KR100892587B1

KR100892587B1 - 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를함유하는 암 진단용 조성물 및 그 용도

Info

Publication number: KR100892587B1
Application number: KR1020060029175A
Authority: KR
Inventors: 안성환; 윤치왕; 문영호; 오태정; 김명순
Original assignee: (주)지노믹트리
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2006-03-30
Publication date: 2009-04-08
Also published as: KR20070098034A

Abstract

본 발명은 대장암 특이적 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물, 상기 조성물이 기질상에 고정되어 있는 암 진단용 마이크로어레이 및 상기 조성물을 함유하는 대장암 진단키트에 관한 것이다.

본 발명에 의해 기능이 확인된 대장암 특이적 발현 감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물은 대장암의 조기진단뿐 아니라 예후 예측을 위한 목적으로 유용하다.

메틸화, 대장암, 발현감소 유전자, 프로모터, 마이크로어레이, 암 진단

Description

대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물 및 그 용도{Composition For Cancer diagnosis Containing Methylated Promoters of Colon Cancer Specific Expression-decreased Genes and Use Thereof}

도 1은 프로모터 메틸화에 따른 유전자 발현 감소를 보이는 유전자를 선별하여 대장암 진단용 메틸레이션 바이오마커를 선별하는 과정을 도시한 것이다.

도 2는 본 발명에서 발굴된 대장암 진단용 유전자의 프로모터를 대상으로, 프로모터 메틸화 여부를 측정할 수 있는 방법인 HpaII/MspI 효소절단분석(enzyme digestion assay)을 도식화한 그림이다.

도 3은 본 발명에서 발굴된 15종 유전자의 프로모터를 대상으로, 대장암 세포주인 Caco-2와 HCT116에서의 프로모터 메틸화 여부를 측정하는 방법 HpaII/MspI 효소절단분석(enzyme digestion assay)을 수행한 결과를 도시한 것이다.

도 4는 본 발명에서 발굴된 15종의 유전자 발현이 탈메틸화제 처리에 의해 발현이 증가하는 것을 도시한 것이다.

도 5는 본 발명에서 선별된 8종 유전자의 프로모터를 대상으로, 40명의 대 장암 환자로부터 얻어진 암 조직 및 이와 인접하는 정상조직 및 정상 대장조직에 대하여 HpaII/MspI 효소절단분석(enzyme digestion assay)을 수행한 후 메틸화 프로파일을 작성한 것이다.

발명의 분야

발명의 배경

의학이 발달한 오늘날에도 인체 암, 특히 대다수를 차지하는 고형암(solid tumor: 혈액암을 제외한 나머지 암)의 경우 5년 생존율은 50%미만이다. 전체 암환자의 약 3분의 2는 진행된 단계에서 발견되며, 이들 대부분은 진단 후 2년 이내에 사망한다. 이와 같이 저조한 암의 치료효과는 치료법의 문제 뿐만은 아니며, 실제 암을 조기에 진단할 수 있는 방법과 진행된 암을 정확히 진단하고 치료 후 추적 조 사하는 것이 용이하지 않기 때문이다.

현재 임상에서 암의 진단은 문진(history taking)과 신체검사, 임상병리검사를 거쳐 일단 의심이 되면 방사선검사 및 내시경검사로 진행되며, 최종적으로는 조직검사로 확인된다. 그러나 현존 임상검사법으로는 암의 세포수가 10억개, 암의 직경이 1㎝ 이상이 되어야 진단이 가능하다. 이런 경우 이미 암세포는 전이능력을 갖고 있으며, 실제 절반 이상에서 암이 이미 전이되어 있다. 한편, 암이 직간접으로 생산하는 물질을 혈액내에서 찾는 종양마커(tumor markers)가 암 선별검사(cancer screening)에 이용되는데, 이는 정확도에 한계가 있어서 암이 있을 때도 약 절반까지 정상으로 나타나며, 암이 없을 때도 종종 양성으로 나타나서 혼란을 야기한다. 또한, 암의 치료에 주로 사용되는 항암제의 경우, 암의 용적이 적은 경우에만 그 효과를 나타내는 문제점이 있다.

상기한 바와 같이, 암의 진단과 치료가 모두 어려운 것은 정상세포와 다른 점이 많고, 매우 복잡하고 다양하기 때문이다. 암은 제멋대로 과잉으로 계속 자라며, 사망에서 해방되어 계속 생존하고, 주위조직을 침범하고 원위 장기로 확산(전이)되어서 인간을 사망하게 한다. 면역기전의 공격이나 항암 치료에도 생존하고, 끊임없이 진화하며 생존에 가장 유리한 세포군(클론)이 선택적으로 증식한다. 암세포는 다수의 유전자의 변이에 의해 발생하는 고도의 생존능력을 가진 생존체이다.하나의 세포가 암세포로 바뀌고, 임상에서 보는 악성의 암 덩어리로 발전해 나가기 위해서는 다수의 유전자에 변이가 일어나야 한다. 따라서 암을 근원적으로 진단하고 치료하기 위해서는 유전자 수준에서 접근할 필요가 있다.

최근, 암의 진단에 유전자검사가 적극적으로 시도되고 있다. 가장 단순한 대표적 방법은 혈액에서 백혈병의 유전자 지표인 ABL:BCR 융합 유전자의 유무를 PCR로 찾는 것이다. 이는 정확도가 95%이상이며, 단순 용이한 검사로 만성골수성 백혈병의 진단과 치료 후 결과 평가, 추적조사 등에 유용하게 사용되고 있다. 그러나, 이 방법은 소수 혈액암의 경우에만 적용이 가능하다.

또한, 암세포가 발현하는 유전자의 존재를 RT-PCR 및 블라팅으로 파악함으로써 혈구세포 중에 함께 존재하는 암세포를 진단하는 방법도 시도되고 있다. 그러나 이 방법은 전립선암과 흑색종 등 일부 암에서만 적용이 가능하며, 가양성(false positive rate)이 많고, 검사 및 판독 방법의 표준화가 어렵고, 그 유용성에도 한계가 있다 (Kopreski, M.S. et al ., Clin . Cancer Res ., 5:1961, 1999; Miyashiro, I. et al ., Clin . Chem ., 47:505, 2001).

혈청(serum)이나 혈장(plasma)내 DNA를 사용하는 유전자검사가 최근 활발히 시도되고 있다. 이는 암세포에서 분리되어 혈액으로 나와서 혈청 내에 유리형(free DNA)으로 존재하는 암 관련 유전자를 찾는 방법이다. 실제 암환자에서는 혈청 내 DNA 농도가 정상인의 5-10배로 증가되며, 이렇게 증가된 DNA는 대부분이 암세포에서 유리되는 것으로 밝혀지고 있다. 이들 암에서 유리된 DNA를 가지고 암 유전자(oncogene)와 종양억제 유전자의 돌연변이나 소실, 기능상실 등, 암에 특이한 유전자 이상을 분석하면 암을 진단할 수 있다. 실제 혈청에서 돌연변이형의 K-Ras 암유전자나 p53 종양억제 유전자, p16 유전자의 프로모터 메틸화, 그리고 마이크로세틀라이트(microsatellite)의 표지와 불안정성(instability) 등을 검사하여 폐암과 두경부암, 유방암, 대장암, 간암 등을 진단하는 것이 활발하게 시도되고 있다 (Chen, X.Q. et al ., Clin . Cancer Res ., 5:2297, 1999; Esteller, M. et al ., Cancer Res., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedes, M. et al ., Cancer Res ., 60:892, 2000; Sozzi, G. et al ., Clin . Cancer Res ., 5:2689, 1999).

한편, 혈액외의 검체에서도 암의 DNA를 검사할 수 있다. 폐암 환자에서 객담이나 기관지폐포 세척액(bronchoalveolar lavage) 내에 존재하는 암세포 및 암 유전자의 존재를 유전자검사나 항체검사로 찾는 방법이 시도되고 있으며(Palmisano, W.A. et al., Cancer Res ., 60:5954, 2000; Sueoka, E. et al ., Cancer Res ., 59:1404, 1999), 대장 및 직장암에서 대변 내에 존재하는 암 유전자를 찾는 방법 (Ahlquist, D.A. et al ., Gastroenterol ., 119:1219-27, 2000)과 소변 및 전립선액 내에 존재하는 프로모터 메틸화 이상을 검사하는 방법 (Goessl, C. et al ., Cancer Res ., 60:5941, 2000)도 시도되고 있다. 하지만, 다수 유전자 이상을 동반하며 개개 암별로 제각기 다양한 변이를 보이는 암을 정확하게 진단하기 위해서는 다수의 유전자를 동시에, 그리고 정확하게 자동분석할 수 있는 방법이 요구되나, 아직 이러한 방법은 정립되어 있지 않다.

이에 최근에는 DNA 메틸화 측정을 통하여 암을 진단하는 방법들이 제시되고 있다. 특정 유전자의 프로모터 CpG 섬이 과메틸화되어 있을 때, 그 유전자의 발현은 차단(gene silencing)되게 된다. 이는 생체 내에서 유전자의 단백질 지정 코딩서열(coding sequence)에 돌연변이(mutation)가 없이도 그 유전자의 기능이 소실되는 주요 기전이며, 인체 암에서 다수의 종양억제 유전자(tumor suppressor genes) 의 기능이 소실되는 원인으로 해석되고 있다. 따라서 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화를 검색하는 것은 암의 연구에 큰 도움이 되며, 이를 메틸화 특이 PCR(이하 MSP라고 함)이나 자동염기분석 등의 방법으로 검사하여 암의 진단과 스크리닝 등에 이용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다.

상당수의 질환은 유전자의 이상에 의해 발생하고, 유전자 이상 중 가장 많은 형태는 유전자의 코딩서열에 변화가 오는 것으로 이러한 유전자 자체의 변화(genetic change)를 돌연변이라고 한다. 어떤 유전자에 돌연변이가 있을 때, 그 유전자가 코딩하는 단백질은 구조와 기능이 바뀌고 장애와 결손을 가져오게 되며, 이러한 돌연변이 단백질은 질병을 유발한다. 그러나 특정 유전자에 돌연변이가 없이도 그 유전자의 발현에 이상이 있으면 질병이 유발될 수 있다. 대표적인 예가 유전자 전사의 조절부위, 즉 프로모터 CpG 섬의 시토신 염기부위에 메틸기가 붙는 메틸화로, 이 경우 그 유전자는 발현이 차단된다. 이와 같은 것을 유전자외 변화(epigenetic change)라고 하며, 이것도 돌연변이와 마찬가지로 자손세포에 전달되며, 동일한 효과, 즉 해당 단백질의 발현 상실을 야기한다. 가장 대표적인 것이 암세포에서 프로모터 CpG 섬의 메틸화에 의해 종양억제 유전자의 발현이 차단되는 것으로, 이는 발암의 중요한 기전이 된다 (Robertson, K.D. et al ., Carcinogensis, 21:461, 2000).

암을 정확히 진단하려면 변이유전자를 파악하는 것뿐만 아니라, 그 유전자의 변이가 나타나는 기전을 파악하는 것이 중요하다. 이전에는 유전자의 코딩서열의 돌연변이, 즉 점 돌연변이나 결실, 삽입 등의 미세변화나 거시적인 염색체 이상에 초점을 맞추어 연구해 왔다. 그러나 최근에는 이들 만큼 유전자외 변화가 중요한 것으로 보고되고 있고, 대표적인 것이 프로모터 CpG 섬의 메틸화이다.

포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 환의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸기가 붙어서 메틸화되어 있다. 이러한 CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열(repetitive sequence)이 발현되지 못하도록 억제하며, 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위이다. 이러한 CpG의 5-mC는 자연히 탈아미노화(deamination)되어 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.

CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있으며, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3kb이고, C 및 G염기의 분포백분율이 50%를 넘으며, CpG의 분포백분율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다. CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자중 약 절반을 차지하는 중요 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다 (Cross, S. et al ., Curr. Opin . Gene Develop ., 5:309, 1995).

한편, 정상인의 체세포(somatic cell)에서는 이들 중요 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에 발현되지 않도록 각인 된(imprinted) 유전자와 비활성화(inactivation)된 X 염색체상의 유전자들은 메틸화되어 있다.

발암과정 중에는 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 나타나며, 그 해당 유전자의 발현에 장애가 나타나게 된다. 특히, 세포주기나 고사를 조절하고, DNA를 복구하며 세포의 부착과 세포간 상호협조 작용에 관여하고, 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들의 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 발생하는 경우, 이는 코딩서열의 돌연변이와 동일하게 이들 유전자의 발현과 기능을 차단하며, 그 결과 암의 발생과 진행이 촉진된다. 그 외에도 노화에 따라 CpG 섬에 부분적으로 메틸화가 나타나기도 한다.

흥미로운 사실은 선천성 암에서는 돌연변이가 발암의 원인이 되나, 후천성암에서는 돌연변이가 나타나지 않는 유전자들의 경우, 돌연변이 대신에 프로모터 CpG 섬의 메틸화가 나타난다는 것이다. 대표적인 예로, 후천성 신장암의 VHL(von Hippel Lindau), 유방암의 BRCA1, 대장암의 MLH1, 위암의 E-CAD와 같은 유전자의 프로모터 메틸화가 있다. 아울러 전체 암 중 약 절반에서 p16의 프로모터 메틸화나 Rb의 돌연변이가 나타나며, 나머지 절반은 p53의 돌연변이나 그 계열로 p73, p14 등의 프로모터 메틸화를 보인다.

중요한 사실은 이러한 프로모터 메틸화에 의한 유전자외 변화가 곧 유전자의 변화, 즉 코딩서열의 돌연변이를 유발하며, 이들 유전자 및 유전자외의 변화가 결합하여 발암이 진행된다는 것이다. MLH1 유전자를 예로 들면, 대장암세포에서 흔히 MLH1 유전자의 한 대립유전자(allele)는 돌연변이나 결실로 인해 기능이 상실되어 있고, 나머지 한 대립유전자는 프로모터 메틸화 때문에 고장이 나있는 경우가 있다. 아울러 프로모터 메틸화 때문에 DNA 복구 유전자인 MLH1의 기능이 상실되면, 이는 곧 다른 중요 유전자에 돌연변이가 일어나는 것을 용이하게 함으로써 발암을 촉진한다.

대부분의 암은 CpG에 관해 3가지 공통된 특징을 보이는데, 이는 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 과메틸화, 나머지 CpG 염기부위의 과소메틸화, 및 메틸화 효소, 즉 DNA 시토신 메틸트랜스퍼라제(DNMT)의 활성증가가 그것이다 (Singal, R. & Ginder, G.D., Blood, 93:4059, 1999; Robertson, K. et al ., Carcinogensis, 21:461, 2000; Malik, K. & Brown, K.W., Brit . J. Cancer, 83:1583, 2000).

프로모터 CpG 섬이 메틸화되어 있을 때, 그 해당 유전자의 발현이 차단되는 이유는 명확히 밝혀져 있지 않으나, 메틸화된 시토신에 메틸 CpG 부착 단백질(MECP)이나 CpG 부착 도메인 단백질(domain protein, MBD), 및 히스톤 디아세틸라제(histone deacetylase)가 부착되면서 염색체의 크로마틴 구조를 바꾸고 히스톤을 변화시키기 때문인 것으로 추측되고 있다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화가 발암을 직접 유발하는지, 또는 이것이 발암에 2차적인 변화인지에 대해 논란이 있으나, 분명한 사실은 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화가 암의 중요한 지표이며, 따라서 이는 암의 진단과 조기진단, 발암위험의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암요법에 대한 반응 예측 등 다방면으로 이용될 수 있다는 것이다. 실제 혈액이나 객담, 침, 대변, 소변 등에서 종양관련 유전자의 프로모터 메틸화를 조사하여 각종 암 진료에 사용하려는 시도가 최근 활발하게 이루어지고 있다 (Esteller, M. et al ., Cancer Res ., 59:67, 1999; Sanchez-Cespedez, M. et al ., Cancer Res ., 60:892, 2000; Ahlquist, D.A. et al ., Gastroenterol., 119:1219, 2000).

프로모터 메틸화를 이용한 암 진단의 정확도를 극대화하고 발암을 단계별로 분석하며, 암과 고령화에 따른 변화를 감별하기 위해서는 프로모터 CpG 섬의 전체 시토신 염기의 메틸화를 모두 정확하게 분석할 수 있는 검사가 필요하다. 현재 이를 위한 표준적 방법은 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법이다. 이는 검체 DNA를 소듐 바이설파이트로 처리한 다음, 표적 유전자의 검사하고자 하는 CpG 섬 전체 부위를 PCR로 증폭한 후, 그 염기서열을 분석하는 것이다. 그러나 이 검사는 한번에 검사할 수 있는 유전자의 수나 검체의 수에 한계가 있으며, 자동화가 어렵고 시간과 비용이 많이 소요되는 단점이 있다.

존스 홉킨스 의대와 MD 엔더슨 암센터, 베를린의대 등에서 암과 관련된 유전자의 프로모터 메틸화에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다. 이렇게 얻어진 기초자료는 DNA Methylation Society(DMS)에서 교류가 이루어지고 있으며, MethDB (http://www.methdb.de)에 자료가 저장되고 있다. 한편, EpiGenX Pharmaceuticals사는 CpG 섬의 메틸화와 관련된 치료제를 개발하고 있고, Epigenomics사는 DNA칩과 MALDI-TOF 등의 기법으로 프로모터 메틸화를 검사하여 암 진단에 응용하려는 연구를 진행 중이다.

프로모터 CpG 섬의 메틸화는 인체의 발생과 분화 등의 생리적 현상이나 노화, 각종 암과 양성질환의 발생과 깊은 연관이 있고, 특히 종양관련 유전자의 프로 모터 CpG 섬의 메틸화는 암의 발생과 진행에 중요한 역할을 하여 암의 지표가 될 수 있다. 그러나, 기존의 방식으로는 수많은 유전자의 CpG 섬 모두를 MSP로 증폭하고, 각각 염기서열 분석법(바이설파이트 게놈 시퀀싱)으로 분석해야 한다는 어려움이 있다. 또한 다수 유전자의 다양한 형태의 프로모터 메틸화 변화를 한꺼번에 정확하고 신속하게 자동분석할 수 있고, 임상에서 각종 암의 진단이나 조기검진, 병기평가 등에 바로 응용될 수 있는 방법은 전무한 상태이다.

새로운 메틸화 관련 암억제 유전자의 스크리닝에 있어서도 많은 연구가 이루어져 왔다. 기존의 방법은, 암 조직과 정상 조직의 지노믹 DNA를 메틸화관련 제한효소로 제한한 후, 만들어진 수많은 DNA 단편을 모두 클로닝하여 암 조직과 정상 조직에서 차이나는 DNA 단편을 선정하고, 시퀀싱하여 스크리닝하는 방법, 또는 CpG 섬을 인식하는 binding column을 사용하는 방법 등이 있다 (Huang, T.H. et al ., Hum. Mol . Genet ., 8:459, 1999; Cross, S.H. et al ., Nat . Genet ., 6:236, 1994). 그러나, 이들 방법은 많은 시간을 필요로 할 뿐만 아니라, 유전자 후보군의 스크리닝 또한 효율적이지 못하며, 실제 임상에 적용하기에 어려움이 있다.

따라서, 본 발명자들은 대장암 특이적 발현감소 유전자 LAMA2 (Laminin merosin alpha 2), FABP4 (Fatty acid binding protein 4), GSTA2 (Glutathione S-transferase A2), STMN2 (Stathmin-like 2), NR4A2 (Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2), DSCR1L1 (Down syndrome critical region gene 1-like 1), A2M (Alpha-2-macroglobulin) 및 SEPP1 (Selenoprotein P, plasma, 1)의 메틸화된 프로모터를 이용한 암 진단용 마이크로어레이 및 암 진단키트에 대한 발명을 하여 출원한 바 있다 (한국특허출원번호 10-2004-0076765). 이를 기초로 본 발명에서는 대장암 특이적 발현감소 유전자 ID3 (Inhibitor of DNA binding 3), RGS2 (Regulator of G-protein signalling 2), WISP2 (WNT1 inducible signaling pathway protein 2), MGLL (Monoglyceride lipase), CPM (Carboxypeptidase M), GABRA1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor), CLU (Clusterin) 및 F2RL1 (Coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1)의 메틸화된 프로모터를 이용하여 암 진단용 마이크로어레이 및 암 진단키트에 대한 연구를 수행하였다.

이에, 본 발명자들은 대장암의 조직과 세포주로부터 특이적으로 발현이 억제되는 유전자(대장암 특이적 발현감소 유전자)의 프로모터를 찾아내고, 이들이 암의 진단에 유용하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 메틸화된 프로모터가 고정되어 있는 암의 조기진단에 유용한 마이크로어레이를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 대장암의 조기진단을 위하여 임상샘플 유래의 샘플 DNA를 증폭하는데 유용한 프라이머 혼합물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 혼합물 및/또는 상기 마이크로어레이를 이용하는 것을 특징으로 하는 암의 조기 진단방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 8종의 대장암 특이적 발현감소 유전자 및 그 프로모터를 찾아내고, 상기 메틸화된 프로모터가 임상적으로 응용이 가능한지를 확인하였다.

결국, 본 발명은 ID3 (Inhibitor of DNA binding 3), RGS2 (Regulator of G-protein signalling 2), WISP2 (WNT1 inducible signaling pathway protein 2), MGLL (Monoglyceride lipase), CPM (Carboxypeptidase M), GABRA1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor), CLU (Clusterin) 및 F2RL1 (Coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1)로 구성된 군에서 선택되는 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 ID3 (Inhibitor of DNA binding 3), RGS2 (Regulator of G-protein signalling 2), WISP2 (WNT1 inducible signaling pathway protein 2), MGLL (Monoglyceride lipase), CPM (Carboxypeptidase M), GABRA1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor), CLU (Clusterin) 및 F2RL1 (Coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1)는 각각 서열번호 1 내지 8의 DNA 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 메틸화된 프로모터는, 적어도 하나의 메틸화된 CpG 디뉴클레오티드를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있 고, 다음으로 구성된 군에서 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다:

(a) SEQ ID NO: 9의 1747 내지 1944 영역;

(b) SEQ ID NO: 10의 1112 내지 1829 영역;

(c) SEQ ID NO: 11의 1668 내지 1782 영역;

(d) SEQ ID NO: 12의 607 내지 1701 영역;

(e) SEQ ID NO: 13의 53 내지 973 영역;

(f) SEQ ID NO: 14의 1663 내지 1787 영역;

(g) SEQ ID NO: 15의 1790 내지 1942 영역; 및

(h) SEQ ID NO: 16의 1488 내지 1945 영역.

보다 바람직하게, 상기 메틸화된 프로모터는 서열번호 9 내지 16으로 표시되는 DNA 서열 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 조성물이 고체 기질상에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 암 진단용 마이크로어레이 및 상기 조성물을 함유하는 암 진단키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 17/18, 서열번호 19/20, 서열번호 21/22, 서열번호 23/24, 서열번호 25/26, 서열번호 27/28, 서열번호 29/30, 및 서열번호 31/32로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 혼합물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 임상샘플에서 샘플 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 샘플 DNA를 (i) 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 변형시키는 시약, 또는 (ii) MspI, HpaII, BssHII, BstUI 및 NotI로 구성된 군에서 선택되는 메틸레이션 민감성(methylation sensitive) 제한효소로 처리하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 처리된 DNA를 ID3 (Inhibitor of DNA binding 3), RGS2 (Regulator of G-protein signalling 2), WISP2 (WNT1 inducible signaling pathway protein 2), MGLL (Monoglyceride lipase), CPM (Carboxypeptidase M), GABRA1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor), CLU (Clusterin) 및 F2RL1 (Coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1)로 구성된 군에서 선택되는 유전자의 프로모터에서 유래된 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머를 사용하여 증폭하는 단계; 및 (d) 상기 (c) 단계에서 증폭된 결과물의 존재 유무를 근거로 프로모터의 메틸화 여부를 결정하는 단계를 포함하는 종양 임상샘플 유래 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 임상샘플은 암 의심환자 또는 진단대상 유래의 조직, 세포, 가래, 대변, 소변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기 또는 혈액인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 메틸화되지 않은 시토신 잔기를 변형시키는 시약은 바이설파이트(bisulfite)인 것을 특징으로 할 수 있다. 바이설파이트(bisulfite)를 이용하여 메틸화되지 않은 시토신 잔기(residue)를 변형시켜 프로모터의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 종래기술에 상세히 기술되어 있다 (WO 01/26536; US 2003/0148326A1).

또한, 상기 증폭은 전형적으로 PCR, DNA microarray 또는 bisulfite sequencing에 의한 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 증폭물의 메틸화 여부는 시퀀 싱(sequencing)에 의해 확인할 수 있으며, 본 발명의 방법에 의해 증폭된 서열은 PCR, 올리고머 제한, ASO(allele-specific oliginucleotide) 프로브 분석(Conner, B.J. et al ., PNAS , 80:278, 1983 Saiki, R.K. et al ., Nature , 324:163, 1986), OLA(oligonucleotide ligation assays) (Landegren, U. et al ., Science , 241:1077, 1988 Landegren, U., Bioessays, 15:761, 1993)과 같은 특정 DNA 서열의 검출방법에 의해 용액에서 또는 고체 지지체에 결합한 후에 평가, 검출, 클로닝 또는 시퀀싱할 수 있다.

선택적으로, 핵산의 메틸레이션 패턴은 제한효소 절단(restriction enzyme digestion) 및 써던블롯(Southern blot) 분석에 의해 확인할 수 있다. 5'CpG 메틸화를 검출할 수 있는 메틸레이션 민감성 제한효소의 예로는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있다. 그 인식부위의 일부로 CG 함유하는 제한효소는 C가 메틸화되는 것을 저해한다. 전형적으로, 메틸레이션 민감성 제한효소는 HpaII, MspI, 또는 BssHII 단독이거나 그 조합이다. 다른 메틸레이션 민감성 제한효소는 당업계에 잘 알려져 있다.

상기 CpG 섬을 증폭할 수 있는 프라이머는 서열번호 17/18, 서열번호 19/20, 서열번호 21/22, 서열번호 23/24, 서열번호 25/26, 서열번호 27/28, 서열번호 29/30, 및 서열번호 31/32로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍을 함유하는 프라이머 혼합물인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 프라이머 혼합물은 서열번호 17 내지 32의 프라이머를 모두 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 프로모터 메틸화 여부를 검출하는 방법에 있어서, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 증폭 결과물을 전기영동하여, mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, HpaII로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하고, HpaII로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 프로모터가 메틸화되지 않은 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한, 상기 (d) 단계는 상기 (c) 단계의 증폭 결과물을 상기 암 진단용 마이크로어레이와 하이브리다이제이션하여, mock DNA와 HpaII로 처리된 DNA에서 모두 하이브리다이제이션된 경우를 프로모터가 메틸화된 것으로 결정하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 '임상샘플'은 암 여부를 진단할 대상 유래의 조직, 세포뿐만 아니라 가래, 대변, 소변, 세포막, 뇌수, 양수, 안구, 장기, 혈액 등을 의미한다. 또 다른 용어 '대장암 특이적 발현감소 유전자'는 대장암에서 특이적으로 발현이 억제되는 유전자를 의미한다. 또 다른 용어 'mock DNA'는 임상샘플로부터 분리된, 아무런 처리를 하지 않은 상태의 샘플 DNA를 의미한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: 대장암 조직에서 메틸레이션에 의하여 발현이 감소하는 유전자군 선별

5개의 대장암 조직샘플과 이와 인접하는 5개의 정상 대장샘플을 사용하여, 대장암 특이적 발현감소 유전자군을 선별하기 위하여, 간접비교방법으로 human 17K cDNA 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

5개의 대장암 조직샘플과 5개의 정상 대장 샘플에서 추출한 total RNA 100㎍을 Cy5-dUTP 형광염료로 labeling하고, 11종의 세포주에서 추출한 total RNA를 혼합한 common reference RNA (한국특허출원번호 10-2003-0058033) 100㎍을 Cy3-dUTP 형광염료로 labeling한 후, human 17K cDNA 마이크로어레이 (GenomicTree, Inc., Korea)에 하이브리다이제이션한 후, 그 발현변화를 분석하였다. ANOVA test (p〈0.05)를 수행하여 대장암 조직에서 이와 인접하는 정상조직에 비하여 발현이 현저하게 감소한 1,312종의 유전자를 선별하였다. 1,312종의 유전자가 그 프로모터 부분의 메틸화에 의한 발현이 조절되는지를 검증하기 위하여, 프로모터 부분의 메틸화 현상을 억제하는 탈메틸화제 (demethylating agent)인 DAC (5'-aza-deoxycytidine)을 처리하였다. 대장암 세포주인 Caco-2와 HCT116을 배양하여, DAC (최종농도 1μM)을 처리하고, 대조군 (약물 비처리 그룹)과 함께, total RNA를 추출하여, human 22K 올리고 마이크로어레이 실험을 수행하였다. 우선, 세포주를 DMEM (10% FBS, 1% penicillin, 1% streptomycin) 배지에 현탁하고, 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 상기 세포주에 DAC (최종농도 1μM)을 처리하고, 대조군 (약물 비처리 그룹)과 함께, total RNA를 추출하여, human 22K 올리고 마이크로어레이 실험을 수행하였다. DAC 단독 처리군의 total RNA 100㎍을 Cy5형광염료로 labeling하고, 그에 상응하는 대조군 100㎍을 Cy3형광염료로 labeling하여, human 22K 올리고칩 (GenomicTree, Inc., Korea)에 혼성화 반응을 수행하였다. 65℃에서 16시간동안 혼성화하고, 세척한 다음, Axon Scanner 400B로 스캔닝하고 GenePixPro 4.0 program으로 각 프로브의 시그널 강도를 측정하였다.

이 실험에서는 메틸화에 의해 발현 억제되는 유전자는 위와 같은 실험에 의해 프로모터 메틸화 현상이 없어져 다시 발현될 것으로 예상하였다. 상기 실험 결과, 280종 유전자의 발현은 대조군에 비해, 메틸화 저해제를 처리한 세포주에서 1.5배 이상 증가하였다 (도 1). 280종의 유전자 중 대장암조직에서 정상조직에 비하여 발현이 감소하는 43종의 유전자를 대장암에서 프로모터의 메틸화에 의해 발현이 감소하는 유전자 후보군으로 선별하였다. 43종의 유전자를 대상으로 프로모터 부위에 CpG 섬의 존재 유무를 MethPrimer 프로그램을 이용하여 조사한 결과 33종의 유전자의 프로모터에 CpG섬이 존재한다는 것을 확인하였다.

실시예 2: 20종 유전자의 대장암세포주에서의 메틸화 검증

상기 실시예 1의 방법에 의하여 배양된 2종의 대장암 세포주로부터 genomic DNA을 추출하여, 400ng의 DNA를 각각 20U의 HpaII 및 40U의 MspI으로 처리하였다. 상기 제한효소로 처리된 DNA를 정제한 다음, 제한효소로 처리되지 않은 샘플 DNA(mock DNA)와 함께, 표 1의 프라이머를 이용하여 33종의 유전자에 대하여 PCR [(94℃ 1 min → 66℃ 1 min → 72℃ 1 min) 30 cycle]을 수행하였다.

상기 각각의 PCR 결과물을 전기영동하여 프로모터의 메틸화 여부를 검증하였다. 프로모터가 메틸화되어 있는 유전자는 HpaII로 절단되지 않으므로, PCR 결과가 나오게 되며, 프로모터가 메틸화되지 않은 유전자는 HpaII로 절단되기 때문에 PCR이 되지 않는다. HpaII 제한효소의 활성이 메틸화된 프로모터에 의해 억제되는지 여부를 검증하기 위해, MspI 제한효소를 사용하였다. MspI은 메틸화에 관계없이 HpaII 제한효소가 인식하는 염기서열과 동일한 염기서열을 인식하여 절단하므로, HpaII 제한효소의 메틸화 특이적 절단반응을 검증할 수 있다.

상기 증폭된 PCR 결과물을 전기영동하여, HpaII로 처리된 샘플에서는 PCR 결과물이 있는 것을 메틸화된 것으로 결정하여 흑색 block으로 표시하고, 메틸화되지 않아 HpaII로 처리된 샘플에서 PCR 결과물이 보이지 않은 경우를 회색 block으로 나타냈다 (도 2). 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 선별된 15종 유전자의 프로모터는 2종의 대장암 세포주 중 최소 1종에서 메틸화되어 있다는 것을 확인하였으며, 8종 유전자의 프로모터 메틸화 여부를 다른 방법으로 확인하기 위하여 상기 8개 유전자의 프로모터를 대상으로 바이설파이트 시퀀싱 (bisulfite sequencing)방법으로도 확인하였다. DNA에 바이설파이트를 처리하면 메틸화되지 않은 씨토신은 우라실로 변하고, 메틸화된 씨토신은 변하지 않는다. 대장암 세포주 HCT116의 게놈 DNA 1㎍을 MSP 바이설파이트 변형키트(In2Gen, Inc., 한국)를 사용하여 바이설파이트 변형(Sato, N. et al ., Cancer Research, 63:3735, 2003)을 실시하였다. 바이설파이트 처리된 HCT116 게놈 DNA를 서열번호 25/26, 29/30 및 31/32의 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭한 다음, PCR 산물의 염기서열을 분석한 결과, 개 유전 자(NR4A2, A2M 및 SEPP1) 프로모터의 염기서열 중 CpG 섬을 포함하는 부분에서 모두 씨토신이 검출되어, 상기 8개 유전자 (ID3 (Inhibitor of DNA binding 3), RGS2 (Regulator of G-protein signalling 2), WISP2 (WNT1 inducible signaling pathway protein 2), MGLL (Monoglyceride lipase), CPM (Carboxypeptidase M), GABRA1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor), CLU (Clusterin) 및 F2RL1 (Coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1)의 프로모터가 모두 메틸화되어 있다는 것을 확인할 수 있었다.

선별된 15종의 유전자의 프로모터가 대장 정상조직에서 메틸화되어 있는지 여부를 검증하기 위하여 3종의 대장 정상조직 DNA (Biochain 사)를 대상으로 메틸화 여부를 확인한 결과, 총 8종의 유전자의 프로모터는 대장 정상조직에서 전혀 메틸화되지 않았음을 확인하였다 (도 4). 도 4는 선별된 15종의 유전자 발현이 탈메틸화제에 의하여 2종의 대장암 세포주 중 최소 1종 이상에서 발현이 1.5배 이상 증가하는 것을 나타낸 것이다.

실시예 3: 8종 유전자의 대장암 진단용 바이오마커 검증실험

본 발명에서 선별된 8종 유전자에 대한 메틸화 프로모터의 임상 적용가능성을 확인하기 위해, 동일환자의 대장암 조직샘플과 이와 안접한 정상조직 DNA를 대상으로 상기 실시예 2와 같은 방법으로 메틸화 여부를 검증하였다.

도 5 및 표 2에 나타난 바와 같이, 대부분의 대장암 조직에서는 8종의 유전자 프로모터가 높은 빈도로 메틸화되어 있는 것을 확인하였다.

유전자명	서열번호	기능
ID3	1	inhibitor of DNA binding 3, dominant negative helix-loop-helix protein
RGS2	2	regulator of G-protein singalling 2, 24kDa
WISP2	3	WNT1 inducible signaling pathway protein 2
MGLL	4	monoglycerine lipase
CPM	5	carboxypeptidase M 12q14.3
GABRA1	6	gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor, alpha 1
CLU	7	clusterin (complement lysis inhibitor, SP-40, 40, sulfated glycoprotein 2, testosterone-repressed prostate message 2, apolipoprotein J)
F2RL1	8	coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1

실시예 4: 8종 유전자 프로모터의 암조기진단 마커로서의 유용성 검증 실험

본 발명에서 선별된 8종의 유전자에 대한 조기진단용 바이오마커로서의 유용성을 검증하기 위하여 대장암 조직과 인접하는 정상조직을 대상으로 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 메틸화 여부를 확인하였다. 그 결과 이들 8종의 유전자의 프로모터들은 암 조직과 인접하는 조직에서도 메틸화되는 것을 확인하였다 (표 2).

이들 8종의 유전자들은 대장암 환자가 아닌 정상인의 DNA에서는 메틸화가 전혀 되어 있지 않고, 대장암 조직과 인접하는 정상조직에서는 프로모터가 메틸화되어 있다는 것은 대장암 발생의 초기부터 메틸화가 진행된다는 것을 의미함으로 조기진단에 매우 유용하다는 것을 보여주고 있다.

8종의 대장암 진단용 메틸레이션 바이오마커의 정상 대장조직, 대장암 조직과 인접하는 조직 및 대장암 조직에서의 메틸화 빈도

바이오마커	메틸화 빈도 (%)
바이오마커	대장 정상조직	대장암 조직과 인접하는 정상조직	대장암 조직
ID3	0	20	20
RGS2	0	7.5	7.5
WISP2	0	52.5	52.5
MGLL	0	25	42.5
CPM	0	50	52.5
GABRA1	0	22.5	57.5
CLU	0	52.5	55
F2RL1	0	25	32.5

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에서는 8종의 대장암 특이적 발현감소 유전자 및 그 프로모터를 찾아내고, 이들이 여러 임상샘플에 광범위하게 적용되는 암 진단 바이오마커(biomarker)로서의 기능을 가진다는 것을 밝혀냈다. 본 발명에 따른 대장암 특이적 발현감소 유전자의 메틸화된 프로모터를 함유하는 암 진단용 조성물은 암 환자의 조기진단뿐 아니라 예후 예측을 통하여 결국 암의 완치율 향상에 기여할 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> GENOMICTREE <120> METHYLATED PROMOTERS OF COLON CANCER SPECIFIC EXPRESSION-DECREASED GENES AND USE THEREOF <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1830 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gatctggggt gctgccagga aaaagcaaat tctggaagtt aatggttttg agtgattttt 60 aaatccttgc tggcggagag gcccgcctct ccccggtatc agcgcttcct cattctttga 120 atccgcggct ccgcggtctt cggcgtcaga ccagccggag gaagcctgtt tgcaatttaa 180 gcgggctgtg aacgcccagg gccggcgggg gcagggccga ggcgggccat tttgaataaa 240 gaggcgtgcc ttccaggcag gctctataag tgaccgccgc ggcgagcgtg cgcgcgttgc 300 aggtcactgt agcgggactt cttttggttt tctttctctt tggggcacct ctggactcac 360 tccccagcat gaaggcgctg agcccggtgc gcggctgcta cgaggcggtg tgctgcctgt 420 cggaacgcag tctggccatc gcccggggcc gagggaaggg cccggcagct gaggagccgc 480 tgagcttgct ggacgacatg aaccactgct actcccgcct gcgggaactg gtacccggag 540 tcccgagagg cactcagctt agccaggtgg aaatcctaca gcgcgtcatc gactacattc 600 tcgacctgca ggtagtcctg gccgagccag cccctggacc ccctgatggc ccccaccttc 660 ccatccaggt aagcctcgaa 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대장암 마커 유전자인 RGS2 (Regulator of G-protein signalling 2), WISP2 (WNT1 inducible signaling pathway protein 2), MGLL (Monoglyceride lipase), CPM (Carboxypeptidase M), GABRA1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor), CLU (Clusterin) 및 F2RL1 (Coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1)의 프로모터의 CpG 섬을 증폭하기 위한 프라이머들 및 비메틸화 핵산을 민감하게 절단하는 제한효소를 함유하는 대장암 진단용 키트.
대장암 마커 유전자인 RGS2 (Regulator of G-protein signalling 2), WISP2 (WNT1 inducible signaling pathway protein 2), MGLL (Monoglyceride lipase), CPM (Carboxypeptidase M), GABRA1 (Gamma-aminobutyric acid (GABA) A receptor), CLU (Clusterin) 및 F2RL1 (Coagulation factor Ⅱ (thrombin) receptor-like 1)의 프로모터의 CpG 섬과 하이브리다이제이션할 수 있는 프로브들을 포함하는 대장암 진단용 핵산 칩.
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