KR100894703B1 - Methods for immobilizing cells - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 고상의 기질 상에 세포를 고정화시키는 방법, 세포 고정화에 이용될 수 있는 신규한 펩타이드 및 마이크로어레이 또는 바이오센서에 관한 것이다.The present invention relates to methods for immobilizing cells on solid substrates, novel peptides and microarrays or biosensors that can be used for cell immobilization.
고체 표면상에 동물 세포를 부착시키는 것은 세포 배양과 조직 공학의 영역에서 매우 기본적이고 중요한 요소이며 적합한 부착 물질을 이용하여 세포를 고정화 시킬 경우 일반적으로 세포의 증식 효과를 나타낸다[1, 2]. 콜라겐(젤라틴), 피브린, 엘라스틴, 피브로넥틴 및 라미닌 등의 세포외기질(ECM) 단백질들과 폴리-L-라이신(PLL)과 같은 물질들이 세포 배양 용기 표면 코팅에 이용되어 왔다[3]. 특히 현재 중요 연구 분야인 줄기세포 배양에는 콜라겐을 부분 가수분해해서 얻어진 젤라틴이 세포 부착 물질로 사용되고 있다. 부착 의존형 동물 세포는 ECM에 부착하지 못할 경우 세포 사멸이 일어 날 수 있어 ECM 성분은 세포 배양과 조직 공학에 널리 이용되어 왔으나, ECM 성분을 이용하는 경우 고가의 비용이 드는 점과 다른 동물들로부터 추출되기 때문에 감염 위험성을 가지고 있다 [4]. PLL은 경제 적이지만, 비특이적인 세포 부착과 세포 독성을 가지고 있고, 비정상적인 세포 확산을 유도하여 효과적인 세포 부착 물질이 아니다 [3].Attachment of animal cells on a solid surface is a very basic and important element in the field of cell culture and tissue engineering, and generally shows the proliferative effect of cells when immobilized cells with suitable adhesion materials [1, 2]. Extracellular matrix (ECM) proteins such as collagen (gelatin), fibrin, elastin, fibronectin and laminin and materials such as poly-L-lysine (PLL) have been used for cell culture vessel surface coatings [3]. In particular, gelatin obtained by partially hydrolyzing collagen is used as a cell adhesion substance in stem cell culture, which is an important research field. Adhesion-dependent animal cells can cause cell death if they fail to attach to ECM. ECM components have been widely used in cell culture and tissue engineering.However, the use of ECM components is expensive and can be extracted from other animals. There is a risk of infection [4]. PLL is economical, but has nonspecific cell adhesion and cytotoxicity and is not an effective cell adhesion substance by inducing abnormal cell proliferation [3].
최근 Spatz 등은 생활성(bioactive) 나노패턴을 이용한 세포 미세환경(cellular microenvironment) 형성을 보고 한바 있다 [ 5 ]. 이러한 나노 단위의 미세 세포환경은 세포 이동, 분화 및 증식과 같은 세포 활성을 조절할 수 있어 세포 칩 제작 등에 이용이 가능할 것이다. 세포 부착력을 증대시키기 위하여, 나노패턴과 세포 부착 물질을 함께 사용하고자 할 때 ECM 성분이나 PLL 분자들은 그 분자량이 커서 나노패턴과 같은 나노구조체에 적용할 수 없다. 그러므로, 나노 구조체를 이용한 세포칩 개발 등을 위해서는 세포에 대한 세포독성이 적고, 효과적인 세포 부착 능력을 가지고 있는 비고분자 물질의 요구되고 있다.Spatz et al. Recently reported the formation of cellular microenvironment using bioactive nanopatterns [5]. The nano-cellular microenvironment can control cell activities such as cell migration, differentiation and proliferation, and thus may be used for cell chip fabrication. In order to increase cell adhesion, when the nanopattern and cell adhesion material are used together, ECM components or PLL molecules have a large molecular weight and thus cannot be applied to nanostructures such as nanopatterns. Therefore, for the development of cell chips using nanostructures, there is a demand for non-polymeric materials having low cytotoxicity to cells and effective cell adhesion.
최근 연구에서는 세포를 직접 대상으로 하여 신약 발굴(세포 마이크로어레이 기술 이용)을 하거나 칩 상에서 세포 대사 관련 실험(lab-on-a chip) 등 세포칩 개발 연구가 진행되고 있다. 이중 전기화학적 측정을 요하는 세포칩에는 금 플레이트가 많이 활용되고 있는데, 티올과 유기 이황화물들의 흡착 단계는 다음과 같은 전극 반응에 의하여 일어나는 것으로 알려져 왔다[12-13]. 여기서 M은 표면에서 M-S 결합을 하는 금, 은 등의 금속을 나타낸다.In recent research, cell chip development studies such as discovery of new drugs (using cell microarray technology) or experiments on cell metabolism (lab-on-a chip) on a chip are being conducted. Gold plates are widely used in cell chips requiring double electrochemical measurements, and the adsorption step of thiol and organic disulfides has been known to be caused by the following electrode reactions [12-13]. Here, M represents a metal such as gold, silver, etc. having M-S bond on the surface.
RSH + M → RS-M + H+ + e- (M) (M= Au, Ag)RSH + M → RS-M + H + + e - (M) (M = Au, Ag)
RSSR + e-(M) → RS-M + RS- RSSR + e - (M) → RS-M + RS -
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.
본 발명자들은 세포, 특히 동물세포를 고상의 기질(solid substrate) 상에 고정화 시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, Arg-Gly-Asp(RGD) 모티프를 포함하는 서열을 이용하면, 세포 독성 없이 세포를 특이적으로 고상 기질 상에 고정화 시킬 수 있으며, 미세 세포환경 세포칩에 활용될 수 있는 나노패턴에 세포를 고정화시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors have sought to develop a method for immobilizing cells, especially animal cells, on a solid substrate. As a result, using a sequence containing an Arg-Gly-Asp (RGD) motif, the cells can be immobilized on a solid substrate specifically without cytotoxicity, and can be applied to nanopatterns that can be utilized in microcellular cell chips. By confirming that the cells can be immobilized, the present invention has been completed.
따라서, 본 발명의 목적은 고상의 기질 상에 세포를 고정화시키는 방법을 제공하는 데 있다.Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for immobilizing cells on solid substrates.
본 발명의 다른 목적은 세포 고정화에 이용될 수 있는 신규한 펩타이드를 제공하는 데 있다.Another object of the present invention is to provide a novel peptide that can be used for cell immobilization.
본 발명의 또 다른 목적은 펩타이드 링커가 코팅된 마이크로어레이 또는 바이오센서를 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a microarray or biosensor coated with a peptide linker.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도 면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 세포를 고상의 기질 상에 고정화시키는 방법을 제공한다: According to one aspect of the invention, the invention provides a method of immobilizing a cell on a solid substrate comprising the following steps:
(a) Arg-Gly-Asp 서열을 포함하며 말단에 시스테인 잔기를 포함하는 펩타이드를 고상의 기질 상에 코팅하는 단계; 및 (a) coating on a solid substrate a peptide comprising an Arg-Gly-Asp sequence and comprising a cysteine residue at the end; And
(b) 상기 고상의 기질 상에 코팅된 펩타이드에 세포를 접촉시키는 단계.(b) contacting the cells with a peptide coated on the solid substrate.
본 발명자들은 세포, 특히 동물세포를 고상의 기질(solid substrate) 상에 고정화 시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, Arg-Gly-Asp(RGD) 모티프를 포함하는 서열을 이용하면, 세포 독성 없이 세포를 특이적으로 고상 기질 상에 고정화 시킬 수 있으며, 미세 세포환경 세포칩에 활용될 수 있는 나노패턴에 세포를 고정화시킬 수 있음을 확인하였다.The inventors have sought to develop a method for immobilizing cells, especially animal cells, on a solid substrate. As a result, using a sequence containing an Arg-Gly-Asp (RGD) motif, the cells can be immobilized on a solid substrate specifically without cytotoxicity, and can be applied to nanopatterns that can be utilized in microcellular cell chips. It was confirmed that the cells can be immobilized.
본 발명은 고상의 기질 상에 세포를 고정화시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 세포가 고정화된 고상의 기질을 제조하는 방법으로 표현될 수 있다.The present invention relates to a method of immobilizing cells on a solid substrate. In addition, the present invention can be expressed as a method of preparing a solid substrate in which cells are immobilized.
본 발명에서 이용되는 펩타이드는 RGD 모티프를 포함하는 특징을 갖는다.Peptides used in the present invention have a feature comprising an RGD motif.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 펩타이드는 다음 일반식 1로 표시되며, N-말단 또는 C-말단에 시스테인 잔기가 추가적으로 결합되어 있는 것이다:According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide used in the present invention is represented by the following general formula (1), wherein the cysteine residue is additionally bonded to the N-terminus or C-terminus:
일반식 1
(Arg-Gly-Asp)n (Arg-Gly-Asp) n
상기 일반식에서, n은 1-100의 정수이다.In the general formula, n is an integer of 1-100.
일반식 1의 펩타이드의 구체적인 예는 Cys-Arg-Gly-Asp이다.A specific example of the peptide of
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 펩타이드는 다음 일반식 2로 표시되며, N-말단 또는 C-말단에 시스테인 잔기가 추가적으로 결합되어 있는 것이다: According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide used in the present invention is represented by the following general formula (2), wherein the cysteine residue is additionally bonded to the N-terminus or C-terminus:
일반식 2
(Arg-Gly-Asp-Xaa1)n (Arg-Gly-Asp-X aa1 ) n
상기 일반식에서, Xaa1은 Gly 또는 Ala이고, n은 1-100의 정수이다.In the above formula, X aa1 is Gly or Ala and n is an integer of 1-100.
일반식 2에서, Xaa1은 펩타이드 서열에서 유연성(flexibility)를 주기 위한 잔기로서, R-기의 크기가 작은 아미노산이 적합하다. 바람직하게는, Xaa1은 Gly이다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 펩타이드는 일반식 1 또는 일반식 2로 표시되는 2-20개의 펩타이드가 아미노산 링커에 의해 결합되어 있는 것이다. 즉, 여러 개의 펩타이드가 결합되어 있는 펩타이드 맵(MAP) 형태를 갖는다.In Formula 2, X aa1 is a residue for giving flexibility in the peptide sequence, and amino acids having a small R-group are suitable. Preferably, X aa1 is Gly.
According to a more preferred embodiment of the present invention, the peptide used in the present invention is that 2-20 peptides represented by Formula 1 or Formula 2 are bound by an amino acid linker. That is, it has a peptide map (MAP) form in which several peptides are bound.
본 명세서에서 사용되는 용어 “펩타이드 맵(MAP)”은 여러 개의 펩타이드가 결합되어 있는 형태로, 병렬적으로 나열된 펩타이드 절편을 아미노산 링커를 통해 연결한 것을 의미한다. 특히, 본 명세서에서 사용하는 맵에는 마지막 링커 말단에 알라닌(bAla)이 연결되어 있다. 예컨대, C-[(RGD-G)2-RGD]4-MAP은 
펩타이드 맵을 제조하는 경우, 이용되는 링커는 당업계에 공지된 다양한 아 미노산 링커를 이용할 수 있다. 링커에 적합한 아미노산 서열은 Maratea et al., Gene 40:39-46(1985); Murphy et al., Proc. Natl . Acad Sci . USA 83:8258-8562(1986); 미국 특허 제4,935,233호, 제4,751,180호 및 제5,990,275호에 개시되어 있다. 링커 서열은 1-50 아미노산 잔기로 구성될 수 있다.When preparing the peptide map, the linker used may utilize various amino acid linkers known in the art. Suitable amino acid sequences for linkers are described in Maratea et al., Gene 40: 39-46 (1985); Murphy et al., Proc. Natl . Acad Sci . USA 83: 8258-8562 (1986); US Pat. Nos. 4,935,233, 4,751,180 and 5,990,275. The linker sequence may consist of 1-50 amino acid residues.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 링커는 R-기에 아미노기 또는 카르복실기가 있는 아미노산으로서, Lys, Arg, Asp 또는 Glu이며, 가장 바람직하게는 Lys이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the linker used in the present invention is an amino acid having an amino group or a carboxyl group in the R- group, and is Lys, Arg, Asp or Glu, most preferably Lys.
링커의 크기는 바람직하게는 1-5 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 1-3 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 1 아미노산 잔기이다.The size of the linker is preferably 1-5 amino acid residues, more preferably 1-3 amino acid residues, most preferably 1 amino acid residue.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 이용되는 펩타이드는 다음 일반식 3 또는 4로 표시되는 펩타이드이다:According to a preferred embodiment of the present invention, the peptide used in the present invention is a peptide represented by the following general formula (3) or (4):
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일반식 3
일반식 4Formula 4
상기 일반식에서, Xaa1은 Gly 또는 Ala이고, n1-n8은 각각 독립적으로 1-100의 정수이다.In the general formula, X aa1 is Gly or Ala, and n1-n8 are each independently an integer of 1-100.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 펩타이드는 다음의 서열로 표시되는 펩타이드이다:More preferably, the peptide used in the present invention is a peptide represented by the following sequence:
가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 펩타이드는Most preferably, the peptide used in the present invention
본 발명에서 이용되는 펩타이드는 세포를 고상 기질에 고정화 하기 위한 링커로서의 역할을 하며, 상기 펩타이드 링커는 기질 표면 상에서 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer: SAMs)을 형성하며, 이 SAMs는 간단한 과정을 통하여 세포를 고상 기질에 고정화 되도록 한다.Peptides used in the present invention serves as a linker for immobilizing cells on a solid substrate, the peptide linker forms self-assembled monolayers (SAMs) on the substrate surface, the SAMs through a simple process Allow cells to be immobilized on a solid substrate.
본 발명에서 이용되는 고상 기질은 당업계에 공지된 다양한 기질을 포함한다. 예를 들어, 고상 기질은, 금속(예컨대, 금, 금과 구리의 합금, 알루미눔), 금속 옥사이드, 유리, 세라믹, 석영, 실리콘, 반도체, Si/SiO2 웨이퍼, 게르마늄, 갈륨 아르세나이드, 카본, 탄소나노튜브, 폴리머(예컨대, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리아크릴아미드), 세파로스, 아가로스 및 콜로이드를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.Solid substrates used in the present invention include various substrates known in the art. For example, solid substrates may include metals (eg gold, alloys of gold and copper, aluminum), metal oxides, glass, ceramics, quartz, silicon, semiconductors, Si / SiO 2 wafers, germanium, gallium arsenide, Carbon, carbon nanotubes, polymers (eg, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyacrylamide), sepharose, agarose, and colloids.
가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 고상의 기질은 금이 표면에 코팅된 기질이다.Most preferably, the solid substrate used in the present invention is a substrate coated with gold.
본 발명에 적용될 수 있는 세포는, 바람직하게는 인테그린 단백질을 표면에 가지고 있는 동물세포이며, 가장 바람직하게는 인간세포이다. 또한, 본 발명에 적용될 수 있는 세포는, 초기 배양 세포(primary cultured cell), 구축 세포(established cell), 암세포 및 줄기세포 등을 포함한다.The cell which can be applied to the present invention is preferably an animal cell having an integrin protein on its surface, and most preferably a human cell. In addition, cells that can be applied to the present invention include primary cultured cells, primary cells, cancer cells, stem cells, and the like.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 일반식 3 또는 4로 표시되는 펩타이드를 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a peptide represented by the following general formula (3) or (4):
일반식 3
일반식 4Formula 4
상기 일반식에서, Xaa1은 Gly 또는 Ala이고, n1-n8은 각각 독립적으로 1-100의 정수이다.In the general formula, X aa1 is Gly or Ala, and n1-n8 are each independently an integer of 1-100.
보다 바람직하게는, 본 발명의 펩타이드는 다음의 서열로 표시되는 펩타이드 이다:More preferably, the peptide of the present invention is a peptide represented by the following sequence:
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 펩타이드가 표면에 코팅된 고상 기질을 포함하는 마이크로어레이 또는 바이오센서를 제공한다.According to another aspect of the present invention, the present invention provides a microarray or biosensor comprising a solid substrate coated on the surface of the above-described peptide of the present invention.
본 발명의 마이크로어레이(즉, 세포칩)에 적용될 수 있는 일반적인 설명은, 미국 특허 제5,143,854, 5,242,974, 5,252,743, 5,324,633, 5,384,261, 5,405,783, 5,412,087, 5,424,186, 5,451,683, 5,482,867, 5,491,074, 5,527,681, 5,550,215, 5,571,639, 5,578,832, 5,593,839, 5,599,695, 5,624,711, 5,631,734, 5,795,716, 5,831,070, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,889,165, 5,936,324, 5,959,098, 5,968,740, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6,033,860, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,147,205, 6,262,216, 6,269,846, 6,310,189 및 6,428,752 호게 상세하게 기재되어 있다.General descriptions applicable to microarrays (i.e., cell chips) of the present invention are described in U.S. Pat. 5578832, 5593839, 5599695, 5624711, 5631734, 5795716, 5.83107 million, 5,837,832, 5,856,101, 5,858,659, 5,889,165, 5,936,324, 5,959,098, 5.96874 million, 5,974,164, 5,981,185, 5,981,956, 6,025,601, 6.03386 million, 6,040,193, 6,090,555, 6,136,269, 6,147,205, 6,262,216, 6,269,846, 6,310,189 and 6,428,752 are described in detail.
본 발명의 바이오센서에 적용될 수 있는 일반적인 내용은, Myska, J. Mol . Recognit, 12:279-284(1999); J. Dubendorfer et al. Journal of Biomedical Optics, 2(4):391-400(1997General information that can be applied to the biosensor of the present invention, Myska, J. Mol . Recognit , 12: 279-284 (1999); J. Dubendorfer et al. Journal of Biomedical Optics , 2 (4): 391-400 (1997
본 발명에 따르면, 세포, 특히 동물세포를 고상의 기질 상에 효율적으로 고정화 시킬 수 있으며, 특히 세포 독성 없이 세포를 특이적으로 고상 기질 상에 고정화 시킬 수 있으며, 미세 세포환경 세포칩에 활용될 수 있는 나노패턴에 세포를 고정화시킬 수 있다.According to the present invention, cells, particularly animal cells, can be efficiently immobilized on solid substrates, and in particular, cells can be immobilized on solid substrates specifically without cytotoxicity, and can be utilized in microcellular environment cell chips. The cells can be immobilized on a nanopattern.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .
실시예
실시예 1: 신규 RGD 펩타이드 맵의 디자인
도 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에서는 3가지 RGD 펩타이드를 이용하였다. 도 1에서 C-RGD(펩타이드 1)는 한 개의 RGD서열을 가지고 있는 구조로, RGD 서열은 인테그린을 인식하여 ECM 단백질에 세포를 결합시켜 줄 수 있는 모티브이므로 세포 부착 물질에 이용하고자 하였고, C는 티올 작용기를 가진 시스테인으로 금 기판에 물질을 결합시키기 위하여 추가 도입되었다. Example
Example 1: Design of a New RGD Peptide Map
As shown in Figure 1, three RGD peptides were used in the present invention. In Figure 1, C-RGD (peptide 1) is a structure having a single RGD sequence, RGD sequence is a motif that can bind the cell to ECM protein by recognizing integrin, was intended to be used for cell attachment substances, C is Cysteine with thiol functionality was further introduced to bind the material to the gold substrate.
보다 효율적인 세포 고정용 RGD 펩타이드를 제작하고자 하나의 맵(MAP)으로 구성하여 한 분자에 여러 개의 RGD를 가진 구조, 즉, 여러 개의 펩타이드가 결합되어 있는 형태의 펩타이드를 디자인하였다. 금 기판 상에 펩타이드 맵을 결합시키기 위해서는 티올 작용기가 필요하기 때문에 시스테인 추가 도입 위치를 2 가지로 디자인할 수 있었다. 예컨대, 도 1에서 제시한 바와 같이, 펩타이드 2는 RGD-G를 2개 연결하고 마지막에 RGD를 연결하여 만든 맵 구조로, 이는 병렬적으로 연결된 각 펩타이드의 RGD 서열 끝에 시스테인을 가지고 있어 금 기판에 안정적으로 고정화 될 수 있으나 RGD 모티브가 내부로 가려질 가능성을 가지고 있다. 다른 예인 펩타이드 3은 여러 개의 RGD 모티브를 먼저 MAP으로 연결하고 그 맵의 끝 부분에 시스테인을 추가 도입하여 제작하도록 하였다.In order to produce more efficient cell fixation RGD peptides, a single map (MAP) was constructed to design a structure having several RGDs in one molecule, that is, a peptide in which several peptides were combined. Since a thiol functional group is required to bind the peptide map on the gold substrate, two additional cysteine introduction sites could be designed. For example, as shown in FIG. 1,
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본 발명에서 이용되는 펩타이드들은 도 1의 왼쪽 패널에 나타내었으며, 이는 (주)펩트론(대한민국)에 의뢰하여 합성하였다.Peptides used in the present invention are shown in the left panel of Figure 1, which was synthesized by the request to Peptron (Korea).
실시예Example 2: 2: 펩타이드Peptide 고정화 및 Immobilization and 펩타이드Peptide -변형 금 표면 분석-Deformation gold surface analysis
금 기판은 DC 마그네트론 스퍼터링(magnetron sputtering) 방식 및 실리콘 기판을 이용하여 제조하였다. 금 증착하기 이전에 Cr을 매개체로 증착하였다. 금과 크롬의 두께는 각각 43 nm와 2 nm이다. 펩타이드 막을 만들기 전에 결합되어 있는 이물질을 제거하기 위하여, 금 표면을 피라나 용액(piranha solution, 70% vol H2SO4, 30% H2O2)을 이용하여 세척하였다. 금 표면 상의 펩타이드 박막은 기판을 펩타이드 용액(0.1 mg/ml)으로 12 시간 처리한 후, PBS(Phosphate buffered saline)를 사용하여 세척하고, N2 가스를 이용하여 건조시켜 제작하였다. 제작된 펩타이드 박막의 표면 분석을 위하여, 금 기판과 펩타이드 1, 펩타이드 2 또는 펩타이드 3으로 개질된 금 표면을 AFM(atomic force microscopy, NTEGRA spectra, NT-MDT, Russia)를 이용하여 조사하였다. AFM 이미지는 상온 하에서 반-접촉 모드로, 스캔 속도 1Hz로 얻었다.Gold substrates were prepared using a DC magnetron sputtering method and a silicon substrate. Cr was deposited as a medium before gold deposition. Gold and chromium are 43 nm and 2 nm thick, respectively. The gold surface was washed with a piranha solution (piranha solution, 70% vol H 2 SO 4 , 30% H 2 O 2 ) to remove the foreign matter bound before the peptide membrane was made. The peptide thin film on the gold surface was prepared by treating the substrate with a peptide solution (0.1 mg / ml) for 12 hours, washing with PBS (Phosphate buffered saline), and drying with N 2 gas. For surface analysis of the fabricated peptide thin film, the gold substrate and the gold surface modified with
AFM 분석 결과, 아무 것도 처리되지 않은 베어 기판은 평균 높이 12 nm 였으나, 펩타이드 처리된 금 기판은 높이 증가를 나타내었다. 특히 단일 서열인 C-RGD보다 맵 구조를 가진 펩타이드 처리로 높이 증가가 더 많은 것을 볼 수 있었다. 맵 구조 펩타이드 중에서는 펩타이드 2가 보다 안정적으로 고르게 결합된 것으로 판단된다.AFM analysis showed that bare substrates without any treatment had an average height of 12 nm, while peptide-treated gold substrates showed an increase in height. In particular, the increase in height was seen by the peptide treatment with the map structure than the single sequence C-RGD. Among the map structural peptides, it is determined that
실시예Example 3: 세포 배양 및 세포 성장도 조사 3: cell culture and cell growth
새로이 디자인한 펩타이드들을 금 기판에 각각 처리한 다음, 동물세포[암세포(HeLa, ATCC로부터 구입)와 줄기세포(mouse embryonic cell, J1 ES cell, 서강대학교 김정호 교수로부터 제공받음, 참고 문헌 14)를 배양하였다. 줄기세포의 경우 피더세포를 이용하지 않고 배양하는 경우 부착력이 약하기 때문에, 보통 동물 세포 배양기에 다시 젤라틴 코팅하여 사용하게 되는데, 젤라틴은 ECM 단백질 콜라 겐을 부분 가수분해하여 얻어진 것으로 이 역시 고분자 물질이므로 나노 단위 미세세포 환경의 조성에는 적합하지 않다. Each of the newly designed peptides was treated on a gold substrate, followed by culturing animal cells (cancer cells (obtained from HeLa, ATCC) and stem cells (mouse embryonic cells, J1 ES cell, provided by Professor Kim Jeong-ho, Sogang University, Ref. 14). It was. In the case of culturing without using feeder cells, stem cells are weakly attached, so they are usually used by re-coating gelatin in animal cell incubators, which are obtained by partial hydrolysis of ECM protein collagen. It is not suitable for the composition of a unit microcell environment.
줄기세포용 나노패턴 세포 칩의 제작 시, 세포 고정에 본 발명의 RGD 펩타이드 맵이 젤라틴 대체 물질로 사용 가능한가 여부를 세포 부착 및 배양 후 세포 증식 정도를 비교하였다.When preparing the nanopattern cell chip for stem cells, the degree of cell proliferation after cell attachment and culture was compared whether the RGD peptide map of the present invention can be used as a gelatin replacement material for cell fixation.
도 3은 마우스 줄기세포를 금 기판 위에서 3 일간 배양한 후에 현미경으로 관찰한 결과이다. [RGD]n-MAP-C 펩타이드를 처리한 금 기판에서 배양된 줄기 세포는 일반적으로 사용하는 젤라틴 코팅 방법과 거의 같은 수준으로 세포의 증식을 보였으며 세포의 모양도 차이를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 이후 연구될 세포칩용 금기판 나노 단위 패턴 상에 젤라틴을 대신하여 본 발명의 펩타이드를 사용할 수 있음을 증명하는 것이다.Figure 3 is a result of observing with a microscope after culturing mouse stem cells on a gold substrate for 3 days. Stem cells cultured on gold substrates treated with [RGD] n-MAP-C peptide showed proliferation at about the same level as the gelatin coating method commonly used, and did not show any difference in cell shape. These results demonstrate that the peptide of the present invention can be used in place of gelatin on the gold substrate nano-unit pattern for cell chips to be studied later.
한편, 도 4는 순수 베어 골드(bare gold)와 3 가지 RGD 계열 펩타이드들이 처리된 금 기판에서 암세포(HeLa)를 2 일간 배양한 후에 MTT 분석(Farokhzad, O. C.; Cheng, J.; Teply, B. A.; Sherifi, I.; Jon, S.; Kantoff, P. W.; Richie, J. P.; Langer, R. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2004, 103 (16) 6315-6320)을 통하여 세포 증식 정도를 비교하여 나타낸 것이다. Meanwhile, FIG. 4 shows MTT assay (Farokhzad, OC; Cheng, J .; Teply, BA;) after culturing cancer cells (HeLa) for 2 days on a gold substrate treated with pure bare gold and three RGD-based peptides. Sherifi, I .; Jon, S .; Kantoff, PW; Richie, JP; Langer, R. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2004, 103 (16) 6315-6320). will be.
단일 펩타이드 처리의 경우 베어 골드에 비하여 2.5 배 정도 세포 증식 효과를 나타내었으며, 펩타이드 3을 처리한 경우는 4 배 이상 증가 되었다. 한편, 표면 분석에서 고르고 안정된 결합 구조를 나타내었던 펩타이드 2의 경우, 단일 CRGD 처리보다 세포 증식 효과가 감소하였다. 이와 같은 결과는 C-[(RGD-G)n-RGD]n-MAP 구조에서 세포 부착능을 가진 RGD 펩타이드가 내부로 가려지기 때문이라고 판단된다.Single peptide treatment showed 2.5 times more cell proliferation effect than bare gold, and
본 발명의 RGD 계열 펩타이드, 특히 펩타이드 3은 시스테인의 티올기를 통하여 금 기판 상에서 자기조립이 가능하며, 줄기세포를 비롯한 동물세포 배양에서 금 기판 사용 시보다 세포 증식률의 증대 효과를 나타내었다. 고분자 ECM 성분을 대신할 수 있는 본 발명의 저분자량 RGD 모티프 펩타이드는 나노패턴과 같은 나노수준에서 표면 개질에 적용할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드로 개질된 금 전극은 전기화학적인 혹은 전기적인 검출 시스템에 적용할 수 있다.The RGD-based peptide of the present invention, in particular,
참조 문헌Reference
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281(2006) 33554 281 (2006) 33554
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.
도 1은 본 발명에서 이용되는 세포 고정화를 위한 RGD 펩타이드 맵의 구조 및 이에 대한 일반식을 나타낸다.Figure 1 shows the structure and general formula for the RGD peptide map for cell immobilization used in the present invention.
도 2는 본 발명의 펩타이드-처리된 금 기판의 표면을 분석한 결과를 보여준다. 표면 분석은 원자현미경, AFM을 이용하였으며, 분석 범위는 500 nm X 500 nm, 스캔 속도는 1 Hz의 조건으로 진행되었다. (a) 베어 골드, (b)-(d) 각각 C-RGD, [C-RGD]n-MAP 및 [RGD]n-MAP-C 처리된 금 기판.Figure 2 shows the results of analyzing the surface of the peptide-treated gold substrate of the present invention. The surface analysis was performed using atomic force microscope and AFM, and the analysis range was 500 nm X 500 nm, and the scanning speed was 1 Hz. (a) bare gold, (b)-(d) C-RGD, [C-RGD] n-MAP and [RGD] n-MAP-C treated gold substrates, respectively.
도 3은 금 기판 위에서 줄기세포를 배양한 결과를 보여주는 형태(morphology) 분석 결과이다(x 40). 왼쪽 사진부터 베어 골드, [RGD]n-MAP-C 처리된 금 기판 및 젤라틴 처리된 금 기판.3 is a morphology analysis result showing the result of culturing stem cells on a gold substrate (x 40). From left photo Bare Gold, [RGD] n-MAP-C treated gold substrate and gelatinized gold substrate.
도 4는 세포 증식에 대한 본 발명의 펩타이드 효과를 보여주는 그래프이다.4 is a graph showing the peptide effect of the present invention on cell proliferation.
Claims (10)
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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