KR100888481B1 - 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자 및 이를함유하는 재조합 벡터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자 및 이를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 본 발명은 플라스틱 가소제로 사용하는 프탈레이트류의 생물학적 분해에 이용되는 백색 부후균, 겨울우산버섯의 리그닌 분해 관여 효소인 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자의 유전적 기능을 규명함으로써, 백색 부후균을 포함한 진균류의 목질 분해의 유전적 메카니즘을 이해할 수 있게 한다. 또한, 본 발명은 상기 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자에 의한 리그닌 분해 기능성이 강화된 식용버섯을 포함한 진균류의 생산 및 이용에 기여할 수 있다.
겨울우산버섯, 망간에이즈 퍼옥시다아제
Description
본 발명은 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자 및 이를 함유하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 플라스틱 가소제로 사용하는 프탈레이트류의 생물학적 분해에 이용된 백색 부후균인 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)의 리그닌 분해 효소 유전자의 분리 및 발현 특성을 조사하고 형질전환 기술을 확립하고, 이를 이용하여 환경호르몬을 포함한 목질 내 고분자 물질의 분해 기능이 확대된 백색부후균의 형질전환체를 얻는 것에 관한 것이다.
내분비계 장애물질(Endocrine Disruptor)은 환경 중 배출된 화학물질이 체내에 유입되어 마치 호르몬처럼 작용하여 생태계 및 인간의 생식기능 저하, 기형, 성장장애, 암 등을 유발하여 오존층 파괴, 지구 온난화 문제와 함께 세계 3대 환경문제로 등장하였다. 내분비계 장애물질은 일반적으로 물질의 종류에 따라 저해호르몬 의 종류 및 저해방법이 각각 다르다.
환경호르몬으로 작용하여 인체에 영향을 미치는 프탈레이트류는 백색부후균인 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)에 의해 분해될 수 있다. 리그닌분해효소인 망간에이즈 퍼옥시다아제(Manganese peroxidase)는 대부분 백색부후균에서 발견되고 있다. 이러한 장점으로 인해 리그닌을 포함하여 여러 방향족 고분자 화합물을 분해시켜 저분자화 한다.
그러나 리그닌분해효소의 유전자적 특성에 관해서는 널이 알려진 바 없다. 특히 목질 내의 리그닌 분해력이 우수한 것으로 알려진 판막버섯(Phanerochate chrysosporium), 구름버섯(Trametes versicolor)의 리그닌 분해효소 라카아제, Mn-peroxidase(mnp1-mnp3), Lignin-peroxidase(lipA -lipJ, LPGI-LPGIV) 유전자를 이용하여 Aspergillus nidulans로부터 분리한 α-amylase 프로모터 조절에 의해 열적으로 안정하고 생물학적 복구법에 이용될 수 있도록 그 기능을 강화한 형질 전환 기술은 활발히 진행되고 있다.
리그닌 분해효소를 사용할 경우에는 소량의 화합물로 적은 에너지를 사용하여 고효율의 리그닌을 처리할 수 있고 환경오염물의 방출도 줄일 수 있는 장점을 가지고 있다. 또한, 리그닌 분해효소는 다양한 종류의 자연계에 존재하며 인체에 유해하거나 환경에 해를 끼치는 방향족 화합물을 분해할 수 있어 환경보전의 측면에서 매우 중요한 관심을 끌고 있다(Field, J. F., et al., Trend in Biotechnol. 1993, 11, 44-49).
백색부후균의 경우는 각종 화합물에 대하여 비특이적으로 작용할 수 있는 기 작을 보유하여 다양한 난분해성 화합물을 분해할 수 있으며, 분해과정이 세포외에서 이루어지기 때문에 고농도의 독성화합물과 불용성 화합물의 처리가 가능하고 현장적용에 있어서도 생장조건의 특이성으로 선택적인 성장을 보이므로 다른 미생물의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 이러한 특징 때문에 백색부후균은 생물학적 환경정화에 유용하게 사용될 수 있으며, 이를 적용하기 위해서는 우수한 균주를 선별하는 기술, 백색부후균의 균사체를 대량으로 배양하는 기술, 리그닌분해효소를 효소활성이 높게 생산하는 기술 등이 필요하다.
본 발명의 목적은 플라스틱 가소제로 사용하는 프탈레이트류의 생물학적 분해에 이용되는 백색 부후균인 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 겨울우산버섯(Polyporus brumalis) 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 효소를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 함유하는 형질전환체를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 백색부후균에 도 입하여 환경호르몬을 포함한 목질 내 고분자 물질의 분해 기능이 확대된 백색부후균의 형질전환체를 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 겨울우산버섯(Polyporus brumalis) 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자를 제공한다.
본 발명은 상기 유전자가 코딩하는 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산서열로 이루어진 겨울우산버섯(Polyporus brumalis) 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 효소를 제공한다.
본 발명은 상기 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 상기 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli)을 제공한다.
본 발명은 상기 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 리그닌 분해 기능성이 강화된 겨울우산버섯을 제공한다.
본 발명은 플라스틱 가소제로 사용하는 프탈레이트류의 생물학적 분해에 이용되는 백색 부후균인 겨울우산버섯의 리그닌 분해 관여 효소인 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자의 유전적 기능을 규명함으로써, 백색 부후균을 포함한 진균류의 목질 분해의 유전적 메카니즘을 이해할 수 있게 한다. 또한, 본 발명은 상기 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자에 의한 리그닌 분해 기능성이 강화된 식용버섯을 포함한 진균류의 생산 및 이용에 기여할 수 있다.
본 발명은 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 겨울우산버섯(Polyporus brumalis) 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자를 나타낸다.
본 발명은 상기에서 언급한 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 포함한다.
본 발명은 상기에서 언급한 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli)을 포함한다.
본 발명은 상기에서 언급한 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 리그닌 분해 기능성이 강화된 겨울우산버섯을 포함한다.
본 발명은 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 겨울우산버섯(Polyporus brumalis) 망 간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 효소를 포함한다.
본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명을 위하여 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase: MnP) 분해 효소에 의해 자연계에 존재하는 방향족 화합물을 분해 가능한 여러 백색부후균을 이용하여 플라스틱 가소제인 프탈레이트류에 대한 저항성 및 분해능을 조사한 결과 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)이 우수한 분해능을 보였고 그 분해산물의 에스트로겐성 저감효과도 뛰어난 것으로 나타났다. 이러한 백색부후균의 리그닌 분해력과 환경 정화의 기능이 강화된 백색 부후균 리그닌 분해 효소의 유전자적 기능을 구명하는 것이 필요하였고 이를 바탕으로 백색 부후균의 리그닌 분해 효소 유전자를 분리하고 기능성이 강화된 형질전환 백색 부후균을 얻기 위하여 리그닌 분해 효소 유전자의 발현 유도 및 검정을 하였다.
본 발명은 환경호르몬에 오염된 토양, 수질 및 생물분해 반응기에서의 생물학적 분해 및 복구법에 이용되는 백색부후균인 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)의 리그닌 분해효소 유전자를 분리하고 발현 특성을 조사하였다. 이를 위하여 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)의 리그닌 분해효소 중 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase: MnP) 유전자를 분리하여 유전자(full gene)를 확보하였고 환경호르몬 분해 시 나타나는 발현 특성을 조사하였다.
본 발명은 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase)의 유전자(full gene)를 확보하기 위하여 겨울우산버섯을 SSC 배지에서 배양한 후 회수하여 갈고 트리졸(Trizol: invitrogen)을 사용하여 전체 RNA(total RNA)를 분리할 수 있다.
상기 total RNA로부터 cDNA의 합성은 total RNA를 주형(template)으로 하고, cDNA를 합성 키트로 Cap Fishing Full-length cDNA Premix Kit (Seegene) 또는 BD Rapid cDNA Amplified Ends (RACE) kit (Clontech)을 사용하여 cDNA를 합성할 수 있다.
상기 cDNA로부터 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase)의 PCR 산물을 얻을 수 있으며, 상기 PCR 산물을 pGEM-T Vector system1 kit 또는 TOPO-TA kit를 사용하여 벡터(vector)에 클로닝 하는 것이 바람직하다.
본 발명은 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자의 염기서열을 분석하여 Pbmnp1 (서열 1), Pbmnp2 (서열 2), Pbmnp3 (서열 3), Pbmnp4 (서열 4), Pbmnp5 (서열 5) 및 Pbmnp6 (서열 6)로 명명하였다.
본 발명은 상기 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자 중에서 선택된 어느 하나를 함유하는 재조합 벡터를 제조할 수 있다.
본 발명은 상기 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 함유하는 형질전환체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 리그닌 분해 기능성이 강화된 겨울우산버섯을 제조할 수 있다.
환경호르몬으로 작용하여 인체에 영향을 미치는 프탈레이트류가 백색부후균인 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)에 의해 분해될 수 있으며, 난분해성 위해물 질이 가지는 특징 중의 하나인 에스트로겐성을 저감시킨다.
따라서 본 발명은 플라스틱 가소제로 사용하는 프탈레이트류의 생물학적 분해에 이용되는 백색 부후균인 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 제공하고, 본 발명은 백색 부후균의 리그닌 분해 관여 효소의 유전적 기능을 구명함으로써 백색 부후균을 포함한 진균류의 목질 분해의 유전적 메카니즘을 이해하여 선발 유전자에 의한 기능성이 강화된 식용버섯을 포함한 진균류의 생산 및 이용에 기여할 수 있다고 사료된다.
이하 본 발명을 다음 실시 예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 위해 제안된 것으로서 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 균주 및 배양
백색부후균의 리그닌분해효소 유전자를 분리하기 위하여 공시균주로는 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)으로 하고, 리그닌분해효소 활성을 증가시키기 위해 본래의 박층고정상(SSC;Shallow stationary culture) 배지를 약간 변화시켜 사용하였다.
본 발명에서 사용된 액체배지 1L에 글루코오스(glucose) 10g, (NH4)2C4H4O6 0.5g, 티아민(Thiamine)-HCl 0.5㎎, KH2PO4 0.5g, MgSO4·7H2O 0.5g, Ca(H2PO4)2 0.5g, 그리고 소량의 무기질 혼합물(MgSO4 3g, NaCl 1g, MnSO4 0.5g, FeSO4·7H2O 0.1g, CoCl2 0.1g, ZnSO4·7H2O 0.1g, CuSO4 0.1g, AlK(SO4)2·12H2O 10㎎, 니트릴로아세틱에시드(nitriloacetic acid) 1.5g을 1L의 증류수에 (0.2㎛ 여과지를 이용하여 여과 후 배지에 첨가) 첨가하였으며, pH는 4.5로 조정하였다. 접종은 PDA 배지에서 7일간 선 배양된 균을 대상으로 8㎜ 직경의 플러그(plug)를 제조한 후 배지 20㎖ 당 1 개의 플러그(plug)를 접종하였으며 25℃에서 10일간 진탕배양을 수행하였다.
<실시예 2> 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자 분리
겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase)의 유전자(full gene)를 확보하기 위하여 겨울우산버섯을 SSC 배지에서 배양한 후 회수하여 갈고 트리졸(Trizol: invitrogen)을 사용하여 전체 RNA(total RNA)를 분리하였다. cDNA를 합성을 하기 위해 전체 RNA 4㎍을 주형(template)으로 Cap Fishing Full-length cDNA Premix Kit (Seegene)을 사용하여 cDNA를 합성하였다.
한편, 5'-, 3'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)를 수행하기 위하여 각 유전자의 디제너레이트 프라이머(degenerate primer)를 사용하여 확보된 부분 염기서열을 바탕으로 엑손(exon) 부분에서 특이 프라이머(specific primer)를 제작(표 1)하여 UPM 프라이머와 NUP 프라이머와 함께 RACE PCR (1 단계, 25 사이클; 94℃, 30초; 프라이머 어닐링 온도, 30 초; 72℃, 3분)을 수행하였다.
디제너레이트 프라이머(degenerate primer):
- Forward primer
· F2 : CACGACGCCATCGSCATCTC
· F3 : CTYCGCCTSACMTTCCACGAC
- Reverse primer
· R2 : TCGGACTGSAGSCGCAKCTC
· R6 : BGGRGTKGAGTCGAARGGMGT
· R10 : GTCGATGACGGGGAAGAGCG
UPM 프라이머:
CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT+CTAATACGACTCACTATAGGGC
NUP 프라이머:
AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT
<실시예 3> 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자 클로닝
실시예 2에서 분리한 퍼옥시다아제(peroxidase)의 PCR 산물을 pGEM-T Vector system1 kit를 사용하여 벡터에 연결한 후 E. coli에 삽입하였다. 이렇게 확보된 부분 염기서열들을 조합하여 전체길이의 염기서열을 구성하였고 이를 바탕으로 단백질이 만들어지는 코딩 염기서열 (ORF) 부분을 포함해서 다시 프라이머를 제작하 여 PCR (표 2; 3 단계, 29 사이클; 1 단계: 94℃, 2분, 2 단계: 94℃, 30초/ 60℃, 30초/ 72℃, 3분, 1 사이클, 3 단계: 72℃, 10분)을 통해 전체 길이의 cDNA(full length cDNA)를 확보하였다.
<표 1> RACE 프라이머
Clone | RACE | Primer | Annealing Temp. | PCR size | Primer sequence |
pbmnp2 | 5' | pbmnp1-r1 | 70.8 | 521 | GAAGGCTATTACACGTACCGAAAGG |
pbmnp1-r2 | 74.4 | 422 | CTTGAACTCGAGCTGAGGTGCACC | ||
3' | pbmnp1-f1 | 77.8 | 771 | ACGCAAATGGAGGCACCGACGAG | |
pbmnp1-f2 | 70.2 | 749 | GATCGTCGCGTTGCAGAAGCCC | ||
pbmnp3 | 5' | pbmnp2-r3 | 75.4 | 396 | GTGAGGTTGTGGCGCTGGATGA |
pbmnp2-r2 | 74.5 | 334 | CGCGTGGAAGTTGGTCTCGATG | ||
pbmnp4 | 5' | pbmnp4-r2 | 70.7 | 347 | CGTTGTTCGCCGATGATCTCA |
pbmnp4-r1 | 71.5 | 329 | CGTGGAAGTTAGTCTCGATGTCGTC | ||
pbmnp5 | 5' | pbmnp7-r2 | 77.5 | 444 | AGGGCACTGAGCGAGCGCGA |
pbmnp7-r3 | 74.9 | 400 | CGGCCGAGATGTTGTGCTTGG | ||
3' | pbmnp7-f4 | 73.8 | 768 | GAGATCGTCGCGTTGCAGAAGC | |
pbmnp7-f2 | 74.9 | 737 | TCGCGCTCGCTCAGTGCCCT | ||
pbmnp7-f3 | 77.5 | 692 | CCAAGCACAACATCTCGGCCG | ||
pbmnp6 | 5' | pbmnp9-r1 | 66 | 588 | GGCGAGGAGGGCGACA |
pbmnp9-r3 | 69 | 354 | ATGATCTCATCGACACCAAGGTTC | ||
3' | pbmnp9-f2 | 69 | 426 | GAACCTTGGTGTCGATGAGATCAT | |
pbmnp9-f4 | 72.5 | 360 | CTTGCTGGTGCGATCGGTGTC | ||
pbmnp9-f5 | 73.2 | 309 | GTCTTTGTCGGCCGTCAGGATG |
<표 2> Full length cDNA를 위한 PCR 프라이머
Clone | Primer | Full length(ORF) |
pbmnp1 | pbmnp1-RT-f1(CGGACTCTACGGACATGG) /pbmnp1-RT-r2(CGAGTGTACAACGTGATCATG) | 1269(1098) bp |
pbmnp2 | fpbmnp2-f(CAATAGGTCAACGGTCATG) /pbmnp2-RT-r(ACTACAACCTATGTGCTGTTCTG) | 1274(1083) bp |
pbmnp3 | fpbmnp3-f(CACTTCATCTCCTCTTCGG) /pbmnp3-UTR-r(ACTGACAATCTGACTCTCTACGA) | 1410(1095) bp |
pbmnp4 | fpbmnp4-f-1(CGGAATGCCTCAAACACCCAG) /fpbmnp4-r(TCCAGTCTGAGCAGCACCGC) | 1394(1314) bp |
pbmnp5 | fpbmnp5-f(GAGGAACGCATCACCGACAACAG) /fpbmnp5-r(GTTCACCGAGCTGGCTAGCGAG) | 1471(1098) bp |
pbmnp6 | fpbmnp6-f-1(CAGCTGTTCATCTCCTTCTCGG) /fpbmnp6-r(GCGCCAACAAGTCTAGTCGGTG) | 1.3kb(1095) bp |
SSC 배지에서 배양한 겨울우산버섯(Polyporus brumalis)으로부터 6개의 새로운 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase: MnP) 유전자를 분리하였다(도 1). 분리한 유전자를 Pbmnp1 (서열 1), Pbmnp2 (서열 2), Pbmnp3 (서열 3), Pbmnp4 (서열 4), Pbmnp5 (서열 5) 및 Pbmnp6 (서열 6)으로 명명하고 각각 전체 유전자(full gene)의 염기서열을 결정하였다. 도 2는 상기 유전자가 코딩하는 각각의 아미노산 서열(서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12)을 비교하여 나타낸 것이다. 각각의 MnP 유전자는 각각 51-89% 유사성을 가졌는데 전체 길이는 1,250-1,500bp로 ORF (Open Reading Frame) 부분의 아미노산 서열이 360 aa 정도이고 분자량은 보통의 MnP가 가지는 특성인 38-39 KDa에 포함되었다(표 3). 그러나 UTR (Untranslated Region) 부분의 크기가 매우 달라 발현과 활성에서 다른 특성을 가질 것으로 예상되었다.
<표 3> 겨울우산버섯 MnP 유전자의 특성
Clone | Full length(nt) | ORF(aa) | 5'UTR(nt) | 3'UTR(nt) | Mw. | pl |
pbmnp1 | 1,269bp | 365 aa | 17 bp | 154 bp | 38.92 kDa | 4.26 |
pbmnp2 | 1,274bp | 360 aa | 90 bp | 101 bp | 38.48 kDa | 4.84 |
pbmnp3 | 1,410bp | 363 aa | 95 bp | 167 bp | 38.02 kDa | 4.25 |
pbmnp4 | 1,394bp | 364 aa | 545 bp | 152 bp | 38.10 kDa | 4.25 |
pbmnp5 | 1,471bp | 365 aa | 211 bp | 193 bp | 39.03 kDa | 4.54 |
pbmnp6 | 1,300bp | 364 aa | 77 bp | 128 bp | 37.99 kDa | 4.07 |
<실시예 4> 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자의 발현분석
겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자의 발현 분석을 위하여, 겨울우산버섯 균체를 SSC 액체배지 (glucose 1.5 %, ammonium tartrate 0.1 %, pH 4.5, 25℃) 1L에서 5일간 배양하여, 균체를 블렌딩(blending) 한 후 블렌딩한 균사체 500㎖를 새 SSC 배지 500㎖에 계대하였다. 계대 후 5일에 DBP(dibutyl phthalate)를 100uM, 300uM의 농도로 각각 첨가한 다음 9일 후, 15일 후에 균사체를 40㎖씩 회수하였다. 트리졸(Trizol: Invitrogen)을 사용하여 회수한 균사체로부터 total RNA를 분리한 다음 역전사 효소 (Reverse Transcriptase: Promega)를 이용하여 cDNA를 만든 후 표 4와 같은 조건으로 PCR하였다.
<표 4> 발현량 분석에 사용된 프라이머
Clone | Forward | Reverse | Temp. (℃) | Cycles |
pbmnp1 | pbmnp1-UTR-f2 | pbmnp1-UTR-r1 | 62 | 40 |
CGTTCCCAATGCATGATC AC | TACACCGTCCGCCACAAC | |||
pbmnp2 | pbmnp2-UTR-f | pbmnp2-UTR-r | 55 | 40 |
TGACCAACGATGACCTTC | GTGTAAGTCGCCTTTTTCAG | |||
pbmnp3 | pbmnp3-UTR-f | pbmnp3-UTR-r | 55 | 40 |
GTGTCAGACCGTGAAGCG | ACTGACAATCTGACTCTCTACGA | |||
pbmnp4 | pbmnp4-f1 | pbmnp4-UTR-r1 | 55 | 40 |
CTCGCTCGTGACGACTCTCG | ACATAATCTCAATGATAGACCAG | |||
pbmnp5 | pbmnp5-UTR-f1 | pbmnp5-UTR-r1 | 55 | 40 |
AACCTATAAGCCGTTCACC | TTCGCTGTAGGGAACAT | |||
pbmnp6 | pbmnp6-UTR-f | pbmnp6-UTR-r | 55 | 40 |
TCCTTCCTAAATATTCACCG | GTTGGATACGGGTTTACTCA |
배지 내 효소 활성 변화를 확인하기 위해, 1일부터 20일 동안 배양시킨 각각의 시료에 대해 Whatmann No. 2 여과지를 사용하여 감압 상태에서 여과를 수행하였으며, 이를 조추출액으로 이용하였다. 배지 내 단백질량은 브래드포드 분석(bradford assay) 방법(Bradford, 1976)을 이용하였으며, 리그닌 분해효소로 MnP(manganese-dependent peroxidase)와 라카아제(laccase)의 역가의 활성을 다음과 같은 방법으로 측정하였다. MnP 역가는 ABTS(2,2'-Azino-bis(3- ethylbenzthiazoline -6-sulfonic acid))(0.08 g/ℓ)를 기질로 사용하여 H2O2 (0.1 mM), MnSO4 (0.2 mM) 및 0.2M citrate buffer (pH 4.5) 용액을 이용하여 측정하였으며 조효소액을 제일 나중에 첨가하여 측정을 하였고 ABTS를 기준으로 ∑414= 36,000 M-1㎝-1을 적용하여 계산하였다.
겨울우산버섯의 최소배지 배양 시 DBP (Dibutylphthalate) 100μM, 300μM을 각각 더하고 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase)의 활성변화 및 발현을 분석한 결과 배양 9일 째 MnP 활성이 발현증가를 보였다. 특히 pbmnp2, pbmnp4 유전자가 강하게 유도되어 환경호르몬 분해에 매우 강하게 발현되는 유전자로 특징지을 수 있었다(도 3a).
내분비장애물질 분해에 대한 겨울우산버섯의 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase)의 활성은 DBP(Dibutylphthalate) 무처리(control), 100μM, 300μM을 각각 더하고 측정한 결과 DBP 첨가 시 활성이 무첨가(control) 시보다 더 높음을 알 수 있었고 배양 14일(DBP 첨가 후 9일)에는 100μM 농도에서, 배양 20일(DBP 첨가 후 15일)에는 300μM 농도에서 각각 활성이 높은 것으로 나타났다(도 3b).
<실시예 5> 서던 블럿(Southern blot)
서던 블럿(Southern blot)에 의해 망간에이즈 퍼옥시다아제(MnP) 유전자인지 여부를 확인하기 위하여 상기 실시예 3에서 분리한 6개의 MnP 유전자를 주 형(template)으로 하여 3-UTR(untranslational region)에 특이적인 프라이머(표 5)를 각각 제작하여 PCR (3 단계, 29 사이클; 1 단계: 94℃, 2분, 2 단계: 사이클, 94℃, 30초/ 프라이머 어닐링 온도, 30초/ 72℃, 30초, 3 단계: 72℃, 10분)로 각 유전자들의 UTR을 증폭하고 TOPO-TA Kit를 사용하여 염기서열을 확인한 후 UTR 부분만 EcoR I 제한효소로 절단하여 약 100ng의 프로브(probe)용 DNA를 확보하였다. 이것을 95℃에서 5 분간 가열하여 단일가닥으로 변성시킨 후 동위원소 32P를 첨가하고 레이블 키트(ladderman labeling Kit: TAKARA)를 이용하여 37℃에서 20분간 반응시켜 32P가 표지된 프로브(probe)를 제작하였다.
<표 5> 프로브(Probe) 제작에 사용된 프라이머
Clone | Primer | Size | Annealing temp. |
pbmnp1 | pbmnp1-UTR-f2(CGTTCCCAATGCATGATCAC) /pbmnp1-UTR-r1(TACACCGTCCGCCACAAC) | 152bp | 62℃ |
pbmnp2 | pbmnp2-UTR-f(TGACCAACGATGACCTTC) /pbmnp2-UTR-r(GTGTAAGTCGCCTTTTTCAG) | 101bp | 55℃ |
pbmnp3 | pbmnp3-UTR-f(GTGTCAGACCGTGAAGCG) /pbmnp3-UTR-r(ACTGACAATCTGACTCTCTACGA) | 138bp | 55℃ |
pbmnp4 | pbmnp4-UTR-f1(TAAAGTGTCGCGGTGCTG) /pbmnp4-UTR-r1(ACATAATCTCAATGATAGACCAG) | 401bp | 55℃ |
pbmnp5 | pbmnp5-UTR-f1(AACCTATAAGCCGTTCACC) /pbmnp5-UTR-r1(TTCAAAGCTGTAGGGAACAT) | 144bp | 55℃ |
pbmnp6 | pbmnp6-UTR-f(TCCTTCCTAAATATTCACCG) /pbmnp6-UTR-r(GTTGGATACGGGTTTACTCA) | 100bp | 55℃ |
겨울우산버섯의 게놈 DNA(genomic DNA)는 회수된 균사체로부터 세틸트리메틸암모니움브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide: CTAB)를 이용한 방법에 의해 분리하였다. 분리한 게놈 DNA를 4개의 마이크로 튜브에 25㎍씩 분취하여 4 종의 제한효소 (Xho I, BamH I, EcoR V, Pst I) 50 unit 으로 24시간 동안 37℃에 반응시 켜 절단한 후, 0.8 % 아가로스 겔 상에서 3시간 도안 80 V로 전기영동 하여 게놈 DNA 절편들을 전개시켰다. 전기영동 겔을 250 mM HCl에서 20분간 침지하여 디퓨리네이션(defurination) 시키고 변성(denature) 용액(0.5 M NaOH2, 1.5 M NaCl)에 15분간 두 번 침지시킨 후, 중화(neutralization) 용액 (0.5 M Tris-HCl(pH 7.5), 0.1 M NaCl)에 두 번 침지시킨 다음 증류수로 두 번 씻은 뒤 20×SSC 버퍼 (3 M NaCl, 0.3 M Sodium citrate, pH 7.0)로 제타-프로브 GT 멤브레인(Zeta-probe GT membrane; Bio-Rad)에 블럿(blotting) 하였다.
블럿(Blot)은 3시간 동안 40℃에서 하이브리다이제이션(hybridization) 용액으로 프리-하이브리다이제이션(pre-hybridization) 하고, 각 유전자 cDNA의 3-UTR(untranslational region) 부분에 특이적인 32P-표지한 프로브(32P-labeled probe)와 하이브리다이제이션 하였다. 하이브리다이제이션은 42℃하에 pH 7.2의 0.5 M 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 7% SDS, 1 mM EDTA 조건으로 수행하였다. 하이브리드(Hybrid)된 멤브레인은 워싱 버퍼 Ⅰ(washing buffer Ⅰ: 2X SSC, 0.2% SDS)로 두 번 실온에서 워싱한 후 워싱 버퍼 Ⅱ(washing buffer Ⅱ: 0.2X SSC, 0.2% SDS)로 62℃에서 반복해서 워싱하였다. 멤브레인을 비닐 백에 넣어서 물기가 흐르지 않도록 봉한 다음 암실에서 X-ray 필름과 함께 카세트에 넣어서 -70℃에서 하루 동안 노출(expose)시킨 후 X-ray 필름을 현상(develope) 용액과 고정(fixer) 용액에서 현상시킨 후, 물로 세척하여 말려서 밴드(band)를 확인하였다.
겨울우산버섯의 크로모좀(chromosomal) DNA로부터 유래된 유전자임을 확인하 기 위하여 4가지 제한 효소에 의해 각각의 카피(copy) 수가 보이는지 확인하였고 각각의 유전자들이 다른 밴드의 양상을 띠는 것을 보아 각각의 유전자들이 확실히 다른 특성을 가지고 있다고 결론지을 수 있었다(도 4).
도 1은 겨울우산버섯의 MnP 유전자를 클로닝 한 후 전기영동 하여 확인한 것이다.
도 2는 겨울우산버섯의 MnP 유전자의 alignment를 나타낸 것이다.
도 3a는 겨울우산버섯의 MnP 발현 특성을 나타낸 것이다.
도 3b는 겨울우산버섯의 MnP 활성을 측정하여 나타낸 것이다.
도 4는 Southern blot 분석에 의한 겨울우산버섯의 MnP를 확인한 것이다.
<110> Korea Forest Research Institute
<120> Manganese peroxidase cDNAs from basidiomycete fungus, Polyporus
brumalis and expression vector containing thereof
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1316
<212> DNA
<213> Polyporus brumalis
<400> 1
caccggactc tacggacatg gccttccaag ctctcctctc catagtcgcc gttgttgctg 60
cccttcaagg cgtcgacgct gcgctcaccc gccgcgtcgc ttgcccggac ggcaagaaca 120
ccgcgacgaa cgcggcatgc tgcgccctct tccctatccg ggacgacatc gtcgagaacc 180
tcttccacaa ccagtgcgct gaggaggccc acgagtccct ccgcttgact ttccacgacg 240
ccgtcgcctt ctcgcccgcg gcgcaggccc ggggcgagtt tgtcggcgga ggcgctgacg 300
gctccatcgt cctcttctcc gacatcgaga cgaacttcca tgcgaacgac ggcaccgacg 360
acatcgtcgc gttgcagaag ccgttcatcg ccaagcacaa catctctgcc gctgacttcg 420
tgcaatttgc gggtgccgtc gggctcgctc agtgccccgg tgcacctcag ctcgagttcc 480
tgctcggtcg caaggatgcc actcagcctg ctaatgatgg tcttgttcca gagcccttcg 540
atagcgttga cagcatcctc gctcgcctcc tcgacgtcgg cttccaggac ttcgaggtcg 600
tctggctgct ctccgcccat acggtcgcag ctgccgacag ggtggacccc accatcccgc 660
gcacgccctt cgattctacc ccggagatct tcgacaccca gttcttcatc gagactcagc 720
tccgcgggca gacattcccc ggcgtgggcg gcgagcaggg cgaggtgacg tccccgctcc 780
gcggcgagat gcggctgcaa tcagaccacc tcctcgcacg cgactcgcgc acctcgtgcg 840
agtggcagtc tttcaccaac gaccaggaga agttcgccga gacgttcccg gacgtcatgg 900
gccgccttgc gctcctcggc gtggaccaga gccagctcat cgactgctcg gaagtcatcc 960
ccatcgcgcc gcctctcccc gccagctccc gcccccactt ccccgctggc aagactgctg 1020
ctgatgtcga gcaggcttgc gccgagaccc ccttcccgtc cttccccacc gaccccggcc 1080
cggccacctc tgttgcgccc gttcccaatg catgatcacg ttgtacactc gtacacgacc 1140
cggagtattc gtgttggccc attgtatgct tttcgacttg tggtgtacta catacttagt 1200
ggtatcagga ccgtcgcagc tgcgcccggc gctggttgtg gcggacggtg tacattacct 1260
cgtgtgtgaa acttgtatca ctgtcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1316
<210> 2
<211> 1226
<212> DNA
<213> Polyporus brumalis
<400> 2
caataggtca acggtcatgg ctttcaaggc tctgctctcc ttcgtctcca tcgtcgccgc 60
catccagggt gccaccgctg cgctcacaag gcgcgtcgct tgccccgacg gcaagaacac 120
tgcgaccaat gcagcgtgct gcgccctctt ccccattcgg gacgacatcg tcaagaacct 180
cttccacaac cagtgcgcag aggaggccca cgagtccctc cgcctcacct tccacgacgc 240
tgtcgcgttc tcgcccgctg cccaagcccg tggccagttc gccggtggag gcgccgacgg 300
ctccatcgtt ctcttctccg aaatcgagac ggccttccac gcaaatggag gcaccgacga 360
gatcgtcgcg ttgcagaagc ccttcatcgc caagcataac atctccgccg ctgacttcgt 420
tcaattcgcg ggcgccgtcg ggctcgctca gtgccccggt gcacctcagc tcgagttcaa 480
gctcggtcgc aaggacgcaa cccgggccgc acctgacggt ctcgtccccg aacctttcga 540
ctcggtcgac aagatccttg cccgcttgct cgacgtcggt ttccaggact tcgaggtcgt 600
atggctgctc tccgcacaca ctgtcgccgc cgccgaccta gtcgacccga cgatcccgcg 660
tacgccattc gactcaactc cggaaatctt cgacacccag tttttcatcg agacccagct 720
ccgcggacag accttccccg gtaagggcgg catccagggc gaggtgacgt ccccgctccg 780
cggcgagatg cgcctgcagt ccgaccatct gctcgcgcgt gactcgcgca catcgtgcga 840
gtggcagtcg ttcaccaacg accaggagaa gtttgcggag acgttcccgg acgtcatggg 900
ccgccttgcg ctcctcggtg tcgacgagag caagctcatt gattgctcgg aggtcattcc 960
gctcgccccg cccctcccgg ccaacatccg cccgcatttc cctgctggaa agacccatgc 1020
cgacatcgag caagcatgtg ctgagacgcc gttcccctcg ggtccggcga ctgtcgtcgc 1080
tcctgttccc aacctttaga ttggtccagg ctctgaaggt catcgttggt cacaggttca 1140
tagacagtgt catggtgctg cagtatatga gtggtcactc gcgaatacta tctgacttat 1200
gatcatcaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1226
<210> 3
<211> 1905
<212> DNA
<213> Polyporus brumalis
<400> 3
ggcacgaggg ttagacagac atgctgtctg cccgcactgt cttgcaattc cgtatacaac 60
accaacgttc cagggagtgt actctcacca cgaacctcac ctgcccggtg ccggtcctgc 120
ggagcaccca ctgccgtgac tcgggcatcc gctccactgt cgcatcggta ccgtggtcgt 180
actcgcaggc atcggcacca ttcgcacact tgtttggtac cagctcctac gctgcccaca 240
gccgaggtgc cgacaccgtc ctaaatatct ggttctctca ggagcgcacc cgaaccctgg 300
tagaggtgct atgcaagcag cgagagacat gacccgccgg gtgcccgacg caccgtttgg 360
gttaggcagc gacgtgccat tggctgcgtc catattgtac gccgacacgc cgacgtcggc 420
atgccctgta cacccatggc atcgggttat tgcgttcacg ctgtcagaat gggtgcagcg 480
tgattggctg gcctccttgg caagggttta tgtacctttc gcaatttcga ggacatagca 540
gcaccttttg caggatggcg aagagtataa aagagctgtg gcgactgcca ccaaacttca 600
ggacatccac ctttcctcag tcacttcatc tcctcttcgg acaatggcct tcaaaacact 660
cgcgtctttc gtctcggttc ttgcggccct ccaggtcgcc aacggtgccc tcgtacgccg 720
ggtcacttgc gctgacggca gcgtcacgtc caacgcggca tgctgcgcgc tcttcccggt 780
gatccaggat ctccagacaa acctcttcga cggcggcgag tgtggtgagg aggttcacga 840
atcccttcgt ctgaccttcc acgacgccat cggtatctct cccgccatcg cctcccgcgg 900
ccaattcggt ggtggaggtg ccgacggttc gatcgccctc ttcgaagaca tcgagaccaa 960
cttccacgcg aacaacggtg tcgacgagat catcgacgaa cagcgccccc tcatccagcg 1020
ccacaacctc accacggctg acttcatcca gcttgctggt gccatcggtg tcagcaactg 1080
tcctggtgcc cctcgtcttg cagtgttcgt tggtcgcccc gacgccacac agcccgcgcc 1140
cgacctgacc gtcccggagc ccttcgacac cgtcgacagc atcctgcaac gcttcgatga 1200
tgccggtggc ttcactccag cggaggtcgt ggcgctcctc ggctcccaca ccatcgccgc 1260
ggccgaccac gtcgacccgt ccatcccggg aactcccttc gactcgactc ctgagctctt 1320
cgacacccag ttctttatcg agactcagct ccgtggcacg ctcttccccg gcaccggcgg 1380
caaccagggt gaggtcgagt cgcccctccg cggcgagctc cgtctccagt ccgactccga 1440
gctcgcccgt gactctcgca ctgcttgcga gtggcagtcc ttcgtcaaca accaggctaa 1500
gctccagtcc gcgttcgctg ctgccttccg caagatgacg atcctcgggc acgacgaaag 1560
ctcgctgatc gactgttctg acgtcgtccc gactcccccg gccccggcct ccagcgcgca 1620
ccttcccgcc ggcctcaccc acaacgacgt cgagcaggct tgcgccagca cccccttccc 1680
cacgctcccc accgaccccg gtccggccac cactgtcgct cctgtccctc cctcttagag 1740
tgtgtcagac cgtgaagcgg tgctcaggct ggagaacgtc tttcattgtc cgggcgttgc 1800
tggaatgtcg ccacgtatct ttgaccatcg ggtgtatttc tatgtatcat gggctatcgt 1860
agagagtcag attgtcagta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1905
<210> 4
<211> 2011
<212> DNA
<213> Polyporus brumalis
<400> 4
acgcggggga cgtcccattc tactgaacag tcccactccc tcagcctgtc agcaacgtgt 60
cagcattcag gcgtaccaca aggaccaata tacgtacaac tgtcatgcaa atatattggc 120
tcgaagtgcg ctgcgaaata cgcgtgctcg gacgacactc ccaccaagaa cccaataccg 180
gtcctccgat ctgcccactg ctgtggtaag tctacccacc tgcatctgcc catctcatca 240
actaggtccc tgttcgtaga ttctctcgaa catccactcc actgtcgcat cgataccgtg 300
gtcgtgctcg cagggaccgg taccaatcgc gcaaccgctt cgaacagctc ctacgctgcc 360
cgcagccgag gttctgaacc acactaaggt ggctttagtt ctcaggagcg cacccgaagc 420
ttggttcagg tgcgatgcca gcagcgcgaa acatgacccg ctgggtaccc gccgtaccgt 480
ttgggtagtc attggccttc cattggctcc gtacatactg tacgccgaca caccgacgat 540
gcggaatgcc tcaaacaccc agggaatcgg gtgcctgcgt tcacgctgtg agaatgggtg 600
cagcgcgatt ggctggtctc cttgaacacg acctacgcct cgcaaggtcg agacatagca 660
tcaccgttaa ggctttggcg aacgagtata aaggagctgg ggcgacgacg accaaacctc 720
aggacatcta cctctcctca gtcgctccat ctcctcttcg gacaatggcc ttcaaaacac 780
tcgcgtcttt cgtctcagtt ctcgcggctt tccaagccgc taacggtgcc ctcgtccgcc 840
gagttacttg cgctgacggc agcgtcacgg cgaacgcggc gtgctgcgca ctcttcccgg 900
tgattcagga tctccagacg aacctcttcg acggcggcga gtgcggtgag gaggtccacg 960
aatcccttcg tctgaccttc cacgacgcca tcggtatatc ccccgctatc gcctcccgcg 1020
gccaattcgg tggtggcggc gccgacggtt cgatcgccat attcgacgac atcgagacta 1080
acttccacgc gaacaacggt gtcgatgaga tcatcggcga acaacgcccg ctcatccagc 1140
gccacaacat caccacggct gacttcatcc agctcgctgg tgccatcggt gtcagcaact 1200
gtcctggtgc tcctcgcctc gcggtgtttg tcggccgtcc tgatgccacc cagcccgcgc 1260
ccgacttgac cgtcccggag ccctttgaca ccgtcgacag catcctgcag cgcttcgacg 1320
atgccggtgg cttcactcct gaagaggttg tggctctcct tggctcccac actatcgccg 1380
cggccgacca cgtcgacccc tcgatccccg gaaccccctt cgactcgacg cctgagctct 1440
tcgacactca gttcttcatc gagacgcagc tccgtggtac gctcttcccc ggcactggcg 1500
gcaaccaggg tgaggtcgag tcgcccctcc gcggcgagct ccgtctccag tccgactctg 1560
agctcgctcg tgactctcgc actgcttgcg agtggcagtc cttcgtcaac aaccaggcca 1620
agctccagtc cgccttcgct gctgccttcc gcaagatgac gatcctcggc cacgacgagg 1680
gctcgctggt tgactgctcc gacgtcgtcc cgactccccc agccccggcc tcccaggcac 1740
acctccccgc cggtctcact cacaatgacg ttgagcaggc ttgtgccagc actcccttcc 1800
ccactctccc caccgacccc ggtccggcca cctccgttgc ccctgttcct ccctcctaaa 1860
gtgtcgcggt gctgctcaga ctggagatca ttcttcgtta tctcgggatg gctgctacat 1920
agatatgtaa ctcttaacca ctggtctatc attgagatta tgtgacaaca accgattcgt 1980
cccataaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 2011
<210> 5
<211> 1502
<212> DNA
<213> Polyporus brumalis
<400> 5
acgcggggtc agggaggaac gcatcaccga caacagcaaa tggtcgtgtt gtcattggtc 60
acccttcgag tatccgacca tggtgtaacg actcagcgag atacaggacg gtcacgtccg 120
gctcatatgc agagtccgcc agggtataag ggcctcctcc ttcgtccctc cactcctcag 180
cgaactcggc tttcgttacc agaagcacga catgggtttc aaggctctcc tctctattct 240
cgccgtcgtc gcaaggctcg aggtcgccag cgctgcgctt acgcgccgtg ttgcgtgccc 300
cgacgggaag aacaccgcga cgaacgcggc gtgctgcgct ctgttcccga tccgggacga 360
catcgtcgag aacctcttcc acaaccagtg cgccgaggag gcccacgaat ccctccgtct 420
gaccttccac gacgctgtcg cgttctcgcc cgcagctgag gctcgcggcc agttcgccgg 480
tggaggcgcc gacggctcca tcgttctctt ctccgagatc gagacggcat tccacgcaaa 540
cggaggcacc gacgagatcg tcgcgctgca gaagcccttc atcgccaagc acaacatctc 600
ggccgctgac ttcattcaat tcgcgggcgc cgtcgcgctc gctcagtgcc ctggtgcacc 660
tcagctcgag ttcatgctcg gccgcaagga tgctacgcgg gccgcccctg atggtctcgt 720
ccccgagccc ttcgacacaa tcgatgacat cctcgcccgc ttgctcgacg tcgggttcca 780
ggacttcgaa gtcgtgtggc tgctctcagc acacaccgtc gctgccgccg acctggtcga 840
cccgaccatc ccgcgcacgc ccttcgactc gacgccggag atctttgaca cccagttctt 900
catcgagacc cagctccgtg gtctgaagtt cgccggccag ggcggcatcc acggcgaggt 960
caactctccg ctcaccggcg agatgcgcct ccagtcggac cacctcctcg ctcgcgactc 1020
gcgcacggcc tgcgagtggc agtcattcac gaacgaccag gagaagttcg cggagacgtt 1080
cccggatgtg atgggccgcc ttgcgctcct cggtgttgat cagagcacgc tcatcgactg 1140
ctctgaggtc atcccgcttg ccccgcccct gcccgccagc tctcgcccgc acttccccgc 1200
tggcaagacc cacgccgaca tcgaacaggc ttgcgccgac accccgttcc cgaccttccc 1260
cactgaccct ggtccggcca ccaaggtcgc ccccgttccc aacctataag ccgttcaccg 1320
agctggctag cgagcgtcat gaggtccatt tgcgggctac aagagcacac agcaggggtg 1380
ttgctggttg taggtgccgc tggttataga tgctatcgga gcccatgttc cctacagctt 1440
tgaagttatg ttgaataacg aatatcaaac gtttgaattt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1500
aa 1502
<210> 6
<211> 2245
<212> DNA
<213> Polyporus brumalis
<400> 6
aagcagtggt aacaacgcag agtacgcggg ataggctcaa gttgtattcc acggccgtgg 60
gccacaaggt tcccgcagca ggacttttac tgctttgtga cgcggccgtg ggagcggtac 120
atctcgggaa gctcaagcta aaatatggcc gacacggcag gatcttaagg ctttgggtcc 180
tgcttcgatc gtgccatctc cgggcctggg acgcatgccc gaggccggag ctcgagctcg 240
aaccacatcg ccgtttctgg tgaccccacc cagagcccct gcgatttgga cctgccaagg 300
gacctacaat cgcacgaacg tcaacttggc gtgtcgtttt cctttttcct tgtgccatag 360
cagtgcagcg gtctgcgcgg tgtacgcctg catgtccgaa gatagagctt cagactcaag 420
ctgtgcactc tcaccaagaa cctctcgctc gccgttgccg aagaccagca tcctggtata 480
tccccatact accgctccac ccgttcgttc cttgacatgg cagccccacc gtggcaatgg 540
agctgtggtt gaggtcgcag gaactgggtg cggcccgcta ccgccttgtt ccatctgcaa 600
tgccgcccgc agccgaggac tcgacgcgcc cgcccatgcc tccgtttctc atgaacgcgc 660
ccttcgcctg gtggacgtgt cgcgtaaata agtccggaac atgtcgctct gggtacccgc 720
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tgcgcgctcg gcgattggcc gacctcttgg ttttggggtc gacctaccaa gggtataagc 900
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cgacggccag caagattcag gacacctacc tcctcctcag ctgttcatct ccttctcgga 1020
caatggcatt cgcaatcctc gcttccttcg tctctgccct cgcggctctt caggtcgcca 1080
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ctgccatcgc cgctcgcggg caattcggtg gcggaggcgc cgacggctcg atcgccctgt 1320
tcgaggacat cgagaccaac ttccacgcga accttggtgt cgatgagatc atcgacgagc 1380
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cgatcggtgt cgccaactgc cccggtgctc ctcgcctcgc cgtctttgtc ggccgtcagg 1500
atgctactca gcccgcaccc gacttgacag tccctgagcc tttcgacacc gtcgacagca 1560
tcctgcagcg cttcgaggat gccggtggct tcacccccgc tgaagttgtc gccctcctcg 1620
cctctcacac gatcgctgca gccgaccacg tggacccgag catccccgga acgcctttcg 1680
actccacgcc tgagttgttc gacacccagt tcttcatcga gacccagctc cgcggcaccc 1740
tcttccccgg aaccccaggt aaccagggcg aggtcgagtc accagtcccc ggcgagatcc 1800
gtctccagtc tgactctgag ctcgctcgcg actctcgcac tgcttgcgag tggcagtcct 1860
ttgtcaacaa ccaggctaag ctccagtccg cgttcgccgc tgcgttccgc aagatgacga 1920
tcctcggcca cgacgagagc gagctcgtcg actgctccga cgtcgtccag cagcccccgc 1980
ctccggcttc cgctgcgcac ttccccgccg gtctcagcaa cgccgacatc gagcaggcgt 2040
gcgccagcac tcccttcccc actctcccca ccgaccccgg cccggtcacc tcggtcgcac 2100
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gcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 2245
<210> 7
<211> 365
<212> PRT
<213> Polyporus brumalis
<400> 7
Met Ala Phe Gln Ala Leu Leu Ser Ile Val Ala Val Val Ala Ala Leu
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<212> PRT
<213> Polyporus brumalis
<400> 8
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<213> Polyporus brumalis
<400> 10
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225 230 235 240
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<213> Polyporus brumalis
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ile Ser Ala Ala Asp Phe Ile Gln Phe Ala Gly Ala Val Ala Leu Ala
130 135 140
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145 150 155 160
Ala Thr Arg Ala Ala Pro Asp Gly Leu Val Pro Glu Pro Phe Asp Thr
165 170 175
Ile Asp Asp Ile Leu Ala Arg Leu Leu Asp Val Gly Phe Gln Asp Phe
180 185 190
Glu Val Val Trp Leu Leu Ser Ala His Thr Val Ala Ala Ala Asp Leu
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ala Gly Gln Gly Gly Ile His Gly Glu Val Asn Ser Pro Leu Thr Gly
245 250 255
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260 265 270
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325 330 335
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<213> Polyporus brumalis
<400> 12
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1 5 10 15
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Thr Arg Thr Tyr Lys Glu Ala Gly Thr Thr Ala Ser Lys Ile Gln Asp
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Thr Tyr Leu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Pro Ser Arg Thr Met Ala Phe
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65 70 75 80
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Claims (5)
- 서열 1, 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5 및 서열 6 중에서 선택된 어느 하나의 염기서열로 이루어진 겨울우산버섯(Polyporus brumalis) 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 유전자.
- 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11 및 서열 12 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 겨울우산버섯(Polyporus brumalis) 망간에이즈 퍼옥시다아제(manganese peroxidase) 효소.
- 제1항의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터.
- 제3항의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 재조합 벡터로 형질전환된 대장균(E. coli).
- 제1항의 망간에이즈 퍼옥시다아제 유전자를 함유하는 리그닌 분해 기능성이 강화된 겨울우산버섯.
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Citations (2)
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JPH0975079A (ja) * | 1995-09-12 | 1997-03-25 | Kobe Steel Ltd | マンガンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼdna、それを含む組換えベクター、及びその形質転換体 |
US6642439B2 (en) | 2000-07-25 | 2003-11-04 | Agency Of Industrial Science And Technology | Basidiomycete manganese peroxidase gene-transferred plant and a method for removing an environmental contaminant using the same |
-
2007
- 2007-08-16 KR KR1020070082453A patent/KR100888481B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0975079A (ja) * | 1995-09-12 | 1997-03-25 | Kobe Steel Ltd | マンガンパーオキシダーゼ、マンガンパーオキシダーゼdna、それを含む組換えベクター、及びその形質転換体 |
US6642439B2 (en) | 2000-07-25 | 2003-11-04 | Agency Of Industrial Science And Technology | Basidiomycete manganese peroxidase gene-transferred plant and a method for removing an environmental contaminant using the same |
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