KR100896483B1

KR100896483B1 - Anti-Tumor Pharmaceutical Composition Comprising Dendritic Cell and Oncolytic Adenovirus Expressing IL-12 and 4-1BBL

Info

Publication number: KR100896483B1
Application number: KR1020070070686A
Authority: KR
Inventors: 윤채옥
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2007-07-13
Filing date: 2007-07-13
Publication date: 2009-05-08
Also published as: KR20090007067A

Abstract

본 발명은 종양 선택적 살상 재조합 아데노바이러스와 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 종양성장 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 인터루킨(interleukin, IL)-12 코딩 유전자 및 4-1BBL(4-1BB ligand) 코딩 유전자를 갖는 재조합 아데노바이러스와, 암 항원을 인지시켜 제조한 성숙 수지상세포(mature dendritic cell)를 조합한 종양성장 억제용 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 종양 선택적 살상가능 재조합 아데노바이러스와 항종양 면역반응 유도능력을 획득한 수지상세포를 병합하여 사용함으로써 종양의 성장 및 전이 억제 효과를 극대화 할 수 있다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting tumor growth, comprising a tumor selective killing recombinant adenovirus and dendritic cells as an active ingredient. The present invention is a combination of a recombinant adenovirus having an interleukin (IL) -12 coding gene and a 4-1BBL (4-1BB ligand) coding gene, and a mature dendritic cell prepared by recognizing a cancer antigen. It provides a pharmaceutical composition for inhibiting tumor growth. The pharmaceutical composition of the present invention can maximize the tumor growth and metastasis inhibitory effect by using a combination of tumor selective killable recombinant adenovirus and dendritic cells obtained the ability to induce anti-tumor immune response.

종양선택적살상 아데노바이러스, IL-12, 4-1BBL, 유전자치료, 세포치료, 면역치료, 암 Tumor selective killing adenovirus, IL-12, 4-1BBL, gene therapy, cell therapy, immunotherapy, cancer

Description

ＩＬ-12 및 4-1ＢＢＬ을 발현하는 종양 선택적 살상 재조합 아데노바이러스 및 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 항종양용 약제학적 조성물{Anti-Tumor Pharmaceutical Composition Comprising Dendritic Cell and Oncolytic Adenovirus Expressing IL-12 and 4-1BBL}Anti-Tumor Pharmaceutical Composition Comprising Dendritic Cell and Oncolytic Adenovirus Expressing IL-12 and 4-1BBL as Tumor Selective Killing Recombinant Adenovirus and Dendritic Cells Expressing IL-1 and 4-1 }

본 발명은 종양 선택적 살상 재조합 아데노바이러스와 수지상 세포를 유효성분으로 포함하는 종양성장 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting tumor growth, comprising a tumor selective killing recombinant adenovirus and dendritic cells as an active ingredient.

각 조직에서 세포들은 정상적으로 증식과 사멸이 균형을 이루고 있으며 이러한 세포가 유전적 결함 또는 돌연변이 등에 의하여 비정상적으로 성장을 계속하거나 분열할 때 종양이 생성되며, 침윤 및 전이 등 특성을 가지고 있다. 암 치료에 있어서 여러 가지 방식을 복합적으로 이용하고 있지만, 많은 경우에서 치료효과는 아직 만족할 만한 수준에 달하고 있지 못하고 중, 말기 암에서는 아직 어떤 치료방식도 50 % 이상의 항암 효과를 보지 못하고 있다. 암에서 바이러스를 이용한 유전자 치료가 1990년대에 들어와서 본격적으로 소개되기 시작하였는데 초기에는 레트 로바이러스의 활용이 큰 비중을 차지했지만 점차적으로 아데노바이러스를 이용한 연구와 임상사례가 늘어나고 있는 추세이다. 재조합 아데노바이러스는 우수한 유전자 전달효율을 보이며 높은 역가로 생산이 가능하고 쉽게 농축할 수 있을 뿐만 아니라 인 비보 에서도 유전자 전달이 용이하다는 점이 보고 되면서 최근 5년 사이에 암을 대상으로 하는 유전자 치료에 재조합 아데노바이러스를 이용하는 빈도수가 급격히 증가하고 있다. 아데노바이러스를 이용한 유전자 치료에 사용되던 일 세대 아데노바이러스는 증식불능 아데노바이러스로서 바이러스가 감염된 세포, 또는 극히 일부의 주변세포들에서만 항암효과를 유발할 수 있어 그 효과가 미미한 수준이었다(1). 그러나 이러한 점을 극복하기 위한 방안으로 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양세포 특이증식 및 세포살상 재조합 아데노바이러스에 대한 연구가 McCormick 그룹에 의해 처음 보고(2) 된 후 종양세포선택살상 바이러스의 가능성이 다각도로 연구되고 있다. In each tissue, cells are normally balanced for proliferation and death. Tumors are formed when these cells continue to grow or divide abnormally due to genetic defects or mutations, and have infiltration and metastasis characteristics. Although various methods are used in the treatment of cancer, in many cases, the therapeutic effect has not reached a satisfactory level, and in mid- and late stages, no treatment method has yet more than 50% of anti-cancer effects. Gene therapy using viruses in cancer began to be introduced in earnest in the 1990s. In the early stages, the use of retroviruses accounted for a great deal, but research and clinical cases using adenoviruses are gradually increasing. Recombinant adenoviruses have been reported to show excellent gene transfer efficiency, can be produced at high titers , can be easily concentrated, and can be easily transferred to in vivo . The frequency of using viruses is increasing rapidly. The first generation of adenoviruses used for gene therapy with adenoviruses are nonproliferative adenoviruses, which have only minimal effects because they can induce anticancer effects only in cells infected with the virus or in only a few peripheral cells (1). However, in order to overcome this, tumor cell specific proliferation and cytotoxic recombinant adenoviruses that selectively proliferate only in cancer cells to kill cancer cells were first reported by McCormick group (2). Possibilities are being studied in various ways.

종양억제 유전자로 잘 알려진 p53은 폐암, 난소암, 유방암, 직장암, 두경부암 등 인체 종양의 50% 정도에서 유전자 변이가 나타나고(3, 4, 5) p53이 정상형으로 밝혀진 종양에서도 mdm2의 과다발현(6, 7) 또는 인간 파필로마 바이러스에 의한 감염(8) 등으로 p53의 기능이 비활성화 되어 있는 경우가 빈번한 것으로 보고 되었다(9). 아데노바이러스가 정상세포를 감염하면, 감염된 세포는 종양 억제 단백질인 p53을 활성화시켜 바이러스의 증식을 억제하는데 이때 E1B55kDa 단백질이 p53 단백질에 결합하여 p53의 기능을 억제하는 역할을 하며(10), 이에 따라 야생형 아데노바이러스는 활발하게 증식을 하여 궁극적으로 감염세포의 살상을 유도한다. 하지만 E1B55kDa 유전자가 소실된 재조합 아데노바이러스가 정상세포를 감염하면 이들 세포에 있는 p53의 비활성화를 유도할 수 없어 바이러스의 증식이 억제되지만, p53의 기능이 억제되어 있는 여러 암세포들에서는 바이러스의 증식이 활발하게 일어나게 되어 궁극적으로 종양세포의 살상을 유도하게 된다(2, 11). Bischoff 등은 E1B 55kDa 유전자가 부분 결실된 아데노바이러스인 ONYX-015 (dl1520)의 특이적 항종양 효과를 보고하였고, 시스플라틴(cisplatin)과 같은 항암제를 동시에 처리함으로써 암세포에 대한 살상능을 배가시킬 수 있었으며, p53이 정상인 암세포들도 효과적으로 살상할 수 있었다(2, 11). 아데노바이러스 E1B 유전자의 또 다른 단백질인 E1B19kDa은 강력한 세포고사(apoptosis) 억제제로서 Bcl-2와 염기서열 및 그 기능이 유사하다(12, 13). E1B19kDa 단백질은 아데노바이러스의 초기 발현 유전자인 E1A에 의해 유도되는 세포고사를 억제하는 물질로 잘 알려져 있으며, 여러 사람의 종양세포들에서 p53에 의하여 유도되어지는 세포고사도 억제시킨다는 결과가 보고되었다(14, 15, 16, 17). 또한, 성장 인자 (growth factor)의 제거나 방사선 치료, 또는 항암제에 의해 유도되는 세포고사를 억제하는 데 있어서 E1B 19kDa과 Bcl-2가 기능적으로 같은 역할을 할 수 있음이 보고된 바 있다(18). 세포사(cell death)에 관한 최근의 연구들에 의하여 밝혀진 바와 같이, 여러 항암제에 의한 세포 사멸은 주로 세포고사에 의해 이루어지며, 이들에 의한 항암 효과는 암세포에서의 세포고사 기작이 정상일 때 보다 효과적이다. 상기 E1B19kDa과 E1B55kDa를 동시에 결손시킨 아데노바이러스의 우수한 항종양효과는 이미 실험실에서도 검증이 되었다(19).P53, a well-known tumor suppressor gene, shows genetic mutations in about 50% of human tumors such as lung cancer, ovarian cancer, breast cancer, rectal cancer, and head and neck cancer (3, 4, 5) and overexpression of mdm2 in tumors where p53 is found to be normal. 6, 7) or infection with human papilloma virus (8) has been reported to inactivate p53 function frequently (9). When adenoviruses infect normal cells, the infected cells activate the tumor suppressor protein p53 to inhibit the growth of the virus, whereby the E1B55kDa protein binds to the p53 protein and inhibits the function of p53 (10). Wild-type adenoviruses proliferate actively, ultimately inducing the killing of infected cells. However, if a recombinant adenovirus that lacks the E1B55kDa gene infects normal cells, it does not induce the inactivation of p53 in these cells, which inhibits the proliferation of the virus. This can eventually lead to the killing of tumor cells (2, 11). Bischoff et al. Reported the specific antitumor effect of ONYX-015 (dl1520), an adenovirus partially missing the E1B 55kDa gene, and was able to double the killing ability of cancer cells by simultaneously treating anticancer drugs such as cisplatin. In addition, cancer cells with normal p53 were able to kill effectively (2, 11). E1B19kDa, another protein of the adenovirus E1B gene, is a potent inhibitor of apoptosis and has similar sequence and function to Bcl-2 (12, 13). E1B19kDa protein is well known as a substance that inhibits apoptosis induced by E1A, an early expression gene of adenovirus, and has been reported to inhibit apoptosis induced by p53 in various tumor cells (14). , 15, 16, 17). In addition, it has been reported that E1B 19kDa and Bcl-2 may play a functional role in the removal of growth factors, radiation therapy, or suppression of cell death induced by anticancer agents (18). . As evidenced by recent studies on cell death, cell death by various anticancer drugs is mainly caused by apoptosis, and their anticancer effects are more effective when the cell death mechanism in cancer cells is normal. . The superior anti-tumor effect of adenoviruses that simultaneously delete the E1B19kDa and E1B55kDa has already been demonstrated in the laboratory (19).

아데노바이러스 E1A는 감염직후 가장 먼저 발현되는 단백질로서 바이러스 복제에 필수적이고, 세포주기를 조절하는 retinoblastoma 단백질 (pRb)과 결합하여 E2F-pRb 복합체로부터 E2F의 해리를 유도하여(20, 21, 22, 23), 결과적으로, 세포주기 활성화에 관여하는 여러 단백질들의 전사를 촉진시킨다(23). 그러나 종양세포에서는 pRb 유전자의 변이 Rb와 관련된 신호전달체계(p16ARF/pRb/E2F 등)가 손상되어 활발한 세포주기가 계속 진행되며(24), 결국 E1A 단백질이 pRb와 결합하지 않더라도 바이러스의 활발한 증식이 일어난다. 이에 반하여 pRb의 기능이 정상적인 세포내에서는 pRb와의 결합능이 상실된 증식가능 아데노바이러스의 E1A가 pRb와 결합할 수 없어, S 세포주기로 진행되지 못하고 결과적으로 바이러스는 복제되지 못한다. 이에 근거하여 Fueyo 등은 120-127 아미노산 서열을 결손시킨 △24 아데노바이러스를 개발하여 Rb 유전자가 돌연변이 된 암세포를 선택적으로 살상할 수 있음을 보고하였으며(25), 본 연구자들은 E1A 유전자 염기서열 중 pRb 단백질과의 결합에 관여하는 두 결합부위, CR1의 아미노산 Glu를 Gly로 치환하고 CR2의 121-127 아미노산을 Gly로 치환하고 동시에 E1B19KDa과 E1B55KDa유전자를 결실시킨 Ad-ΔE1Bmt7(Ad-ΔB7)를 제작하였다. 이 바이러스는 암세포에서는 야생형 아데노바이러스와 유사하거나 보다 빠른 종양세포살상을 유도하였고 정상세포에서는 Ad-ΔB7 아데노바이러스의 세포 살상능력이 현저히 감소하는 종양세포 특이성을 확인하였다(Kim JS, Choi KJ, Kim PH, Kim JH, Sohn JH, CO. Y. Enhanced Oncolytic Effect and Anti-Tumor Effect of Replication Competent Adenovirus with Double Mutation in E1A & E1B Regions. J Bacteriol Virol . Korean . 2005; 35(2): 113- 124.) Adenovirus E1A is the first protein to be expressed immediately after infection, which is essential for viral replication and binds to the retinoblastoma protein (pRb), which regulates the cell cycle, inducing the dissociation of E2F from the E2F-pRb complex (20, 21, 22, 23). As a result, it promotes the transcription of several proteins involved in cell cycle activation (23). However, in tumor cells, the signaling system (p16ARF / pRb / E2F, etc.) related to the mutation Rb of the pRb gene is impaired and the active cell cycle continues (24), resulting in active proliferation of the virus even if the E1A protein does not bind to pRb. Happens. In contrast, E1A of a proliferative adenovirus that lost its ability to bind pRb cannot normally bind to pRb in cells with normal pRb function, and thus cannot progress to the S cell cycle and consequently the virus cannot replicate. Based on these findings, Fueyo et al. (2007) reported the development of a Δ24 adenovirus that lacks the 120-127 amino acid sequence, which can selectively kill cancer cells mutated by the Rb gene (25). Ad-ΔE1Bmt7 (Ad-ΔB7) was prepared by substituting Gly for amino acid Glu of CR1 and Gly for 121-127 amino acid of CR2 with two binding sites involved in binding to protein, and deleting E1B19KDa and E1B55KDa genes. . The virus induced tumor cell death similar to or faster than that of wild-type adenovirus in cancer cells, and tumor cell specificity of Ad-ΔB7 adenovirus was significantly reduced in normal cells (Kim JS, Choi KJ, Kim PH). , Kim JH, Sohn JH, CO Y. Enhanced oncolytic Effect and Anti-Tumor Effect of Replication Competent Adenovirus with Double Mutation in E1A & E1B Regions J Bacteriol Virol Korean 2005; 35 (2):.... 113- 124.)

뿐만 아니라 최근 종양 면역학의 급속한 발전에 따라서 숙주와 종양과의 관계가 점차 규명되고, 여러 생물학적 인자들의 시험관 내 및 생체 내 기능이 밝혀짐에 따라 종양에 대한 숙주의 면역반응의 활성화를 통하여 종양 치료 가능성이 검토되기 시작하였다. 항암 면역치료에 연구되고 있는 사이토카인들 중 특히 인터루킨(Interleukin, IL)-12는 우수한 항암 면역반응을 유도할 수 있음이 보고 된 이후, 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(26). IL-12는 p40과 p35 소단위의 공유결합의 75 kDa의 사이토카인으로서 1989년에 최초로 발견되었다(27). IL-12는 Th₁ 세포 반응의 중요한 조절자로 널리 알려져 있으며 수지상세포(Dendritic Cells, DCs), 단핵세포와 대식세포에서 많이 발현하고 있는 것으로 알려져 있다(28, 29, 30). IL-12는 감염초기반응에서 생성되며(29) NK 세포 기능과 T 세포의 활성에서 강력한 작용을 한다(31). 그러나 다른 한편, 신장과 전신적인 IL-12의 독성에 관련된 보고도 있다(26). 그러므로 이러한 항암면역반응을 유도하는 사이토카인을 너무 높은 용량으로 사용하는 것은 무리이다. Heller등은 IL-12 플라즈미드를 B16F-10 흑색종양에 투여한 다음 전기충격을 주어 항종양 효과를 관찰함과 동시에 그 독성을 최소화 하는 방법을 채택하였다(32). 이에 근거하여 다른 복합자극 분자의 병합투여로 IL-12의 양은 감소시키는 동시에 항암면역을 더 향상시키는 것을 고려해 볼 필요가 있다. In addition, with the recent rapid development of tumor immunology, the relationship between the host and the tumor is gradually revealed, and as the in vitro and in vivo functions of various biological factors are revealed, tumor treatment is possible through activation of the host's immune response to the tumor. This began to be reviewed. Among the cytokines studied for anticancer immunotherapy, interleukin (IL) -12 has been reported to induce an excellent anticancer immune response, and studies have been actively conducted (26). IL-12 was first discovered in 1989 as a 75 kDa cytokine of covalent bonds of p40 and p35 subunits (27). IL-12 is widely known as an important regulator of Th ₁ cell responses and is highly expressed in dendritic cells (DCs), monocytes and macrophages (28, 29, 30). IL-12 is produced in the early stages of infection (29) and plays a potent role in NK cell function and T cell activity (31). On the other hand, however, there have been reports of renal and systemic toxicity of IL-12 (26). Therefore, it is unreasonable to use too high a dose of cytokine that induces an anticancer immune response. Heller et al. (16) adopted IL-12 plasmid in B16F-10 melanoma and gave an electric shock to observe the antitumor effect and minimize its toxicity (32). Based on this, it is necessary to consider improving the anticancer immunity while reducing the amount of IL-12 by the combined administration of other multistimulatory molecules.

최근 연구가 많이 되고 있는 4-1BBL와 4-1BB는 일종의 T 세포의 복합자극분 자이다. 4-1BB는 type Ⅰ 수송 막당단백질의 일종으로서 TNF(tumor necrosis factor)의 수용체 이며 인간과 생쥐의 CD4⁺와 CD8⁺ 세포에 발현이 되며(33, 34, 35, 36) 생쥐에서는 활성화된 NK 세포 혹은 수지상 세포(DCs) 외에 호중구에도 발현이 되고 있다(37). 인간에서는 여포의 DCs(38), 단핵세포(39), 헤파토마 세포(34) 그리고 악성종양에서 생성된 특정 혈관 벽에 발현이 된다고 보고되어 있다(40). 이에 상응하는 4-1BB 리간드(4-1BBL)는 typeⅡ 막 당단백질이며 TNF 수퍼 패밀리(super family)의 일종으로서 세포밖의 탄소말단구역에 위치하고 있으며 인간과 생쥐 모두가 주로 활성화된 항원 제시 세포(antigen presenting cells, APCs)에 발현되는데 DCs와 대식세포뿐만 아니라 활성화된 B 세포에도 그 발현이 증가된다고 보고 되고 있다(41, 42, 43, 44, 45). 4-1BB와 4-1BBL는 TNF-TNF 조절분자들의 한 패밀리로서 T 세포의 활성화(35, 46, 47), 분화 및 세포고사에서(48) 중요한 역할을 한다. 4-1BB는 TRAF2-NIK 경로와 NK-κB 활성화를 거쳐 신호를 전달하는데, 다시 말하면 4-1BB의 활성화는 활성화-유도 세포사멸(activation-induced cell death, AICD)를 억제하고 Post-CD28 단계를 통하여 면역체계를 보호한다. 이들은 복합자극신호를 형성하여 T 세포의 활성화와 증식을 유도하며 세포사멸신호를 조절한다(41). Lee (49) 등은 4-1BB가 bcl-XL와 bfl-l 등 항 세포고사 관련 단백질들을 증가시킴으로써 4-1BB를 매개로 한 NF-κB의 활성화를 통하여 CD8⁺ T 세포를 AICD로부터 벗어나게 한다고 보고하였다. 또한, Wen (50) 등은 인간의 CD8⁺ T 세포반응의 시작은 수지상세포의 4-1BBL의 발현과 그 기능에 의해 증가된 효능(effector) CD8⁺ T 세포의 증식과 생존율의 증가를 통해 이루어진다고 보고한 바 있다. 4-1BBL는 CD8⁺ T 세포의 분화와 효과기억 CD8⁺ T 세포에서 중요한 기능을 하고 있고(48), 4-1BBL의 신호전달경로는 CD8⁺ T 세포뿐 아니라 CD4⁺ T 세포에서도 선택적으로 비교하여 볼 수 있는데, Melero (51) 등은 생쥐실험에서는 mAb를 사용하여 선택적으로 CD4⁺ T 세포집락을 고갈시킨 후 항 종양 효과가 없어지는 것을 관찰하였다. 그리고 Zhu (52)등은 Ag의 투여로 생체 실험했을 때 4-1BBL가 B 세포의 생존을 조절함으로서 체액 면역반응을 조절한다고 보고하였다. 4-1BBL가 최근에는 수지상세포의 활성자(activator)로도 알려져 있다(44). 이러한 4-1BBL의 일차면역과 2차면역에서의 세포독성면역과 기억면역세포에 의한 면역반응의 조절은 항 종양 면역치료에서도 좋은 전망을 보이고 있다(53, 54). Martinet (55)등은 복제불능 아데노바이러스를 벡터로 사용하여 유방암 간 전이모델에서 IL-12와 항4-1BB 항체 혹은 4-1BBL를 마우스의 종양에 전달시킨 경우, 마우스의 생존율이 87 %와 78 %라는 좋은 치료효과를 보았으며, Xu (56) 등은IL-12와 4-1BBL를 병합하여 치료하였을 때는 항암면역이 주로 CD8⁺ T 세포를 통하여 일어난다고 보고하였고 또 Pan (57) 등은 IL-12와 4-1BB항체가 삽입된 복제불능 아데노바이러스 유전자 전달체를 이용하여 대장암의 간 전이를 억제하였을 뿐만 아니라 종양에서의 수지상세포와 NK 세포의 침윤을 일으킨다고 보고하였다.4-1BBL and 4-1BB, which are being studied recently, are a kind of complex stimulating molecules of T cells. 4-1BB is a type I transporter membrane glycoprotein, a receptor of the tumor necrosis factor (TNF) and is expressed on CD4 ⁺ and CD8 ⁺ cells in humans and mice (33, 34, 35, 36) and activated NK cells in mice Or they are expressed in neutrophils in addition to dendritic cells (DCs) (37). In humans, it has been reported to be expressed on follicular DCs (38), monocytes (39), hepatoma cells (34) and certain blood vessel walls produced by malignancies (40). The corresponding 4-1BB ligand (4-1BBL) is a type II membrane glycoprotein, a type of TNF super family that is located in the extracellular carbon-terminal zone and is mainly activated antigen presenting in both humans and mice. cells, APCs), which are reported to increase the expression of activated B cells as well as DCs and macrophages (41, 42, 43, 44, 45). 4-1BB and 4-1BBL are a family of TNF-TNF regulatory molecules that play important roles in T cell activation (35, 46, 47), differentiation and apoptosis (48). 4-1BB transmits signals through TRAF2-NIK pathway and NK-κB activation, ie activation of 4-1BB inhibits activation-induced cell death (AICD) and post-CD28 Protects the immune system. They form complex stimulatory signals that induce activation and proliferation of T cells and regulate cell death signals (41). Lee (49) reported that 4-1BB frees CD8 ⁺ T cells from AICD through activation of 4-1BB-mediated NF-κB by increasing anti-apoptosis related proteins such as bcl-XL and bfl-l. It was. In addition, Wen et al. (50) noted that the initiation of CD8 ⁺ T cell responses in humans is achieved by increasing the proliferation and viability of effector CD8 ⁺ T cells increased by the expression of 4-1BBL in dendritic cells and their function. It was reported. 4-1BBL is selectively compared in the signaling pathways of differentiation of CD8 ⁺ T cells and CD8 ⁺ memory effect an important function in T cells and and (48), 4-1BBL, as well as CD8 ⁺ T cells, CD4 ⁺ T cells Melero (51) et al. Observed that in mice experiments, mAb was used to selectively deplete CD4 ⁺ T cell colonies and then disappeared. Zhu et al. (52) reported that 4-1BBL regulates humoral immune responses by regulating B cell survival when administered in vivo with administration of Ag. 4-1BBL is also recently known as an activator of dendritic cells (44). The regulation of cytotoxic and memory immune cells in primary and secondary immunity of 4-1BBL shows good prospects for antitumor immunotherapy (53, 54). Martinet et al. (55) reported that when a non-replicating adenovirus was used as a vector, IL-12 and anti4-1BB antibodies or 4-1BBL were delivered to mouse tumors in a breast cancer liver metastasis model. Xu (56) reported that anti-cancer immunity was mainly through CD8 ⁺ T cells when IL-12 and 4-1BBL were treated. Pan (57) et al. A non-replicating adenovirus gene carrier with -12 and 4-1BB antibodies was used to inhibit liver metastasis of colorectal cancer and to induce dendritic and NK cells in tumors.

현재 암의 면역치료에 직면한 가장 큰 문제 중의 하나는 정상세포에 대한 독성을 해결하지 못하고 있는 것이다. 정상세포에 영향을 주지 않고 종양만을 선택적으로 파괴하도록 하는 종양 특이 면역의 유도 기능 향상은 항암 치료의 새로운 가능성으로 대두되고 있다. 생체 내 정상적으로 존재하는 면역감시기구 중 종양세포를 인지하고 소멸시키는 것은 T 세포나 NK 세포 등 세포성 면역기능의 활성화가 주요 역할을 담당하게 된다. 종양세포에 특이적으로 작용하는 T 세포의 활성화 과정은 이를 조절하는 항원제시세포의 역할이 선행 되여야만 하는데, 수지상세포는 체내에서 알려진 가장 전문적이고 강력한 항원제시세포이다. 1973년 Steinman과 Chon (58)이 보고한 수지상세포는‘nature's adjuvant' 라는 명성을 얻고 있으며 고도로 전문화된 항원제시세포로 resting / naive T 세포의 강력한 활성자로 발견되었다(59, 60, 61, 62, 63). 수지상세포가 강력한 면역기능 활성의 중심에 설수 있는 이유는 세포표면에 MHC 분자(Ⅰ/Ⅱ)을 발현함으로서 항원제시세포(APC, antigene-presenting cell)의 기능을 수행할 뿐만 아니라 공동-자극분자(co-stimulatory molecule) (CD80, CD86)와 4-1BB 리간드, 그리고 어드히젼 분자(adhesion molecule) (예, ICAM-1)등을 고농도로 발현하고 있고, 또한 스스로 사이토카인을 분비할 뿐만 아니라 세포살상 T 림프구(CTL)의 활성화를 통하여 여러 가지 사이토카인(TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-18등) 들을 분비하기 때문인 것으로 알려져 있다. 최근에는 수지상세포에 의한 항원 특이 살상 T 세포 (cytotoxic T lymphocyte / CTL) 의 생성, CD4⁺ 헬퍼 T 세포(Th₁ type)의 증식 및 활성화 등의 연구 결과가 발 표되고 있으며, 인 비보 실험을 통해 생체 내로 주입된 수지상세포도 CTL의 생성을 촉진시킴이 밝혀지고 있다(64, 65, 66, 67, 68, 69). 따라서 DC를 치료하고자 하는 종양의 항원/표지 인자로 교육시켜 종양 특이 면역 세포의 기능을 회복시키거나 또는 활성화시키도록 유도하여 종양을 치료하는 면역세포 치료제로서 사용할 수 있을 뿐만 아니라 기억면역을 되살려 숙주가 종양세포의 공격을 받을 때 보호작용을 할 수 있다. One of the biggest problems facing current cancer immunotherapy is not addressing toxicity to normal cells. Improving the ability of tumor-specific immunity to selectively destroy only tumors without affecting normal cells is emerging as a new possibility of chemotherapy. In the immune monitoring apparatus that normally exists in vivo, the recognition and disappearance of tumor cells plays an important role in the activation of cellular immune functions such as T cells and NK cells. The activation process of T cells that specifically act on tumor cells must be preceded by the role of antigen presenting cells to regulate them. Dendritic cells are the most specialized and powerful antigen presenting cells known in the body. Dendritic cells, reported by Steinman and Chon (58) in 1973, have a reputation as 'nature's adjuvant' and are highly specialized antigen-presenting cells found to be potent activators of resting / naive T cells (59, 60, 61, 62, 63). The reason why dendritic cells can be at the center of potent immune function is to express MHC molecules (I / II) on the cell surface and to perform the functions of antigen-presenting cells (APCs) as well as co-stimulatory molecules ( Co-stimulatory molecules (CD80, CD86), 4-1BB ligand, and Adhesion molecule (e.g. ICAM-1) are expressed at high concentrations, and they secrete cytokines and kill themselves It is known to secrete various cytokines (TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-18, etc.) through activation of T lymphocytes (CTL). Recently, a study of such proliferation and the activation of the generation of antigen-specific killing T cells (cytotoxic T lymphocyte / CTL) by dendritic cells, CD4 ⁺ helper T cells (Th ₁ type) and to the table, through the in vivo experiment Dendritic cells injected in vivo have also been shown to promote CTL production (64, 65, 66, 67, 68, 69). Therefore, DC can be used as an immune cell therapeutic agent to treat tumors by educating the antigens / markers of tumors to be treated to induce or restore the function of tumor-specific immune cells. Can protect against tumor cell attack.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다. Throughout this specification, many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 치료 방법에 대해 심도 있게 연구한 결과, 항종양 면역반응 활성 사이토카인인 인터루킨(interleukin, IL)-12 코딩 뉴클레오타이드 서열 및 T 세포 복합자극분자인 4-1BBL(4-1BB ligand) 코딩 뉴클레오타이드 서열을 동시에 갖는 재조합 아데노바이러스와, 암 항원을 인지시켜 제조한 수지상세포(dendritic cell)를 조합하여 병행 치료 하게 되면, 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다. The present inventors have conducted in-depth studies on therapeutic methods that can effectively inhibit tumor growth and metastasis. As a result, the anti-tumor immune response cytokines, interleukin (IL) -12 coding nucleotide sequences and T cell complex stimulatory molecules, Combination treatment with a recombinant adenovirus having a 4-1BBL (4-1BB ligand) coding nucleotide sequence and a dendritic cell prepared by recognizing a cancer antigen can effectively inhibit tumor growth and metastasis. Experimentally confirmed that it can be completed the present invention.

따라서 본 발명의 목적은 IL-12 또는 4-1BBL 코딩 뉴클레오타이드 서열을 갖는 재조합 아데노바이러스 및 수지상세포를 유효성분으로 포함하는 종양 성장 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for inhibiting tumor growth, comprising a recombinant adenovirus and dendritic cells having IL-12 or 4-1BBL coding nucleotide sequence as an active ingredient.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다. The objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 인터루킨(interleukin, IL)-12 또는 4-1BBL(4-1BB ligand) 코딩 뉴클레오타이드 서열을 갖는 재조합 아데노바이러 스 및 수지상세포(dendritic cell)의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항종양용 약제학적 조성물을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention provides a method for the preparation of recombinant adenovirus and dendritic cells having an interleukin (IL) -12 or 4-1BBL (4-1BB ligand) coding nucleotide sequence. It provides a pharmaceutical composition for anti-tumor, comprising a therapeutically effective amount and (b) a pharmaceutically acceptable carrier.

본 발명자들은 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있는 치료 방법에 대해 심도 있게 연구한 결과, 항종양 면역활성 사이토카인인 인터루킨(interleukin, IL)-12를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및 T 세포 복합자극분자인 4-1BBL(4-1BB ligand)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스와, 암 항원을 인지시켜 제조한 수지상세포(dendritic cell)를 조합하여 병행 치료 하게 되면, 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제할 수 있다는 사실을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. The present inventors have conducted in-depth studies on therapeutic methods that can effectively inhibit tumor growth and metastasis. As a result, the nucleotide sequence encoding T-cell complex stimulatory molecule, interleukin (IL) -12, an anti-tumor immunoactive cytokine Combination treatment with a recombinant adenovirus comprising a nucleotide sequence encoding 4-1BBL (4-1BB ligand) and a dendritic cell prepared by recognizing a cancer antigen results in tumor growth and metastasis. The present invention has been completed by experimentally confirming that it can be effectively suppressed.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 항종양 면역활성 사이토카인으로서 IL-12 를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열과, T세포 복합자극분자로서 4-1BBL를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. The recombinant adenovirus of the present invention comprises a nucleotide sequence encoding IL-12 as an anti-tumor immunoactivating cytokine and a nucleotide sequence encoding 4-1BBL as a T cell multistimulatory molecule.

본 발명의 명세서에서 용어“사이토카인”은 면역시스템에 관련된 세포에 의해 생성되는 단백질 또는 펩타이드들로서, 면역반응을 조절하는 작용을 한다. 이러한 면역반응의 조절은 체액성 면역반응 또는 세포성 면역반응에서 행해지며, 구체적으로 T 세포, B 세포, NK(Natural Killer) 세포, 식세포, 항원제시세포 또는 다른 면역세포의 효능 기능(effector function)을 조절함으로서 행해진다. 사이토카인은 통상 약 30 kDa 보다 적은 분자량을 갖는 작은 단백질 또는 당단백질이다. 본 발명의 명세서에서 사이토카인은 림프구에 의해서 분비되는 사이토카인(림포카 인, lymphokine)과 단핵세포 또는 대식세포 등의 세포타입에 의해 분비되는 사이토카인(모노카인, monokine)을 모두 포함한다. 본 발명에서 사이토카인은 조혈모세포 및 면역세포의 성장 및 분화에 영향을 미치는 백혈구(leukocyte)로부터 분비되는 IL-2, IL-4, IL-8 및 IL-12을 포함한다. As used herein, the term "cytokine" refers to proteins or peptides produced by cells involved in the immune system, and functions to modulate the immune response. The regulation of this immune response is in a humoral or cellular immune response, specifically the effector function of T cells, B cells, natural killer (NK) cells, phagocytes, antigen presenting cells or other immune cells. By adjusting the Cytokines are usually small proteins or glycoproteins with molecular weight less than about 30 kDa. Cytokines in the context of the present invention include both cytokines (lymphokines, lymphokine) secreted by lymphocytes and cytokines (monokines, monokine) secreted by cell types such as monocytes or macrophages. Cytokines in the present invention include IL-2, IL-4, IL-8 and IL-12 secreted from leukocytes that affect the growth and differentiation of hematopoietic and immune cells.

본 발명의 명세서에서 용어 “인터루킨-12(IL-12)”는 40 kDa 서브유닛(p40 서브유닛) 및 35 kDa 서브유닛(p35 서브유닛)이 다이설파이드(disulfide) 결합에 의해 결합되어 이루어진 75 kDa 분자량을 갖는 헤테로다이머의 사이토카인을 의미한다. IL-12는 대식세포와 같은 항원제시세포에 의해 생성되어 활성화된 T 세포, B 세포 및 NK 세포들의 세포표면의 수용체에 결합한다(Desai, B. B., et al., J. Immunol., 148:3125-3132 (1992); Vogel, L. A., et al., Int. Immunol., 8:1955-1962, (1996)). 상기 IL-12는 ⅰ) T 세포와 NK 세포들의 증식을 촉진하며, ⅱ) T 세포, NK 세포 및 대식세포의 세포독성 효과를 증진시키며, ⅲ) IFN-γ, TNF-α 및 GM-CSF의 생성을 유도하고, ⅳ) Th₁ 세포의 활성화를 유도하는 작용을 한다(Trinchieri, G., et al., Blood, 84:4008-4027 (1994). IL-12는 Th₁ 클론 증식의 중요한 공동자극자인 것으로 알려져 왔고(Kennedy et al., Eur. J. Immunol. 24:2271-2278 (1994)), 혈청중에서 IgG2a 항체의 생성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(Morris, S. C., et al., J. Immunol. 152:1047-1056 (1994); Germann, T. M., et al., Eur. J. Immunol., 25:823-829 (1995); Sher, A., et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 795:202-207 (1996); Buchanan, J. M., et al., Int. Immunol., 7:1519-1528 (1995); Metzger, D. W. et al., Eur. J. Imunol., 27:1958-1965 (1997)). 또한, IL-12를 투여하면 IgG1 항체의 생성을 일시적으로 감소킬 수 있는 것으로 알려져 있는데, 이는 IL-12가 Th₂ 면역 반응을 억제한다는 것을 암시한다(Morris, S. C., et al., J. Immunol. 152:1047-1056 (1994); McKnight, A. J., J. Immunol. 152:2172-2179 (1994); Buchanan, J. M., et al., Int. Immunol., 7:1519-1528 (1995)). IL-12의 클로닝 및 정제는 WO 92/05256, WO 90/05147, 및 EP 322,827 (“CLMF”로 확인됨)에 개시되어 있고, 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. In the present specification, the term “interleukin-12 (IL-12)” refers to a 75 kDa in which a 40 kDa subunit (p40 subunit) and a 35 kDa subunit (p35 subunit) are combined by disulfide bonds. It means the cytokine of the heterodimer which has a molecular weight. IL-12 is produced by antigen presenting cells such as macrophages and binds to receptors on the cell surface of activated T cells, B cells and NK cells (Desai, BB, et al., J. Immunol., 148: 3125). -3132 (1992); Vogel, LA, et al., Int. Immunol. , 8: 1955-1962, (1996)). IL-12 promotes the proliferation of T cells and NK cells, ii) enhances the cytotoxic effects of T cells, NK cells and macrophages, and iii) enhances IFN-γ, TNF-α and GM-CSF. Induces production and iii) induces activation of Th ₁ cells (Trinchieri, G., et al., Blood , 84: 4008-4027 (1994). IL-12 is an important co-factor of Th ₁ clone proliferation) It has been known to be a stimulator (Kennedy et al., Eur. J. Immunol. 24: 2271-2278 (1994)) and is known to increase the production of IgG2a antibodies in serum (Morris, SC, et al., J. Immunol. 152: 1047-1056 (1994); Germann, TM, et al., Eur. J. Immunol. , 25: 823-829 (1995); Sher, A., et al., Ann. NY Acad. Sci , 795: 202-207 (1996); Buchanan, JM, et al., Int. Immunol. , 7: 1519-1528 (1995); Metzger, DW et al., Eur.J. Imunol. , 27: 1958 -1965 (1997)). in addition, the administration of IL-12 also known that can kill it reduces the production of IgG1 antibodies temporarily, which is IL-12 Th ₂ immune Suggests that inhibiting the response (Morris, SC, et al, J. Immunol 152:... 1047-1056 (1994); McKnight, AJ, J. Immunol 152: 2172-2179 (1994); Buchanan, JM, et al., Int. Immunol., 7: 1519-1528 (1995)) Cloning and purification of IL-12 is disclosed in WO 92/05256, WO 90/05147, and EP 322,827 (identified by “CLMF”). The contents of these documents are incorporated herein by reference.

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 IL-12 코딩 뉴클레오타이드 서열을 발현 가능한 형태로 포함함으로써 종양세포에 감염된 후 IL-12를 분비하여 강력한 항종양 면역반응을 유도한다. Recombinant adenoviruses of the present invention include IL-12 coding nucleotide sequences in expressible forms to secrete IL-12 after infection with tumor cells to induce potent anti-tumor immune responses.

본 발명의 재조합 아데노바이러스를 이용하여 IL-12를 효율적으로 발현시키기 위해서는 IL-12의 두 서브유닛, 즉 p35 서브유닛 코딩 뉴클레오타이드 서열과 p40 서브유닛 코딩 뉴클레오타이드 서열을 모두 이용하여 발현 시스템을 구축하여야 한다. 본 발명에서의 용어 “p35 서브유닛” 및 “p40 서브유닛”는 실시예에 예시된 서브유닛 뿐만 아니라, 각각의 서브유닛의 고유의 기능을 할 수 있는 서브유닛의 모든 유사체(analogues)를 포함한다. In order to efficiently express IL-12 using the recombinant adenovirus of the present invention, an expression system must be constructed using both subunits of IL-12, that is, a p35 subunit coding nucleotide sequence and a p40 subunit coding nucleotide sequence. . The terms “p35 subunit” and “p40 subunit” in the present invention include not only the subunits illustrated in the embodiments, but also all analogs of the subunits capable of inherent functions of each subunit. .

본 발명에서 이용될 수 있는 p35 및 p40 서브유닛의 아미노산 서열은 각각 GenBank 접근번호 AAD56385 및 AAD56386에 기재된 서열이다(만일, 마우스 p35 및 p40 서브유닛의 아미노산 서열을 발현하고자 하는 경우에는, 각각 GenBank 접근번호 AAA39292 및 AAA39296 에 기재된 서열을 참조). 본 발명에서 이용될 수 있는 p35 및 p40 서브유닛을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 p35 및 p40 서브유닛의 아미노산 서열을 코딩하는 서열로서, 바람직하게는 각각 GenBank 접근번호 AF180562 및 AF180563에 기재된 서열 중 CDS(coding sequence)에 해당하는 뉴클레오타이드 서열이다(만일, 마우스 p35 및 p40 뉴클레오타이드 서열을 이용하고 하는 경우에는, 각각 GenBank 접근번호 M86672 및 M86671 에 기재된 서열 중 CDS 서열 참조). The amino acid sequences of the p35 and p40 subunits that can be used in the present invention are the sequences described in GenBank accession numbers AAD56385 and AAD56386, respectively (if it is desired to express the amino acid sequences of mouse p35 and p40 subunits, respectively, the GenBank accession numbers See sequences described in AAA39292 and AAA39296). The nucleotide sequence encoding the p35 and p40 subunits that can be used in the present invention is a sequence encoding the amino acid sequence of the p35 and p40 subunits, preferably CDS (coding sequence) among the sequences described in GenBank Accession Nos. AF180562 and AF180563, respectively. nucleotide sequence (if the mouse p35 and p40 nucleotide sequences are used, see CDS sequence among the sequences described in GenBank Accession Nos. M86672 and M86671, respectively).

본 발명의 명세서에서 용어 “4-1BB"는 인간 TNF 수용체 수퍼-패밀리(super family)의 일원으로서, 세포, 특히 자극된 인간 주변 혈액 림프구의 표면에서 발현되는 단백질을 의미한다. 뮤린 (murine) 4-1BB를 헬퍼(helper), 서프레서(suppressor) 및 세포살상(cytolytic) T 림프구를 포함하는 세포 타입에서 발현시킨 것이 보고되었으며(B.S. Kwon et al. PNAS 86:1963-1967, Mar. 1989; B.S. Kwon et al. , PNAS 84:2896-2900, May 1987), 4-1BB는 마우스의 뇌 조직에서도 발견되었다. As used herein, the term “4-1BB” is a member of the human TNF receptor super-family and refers to proteins expressed on the surface of cells, especially stimulated human peripheral blood lymphocytes. Expression of -1BB in cell types including helper, suppressor and cytolytic T lymphocytes has been reported (BS Kwon et al. PNAS) 86: 1963-1967, Mar. 1989; BS Kwon et al. , PNAS 84: 2896-2900, May 1987), 4-1BB was also found in the brain tissue of mice.

본 명세서에서 용어 “4-1BBL(4-1BB ligand)"는 4-1BB에 결합할 수 있는 포유동물 폴리펩타이드를 의미한다. 4-1BBL은 폴리펩타이드의 N-말단에서 세포내(cytoplasmic) 도메인을 갖고, 이 도메인에 이어서 막투과(transmembrane) 부위를 가지며, 폴리펩타이드의 C-말단에는 세포외(수용체-결합) 도메인을 갖는 타입 Ⅱ 세포외 막 폴리펩타이드이다. 가용성(soluble) 4-1BBL 폴리펩타이드들이 세포 외 도메인으로부터 유래될 수 있다. 4-1BB 리간드가 4-1BB에 결합하게 되면 수용체를 갖는 세포에서 생물학적 신호의 전달을 개시하게 된다. 최근 연구결과에 의하면 상기 4-1BB 및 4-1BBL은 T 세포의 활성화, 분화 및 증식을 유도하며, 상기 4-1BBL은 수지상세포의 활성자로서도 작용한다고 알려져 있다. As used herein, the term “4-1BBL (4-1BB ligand)” means a mammalian polypeptide capable of binding to 4-1BB. 4-1BBL refers to a cytoplasmic domain at the N-terminus of the polypeptide. It is a type II extracellular membrane polypeptide which has a transmembrane site following this domain and has an extracellular (receptor-binding) domain at the C-terminus of the polypeptide. When the 4-1BB ligand binds to 4-1BB, it initiates the transmission of biological signals in cells bearing the receptor.The recent studies show that 4-1BB and 4-1BBL It induces the activation, differentiation and proliferation of T cells, and the 4-1BBL is known to act as an activator of dendritic cells.

본 발명에서 “4-1BB” 및 “4-1BBL” 은 전장(full length) “4-1BB” 및 “4-1BBL”폴리펩타이드 뿐만 아니라 생물학적 활성을 갖는 이들의 단편 또는 변이체를 포함한다. 4-1BBL의 세포외 도메인 또는 이들의 수용체 결합 단편을 포함하는 가용성 폴리펩타이드들도 생물학적 활성을 갖는다면 본 발명의 “4-1BB” 및 “4-1BBL”폴리펩타이드 범위에 포함된다. 상기 “4-1BB” 및 “4-1BBL”폴리펩타이드에 관한 상세한 설명은 미국특허 제 5,674,704호, 미국특허 제 7,211,259호 및 문헌 Alderson et al. Eur . J. Immunol . 24:2219-2227, 1994.에 개시되어 있는 바, 이들 내용은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. In the present invention, “4-1BB” and “4-1BBL” include full length “4-1BB” and “4-1BBL” polypeptides as well as fragments or variants thereof having biological activity. Soluble polypeptides, including the extracellular domain of 4-1BBL or receptor binding fragments thereof, are also within the scope of the “4-1BB” and “4-1BBL” polypeptides of the present invention as long as they have biological activity. Detailed descriptions of the “4-1BB” and “4-1BBL” polypeptides are provided in US Pat. No. 5,674,704, US Pat. No. 7,211,259, and in Alderson et al. Eur . J. Immunol . 24: 2219-2227, 1994. The contents of which are incorporated herein by reference.

본 발명에서 이용될 수 있는 4-1BBL의 아미노산 서열은 GenBank 접근번호 AAA53134 에 기재된 서열이다(만일, 마우스 4-1BBL의 아미노산 서열을 발현하고자 하는 경우에는, GenBank 접근번호 AAA39435 에 기재된 서열을 참조한다). 본 발명에서 이용될 수 있는 4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 4-1BBL의 아미노산 서열을 코딩하는 서열로서, 바람직하게는 GenBank 접근번호 U03398 에 기재된 서열 중 CDS(coding sequence)에 해당하는 뉴클레오타이드 서열이다(만일, 마우스 4-1BBL의 뉴클레오타이드 서열을 이용하고 하는 경우에는, GenBank 접근번호 L15435 에 기재된 서열 중 CDS 서열을 참조한다). The amino acid sequence of 4-1BBL that can be used in the present invention is the sequence described in GenBank Accession No. AAA53134 (if the expression is to express the amino acid sequence of mouse 4-1BBL, refer to the sequence described in GenBank Accession No. AAA39435). . The nucleotide sequence encoding the 4-1BBL that can be used in the present invention is a sequence encoding the amino acid sequence of the 4-1BBL, preferably the nucleotide sequence corresponding to the CDS (coding sequence) of the sequence described in GenBank Accession Number U03398 (If the nucleotide sequence of mouse 4-1BBL is used, refer to the CDS sequence in the sequence described in GenBank Accession No. L15435).

본 발명의 재조합 아데노바이러스는 4-1BBL 코딩 뉴클레오타이드 서열을 발현 가능한 형태로 포함함으로써, 종양세포에 감염된 후 4-1BBL을 분비하여 T 세포의 증식, 분화, 활성화를 유도하며, 병합치료로서 투여되는 수지상 세포의 활성화를 유도하는 작용을 한다.The recombinant adenovirus of the present invention comprises a 4-1BBL coding nucleotide sequence in a form capable of expression, thereby secreting 4-1BBL after infection with tumor cells, inducing proliferation, differentiation and activation of T cells, and being administered as a combination therapy. Induces cell activation.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 IL-12 및 4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 IL-12 및 4-1BBL를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 발현 가능한 형태로 동시에 포함함으로써 종양세포에 감염된 후 항종양 효과를 현저하게 증대시킬 수 있다. According to a preferred embodiment of the invention, the recombinant adenovirus of the invention is characterized in that it comprises nucleotide sequences encoding IL-12 and 4-1BBL. Recombinant adenovirus of the present invention can include a nucleotide sequence encoding IL-12 and 4-1BBL at the same time in an expressible form to significantly increase the anti-tumor effect after infection with tumor cells.

본 발명에서 IL-12 또는 4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 재조합 아데노바이러스 지놈에 삽입된다. In the present invention, the nucleotide sequence encoding IL-12 or 4-1BBL is inserted into the recombinant adenovirus genome.

종양을 대상으로 유전자 치료를 시행하는 경우에는 일생동안 치료 유전자의 발현을 지속시킬 필요가 없고, 국소 투여할 경우에 아데노바이러스에 의한 면역반응이 크게 문제시 되지 않거나, 오히려 장점이 될 수 있기 때문에 아데노바이러스를 이용한 암유전자 치료제 개발 연구가 활발하게 이루어지고 있다. Gene therapy in tumors does not require a sustained expression of the gene for life, and topical administration does not significantly affect the immune response caused by adenovirus, or may be an advantage. Research into the development of cancer gene therapy using viruses has been actively conducted.

본 발명에서도 기본적으로 아데노바이러스의 지놈 골격을 이용하여 종양의 유전자 치료를 달성하고 있다. 아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트 이다. 지놈의 E1 영역 (E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역 (E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다. 아데노바이러스 지놈의 작은 부분만이 cis에서 필요한 것으로 알려져 있기 때문에 (Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1981)), 아네노바이러스는 대량의 외래 DNA 분자를 운반할 수 있는 능력이 있다. In the present invention, gene therapy of tumors is basically achieved using the genome skeleton of adenovirus. Adenoviruses are widely used as gene transfer vectors because of their medium genome size, ease of manipulation, high titers, wide range of target cells and excellent infectivity. Both ends of the genome contain 100-200 bp of Inverted Terminal Repeat (ITR), which is an essential cis element for DNA replication and packaging. The genome El region (E1A and E1B) encodes proteins that regulate transcription and transcription of host cell genes. The E2 regions (E2A and E2B) encode proteins that are involved in viral DNA replication. Because only a small part of the adenovirus genome is known to be required in cis (Tooza, J. Molecular biology of DNA Tumor viruses , 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1981)), anenoviruses are capable of carrying large quantities of foreign DNA molecules.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 지놈은 E1 영역 및 E3 영역이 결실된 것이고, 더욱 바람직하게는 E1 영역에서 E1B 영역이 결실되고 E1A 영역의 Rb(retino blastoma) 단백질 결합부위가 결실된 것이다. According to a preferred embodiment of the present invention, the genome of the recombinant adenovirus of the present invention is the deletion of the E1 region and the E3 region, more preferably, the E1B region is deleted in the E1 region and the retino blastoma (Rb) protein binding of the E1A region The site is deleted.

본 발명에서 세포내로 운반하고자 하는 IL-12 또는 4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 결실된 E1 영역 (E1A 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 따르면, 상기 IL-12 코딩 뉴클레오타이드 서열은 아데노바이러스의 E1 영역에 삽입되고, 상기 4-1BBL 코딩 뉴클레오타이드 서열은 아데노바이러스의 E3 영역에 삽입된다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어 “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다. In the present invention, the nucleotide sequence encoding the IL-12 or 4-1BBL to be delivered into the cell is preferably inserted into the deleted E1 region (E1A and / or E1B region, preferably E1B region) or E3 region. According to the most preferred embodiment of the present invention, the IL-12 coding nucleotide sequence is inserted into the E1 region of the adenovirus, and the 4-1BBL coding nucleotide sequence is inserted into the E3 region of the adenovirus. As used herein, the term “deletions” as used in reference to viral genome sequences has the meaning including not only those sequences that are completely deleted, but also those that are partially deleted.

본 발명의 IL-12 또는 4-1BBL 를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트 (expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. The nucleotide sequence encoding the IL-12 or 4-1BBL of the present invention is preferably present in a suitable expression construct.

본 명세서에서 사용되는 용어 “발현 컨스트럭트”는 발현 목적의 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열의 발현을 유도하는 발현서열(예컨대, 프로모터)을 포함하는 발현을 위한 최소한의 엘리먼트(elements)를 의미한다. 이러한 발현 컨스트럭트는 바람직하게는, 전사조절 서열-발현 목적의 뉴클레오타이드 서열-폴리아데닐화 서열을 포함한다. 본 발명에서, IL-12 또는 4-1BBL을 코딩하는 서열들의 발현을 개별적인 발현 컨스트럭트에서 이루어지도록 벡터를 제작할 수 있다. 예를 들어, “진핵세포에서 작동가능한 프로모터 - IL-12 코딩 뉴클레오타이드서열 - 폴리아데닐화 서열”, “진핵세포에서 작동가능한 프로모터 - 4-1BBL 코딩 뉴클레오타이드서열 - 폴리아데닐화 서열”의 발현 컨스트럭트를 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제작할 수 있다. As used herein, the term “expression construct” refers to minimal elements for expression, including a nucleotide sequence for expression purposes and an expression sequence (eg, a promoter) that directs expression of the sequence. Such expression constructs preferably comprise nucleotide sequence-polyadenylation sequences for transcriptional regulatory sequence-expression purposes. In the present invention, vectors can be constructed so that expression of the sequences encoding IL-12 or 4-1BBL is done in separate expression constructs. For example, the expression constructs of "promoter operable in eukaryotic cells-IL-12 coding nucleotide sequence-polyadenylation sequence", "promoter operable in eukaryotic cells-4-1BBL coding nucleotide sequence-polyadenylation sequence" It can be produced a recombinant adenovirus vector comprising a.

본 명세서에서 용어 “진핵세포에서 작동 가능한 프로모터”는 진핵세포에서 목적 유전자의 전사를 유발할 수 있는 전사 조절 서열을 의미한다. 각각의 서브유닛 코딩 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 결합되어 있다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. As used herein, the term “promoter operable in eukaryotic cells” means a transcriptional regulatory sequence capable of inducing transcription of a gene of interest in eukaryotic cells. Each subunit coding nucleotide sequence is operably linked to a promoter. As used herein, the term “operably linked” refers to a functional binding between a nucleic acid expression control sequence (eg, an array of promoters, signal sequences, or transcriptional regulator binding sites) and other nucleic acid sequences, thereby The regulatory sequence will control the transcription and / or translation of said other nucleic acid sequence.

본 발명에 있어서, IL-12 또는 4-1BBL 코딩 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 IL-12 또는 4-1BBL 코딩 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절할 수 있는 것으로 서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 유도성 (inducible) 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA 프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, CMV 프로모터이다. In the present invention, a promoter linked to an IL-12 or 4-1BBL coding nucleotide sequence is preferably operated in an animal cell, more preferably a mammalian cell to facilitate transcription of the IL-12 or 4-1BBL coding nucleotide sequence. As modulators, these include promoters derived from mammalian viruses and promoters derived from genomes of mammalian cells, such as, for example, the U6 promoter, the H1 promoter, the cytomegalo virus (CMV) promoter, the adenovirus late promoter, the vaccinia virus. 7.5K promoter, SV40 promoter, HSV tk Promoter, RSV promoter, EF1 alpha promoter, metallothionine promoter, beta-actin promoter, promoter of human IL-2 gene, promoter of human IFN gene, promoter of human IL-4 gene, promoter of human lymphotoxin gene, human Promoter, inducible promoter, cancer cell specific promoter (e.g., TERT promoter, PSA promoter, PSMA promoter, CEA promoter, E2F promoter and AFP promoter) of GM-CSF gene and tissue specific promoter (e.g. albumin promoter) It includes, but is not limited to. Most preferably, it is a CMV promoter.

본 발명의 재조합 아데노바이러스의 기본 골격의 유전자 지도 및 IL-12 및/또는 4-1BBL을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스의 유전자 지도는 도 1a - 도 1i에 상세히 개시되어 있다. 도 1a는 본 발명의 재조합 아데노바이러스(Ad-ΔB7) 기본 골격 유전자를 나타낸다. 도 1b는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영역에 4-1BBL 유전자가 삽입된 유전자 지도를 나타내며, 도 1c는 재조합 아데노바이러스 E3 영역에 4-1BBL 유전자가 삽입된 것을 나타낸다. 도 1d는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영역에 IL-12 유전자가 삽입된 유전자 지도를 나타내며, 도 1e는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E3 영역에 IL-12 유전자가 삽입된 것을 나타낸다. 도 1f는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영 역에 IL-12 유전자가, E3 영역에 4-1BBL 유전자가 각각 삽입된 것을 나타낸다. 도 1g는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영역에 4-1BBL 유전자가, E3 영역에 IL-12 유전자가 삽입된 것을 나타낸다. 도 1h 및 도 1i는 E1A 유전자에 돌연변이를 갖지 않는 재조합 아데노바이러스 기본 골격에 IL-12 유전자 및 4-1BBL 유전자가 E1B 영역 또는 E3 영역에 삽입된 재조합 아데노바이러스의 유전자 지도를 나타낸다. Gene maps of the basic backbone of the recombinant adenovirus of the present invention and genetic maps of recombinant adenoviruses comprising nucleotide sequences encoding IL-12 and / or 4-1BBL are detailed in FIGS. 1A-1I. 1A shows the recombinant adenovirus (Ad-ΔB7) basic skeletal gene of the present invention. FIG. 1B shows a gene map in which a 4-1BBL gene is inserted into a recombinant adenovirus E1B region of the present invention, and FIG. 1C shows a 4-1BBL gene inserted into a recombinant adenovirus E3 region. 1D shows a gene map in which an IL-12 gene is inserted into a recombinant adenovirus E1B region of the present invention, and FIG. 1E shows an IL-12 gene inserted into a recombinant adenovirus E3 region of the present invention. 1F shows that the IL-12 gene is inserted into the recombinant adenovirus E1B region of the present invention and the 4-1BBL gene is inserted into the E3 region, respectively. 1G shows that the 4-1BBL gene is inserted into the recombinant adenovirus E1B region of the present invention and the IL-12 gene is inserted into the E3 region. 1H and 1I show gene maps of recombinant adenoviruses in which the IL-12 gene and the 4-1BBL gene are inserted into the E1B region or the E3 region in a recombinant adenovirus basic skeleton having no mutation in the E1A gene.

본 발명의 명세서에서 용어 “수지상세포”는 MHC (major histocompatibility complex) 를 통하여 T 세포에 항원을 제시할 수 있는 세포를 의미한다. 수지상세포는 성숙도 정도에 따라, 미성숙 수지상세포(immature dendritic cells) 및 성숙 수지상세포(mature dendritic cells)로 나뉜다. “미성숙 수지상세포”는 다양한 전구세포로부터 분화 유도되어 형성된 수지상세포로서, 하기의 성숙 수지상세포의 표면 형질(surface phenotypes) 중 CD80 또는 CD86 등의 공동자극분자(costimulatory molecule)의 발현이 낮은 수지상세포를 의미한다. “성숙 수지상세포”는 미성숙 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미하며, 다음과 같은 표면 형질들 중 적어도 하나 이상을 나타내는 세포를 의미한다: 감소된 CD115, CD14 또는 CD68의 발현; 및 증가된 CD11c, CD80, CD86, CD40, MHC 클래스 Ⅱ, p55 및 CD83의 발현. As used herein, the term “dendritic cell” refers to a cell capable of presenting an antigen to T cells through a major histocompatibility complex (MHC). Dendritic cells are divided into immature dendritic cells and mature dendritic cells, depending on the degree of maturity. "Immature dendritic cells" are dendritic cells formed by differentiation from various progenitor cells. Dendritic cells having low expression of costimulatory molecules such as CD80 or CD86 among the surface phenotypes of the mature dendritic cells are shown below. it means. “Mature dendritic cells” means cells formed by maturation of immature dendritic cells, and refers to cells that exhibit at least one or more of the following surface traits: reduced expression of CD115, CD14 or CD68; And increased expression of CD11c, CD80, CD86, CD40, MHC class II, p55 and CD83.

이러한 표면 마커의 발현 프로파일링은 당업계에 공지된 유세포 분석을 통하여 용이하게 할 수 있다. 미성숙 수지상세포의 분리 및 배양 방법은 미국특허 제5,994,126호 및 PCT 출원 WO 97/29182호에 개시되어 있고, 관련 문헌의 전체 내용 은 참조로서 본 명세서에 삽입된다. Expression profiling of such surface markers can be facilitated via flow cytometry known in the art. Methods for isolating and culturing immature dendritic cells are disclosed in US Pat. No. 5,994,126 and PCT Application WO 97/29182, the entire contents of which are incorporated herein by reference.

미성숙 수지상세포의 소스는 미성숙 수지상세포 또는 증식 가능한 이들의 원조(progenitor)를 포함하는 조직 소스이며, 구체적으로 비장, 어패런트(afferent) 림프, 골수, 혈액, 및 G-CSF 또는 FLT-3 리간드와 같은 사이토카인을 투여하여 유도된 혈액 세포를 포함한다. The source of immature dendritic cells is a tissue source comprising immature dendritic cells or progenitors thereof, specifically the spleen, the parent lymph, bone marrow, blood, and G-CSF or FLT-3 ligands. Blood cells derived from administration of the same cytokine.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 다른 세포 타입에 대한 수지상세포 전구세포의 비율을 증가시키기 위해서, 조직 소스를 배양 전에 예를 들어 G-CSF, FLT-3, GM-CSF, M-CSF, TGF-β 및 트롬보포이에틴과 같은 자극 물질로 처리할 수 있다. 상기와 같이 처리하면 수지상세포의 원조세포들과 경쟁하여 증식을 방해하는 세포들을 제거할 수 있다. 상기 전처리에 의해 조직 소스가 인 비트로 배양에 더욱 적합하게 될 수 있다. 전처리 방법은 특정 조직 소스에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 비장 또는 골수를 본 명세서에서 참조로서 삽입되는 미국특허 제5,851,756호 및 제5,994,126호에 개시된 방법과 같은 적합한 방법에 의해 단일 세포를 얻기 위해 처리한다. 혈액에서 독성이 있는 적혈구를 포함하는 다른 세포 타입들로부터 세포 분리 방법을 이용하여 백혈구를 분리한다. 상기 적혈구를 제거하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 조직 소스는 혈액 또는 골수이다. According to one embodiment of the invention, in order to increase the ratio of dendritic cell progenitors to other cell types, for example G-CSF, FLT-3, GM-CSF, M-CSF, TGF prior to culturing the tissue source treatment with irritants such as -β and thrombopoietin. Treatment as described above can remove cells that interfere with proliferation by competing with the original cells of the dendritic cells. The pretreatment can make the tissue source more suitable for in vitro culture. Pretreatment methods may vary depending on the particular tissue source. For example, the spleen or bone marrow is treated to obtain a single cell by a suitable method, such as the methods disclosed in US Pat. Nos. 5,851,756 and 5,994,126, which are incorporated herein by reference. White blood cells are isolated using cell separation methods from other cell types, including toxic red blood cells in the blood. Methods of removing the red blood cells are known in the art. The tissue source is blood or bone marrow.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 미성숙 수지상세포는 PCT 국제출원 WO 97/29182호에 개시된 바와 같이 혈액의 다능성 단핵세포 전구세포로부터 유도될 수 있다. 이들 다능성 세포들은 CD14, CD32, CD68 및 CD115 단핵세포 마커를 발현하고, CD83, p55, CD40 및 CD86는 거의 발현하지 않는다. 다능성 세포를 사이토카 인 GM-CSF와 IL-4 또는 IL-13의 존재 하에 배양하여 미성숙 수지상 세포를 유도한다. 미성숙 수지상세포를 인 비트로 또는 인 비보에서 미성숙한 상태로 유지하기 위해서 변형시킬 수 있는데, 예를 들어 IL-10을 발현하는 벡터를 사용할 수 있다. 당업자는 미성숙 수지상세포를 분리하고 이들을 미성숙의 상태에서 유지하기 위한 공지된 방법에 변형을 가할 수 있다. According to another embodiment of the invention, immature dendritic cells can be derived from pluripotent mononuclear progenitor cells of blood as disclosed in PCT International Application WO 97/29182. These pluripotent cells express CD14, CD32, CD68 and CD115 monocyte markers and rarely express CD83, p55, CD40 and CD86. Pluripotent cells are cultured in the presence of the cytokine GM-CSF and IL-4 or IL-13 to induce immature dendritic cells. Immature dendritic cells can be modified to remain immature in vitro or in vivo, for example using a vector expressing IL-10. One skilled in the art can make modifications to known methods for isolating immature dendritic cells and maintaining them in an immature state.

상기한 바와 같이, 적합한 조직 소스로부터 세포를 얻은 다음, 이 세포를 적합한 지지체(substrate)에서 배지(바람직하게는, GM-CSF로 보충된 배지)를 이용하여 일차 배양(primary culture)한다. 전능성 세포 또는 다능성 세포로부터 미성숙 수지상세포로의 분화를 촉진하는 물질, 특히 GM-CSF는 미국특허 제5,851,756호 및 제5,994,126호에 개시되어 있으며, 이들 내용은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 상기 기판은 바람직하게는 세포가 부착할 수 있는 기판을 포함하며, 바람직하게는 조직 배양에 사용되는 플라스틱이다. As noted above, cells are obtained from a suitable tissue source and then primary cells are cultured in a suitable substrate using a medium (preferably medium supplemented with GM-CSF). Substances that promote differentiation from pluripotent or pluripotent cells to immature dendritic cells, in particular GM-CSF, are disclosed in US Pat. Nos. 5,851,756 and 5,994,126, the contents of which are incorporated herein by reference. The substrate preferably comprises a substrate to which cells can attach, preferably a plastic used for tissue culture.

미성숙 수지상세포의 수율을 증가시키기 위해, GM-CSF 이외에, 비-수지상세포 타입의 증식을 막거나 억제하는 인자들을 배양배지에 첨가할 수 있다. 상기 인자들은, 예를 들어 대식세포를 억제하는 IL-4 및/또는 IL-13를 포함한다. 상기 인자들은 수지상세포 전구세포들의 증식을 촉진하는 반면 비-수지상세포 타입의 성장을 억제함으로써 배지에서 미성숙 수지상세포의 수를 증가시킨다. In order to increase the yield of immature dendritic cells, in addition to GM-CSF, factors that prevent or inhibit the proliferation of non-dendritic cell types can be added to the culture medium. Such factors include, for example, IL-4 and / or IL-13 which inhibit macrophages. These factors promote the proliferation of dendritic cell progenitors while increasing the number of immature dendritic cells in the medium by inhibiting the growth of non-dendritic cell types.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 단핵세포를 플라스틱 조직 배양 플레이트에 플레이팅하여 부착시킴으로써 혈액의 단핵세포 전구세포로부터 미성숙 수지상세포를 생성시킬 수 있다. 미성숙 수지상세포의 파퓰레이션을 증가시키기 위해서 플라 스틱 부착 세포들을 GM-CSF 및 IL-4의 존재 하에서 배양한다. IL-4 대신에 IL-13과 같은 다른 사이토카인을 사용할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, immature dendritic cells can be generated from mononuclear progenitor cells of blood by attaching mononuclear cells to a plastic tissue culture plate. Plastic adherent cells are cultured in the presence of GM-CSF and IL-4 to increase the population of immature dendritic cells. Instead of IL-4, other cytokines such as IL-13 can be used.

상기 미성숙 수지상세포를 얻기 위한 과정에서 이용되는 배지로는, 동물세포의 배양에 이용되는 일반적인 어떠한 배지도 이용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈(예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat . New Biol . 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp . Med . 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc . Soc . Exp . Bio. Med . 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer . Med . Assoc . 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp . Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항산화제(예컨대, β-머캅토에탄올)가 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으 며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. As a medium used in the process for obtaining the immature dendritic cells, any medium commonly used for culturing animal cells can be used. Preferably, the medium contains serum (eg fetal calf serum, horse serum and human serum). Medium that may be used in the present invention is, for example, RPMI series (e.g., RPMI 1640), Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130: 432 (1959)), α-MEM (Stanner, CP et al., Nat . New Biol . 230: 52 (1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al, J. Exp Med 147:... 923 (1978).....), 199 medium (Morgan et al, Proc Soc Exp Bio Med . 73: 1 (1950)) , CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al, J. Amer Med Assoc 199:.... 519 (1967)....), F12 (Ham, Proc Natl Acad Sci USA 53 : 288 (1965)), F10 (Ham, RG Exp . Cell Res. 29: 515 (1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8: 396 (1959)), A mixture of DMEM and F12 (Barnes, D. et al., Anal . Biochem . 102: 255 (1980)), Way-mouth's MB752 / 1 (Waymouth, C. J. Natl . Cancer Inst . 22: 1003 (1959)), McCoy's 5A (McCoy, TA, et al., Proc . Soc . Exp . Biol . Med . 100: 115 (1959)) and the MCDB series (Ham, RG et al., In Vitro 14). : 11 (1978)), but is not limited to such. The medium may contain other components, such as antioxidants (eg β-mercaptoethanol). For a general description of medium and culture, see R. Ian Freshney, Culture. of Animal Cells , Alan R. Liss, Inc., New York (1984), which is incorporated herein by reference.

본 발명의 성숙 수지상세포는 상기 미성숙 수지상세포를 적합한 활성화 인자의 존재하에서 배양함으로써 얻는다. 일반적으로 어떠한 소스로부터 얻어진 미성숙 수지상세포라 하여도, 단핵세포-유래 사이토카인(monocyte-derived cytokines), 리포폴리사카라이드(lipopolysacharide), 및 CpG 반복서열을 포함하는 DNA, TNF-α, IL-6, IFN-α, IL-1β와 같은 사이토카인, 괴저성 세포(necrotic cell), readherence, 전체 세균(whole bacteria), 막성분(membrane components), RNA 또는 polyI:C (polyinosinic-polycytidylic acid)와 같은 활성화 인자의 존재 하에서 배양하면 미성숙 수지상세포가 활성화 된다 (Clark, R. B. (2002). J Leukoc Biol, 71, 388-400; Hacker, G., Redecke, V. & Hacker, H. (2002). Immunology 105, 245-251; Kaisho, T. & Akira, S. (2002). Biochim Biophys Acta 1589, 1-13; Koski, G. K., Lyakh, L. A., Cohen, P. A. & Rice, N. R. (2001). Crit Rev Immunol 21, 179-189). 또한, 이러한 수지상세포의 활성화는 NF-κB 억제자가 존재하면 억제된다(O'Sullivan, B. J., and Thomas, R. (2002). CD40 Ligation conditions dendritic cell antigen-presenting function through sustained activation of NF-kappaB, J Immunol 168, 5491-5498.). 성숙 수지상세포들은 예컨대, CD83, DC-LAMP, p55, CCR-7 표면 마커의 발현, 그리고 MHC 클래스 Ⅱ와 공동자극분자(costimulatory molecules), 예컨대 CD86의 고발현을 나타낸다. 상기한 마커 또는 마커에 대한 항체를 이용하여 당업계에 공지된 방법에 따라 미성숙 수지상세포를 확인할 수 있다. 또한, 항체를 이용하여 당업계에서 공지된 유세포 분석법 또는 다른 세포 분류(sorting) 방법에 따라 혼합된 세포 배양으로부터 미성숙 수지상세포를 분리 또는 정제할 수 있다. Mature dendritic cells of the present invention are obtained by culturing the immature dendritic cells in the presence of a suitable activating factor. In general, immature dendritic cells obtained from any source, including DNA, TNF-α, IL-6, including mononuclear cell-derived cytokines, lipopolysaccharides, and CpG repeats Activation such as cytokines such as IFN-α, IL-1β, necrotic cells, readherence, whole bacteria, membrane components, RNA or polyI: C (polyinosinic-polycytidylic acid) Culture in the presence of a factor activates immature dendritic cells (Clark, RB (2002). J Leukoc Biol , 71, 388-400; Hacker, G., Redecke, V. & Hacker, H. (2002). Immunology 105, 245-251; Kaisho, T. & Akira, S. (2002). Biochim Biophys Acta 1589, 1-13; Koski, GK, Lyakh, LA, Cohen, PA & Rice, NR (2001). Crit rev Immunol 21, 179-189). In addition, activation of these dendritic cells is inhibited in the presence of NF-κB inhibitors (O'Sullivan, BJ, and Thomas, R. (2002). CD40 Ligation conditions dendritic cell antigen-presenting function through sustained activation of NF-kappaB, J Immunol 168, 5491-5498.). Mature dendritic cells exhibit, for example, the expression of CD83, DC-LAMP, p55, CCR-7 surface markers, and high expression of MHC class II and costimulatory molecules such as CD86. Immature dendritic cells can be identified according to methods known in the art using the markers or antibodies to the markers described above. The antibody can also be used to isolate or purify immature dendritic cells from the mixed cell culture according to flow cytometry or other cell sorting methods known in the art.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면 활성화 인자로서 리포폴리사카라이드(LPS, Lipopolysaccharide) 존재하에서 미성숙 수지상세포를 배양함으로써 성숙 수지상세포를 얻는다. According to a specific embodiment of the present invention, mature dendritic cells are obtained by culturing immature dendritic cells in the presence of lipopolysaccharide (LPS) as an activating factor.

본 발명에서 미성숙 수지상세포로부터 성숙을 유도하여 성숙 수지상세포를 얻는데 사용하는 배지는 상기 미성숙 수지상세포의 분리 및 배양에 사용한 배지를 사용할 수 있다. In the present invention, as a medium used to induce maturation from immature dendritic cells to obtain mature dendritic cells, a medium used for isolation and culture of the immature dendritic cells can be used.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 성숙 수지상세포는 암 항원의 존재 하에 성숙을 유도하여 얻는다. According to a preferred embodiment of the invention, the mature dendritic cells of the invention are obtained by inducing maturation in the presence of cancer antigens.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 의하면, 본 발명에서 암 항원은 암 세포를 동결-융해(freezing-thawing) 과정을 행한 후에 암 세포로부터 얻어지는 총 단백질을 사용한다. According to one specific embodiment of the present invention, the cancer antigen in the present invention uses a total protein obtained from cancer cells after freezing-thawing the cancer cells.

본 발명의 암 항원의 존재하에 미성숙 수지상세포를 배양하면, 미성숙 수지상세포가 암 항원과 접촉하게 되고, 암 항원을 세포내로 받아들이며, 이를 처리(processing)한 후 MHC 분자와 결합시켜 수지상 세포 표면에서 T 세포에 이를 제시(presenting)한다. 암 항원이 세포 표면에 제시된 수지상 세포와 T 세포가 접촉하게 되면 T 세포는 암 항원에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 능력을 획득한다. 따라서, 본 발명의 특정 암 항원의 존재하에서 배양되어 성숙 유도된 수지상세포는 특정 암 또는 종양에 대한 면역반응 유도 능력이 현저하게 증가되어 우수한 종양 성장 억제 효능을 갖게 된다. When the immature dendritic cells are cultured in the presence of the cancer antigen of the present invention, the immature dendritic cells are brought into contact with the cancer antigens, the cancer antigens are taken into the cell, processed, and then combined with the MHC molecules to form T at the dendritic cell surface. Present it to the cell. When the cancer antigen comes in contact with dendritic cells present on the cell surface, the T cells acquire the ability to induce an immune response against the cancer antigen. Thus, dendritic cells cultured in the presence of certain cancer antigens of the present invention to mature induce a significant increase in the ability to induce an immune response to a particular cancer or tumor has excellent tumor growth inhibitory effect.

상기 암 항원은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암을 예를 들 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 암 항원은 바람직하게는 뇌암, 폐암 또는 피부암으로부터 유래된 것이다. The cancer antigens include gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer or ureter cancer. It may include, but is not limited to. In the present invention, the cancer antigen is preferably derived from brain cancer, lung cancer or skin cancer.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다. Pharmaceutically acceptable carriers included in the pharmaceutical compositions of the present invention are those commonly used in the preparation, such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, Calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like It doesn't happen. In addition to the above components, the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like. Suitable pharmaceutically acceptable carriers and agents are Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있고, 피부를 통한 국소 투여(경피 투여) 또는 피하 주입이 바람직하며, 피하주입이 가장 바람직하다. The pharmaceutical compositions of the present invention may be administered parenterally, with topical administration (dermal administration) or subcutaneous injection through the skin being preferred, with subcutaneous injection being most preferred.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학 적 조성물의 경구 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-100 mg/kg(체중)이다. Suitable dosages of the pharmaceutical compositions of the present invention may vary depending on factors such as the formulation method, mode of administration, age, weight, sex, morbidity, condition of food, time of administration, route of administration, rate of excretion and response to response of the patient. Can be. On the other hand, the oral dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 0.001-100 mg / kg (body weight) per day.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. The pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in unit dose form by formulating with a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to methods which can be easily carried out by those skilled in the art. Or may be prepared by incorporation into a multi-dose container. In this case, the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in an oil or an aqueous medium, or may be in the form of extracts, powders, granules, tablets or capsules, and may further include a dispersant or stabilizer.

본 발명은 종양 선택적 살상 재조합 아데노바이러스와 수지상 세포를 병합하여 치료하는 종양성장 억제용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 종양 선택적 살상가능 재조합 아데노바이러스와 항종양 면역반응 유도능력을 획득한 수지상세포를 병합하여 사용함으로써 종양의 성장 및 전이 억제 효과를 극대화 할 수 있다. The present invention relates to a pharmaceutical composition for inhibiting tumor growth, which treats a combination of tumor selective killing adenovirus and dendritic cells. The pharmaceutical composition of the present invention can maximize the tumor growth and metastasis inhibitory effect by using a combination of tumor selective killable recombinant adenovirus and dendritic cells obtained the ability to induce anti-tumor immune response.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예Example

실험 재료 및 실험 방법Experimental Materials and Experimental Methods

1. 대상세포주 및 세포배양 Target cell line and cell culture

실험에 사용된 세포주로는 아데노바이러스의 E1이 변형된 인체 배아 신장세포주 (HEK293), 인간 뇌암 세포주 (U343), 폐암 세포주 A549, 마우스 피부 섬유아세포주 (Mus Dunni), 마우스 흑색종 세포주 B16BL6, B16-F10 등이다. B16BL6는 한국 서울대 세포주은행에서 구입하였고, 그 외의 모든 세포주는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입하였다. 대부분 세포주는 10 ％의 우태아혈청(GIBCO, Grand Island, NY)을 포함하는 DMEM (Invitrogen, NY, USA) 배지에 배양하고, B16BL6 세포주는 1 x 의 MEM 비타민 용액(Invitrogen)이 함유된 10 ％ MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen)에 배양하였다. 모든 세포의 배지에는 2 mM의 L-글루타민 100 IU/㎖ (Invitrogen); 페니실린/스트렙토마이신 100 ㎍/㎖ (Invitrogen); 젠타마이신 설페이트(Duchefa, Netherlands)를 15 ㎍/㎖되게 첨가하여 사용하였다. 수지상세포의 분화와 배양에 사용한 10 ％ RPMI 1640에는 50 μM이 되게 β-메르캅토에탄올을 첨가하였고, 재조합 마우스 인터루킨-4 (Endogene, Rockford, USA)를 0.02 ㎍/㎖, 재조합 마우스 Granulocyte and Monocyte-Colony Stimulating Factor (rmGM-CSF, Endogene)를 0.004 ㎍/㎖ 첨가하였다(R10 라고 부른다). The cell lines used in the experiments were human embryonic kidney cell line (HEK293), human brain cancer cell line (U343), lung cancer cell line A549, mouse skin fibroblast cell line (Mus Dunni), mouse melanoma cell line B16BL6 modified with adenovirus E1. -F10 and so on. B16BL6 was purchased from Seoul National University Cell Line Bank and all other cell lines were purchased from American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Most cell lines were cultured in DMEM (Invitrogen, NY, USA) medium containing 10% fetal bovine serum (GIBCO, Grand Island, NY), and the B16BL6 cell line was 10% containing 1 x MEM vitamin solution (Invitrogen). Incubated in MEM (Minimum Essential Medium, Invitrogen). Medium of all cells contained 2 mM L-glutamine 100 IU / ml (Invitrogen); Penicillin / streptomycin 100 μg / ml (Invitrogen); Gentamicin sulfate (Duchefa, Netherlands) was used to add 15 μg / ml. Β-mercaptoethanol was added to 10% RPMI 1640 used for differentiation and culture of dendritic cells to 0.02 μg / ml of recombinant mouse interleukin-4 (Endogene, Rockford, USA), and recombinant mouse Granulocyte and Monocyte- Colony Stimulating Factor (rmGM-CSF, Endogene) was added at 0.004 μg / ml (called R10).

2. 실험동물 2. Experimental Animal

6-8 주령의 체중 20 g 내외의 건강한 C57BL/6 수컷 마우스를 사용하였다. 마우스는 SLC(Japan SLC, 도쿄, 일본국)에서 구입하여 폴리카보네이트 케이지에 3-4 마리씩 넣어 멸균된 수돗물과 사료(중앙실험동물, 서울, 대한민국)를 공급하고 가능한 스트레스를 받지 않도록 조용한 분위기를 주었고, SPFR (specific pathogene free room)에서 사육하였다. 폐 전이 모델에서 다리를 자른 마우스는 자를 다리를 알코올로 소독한 다음 멸균된 가위로 자르고 상처를 불에 살짝 지져서 지혈하였다. 모든 동물실험은 한국 연세대학 의과대학 동물사육 및 실험관련 규칙을 준수하였다. Healthy C57BL / 6 male mice at around 20 g body weight of 6-8 weeks of age were used. Mice were purchased from SLC (Japan SLC, Tokyo, Japan) and fed 3-4 animals in polycarbonate cages to provide sterilized tap water and feed (Central Laboratory Animals, Seoul, Korea) and provide a quiet atmosphere to avoid possible stress. Were bred in SPFR (specific pathogene free room). In the lung metastasis model, the cut mouse was hemostatically ruled with alcohol and then cut with sterile scissors and the wound lightly burned. All animal experiments followed the rules for animal breeding and testing at Yonsei University College of Medicine.

3. 4-1BBL와 IL-12를 발현하는 종양 선택성 복제가능 재조합 아데노바이러스들의 제작, 생산 및 역가산출 3. Construction, production and titration of tumor-selective replicable recombinant adenoviruses expressing 4-1BBL and IL-12

연구에 사용된 벡터 아데노바이러스는 Ⅴ 타입이고, E1B 부위와 E3 부위가 모두 결손되고 E1A 부위의 Rb 단백질 결합 위치가 돌연변이 된 Ad-ΔB7(pdl 324 ΔE1B/E1A mt#7)은 이미 본 연구소에서 그 종양세포 특이적 살상 복제가능 기능이 확인된 바 있다(Kim JS, Choi KJ, Kim PH, Kim JH, Sohn JH, CO. Y. Enhanced Oncolytic Effect and Anti-Tumor Effect of Replication Competent Adenovirus with Double Mutation in E1A & E1B Regions. J Bacteriol Virol . Korean . 2005;35(2):113-124.).The vector adenovirus used in the study was type V, and Ad-ΔB7 (pdl 324 ΔE1B / E1A mt # 7), in which both the E1B and E3 sites were deleted and the Rb protein binding site of the E1A site was mutated, was already Tumor cell specific killing function has been identified (Kim JS, Choi KJ, Kim PH, Kim JH, Sohn JH, CO.Y. Enhanced Oncolytic Effect and Anti-Tumor Effect of Replication Competent Adenovirus with Double Mutation in E1A & E1B Regions. J Bacteriol Virol . Korean . 2005; 35 (2): 113-124.).

Ad-ΔB7/IL12/41BBL를 제작하기 위하여, 먼저 마우스 IL-12 유전자를 발현하는 아데노바이러스를 제작하였다. pcDNA3.1-IRES 벡터를 EcoRⅠ제한효소로 처리하여 나온 약 800 bp 크기의 IRES 유전자를 pcDNA3.1-p35 벡터의 (사이토카인 은행, 전북대학교) p35 유전자 바로 뒤의 EcoRⅠ제한효소를 이용하여 삽입시켜 pcDNA3.1-p35/IRES 벡터를 제작하였다. 그리고 pcDNA3.1-p40을 (사이토카인 은행, 전북대학교) PmeⅠ과 XhoⅠ제한효소로 처리하여 나온 약 1007 bp 크기의 p40 유전자를 pcDNA3.1-p35/IRES 벡터의 IRES 바로 뒤의 EcoRⅤ 제한효소를 이용하여 삽입시켜 pcDNA3.1-IL12 벡터를 제작하였다. pcDNA3.1-IL12 벡터를 PmeⅠ과 XhoⅠ제한효소로 다시 처리하여 나온 약 2.5 kb 크기의 IL-12를 (p35/IRES/p40) EcoRⅤ과 SalⅠ제한효소로 처리된 pCA14 또는 pCA14/E1AE1B19 벡터에 삽입시켜 pCA14/E1AE1B19-IL12 아데노바이러스 E1 셔틀벡터를 제작하였다. 제작된 pCA14/E1AE1B19/IL12 셔틀벡터를 NdeⅠ제한효소로 처리하여 선형화 시키고, BstBⅠ을 처리하여 선형화된 토탈 벡터인 Ad-B7과 함께 대장균 BJ5183에 동시에 형질 전환시켜 상동 재조합을 유도하여 E1 부위에 IL-12 유전자가 삽입된 종양 특이적 살상 복제가능 아데노바이러스인 Ad-ΔB7/IL12를 제작하였다. To prepare Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL, first, an adenovirus expressing the mouse IL-12 gene was constructed. by the IRES gene of about 800 bp in size resulted by processing the pcDNA3.1-IRES vector with a restriction enzyme Eco RⅠ using the restriction enzymes Eco RⅠ behind the pcDNA3.1-p35 vector (Cytokine Bank, University JEONBUK) p35 gene directly Insertion was performed to construct pcDNA3.1-p35 / IRES vector. Then, a P7 gene of about 1007 bp from pcDNA3.1-p40 (Cytokine Bank, Chonbuk National University) with Pme I and Xho I restriction enzymes was used to limit Eco RV immediately after the IRES of the pcDNA3.1-p35 / IRES vector. The enzyme was inserted using an enzyme to construct a pcDNA3.1-IL12 vector. pCA14 or pCA14 / E1AE1B19 treated with Eco RV and Sal I restriction enzymes with approximately 2.5 kb of IL-12 (p35 / IRES / p40) from PCDNA3.1 -IL12 vector re-treated with Pme I and Xho I restriction enzymes (p35 / IRES / p40) The pCA14 / E1AE1B19-IL12 adenovirus E1 shuttle vector was constructed by inserting into the vector. The prepared pCA14 / E1AE1B19 / IL12 shuttle vector was linearized by treatment with Nde I restriction enzyme, and Bst BI was processed to transform E. coli BJ5183 together with Ad-B7, a linearized total vector, to induce homologous recombination. Ad-ΔB7 / IL12, a tumor specific killable adenovirus with the IL-12 gene inserted, was constructed.

그리고 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 유전자를 추출하기 위하여 C57BL/6 마우스의 골수에서 분리, 분화, 활성화 시킨 수지상세포로부터 역전사-중합 연쇄 반응 (RT-PCR)을 수행하여 총 RNA 산물을 획득한 다음 cDNA 합성을 수행하였다. 4-1BB 리간드를 증폭할 수 있는 프라이머 (Sense는 5’-ATGGATCCACCATGGACCAGCACACACTTG-3’, Anti-Sense는 5’-AGATAAGCTTTCATTCCCATGGGTTGTC-3’)를 제작하고 PCR을 수행하여 획득한 산물을 BamHⅠ과 HindⅢ 제한효소로 잘라서 약 930 bp 길이의 DNA 절편을 획득한 뒤, pSP72/ΔE3/CMV-polyA 셔틀벡터에 라이게이션하여 또 다른 pSP72/ΔE3/CMV-41BBL-poly 셔틀벡터를 제작하였다. 4-1BBL 유전자의 서열을 확인하여 본 결과 National Center for Biotechnology Information (NCBI) L15435 서열의 53-982 부분이 100 ％ 동일하였다. 이 셔틀벡터를 XmnⅠ으로 자른 다음 SpeⅠ 제한효소로 자른 Ad-ΔB7 (pdl 324 ΔE1B/E1A mt#7) 토탈 벡터, 그리고 E1B 부위에 마우스 인터루킨-12 (mIL-12) 유전자가 삽입된 Ad-ΔB7/IL12 아데노바이러스 토탈벡터(pdl 324ΔE1B/E1Amt#7/CMV-IL12-polyA)와 각각 BJ5183 대장균에 형질전환시켜 상동 재조합(homologous recombination)을 유도하여 E3 부위에 마우스 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 유전자가 삽입된 Ad-ΔB7/41BBL 와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL를 제작하였다. 제작된 모든 플라즈미드는 PacⅠ으로 자른 다음 리포펙타민(lipofectamin)을 사용하여 293 세포주에 트랜스펙션(transfection) 하였다. 이렇게 증식 배양 한 후 CsCl 밀도에 의해 정제를 행하고 투석시킨 후, 4 ％ 수크로오스를 함유한 저장 버퍼(storage buffer)의 삼투를 거친 다음 분취하여 -80 ℃에 냉동 저장하였다. 각 바이러스 스톡(stock)의 타이터(titer)는 스펙트로포토미터(spectrophotometer)를 이용하여 바이러스 지놈의 흡광도에 의한 흡광도(O.D)로 산출하였다. In order to extract 4-1BB ligand (4-1BBL) gene, reverse transcription-polymerization chain reaction (RT-PCR) was performed on dendritic cells isolated, differentiated, and activated in bone marrow of C57BL / 6 mice to obtain total RNA products. Following cDNA synthesis was performed. A primer capable of amplifying the 4-1BB ligand (Sense is 5'-ATGGATCCACCATGGACCAGCACACACTTG-3 'and Anti-Sense is 5'-AGATAAGCTTTCATTCCCATGGGTTGTC-3') was prepared, and the product obtained by PCR was restricted to Bam HI and Hind III. DNA fragments of about 930 bp length were obtained by enzymatic digestion, and then ligated to pSP72 / ΔE3 / CMV-polyA shuttle vector to prepare another pSP72 / ΔE3 / CMV-41BBL-poly shuttle vector. The sequence of the 4-1BBL gene was confirmed. As a result, the 53-982 portions of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) L15435 sequence were 100% identical. This shuttle vector was cut with Xmn I and then a total vector of Ad-ΔB7 (pdl 324 ΔE1B / E1A mt # 7) with Spe I restriction enzyme, and Ad- with mouse interleukin-12 (mIL-12) gene inserted into the E1B region. ΔB7 / IL12 adenovirus total vector (pdl 324ΔE1B / E1Amt # 7 / CMV-IL12-polyA) was transformed into E. coli BJ5183 to induce homologous recombination to induce homologous recombination of mouse 4-1BB ligand (4-1BBL). ) Ad-ΔB7 / 41BBL and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL were prepared. All prepared plasmids were cut into Pac I and then transfected into 293 cell lines using lipofectamin. After proliferation and culture, purification was performed by CsCl density, and dialyzed, followed by osmosis of a storage buffer containing 4% sucrose, followed by an aliquot, and freezing storage at -80 ° C. The titer of each virus stock was calculated as absorbance (OD) by the absorbance of the virus genome using a spectrophotometer.

4. 종양살상분석법(Oncolytic Assay)를 통한 바이러스의 살상능 비교 4. Comparison of Killing Capacity of Viruses by Oncolytic Assay

IL-12와 4-1BBL유전자의 발현여부가 아데노바이러스의 복제와 종양세포살상능에 어떠한 영향을 미치는지 검증하기 위하여 Ad-dl 324ΔE1, Ad-ΔB7, Ad-Δ B7/IL12, Ad-ΔB7/41BBL, Ad-ΔB7/IL12/41BBL등 5 종류의 바이러스를 이용하여 종양세포살상효과를 비교, 분석하였다. 실험에 사용한 세포주들은 인체 뇌암세포주 (U343), 인체 폐암 세포주 (A549), C57BL/6 마우스의 흑색종양 세포주 (B16-F10)이다. 암세포들은 30-50 ％의 컨플루언스(confluence)로 24-웰 플레이트에 분주한 뒤 0.1-200 Multiplicity of infection (MOI) 별로 선택하여 각각 감염시켰다. 이들 바이러스 중 어느 한 바이러스가 제일 낮은 역가에서 암세포를 완전히 사멸시킨 시점, 혹은 8-10 일 시점에서 모든 배지를 제거하고 0.5 ％ 크리스탈 바이올렛으로(50 ％ 메탄올) 잔존한 세포들을 고정하고 염색한 후 분석하였다. Ad-dl 324ΔE1, Ad-ΔB7, Ad-ΔB7 / IL12, Ad-ΔB7 / 41BBL, to examine how the expression of IL-12 and 4-1BBL gene affect the adenovirus replication and tumor cell killing ability Tumor cell killing effects were compared and analyzed using five viruses, including Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL. The cell lines used in the experiment were human brain cancer cell line (U343), human lung cancer cell line (A549), and melanoma cell line (B16-F10) of C57BL / 6 mice. Cancer cells were dispensed into 24-well plates with 30-50% confluence and selected by 0.1-200 Multiplicity of infection (MOI), respectively. Any one of these viruses completely removed the cancer cells at the lowest titer, or at 8-10 days after removing all media and fixing and staining the remaining cells with 0.5% crystal violet (50% methanol). It was.

5. 5. 골수유래Bone marrow 수지상세포( Dendritic cells ( BoneBone marrowmarrow derivedderived dendriticdendritic cellcell )의 분화와 배양 Differentiation and culture

수지상세포의 분화와 배양은 변형된 Inaba 등의 배양방법으로 시행하였다(Inaba, K., Metlay, J. P., Crowley, M. T. & Steinman, R. M. Dendritic cells pulsed with protein antigens in vitro can prime antigen-specific, MHC-restricted T cells in situ. J Exp Med 172, 631-40, 1990). 골수세포는 6-8 주령 된 C57BL/6 마우스의 경골과 대퇴골에서 분리하고 적혈구를 제거하기 위해 EDTA-ammonium chloride 용액(0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA)을 10 ㎖ 넣어 4 ℃ 에서 5 분간 방치한 후 10 ％ RPMI 1640 배지로 2 회 세척한다. 다음 100 ㎛의 cell strainer에 걸러내어 찌꺼기를 제거하였다. 이 여과 된 세포를 1 x 10⁶ 세포/㎖로 10 ％ RPMI 1640 (50 μM의 ß - 메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 15 ㎍/㎖ 젠타마이신)에 부유시킨 다음 rmIL-4(재조합 마우스 인터루킨-4, ENDOGEN, Woburn, MA, USA)를 0.02 ㎍/㎖, rmGM-CSF(재조합 마우스 Granulocyte and Monocyte-Colony Stimulating Factor, ENDOGEN)를 0.004 ㎍/㎖ 넣어주고, 6 웰 플레이트에 분주하였다. 2 일과 4 일에는 부유되어 있는 세포와 배지를 버리고 rmIL-4가 0.02 ㎍/㎖, rmGM-CSF가 0.004 ㎍/㎖ 함유 된 신선한 10 ％ RPMI 1640 배양액(R10)으로 교체해주었다. 6 일에는 위와 같은 배지로 갈아주는 동시에 B16-F10 혹은 B16BL6 멜라노마 세포주를 동결-융해(freezing-thawing)하여 정제 축출해 낸 총 단백질을 50 ㎍/㎖ 첨가하여 주고, 7 일에는 LPS(Lipopolysaccharide, SIGMA, St. Louis, MO, USA)를 1 ㎍/㎖로 첨가하여 주었다. 8 일에는 살짝 붙어있는 세포를 파이펫 충격으로 떨어뜨려 회수한 다음 원심 분리하여 상층액은 버리고 세포 펠렛은 멸균된 식염수로 세척하여 사용하였다. Differentiation and culture of dendritic cells were performed by modified Inaba et al. (Inaba, K., Metlay, JP, Crowley, MT & Steinman, RM Dendritic cells pulsed with protein antigens in vitro can prime antigen-specific, MHC- restricted T cells in situ.J Exp Med 172 , 631-40, 1990). Bone marrow cells were isolated from the tibia and femur of 6-8-week-old C57BL / 6 mice, and 10 ml of EDTA-ammonium chloride solution (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) was removed at 4 ° C to remove red blood cells. Leave on for 2 minutes and wash twice with 10% RPMI 1640 medium. Next, the filter was removed by filtering the cell strainer of 100 ㎛. These filtered cells were treated with 10% RPMI 1640 (50 μM ß-mercaptoethanol, 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 μg / ml streptomycin, 15 μg / ml) at 1 × 10 ⁶ cells / ml. Gentamicin) followed by rmIL-4 (recombinant mouse interleukin-4, ENDOGEN, Woburn, MA, USA) 0.02 μg / ml and rmGM-CSF (recombinant mouse Granulocyte and Monocyte-Colony Stimulating Factor, ENDOGEN) 0.004 μg / Ml was added and aliquoted into 6 well plates. On days 2 and 4, suspended cells and media were discarded and replaced with fresh 10% RPMI 1640 medium (R10) containing 0.02 μg / ml rmIL-4 and 0.004 μg / ml rmGM-CSF. On day 6, 50 µg / mL of the total protein extracted by freezing-thawing the B16-F10 or B16BL6 melanoma cell line by freezing-thawing was added, and on day 7, LPS (Lipopolysaccharide, SIGMA, St. Louis, Mo., USA) was added at 1 μg / ml. On day 8, the cells slightly adhered to the pipette were collected by dropping and then centrifuged to discard the supernatant, and the cell pellet was washed with sterile saline.

6. B16-F10 세포주에서의 IL-12 단백질 발현양 측정 6. Measurement of IL-12 Protein Expression in B16-F10 Cell Line

IL-12는 분비형 단백질로서, Ad-ΔB7/IL12 와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 의 감염에 따른 단백질의 발현 정도를 측정하기 위하여 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)를 실시하였다. 뮤린(murine) 세포주에 대한 인간 아데노바이러스의 유전자 전달 효율은 낮다고 보고된 바 있어, 유전자 전달 효율을 증가 시켜 주기 위해 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen)과 플러스(Plus, Invitrogen)를 이용하였다. B16-F10 마우스 흑색종 세포를 2 X 10⁴ 세포/well, 6 웰 플레이트에 분주한 다음 날 0, 25, 50, 100등 여러 MOI로 Ad-ΔB7, Ad-ΔB7/41BBL, Ad-ΔB7/IL12와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스를 리포펙타민과 15 분, 플러스와 15 분간 상온에서 반응시킨 다음, 10 ％ RPMI 1640 배지로 토탈 볼륨을 1.5 ㎖로 맞추어 각각의 웰에 감염시켰다. 4 시간 뒤 1.5 ㎖의 배지로 갈아주고 바이러스 감염 후 48 시간 경에 배지를 수득하여 ELISA 분석을 실시하였다. ELISA 분석의 전 과정은 마우스 IL-12 ELISA Set(ENDOGGEN)의 설명서에 따라 시행하였다. IL-12 is a secreted protein. An ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) was performed to measure the expression level of the protein following infection with Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL. Since gene transfer efficiency of human adenovirus to murine cell lines has been reported to be low, lipofectamine (Lipofectamine, Invitrogen) and plus (Plus, Invitrogen) were used to increase gene transfer efficiency. B16-F10 mouse melanoma cells were dispensed in 2 X 10 ⁴ cells / well, 6 well plates, and then Ad-ΔB7, Ad-ΔB7 / 41BBL, Ad-ΔB7 / IL12 at various MOIs including 0, 25, 50, 100, etc. And Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus were reacted with lipofectamine for 15 minutes, plus and 15 minutes at room temperature, and then infected with each well by adjusting the total volume to 1.5 ml with 10% RPMI 1640 medium. After 4 hours, the medium was changed to 1.5 ml of medium, and the medium was obtained 48 hours after the virus infection. The whole procedure of ELISA analysis was performed according to the instructions of mouse IL-12 ELISA Set (ENDOGGEN).

7. B16-F10 세포주에서의 m4-1BBL단백질 발현양 측정 7. Measurement of m4-1BBL Protein Expression in B16-F10 Cell Lines

바이러스가 감염된 세포에서 4-1BBL 발현을 알아보기 위해서, 리포펙타민(Lipofectamine)과 플러스(Plus)를 첨가한 상기의 바이러스들로 20, 40, 80 MOI로 각각 감염시킨 1 x 10⁶ 개의 B16-F10 세포를 20 시간 뒤 수득하여 PBS로 (phosphate buffered saline, Invitrogen, MA, USA) 2 회 세척한 다음 Proteinase Inhibitor Cocktail(SIGMA)을 1 x 되게 첨가한 RIPA용액 (0.15 M NaCl, 0.05 M Tris-Cl: pH 7.2, 1％ Triton X-100, 0.1 ％ SDS, in DW)을 사용하여 세포를 용해시켰다. 여기에서부터 토탈 단백질을 축출하고 BCA^TM Protein Assay Kit (Pierce biotechnology Inc, USA)를 사용하여 단백질의 량을 각각 측정하였다. 측정한 단백질에 ß - 메르캅토에탄올을 10 ％ 되게 첨가, 단백질 로딩 버퍼(protein loading buffer)를 1 x 되게 첨가한 다음 끓는 물에 5 분 끓여 준 뒤, 즉시 얼음안에 넣어 서 10 분간 충분히 냉각시킨 뒤 잘 흔들어 섞어주었다. 이 준비된 단백질 샘플을 10 ％ Tris-glycine SDS-polyacrylamide Gel 에서 전기 영동을 한 뒤, 12 V 에서 전기영동으로 1시간 동안 수행하여 PVDF 멤브레인(Chelmsford, MA, USA)에 단백질을 옮겼다. 그 다음 1 ％ BSA가 첨가된 PBS로 단백질이 옮겨진 PVDF 멤브레인을 실온 진탕기에서 30 분 블로킹하였다. 블로킹된 PVDF 멤브레인을 5 ％ 탈지분유가 함유된 PBS-T 버퍼에 담그고 33.3 ng/㎖로 고우트(goat) 항-마우스 4-1BB 리간드 항체(R&D systems, Inc, USA)를 넣어서 실온에서 45 분 인큐베이션한 다음 Tween 20 이 0.1 % 들어있는 PBS로 3 회 세척해주고, 래빗(rabbit) 항-고우트 IgG(H+L)-HRP (Southern Biotech, USA)를 1:3000으로 넣어서 실온, 진탕기에서 45 분 반응시켰다. PBS-T로 3 회 세척한 다음 Western Blotting Luminol Reagent Solution “A”와“B”(Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA)를 1:1로 섞어서 PVDF 멤브레인을 적셔주고 필름에 현상하였다. To examine 4-1BBL expression in virus infected cells, 1 x 10 ⁶ B16- infected with 20, 40, and 80 MOI, respectively, with the above-mentioned viruses added Lipofectamine and Plus. F10 cells were obtained after 20 hours, washed twice with PBS (phosphate buffered saline, Invitrogen, MA, USA), and then RIPA solution (0.15 M NaCl, 0.05 M Tris-Cl added with 1 × Proteinase Inhibitor Cocktail (SIGMA)). : pH 7.2, 1% Triton X-100, 0.1% SDS, in DW) was used to lyse the cells. From here the total protein was removed and the amount of protein was measured using the BCA ^™ Protein Assay Kit (Pierce biotechnology Inc, USA). Add 10% ß-mercaptoethanol to the measured protein, add 1x protein loading buffer, boil it in boiling water for 5 minutes, immediately put it in ice, and cool it for 10 minutes. Shake well. The prepared protein samples were subjected to electrophoresis on 10% Tris-glycine SDS-polyacrylamide Gel, followed by electrophoresis at 12 V for 1 hour to transfer proteins to PVDF membranes (Chelmsford, MA, USA). The PVDF membrane, which was then transferred to PBS with 1% BSA, was blocked for 30 minutes on a room temperature shaker. The blocked PVDF membrane was immersed in PBS-T buffer containing 5% skim milk powder and placed at 33.3 ng / ml in goat anti-mouse 4-1BB ligand antibody (R & D systems, Inc, USA) for 45 minutes at room temperature. After incubation, wash 3 times with PBS containing 0.1% Tween 20, and add rabbit anti-gout IgG (H + L) -HRP (Southern Biotech, USA) 1: 3000 at room temperature, on a shaker. The reaction was carried out for 45 minutes. After washing three times with PBS-T, Western Blotting Luminol Reagent Solution “A” and “B” (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA) were mixed 1: 1 to soak the PVDF membrane and developed on the film.

8. 종양 형성 및 8. Tumor Formation and 항 종양Antitumor 효과 관찰 Observe the effect

B16-F10 흑생종 세포는 10 % RPMI 1640 배지에서 단층으로 배양하여 0.25% 트립신-EDTA(Invitrogen)를 처리한 후 10 % RPMI 1640배지로 회수하고 계대 배양하거나 또는 5 X 10⁵ 개의 생존세포를 50 ㎕ Hanks' Balanced salt solution(HBSS, Invitrogen)으로 부유하여 마우스의 우측 중부 복부에 피하 주사하였다. 종양세포 이식 후 약 5-7 일 경에 종양의 크기가 약 80-100 ㎣ 가량 성장한 다음, 바이러스 사이의 항종양 효과 비교 관찰은 PBS, Ad-ΔB7 및 Ad-ΔB7/41BBL는 1 X 10¹⁰ 바이러스입자(VP, virus particle)/50 ㎕, Ad-ΔB7/IL12, Ad-ΔB7/IL12/41BBL 아데노바이러스는 5 X 10⁹ VP/50 ㎕ 용량으로 리포펙타민과 플러스에 혼합하여 2 일에 한번씩, 3 회 종양 내로 주사하였고 아데노바이러스와 수지상세포를 (DCs) 병합한 항 종양 효과 관찰은 PBS, DC, Ad-ΔB7/IL12/41BBL, Ad-ΔB7/IL12/41BBL + DC 등 4개 그룹으로 나누고 바이러스는 2.5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 2 일 간격으로 3회 종양 내 투여하였고 수지상세포(1 X 10⁶ 세포/50 ㎕)는 첫 번째 바이러스 투여 다음 날부터 2일 간격으로 3회 종양 내 투여를 실시하였다. 종양의 크기는 바이러스 투여시점부터 종양의 최장경(a)과 그에 수직되는 최단경(b)을 각각 측정하여 a X b² X 0.523의 공식으로 산출하였다. B16-F10 melanoma cells were cultured in a monolayer in 10% RPMI 1640 medium, treated with 0.25% trypsin-EDTA (Invitrogen), recovered with 10% RPMI 1640 medium and passaged or 50 μl of 5 × 10 ⁵ viable cells. Hanks' Balanced salt solution (HBSS, Invitrogen) was suspended subcutaneously in the right central abdomen of mice. About 5-7 days after tumor cell transplantation, the tumor size grew about 80-100 mm 3, and then the antitumor effect between the viruses was observed. PBS, Ad-ΔB7 and Ad-ΔB7 / 41BBL were 1 X 10 ¹⁰ virus. 50 μl of particles (VP, virus particle), Ad-ΔB7 / IL12, Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL adenoviruses were mixed with lipofectamine plus at a dose of 5 × 10 ⁹ VP / 50 μl once every two days, Three intratumoral injections and anti-tumor effects combined with adenovirus and dendritic cells (DCs) were divided into four groups: PBS, DC, Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL, Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL + DC, and virus. 2.5 x 10 ⁹ VP / 50 μl, administered intratumorally three times every two days, and dendritic cells (1 X 10 ⁶ cells / 50 μl) were administered three times intratumorally, two days apart from the day following the first virus administration. Was carried out. Tumor size was calculated by the formula of a X b ² X 0.523 by measuring the longest diameter (a) and the shortest diameter (b) perpendicular to the tumor from the time of virus administration.

9. 흑색종 폐 자연전이 암 모델에서의 전이 억제 관찰 9. Observation of metastasis inhibition in melanoma lung metastasis cancer model

B16BL6 세포주를 이용한 폐 자연전이 암 모델에서의 억제 전이 관찰에서는 다음과 같이 실험을 진행하였다. 먼저 B16BL6 세포를 1.5 X 10⁵ 세포/50 ㎕로 HBSS에 부유시킨 다음 마우스의 발바닥 피하에 주사하였다. 그리고 흑색종양의 크기가 약 180-200 ㎣ 되었을 때 (18 일) Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스는 18 일, 20 일, 22 일에 5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 종양 내로 투여했고 DCs는 19 일, 21 일, 23 일에 1 X 10⁶ 세포/100 ㎕, 2 일 간격으로 3 회 흉강 내 투여를 실시하였다. 26 일(DCs 투여가 끝난 후 3일째)에 오른쪽 무릎관절을 잘라버리고 불에 지져서 지혈한 다음 사육, 관찰하였다. 48 일에 마우스를 경추 탈골 시키고 해부하여 폐 전이 상황을 비교, 분석하였다. 폐의 무게를 측정하고 폐의 자연전이 결절(nodule)은 매 그룹의 결절 크기에 근거하여 Great(>1 cm), Large(1 cm≥large>0.5 cm), Medium(0.5 cm≥medium>0.3 cm), Small(0.3 cm≥small)로 나누어 분석하였다. Observation of inhibitory metastasis in lung metastasis cancer model using B16BL6 cell line was performed as follows. B16BL6 cells were first suspended in HBSS at 1.5 × 10 ⁵ cells / 50 μl and then injected subcutaneously in the plantar portion of mice. Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus was administered into tumors at 5 × 10 ⁹ VP / 50 μl on the 18th, 20th and 22nd days when the tumor size was about 180-200 mm 3 (18 days). Three intrathoracic administrations were performed on days 19, 21, and 23 at 1 × 10 ⁶ cells / 100 μl, two days apart. On the 26th day (3 days after the end of DCs administration), the right knee joint was cut out, burned, and bleeded. At 48 days, the cervical spine was dissected and dissected to compare and analyze lung metastasis. The lungs are weighed and the natural metastasis nodule of the lungs is based on the nodule size of each group: Great (> 1 cm), Large (1 cm≥large> 0.5 cm), Medium (0.5 cm≥medium> 0.3 cm ), Small (0.3 cm ≥ small) was analyzed.

10. 마우스 생체 내의 비장 적출 10. Spleen Extraction in Mouse In Vivo

C57BL/6 마우스에서 무균상태로 비장을 적출한 뒤 비장을 균질화하고, 적혈구를 제거하기 위해 EDTA-ammonium chloride 용액(0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA)을 10 ㎖ 넣어 4 ℃ 에서 5 분간 방치하고 2000 rpm에서 10분간 원심 분리한 뒤 상층액을 제거하고, 10 % RPMI 1640 배지로 2 회 세척하였다. 위의 세척과정이 끝난 세포는 100 ㎛의 cell strainer에 걸러내어 여과된 세포를 수거하여 사용하였다. Aseptically remove the spleen from C57BL / 6 mice, homogenize the spleen, and add 10 ml of EDTA-ammonium chloride solution (0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) to remove red blood cells for 5 minutes at 4 ° C. After standing and centrifuged at 2000 rpm for 10 minutes, the supernatant was removed and washed twice with 10% RPMI 1640 medium. After the above washing process, the filtered cells were collected by filtering the cell strainer of 100 ㎛.

11. 종양조직 내 11. In tumor tissue INFINF -γ 발현량 관찰 -γ expression level observation

종양내의 면역관련 IFN-γ 사이토카인의 발현량이 종양살상에 어떤 영향을 미치는지를 확인하기 위하여 종양조직 내 발현량을 ELISA를 시행하여 관찰하였다. 마우스에 유발시킨 B16-F10 흑색종양 내로 각각의 바이러스를 5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 2 일 간격으로 3회 투여를 끝내고 5일 후 종양을 적출하였다. 그리고 또 아데노바이러스와 수지상세포와의 병합치료 그룹은 위와 같이 바이러스는 5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 2 일 간격으로 3회 종양 내 투여하였고 수지상세포는 첫 번째 바이러스 투여 다음 날부터 2일 간격으로 3회 종양 내 투여를 실시하였다. 수지상세포의 투여가 끝난 5 일 후 종양을 적출하였다. 적출한 종양을 막자 사발에 균질화 한 후 1 x 프로테아제 억제제 칵테일 (SIGMA)이 첨가된 PBS를 사용하여 부유한 다음, 4 ℃, 13200 rpm에서 10 분 원심 분리한 뒤 상층액만 수득하여 단백질 정량을 시행하고 일정량의 단백질에서의 IFN-γ 단백질의 발현량을 ELISA로 측정하였다. ELISA의 전 과정은 마우스 IFN-γ ELISA Kit(ENDOGEN)의 사용 설명서에 따라 시행하였다. The expression level of tumor-associated IFN-γ cytokines in tumors was examined by ELISA to determine the effect of expression on tumor killing. Each virus was injected into the B16-F10 melanoma induced in mice, 5 × 10 ⁹ VP / 50 μl, three times at 2 days intervals, and tumors were extracted 5 days later. In addition, the combination group of adenovirus and dendritic cells was administered 3 times intratumorally at 5 x 10 ⁹ VP / 50 μl, two days apart, and dendritic cells were given two days apart from the day following the first virus administration. Three intratumoral administrations were performed. Tumors were removed 5 days after the end of dendritic cell administration. The isolated tumors were homogenized in a bowl, suspended in PBS with 1 x Protease Inhibitor Cocktail (SIGMA), and then centrifuged at 4200C and 13200 rpm for 10 minutes. The expression level of IFN-γ protein in a certain amount of protein was measured by ELISA. The whole procedure of ELISA was performed according to the instruction manual of the mouse IFN-γ ELISA Kit (ENDOGEN).

12. 12. 수지상세포의Dendritic FACSFACS 분석 analysis

마우스의 골수유래 수지상세포를 단세포 부유물로 만든 다음, 정제된 햄스터항-마우스 CD3e 모노클로날 항체, R-Phycoerythrin-콘주게이트 햄스터 항-마우스 CD11c (Integrin α_x chain) 모노클로날 항체, 정제된 Rat 항-마우스 CD14 모노클로날 항체, 정제된 랫트 항-마우스 CD19 모노클로날 항체, 정제된 랫트 항-마우스 CD40 모노클로날 항체, 정제된 랫트 항-마우스 CD86 (B7-2) 모노클로날 항체, 정제된 랫트 항-마우스 CD80 (B7-1) 모노클로날 항체, 정제된 마우스 항-마우스 H-2Kb/H-2Db 모노클로날 항체, 정제된 마우스 항-마우스 I-Ab 모노클로날 항체(Pharmingen, Dickinson, USA)등을 각각 넣어 4 ℃에서 45 분 반응 시킨 후 2 % PBS로 2번 세척하고 Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 혹은 Phycoerythrin (PE)가 연결된 2차 항체(SouthernBiotech, Birmingham, USA)를 첨가하여 또 45 분 반응시켰다. 2 % PBS로 2번 세척한 후 2 % 파라포름알데히드로 고정시킨 후 유세포분석(Flow cytometric analysis)를 실시하였다. Bone marrow-derived dendritic cells of mice were made into single cell suspensions, followed by purified hamster anti-mouse CD3e monoclonal antibody, R-Phycoerythrin-conjugate hamster anti-mouse CD11c (Integrin α _x chain) monoclonal antibody, purified Rat Anti-mouse CD14 monoclonal antibody, purified rat anti-mouse CD19 monoclonal antibody, purified rat anti-mouse CD40 monoclonal antibody, purified rat anti-mouse CD86 (B7-2) monoclonal antibody, Purified rat anti-mouse CD80 (B7-1) monoclonal antibody, purified mouse anti-mouse H-2Kb / H-2Db monoclonal antibody, purified mouse anti-mouse I-Ab monoclonal antibody (Pharmingen , Dickinson, USA) and reacted for 45 minutes at 4 ℃, washed twice with 2% PBS and added a secondary antibody (SouthernBiotech, Birmingham, USA) connected with Fluorescein Isothiocyanate (FITC) or Phycoerythrin (PE) It was made to react for 45 minutes. After washing twice with 2% PBS, 2% paraformaldehyde was fixed and flow cytometric analysis was performed.

13. 13. IFNIFN -γ -γ EnzymeEnzyme -- LinkedLinked ImmuneImmune SpotSpot (( ELISpotELISpot ) 분석) analysis

아데노바이러스를 투여한 마우스에서 종양세포 특이적 T 세포 매개 살상효과를 검증하기 위하여, ELISpot 분석을 실시하였다. 각각의 아데노바이러스 혹은 Ad-ΔB7/IL12/41BBL와 DCs를 투여한 마우스의 비장세포를 비장적출 방법으로 분리하였다. 분리한 마우스의 비장세포를 24시간 전에 12000Gy로 조사(irradiation)을 주고 3 X 10⁶ 세포/175 T로 24 시간 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 B16-F10 세포에 rmIL-2를 (재조합 마우스 인터루킨-4, Endogen) 100 U/㎖ 되게 첨가된 10 % RPMI 1640 배양액과 같이 넣어서 5 일 공동-배양을 시행하고 다시 비장세포를 수거하였다. 24시간 전에 항-마우스 IFN-γ (Pharmingen, San Diego, USA) 항체로 4℃에서 코팅한 96 웰 분석 플레이트(Pharmingen)를 10 % RPMI 1640으로, 37 ℃에서 2 시간 블로킹하고 수집된 비장세포를 1 X 10⁴, 2 X 10⁴, 4 X 10⁸, 2 X 10⁵, 4 X 10⁵, 8 X 10⁵ 개의 세포씩 96 웰 분석 플레이트에 각 범위 별로 분주한 뒤 37 ℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 고정한 상태에서 12-16 시간 배양하였다. 12-16 시간 후 플레이트에 있는 세포를 버리고 DW로 반응을 정지 시킨 후 10% FBS 가 첨가 된 PBS로 1시간 블로킹하고 세척 버퍼로 3 회 세척한 다음 바이오틴화된 항-IFN-γ (Pharmingen) 항체를 넣고 2 시간 동안 반응시키고 스트렙타비딘-알카라인 포스파타아제(Pharmingen) 접합체를 넣고 30 분 동안 반응시켰다. 기질액(Pharmingen) 을 넣고 반응을 지속시킨 다음, 각각의 세포 분비에 의한 IFN-γ 단백질이 붙은 부위가 자주빛 색깔이 있는 점으로 보여지게 되는데, 반점이 적당할 때 DW로 반응을 정지시켰다. ELISpot reader로 그 수를 측정하였다. 모든 실험과정은 BDTM ELISPOT 마우스 IFN-γ Set (Pharmingen, San Diego, USA)에서 제시한 실험법을 그대로 시행 하였다. To verify tumor cell specific T cell mediated killing effects in mice treated with adenovirus, ELISpot analysis was performed. Splenocytes of mice treated with adenovirus or Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL and DCs were isolated by spleen extraction. The splenocytes of the isolated mice were irradiated with 12000 Gy 24 hours before, and rmIL-2 was applied to B16-F10 cells incubated in a 5% CO ₂ incubator at 37 ° C. for 24 hours at 3 × 10 ⁶ cells / 175 T. Recombinant mouse Interleukin-4, Endogen) 5 days co-culture was added with 10% RPMI 1640 medium added to 100 U / ㎖ and splenocytes were harvested again. A 96 well assay plate (Pharmingen) coated at 4 ° C. with anti-mouse IFN-γ (Pharmingen, San Diego, USA) antibody 24 hours ago was blocked with 10% RPMI 1640 at 37 ° C. for 2 hours and collected splenocytes. Dispense 1 x 10 ⁴ , 2 x 10 ⁴ , 4 x 10 ⁸ , 2 x 10 ⁵ , 4 x 10 ⁵ , and 8 x 10 ⁵ cells into 96-well assay plates for each range, and then at 37 ° C, 5% CO ₂ Incubation was carried out for 12-16 hours in a fixed incubator. After 12-16 hours, the cells on the plate were discarded, the reaction was stopped with DW, blocked with PBS with 10% FBS for 1 hour, washed three times with wash buffer, and then biotinylated anti-IFN-γ (Pharmingen) antibody. Reaction was added for 2 hours, streptavidin-alkaline phosphatase (Pharmingen) conjugate was added and reacted for 30 minutes. After adding the substrate solution (Pharmingen) and continuing the reaction, the site where the IFN-γ protein attached by each cell secretion appeared to have a purple color, and when the spot was appropriate, the reaction was stopped by DW. The number was measured with an ELISpot reader. All experiments were performed in the same manner as in the BDTM ELISPOT mouse IFN-γ Set (Pharmingen, San Diego, USA).

14. 조직면역염색법 14. Tissue Immunostaining

약 6-8 주령의 C57BL/6마우스의 우측 중부 복벽에 5 X 10⁵개의 B16-F10 세포를 피하 주사한 후, 종양의 크기가 약 80-100 ㎣ 정도 성장하면 바이러스만을 주입한 비교 그룹에서는 PBS, Ad-ΔB7, Ad-ΔB7/41BBL, Ad-ΔB7/IL12, Ad-ΔB7/IL12/41BBL 아데노바이러스를 5 X 10⁹ VP로 각각 리포펙타민과 플러스 용액 (Invitrogen, USA) 6:8 (㎕)비율로 반응시켜 이틀에 한번씩 3회 종양 내로 주사하였다. 그리고 PBS, DC, Ad-ΔB7/IL12/41BBL, Ad-ΔB7/IL12/41BBL + DC등 4 개로 나뉜 그룹에서는, 바이러스는 5 X 10⁹ VP/50 ㎕로 2 일에 한번씩 3 회 종양 내로 투 여, DC는 1 X 10⁶ 세포/50 ㎕, 바이러스 투여간격 사이로 2 일에 한번씩 3 회 종양 내로 투여하였다. 각각의 투여가 끝난 5 일 뒤 마우스에서 종양을 적출하여 조직은 O.C.T. 화합물(Sakura Finetec, Torrance, CA)로 동결 박편 하고 10 ㎛ 두께로 절단하여 젤라틴이 코팅된 글라스 슬라이드 위에 부착한 다음 조직 면역염색을 실시하였다. 먼저 조직과 슬라이드에 부착된 OCT는 20 분간 4℃ 100 % 아세톤 용액에 넣어서 제거하고 슬라이드에 부착된 조직을 3 % H₂O₂ 용액에서 20 분간 반응시켜 내인성 과산화 효소의 작용을 차단시킨 후 우혈청 알부민(Bovine Serum Albumin) (Sigma)이 4 % 함유된 PBS로 실온에서 1 시간 블로킹 처리를 한 다음 제1차 항체인 랫트 항-마우스 CD4 (정제된 랫트 항-마우스 CD4 모노클로날 항체, Pharmingen), 또는 CD8 (정제된 랫트 항-마우스 CD8 모노클로날 항체, Pharmingen), CD86 (정제된 랫트 항-마우스 CD86 모노클로날 항체, Pharmingen) 햄스터 항-마우스 CD11c (정제된 햄스터 항-마우스 CD11c 모노클로날 항체, Pharmigen)를 1:20으로 희석한 용액을 100 ㎕씩 조직박편에 떨구어 습도가 적당한 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이 후 2차 항체인 Horseradish Peroxidase (HRP)가 결합된 고우트 항-랫트 (Goat Anti-Rat IgG-HRP, Pharmigen) 항체를 넣어 실온에서 1 시간 동안 반응 시키고. DAB (DAKO, Carpinteria, CA, USA)를 첨가하여 발색 정도를 지켜본 후 70%, 90%, 100% 알코올에 탈수하고 100% 자일렌(xylene)에 침전시킨 다음 커버 글라스를 덮어 관찰하였다. Subcutaneous injection of 5 × 10 ⁵ B16-F10 cells into the right central abdominal wall of C57BL / 6 mice at about 6-8 weeks of age, followed by PBS in the comparison group injected with virus only when tumors grew to about 80-100 mm 3 , Lipofectamine and Plus Solution (Invitrogen, USA) 6: 8 (μl, Ad-ΔB7, Ad-ΔB7 / 41BBL, Ad-ΔB7 / IL12, Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL adenovirus at 5 × 10 ⁹ VP, respectively And injected into the tumor three times every two days. In four groups, PBS, DC, Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL, Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL + DC, the virus was administered into tumors three times every two days at 5 × 10 ⁹ VP / 50 μl. , DCs were administered into tumors three times every two days between 1 × 10 ⁶ cells / 50 μl and the interval between virus administrations. Five days after the end of each dose, the tumors were removed from the mice, and the tissues were lyophilized with OCT compounds (Sakura Finetec, Torrance, Calif.), Cut into 10 μm thicknesses, adhered onto gelatin-coated glass slides, and then tissue immunostaining. Was carried out. First, the OCT attached to the tissue and the slide was removed by putting it in 4 ° C. 100% acetone solution for 20 minutes and removing the tissue attached to the slide by 3% H ₂ O _2. After reacting for 20 minutes in the solution to block the action of endogenous peroxidase, blocking was performed for 1 hour at room temperature with PBS containing 4% bovine serum albumin (Sigma), and then the anti-rat rat anti- Mouse CD4 (purified rat anti-mouse CD4 monoclonal antibody, Pharmingen), or CD8 (purified rat anti-mouse CD8 monoclonal antibody, Pharmingen), CD86 (purified rat anti-mouse CD86 monoclonal antibody, Pharmingen) hamster anti-mouse CD11c (purified hamster anti-mouse CD11c monoclonal antibody, Pharmigen) diluted 1:20 of the solution was dropped into the tissue slices and reacted for 2 hours at room temperature with moderate humidity. Afterwards, a Goat Anti-Rat IgG-HRP (Pharmigen) antibody conjugated with a horseradish peroxidase (HRP) secondary antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. DAB (DAKO, Carpinteria, CA, USA) was added to observe the degree of color development, and then dehydrated in 70%, 90% and 100% alcohol, precipitated in 100% xylene and then covered with a cover glass.

15. 15. CTLCTL 분석 analysis

이미 제작한 상기의 여러 가지 아데노바이러스에 의한 항 종양 효과가 어떤 기전에 의해 되었는지, 종양에 대한 세포독성을 어느 정도 가지게 되는지를 알아보기 위하여, 그리고 또 제작된 아데노바이러스 중 항암 기능이 제일 강력한 IL-12 와 4-1BBL 유전자가 모두 삽입된 아데노바이러스와 수지상세포와의 병합치료에서 어느 정도의 종양세포독성을 나타내는지를 알아보기 위하여 CTL 분석을 실행하였다. 여러 가지 그룹의 샘플 준비는 위의 IFN-γ ELISpot assay 와 같다. 마우스에서 종양세포 특이적 살상T 세포 활성도를 검증하기 위한 CTL 활성 실험은 5 시간 ⁵¹Cr 유리법을 이용하였다. 비장세포제조에서 축출한 비장 세포를 1.5 x 10⁶ 세포/㎖ 이 되도록 배지로 희석한 후 rmIL-2(100 U/㎖)와 방사선이 조사된 B16-F10세포주와 함께 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 5일 동안 배양하였다. 배양 후 5일에 세포를 수집하여 원심 분리하고, 10 % RPMI-1640 배지로 2회 세척하였다. 표적세포(Target cell: B16-F10 and Mus dunni cells)를 ⁵¹Cr로 표지시키기 위해서는, ⁵¹Cr을 200 μci첨가하고 10% RPMI 1640을 150 ㎕ 넣어주고 FBS를 50 ㎕ 넣어준 다음 살짝 부유하여 37 ℃, 5 % CO₂ 배양기에서 60 분간 배양한 뒤, 10 % FCS가 들어 있는 RPMI-1640 배지로 1000 rpm에서 3분씩 원심 분리하여 2-3회 세척하였다. 상기에서 준비된 5 일간공동-배양한 비장세포(Effecter cell)와 ⁵¹Cr으로 표지된 표적세포를 5:1, 15:1, 45:1(E:T)의 비율로 섞은 뒤 Round-bottomed 96-웰 마이크로플레이 트(Corning, New York, USA)에 넣고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 5시간 동안 배양하였다. 5시간 후 1000 rpm에서 5분 원심분리하고 상층액을 100 ㎕씩 채취해 γ-카운터로 상층액에 유리된 ⁵¹Cr에 의한 γ선의 강도를 측정하여 세포에 대한 독성을 산출하였다. 각 실험은 3 배수(triplicate)로 하며, 다음의 공식으로 세포독성에 의한 ⁵¹Cr의 방출량을 산출하였다. ⁵¹Cr 방출(cytotoxicity)% = (E-S) x 100% / (M-S), E: Experimental release count, S: Spontaneous release count, M: Maximum incorporation count. The mechanism of antitumor effect caused by the various adenoviruses described above was determined by the mechanism, the degree of cytotoxicity against tumors, and IL- CTL analysis was performed to determine the extent of tumor cytotoxicity in the combined treatment of adenovirus and dendritic cells into which the 12 and 4-1BBL genes were inserted. Sample preparation of various groups is the same as the above IFN-γ ELISpot assay. CTL activity experiments to verify tumor cell specific killing T cell activity in mice were performed using a 5 hour ⁵¹ Cr glass method. The splenocytes erupted in the preparation of the splenocytes were diluted with medium to 1.5 x 10 ⁶ cells / ml, followed by 37 ° C and 5% CO ₂ with rmIL-2 (100 U / ml) and irradiated B16-F10 cell line. The incubator was incubated for 5 days. Cells were collected and centrifuged 5 days after incubation and washed twice with 10% RPMI-1640 medium. To label target cells (B16-F10 and Mus dunni cells) with ⁵¹ Cr, add 200 μci of ⁵¹ Cr, add 150 μl of 10% RPMI 1640, add 50 μl of FBS, and then slightly float to 37 ° C. After incubation for 60 minutes in a 5% CO ₂ incubator, centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes with RPMI-1640 medium containing 10% FCS and washed 2-3 times. Five days of co-cultured splenocytes (Effecter cells) prepared in the above and ⁵¹ Cr labeled target cells were mixed at a ratio of 5: 1, 15: 1, 45: 1 (E: T), and then round-bottomed 96- It was placed in a well microplate (Corning, New York, USA) and incubated for 5 hours in a 37 ℃, 5% CO ₂ incubator. After 5 hours, centrifugation was performed at 1000 rpm for 5 minutes, 100 μl of the supernatant was collected, and the γ-counter was used to measure the intensity of γ-rays by ⁵¹ Cr liberated in the supernatant. Each experiment was tripled and the following formula yielded ⁵¹ Cr release due to cytotoxicity. ⁵¹ Cr release (cytotoxicity)% (ES) x 100% / (MS), E: Experimental release count, S: Spontaneous release count, M: Maximum incorporation count.

실험 결과 Experiment result

1. 4-11.4-1 BBLBBL 와 Wow ILIL -12를 발현하는 종양선택적 살상, 복제가능 재조합 Tumor-selective killing expressing -12, replicable recombination 아데노바이러스의Adenovirus 제작 및 생산 Production and production

Ad-ΔB7는 초기발현 유전자인 E1B 부위가 모두 결손되고 E1A의 일부 유전자가 인위적인 변이에 의해 pRb 결합능이 소실된 암세포 특이적 살상 아데노바이러스이다(Kim JS, Choi KJ, Kim PH, Kim JH, Sohn JH, CO. Y. Enhanced Oncolytic Effect and Anti-Tumor Effect of Replication Competent Adenovirus with Double Mutation in E1A & E1B Regions. J Bacteriol Virol . Korean . 2005;35(2):113-124.). Ad-ΔB7 아데노바이러스 벡터를 이용하여 IL-12와 4-1BBL 단백질을 고 발현시켜 암세포에 대한 살상 효과의 개선 여부를 알아보기 위하여, IL-12 유전자가 E1 부위에 삽입되고 4-1BBL 유전자가 E3 부위에 삽입된 Ad-ΔB7/IL12, Ad-ΔB7/41BBL 아데노바이러스를 각각 제작하였으며, 또한 IL-12와 4-1BBL 유전자가 동시에 삽입된 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스를 제작하였다(도 1). Ad-ΔB7 is a cancer cell specific killing adenovirus in which all of the E1B sites, which are early expression genes, and some genes of E1A have lost pRb binding ability due to artificial mutations (Kim JS, Choi KJ, Kim PH, Kim JH, Sohn JH) , CO. Y. Enhanced oncolytic Effect and Anti-Tumor Effect of Replication Competent Adenovirus with Double Mutation in E1A & E1B Regions. J Bacteriol Virol . Korean . 2005; 35 (2): 113-124.). IL-12 gene was inserted into E1 region and 4-1BBL gene was inserted into E3 to determine whether the expression of IL-12 and 4-1BBL protein was improved by using Ad-ΔB7 adenovirus vector to improve the killing effect on cancer cells. Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / 41BBL adenoviruses inserted into the sites were prepared, respectively, and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenoviruses in which IL-12 and 4-1BBL genes were inserted at the same time (FIG. One).

제작된 아데노바이러스에 의한 4-1BBL의 발현 정도를 알아보기 위하여 마우스 흑색종인 B16-F10 세포주에 리포펙타민(Lipofectamine)을 사용하여 감염시키고 20 시간 후 세포를 수득하여 4-1BBL 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블로팅 분석법을 실시하여 관찰하였다. 그 결과 도 2a 에서 보는 바와 같이 4-1BBL 유전자가 삽입된 Ad-ΔB7/41BBL와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 아데노바이러스에서 35kDa과 50kDa의 4-1BBL 단백질의 발현이 바이러스의 역가가 증가함에 따라 용량 비례적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. In order to determine the expression level of 4-1BBL by the produced adenovirus, B16-F10 cell line, which is a mouse melanoma, was infected with lipofectamine, and cells were obtained 20 hours later to determine the expression level of 4-1BBL protein. Western blotting analysis was performed. As a result, as shown in FIG. 2A, the expression of 35kDa and 50kDa 4-1BBL proteins in Ad-ΔB7 / 41BBL and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL adenovirus into which the 4-1BBL gene was inserted was increased as the titer of the virus increased. A proportional increase could be observed.

한편 마우스의 B16-F10 흑색종 세포주에 각각의 아데노바이러스를 리포펙타민을 사용하여 감염시킨 뒤 48시간에 배지를 수거하여 IL-12(75kDa) ELISA 를 실시 하여 사이토카인의 발현량을 관찰하였다. 그 결과 도 2b 에서 보는 바와 같이 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스를 감염시킨 경우에서 바이러스의 역가가 증가함에 따라 IL-12 단백질의 발현도 용량 비례적으로 증가 되었음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들로부터 제작된 바이러스의 감염에 의해 IL-12와 4-1BBL 단백질이 마우스의 흑색종양 세포에서도 고 발현됨을 확인 할 수 있었다. Meanwhile, each adenovirus was infected with B16-F10 melanoma cell line using lipofectamine, and the media were harvested at 48 hours, followed by IL-12 (75kDa) ELISA, and the expression levels of cytokines were observed. As a result, as shown in FIG. 2B, as the virus titer was increased, the expression of IL-12 protein was increased in proportion to the dose of the Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus. From these results, it was confirmed that IL-12 and 4-1BBL proteins were highly expressed in mouse melanoma cells by infection with the virus.

2. 바이러스의 2. Virus 복제능Replication , , 살상능Killing power 비교를 위한 For comparison 종양살상분석Tumor Killing Analysis (( OncolyticOncolytic AssayAssay ) )

IL-12와 4-1BBL 유전자 발현이 아데노바이러스의 복제에 미치는 영향을 알아 보기 위하여 종양살상분석으로 관찰하였다. 여러 종류의 암 세포주를 Ad-ΔE1 (1), Ad-ΔB7 (2), Ad-ΔB7/41BBL (3), Ad-ΔB7/IL12 (4) 또는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL (5) 등 5 종류의 아데노바이러스로 각각 0.1-200 MOI로 감염시키고 잔류 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 세포사멸 정도를 관찰하였다. To investigate the effect of IL-12 and 4-1BBL gene expression on the replication of adenoviruses, the tumor killing assay was performed. Several cancer cell lines were identified as Ad-ΔE1 (1), Ad-ΔB7 (2), Ad-ΔB7 / 41BBL (3), Ad-ΔB7 / IL12 (4) or Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (5). Different adenoviruses were infected with 0.1-200 MOI, and residual cells were stained with crystal violet to observe the degree of cell death.

도 3 에서 확인할 수 있듯이 음성 대조군인 복제불능 Ad-ΔE1 아데노바이러스로 감염시킨 세포에서는 아데노바이러스가 복제되지 않기 때문에 세포살상 효과가 나타나지 않았으나 복제가능 아데노바이러스인 Ad-B7, Ad-ΔB7/41BBL, Ad-ΔB7/IL12 또는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL를 감염시킨 경우에는 투여된 바이러스 량의 증가에 따라 종양세포 살상효과가 증가되는 것을 관찰하였다. 특히 인간 폐암세포주인 A549의 경우, 각각의 바이러스에 의한 세포사멸 정도가 비슷하였으며 인간 뇌암세포주인 U343과 마우스 흑색종양 세포주인 B16-F10에서 Ad-ΔB7/IL12, Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스의 감염에 의해 세포 사멸 정도가 약간 빠르게 유도되는 것을 관찰하였다. 이 결과에서 IL-12와 4-1BBL 단백질의 발현이 아데노바이러스의 복제가 저해되지 않고 그 결과, 세포살상능도 감소되지 않음을 확인할 수 있었다.As shown in FIG. 3, the cells infected with the non-replicating Ad-ΔE1 adenovirus, which is a negative control, did not replicate because adenovirus did not replicate, but the replicable adenoviruses Ad-B7, Ad-ΔB7 / 41BBL, Ad In the case of infection with -ΔB7 / IL12 or Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL, it was observed that the effect of tumor cell killing was increased by increasing the amount of virus administered. In particular, in the case of human lung cancer cell line A549, the degree of apoptosis by each virus was similar, and the levels of Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL viruses were detected in the U343 human brain cancer cell line and B16-F10 mouse mouse tumor cell line It was observed that the degree of cell death was induced slightly faster by infection. In this result, it was confirmed that the expression of IL-12 and 4-1BBL protein did not inhibit the replication of adenovirus, and as a result, the apoptosis was not reduced.

3. 3. 멜라노마Melanoma 모델에서의 재조합 Recombination in the Model 아데노바이러스를Adenovirus 이용한 Used 항 종양Antitumor 효과 관찰 Observe the effect

재조합 아데노바이러스의 종양살상 효과를 관찰하기 위하여 C57BL6 마우스에서B16-F10 흑색종양을 유발한 뒤 각각의 종양 특이적 세포살상 아데노바이러스를 종양 내로 주사하고 종양의 성장을 비교 관찰하였다. 음성 대조군인 PBS를 투여한 마우스의 경우 종양이 급속한 속도로 성장하여 18일 이후에는 생존한 마우스가 거 의 없었다. 치료가 시작되어 12 일에는 IL-12 유전자가 삽입된 2 종류의 바이러스 그룹(Ad-ΔB7/IL12 : 263.2 ㎣ ± 96.4 Ad-ΔB7/IL12/41BBL : 56.2 ㎣ ± 28.8) 과 2배의 타이터로 치료한 다른 IL-12유전자가 삽입되지 않은 바이러스 그룹(Ad-ΔB7 3310.9 ㎣ ± 831.0; Ad-ΔB7/41BBL 2239.8 ㎣ ± 749.4)보다 현저하게 항 종양 효과를 보이는 것을 확인할 수 있었다(P<0.01). 그리고 IL-12 유전자와 4-1BBL 유전자를 동시에 삽입한 Ad-ΔB7/IL12/41BBL (56.2 ㎣± 28.8)로 치료한 그룹을 Ad-ΔB7/IL12 (263.2 ㎣± 96.4)로 치료한 그룹과 비교하였을 때 더 강력한 향 종양 효과를 보였다(P<0.05). 그에 비하여 Ad-ΔB7/41BBL 바이러스(2239.8 ㎣± 749.4)는 Ad-ΔB7 바이러스(3310.9 ㎣± 831.0)에 비하여 조금 더 좋은 항 종양 경향성은 보였지만 통계학적으로 유의성이 없었다. 각 그룹의 마우스는 8-9 마리로 실험을 진행하였고 3회의 반복실험에서 모두 유사한 실험결과를 보여 주었다. 이 실험 결과에서 IL-12 유전자가 삽입된 재조합 아데노바이러스들에 의해 현저한 항 종양 효과가 유도되며, 또한 T 세포와 APC 세포의 증식 및 활성화에 긍정적 영향을 주는 4-1BBL 유전자를 더 삽입한 재조합 아데노바이러스의 경우, IL-12만 발현하는 아데노바이러스에 비해 보다 우수한 항 종양 효과를 유도한다는 것을 알 수 있었다. In order to observe the oncolytic effect of recombinant adenovirus, B16-F10 melanoma was induced in C57BL6 mice, followed by injection of each tumor specific apoptotic adenovirus into the tumor, and the growth of the tumor was compared. Mice treated with PBS, a negative control, grew rapidly at a rapid rate and almost no mice survived after 18 days. On the 12th day of treatment, two types of virus group (Ad-ΔB7 / IL12: 263.2 ㎣ ± 96.4 Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL: 56.2 ㎣ ± 28.8) with IL-12 gene were inserted and double titers. It was confirmed that the anti-tumor effect was significantly higher than that of the other viral group to which the treated IL-12 gene was not inserted (Ad-ΔB7 3310.9 ㎣ ± 831.0; Ad-ΔB7 / 41BBL 2239.8 ㎣ ± 749.4). And the group treated with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (56.2 ㎣ ± 28.8) with IL-12 gene and 4-1BBL gene at the same time was compared with the group treated with Ad-ΔB7 / IL12 (263.2 ㎣ ± 96.4). It showed a stronger potent tumor effect (P <0.05). In comparison, Ad-ΔB7 / 41BBL virus (2239.8 ㎣ ± 749.4) showed a slightly better anti-tumor tendency than Ad-ΔB7 virus (3310.9 ㎣ ± 831.0), but was not statistically significant. The mice in each group were experimented with 8-9 mice and showed similar results in all three replicates. In this experiment, remarkable anti-tumor effects were induced by recombinant adenoviruses inserted with IL-12 gene, and further inserted with 4-1BBL gene which positively affects proliferation and activation of T cells and APC cells. In the case of the virus, it can be seen that it induces a better anti-tumor effect than adenovirus expressing only IL-12.

4. 재조합 4. Recombination 아데노바이러스Adenovirus 치료에서 종양조직 내 In tumor tissue in treatment IFNIFN -γ 사이토카인의 발현량 분석Expression Analysis of -γ Cytokines

Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스가 다른 바이러스 보다 증가된 항암효과를 나타내는 것이 종양조직 내의 NK 세포와 CTL 세포에 의한 사이토카인의 변화에 의한 것인지를 검증하기 위하여 종양조직내의 IFN-γ 사이토카인의 함량을 ELISA를 실시하여 비교, 분석하였다. 도 5 에서 볼 수 있듯이 흑색종양에서의 IFN-γ 사이토카인의 발현량을 관찰한 결과, 4-1BBL만 삽입한 아데노바이러스로 치료하였을 때 (57.3 pg/mg ± 10.5) 에도 벡터 컨트롤 그룹(25.2 pg/mg ± 2.2) 보다 현저하게 IFN-γ의 발현을 증가시킬(P<0.01) 뿐만 아니라 IL-12만 삽입한 두 종류의 아데노바이러스로 치료한 그룹에서는(279.2 pg/mg ± 18.3 (Ad-ΔB7/IL12); 366.3 pg/㎎ ± 7.5 (Ad-ΔB7/IL12/41BBL) 다른 IL-12를 삽입하지 않은 아데노바이러스로 치료한 그룹 (25.2 pg/mg ± 2.2 (Ad-ΔB7); 57.3 pg/mg ± 10.5 (Ad-ΔB7/41BBL) 보다 훨씬 더 현저하게 IFN-γ의 발현을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다(P<0.01). INF-γ의 발현량은 IL-12와 4-1BBL 유전자를 모두 삽입한 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스를 투여한 종양조직에서(366.3 pg/㎎ ± 7.5) Ad-ΔB7/IL12 아데노바이러스를 투여 한 종양조직(279.2 pg/㎎ ± 18.3) 보다 더 많이 확인되었고 현저한 유의성을 나타내었다(P<0.01). 이 결과는 4-1BBL복합자극분자가 NK세포와 CTL의 활성을 증가시킨다는 하나의 유력한 증거이다. 그리고 IL-12의 고 발현에 의한 종양내의 IFN-γ 사이토카인이 현저하게 많아질 뿐만 아니라 IL-12와 4-1BBL의 동시 고 발현으로 인해 더 현저하게 많아진다는 것을 보여주는데 간접적으로 IL-12가 강력한 NK 세포와 CTL 의 활성을 유도하는 사이토카인일 뿐만 아니라 4-1BBL복합자극분자의 고 발현이 동시에 존재할 때 NK세포와 CTL의 활성을 유도하는 기능이 더한층 높아진다는 것을 의미한다. IFN-γ cytokines in tumor tissues to verify whether Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenoviruses exhibit increased anticancer effects than other viruses due to cytokine changes by NK cells and CTL cells in tumor tissues Was compared and analyzed by ELISA. As shown in FIG. 5, the expression levels of IFN-γ cytokines in the melanoma were observed. When treated with adenovirus containing only 4-1BBL (57.3 pg / mg ± 10.5), the vector control group (25.2 pg / mg ± 2.2) significantly increased the expression of IFN-γ (P <0.01), as well as in the group treated with two adenoviruses with only IL-12 (279.2 pg / mg ± 18.3 (Ad-ΔB7) 366.3 pg / mg ± 7.5 (Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL) group treated with adenovirus without other IL-12 (25.2 pg / mg ± 2.2 (Ad-ΔB7); 57.3 pg / mg It was found that the expression of IFN-γ was increased significantly more significantly than ± 10.5 (Ad-ΔB7 / 41BBL) (P <0.01) .The expression level of INF-γ was inserted into both IL-12 and 4-1BBL genes. Tumor tissue administered with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenovirus (366.3 pg / mg ± 7.5) than tumor tissue administered with Ad-ΔB7 / IL12 adenovirus (279.2 pg / mg ± 18.3) It was well identified and markedly significant (P <0.01), which is one of the strongest evidences that 4-1BBL complex stimulatory molecules increase the activity of NK cells and CTL, and the high expression of IL-12 in tumors. Not only is the IFN-γ cytokine not only significantly higher, but also more pronounced due to simultaneous high expression of IL-12 and 4-1BBL, indirectly IL-12 induces the activity of potent NK cells and CTLs. In addition, when high expression of 4-1BBL complex stimulatory molecules is present at the same time, it means that the function of inducing the activity of NK cells and CTL is further increased.

5. 재조합 5. Recombination 아데노바이러스Adenovirus 치료 그룹 Treatment group 비장세포의Splenocyte IFNIFN -γ -γ EnzymeEnzyme -- LinkedLinked ImmuneImmune SpotSpot ( ( ELISpotELISpot ) 분석 ) analysis

재조합 아데노바이러스를 투여한 마우스에서 종양세포 특이적 면역 세포의 빈도가 어느 정도 증가되었는지 분석하기 위하여, 주로 NK 세포와 CD8+ T 세포에 의해 분비되는 항종양에서 중요한 사이토카인인 IFN-γ를 분비하는 세포들의 빈도를 ELISpot 분석으로 측정하였다. 아데노바이러스 치료가 끝난 마우스에서 분리한 비장세포를 조사(irradiation)를 준 B16-F10 세포와 5일간 공동-배양을 시행하고 수집된 비장세포를 1 X 10⁴, 2 X 10⁴, 4 X 10⁴, 8 X 10⁴, 2 X 10⁵, 4 X 10⁵, 8 X 10⁵개씩 항-마우스 IFN-γ 항체로 코팅된 96 웰-PVDF 멤브레인 플레이트에 분주하고 12시간 반응시켰다. 실험에서는 BDTM ELISPOT 마우스 IFN-γ Set (Pharmingen, San Diego, USA)를 사용하였고 그 실험법으로 진행하였다. 도 6 에서 볼 수 있듯이 4 X 10⁴ 개의 비장세포를 처리한 경우, Ad-ΔB7/IL12를 투여한 마우스의 경우 spot의 개수가 175.7 ± 20.3으로 다른 세 개의 그룹 즉, PBS (14.0 ± 3.1)와 Ad-ΔB7 (29.0 ± 6.2), Ad-ΔB7/41BBL (40.3± 6.1) 에 비해 크게 증가하였으며 (P<0.001) 특히 IL-12와 4-1BBL 유전자가 동시에 삽입된 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 경우 더욱 크게 증가한 spot (409.3 ± 17.0) 개수를 관찰하였다 (P<0.001, versus Ad-ΔB7/IL12). 이것은 종양 내로 Ad-ΔB7/IL12와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스를 투여하였을 때 IL-12의 고 발현에 의해 IFN-γ를 분비하는 종양세포 특이적 면역 세포가 현저하게 증가 될 뿐만 아니라 IL-12와 4-1BBL의 협력기전에 의하여 IFN-γ를 분비하는 종양 특이적 면역 세포의 개수가 더욱 현격하게 증가 되었음을 의미한다. To analyze the increased frequency of tumor cell specific immune cells in mice treated with recombinant adenovirus, cells secreting IFN-γ, an important cytokine in antitumor secreted mainly by NK cells and CD8 + T cells Frequency was measured by ELISpot assay. Splenocytes isolated from adenovirus-treated mice were co-cultured with irradiated B16-F10 cells for 5 days and the collected splenocytes were 1 X 10 ⁴ , 2 X 10 ⁴ , 4 X 10 ⁴ , 8 × 10 ⁴ , 2 × 10 ⁵ , 4 × 10 ⁵ , and 8 × 10 ⁵ each were dispensed into 96 well-PVDF membrane plates coated with anti-mouse IFN-γ antibody and reacted for 12 hours. In the experiment, BDTM ELISPOT mouse IFN-γ Set (Pharmingen, San Diego, USA) was used and proceeded to the test method. As can be seen in FIG. 6, when treated with 4 × 10 ⁴ splenocytes, mice treated with Ad-ΔB7 / IL12 had a number of spots of 175.7 ± 20.3, and the other three groups, namely, PBS (14.0 ± 3.1) and Significant increase compared to Ad-ΔB7 (29.0 ± 6.2) and Ad-ΔB7 / 41BBL (40.3 ± 6.1) (P <0.001), especially for Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL with IL-12 and 4-1BBL genes inserted A significantly increased number of spots (409.3 ± 17.0) was observed (P <0.001, versus Ad-ΔB7 / IL12). This resulted in a marked increase in tumor cell specific immune cells that secrete IFN-γ by high expression of IL-12 when Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL viruses were administered into tumors. The cooperative mechanism of 12 and 4-1BBL increased the number of tumor-specific immune cells that secrete IFN-γ.

6. 종양 선택적 살상 6. Tumor selective killing 아데노바이러스Adenovirus 치료에서 흑색종양 내의 면역세포 분포분석 Analysis of Immune Cell Distribution in Melanoma in Treatment

치료 후 5일 뒤 종양 내 괴사범위를 비교, 분석하기 위하여 H&E 염색을 실시하였다. 결과, Ad-ΔB7/41BBL를 투여하였을 때 벡터 대조군 아데노바이러스인 Ad-ΔB7를 투여한 그룹에 비하여 좀 더 넓은 종양 괴사범위가 확인 되었고 IL-12 유전자를 삽입한 종양특이적 살상 복제 가능한 아데노바이러스인 Ad-ΔB7/IL12와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL로 치료한 종양에서는 종양크기가 제일 많이 줄었을 뿐만 아니라 종양조직 괴사범위도 크게 증가하였다. 또한 종양 조직 내 침윤된 림프구 세포군집을 조사하기 위하여 CD4+, CD8+ T 림프구를 특이적으로 인지할 수 있는 항체와 수지상세포군을 인지하는 CD86, CD11c 항체를 사용하여 조직면역염색법을 실시하였다. 실험 결과 4-1BBL 유전자가 삽입된 Ad-ΔB7/41BBL로 치료한 종양에서 벡터 대조군 아데노바이러스인 Ad-ΔB7 보다 좀 더 많은 CD4+와 CD8+ T 세포군집과 CD86+, CD11c+ 세포군집을 확인하였고 IL-12 유전자가 삽입된 Ad-ΔB7/IL12, Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스의 경우 많이 증가된 CD4+, CD8+ T 세포군집과 CD86+, CD11c+ 세포군집을 확인하였다. 그리고 이러한 세포군집의 침윤이 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스로 치료한 종양에서 약간 더 많이 나타나는 것을 확인하였다. 이것은 NK, T 세포의 강력한 활성화 기능을 하는 IL-12 단백질과 T, NK 세포와 항원제시세포(APC)등 세포의 증식, 활성화, 생존에 긍정적인 신호를 주는 4-1BBL 단백질을 고 발현시킴으로써 이런 협력작용에 의한 결과일 것으로 사료된다. Five days after treatment, H & E staining was performed to compare and analyze the necrotic range in the tumor. As a result, when Ad-ΔB7 / 41BBL was administered, a wider range of tumor necrosis was observed than the group administered with Ad-ΔB7, a vector control adenovirus. In tumors treated with Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL, the tumor size decreased most and the tumor tissue necrosis range increased significantly. In addition, tissue immunostaining was performed using antibodies that can specifically recognize CD4 + and CD8 + T lymphocytes and CD86 and CD11c antibodies that recognize dendritic cell populations. In the tumor treated with Ad-ΔB7 / 41BBL inserted with 4-1BBL gene, more CD4 + and CD8 + T cell populations and CD86 + and CD11c + cell populations were identified than the vector control adenovirus Ad-ΔB7. In the case of Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL viruses, the CD4 + and CD8 + T cell populations and CD86 + and CD11c + cell populations were significantly increased. And it was confirmed that the infiltration of this cell population appeared slightly more in tumors treated with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus. This is achieved by high expression of IL-12 protein, a potent activator of NK and T cells, and 4-1BBL protein, which is a positive signal for proliferation, activation and survival of cells such as T, NK cells and antigen presenting cells (APC). It is thought to be the result of cooperative action.

7. 재조합 7. Recombination 아데노바이러스Adenovirus 치료에서의 In therapy CTLCTL 분석 analysis

이미 제작된 재조합 아데노바이러스가 종양살상능에서 주로 종양특이적 세포독성 CD8⁺ T 세포에 의하여 이루어진다는 것을 확인, 검증하기 위하여 이 실험을 진행하였다. 인 비보 실험과정은 ELISpot 분석 과정과 동일하게 진행하였으며 대조 타깃 세포로는 Mus dunni 종양세포를 사용하였다. 실험 결과 IL-12가 삽입된 아데노바이러스인 경우 현격한 세포살상능이 확인 되였으며(T:E=1:45에서 Ad-ΔB7/IL12는 22.20%± 1.48, Ad-ΔB7/IL12/41BBL는 25.88%± 0.94), 그 중 4-1BBL 단백질을 발현할 수 있는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL는 더 현저한 세포살상능의 차이를 보였다(P<0.01 versus Ad-ΔB7/IL12 그룹). 반면에 Mus dunni 세포에서는 이러한 살상효과가 5~7% 미만에 그치는데 불과 하였다(데이터 제시하지 않음). 이 결과에서, IL-12 사이토카인이 항 종양면역에서도 확실한 종양특이적 세포독성 CD8⁺ T 세포의 활성자 기능을 하며 또한 이렇게 활성화된 종양특이적 세포독성 CD8⁺ T 세포는 4-1BBL에 의해 그 량의 증가와 생명연장으로 더 강력하게 표현 되었다고 보여진다. This experiment was carried out to confirm and verify that the recombinant adenoviruses already prepared are mainly caused by tumor specific cytotoxic CD8 ⁺ T cells in the tumor killing ability. In vivo experiments were performed in the same manner as the ELISpot assay and Mus dunni tumor cells were used as control target cells. As a result, IL-12-incorporated adenoviruses showed marked cell killing ability (22.20% ± 1.48 for Ad-ΔB7 / IL12 and 25.88% for Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL at T: E = 1: 45). ± 0.94), among which Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL, which can express 4-1BBL protein, showed a more significant difference in apoptosis (P <0.01 versus Ad-ΔB7 / IL12 group). On the other hand, in Mus dunni cells, this killing effect was only 5-7% (data not shown). In this result, IL-12 cytokine is a solid tumor specific anti-tumor cell activity capabilities of toxicity CD8 ⁺ T cells in the immune, and thus also the activated tumor-specific cytotoxic CD8 ⁺ T cells is that by 4-1BBL It is shown to be more strongly expressed by the increase in quantity and the extension of life.

8, 8, 골수유래Bone marrow 수지상세포( Dendritic cells ( BoneBone marrowmarrow derivedderived dendriticdendritic cellscells , , BMDCsBMDCs )의 분화과정과 Eruption process FACSFACS 분석 analysis

마우스에서 추출한 수지상세포의 분화와 활성화 정도를 알아보기 위하여 활성화된 DCs에서 과 발현되어 있다고 알려진 표식자를 인지하는 항체를 사용하여 FACS 분석을 실시하였다. CD11c⁺, CD40⁺, CD86⁺, MHCⅡ 세포군은 93.13%, 62.95%, 60.82%, 89.65%로 각각 관찰 되었다. 한편 마우스에서 분리한 수지상세포의 경우, 다른 면역세포에 의해 오염될 수 있기 때문에 T 세포의 군집을 알아보는 표식자인 CD3e⁺ 와 B 세포 군집의 표식자인 CD19⁺, 단핵세포 표식자 CD14⁺ 세포군집의 량을 확인 하였다. CD3e⁺ 세포군집은 0.68%, CD19⁺ 세포군집의 경우 3.29%, CD14⁺ 단핵세포군집의 경우 9.42%로 검출되었다. 따라서 상술한 방법으로 추출한 골수유래 마우스 수지상세포(BMDCs)의 경우 수지상세포에서 발현하는 표식자가 과 발현 되어 있어 전형적인 수지상세포의 특징을 보이고 있을 뿐만 아니라 T, B 세포와 단핵세포의 오염도가 낮은 순도 높은 수지상세포(DCs)를 수득하였음을 알 수 있었다. 또한 도 9 의 현미경사진으로 수지상세포의 형태를 관찰한 결과 돌기가 방사형으로 돌출된 전형적인 수지상세포의 성숙된 형태임을 관찰할 수 있었다. FACS analysis was performed using antibodies that recognize markers known to be overexpressed in activated DCs to determine the degree of differentiation and activation of dendritic cells extracted from mice. CD11c ⁺ , CD40 ⁺ , CD86 ⁺ and MHCII cell populations were observed in 93.13%, 62.95%, 60.82% and 89.65%, respectively. In contrast, dendritic cells isolated from mice could be contaminated by other immune cells. Thus, CD3e ⁺ , a marker for identifying T cell populations, and CD19 ⁺ , a monocyte marker CD14 ⁺ , for markers of B cell populations. Check it. The CD3e ⁺ cell population was detected as 0.68%, 3.29% for CD19 ⁺ cell population, and 9.42% for CD14 ⁺ mononuclear cell population. Therefore, the bone marrow-derived mouse dendritic cells (BMDCs) extracted by the above-described method are overexpressed with markers expressed in dendritic cells, which not only show typical dendritic cell characteristics but also have high purity with low contamination of T, B cells and mononuclear cells. It was found that dendritic cells (DCs) were obtained. In addition, as a result of observing dendritic cell morphology with the micrograph of FIG.

9. 9. 멜라노마Melanoma 모델에서의 In the model AdAd -ΔB7/-ΔB7 / IL12IL12 /41/ 41 BBLBBL 종양 특이적 살상 복제가능 재조합 Tumor Specific Killing Replicable Recombination 아데노바이러스와Adenovirus and DCs의 병합치료에 의한 By combination therapy of DCs 항 종양Antitumor 효과 effect

본 연구에서 제작된 아데노바이러스 중 종양살상능이 가장 우수한 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스와 종양 항원으로 인지시킨 수지상세포를 병합 투여하여 항 종양 효과가 증가되는지를 생쥐의 피하에 만든 B16-F10 흑색종양 모델에서 종양 내로의 직접적인 투여방식으로 비교, 검증하였다. 투여량과 투여방식은 실험방법대로 시행하였다. 12일에 종양의 크기를 분석한 결과 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스와 DCs를 병합하여 투여한 그룹(20.8 ㎣ ± 12.3)이 바이러스를 단독 투여한 그룹(281.5 ㎣ ± 92.4) 보다 현저한 항 종양효과를 보였으며(P<0.05), DCs를 단독 투여한 그룹(2347.9 ㎣ ± 1107.1)보다는 더 강력한 항 종양 효과를 보였으며(P<0.001) 80일 까지 관찰하였을 때 종양이 완전 소실된 마우스도 3 마리가 있었으며(3/7) 이들 마우스는 추후의 관찰기간 동안(120 일)에도 종양이 다시 생성되지 않았다. DC로 단독 치료한 그룹은 PBS 치료그룹(6148.1 ㎣ ± 646.5)에 비하여 항 종양효과가 우수하였다(p<0.01). 모든 그룹의 마우스 개체 수는 6~7 마리이고 3회의 반복 실험에서 모두 유사한 결과가 확인되었다. B16-F10 melanoma, which was produced subcutaneously in mice, to determine whether the anti-tumor effect is increased by combining Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus with the best tumor killing ability and dendritic cells recognized as a tumor antigen. The model was compared and verified by direct administration into the tumor. Dosage and mode of administration were performed according to the experimental method. On the 12th day, the tumor size was analyzed and the anti-tumor effect of Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus combined with DCs (20.8 ㎣ ± 12.3) was significantly higher than that of the virus alone (281.5 ㎣ ± 92.4). (P <0.05), more potent antitumor effect than the DCs alone group (2347.9 ㎣ ± 1107.1), and 3 mice with complete tumor loss when observed up to 80 days (3/7) and these mice did not regenerate tumors during the later observation period (120 days). The group treated with DC alone had better antitumor effect than the PBS group (6148.1 mm ± 646.5) (p <0.01). The number of mouse populations in all groups was 6-7 and similar results were found in all three replicates.

10. 흑색종 폐 10. Melanoma Lung 자연전이암Natural metastasis 모델에서의 억제 전이 관찰 Inhibition transition in the model

인 비보 에서 이미 그 종양살상기능이 검증이 된 IL-12와 4-1BBL 단백질을 고 발현할 수 있는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 종양 선택적 살상 복제가능 아데노바이러스와 수지상세포(DCs)의 병합치료가 흑색종 전이에서 어떠한 효과를 보일 것인지를 관찰하기 위하여, B16BL6 마우스 흑색종 폐 자연전이 모델에서 치료한 후 비교, 분석하였다. 마우스의 오른쪽 발바닥에 흑색종양을 유도한 다음 크기가 180~200 ㎣ 되었을 때(18일째)부터 바이러스와 수지상세포의 투여를 실험방법에서 제시한 대로 시행하였다(23일째 마지막 DC 투여가 끝남). 도 11a에서 보는 바와 같이 DCs 투여까지 끝나고 3일 뒤에(26일째) 오른쪽 무릎관절을 잘라버리고, 22 일 뒤에(48일째) 마우스를 경추 탈골 시켜 폐의 자연전이 된 양상을 관찰한 결과, PBS 그룹 전부 마우스의 폐에서 전이된 흑색종양을 확인 할 수가 있었다. 폐의 자연전 이 결절(nodules)은 매 그룹의 결절 크기에 근거하여 Greate(>1 ㎝), Large(1 ㎝≥ large >0.5 ㎝), Medium(0.5 ㎝≥Medium>0.3 ㎝), Small(0.3 ㎝≥Small)로 나누어 분석하였다. 도 11c 에서 볼 수 있듯이 폐의 자연전이 결절 관찰에서 DCs와 바이러스의 단독 치료 그룹이 PBS 그룹에 비교하여 자연전이 결절을 많이 감소시킬 뿐만 아니라 DCs와 바이러스의 병합치료는 더 확실히 크기가 큰 결절(great nodule)을 감소시킨다는 것을 알 수 있었다. 그리고 폐의 무게를 측정한 결과 PBS를 투여한 그룹(505.0 ㎎ ± 59.3)에 비하여 DCs 단독 치료그룹(340 ㎎ ± 83.8)(p<0.05), 바이러스 단독 치료 그룹(295 ㎎ ± 65.8)(p<0.01)은 유의하게 폐의 무게가 적었다. 그리고 또 바이러스와 DCs의 병합치료 그룹(226.7 ㎎ ± 15.2)은 바이러스 단독 치료 그룹에 비하여 큰 유의성을 보였으나(P=0.015) DCs를 단독 처리한 그룹에 비하여 편차가 큰 영향으로 유의성을 보이지 않았다(P=0.0572, 340 ㎎ ± 83.8). 그러나 폐 무게가 현저하게 감소하는 경향성은 확인할 수 있었다. 매 그룹의 마우스 개체 수는 6-7 마리이고 3 회 반복 실험에서 모두 유사한 결과가 확인되었다. 이 결과에서 종양항원으로 활성화된 수지상세포로 흑색종양을 치료하였을 때 폐의 전이를 억제할 뿐만 아니라 IL-12와 4-1BBL를 고 발현시켜도 폐로의 전이를 억제한다는 것을 알 수 있었다. 수지상세포와 IL-12, 4-1BBL를 병합하여 치료할 때에는 더 현저하게 전이를 억제하는 작용을 한다는 것을 알 수 있었다. Ad-ΔB7/IL12/4-1BBL 재조합 아데노바이러스와 수지상세포를 병합하여 치료에 사용하였을 때 각각 단독으로 치료에 사용하였을 때 보다 더 현저하게 마우스 흑색종양의 폐로의 전이를 억제한다는 것은 이러한 병합치료방식이 전이억제에 대한 종양 특이적 기억면역 에도 뛰어난 기능을 한다는 것을 의미한다. The combined therapy of tumor destruction already that function selectively 4-1BBL and IL12 protein and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant tumor is capable of expressing clone can be verified destruction adenovirus and dendritic cells (DCs) in vivo In order to observe the effect on the melanoma metastasis, B16BL6 mouse melanoma lung natural metastasis model was treated after comparison and analysis. After inducing melanoma on the right foot of the mouse, the virus and dendritic cells were administered from 180 to 200 mm 3 (day 18), as suggested by the experimental method (last DC administration on day 23). As shown in FIG. 11A, the right knee joint was cut out after 3 days (Day 26) and until 22 days (Day 48) after DCs administration. Melanoma metastases from the lungs of mice could be identified. Natural nodules in the lungs are defined as Greate (> 1 cm), Large (1 cm≥ large> 0.5 cm), Medium (0.5 cm≥Medium> 0.3 cm), and Small (0.3) based on the size of each group of nodules. Divided by cm≥Small). As can be seen in FIG. 11C, the monotherapy group of DCs and virus not only reduced the natural metastasis nodule significantly compared to the PBS group, but the combination therapy of DCs and virus was more obviously larger in the observation of natural metastatic nodules in the lungs. nodule). The lung weight was measured and compared with the group treated with PBS (505.0 mg ± 59.3), the DCs treatment group (340 mg ± 83.8) (p <0.05), and the virus treatment group (295 mg ± 65.8) (p < 0.01) significantly less lung weight. In addition, the combination of virus and DCs group (226.7 mg ± 15.2) showed greater significance than the virus-only group (P = 0.015), but there was no significant difference due to the significant difference compared to the group treated with DCs alone (P = 0.015). P = 0.0572, 340 mg ± 83.8). However, the tendency to significantly reduce lung weight was confirmed. The number of mouse populations in each group was 6-7 and similar results were found in all three replicates. These results indicate that treatment of melanoma with dendritic cells activated with tumor antigens not only inhibits lung metastasis but also inhibits metastasis to lung even when high expression of IL-12 and 4-1BBL is achieved. In combination with dendritic cells and IL-12, 4-1BBL treatment it was found that the action to inhibit the metastasis more significantly. Combination therapy of Ad-ΔB7 / IL12 / 4-1BBL recombinant adenovirus and dendritic cells, when used for treatment, significantly inhibited the metastasis of mouse melanoma to the lung than when used alone for treatment. This means that it is also excellent in tumor-specific memory immunity to this metastasis inhibition.

11. 11. AdAd -ΔB7/-ΔB7 / IL12IL12 /41/ 41 BBLBBL 재조합 Recombination 아데노바이러스와Adenovirus and DCsDCs 의 병합치료에서 종양조직 내 Intratumoral tissue in combination therapy IFNIFN -γ 사이토카인의 발현량 분석 Expression Analysis of -γ Cytokines

Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스와 DCs의 병합치료에서 다른 단독 투여 그룹 보다 더 증가된 항암효과를 나타내는 것이 종양조직 내의 면역 세포에 의한 사이토카인의 변화에 의한 것인지를 검증하기 위하여 종양조직내의 IFN-γ 사이토카인의 함량을 ELISA를 실시하여 비교, 분석하였다. 도 12 에서 볼 수 있듯이 Ad-ΔB7/IL12/41BBL와 수지상세포(DCs)를 병합하여 투여한 종양조직에서(508.4 pg/㎎ ± 29.5) DCs를 단독 투여(316.9 pg/㎎ ± 14.8), 혹은 바이러스를 단독으로 투여한 종양조직(IFN-γ: 366.3 pg/㎎ ± 7.5)보다 IFN-γ 사이토카인의 분비를 현저하게 많이 한다는 것을 확인하였다(P=0.0013, versus virus only; P<0.001, versus DC only). 그리고 DCs를 단독으로 투여한 그룹도 PBS 투여 그룹(28.1pg/mg ± 2.9)보다 현저하게 더 많은 량의 IFN-γ를 분비하였다(P<0.001). 그리고 이 실험방법에서 바이러스를 단독으로 투여한 것이 DCs를 단독으로 투여한 것 보다 종양 내에 IFN-γ의 분비를 더 현저하게 많이 한다는 것을 알 수 있었다(P<0.01). 이것은 이러한 치료방법에 의한 IL-12와 4-1BBL 단백질의 동시 고 발현은 DCs만 치료한 방법에 비하여 NK 세포와 CTL의 활성을 조절하는 능력에서 더 강력하다는 것을 의미한다. 그리고 또 바이러스와 DCs 병합투여가 적응성 면역기능의 CTL 세포와 선천적 면역기능의 NK 세포를 더 강력하게 활성화 시킬 수 있다는 것을 의미한다. 이 실험은 3마리/그룹, C57BL/6 마우스의 종양에 치료한 다음 그 종양에서 확인하였으며, 3회의 반복실험을 거쳐 모두 유사한 결과를 얻을 수 있었다. Combination therapy of Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenovirus and DCs in tumor tissues to verify whether the increased anti-cancer effect was caused by changes in cytokines by immune cells in tumor tissues The content of IFN-γ cytokines was compared and analyzed by ELISA. As shown in FIG. 12, DCs were administered alone (316.9 pg / mg ± 14.8), or virus, in tumor tissue administered with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL combined with dendritic cells (DCs) (508.4 pg / mg ± 29.5). It was confirmed that the secretion of IFN-γ cytokine was significantly higher than that of tumor tissue administered alone (IFN-γ: 366.3 pg / mg ± 7.5) (P = 0.0013, versus virus only; P <0.001, versus DC). only). In addition, the group receiving DCs alone secreted significantly more IFN-γ than the PBS group (28.1 pg / mg ± 2.9) (P <0.001). In this experimental method, the administration of virus alone significantly increased the secretion of IFN-γ in the tumor than the administration of DCs alone (P <0.01). This means that simultaneous high expression of IL-12 and 4-1BBL proteins by these treatments is more potent in their ability to modulate NK cell and CTL activity than DCs alone. In addition, the combination of virus and DCs may activate CTL cells of adaptive immune function and NK cells of innate immune function more strongly. This experiment was treated in tumors of 3 mice / group, C57BL / 6 mice, and confirmed in the tumors. Similar results were obtained after three replicates.

12. 12. AdAd -ΔB7/-ΔB7 / IL12IL12 /41/ 41 BBLBBL 재조합 Recombination 아데노바이러스와Adenovirus and 수지상세포를Dendritic cells 병합치료 한 Combined treatment 비장세포의Splenocyte IFNIFN -γEnzyme-Linked -γ Enzyme-Linked ImmuneSpotImmuneSpot (( ELISpotELISpot ) 분석) analysis

한편 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스와 DCs를 병합 투여 시 종양 특이적 면역세포의 증식을 확인하기 위하여 비장세포를 분리, 수거하여 IFN- ELISpot assay를 실시하여 분석하였다. 이러한 종양특이 면역세포는 종양세포와의 공동-배양에 근거하여 간접적으로 확인할 수 있었다. 그 결과 바이러스와 DCs를 함께 치료한 마우스의 경우 4 X 10⁴ 개의 비장세포를 처리한 경우에 spot의 개수가 1025.0 ± 19.2로 다른 그룹에 비하여(PBS: 50.0 ± 5.0, DCs: 323.0 ± 16.5, virus: 527.3 ± 11.8) IFN-γ의 Spot 개수를 훨씬 더 많이 증가 시킨다(P<0.01)는 것을 알 수 있었다. 이 결과는 종양항원을 인지시킨 수지상세포에 의해서도 종양 특이적 면역세포가 증가할 뿐만 아니라 IL-12와 4-1BBL의 유전자 치료에 의해서도 이런 종양 특이적 면역세포가 증식된다는 것을 의미한다. 그리고 IL-12와 4-1BBL 유전자치료와 수지상세포를 병합하여 치료하였을 때 종양 특이적 면역세포가 더 현저하게 증가된다는 것을 의미한다. 이 실험은 3마리/그룹, C57BL/6 마우스의 종양에 치료한 다음 그 비장에서 확인하였으며, 3회의 반복실험을 거쳐 모두 유사한 결과를 얻을 수 있었다. Meanwhile, in order to confirm the proliferation of tumor-specific immune cells when Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus and DCs were administered in combination, splenocytes were isolated and collected and analyzed by IFN-ELISpot assay. These tumor specific immune cells could be identified indirectly based on co-culture with tumor cells. As a result, mice treated with virus and DCs co-treated with 4 x 10 ⁴ splenocytes showed 1025.0 ± 19.2 spots compared to other groups (PBS: 50.0 ± 5.0, DCs: 323.0 ± 16.5, virus : 527.3 ± 11.8) It was found that the number of spots of IFN-γ was increased even more (P <0.01). These results indicate that dendritic cells that recognize tumor antigens not only increase tumor specific immune cells but also proliferate these tumor specific immune cells by gene therapy of IL-12 and 4-1BBL. The combination of IL-12, 4-1BBL gene therapy, and dendritic cells increased tumor-specific immune cells. This experiment was confirmed in the spleen after treatment of tumors of 3 mice / group, C57BL / 6 mice, and all three similar experiments yielded similar results.

13. 13. AdAd -ΔB7/-ΔB7 / IL12IL12 /41/ 41 BBLBBL 와 Wow DCsDCs 병합치료에서의 조직면역염색 분석 Tissue Immunostaining Analysis in Combination Therapy

병합치료 후 종양 내 괴사범위를 비교, 분석하기 위하여 H&E 염색을 실시한 결과 종양특이적 살상 복제 가능한 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스와 DCs를 병합 치료한 그룹에서 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 바이러스 단독 치료 그룹이나 DCs 단독치료 그룹에 비하여 종양크기가 제일 많이 줄었을 뿐만 아니라 종양조직 괴사범위도 제일 컸다. 또한 종양 조직 내 침윤된 림프구 세포군집을 조사하기 위하여 CD4⁺, CD8⁺ T 림프구를 특이적으로 인지할 수 있는 항체와 수지상세포군을 인지하는 CD11c⁺, 그리고 B 세포와 수지상세포, 대식세포등 항원제시세포들의 표식자인 CD86⁺ 항체를 이용하여 조직면역염색을 실시하였다. 실험 결과, T 세포의 강력한 활성화 기능을 하는 IL-12 단백질과 T 세포의 증식과 활성화, 생존 연장에 긍정적인 신호를 주는 4-1BBL 단백질을 발현하는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 아데노바이러스를 투여하여 고 발현 시킴으로써 이런 단백질 기능의 협력에 의해 종양내의 증가된 CD4⁺, CD8⁺ T 군집을 관찰할 수 있었으며 또 증가된 CD86⁺ 항원제시포군집과 CD11c⁺ 수지상세포군집을 확인할 수 있었고, 종양항원으로 인지시킨 활성화된 DCs만 투여한 경우에서도 종양내의 증가된 상기의 면역세포를 확인할 수 있었다. 그리고 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스와 DCs를 병합하여 치료한 종양조직에서는 각각의 단독 투여 그룹에 비해 현격하게 증가된 CD4⁺, CD8⁺ T 세포군집과 CD86⁺, CD11c⁺ 세포군집을 관찰 할 수 있었는데, 이것은 위의 여러 가지 기능의 협력 뿐만 아니라 4-1BBL의 DCs의 활성자 기능도 작용한 것으로 사료된다. H & E staining was performed to compare and analyze necrotic range in tumors after combined treatment. Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL virus in the group treated with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenovirus and DCs capable of tumor specific killing Tumor necrosis was the largest in terms of tumor size as well as the largest reduction in tumor size compared to the monotherapy group or the DCs monotherapy group. In addition, to investigate the infiltrating lymphocyte populations in tumor tissues, CD11c ⁺ , which recognizes CD4 ⁺ , CD8 ⁺ T lymphocytes and CD11c ⁺ which recognizes dendritic cell populations, and antigens such as B cells, dendritic cells, and macrophages Tissue immunostaining was performed using a CD86 ⁺ antibody, a marker of cells. Experimental results showed that administration of IL-12 protein, a potent activator of T cells, and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL adenovirus expressing 4-1BBL protein, a positive signal for proliferation, activation and survival of T cells. By high expression, we could observe the increased CD4 ⁺ , CD8 ⁺ T population in tumors and the increased CD86 ⁺ antigen-presenting and CD11c ⁺ dendritic cell populations. Even when only activated DCs were administered, the increased immune cells in tumors could be confirmed. Tumor tissue treated with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenovirus and DCs were observed to significantly increase CD4 ⁺ , CD8 ⁺ T cell populations and CD86 ⁺ , CD11c ⁺ cell populations compared to the respective treatment groups. This could be attributed to the cooperation of several functions above, as well as the activator function of 4-1BBL's DCs.

14. 재조합 14. Recombination 아데노바이러스Adenovirus (( AdAd -ΔB7/-ΔB7 / IL12IL12 /41/ 41 BBLBBL ) 와 ) Wow 수지상세포Dendritic cells (( DCsDCs ) 병합치료에서의 ) In combination therapy CTLCTL 분석 analysis

Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스가 종양살상능에서 주로 종양특이 세포독성 CD8⁺ T 세포에 의하여 이루어진다는 것이 도 8에서 이미 검증 되었다. 수지상세포와의 병합치료를 시행함으로 이러한 세포살상능을 더 한층 상향 조정할 수 있다는 것을 검증하기 위하여 이 실험을 진행하였다. 실험과정은 ELISpot assay 과정과 거의 유사하게 진행하였으며 대조 세포로는 Mus dunni 종양세포를 사용하였다. 실험 결과(도 15 참조) 바이러스 단독 치료그룹, DCs 단독 치료그룹과 병합치료그룹에서 모두 T:E 비례 증가에 따라 흑색종종양세포 살상효과도 증가하는 것을 관찰하였다. Ad-ΔB7/IL12/41BBL 그룹과 DCs 그룹은 거의 비슷한 세포살상 효과(T:E=1:45에서 virus group은 25.88%± 0.94, DCs group은 22.53%± 1.40)를 보였지만 병합하여 치료한 그룹은 더 한층 업그레이드된 세포살상능을 보여주었다(T:E=1:45에서 34.95%± 0.91, P<0.01, versus virus and DCs only group). 반면에 Mus dunni 세포에서는 이러한 살상효과가 6% 미만에 그치는데 불과 하였다(data not shown). 이 결과에서 알 수 있듯이 DCs 세포치료는 항 종양 면역에서 확실한 종양특이 세포독성 CD8⁺ T 세포의 활성자 기능을 하며 또한 이렇게 활성화된 종양 특이 세포독성 CD8⁺ T 세포는 IL-12 사이토카인과 4-1BBL 복합자극 단백질 병합치료에 의하여 그 량의 증가와 생명연장을 유도하여 CTL반응을 더 강력하게 표현한다는 것을 의미한다. 다른 한편 4-1BBL 복합자극은 수지상세포의 활성화에 영향을 미친다고 사료할 수 있었다. 그리고 또 재조합 아데노바이러스에 의해 살상된 종양세포의 항원이 종양 내로 투여한 수지상세포의 종양특이 활성화에 더 도움을 주었을 것이라고도 사료할 수 있다. It has already been verified in FIG. 8 that Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenovirus is made mainly by tumor specific cytotoxic CD8 ⁺ T cells in tumor killing ability. This experiment was conducted to verify that the cell killing ability could be further adjusted by performing the combined treatment with dendritic cells. The experimental procedure was similar to that of ELISpot assay and Mus dunni tumor cells were used as control cells. Experimental results (see FIG. 15) In the virus alone treatment group, DCs alone treatment group and the combination treatment group, it was observed that the effect of melanoma cell death also increased with T: E proportional increase. Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL group and DCs group showed almost similar cytotoxic effect (25.88% ± 0.94 for virus group and 22.53% ± 1.40 for DCs group at T: E = 1: 45) It showed more upgraded apoptosis (34.95% ± 0.91, P <0.01, versus virus and DCs only group at T: E = 1: 45). On the other hand, in Mus dunni cells, this killing effect was only less than 6% (data not shown). As can be seen from the results DCs cell therapy, wherein the activator function of the specific solid tumors in tumor vaccination, cytotoxic CD8 ⁺ T cells and thus also the activated tumor-specific cytotoxic CD8 ⁺ T cells, IL-12 cytokines and 4- This means that the combination of 1BBL complex stimulation protein induces an increase in its volume and prolongs life, thereby expressing the CTL response more strongly. On the other hand, 4-1BBL complex stimulation may be thought to affect the activation of dendritic cells. In addition, it can be considered that antigens of tumor cells killed by recombinant adenovirus may have helped tumor specific activation of dendritic cells administered into tumors.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

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도 1a - 도 1i는 본 발명에 이용된 재조합 아데노바이러스 및 이를 이용하여 구축된 IL-12 및/또는 41-BBL 발현 재조합 아데노바이러스의 구체적인 실시예를 보여준다. “★”는 E1A의 Rb(retinoblastoma) 결합 위치인 CR1에서 45번째 아미노산의 글루탐산 (Glu)이 글라이신 (Gly)로 치환된 것과 CR2에서 7개 아미노산 (DLTCHEA)이 7개 글라이신 (GGGGGGG)으로 치환된 변이를 나타낸다. Δ는 해당서열이 결실된 것을 나타내고, ITR은 inverted terminal repeat의 축약어이고, Ψ는 패키지 시그널을 포함하는 서열을 나타내며, 기호 Ad는 아데노바이러스의 축약어이고, EP는 진핵세포 프로모터를 나타내며, IX는 Ad 단백질 IX 유전자, polA는 SV40 유래 폴리 아데닐화 서열이다. 1A-1I show specific examples of recombinant adenovirus used in the present invention and IL-12 and / or 41-BBL expressing recombinant adenovirus constructed using the same. “★” indicates that the 45th amino acid glutamic acid (Glu) was substituted with glycine (Gly) at CR1, the Rb (retinoblastoma) binding position of E1A, and the 7 amino acids (DLTCHEA) were replaced with 7 glycine (GGGGGGG) at CR2. Indicates mutation. Δ represents the corresponding sequence deleted, ITR stands for inverted terminal repeat, Ψ represents a sequence containing the package signal, the symbol Ad is an abbreviation of the adenovirus, EP represents the eukaryotic promoter, IX is Ad The protein IX gene, polA, is a polyadenylation sequence derived from SV40.

도 1a는 본 발명의 재조합 아데노바이러스(Ad-ΔB7) 유전자의 기본 골격을 나타낸다. 도 1b는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영역에 4-1BBL 유전자가 삽입된 유전자 지도를 나타내며, 도 1c는 재조합 아데노바이러스 E3 영역에 4-1BBL 유전자가 삽입된 것을 나타낸다. 도 1d는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영역에 IL-12 유전자가 삽입된 유전자 지도를 나타내며, 도 1e는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E3 영역에 IL-12 유전자가 삽입된 것을 나타낸다. 도 1f는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영역에 IL-12 유전자가, E3 영역에 4-1BBL 유전자가 각각 삽입된 것을 나타낸다. 도 1g는 본 발명의 재조합 아데노바이러스 E1B 영역에 4-1BBL 유전자가, E3 영역에 IL-12 유전자가 삽입된 것을 나타낸다. 도 1h 및 도 1i는 E1A 유전자에 돌연변이를 갖지 않는 재조합 아데노바이러스 기본 골격 에 IL-12 유전자 및 4-1BBL 유전자가 E1B 영역 또는 E3 영역에 삽입된 재조합 아데노바이러스의 유전자 지도를 나타낸다. IL-12: 마우스 인터루킨-12, 75kDa, 4-1BBL: 마우스 4-1BB 리간드. 1A shows the basic skeleton of the recombinant adenovirus (Ad-ΔB7) gene of the present invention. FIG. 1B shows a gene map in which a 4-1BBL gene is inserted into a recombinant adenovirus E1B region of the present invention, and FIG. 1C shows a 4-1BBL gene inserted into a recombinant adenovirus E3 region. 1D shows a gene map in which an IL-12 gene is inserted into a recombinant adenovirus E1B region of the present invention, and FIG. 1E shows an IL-12 gene inserted into a recombinant adenovirus E3 region of the present invention. Figure 1f shows that the IL-12 gene is inserted into the recombinant adenovirus E1B region of the present invention, and the 4-1BBL gene is inserted into the E3 region, respectively. 1G shows that the 4-1BBL gene is inserted into the recombinant adenovirus E1B region of the present invention and the IL-12 gene is inserted into the E3 region. 1H and 1I show gene maps of recombinant adenoviruses in which the IL-12 gene and the 4-1BBL gene are inserted into the E1B region or the E3 region in the recombinant adenovirus basic skeleton having no mutation in the E1A gene. IL-12: mouse interleukin-12, 75kDa, 4-1BBL: mouse 4-1BB ligand.

도 2a 및 도 2b는 IL-12 및 4-1BBL 단백질을 확인한 결과를 보여준다. 도 2a는 Ad-ΔB7/41BBL 및 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 감염에 의한 4-1BBL 유전자 발현에 대한 웨스턴 블로팅 분석 결과를 보여준다. 재조합 아데노바이러스를 B16-F10 마우스 멜라노마 세포주에 감염시키고 세포를 20시간 후에 회수한 후 웨스턴 블로팅 분석을 수행하였다. 4-1BB 리간드 단백질은 4-1BB 리간드 유전자가 삽입된 바이러스에서만 검출되었고, 그 크기는 35k Da-50 kDa 이었다. 4-1BBL 단백질은 아데노바이러스 타이터에 비례하여 증가하였다. 아데노바이러스의 E1B 부위에 IL-12 유전자가 삽입된 경우이든 삽입되지 않은 경우이든 4-1BBL 단백질의 발현능력에는 많은 변화는 없었다. 도 2b는 재조합 아데노바이러스 감염에 의한 IL-12 발현 결과를 보여준다. 재조합 아데노바이러스를 B16-F10 마우스 멜라노마 세포주에 감염시키고 48시간 후에 배지를 회수하여 ELISA 분석을 수행하였다. 뮤린 IL-12 단백질은 IL-12 유전자 삽입된 바이러스에 의해서만 검출되었다(Ad-ΔB7/IL12 데이터는 제시하지 않음). IL-12 유전자 비-삽입된 바이러스와 비교하여 상당히 많은 양이 발현되었고 (p<0.001), IL-12 발현은 MOI(0, 25, 50 및 100 MOI) 증가에 따른 감염된 바이러스에 비례하여 증가하였다. 2A and 2B show the results of confirming the IL-12 and 4-1BBL proteins. 2A shows the results of Western blotting analysis for 4-1BBL gene expression by Ad-ΔB7 / 41BBL and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL infection. Recombinant adenovirus was infected with B16-F10 mouse melanoma cell line and cells were harvested after 20 hours followed by Western blotting analysis. The 4-1BB ligand protein was detected only in the virus into which the 4-1BB ligand gene was inserted, and its size was 35k Da-50 kDa. 4-1BBL protein increased in proportion to adenovirus titers. Whether IL-12 gene was inserted into the E1B site of adenovirus or not, there was no significant change in the expression capacity of 4-1BBL protein. 2B shows the results of IL-12 expression by recombinant adenovirus infection. Recombinant adenovirus was infected with B16-F10 mouse melanoma cell line and the media was recovered 48 hours later to perform ELISA analysis. Murine IL-12 protein was detected only by IL-12 transgenic virus (Ad-ΔB7 / IL12 data not shown). Significantly greater amounts were expressed (p <0.001) compared to IL-12 gene non-inserted virus, and IL-12 expression increased in proportion to infected virus with increasing MOI (0, 25, 50 and 100 MOI). .

도 3은 IL-12, 또는 IL-12 및 4-1BBL을 발현하는 아데노바이러스의 종양살상분석 결과를 보여준다. 세포주는 B16-F10 마우스 멜라노마, A549 인간 폐암세포, 및 U343 인간 글리오블라스토마 종양세포이다. 바이러스는 0.1 - 200의 MOI(multiplicity of infection)이었다. B16-F10를 감염시켰다. 바이러스 감염 효율을 증가시키기 위해 리포펙타민(Lipopectamine)을 사용하였다. 레인 1은 Ad-ΔE1; 레인 2는 Ad-ΔB7; 레인 3은 Ad-ΔB7/41BBL; 레인 4는 Ad-ΔB7/IL12; 레인 5는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 이다. 이 결과에 의해 복제가능한 종양 선택적 살상 아데노바이러스가 마우스 암세포에서 보다 인간 암세포에서 종양 살상능력이 우수하다는 것을 알 수 있다. 이러한 결과들은 본 발명의 종양선택적 살상 재조합 아데노바이러스가 인간 및 마우스 암세포주에서 복제할 수 있으며, B16-F10 마우스 멜라노마 세포주에서보다 인간 암세포주에서 복제능력이 우수하고, IL-12 및 4-1BBL의 발현이 고전적 세포변성효과(CPE, cytopathic effect)를 유도하는 바이러스의 능력을 떨어뜨리지 않는다는 것을 암시한다. Figure 3 shows the results of oncolytic analysis of adenoviruses expressing IL-12, or IL-12 and 4-1BBL. The cell lines are B16-F10 mouse melanoma, A549 human lung cancer cells, and U343 human glioblastoma tumor cells. The virus was a multiplicity of infection (MOI) of 0.1-200. B16-F10 was infected. Lipopectamine was used to increase viral infection efficiency. Lane 1 is Ad-ΔE1; Lane 2 is Ad-ΔB7; Lane 3 is Ad-ΔB7 / 41BBL; Lane 4 is Ad-ΔB7 / IL12; Lane 5 is Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL. These results show that the cloned tumor selective killing adenovirus has better tumor killing ability in human cancer cells than in mouse cancer cells. These results indicate that the oncolytic recombinant adenovirus of the present invention can replicate in human and mouse cancer cell lines, has better replication ability in human cancer cell lines than in B16-F10 mouse melanoma cell lines, IL-12 and 4-1BBL. Suggests that does not compromise the ability of the virus to induce classical cytopathic effects (CPE).

도 4는 복제불능 종양살상 아데노바이러스로 처리한 경우의 항-종양 효과의 결과를 보여준다. 오른쪽 피하 복부에 C57BL/6 마우스 멜라노마 (B16-F10) 오르토토픽(orthtophic) 모델을 확립하고 종양부피가 80~100 mm³ 일때 치료를 개시하였다. 각 그룹을 PBS (◇), Ad-ΔB7 (□) (1X 10¹⁰ VP/time), Ad-ΔB7/41BBL (O) (1 X 10¹⁰ VP/time), Ad-ΔB7/IL12 (X) (5 X 10⁹ VP/time) 및 Ad-ΔB7/IL12/41BBL (△) (5 X 10⁹ VP/time)으로 2일 간격으로, 총 3 회에 걸쳐 종양내로 주입하였다. 종양의 성장을 1 내지 2일 간격으로 관찰하였다. 데이터 점들은 각 그룹들에서 각 지정된 시간에서 종양크기의 평균± SE를 나타낸다. Ad-ΔB7/IL12 및 Ad-ΔB7/IL12/41BBL는 각각 2배의 타이터로 주입된 Ad-ΔB7 또는 Ad-ΔB7/41BBL 그룹 보다 우수한 능력을 나타내었다(p<0.01) (그룹당 n= 8-9 마우스). 또한, IL-12 및 4-1BBL의 조합으로 삽입된 아데노바이러스가 IL-12만으로 삽입된 아데노바이러스에 비해 항-종양 효과가 더 우수하였다(P<0.05). 3회 이상의 실험에서도 유사한 결과들을 얻었다. 4 shows the results of anti-tumor effects when treated with nonreplicate oncolytic adenovirus. A C57BL / 6 mouse melanoma (B16-F10) orthotopic model was established in the right subcutaneous abdomen and treatment started when the tumor volume was 80-100 mm ³ . Each group is divided into PBS (◇), Ad-ΔB7 (□) (1X 10 ¹⁰ VP / time), Ad-ΔB7 / 41BBL (O) (1 X 10 ¹⁰ VP / time), Ad-ΔB7 / IL12 (X) ( 5 × 10 ⁹ VP / time) and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (Δ) (5 × 10 ⁹ VP / time) were injected intratumorally over a total of three times, two days apart. Tumor growth was observed at 1-2 day intervals. Data points represent mean ± SE of tumor size at each designated time in each group. Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL showed better performance than the Ad-ΔB7 or Ad-ΔB7 / 41BBL group injected with 2-fold titers, respectively (p <0.01) (n = 8- per group). 9 mice). In addition, the adenovirus inserted with the combination of IL-12 and 4-1BBL had a better anti-tumor effect than the adenovirus inserted with IL-12 alone (P <0.05). Similar results were obtained in three or more experiments.

도 5는 다양한 아데노바이러스를 종양내로 투여한 후 사이토카인의 발현량을 ELISA 분석법으로 측정한 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에서 C57BL/6 마우스 멜라노마(B16-F10) 모델을 확립하고, PBS(□), Ad-ΔB7(▥), Ad-ΔB7/41BBL(▤), Ad-ΔB7/IL12(▦), Ad-ΔB7/IL12/41BBL(▣)로 처리하였다. 바이러스를 총 3회 5 X 10⁹ VP/time 주입하였고, 2일 간격으로 종양내로 주입하였다. 주입은 종양의 부피가 60-80mm³일 때 개시하였고, 치료 5일 후에 마우스를 희생시키고 종양을 회수하여 IFN-γ ELISA를 수행하였다. 바이러스 그룹에서, IFN-γ 사이토카인 발현이 다른 바이러스군에서 보다 IL-12가 삽입된 아데노바이러스로 처리된 군에서 현저하게 증가하는 것을 관찰하였다(p<0.01). IL-12 만이 삽입된 아데노바이러스로 처리한 경우(▦) 보다 4-1BBL와 조합된 IL-12로 처리한 경우(▣)가 IFN-γ 사이토카인의 발현이 더욱 현저한 것을 알 수 있었다. 이 실험결과로부터, Ad-ΔB7 벡터 대조군으 로 처리한 경우(▥)보다 4-1BBL만 삽입된 아데노바이러스로 처리한 종양에서(▤), IFN-γ이 현저하게 높게 발현되었음을 알 수 있었다. 3회 이상의 실험에서도 유사한 결과들을 얻었다. Figure 5 shows the results of measuring the expression level of cytokines after administration of various adenovirus into the tumor ELISA assay. C57BL / 6 mouse melanoma (B16-F10) model was established in C57BL / 6 mice, and PBS (□), Ad-ΔB7 (VII), Ad-ΔB7 / 41BBL (VII), Ad-ΔB7 / IL12 (VII) , Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (▣). Virus was injected three times in total 5 × 10 ⁹ VP / time and injected intratumorally at two day intervals. Infusion was initiated when the tumor volume was 60-80 mm ³ , 5 days after treatment, mice were sacrificed and tumors were recovered to perform IFN-γ ELISA. In the virus group, it was observed that IFN-γ cytokine expression was significantly increased in the group treated with IL-12-inserted adenovirus than in the other virus group (p <0.01). When treated with IL-12 in combination with 4-1BBL (▣), the expression of IFN-γ cytokines was more pronounced than when treated with adenovirus containing only IL-12 (iii). The experimental results showed that IFN-γ was significantly higher in tumors treated with adenovirus containing only 4-1BBL than when treated with Ad-ΔB7 vector control. Similar results were obtained in three or more experiments.

도 6은 종양살상 아데노바이러스로 처리한 것에 대해 INF-γ ELISpot 분석을 수행한 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에서 C57BL/6 마우스 멜라노마 세포 (B16-F10) 오르토토픽 모델을 확립한 후, PBS (□), Ad-ΔB7(▥), Ad-ΔB7/41BBL(▤), Ad-ΔB7/IL12(▦), Ad-ΔB7/IL12/41BBL (▣) (5 X 10⁹ VP/time, 총 3 회, 및 2 일 간격으로 종양-내로 주입하였다). 처리 5일 후, 마우스를 희생시키고 비장림프구를 조사한 B16-F10 세포와 함께 5일간 공동배양하였다. IFN-γ 스폿의 수는 IL-12 유전자 비-삽입 아데노바이러스 그룹(p<0.001) 보다도 IL-12 유전자 삽입 아데노바이러스 그룹에서 현저하게 증가하였다. 또한, Ad-ΔB7/IL12/41BBL 그룹으로 처리한 경우 Ad-ΔB7/IL12 그룹으로 처리한 경우에 비해 스폿의 수가 현저하게 증가하였다(p<0.001). Figure 6 shows the results of the INF-γ ELISpot assay for treatment with oncolytic adenovirus. After establishing the C57BL / 6 mouse melanoma cell (B16-F10) orthotopic model in C57BL / 6 mice, PBS (□), Ad-ΔB7 (VII), Ad-ΔB7 / 41BBL (VII), Ad-ΔB7 / IL12 (IX), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (▣) (5 × 10 ⁹ VP / time injected totally 3 times, and injected intratumorally at 2 day intervals). Five days after treatment, mice were sacrificed and cocultured with B16-F10 cells irradiated with splenic lymphocytes for five days. The number of IFN-γ spots was significantly increased in the IL-12 transgenic adenovirus group than the IL-12 transgenic adenovirus group (p <0.001). In addition, the treatment with the Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL group significantly increased the number of spots compared with the treatment with the Ad-ΔB7 / IL12 group (p <0.001).

도 7은 다양한 아데노바이러스로 처리된 종양내 H&E 및 면역조직화학 염색 분석의 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에서 C57BL/6 마우스 멜라노마 (B16-F10) 오르토토픽 모델을 확립하였고, PBS (1), Ad-ΔB7 (2), Ad-ΔB7/41BBL (3), Ad-ΔB7/IL12 (4), Ad-ΔB7/IL12/41BBL (5)로 처리하였다. 바이러스를 5 X 10⁹ VP/time 으로, 2일 간격으로 총 3회 종양내로 주입하였고, 60-80 mm³ 의 종양부피에서 치료를 개시하였다. 치료 5일 후, 마우스를 희생시키고 종양을 회수한 후 동결 섹션한 후에 H&E 및 면역조직화학 염색을 수행하였다. IL-12 유전자 삽입된 아데노바이러스 Ad-ΔB7/IL12 (4) 및 Ad-ΔB7/IL12/41BBL (5)로 처리된 것의 괴사영역은 다른 그룹과 비교하여 넓었다. Ad-ΔB7/IL12 및 Ad-ΔB7/IL12/41BBL(5) 치료된 종양에서, CD4⁺, CD8⁺, CD86⁺ 및 CD11c⁺ 세포는 다른 아데노바이러스 치료된 경우와 비교하여 침윤된 세포의 수가 가장 증가되었다. 7 shows the results of intratumoral H & E and immunohistochemical staining assays treated with various adenoviruses. A C57BL / 6 mouse melanoma (B16-F10) orthotopic model was established in C57BL / 6 mice and PBS (1), Ad-ΔB7 (2), Ad-ΔB7 / 41BBL (3), Ad-ΔB7 / IL12 ( 4), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (5). The virus was injected intratumorally at 5 × 10 ⁹ VP / time for a total of three times at two-day intervals and treatment was initiated at a tumor volume of 60-80 mm ³ . Five days after treatment, mice were sacrificed and tumors recovered and frozen sections followed by H & E and immunohistochemical staining. The necrotic regions of those treated with the IL-12 gene inserted adenovirus Ad-ΔB7 / IL12 (4) and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (5) were wider than the other groups. In Ad-ΔB7 / IL12 and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (5) treated tumors, CD4 ⁺ , CD8 ⁺ , CD86 ⁺ and CD11c ⁺ cells had the highest number of infiltrated cells compared to other adenovirus treated cases It became.

도 8은 다양한 재조합 아데노바이러스의 치료후에 비장림프구의 세포독성활성을 측정한 결과를 보여준다. 비장세포들을 치료 5일 후에서 다양한 아데노바이러스 치료 그룹에서 치료된 마우스로부터 유도하였다. 각 치료 그룹은 다음과 같다: PBS (◆), Ad-ΔB7 (■), Ad-ΔB7/41BBL (▲), Ad-ΔB7/IL12 (○), Ad-ΔB7/IL12/41BBL (X). 바이러스를 종양내로 3회(5 x 10⁹ VP/time) 2일 간격으로 주입하였다. 또한, 분리된 비장림프구를 인 비트로에서 조사(irradiation)-비활성화시킨 B16-F10 세포로 5일간 다시 자극하였다. B16-F10 및 Mus dunni 세포를 타깃으로 사용하였다. 타깃 세포: 효능 세포 (T:E) 비율은 1:5, 1:15, 1:45 의 범위로 하였다. 데이터 점들은 3회 실험의 평균± SD를 나타낸다. Figure 8 shows the results of measuring the cytotoxic activity of splenic lymphocytes after the treatment of various recombinant adenoviruses. Splenocytes were derived from mice treated in various adenovirus treatment groups 5 days after treatment. Each treatment group was as follows: PBS (◆), Ad-ΔB7 (■), Ad-ΔB7 / 41BBL (▲), Ad-ΔB7 / IL12 (○), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (X). Virus was injected into tumors three times (5 × 10 ⁹ VP / time) two days apart. The irradiation the separated spleen lymphocytes in vitro (irradiation) - 5-day was deactivated B16-F10 cells were re-stimulated. B16-F10 and Mus dunni cells were used as targets. Target cell: effector cell (T: E) ratio was in the range of 1: 5, 1:15, 1:45. Data points represent mean ± SD of 3 experiments.

도 9는 골수유래 수지상세포(DCs)의 형태와 파퓰레이션 및 FACS 분석에 의해 종양 단백질로 펄스된 골수유래 성숙 수지상세포를 확인한 결과를 보여준다. 총 배양된 세포에서 CD11c (93.13 %), CD3e (0.68 %), CD19 (3.29 %), CD14 (9.42 %), CD40 (62.95 %), CD80 (60.88 %), MHC I (70.99 %), MHC II (89.65 %) 세포의 파퓰레이션. 3회 이상 반복실험에서도 유사한 결과를 얻었다. 9 shows the results of morphology and population of bone marrow-derived dendritic cells (DCs) and bone marrow-derived mature dendritic cells pulsed with tumor proteins by population and FACS analysis. In total cultured cells, CD11c (93.13%), CD3e (0.68%), CD19 (3.29%), CD14 (9.42%), CD40 (62.95%), CD80 (60.88%), MHC I (70.99%), MHC II (89.65%) population of cells. Similar results were obtained in three or more replicates.

도 10은 종양살상능의 복제가능 아데노바이러스 Ad-ΔB7/mIL12/m41BBL 및 성숙 DCs에 의한 조합치료의 항-종양효과의 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스 멜라노마 (B16-F10) 오르토토픽 모델을 오른쪽 복부 피하에 확립하였고 종양 부피가 80-100 mm³ 이 되는 경우에서 치료를 개시하였다. 치료 그룹은 다음과 같다: PBS (◇), DCs (■), Ad-ΔB7/IL12/41BBL (△), 및 Ad-ΔB7/IL12/41BBL와 DCs 조합 그룹(●). 바이러스는 2.5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 2 일 간격으로 3회 종양 내 투여하였고 DCs(1 X 10⁶ 세포/50 ㎕)는 첫 번째 바이러스 투여 다음 날부터 2일 간격으로 3회 종양 내 투여를 실시하였다. 종양의 성장을 각 치료후에 1-2일 간격으로 모니터링하였다. 데이터 점들은 각 지정된 시간점에서 각 그룹에서 종양크기의 평균± SE를 나타낸다. DCs와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL의 조합그룹은 인 비보에서 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 보다 현저한 능력을 나타내었다. 바이러스만의 그룹(p<0.05) 및 DSs만의 그룹(p<0.001)으로 치료한 경우와 비교한 항-종양 효과, 및 DCs 만으로 치료한 그룹도 각각 잠재적인 항-종양 효과를 나타내었다(P<0.01, versus to PBS treated group) (그룹당 n=6-7 마우스). 3회 실험한 결과 유사한 결과를 얻었다.10 shows the results of the anti-tumor effect of combination therapy with replicable adenovirus Ad-ΔB7 / mIL12 / m41BBL and mature DCs of oncolytic capacity. A C57BL / 6 mouse melanoma (B16-F10) orthotopic model was established subcutaneously in the right abdomen and treatment started when the tumor volume reached 80-100 mm ³ . Treatment groups were: PBS (◇), DCs (■), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (Δ), and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL and DCs combination group (●). Virus was administered intratumorally three times at 2.5 × 10 ⁹ VP / 50 μl, 2 days apart and DCs (1 × 10 ⁶ cells / 50 μl) were administered 3 times intratumorally at 2 day intervals from the day following the first virus administration. Was carried out. Tumor growth was monitored at 1-2 day intervals after each treatment. Data points represent mean ± SE of tumor size in each group at each designated time point. The combination of DCs and Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL showed more pronounced ability than Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL in vivo. Anti-tumor effects compared to treatment with the virus-only group (p <0.05) and DSs-only group (p <0.001), and the groups treated with DCs alone also showed potential anti-tumor effects (P < 0.01, versus to PBS treated group (n = 6-7 mice per group). Three experiments yielded similar results.

도 11a 내지 도 11d는 DCs와 병합치료한 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 아데노바이러스에 의해 유도된 항-전이 효과를 보여준다. 멜라노마는 오른쪽 발바닥에 확립하였다. 치료는 종양크기가 180-200 mm³ (day 0)에서 개시하였다. 18일, 20일, 22일, (5 X 10⁹ VP/time, 총 3회) 바이러스를 종양내로 주입하였고, 19일, 21일, 23일 (1 X 10⁶ 세포/time, 총 3회) DCs를 흉막내 강에 주입하였다. 26일째에 오른쪽 무릎을 자르고, 마우스를 희생시킨 후, 전이된 멜라노마 결절의 수를 세고, 폐의 무게를 측정(전이성 멜라노마 결절 및 한 동물의 폐의 무게)한 후 각 동물에 대해서 그래프를 작성하였다. 결절 일부의 크기는 Great>1 ㎝, 1 ㎝≥Large>0.5 ㎝, 0.5 ㎝≥medium>0.3 ㎝, 0.3 ㎝≥Small 로 정하였다. 병합치료한 그룹의 폐의 무게는 바이러스만으로 치료한 그룹에 비해 유의성 있게 가벼웠다(p<0.02). 바이러스만으로 치료한 그룹 및 DCs 만으로 치료한 그룹은 PBS 주사한 그룹에 비해서 각각 유의성 있게(P<0.001 및 P<0.015) 가벼웠다(그룹당 n=6-7 마우스). 3회 반복실험한 결과 동일한 결과를 얻었다. 11A-11D show anti-metastatic effects induced by Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL adenovirus in combination with DCs. Melanoma was established on the right foot. Treatment was initiated at a tumor size of 180-200 mm ³ (day 0). 18, 20, 22, (5 × 10 ⁹ VP / time, 3 times total) virus was injected intratumorally, 19, 21, 23 (1 × 10 ⁶ cells / time, total 3 times) DCs were injected into the pleural cavity. On day 26, the right knee was cut, the mouse was sacrificed, the number of metastatic melanoma nodules was counted, the lungs were weighed (metastatic melanoma nodules and the weight of one animal lung), and a graph was drawn for each animal. Created. The size of the nodules was set to Great> 1 cm, 1 cm ≥ Large> 0.5 cm, 0.5 cm ≥ medium> 0.3 cm, 0.3 cm ≥ Small. Lung weights in the combination-treated group were significantly lighter than those in the virus-only group (p <0.02). The group treated with virus only and the group treated with DCs alone were significantly lighter (P <0.001 and P <0.015) compared to the group injected with PBS, respectively (n = 6-7 mice per group). Three replicates yielded the same results.

도 12는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 및 DCs의 종양내 병합치료후에 ELISA 분석에 의한 사이토카인의 발현의 측정 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스 멜라노마 (B16-F10) 모델을 C57BL/6 마우스에서 확립하였고, PBS (□)처리, DCs (▨)처리, Ad-ΔB7/IL12/41BBL (▣)처리, Ad-ΔB7/IL12/41BBL 및 DCs의 병합처리 그룹(■)으로 치 료하였다. 바이러스는 5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 2 일 간격으로 3회 종양 내 투여하였고 종양의 부피가 60-80 mm³ 일때 치료를 개시하였으며,DCs(1 X 10⁶ 세포/50 ㎕)는 첫 번째 바이러스 투여 다음 날부터 2일 간격으로 3회 종양 내 투여를 실시하였다. 12 shows measurement results of cytokine expression by ELISA assay after intratumoral concomitant treatment of Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL and DCs. C57BL / 6 mouse melanoma (B16-F10) model was established in C57BL / 6 mice, treated with PBS (□), DCs (VII), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (▣), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL and DCs were treated as a merged group (■). Virus was administered intratumorally 3 times at 5 × 10 ⁹ VP / 50 μl, 2 days apart and treatment was initiated when the tumor volume was 60-80 mm ³ and DCs (1 × 10 ⁶ cells / 50 μl) were the first Three intratumoral administrations were performed every two days from the day following virus administration.

치료 5 일후에, 마우스를 희생시키고 종양을 회수하여 ELISA 분석을 수행하였다. Ad-ΔB7/IL12/41BBL 및 DCs 병합 그룹(■)의 종양에서 IFN-γ 사이토카인이 바이러스만으로 처리한 경우보다 유의성 있게 (P=0.0013) 또는 DCs 만으로 처리한 경우보다 유의성 있게(P<0.001) 다량 분비되었다. DC 만의 그룹은 PBS 그룹 보다 유의성 있게(P<0.001) IFN-γ 사이토카인의 발현이 높았다. 본 실험에서 DC만으로 치료한 경우 보다도 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 아데노바이러스만으로 치료한 경우가 유의성 있게 (P<0.001) IFN-γ의 발현이 높았다는 것도 확인하였다. 3회 반복 실험에서도 유사한 결과를 얻었다. Five days after treatment, mice were sacrificed and tumors were recovered to perform ELISA analysis. IFN-γ cytokines in tumors of the Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL and DCs consolidation group (■) significantly (P = 0.0013) than those treated with virus only (P = 0.0013) or significantly (P <0.001) than those treated with DCs only Much secretion. The DC-only group had significantly higher expression of IFN-γ cytokines than the PBS group (P <0.001). In this experiment, the treatment with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL adenovirus only was significantly higher (P <0.001) than the treatment with DC alone. Similar results were obtained in three replicates.

도 13은 DCs와 병합한 종양살상 아데노바이러스에 의해 치료한 경우의 INF-γ ELISpot assay 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스 멜라노마 세포(B16-F10) 오르토토픽 모델을 C57BL/6 마우스에서 확립하였고, PBS 처리(□), DCs 처리(▨) Ad-ΔB7/IL12/41BBL 처리(▣), DCs와 병합한 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 처리(■)를 행하였고, 바이러스는 총 3회 5 X 10⁹ VP/time 주입하였으며, 2일 간격으로 종양내 주입하였고, DCs(1 X 10⁶ 세포/time)는 바이러스 주입 공간에 2일 간격으로 종양내 3회 주입 하였다. 치료 5일 후 마우스를 희생시키고 이들의 비장림프구를 조사된 B16-F10 세포와 함께 5일간 공동배양하였다. IFN-γ 스폿 수는 DCs와 병합한 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 그룹으로 치료한 그룹에서 바이러스만으로 치료한 그룹(p<0.01), DCs만으로 치료한 그룹(p<0.01)보다 유의성 있게 증가하였다. 3회 반복 실험에서도 유사한 결과를 얻었다. Figure 13 shows the results of the INF-γ ELISpot assay when treated with oncolytic adenovirus combined with DCs. A C57BL / 6 mouse melanoma cell (B16-F10) orthotopic model was established in C57BL / 6 mice and merged with PBS treatment (□), DCs treatment (▨) Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL treatment (▣), DCs One Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL treatment (■) was performed, virus was injected 3 times in total 5 × 10 ⁹ VP / time, intratumorally injected at 2 days interval, DCs (1 × 10 ⁶ cells / time) Was injected three times intratumorally into the virus injection space every two days. Five days after treatment mice were sacrificed and their splenocytes were co-cultured with irradiated B16-F10 cells for five days. The number of IFN-γ spots was significantly increased in the group treated with Ads-B7 / IL12 / 41BBL group combined with DCs compared to the virus-treated group (p <0.01) and DCs-only group (p <0.01). Similar results were obtained in three replicates.

도 14는 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 및 DCs의 병합치료 후에 H&E 및 면역조직화학 염색 분석을 행한 결과를 보여준다. C57BL/6 마우스에서 C57BL/6 마우스 멜라노마(B16-F10) 오르토토픽 모델을 확립하였고, PBS(1), DCs(2), Ad-ΔB7/IL12/41BBL(3), DCs 병합 Ad-ΔB7/IL12/41BBL (4)으로 치료하였다. 바이러스는 5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 2 일 간격으로 3회 종양 내 투여하였고 종양의 부피가 60-80 mm³ 일때 치료를 개시하였으며, DCs(1 X 10⁶ 세포/50 ㎕)는 첫 번째 바이러스 투여 다음 날부터 2일 간격으로 3회 종양 내 투여를 실시하였다. 치료 5일 후에, 마우스를 희생시키고 종양을 회수하여 동결 섹션시킨 후, H&E 및 면역조직화학 염색을 수행하였다. 병합치료에 의한 괴사 영역이 다른 그룹보다 넓었다. DCs 병합 바이러스 치료의 종양에 있어서, CD4⁺, CD8⁺, CD86⁺ 및 CD11c⁺ 침윤세포가 다른 그룹에 비해 유의성 있게 높았다. 3회 반복실험에 의해서도 유사한 결과를 얻었다. FIG. 14 shows the results of H & E and immunohistochemical staining analysis after combined treatment of Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL and DCs. A C57BL / 6 mouse melanoma (B16-F10) orthotopic model was established in C57BL / 6 mice and PBS (1), DCs (2), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (3), DCs merging Ad-ΔB7 / Treatment with IL12 / 41BBL (4). Virus was administered intratumorally 3 times at 5 × 10 ⁹ VP / 50 μl, 2 days apart and treatment was initiated when the tumor volume was 60-80 mm ³ and DCs (1 × 10 ⁶ cells / 50 μl) were the first Three intratumoral administrations were performed every two days from the day following virus administration. Five days after treatment, mice were sacrificed and tumors recovered and frozen sections, followed by H & E and immunohistochemical staining. Necrosis area by combination therapy was wider than other groups. In tumors of DCs concomitant virus treatment, CD4 ⁺ , CD8 ⁺ , CD86 ⁺ and CD11c ⁺ infiltrating cells were significantly higher than the other groups. Similar results were obtained by three replicates.

도 15는 DCs와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL 재조합 아데노바이러스의 병합 치료후에 비장림프구의 세포독성 활성의 결과를 보여주는 도면이다. 비장세포들은 병합치료 그룹의 치료후 5일 후에서 치료된 마우스로부터 얻었다. 치료 그룹은 다음과 같다: PBS 처리 그룹(◆), DCs 처리 그룹(□), Ad-ΔB7/IL12/41BBL 처리 그룹(X), DCs와 Ad-ΔB7/IL12/41BBL의 병합처리 그룹(●)이다. 바이러스는 5 X 10⁹ VP/50 ㎕, 2 일 간격으로 3회 종양 내 투여하였고 종양의 부피가 60-80 mm³ 일때 치료를 개시하였으며, DCs(1 X 10⁶ 세포/50 ㎕)는 첫 번째 바이러스 투여 다음 날부터 2일 간격으로 3회 종양 내 투여를 실시하였다. 치료 후 5일 후에, 마우스를 희생시키고 비장을 회수하였다. 또한, 분리된 비장림프구를 인 비트로에서 조사된(irradiated)-불활성화 B16-F10 세포로 5일간 다시 자극하였다. B16-F10 세포를 타깃으로 사용하였다. 타깃세포:효능세포(T:E) 비율은 1:5, 1:15, 1:45의 범위로 행하였다. 데이터 점들은 3회 실험의 평균± SD을 나타낸다. FIG. 15 shows the results of cytotoxic activity of splenic lymphocytes after combined treatment of DCs with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL recombinant adenovirus. Splenocytes were obtained from treated mice 5 days after treatment in the combination treatment group. Treatment groups are as follows: PBS treatment group (◆), DCs treatment group (□), Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL treatment group (X), merged treatment group of DCs with Ad-ΔB7 / IL12 / 41BBL (●) to be. Virus was administered intratumorally 3 times at 5 × 10 ⁹ VP / 50 μl, 2 days apart and treatment was initiated when the tumor volume was 60-80 mm ³ and DCs (1 × 10 ⁶ cells / 50 μl) were the first Three intratumoral administrations were performed every two days from the day following virus administration. Five days after treatment, mice were sacrificed and the spleen recovered. The isolated splenocytes were also stimulated again for 5 days with irradiated-inactivated B16-F10 cells in vitro. B16-F10 cells were used as targets. The target cell: effective cell (T: E) ratio was performed in the range of 1: 5, 1:15, 1:45. Data points represent mean ± SD of 3 experiments.

Claims

(a) 인터루킨(interleukin, IL)-12 및 4-1BBL(4-1BB ligand) 코딩 뉴클레오타이드 서열을 갖는 재조합 아데노바이러스 및 수지상세포(dendritic cell)의 치료학적 유효량 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항종양용 약제학적 조성물. (a) a therapeutically effective amount of recombinant adenovirus and dendritic cells having interleukin (IL) -12 and 4-1BBL (4-1BB ligand) coding nucleotide sequences and (b) a pharmaceutically acceptable carrier Pharmaceutical composition for anti-tumor, comprising a.

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제 1 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노 바이러스 유전자 E1B 영역 및 E3 영역이 결실된 것을 특징으로 하는 조성물. The composition of claim 1, wherein the recombinant adenovirus has a deletion of the adenovirus gene E1B region and E3 region.

제 3 항에 있어서, 상기 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 유전자 E1A 영역의 Rb(retino blastoma) 단백질 결합부위가 결실된 것을 특징으로 하는 조성물. 4. The composition of claim 3, wherein the recombinant adenovirus has a deletion of the retino blastoma (Rb) protein binding site of the adenovirus gene E1A region.

제 1 항에 있어서, 상기 IL-12 코딩 뉴클레오타이드 서열은 재조합 아데노바이러스의 유전자 E1B 영역 또는 E3 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는 조성물. The composition of claim 1, wherein the IL-12 coding nucleotide sequence is inserted into a gene E1B region or E3 region of a recombinant adenovirus.

제 1 항에 있어서, 상기 4-1BBL 코딩 뉴클레오타이드 서열은 재조합 아데노바이러스의 유전자 E1B 영역 또는 E3 영역에 삽입되는 것을 특징으로 하는 조성물. The composition of claim 1, wherein the 4-1BBL encoding nucleotide sequence is inserted into a gene E1B region or E3 region of a recombinant adenovirus.

제 1 항에 있어서, 상기 수지상세포는 암 항원의 존재하에 미성숙 수지상세포의 성숙화를 유도하여 얻은 것을 특징으로 하는 조성물. The composition of claim 1, wherein the dendritic cells are obtained by inducing maturation of immature dendritic cells in the presence of a cancer antigen.

제 7 항에 있어서, 상기 암 항원은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암으로부터 유래된 암 항원인 것을 특징으로 하는 조성물. The method of claim 7, wherein the cancer antigen is gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, skin cancer, thyroid cancer, vice A composition comprising a cancer antigen derived from thyroid cancer or ureter cancer.

제 8 항에 있어서, 상기 암 항원은 뇌암, 폐암 또는 피부암으로부터 유래된 것을 특징으로 하는 조성물. 10. The composition of claim 8, wherein the cancer antigen is derived from brain cancer, lung cancer or skin cancer.

제 1 항에 있어서, 상기 종양은 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암, 자궁경부암, 뇌암, 전립선암, 골암, 피부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암에 의해 발생되는 종양인 것을 특징으로 하는 조성물. According to claim 1, wherein the tumor is gastric cancer, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, pancreatic cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, brain cancer, prostate cancer, bone cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer Or a tumor caused by ureter cancer.