KR100893639B1 - Inhibitory Peptidomimetics of APP metabolism Based on Human BACE1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 강력한 APP 대사억제활성을 나타내는 펩티도미메틱 화합물에 관계한다. 본 발명의 화합물은 사람의 1형 베타-시크리타아제 단백질(β-APP cleaving enzyme 1; 이하 BACE1)의 아미노산 128-139 및 286-300에 상응하는 펩티드 또는 이의 단편 및 유사체의 N-말단에 세포 투과를 유도하는 그룹과 C-말단에 보호그룹이 결합된 형태로 구성된다. 본 발명은 이와 같은 펩티도미메틱 화합물의 구조와 이의 APP 대사 억제 활성 용도에 관계한다.The present invention relates to peptidomimetic compounds that exhibit potent APP metabolic inhibitory activity. The compounds of the present invention are cells at the N-terminus of peptides or fragments and analogs thereof corresponding to amino acids 128-139 and 286-300 of human type 1 beta-secretase protein (β-APP cleaving enzyme 1; hereinafter BACE1). It consists of a group inducing permeation and a protective group at the C-terminus. The present invention relates to the structure of such peptidomimetic compounds and their use in inhibiting APP metabolism activity.

베타-시크리타아제, Alzheimer, 치매, 펩티도미메틱, APP Beta-secretase, Alzheimer, dementia, peptidomimetic, APP

Description

사람 1형 베타-시크리타아제에 기초한 펩티도미메틱 에이피피 대사억제제 {Inhibitory Peptidomimetics of APP metabolism Based on Human BACE1}Inhibitory Peptidomimetics of APP metabolism Based on Human BACE1}

도 1은 APP 대사억제제 설계에 대한 가설을 나타낸 도면이다.1 is a view showing a hypothesis about the design of APP metabolism inhibitors.

도 2는 펩티도미메틱 화합물 [2], [3], [4] 및 [5]가 비신경세포인 BA-3의 sAPPβ 및 sAPPα의 생성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다. Fig. 2 shows the effects of peptidomimetic compounds [2], [3], [4] and [5] on the production of sAPPβ and sAPPα of BA-3, which are non-neuronal cells.

도 3은 펩티도미메틱 화합물 [2]가 신경세포인 SAB-1의 sAPPβ 및 sAPPα의 생성에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.3 is a diagram showing the effect of peptidomimetic compound [2] on the production of sAPPβ and sAPPα of SAB-1, which are neurons.

도 4는 펩티도미메틱 화합물 [2] 및 [4]가 비신경세포인 BA-3의 세포내 APP 축적에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.4 is a diagram showing the effect of peptidomimetic compounds [2] and [4] on intracellular APP accumulation of BA-3, which is a non-neuronal cell.

본 발명은 BACE1의 활성부위에 기초한 세포막 투과 APP 대사억제 펩티도미메틱 화합물 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 BACE1의 APP와 결합 및 활성을 나타내는 부위들 중 아미노산 서열 128-139 및 286-300에 상응하는 펩티드에 기초하여 양쪽 말단에 부가 아미노산을 추가한 후 N-말단에 세포막 투과를 가능하게 하는 소수성 지방산을 결합시키고 C-말단에 생체 내 분해가 되지 않도록 보 호그룹을 결합시킨 펩티도미메틱 화합물의 구조와 이의 APP 대사 억제 효과 용도에 관한 것이다. The present invention relates to a cell membrane permeation APP metabolism inhibitory peptidomimetic compound based on the active site of BACE1 and its use. More specifically, the present invention adds additional amino acids at both ends based on peptides corresponding to amino acid sequences 128-139 and 286-300 among the sites showing binding and activity with APP of BACE1, and then permeates the cell membrane at the N-terminus. The present invention relates to a structure of a peptidomimetic compound having a hydrophobic fatty acid which binds to a c-terminus and a protecting group bound to a C-terminus in vivo, and its inhibitory effect on APP metabolism.

Alzheimer성 치매는 Amyloid Precursor Protein (이하 APP)이라는 전구단백질이 대사되어 형성되는 Aβ 폴리펩티드의 침착이 주요 원인 [Selkoe (1994), Annu. Rev. Cell Biol,. 10: 373-403]으로 알려져 있다. APP는 Aβ를 생성하는 amyloidogenic pathway와 이의 생성을 억제하는 non-amyloidogenic pathway에 의해 대사되어진다. Amyloidogenic pathway에서 APP는 베타-시크리타아제의 작용으로 APPβ와 Aβ의 N-말단을 노출시킨 CTFβ (C-terminal fragment β)로 분해 된다. APPβ는 세포 밖으로 방출되며 CTFβ는 감마-시크리타아제의 작용으로 더욱 분해 되어 Aβ를 생성한다. 생성된 Aβ는 세포 내 축적되거나 세포 밖으로 방출된다. Non-amyloidogenic pathway에서는 APP의 Aβ 아미노산 서열의 16과 17번 사이를 알파-시크리타아제가 절단하여 APP는 APPα와 CTFα (C-terminal fragment α)로 분해되고 CTFα가 감마-시크리타아제의 작용으로 p3펩티드를 형성한다. 정상의 경우에서 APP 대사는 이들 두 가지 경로가 균형을 이루고 있으나 Alzheimer성 치매에서는 Aβ를 생성하는 amyloidogenic pathway가 우세한 것으로 인정되고 있다. 따라서 amyloidogenic pathway에서 Aβ의 생성에 참여하는 베타- 및 감마-시크리타아제에 대한 많은 연구가 수행되어 이들의 실체가 밝혀지고 있으며 또한 Alzheimer성 치매 환자에서 그 활성이 높은 것이 확인 되고 있다. 베타-시크리타아제는 1999년 Amgen [Vassar 등 (1999), Science, 286: 735-741], Elan [Sinha 등 (1999), Nature, 402: 537-540], Pharmacia-Upjohn [Yan 등 (1999), Nature, 402,: 533-537] 및 Smithkline Beecham [Hussain 등 (1999), Mol. Cell Neurosci., 14: 419-427]등의 제약회사에서 각각 다른 방법으로 BACE1 유전자의 규명 및 효소활성을 확인하였고 감마-시크리타아제는 가족성 Alzheimer성 치매의 주요 원인으로 알려진 presenilin [Strooper 등 (1999), Nature, 398: 518-522; Struhl 등 (1999), Nature, 398: 522-525]이 그 후보 또는 활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려지고 있다. 이러한 연구결과들을 바탕으로 베타- 및 감마-시크리타아제의 활성 저해제들이 Alzheimer성 치매치료제로 개발 중에 있으며 기질인 APP가 Aβ를 생성하기 위해 절단되는 특정부위의 아미노산 서열에 기초한 기질 경쟁 펩티드성 저해제들이 주를 이루고 있다. 그러나 아직까지 임상에 들어간 저해제가 없는 것으로 보아 이들 단백 분해효소들을 직접 표적으로 하는 저해제의 개발에 어려움이 있는 것으로 보여 진다.Alzheimer's dementia is primarily caused by the deposition of A [beta] polypeptides, which are formed by metabolism of a proprotein called Amyloid Precursor Protein (hereafter APP) [Selkoe (1994), Annu. Rev. Cell Biol ,. 10: 373-403. APP is metabolized by the amyloidogenic pathway that produces Aβ and the non-amyloidogenic pathway that inhibits its production. In the amyloidogenic pathway, APP is broken down into C-terminal fragment β (CTFβ), which exposes the N-terminus of APPβ and Aβ by the action of beta-secretase. APPβ is released outside the cell and CTFβ is further degraded by the action of gamma-secretase to produce Aβ. The resulting Aβ accumulates intracellularly or is released out of the cell. In the non-amyloidogenic pathway, alpha-secretase cleaves between 16 and 17 of the Aβ amino acid sequence of APP, whereby APP is broken down into APPα and C-terminal fragment α (CTFα), and CTFα is acted by gamma-secretase. Form peptides. In normal cases, APP metabolism is balanced between these two pathways, but it is recognized that the amyloidogenic pathway, which produces Aβ, is predominant in Alzheimer's dementia. Therefore, many studies on beta- and gamma-secretases involved in the production of Aβ in the amyloidogenic pathway have been conducted, and their identity has been confirmed, and the activity of Alzheimer's dementia patients is high. Beta-secretase is described in Amgen [Vassar et al. (1999), Science, 286: 735-741], Elan [Sinha et al. (1999), Nature, 402: 537-540], Pharmacia-Upjohn [Yan et al. (1999) ), Nature, 402 ,: 533-537] and Smithkline Beecham [Hussain et al. (1999), Mol. Cell Neurosci., 14: 419-427, et al., Respectively, have identified the BACE1 gene in different ways and identified the enzyme activity. Gamma-secretase is known to be the predominant cause of familial Alzheimer's dementia. 1999, Nature, 398: 518-522; Struhl et al. (1999), Nature, 398: 522-525, are known to play an important role in their candidates or activities. Based on these findings, inhibitors of beta- and gamma-secretase are being developed for the treatment of Alzheimer's dementia. Substrate competition peptide inhibitors based on the amino acid sequence of specific sites where the substrate APP is cleaved to produce Aβ It is a state. However, there are no inhibitors in clinical trials, which indicates that there is a difficulty in developing inhibitors that directly target these proteases.

본 발명에서는 효소의 활성을 직접 억제하는 일반적인 개념의 저해제 대신 기질과 상호 작용하는 효소의 활성 부위에 해당하는 펩티드에 세포막 투과를 가능하도록 지방산 같은 소수성 물질을 결합시킨 신 개념의 펩티도미메틱 화합물을 고안하여 기질인 APP에 대하여 BACE1과 경쟁하여 APP 대사를 억제하는 대사억제제로서 제공하고자 한다.In the present invention, a novel concept of peptidomimetic compounds in which a hydrophobic substance such as a fatty acid is coupled to a peptide corresponding to an active site of an enzyme that interacts with a substrate is used instead of a general inhibitor that directly inhibits enzyme activity. It is intended to provide a metabolic inhibitor that inhibits APP metabolism by competing with BACE1 for the substrate APP.

본 발명에 사용된 펩티도미메틱 화합물 Peptidomimetic Compounds Used in the Present Invention BACE1의 아미노산 배열 Amino acid sequence of BACE1 화합물의 구조Structure of compound 변 형transform 128-139 (VYVPYTQGKWEG)128-139 (VYVPYTQGKWEG) myr-GVYVPYTQGKWQG-NH2 [2] myr-GVYVPYTQGKWQG-NH2 [2] 138E→138Q138E → 138Q 130-136 (VPYTQGK)130-136 (VPYTQGK) myr-GVPYTQGK-NH2 [3] myr-GVPYTQGK-NH2 [3] -- 289-297(DSGTTNLRL)289-297 (DSGTTNLRL) myr-GNSGTTNLRL-NH2 [4] myr-GNSGTTNLRL-NH2 [4] 289D→289N289D → 289N 1-7 (MAQALPW)1-7 (MAQALPW) myr-GMAQALPW-NH2 [5] myr-GMAQALPW-NH2 [5] --

^{여기에서 myr은 글리신과 에스터 결합을 형성한 미리스틱산이며 NH2는 C말단의 카르복실 그룹과 아미드결합을 형성한 아민을 나타냄.Where myr is a myristic acid that forms an ester bond with glycine and NH2 represents an amine that forms an amide bond with a C-terminal carboxyl group.}

상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 기질인 APP의 절단 부위인 베타-사이트에 작용하는 BACE1 활성부위 아미노산 서열을 파악하여 이에 상응하는 펩티드를 합성하고 여기에 세포막 투과를 위하여 N-말단에 소수성 지방산을 결합시키고 C-말단에 보호 그룹을 결합시킨 펩티도미메틱 화합물을 제작하는 단계와 이의 APP 대사억제제로서의 용도 개발 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. In order to achieve the above object, the present invention is to identify the amino acid sequence of the BACE1 active site that acts on the beta-site, which is the cleavage site of APP, which is a substrate, and to synthesize a corresponding peptide. It is characterized in that it comprises a step of preparing a peptidomimetic compound bound to the C-terminus and a protective group and its development as an APP metabolism inhibitor.

본 발명에서는 기질과 작용하는 효소의 활성부위에 상응하는 펩티드를 합성하여 적용하면 기질과 효소의 상호작용을 경쟁적으로 저해하여 효소의 활성을 억제할 수 있을 것으로 예상되는 새로운 억제제 개념 (도 1)을 도입한 것으로 이의 개발을 위해서는 기질과 효소가 결합된 단백질 3차구조가 요구되어진다. 최근 BACE1이 기질인 APP의 베타-사이트에 결합되어 있는 3차구조가 확인 [Hong 등 (2002), Biochemistry, 41: 10963-10967]되어 이를 응용하여 APP 대사억제 펩티도미메틱을 고안할 수 있었다. BACE1의 아미노산 서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information; www.ncbi.nlm.nih.gov)에 gi:6118539로 등록되어있고 본 명세서에서는 서열 목록 1로 표시된다. BACE1은 시그널 시퀀스 (1-24), 프로 도메인 (24-60), 캐탈리틱 도메인 (60-453), 트랜스멤브레인 도메인 (453-481) 및 사이토졸 도메인 (481-501)으로 구성되어 있다. BACE1의 캐탈리틱 도메인은 효소활성을 담당하는 부위로 기질과 상호 작용하는 substrate binding pocket은 P4 P3 P2 P1 P1' P2' P3' P4'등 8곳으로 구성되어진다. 이들이 기질인 APP의 EVNLDAEF 아미노산 서열에 각각 결합하게 되면 BACE1은 APP의 류신 (L)과 아스파틱산 (D) 사이의 펩티드 결합을 절단한다. BACE1의 아미노산 배열 순서에서 크게 72-82 (⁷²GQGYYVEMTVG⁸²), 91-101 (⁹¹LVDTGSSNFAV¹⁰¹), 128-139 (¹²⁸VYVPYTQGKWEG¹³⁹) 및 286-300 (²⁸⁶SIVDSGTTNLRLPKK³⁰⁰) 등이 BACE1의 substrate binding pocket으로 알려졌다. 이들 중 128-139 및 286-300 부위가 APP와 가장 많은 상호 작용을 하고 있으며 296 위치의 아르기닌 (R)이 기질의 결합에 중요한 역할을 하는 것으로 예상되고 있다. 128-139 및 286-300 활성 부위에 해당하는 아미노산들 중 기질과 결합하는 핵심 부분인 ¹³¹PYTQ¹³⁴와 ²⁹¹GTTNLR²⁹⁶이 각각 포함되고 전후의 아미노산 배열의 숫자를 조절한 펩티드에 여분의 아미노산을 추가한 후 세포막을 투과할 수 있도록 N- 말단에 미리스틱산 (myristic acid), 팔미틱산 (palmitic acid), 파니솔 (farnesol) 및 제라니올 (geraniol) 등과 같은 소수성 화합물을 결합시키고 C-말단에는 보호그룹을 결합 시킨 R1-Y-(A)m-[X]-(B)n-R2 (이하 [1])로 대표되는 펩티도미메틱 화합물을 고안하였다. 이 대표 펩티도미메틱 화합물에서 [X]는 5 내지 15개로 구성된 BACE1의 APP와 결합하여 효소활성을 보이는 128-139 및 286-300에 상응하는 올리고펩티드 동족체로 128-139에서는 ¹³¹PYTQ¹³⁴가 286-300에서는 ²⁹¹GTTNLR²⁹⁶가 반드시 포함되어 있는 펩티드이며 R1은 이 화합물이 세포를 투과하거나 또는 세포막에 결합하도록 하는 물질로 주로 글리신이나 시스테인인 Y와 결합한다. R2는 대표 펩티도미메틱 화합물이 체내에서 단백분해효소들에 의한 분해를 막기 위하여 결합시킨 카르복시 말단 보호그룹이고 A 및 B는 화합물의 APP 대사억제 활성을 유지하기 위하여 집합적으로 선택되는 아미노산으로 m 및 n은 0 내지 3의 범위에 있다. [1]에 기초하여 BACE1의 128-139에 상응하는 펩티드에 소수성을 증가시키기 위해 138 위치의 글루탐산 (E)을 글루타민 (Q)으로 대체한 펩티드의 N-말단에 글리신을 추가하고 여기에 미리스틱산을 글리신의 아민그룹과 결합시켜 세포막 투과가 가능하도록 하고 C-말단에는 보호그룹으로 카르복실 그룹을 아미드로 대체시킨 [2]를 합성하였고 똑같은 방법으로 BACE1의 ¹³⁰VPYTQGK¹³⁶ 활성 부위에 해당하는 펩티드를 이용하여 [3]을 합성하였다. BACE1의 또 다른 주요 활성부위인 286-300의 활성 부위 중 ²⁸⁹DSGTTNLRL²⁹⁷에 해당하는 펩티드에서 아스파틱산 (D)을 아스파라긴 (N)으로 대체한 [4]도 합성하였다. 이와 더불어 이들이 선택적인 APP대사 억제효과를 보이는지 조사하고자 활성부위와 무관한 BACE1의 1-7에 해당하는 [5]의 화합물을 합성하였다. 이들을 APP와 BACE1이 과발현된 세포에 처리하고 세포 밖으로 방출된 APP 대사물인 sAPPβ 생성량을 조사 결과 [2], [3] 및 [4]는 억제효과를 보인 반면 대조군으로 사용한 [5]는 효과를 보이지 않았다. [2]와 [3]은 sAPPα 생성도 억제한 반면 [4]는 일정 농도 이하에서는 전혀 효과가 없어 BACE1의 활성을 선택적으로 억제하는 펩티도미메틱 화합물인 것으로 확인되었다. 또한 [2] 및 [4]를 처리한 세포 추출액에서 농도 의존적으로 APP의 축적이 관찰되었고 이러한 현상들은 [2] 및 [4]가 세포를 투과하고 APP에 작용하여 베타-시크리타아제 또는 알파-시크리타아제에 의한 APP 대사를 억제한다는 것을 의미한다. 상기의 결과들은 비신경세포에 적용한 것들로 사람 유래 신경세포에서도 동일한 효과를 [2]를 신경세포에 처리하여 확인 할 수 있었다. 이상 본 발명은 베타- 및 알파-시크리타아제 활성을 동시에 억제하는 [2]와 [3] 종류의 펩티도미메틱 화합물과 베타-시크리타아제 활성을 보다 선택적으로 억제하는 [4] 종류의 펩티도미메틱 화합물을 포함한다. 이들은 APP대사를 억제하여 궁극적으로는 Alzheimer성 치매의 원인 단백질인 Aβ의 생성을 차단할 것으로 예상된다. In the present invention, if a peptide corresponding to the active site of the enzyme acting on the substrate is synthesized and applied, a new inhibitor concept expected to be able to inhibit the activity of the enzyme by competitively inhibiting the interaction between the substrate and the enzyme (FIG. 1) In order to develop this, a protein tertiary structure in which a substrate and an enzyme are combined is required. Recently, a tertiary structure in which BACE1 is bound to the beta-site of APP, which is a substrate, has been identified [Hong et al. (2002), Biochemistry, 41: 10963-10967], whereby APP metabolism inhibitory peptidomimetic could be devised. The amino acid sequence of BACE1 is NCBI; gi in (National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov) : registered to 6,118,539 and is represented by SEQ ID NO. 1 in the present specification. BACE1 consists of signal sequence (1-24), pro domain (24-60), catalytic domain (60-453), transmembrane domain (453-481) and cytosol domain (481-501). The catalytic domain of BACE1 is the site responsible for enzymatic activity, and the substrate binding pocket interacting with the substrate is composed of eight sites such as P4 P3 P2 P1 P1 'P2' P3 'P4'. When they bind to the EVNLDAEF amino acid sequence of APP, the substrate, BACE1 cleaves the peptide bond between leucine (L) and aspartic acid (D) of APP. In the amino acid sequence of BACE1, 72-82 ( ⁷² GQGYYVEMTVG ⁸² ), 91-101 ( ⁹¹ LVDTGSSNFAV ¹⁰¹ ), 128-139 ( ¹²⁸ VYVPYTQGKWEG ¹³⁹ ), and 286-300 ( ²⁸⁶ SIVDSGTTNLRLPKK ³⁰⁰ ) are the substrate binding pockets of BACE1. Became known. Of these, 128-139 and 286-300 sites interact most with APP, and arginine (R) at position 296 is expected to play an important role in substrate binding. Among the amino acids corresponding to 128-139 and 286-300 active sites, ¹³¹ PYTQ ¹³⁴ and ²⁹¹ GTTNLR ^296, which are the key parts of the substrate binding, were added, respectively. Hydrophobic compounds such as myristic acid, palmitic acid, farnesol and geraniol are attached to the N-terminus to penetrate the cell membrane and protected at the C-terminus. A peptidomimetic compound represented by R1-Y- (A) m- [X]-(B) n-R2 (hereinafter [1]) to which a group was combined was designed. In this representative peptidomimetic compound, [X] is an oligopeptide homologue corresponding to 128-139 and 286-300 which show enzymatic activity by binding to APP of 5 to 15 BACE1. In 128-139, ¹³¹ PYTQ ¹³⁴ is 286- At 300, ²⁹¹ GTTNLR ²⁹⁶ is a peptide that must be included. R1 is a substance that allows the compound to penetrate the cell or bind to the cell membrane. It binds mainly to glycine or cysteine Y. R2 is a carboxy terminal protecting group in which a representative peptidomimetic compound is bound to prevent degradation by proteases in the body, and A and B are amino acids selected collectively to maintain the APP metabolism inhibitory activity of m and n is in the range of 0-3. Based on [1], glycine was added to the N-terminus of the peptide where glutamic acid (E) at position 138 was replaced with glutamine (Q) to increase hydrophobicity to the peptide corresponding to 128-139 of BACE1, and mystic An acid was combined with an amine group of glycine to allow cell membrane permeation, and at the C-terminus, a carboxyl group was replaced with an amide as a protecting group. In the same way, a peptide corresponding to ¹³⁰ VPYTQGK ¹³⁶ active site of BACE1 was synthesized. [3] was synthesized using. [4] was also synthesized by replacing aspartic acid (D) with asparagine (N) in a peptide corresponding to ²⁸⁹ DSGTTNLRL ²⁹⁷ of the active site of 286-300, another major active site of BACE1. In addition, the compound of [5] corresponding to 1-7 of BACE1 irrespective of the active site was synthesized to investigate whether they show a selective APP metabolism inhibitory effect. These cells were treated with cells overexpressing APP and BACE1, and the production of sAPPβ, an APP metabolite released out of the cells, showed that [2], [3], and [4] showed inhibitory effects, whereas [5] as a control showed no effect. Did. [2] and [3] also inhibited the production of sAPPα, while [4] was found to be a peptidomimetic compound that selectively inhibits the activity of BACE1 at a certain concentration or less. In addition, the accumulation of APP was observed in cell extracts treated with [2] and [4], and these phenomena were observed by [2] and [4] as they penetrated the cells and acted on APP, resulting in beta-secretase or alpha- Means inhibiting APP metabolism by cyclase. The above results were applied to non-neuronal cells and could be confirmed by treating neurons with the same effect in human-derived neurons [2]. The present invention is a peptidomimide of [2] and [3] which selectively inhibits beta- and alpha-secretase activity, and a [4] type peptidomime which selectively inhibits beta-secretase activity. Methoxy compounds. They are expected to inhibit APP metabolism and ultimately block the production of Aβ, the protein responsible for Alzheimer's dementia.

하기 실시 예는 본 발명의 바람직한 조성물 및 방법을 설명한다. 본 발명의 관점에서, 본 명세서에 설명된 펩티드의 다른 유용한 절편 및 동족체가 당업계의 기술자들에 의해 쉽게 확인될 수 있고, 따라서 본 발명에 포함된다는 것이 당업계의 기술자들에게는 명백할 것이다. 이들 실시 예는 단지 설명을 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.The following examples illustrate preferred compositions and methods of the present invention. In view of the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that other useful fragments and homologues of the peptides described herein can be readily identified by those skilled in the art and are therefore included in the present invention. These examples are illustrative only and are not intended to limit the scope of the invention.

실시 예 1: 펩티드의 합성 Example 1 Synthesis of Peptides

BACE1의 활성 부위 또는 N-말단의 일부에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 펩티도미메틱 화합물 [2], [3], [4], [5]를 합성하였다. 각 화합물은 펩티드 합성 표준 Fmoc 프로토콜 [Fields 및 Noble (1990), Int. J. Pept. Protein Res., 35: 61-241]을 사용하여 조합하였다. N- 말단 Fmoc를 절단하여 생성된 아민과 미리스틱산의 카르복실그룹을 축합 반응하였고 레진에서 제거한 C-말단을 아미데이션 (amidation)하여 펩티도미메틱 화합물을 완성하였다. 0.1% 트리플루오로아세트산 수용액 중에서 C8 칼럼 및 아세토니트릴의 선형 구배를 사용한 역상 HPLC에 의해 펩티도미메틱 화합물을 정제하였고 합성의 효율 및 정확성은 질량 분광기 (LC/MSD)로 측정하였다. 이상의 방법으로 표 1의 [2], [3], [4] 및 [5]를 합성하였다. 본 발명은 본 발명의 펩티드미메틱 화합물을 제조하기 위해 사용된 특정 화학 작용 또는 합성자에 의해 제한되지 않으며 그러한 요인은 본 발명의 펩티드의 활성에 결정적인 것이 아니다.Peptidomimetic compounds [2], [3], [4] and [5] having an amino acid sequence corresponding to the active site or part of the N-terminus of BACE1 were synthesized. Each compound is described in Peptide Synthesis Standard Fmoc Protocol [Fields and Noble (1990), Int. J. Pept. Protein Res., 35: 61-241]. N-terminal Fmoc was cleaved to condensate the amine produced by the amine and mystic acid, and the C-terminus removed from the resin was amidated to complete the peptidomimetic compound. The peptidomimetic compound was purified by reversed phase HPLC using a C8 column and a linear gradient of acetonitrile in 0.1% trifluoroacetic acid aqueous solution and the efficiency and accuracy of the synthesis was determined by mass spectroscopy (LC / MSD). [2], [3], [4] and [5] of Table 1 were synthesized by the above method. The present invention is not limited by the specific chemistry or synthesizer used to prepare the peptidomimetic compounds of the invention and such factors are not critical to the activity of the peptides of the invention.

실시 예 2: 펩티도미메틱 화합물의 배양액 내 APPα 및 β 생성 억제 효과 Example 2 Effect of Inhibiting APPα and β Production in Culture Media of Peptidodometic Compounds

BACE1 및 야생형 APP695가 과발현 되는 HEK293 유래 BA-3 세포주가 6-well plate의 각 well 당 80% 이상의 면적을 차지하도록 10% FBS가 포함된 DMEM을 사용하여 분주하고 1일 동안 배양하였다. 배지를 제거한 다음 FBS가 없는 free DMEM을 37℃로 가온하여 각 well에 0.9ml 넣은 후 0.1ml free DMEM에 [2], [3], [4] 및 [5]를 적정 농도로 희석하여 처리 후 24시간 배양하였다. 각 시료가 처리된 배지 0.2ml을 회수하여 8% SDS-PAGE 후 웨스턴 블롯으로 배양액 내의 APPα 및 β (이하 sAPPα 및 β)를 측정하였다. APPα 및 APPβ는 각각 AB1560 (monoclonal)및 Rb53 (polyclonal) 항체를 사용하여 확인하였다. [2], [3], [4]는 정도의 차이는 있었지만 모두 sAPPβ의 생성을 억제하였다 (도 2). [2]와 [4]는 3.1μM에서 sAPPβ의 생성을 뚜렷이 억제하였고 [3]은 처리 최저 농도인 12.5μM에서 완전한 억제를 보였다. [2]와 [3]은 또한 sAPPα의 생성도 동시에 억제한 반면 [4]는 다른 양상을 보였다. [4]는 처리 최고농도인 50μM에서는 sAPPα 및 sAPPβ의 생성을 동시에 억제하였으나 25μM 이하 처리농도에서는 sAPPβ의 방출만 선택적으로 억제하였다. 이러한 결과들에 의하면 [2] 및 [3]보다 [4]가 보다 BACE1의 활성을 선택적으로 억제하는 펩티도미메틱 화합물인 것으로 보인다. [2], [3], [4]와 비교하여 BACE1의 1-7에 상응하는 펩티드를 기초로 합성한 [5]는 전혀 억제 효과를 보이지 않은 것으로 보아 APP 대사억제 효과는 BACE1의 활성부위에 해당하는 펩티도미메틱 선택적으로 나타난다는 것을 확인하였다. 이상의 결과들은 비신경세포를 대상으로 수행한 것으로 펩티도미메틱 화합물이 신경세포에서도 동일한 효과를 보이는지 조사하였다. BACE1 및 야생형 APP695를 과발현 시킨 사람 SY5Y 유래 SAB-1 세포주를 동일한 시험조건을 적용하여 [2]를 처리하였다. [2]는 처리 최저 농도인 6.3μM에서도 sAPPβ및 sAPPα의 생성을 완전히 억제하였다. 따라서 [2]는 비신경세포 뿐 아니라 신경세포에서도 APP 대사 억제효과가 있는 것을 확인 할 수 있었다 (도 3). HEK293-derived BA-3 cell lines overexpressing BACE1 and wild-type APP695 were aliquoted with DMEM containing 10% FBS and incubated for 1 day so that they occupy more than 80% of each well of the 6-well plate. After removing the medium, the free DMEM without FBS was warmed to 37 ° C, put 0.9ml into each well, and then treated with 0.1ml free DMEM by diluting [2], [3], [4] and [5] to an appropriate concentration. Incubated for 24 hours. 0.2 ml of the medium to which each sample was treated was collected, and 8% SDS-PAGE was followed by Western blot to measure APPα and β (hereinafter, sAPPα and β) in the culture solution. APPα and APPβ were identified using AB1560 (monoclonal) and Rb53 (polyclonal) antibodies, respectively. [2], [3], and [4] had a degree of difference, but all inhibited the production of sAPPβ (FIG. 2). [2] and [4] clearly inhibited the production of sAPPβ at 3.1 μM and [3] showed complete inhibition at 12.5 μM, the lowest concentration. [2] and [3] also inhibited the production of sAPPα, while [4] showed a different pattern. [4] inhibited the production of sAPPα and sAPPβ simultaneously at the highest concentration of 50 μM, but selectively inhibited the release of sAPPβ at concentrations below 25 μM. These results suggest that [4] is a peptidomimetic compound that selectively inhibits the activity of BACE1 more than [2] and [3]. Compared with [2], [3], and [4], [5] synthesized based on peptides corresponding to 1-7 of BACE1 showed no inhibitory effect. It was confirmed that the corresponding peptidomimetic appears selectively. The results were performed on non-neuronal cells and examined whether the peptidomimetic compound showed the same effect on neurons. Human SY5Y-derived SAB-1 cell line overexpressing BACE1 and wild type APP695 was treated with [2] using the same test conditions. [2] completely inhibited the production of sAPPβ and sAPPα even at the lowest concentration of 6.3 μM. Therefore, it was confirmed that [2] has a metabolic inhibitory effect on APP as well as non-neuronal cells (FIG. 3).

실시 예 3: 펩티도미메틱 화합물의 세포내 APP 축적 유도 Example 3 Induction of Intracellular APP Accumulation of Peptidomimetic Compounds

실시 예 2에서와 같은 방법으로 BA-3에 [2] 및 [4]를 처리한 후 배지를 제거하고 차가운 PBS 1ml을 첨가하였다. 스크래퍼로 세포를 모아 원심분리 후 상층액을 제거한 다음 1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail 및 phosphatase inhibitor인 Na3Vo4가 첨가된 TEN buffer (50mM Tris, pH7.6, 150mM NaCl, 2mM EDTA)를 넣고 vortex하여 얼음에 30분 동안 방치 시켰다. Sonicator로 간단히 sonication한 다음 4℃, 14,000rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수하였다. BCA방법으로 단백질을 정량하여 동량을 8% SDS-PAGE 후 AB1560 (monoclonal) 항체를 사용한 웨스턴 블롯으로 세포 내의 APP를 확인하였다. [2] 및 [4]의 처리는 농도 의존적으로 세포내의 APP를 축적시켰다 (도 4). [2]는 처리 최저 농도인 6.3μM에서도 APP의 뚜렷한 축적을 보였고 [4]는 3.1μM 이상에서 APP 축적을 확인 할 수 있었다. 이처럼 APP의 축적은 [2] 및 [4]가 베타- 또는 알파-시크리타아제와 경쟁적으로 APP에 작용하여 이들 효소들의 APP 접근을 차단하고 이로 인해 APP 대사를 억제하는 화합물이라는 것을 보여주는 결과이다.After treating BA-3 [2] and [4] in the same manner as in Example 2, the medium was removed and 1 ml of cold PBS was added. The cells were collected with a scraper and centrifuged to remove supernatant, and then vortex was added with TEN buffer (50mM Tris, pH7.6, 150mM NaCl, 2mM EDTA) containing 1% Triton X-100, protease inhibitor cocktail and phosphatase inhibitor Na3Vo4. It was left on ice for 30 minutes. After sonication with a sonicator, the supernatant was recovered by centrifugation at 4 ° C. and 14,000 rpm for 10 minutes. Proteins were quantified by BCA method, and the same amount was determined by Western blot using 8% SDS-PAGE and AB1560 (monoclonal) antibody. Treatment of [2] and [4] accumulated intracellular APP in a concentration dependent manner (FIG. 4). [2] showed clear accumulation of APP even at the lowest concentration of 6.3μM, and [4] confirmed APP accumulation above 3.1μM. As such, accumulation of APP is the result showing that [2] and [4] are compounds that act on APP competitively with beta- or alpha-secretase to block APP access of these enzymes and thereby inhibit APP metabolism.

세포투과가 가능한 펩티도미메틱이므로 Alzheimer성 치매의 기초연구에 많은 기여를 할 수 있고 또한 구조적 변형으로 저분자량의 더욱 효율적인 억제제를 개발한다면 유용한 Alzheimer성 치매 치료제 개발이 기대되어진다.As the cell-penetrating peptidomimetics can contribute to the basic research of Alzheimer's dementia, it is expected to develop a useful Alzheimer's dementia treatment agent if the structural modification makes more effective inhibitor of low molecular weight.

<110> Lee,Kum-Ki;ILDONG PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Inhibitory Peptidomimetics of APP metabolism Based on Human BACE1 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val 1 5 10 15 Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser 20 25 30 Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp 35 40 45 Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val 50 55 60 Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr 65 70 75 80 Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser 85 90 95 Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr 100 105 110 Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val 115 120 125 Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp 130 135 140 Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile 145 150 155 160 Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp 165 170 175 Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp 180 185 190 Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro 195 200 205 Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln 210 215 220 Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile 225 230 235 240 Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg 245 250 255 Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln 260 265 270 Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val 275 280 285 Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala 290 295 300 Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp 305 310 315 320 Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr 325 330 335 Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val 340 345 350 Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg 355 360 365 Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala 370 375 380 Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala 405 410 415 Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu 420 425 430 Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro 435 440 445 Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala 450 455 460 Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp 465 470 475 480 Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp 485 490 495 Ile Ser Leu Leu Lys 500 <110> Lee, Kum-Ki; ILDONG PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> Inhibitory Peptidomimetics of APP metabolism Based on Human BACE 1 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 501 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Gln Ala Leu Pro Trp Leu Leu Leu Trp Met Gly Ala Gly Val   1 5 10 15 Leu Pro Ala His Gly Thr Gln His Gly Ile Arg Leu Pro Leu Arg Ser              20 25 30 Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Gly Leu Arg Leu Pro Arg Glu Thr Asp          35 40 45 Glu Glu Pro Glu Glu Pro Gly Arg Arg Gly Ser Phe Val Glu Met Val      50 55 60 Asp Asn Leu Arg Gly Lys Ser Gly Gln Gly Tyr Tyr Val Glu Met Thr  65 70 75 80 Val Gly Ser Pro Pro Gln Thr Leu Asn Ile Leu Val Asp Thr Gly Ser                  85 90 95 Ser Asn Phe Ala Val Gly Ala Ala Pro His Pro Phe Leu His Arg Tyr             100 105 110 Tyr Gln Arg Gln Leu Ser Ser Thr Tyr Arg Asp Leu Arg Lys Gly Val         115 120 125 Tyr Val Pro Tyr Thr Gln Gly Lys Trp Glu Gly Glu Leu Gly Thr Asp     130 135 140 Leu Val Ser Ile Pro His Gly Pro Asn Val Thr Val Arg Ala Asn Ile 145 150 155 160 Ala Ala Ile Thr Glu Ser Asp Lys Phe Phe Ile Asn Gly Ser Asn Trp                 165 170 175 Glu Gly Ile Leu Gly Leu Ala Tyr Ala Glu Ile Ala Arg Pro Asp Asp             180 185 190 Ser Leu Glu Pro Phe Phe Asp Ser Leu Val Lys Gln Thr His Val Pro         195 200 205 Asn Leu Phe Ser Leu Gln Leu Cys Gly Ala Gly Phe Pro Leu Asn Gln     210 215 220 Ser Glu Val Leu Ala Ser Val Gly Gly Ser Met Ile Ile Gly Gly Ile 225 230 235 240 Asp His Ser Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Trp Tyr Thr Pro Ile Arg Arg                 245 250 255 Glu Trp Tyr Tyr Glu Val Ile Ile Val Arg Val Glu Ile Asn Gly Gln             260 265 270 Asp Leu Lys Met Asp Cys Lys Glu Tyr Asn Tyr Asp Lys Ser Ile Val         275 280 285 Asp Ser Gly Thr Thr Asn Leu Arg Leu Pro Lys Lys Val Phe Glu Ala     290 295 300 Ala Val Lys Ser Ile Lys Ala Ala Ser Ser Thr Glu Lys Phe Pro Asp 305 310 315 320 Gly Phe Trp Leu Gly Glu Gln Leu Val Cys Trp Gln Ala Gly Thr Thr                 325 330 335 Pro Trp Asn Ile Phe Pro Val Ile Ser Leu Tyr Leu Met Gly Glu Val             340 345 350 Thr Asn Gln Ser Phe Arg Ile Thr Ile Leu Pro Gln Gln Tyr Leu Arg         355 360 365 Pro Val Glu Asp Val Ala Thr Ser Gln Asp Asp Cys Tyr Lys Phe Ala     370 375 380 Ile Ser Gln Ser Ser Thr Gly Thr Val Met Gly Ala Val Ile Met Glu 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Val Val Phe Asp Arg Ala Arg Lys Arg Ile Gly Phe Ala                 405 410 415 Val Ser Ala Cys His Val His Asp Glu Phe Arg Thr Ala Ala Val Glu             420 425 430 Gly Pro Phe Val Thr Leu Asp Met Glu Asp Cys Gly Tyr Asn Ile Pro         435 440 445 Gln Thr Asp Glu Ser Thr Leu Met Thr Ile Ala Tyr Val Met Ala Ala     450 455 460 Ile Cys Ala Leu Phe Met Leu Pro Leu Cys Leu Met Val Cys Gln Trp 465 470 475 480 Arg Cys Leu Arg Cys Leu Arg Gln Gln His Asp Asp Phe Ala Asp Asp                 485 490 495 Ile Ser Leu Leu Lys             500  

Claims (5)

대표구조 R1-Y-[X]-R2 [1]로 표현되는 APP 대사억제 펩티도미메틱 화합물. APP metabolism inhibitory peptidomimetic compound represented by the representative structure R1-Y- [X] -R2 [1]. 상기구조에서, R1은 미리스틱산이고, Y는 글리신이며, [X]는 BACE1의 APP와 결합하여 효소활성을 보이는 아미노산 서열 128-139에서의 ¹³⁰VPYTQGK¹³⁶나 138위 아미노산인 글루탐산 (E)이 글루타민 (Q)로 변형된 올리고펩티드 ¹²⁸VYVPYTQGKWQG¹³⁹ , 또는 289-297에서의 289위 아미노산인 아스파틱산 (D)이 아스파라긴 (N)으로 대체된 올리고펩티드 ²⁸⁹NSGTTNLRL²⁹⁷중에서 선택되는 어느 하나이고, R2는 아민이다.In the above structure, R1 is mystic acid, Y is glycine, and [X] is glutamic acid (E) which is ¹³⁰ VPYTQGK ¹³⁶ or 138 amino acid in amino acid sequence 128-139 showing enzymatic activity by binding to APP of BACE1. Glutamine (Q) modified oligopeptide ¹²⁸ VYVPYTQGKWQG ¹³⁹ , or oligopeptide ²⁸⁹ NSGTTNLRL ²⁹⁷ , wherein aspartic acid (D) at position ^{289 in} 289-297 is replaced with asparagine (N), R2 is Amine. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 대표구조 R1-Y-[X]-R2 [1]로 표현되는 APP 대사억제 펩티도미메틱 화합물.APP metabolism inhibitory peptidomimetic compound represented by the representative structure R1-Y- [X] -R2 [1]. 상기구조에서, R1은 미리스틱산이고, Y는 글리신이며, [X]는 BACE1의 아미노산 서열 128-139 또는 286-300에 상응하는 올리고펩티드 동족체로써 (A)¹³⁰VPYTQGK¹³⁶(B) 또는 ²⁸⁹DSGTTNLRL²⁹⁷ (여기에서, A는 BACE1의 128-129에 상응하는 아미노산으로써, 공백, Y 또는 VY중에서 선택되는 하나이고, B는 137-139에 상응 또는 일부 대체된 아미노산으로써, 공백, W, WE, WQ 또는 WEG중에서 선택되는 하나임, 다만 A와 B가 동시에 공백인 경우는 제외함)이며, R2는 아민이다. In the above structure, R1 is mystic acid, Y is glycine, and [X] is an oligopeptide analogue corresponding to amino acid sequence 128-139 or 286-300 of BACE1 (A) ¹³⁰ VPYTQGK ¹³⁶ (B) or ²⁸⁹ DSGTTNLRL ²⁹⁷ (wherein A is an amino acid corresponding to 128-129 of BACE1, one selected from blank, Y or VY, and B is an amino acid corresponding to or partially substituted with 137-139, blank, W, WE, WQ Or one selected from WEG, except that A and B are both empty at the same time), and R2 is an amine.

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