형에 혼합하였을 때 우수한 미백효과를 나타내는 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to an extract having a whitening effect, and relates to a cosmetic composition exhibiting an excellent whitening effect when Baekbongyeong, hemp, softwood, and gumsil mixed extracts are mixed into a formulation.
사람의 피부색은 멜라닌, 카로틴 및 헤모글로빈의 양에 따라 결정되어 지는데 이중 멜라닌이 가장 결정적인 요소이다. 멜라닌은 피부(표피)내 기저층에 존재하는 색소세포인 멜라노사이트(melanocyte)에서 합성되며 주변 각질세포(Keratinocyte)로 전이되어 사람의 피부색을 나타낸다. 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증(Vitiligo)과 같은 피부 병변이 유발된다. 반대로 과잉 생산은 중년 여성들의 주요 고민중 하나인 기미, 주근깨를 형성하며 또한 피부암(Melanoma)과도 밀접한 관계가 있다. Human skin color is determined by the amount of melanin, carotene and hemoglobin, of which melanin is the most decisive factor. Melanin is synthesized in melanocytes (melanocytes), which are pigment cells in the basal layer of the skin (epidermis), and are transferred to peripheral keratinocytes (Keratinocytes) to represent human skin color. An abnormally low production of melanin causes skin lesions such as vitiligo. Overproduction, on the contrary, forms one of the main concerns among middle-aged women, blemishes and freckles, and is also closely related to skin cancer (Melanoma).
미백 작용을 더욱 자세히 설명하면 다음과 같다. 멜라닌은 피부 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트라는 세포에서 티로신(Tyrosine)이 효소 및 비효소적 산화반응을 거쳐 생성되며, 표피를 구성하고 있는 각질세포로 전이된다. 멜라닌의 생 합성에 관여하는 중요한 효소로는 티로시나제(Tyrosinase), 티로시나제 관련 프로테인 1(Tyrosinase-Related protein 1) 및 도파크롬 토토머라제(dopachrome tautomerase)이 있다. 티로시나제 외의 두 효소는 비교적 최근에 개발되어 최근에 주목을 끌고 있으나 멜라닌 합성에 결정적인 역할을 하는 효소는 티로시나제이다. 멜라닌의 생합성 첫단계는 티로시나제에 의하여 유발된다. 티로시나제에 의해 티로신이 도파(Dopa)로 되고, 이 도파(Dopa)를 도파퀴논(Dopa-quinone)으로 만든다. 이 두 반응의 다음단계 과정들은 비효소적인 반응에 의해서도 가능한 것으로 알려져 있으며 티로시나제 단독으로도 멜라닌 생성이 가능하다고 알려져 있다. The whitening action is described in more detail as follows. Melanin is produced by tyrosine (Tyrosine) through the enzyme and non-enzymatic oxidation reaction in the cell called melanocytes in the basal layer of the skin epidermis, and is transferred to the keratinocytes constituting the epidermis. Important enzymes involved in the biosynthesis of melanin include tyrosinase, tyrosinase-related protein 1 and dopachrome tautomerase. Two enzymes besides tyrosinase have been recently developed and recently attracted attention, but the enzyme that plays a decisive role in the synthesis of melanin is tyrosinase. The first stage of biosynthesis of melanin is caused by tyrosinase. Tyrosinase causes tyrosine to be dopa (Dopa), which makes it dopaquinone (Dopa-quinone). The next steps of these two reactions are known to be possible by non-enzymatic reactions, and tyrosinase alone is known to produce melanin.
최근에는 피부 세포내의 신호 전달물질의 발현에 따른 멜라닌 형성과정에 대한 새로운 이론이 제시되고 있다. 즉, 피부가 자외선에 노출되면 염증을 유발시키는 인터루킨-알파(Interlukin-)가 상피(Epidermis)내에 있는 케라티노사이트(Keratinocyte)로부터 발현되고, 이 인터루킨-알파가 케라티노사이트 엔도셀린(Endothelin)발현을 촉진시킨다. 이러한 일련의 과정이 멜라노사이트의 형성을 증가시키고 멜라노사이트를 활성화시킨다. 이렇게 형성된 멜라노사이트내 멜라노좀에서 티로신이 티로시나제에 의해 멜라닌이 형성된다. Recently, a new theory of melanin formation following the expression of signal transduction agents in skin cells has been proposed. That is, when the skin is exposed to ultraviolet light, interlukin-alpha, which causes inflammation, is expressed from keratinocytes in the epidermis, and the interleukin-alpha expresses keratinocyte endothelin. To promote. This series of processes increases the formation of melanocytes and activates melanocytes. In the melanoma in the melanocytes thus formed, melanin is formed by tyrosine tyrosine.
이미 아스코르빈산(특개평 4-9320), 하이드로퀴논(특개평 6-192062), 코직산(특개 56-7710), 알부틴(특개평 4-9315) 및 일부의 화합물들이 티로시나제 저해 활성을 가지고 있어 미백 화장료의 원료로 이용되고 있으나, 처방계 중에서의 안정성이 떨어져 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 그리고 티로시나제의 억제 효과는 입증되었으나, 실제 생체 레벨과 유사한 실험에서는 그 효과가 낮게 나타난다. 따라서 생체레벨과 유사한 멜라노마 세포 배양에 의한 저해 효과가 요구되고 있는 실정이다. 또한 하이드로퀴논은 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되고 있다. 코직산과 아스코르빈산은 매우 불안정한 물질이다. 소량 함유한 화장료를 실온에서 수주일동안 보관하면 갈변 현상이 발생한다. 식물성 천연물들은 안전성이 뛰어날 뿐만 아니라 여러 가지 유익한 성분들을 가지고 있어 미백 물질의 좋은 검색대상이 되고 있다. Ascorbic acid (JP-A 4-9320), hydroquinone (JP-A 6-192062), kojic acid (JP-A 56-7710), arbutin (JP-A 4-9315) and some compounds already have tyrosinase inhibitory activity and whitening. Although it is used as a raw material for cosmetics, its use is limited due to poor stability in the prescription system, discoloration, discoloration, off-flavor, efficacy at the biological level, unclear effect and safety issues. And the inhibitory effect of tyrosinase has been demonstrated, but the effect is low in experiments similar to the actual biologic level. Therefore, the inhibitory effect of the melanoma cell culture similar to the biological level is required. Hydroquinone is also regulated as a carcinogenic substance and is prohibited from use. Kojic acid and ascorbic acid are very unstable substances. Browning can occur when stored in small amounts for several weeks at room temperature. Plant natural products are not only safe but also have many beneficial ingredients, making them a good candidate for whitening.
오래전부터 멜라닌 생성을 억제하여 미백 효과 기능을 지닌 기존원료가 갖는 문제점을 해결하기 위해서 한방제로 사용되고 있는 생약, 야채, 과일, 꽃 등의 안전성이 뛰어난 식물추출물로부터 비정상적인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 여러 가지 효과를 가진 추출물을 찾고자 하는 노력이 있어 왔다. In order to solve the problems of existing raw materials with whitening effect by suppressing melanin production for a long time, various kinds of abnormal melanin production can be suppressed from high-efficiency plant extracts such as herbal medicines, vegetables, fruits, and flowers. Efforts have been made to find extracts that have an effect.
백봉령(Poria cocos.(Schw.) Wolf.)베어 낸 지 여러 해 지난 소나무뿌리에 기생하여 혹처럼 자라는 것으로 속이 흰 것은 백복령이라 하고 분홍빛인 것은 적복령이라고 한다. Poria cocos. (Schw.) Wolf.It grows like a hump from the roots of pine trees many years ago, and the white one is called Baekbok-ryeong, and the pink one is called Red Bok-Ryeong.
약효가 있는 약용작물로서 식품으로보다는 약재로의 쓰임새가 많았으나 동의보감에 의하면 곡식을 먹지 않아도 배가 고프지 않게 한다고 되어 있는 것을 보면 구황식품으로 이용하기도 하였을 것이다. 동의보감에 의하면 백복령의 맛은 달고 심심하며 성질이 평(平)하여 보(補)하는 작용이 있다고 한다. 그리하여 옛부터 강장제로 많이 사용되었으며 병 후 회복에도 이용하였다. 복령의 주성분은 β-Pachyman이 함유되어 있고, 건조 중량의 약 93%를 차지한다. Triterpenoid 화합물이Pachymic acid, Tumulosic acid, 3-β-Hydroxylanosta-7, 9(11), 24-trien-21-oic acid를 함유한다. 이외에도 Chitin, 단백질, 지방, Sterol, Lecithin, Glucose, Adenin, Histidine, Choline, β-Pachyman 분해효소, Lipase, Protease 등이 함유되어 있다. 암억제, 위장, 강장, 췌장, 신장에 탁월한 효능을 보이고 있다. As a medicinal crop with medicinal effects, it was used as a medicinal herb rather than as a food. According to Dongbogam, the taste of Baekbokyeong is sweet, boring, and flat. Thus, it has been used a lot as a tonic since ancient times and also used for recovery after illness. The main component of Bokryeong contains β-Pachyman and accounts for about 93% of the dry weight. Triterpenoid compounds contain Pachymic acid, Tumulosic acid, 3-β-Hydroxylanosta-7, 9 (11), and 24-trien-21-oic acid. In addition, it contains Chitin, Protein, Fat, Sterol, Lecithin, Glucose, Adenin, Histidine, Choline, β-Pachyman Degrading Enzyme, Lipase and Protease. It is excellent for cancer suppression, stomach, tonic, pancreas and kidney.
옛날부터 강장제로 사용되었다. 폐경(肺經)·비경(脾經)·심경(心經)·신경(腎經)·방광경(膀胱經)에 작용하여 비장을 보하고 가래를 삭이며 정신을 안정시킨다. 약리실험 결과에 의하면 이뇨작용과 혈당량을 낮추는 작용, 진정작용 등을 하는 것으로 밝혀졌으며 면역 부활작용을 하는 것으로도 알려져 있다It has been used as a tonic since ancient times. It works on menopause, parenteral, heart, nerve, and bladder to protect the spleen, sputum, and stabilize the mind. The results of pharmacological experiments have shown that diuretic, lowering blood sugar and sedative effects are also known as immune resuscitation.
마(Dioscorea opposita Thunb)덩굴뻗는 여러해살이풀이다. 뿌리는 크고 덩어리진 원주형이며 삼각형 모양의 타원형 잎이 마주 붙는다. 줄기와 잎꼭지는 가지색을 띤다. Hemp ( Dioscorea opposita Thunb) is a perennial herb. Roots are large, clumped columnar with triangular oval leaves facing each other. Stems and leaf stalks are branched.
중국 춘추전국시대병사들은 여름에 하얀 꽃이 피는 식물의 큰 뿌리를 식량으로 삼았다고 전해진다. 산에서 식량을 찾다 우연히 만났기 때문에 「산우」(山遇)라고 불렀다는 것. 뒷날 소화기 등에 좋은 약재로 쓰이면서 「산약」(山藥)으로 이름이 바뀌었다한다.It is said that Chinese soldiers of the Spring and Autumn Chuo period used large roots of white-flowering plants as food in the summer. It was called `` sanwoo '' because it happened by chance to find food in the mountains. Later, it was used as a good medicine for fire extinguishers, and it was renamed as `` acid medicine '' (山藥).
마의 주성분은 디오스신(Dioscin), 바타타신(Batatasin), 점액질인 뮤신(Mucine), 아밀라제(Amylase) 등의 소화효소, 아미노산, 만난 등이다.The main components of hemp are Dioscin, Batatasin, mucin mucin, Amylase and other digestive enzymes, amino acids, and met.
마의 장점을 2가지로 요약하면 건위(健胃), 강정작용이다. 건위 작용은 위장, 비장 등 소화기 기능을 강화해 입맛을 돋우고 소화력을 증진시키는 것. 강정 작용은 전신의 허탈 증세를 낫게 하는 것. 정력 쇠약과 연관된 증세로 소변이 잦고 배뇨에 힘이 없으며 끝도 개운치 않은 증세나 낭습증, 임포텐츠 등을 눈에 띄게 개선해준다.The merits of the town can be summarized in two ways: health and health (健胃), Gangjeong action. Stomach action is to enhance the digestive system functions such as stomach and spleen to enhance the appetite and digestion. Strong action to heal the collapse of the whole body. Symptoms associated with stagnation weakness, urinating, urinary strength, endless symptoms, cysts, impotents and remarkably improves.
연자(Nelumbo nucifera) 형태는 타원형 또는 둥그스름한 모양으로 길이 1.2-1.8㎝, 지름 0.8-1.4㎝이다. 표면은 엷은 황갈색 또는 홍갈색으로 한쪽의 끝 중심부에는 유두상의 돌기가 있고 짙은 갈색으로 벌어져 있다. 질은 단단하고 쉽게 쪼개지지 않으며 껍질은 얇으면서도 역시 잘 떨어지지 않는다. 맛은 달고 떫으며 성질은 어느 한 쪽으로 치우치지 않고 평(平)하다. 열매의 씨에는 메틸코리달리느 디메틸코클라우린, N- 노르누시페린, 넬룸빈, 누파린, 아르메파빈, 로투신, 리엔시닌, 이소리엔시닌, 네페린 등이 있다. 옛부터 비위를 돕고정신과 기운을 돋우며 오랫동안 복용하면 몸이 가벼워지고 늙지 않으며 배고프지 않고 수명이 길어진다 하여 널리 애용하던 보약재이다. 비장과 신장, 심장에 작용한다. 비장의 기능을 튼튼하게 하여 설사를 멎게 하고 신장의 기능을 북돋아주며, 심장에 작용하여 정신을 안정시키는 효과를 나타낸다. Nelumbo nucifera is elliptical or round in shape, 1.2-1.8 cm long and 0.8-1.4 cm in diameter. The surface is pale yellowish brown or reddish brown with papillary papillae at the center of one end and dark brown. The vagina is hard, not easily split, and the skin is thin but does not fall well. The taste is sweet and salty and the property is flat without being biased in either direction. Seeds of the fruit include methylcorridin dimethyl cocurin, N-nornousiferin, nroomumbin, nufarin, armephabin, rotucin, liensinin, isoriensinin and neferin. It is a medicine that has been widely used because it helps the stomach and the spirit and energy, and when it is taken for a long time, it makes the body light, not old, hungry, and has a long life. It acts on the spleen, kidneys and heart. It strengthens the function of the spleen to stop diarrhea and boosts the function of the kidneys, and acts on the heart to stabilize the mind.
검실(Euryale ferox Salisb)은 수련과에 속하는 가시연꽃의 씨를 말린 것으로 맛은 달고 성질은 차지도 않고 평하여 비장과 신장을 보하는 작용을 한다. 가시연꽃은 우리나라 중부 이남의 못에 심어 재배하며 가을에 익은 열매를 따서 굳은 껍질을 까버리고 햇볕에 말려 사용한다. 씨에는 많은 전분이 함유되어 있으며 100g 중에 함유되어 있는 성분은 단백질 4.4g, 지방 0.2g, 탄수화물32g, 섬유질 0.4g, 회분 0.5g, 칼슘 9mg, 인110mg, 철 0.4mg, 비타민 B, 비타민 C, 니코틴산, 카로틴 등이 미량 들어 있다. 신장 기능을 튼튼히 하고 비, 위장, 소화기 기능을 튼튼히 한다. 스트레스로 생기는 증세를 해소한다. 精氣(정기)를 북돋우며 기억력을 좋게 하고 눈과 귀를 밝게 한다. 오랫동안 복용하면 몸이 가벼워지고 배가 고프지 않으며 늙지 않고 신선이 될 수 있다. Euryale ferox Salisb is dried seed of spiny lotus belonging to the water lily family. It tastes sweet and does not occupy the nature. It acts to protect the spleen and kidney. The thorn lotus is planted in the ponds of the sub-central part of Korea, and it picks up ripe fruits in autumn and cuts the hard bark and dry it in the sun. Seeds contain a lot of starch, and the ingredients in 100g are 4.4g protein, 0.2g fat, 32g carbohydrate, 0.4g fiber, 0.5g ash, 9mg calcium, 110mg phosphorus, 0.4mg iron, vitamin B, vitamin C, It contains trace amounts of nicotinic acid and carotene. Strengthen kidney function, and strengthens rain, gastrointestinal, and digestive function. Relieves symptoms caused by stress. Encourage 精 氣 (regular) to improve memory and brighten eyes and ears. Taking it for a long time can make your body lighter, less hungry, not old and fresh.
따라서, 본 발명의 목적은, 티로시나제 효소의 활성을 억제하고 멜라닌 생성을 억제함으로서 우수한 피부 미백효과를 갖고, 안전성에 문제가 없는 식물성 천연 추출물을 제공하는 것이다. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a plant natural extract having excellent skin whitening effect by inhibiting the activity of tyrosinase enzyme and inhibiting melanin production and having no safety problems.
본 발명의 다른 목적은 이러한 효능을 갖는 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition comprising an extract having such efficacy.
본 발명은 이러한 견지에서, 본 발명자들은 피부 미백효과가 있는 근본적 물질을 찾고자하여 자연의 여러 가지 천연물들 중에서 미백에 유효한 물질을 검색한 결과, 백봉령, 마, 연자, 검실 혼합추출물(이하 양춘백설고)이 우수한 미백효과를 나타냄을 발견하였으며 안정성 문제를 동시에 해결하였다. In view of the present invention, the present inventors search for an effective substance for whitening among various natural products of nature in order to find an essential substance having a skin whitening effect, Baekbong-ryeong, hemp, soft and mixed extracts (Yangchun white snow) It was found to show excellent whitening effect and solved stability problem at the same time.
또한 화장료 조성물에서 양춘백설고를 일정농도 이상 배합하여 사람 피부에 직접 도포한 실험 결과에서도 뚜렷한 미백 효과를 발휘하게 됨을 발견하게 되었다. 본 발명은 비정상적인 멜라닌 형성을 근본적으로 막을 수 있는 양춘백설고를 함유하는 미백 화장료 조성물을 제공하는데 있다. In addition, the cosmetic composition was found to exhibit a clear whitening effect even in the experimental results of applying directly to the skin of the Yangchun white snow snow at a certain concentration. The present invention is to provide a whitening cosmetic composition containing Yangchun white snow that can fundamentally prevent abnormal melanin formation.
이 추출물을 화장료, 다시 말하면 유연화장수(스킨), 영양로션(로션), 영양크림, 맛사지 크림,에센스,팩 등에 첨가하는 것이다. This extract is added to cosmetics, that is, softening water (skin), nourishing lotion (lotion), nourishing cream, massage cream, essence, packs and the like.
본 발명은 피부미백효과를 갖는 양춘백설고를 함유하는 미백화장료 조성물에 관한 것이다. 즉, 백봉령, 마, 연자, 검실 혼합추출물(이하 양춘백설고)을 포함하 여 구성되는 것을 특징으로 하는 미백화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a whitening cosmetic composition containing Yangchun white snow has a skin lightening effect. That is, it relates to a whitening cosmetic composition, characterized in that it comprises a Baekbongryeong, hemp, softwood, gumsil extract (hereinafter Yangchun Baekseolgo).
실험예에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 양춘백설고는 우수한 티로시나제 활성 저해 효과와 멜라닌 생성 억제 작용을 가지며, 본 발명의 추출물을 첨가하여 제조한 화장료가 피부 미백 효과가 우수하였다.As can be seen in the experimental example, Yangchun white snow of the present invention has an excellent inhibitory effect on tyrosinase activity and melanin production, cosmetics prepared by the addition of the extract of the present invention was excellent skin whitening effect.
본 발명을 좀 더 상세히 설명하면 다음과 같다. 건조된 백봉령, 마, 연자, 검실을 추출 용매로서 증류수, 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 헥산, 함수 부틸렌글리콜, 함수 프로필렌글리콜, 함수 글리세린으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나이상의 용매를 5-10배 부피량을 가한다. 추출 방법으로는 냉각 콘덴서가 장치되어 용매가 증발되는 것을 방지한 상태에서 50-100 ℃, 2-20시간 가열하여 추출하거나 5-37℃에서 1-15일간 침적시켜 유효성분을 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 이렇게 추출한 양춘백설고를 냉각 콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 증발되어 나오는 용매를 회수하면서 완전히 감압 농축한 후 그 건조중량으로서 0.001-10%, 바람직하게는 0.01-5%의 양으로 화장료에 첨가하는 것이다. The present invention is described in more detail as follows. One or more solvents selected from the group consisting of distilled water, ethanol, methanol, propanol, butanol, acetone, ethyl acetate, hexane, hydrous butylene glycol, hydrous propylene glycol and hydrolysed glycerin are extracted as dried solvents. Add 5-10 times by volume. Extraction method is a method of extracting by heating at 50-100 ℃ for 2-20 hours or extracting the active ingredient at 5-37 ℃ for 1-15 days while the cooling condenser is installed to prevent the solvent from evaporating. Can be. The extracted Yangchun Baekseol is concentrated under reduced pressure while recovering the solvent evaporated using a distillation apparatus equipped with a cooling condenser, and then added to the cosmetic in an amount of 0.001-10%, preferably 0.01-5%, as its dry weight. .
아래의 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 설명하나, 본 발명의 내용이 여기에 한정되지는 않는다. The following Examples and Experimental Examples illustrate the content of the present invention, but the content of the present invention is not limited thereto.
<실시예 1><Example 1>
건조된 백봉령, 마, 연자, 검실 500g을 증류수 5kg에 넣고 냉각 콘덴서가 달린 추출기를 사용하여 70℃에서 3시간 가온하여 추출한 후 400 메쉬 여과포로 여과하고 상온으로 냉각한 후 5-15℃에서 7일간 방치하여 숙성시킨 후 0.45μm 필터로 여과하였다. 여액을 감압회전증발기에서 용매를 완전히 제거하여 15.1 g 의 추출물을 얻었다. 500g of dried Baekbong-ryeong, hemp, softwood, and gumsil were placed in 5kg of distilled water and extracted by heating at 70 ℃ for 3 hours using an extractor equipped with a cooling condenser. After standing and aged, the product was filtered with a 0.45 μm filter. The filtrate was completely removed from the solvent in a vacuum rotary evaporator to obtain 15.1 g of an extract.
실험예 1. 양춘백설고 세포독성 측정Experimental Example 1. Measurement of cytotoxicity
양춘백설고에 대하여 단층 세포 배양에서의 세포독성을 측정 하였다.Cytotoxicity in monolayer cell cultures was measured for Yangchunbaek Snow.
실험 방법 Experiment method
MTT assay는 살아있는 세포의 수를 측정함으로서 세포 증식이나 독성에 많이 사용되는 실험법으로 살아있는 세포는 미토콘드리아내에서 수용성이고 노란색의 염인 MTT(3-[4,5- dimethylthiazole-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 숙신산탈수소효소(succinate dehydrogenase 또는 mitochondrial dehydrogenase라고도 불림 )에 의해 수불용성인 파란색의 formazan 유도체로 환원되는 원리를 이용하는 것이다. 생성된 formazan 유도체는 용해제(보통 dimethylsulfoxide 사용)를 넣고 용해시킨 후 흡광도를 측정한다. 좀 더 자세히 설명하면, human fibroblasts cell line (ATCC, CRL-2310)을 1x104cells/ml의 농도로 하여 24well plate에 접종하였다. 배지는 소혈청 10%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)를 사용하였다. 접종 후 24시간 후 소혈청 2%를 함유한 DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA)를 교체하고, 시험 시료를 50㎍/㎖의 농도로 10㎕ 첨가 한 후 3일 동안 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양이 끝난 후 상등액을 제거 하고 다시 5% PBS(phosphate buffered saline) 200ul씩을 가하여 세척하고 MTT 용액을 well당 1.0㎖씩 가한 후 4시간 후에 MTT를 제거하고 DMSO를 well당 1.0㎖씩 가한 후 하룻밤 37℃에서 인큐베이션 후 570nm에서 흡광도를 측정 하였다. 그 결과를 표1에 나타내었다. MTT assay is a method widely used for cell proliferation or toxicity by measuring the number of living cells. The living cells are water-soluble and yellow salts of MTT (3- [4,5-dimethylthiazole-2-yl] -2,5 in the mitochondria. It is based on the principle that -diphenyltetrazolium bromide is reduced to a water-insoluble blue formazan derivative by succinate dehydrogenase (also called succinate dehydrogenase or mitochondrial dehydrogenase). The resulting formazan derivative is dissolved by adding a solubilizer (usually dimethylsulfoxide) and then measured for absorbance. In more detail, human fibroblasts cell line (ATCC, CRL-2310) was inoculated in 24well plates at a concentration of 1x10 4 cells / ml. Medium was used DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA) containing 10% bovine serum. 24 hours after the inoculation, DMEM (Dubelcco'S Modified Eagle Medium, BRL, USA) containing 2% of bovine serum was replaced, and 10 μl of the test sample was added at a concentration of 50 μg / ml, followed by 37 ° C. and 5% for 3 days. Incubated in a CO 2 incubator. After incubation, remove the supernatant and wash again with 200ul of 5% PBS (phosphate buffered saline), add 1.0ml of MTT solution per well, remove MTT after 4 hours, and add 1.0ml of DMSO per well overnight. Absorbance was measured at 570 nm after incubation at ℃. The results are shown in Table 1.
실험예 2. 양춘백설고의 프리라디칼(free radical) 소거능 실험Experimental Example 2. Free radical scavenging activity of Yangchunbaek snow
상기 양춘백설고에 대하여, 박의 방법(Park, S. N, 대한화장품학회지, 23(1), pp75-132, 1997)을 따라 DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)을 사용하여 프리라디칼 소거 효과를 측정하였다. For the Yangchun-baek snowy snow, using DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical) according to Park's method (Park, S. N, Journal of Korean Society of Cosmetic Products, 23 (1) , pp75-132, 1997) The radical scavenging effect was measured.
0.2 mM 의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 1 ㎖ 에 양춘백설고를 각 농도별로 2 ㎖ 을 첨가하고, 상온에서 10 분간 반응 시킨 후, 520 nm 에서 흡광도를 측정하여 프리라디칼 소거효과(%)를 구하였다. 이 때 대조군은 DPPH 대신 메탄올을 사용하며, 실험군과 동일한 농도의 양춘백설고 2 ㎖을 첨가하였다. 또한, 프리라디칼 소거능의 양성 대조군으로는 프리라디칼 소거능이 뛰어난 플라보노이드 성분을 다량 함유하고 있는 녹차 추출물과 비교하였다. To 1 ml of 0.2 mM DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) solution, 2 ml of Yangchun white snow sugar was added at each concentration, reacted at room temperature for 10 minutes, and the absorbance was measured at 520 nm. (%) Was obtained. At this time, as a control group, methanol was used instead of DPPH, and 2 ml of Yangchunbaeksulgo was added at the same concentration as the experimental group. In addition, as a positive control of the free radical scavenging ability, it was compared with the green tea extract containing a large amount of flavonoid components excellent in the free radical scavenging ability.
프리라디칼 소거활성 SC50 은 프리라디칼을 50% 소거하는데 요구되는 양춘백설고의 농도(㎍/㎖) 로써 표시하였다. Free radical scavenging activity SC 50 was expressed as the concentration (μg / ml) of Yangchun Baekseolgo required to remove 50% of the free radicals.
하기 표 2의 결과를 보면, 실시예의 양춘백설고는 녹차 추출물의 프리라디칼 소거능보다 비교하여 볼때, 유사하거나 또는 더 낮은 농도에서 SC50 농도를 나타내어 프리라디칼 소거능이 뛰어남을 확인할 수 있었다.Looking at the results of the following Table 2, the Yangchun Baekseolgo of the Example compared to the free radical scavenging ability of the green tea extract, it was confirmed that the free radical scavenging ability by showing the SC 50 concentration at a similar or lower concentration.
실험예 3. 양춘백설고의 세포내 티로시나제 활성 저해 효과Experimental Example 3. Inhibitory Effect of Yangchun Baekseol on Intracellular Tyrosinase Activity
상기 양춘백설고에 대하여 티로시나제의 저해활성을 측정하였다. 모든 농도에 따른 웰 수는 3배수로 준비하였다. B16 멜라노마 세포(ATCC CRL6323)를 10% 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에 1x105 세포의 밀도로 접종하고 하루 동안 5% CO2, 37℃에서 배양시켰다. 그 후 α-MSH(melanocyte stimulating hormone; 멜라닌세포자극호르몬, 0.34 ug/mL, Sigma)가 처리된 DMEM 10% 배지로 갈아준 후 실시예의 시료들을 농도별로 웰에 처리하여 3일간 배양하였다. 배지를 제거하고 세포들은 트립신을 처리하여 떼어낸 후 1.5mL 튜브에 넣어 12,000rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 버리고 PBS로 2회 세척한다. 세포 침전물에 1% 트리톤 X-100과 2mM PMSF(Phenylmethylsulfonyl Fluoride; 단백질 분해 억제제)가 포함된 80mM 포타슘 포스페이트 완충용액(pH6.8) 1mL를 첨가하여 얼음 속에서 20분간 진탕혼합하여 4℃에서 1시간 동안 방치한다. 그 후 4℃, 20분, 12,000rpm에서 원심분리하여 상층액을 모은다. 상층액 0.3mL와 1.5mM 티로신 0.3mL를 37℃에서 3시간 반응시킨다. 강하게 진탕혼합하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 상층액의 단백질 정량은 Bio-rad 단백질 정량 프로토콜에 따라 분석하였으며, 생성된 멜라닌의 흡광도를 단백질 량으로 나누어 주었다. 대조군으로 사용된 상백피 추출물은 좋은 티로시나제 활성 저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다. The inhibitory activity of tyrosinase was measured on the Yangchun-baeksago. Well counts according to all concentrations were prepared in triplicate. B16 melanoma cells (ATCC CRL6323) were seeded in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) with 10% bovine serum and 1% antibiotic at a density of 1 × 10 5 cells and incubated at 5% CO 2 , 37 ° C. for one day. Thereafter, the cells were treated with DMEM 10% medium treated with α-MSH (melanocyte stimulating hormone; melanocyte stimulating hormone, 0.34 ug / mL, Sigma), and the samples of the examples were incubated for 3 days. Remove the medium and remove the cells by trypsin treatment, put in a 1.5mL tube and centrifuged for 5 minutes at 12,000rpm to discard the supernatant and wash twice with PBS. To the cell precipitate, 1 ml of 80% potassium phosphate buffer solution (pH6.8) containing 1% Triton X-100 and 2 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl Fluoride) was added, and the mixture was shaken for 20 minutes on ice for 1 hour at 4 ° C. Leave it for a while. Then, the supernatant is collected by centrifugation at 4 ° C., 20 minutes, and 12,000 rpm. 0.3 mL of the supernatant and 0.3 mL of 1.5 mM tyrosine are reacted at 37 ° C for 3 hours. The mixture was vigorously shaken and the absorbance was measured at 475 nm. Protein quantification of the supernatant was analyzed according to the Bio-rad protein quantification protocol, the absorbance of the resulting melanin was divided by the amount of protein. The extract of Morus bark used as a control has a good tyrosinase activity inhibitory effect and is widely used as a cosmetic raw material.
티로시나제 활성 억제율(%) = [(A-B)/A]x100 % Tyrosinase activity inhibition = [(A-B) / A] x100
A : 시료를 첨가하지 않은 반응용액의 475nm에서 흡광도 A: Absorbance at 475 nm of reaction solution without sample
B : 시료를 첨가한 반응용액의 475nm에서 흡광도B: absorbance at 475 nm of the reaction solution to which the sample was added
실험예 4. 양춘백설고의 B16 melanoma 를 이용한 멜라닌 생성 억제 작용 실험Experimental Example 4. Experiment of melanin production inhibition using B16 melanoma of Yangchunbaek Snow
양춘백설고에 대하여 B16 멜라노마 의 멜라닌 생성 억제작용효과를 측정 하였다. The effects of B16 melanoma on melanin production were measured in Yangchunbaek Snow.
B16 멜라노마 세포 배양을 통하여 멜라닌 생성 억제 기능을 세포 수준에서 검정 하였다. B16 멜라노마 세포는 10 % 소혈청을 함유한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에서 5% CO2, 37℃의 조건에서 2일간 배양하여 1.0 X 108 세포 / T25 프라스크가 될 때까지 배양한다. 그 다음 농도별로 양춘백설고 및 대조군 시료를 넣고 5% CO2, 37℃에서 2일간 배양한다. 그 후 트립신을 첨가하여 세포들을 수거하여 세포의 흑화 정도를 관찰한다. 멜라닌이 생성되어 배출된 T25 프라스크의 상층액을 취해 475 nm 에서 흡광도를 측정하여 멜라닌을 정량하고, 세포수는 수거된 세포: tryphan blue = 1 : 9 의 비율로 혼합하여 현미경으로 관찰하여 살아있는 세포수를 세어 단위 세포당 생성된 멜라닌의 양을 정량하여 저해 효과를 나타낸다. 대조군으로 사용된 상백피 추출물은 좋은 티로시나제 활성 저해 효능을 가지고 있어 화장품 원료로 널리 사용되고 있는 물질이다.Melanogenesis inhibitory function was assayed at the cellular level through B16 melanoma cell culture. B16 melanoma cells were incubated in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) containing 10% bovine serum at 5% CO 2 , 37 ° C for 2 days until 1.0 X 10 8 cells / T25 flask. Then, put Yangchun Baekseol and control samples by concentration and incubated for 2 days at 5% CO 2 , 37 ℃. Then trypsin is added to collect the cells and observe the degree of blackening of the cells. Melanin was quantified by measuring the absorbance at 475 nm, taking the supernatant of melanin-produced and discharged T25 flask, and counting the cells in a ratio of collected cells: tryphan blue = 1: 9 Count the amount of melanin produced per unit cell to show the inhibitory effect. The extract of Morus bark used as a control has a good tyrosinase activity inhibitory effect and is widely used as a cosmetic raw material.
멜라닌생성량 = 흡광계수(0.1498) × A475 Melanin production = extinction coefficient (0.1498) × A 475
멜라닌생성저해효과 = 1 - 멜라닌생성량/시료의세포수Melanin production inhibitory effect = 1-melanin production / sample cell count
<처방예 1> < Prescription Example 1>
양춘백설고를 함유한 화장료 중 유연화장수(스킨)의 처방예는 다음과 같다. 여기에 양춘백설고는 실시예 2의 것이다. 비교예 1은 양춘백설고 대신 동량의 1,3-부틸렌글리콜을 추가하여 첨가한 제형이다. A prescription example of supple cosmetics (skin) among cosmetics containing Yangchun white snow is as follows. Yangchun white snow here is that of Example 2. Comparative Example 1 is a formulation in which an equal amount of 1,3-butylene glycol is added instead of Yangchun Baekseolgo.
<처방예 2> < Prescription Example 2>
양춘백설고를 함유한 화장료 중 밀크로션의 처방예는 다음과 같다. 여기에 양춘백설고는 실시예 2의 것이다. 비교예 2은 양춘백설고 대신 동량의 1,3-부틸렌글리콜을 추가하여 첨가한 제형이다. A prescription example of milk lotion among the cosmetics containing Yangchunbaek snow is as follows. Yangchun white snow here is that of Example 2. Comparative Example 2 is a formulation in which the same amount of 1,3-butylene glycol was added instead of Yangchun Baekseolgo.
<처방예 3> < Prescription Example 3>
양춘백설고를 함유한 화장료 중 영양크림의 처방예는 다음과 같다. 여기에 양춘백설고는 실시예 2의 것이다. 비교예 3은 양춘백설고 대신 동량의 글리세린을 추가하여 첨가한 제형이다.A prescription example of nourishing cream among cosmetics containing Yangchun Baekseol is as follows. Yangchun white snow here is that of Example 2. Comparative Example 3 is a formulation in which the same amount of glycerin was added instead of Yangchun Baekseolgo.
<처방예 4> < Prescription Example 4>
양춘백설고를 함유한 화장료 중 맛사지크림의 처방예는 다음과 같다. 여기에 양춘백설고는 실시예 2의 것이다. 비교예 4는 양춘백설고 대신 동량의 글리세린을 추가하여 첨가한 제형이다.A prescription example of a massage cream among cosmetics containing Yangchunbaek snow is as follows. Yangchun white snow here is that of Example 2. Comparative Example 4 is a formulation in which the same amount of glycerin was added instead of Yangchun Baekseolgo.
시험예 1. 미백 효과 평가Test Example 1. Evaluation of the whitening effect
<인체 피부 수준에서의 미백 효과 평가> < Evaluation of Whitening Effect at Human Skin Level>
건강한 남녀 20명을 대상으로 피검자의 윗 팔뚝 부위에 직경 1.5㎝의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 다음, 각 피검자의 최소 홍반량(MED ; Minimal Erythema Dose)의 1.5∼2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 색소 침착을 유도하고, 시험 물질들을 도포하여 두 달 후에 색차계를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 각 시험 물질들은 처방예 1~3 및 비교예 1∼3을 아침과 저녁에 걸쳐 매일 2회 바르도록 하였다. Twenty healthy men and women affixed an opaque tape with six holes of 1.5 cm in diameter on the upper forearm of the subject, and then treated them with 1.5 ~ 2 times of ultraviolet light (MED; Minimal Erythema Dose). UVB) was irradiated to induce pigmentation of the skin, and two months after application of the test substances, the contrast of the skin was measured using a colorimeter. Each test substance was applied to prescription Examples 1 to 3 and Comparative Examples 1 to 3 twice daily over morning and evening.
효과의 판정은 피부의 명암을 나타내는 L* 값을 구하여 결정하였다. 일반적으로 인공적인 색소 침착을 유도하지 않은 한국인 피부의 L* 값은 50∼70의 영역에 속한다.The determination of the effect was determined by obtaining an L * value representing the contrast of the skin. In general, the L * value of Korean skin that does not induce artificial pigmentation is in the range of 50 to 70.
시험 물질들을 도포하여 효과가 있을 경우에는 L* 값이 점차 증가하게 된다. 도포 시작 시점과 완료 시점에서의 피부색의 차이(ΔL*)를 아래 식에 따라 계산하여 사람 피부에서의 미백 효과를 비교하였으며, 그 측정결과는 표 5에 나타내었다. If the test substances are applied, the L * value will gradually increase. The difference in skin color (ΔL * ) between the start point and the end point of application was calculated according to the following equation, and the whitening effect on the human skin was compared. The measurement results are shown in Table 5.
ΔL* = 시험물질도포 마지막날의 ΔL*값 - 시험물질도포전의 L*값ΔL * = ΔL * value on the last day of test substance application-L * value before test substance application
상기 조사결과와 같이 양춘백설고를 첨가하여 제조한 처방예 1~3의 화장료가 첨가되지 않고 제조한 비교예 1~3 보다 피부 미백 효과가 우수하다는 것을 알 수 있다.
미백화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 영양로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 팩 중에서 선택된 하나의 제형을 갖이 바람직하다.As a result of the investigation, it can be seen that the skin whitening effect is superior to Comparative Examples 1 to 3 prepared without adding the cosmetics of Formulas 1 to 3 prepared by adding Yangchun white snow.
The whitening cosmetic composition is preferably one having a formulation selected from a lotion (skin lotion), nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, essence, pack.
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