KR100887623B1 - Processes for clonal growth of hepatic progenitor cells - Google Patents

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Abstract

본 발명은 배지 존재하에 피더 세포로 이루어진 층상에 내배엽 유래 초대 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물을 배양함을 특징으로 하는 내배엽 유래 초대 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물을 증식하는 방법 등을 개시한다. The present invention discloses a method for propagating endoderm-derived primary progenitor cells, their progeny or mixtures thereof, and the like, wherein the endoderm-derived primary progenitor cells, their progeny or mixtures thereof are cultured on a layer composed of feeder cells in the presence of a medium.

Description

간 전구세포의 클론 증식방법 {PROCESSES FOR CLONAL GROWTH OF HEPATIC PROGENITOR CELLS}Clonal proliferation of hepatic progenitor cells {PROCESSES FOR CLONAL GROWTH OF HEPATIC PROGENITOR CELLS}

본 발명은 다능성 세포(pluripotent cell), 줄기세포 및 기타 초기 간 전구세포(hepatic progenitor cell)를 포함한 포유류의 간 전구세포의 클론 증식을 위한 신규방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 규정배지 및 공배양에서 피더 세포를 사용하여 간 전구세포의 증식시키는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 피더로서 사용되며, 전구세포의 증식을 지지하는 능력이 있는 세포에도 관한 것이다.The present invention relates to a novel method for clonal proliferation of mammalian liver progenitor cells, including pluripotent cells, stem cells, and other early hepatic progenitor cells. In particular, the present invention relates to a method of propagating hepatic progenitor cells using feeder cells in defined medium and coculture. The invention also relates to cells which are used as feeders and which have the ability to support proliferation of progenitor cells.

포유류 조직중의 다능성(multipotential) 전구세포의 동정은 임상적 및 상업적으로 매우 중요하며, 또한 발생과정 및 조직 호메오스타시스를 이해하는 데도 중요하다. 전구세포군은 유전자 요법, 세포 이식 및 생체 인공 장기의 조직 공학의 이상적 표적이다(Millar, AD. 1992 Nature 357, 455; Langer, R. and Vacanti, J. P. 1993 Science 260, 920; Gage, F. H. 1998 Nature 392, 18).The identification of multipotential progenitor cells in mammalian tissue is of great clinical and commercial importance and is also important for understanding developmental processes and tissue homeostasis. Progenitor cell populations are ideal targets for gene therapy, cell transplantation, and tissue engineering of bioartificial organs (Millar, AD. 1992 Nature 357, 455; Langer, R. and Vacanti, JP 1993 Science 260, 920; Gage, FH 1998 Nature 392). , 18).

증식능 및/또는 다능성이 높은 조직 특이적인 "운명된" 줄기 세포 또는 전구 세포가 존재하는 것은 각각 조직에 맞는 특정의 방법을 사용하여 클론을 동정한, 조혈 줄기세포(Spangrude, G. J. et al. 1988 Science 241, 58), 신경 줄기세포(Davis, A. A., and Temple, S. 1994 Nature 372, 263; Stemple, D. l., and Anderson, D. J. 1992 Cell 71, 973) 및 상피 줄기세포(Jones, P. J. and Watt, F. M. 1993 Cell 73, 713)의 연구로부터 밝혀졌다. 이들 전구세포는 정상적인 조혈, 신경 또는 상피 조직의 호메오스타시스를 담당하고, 또한 중상 후에 재생 반응을 담당하는 것으로 간주되어 왔다(Hall, P. A., and Watt, F. M. 1989 Development 106, 619).The presence of tissue-specific "named" stem cells or progenitor cells with high proliferative and / or pluripotency may be found in hematopoietic stem cells (Spangrude, GJ et al. 1988), in which clones were identified using specific methods for each tissue. Science 241, 58), neural stem cells (Davis, AA, and Temple, S. 1994 Nature 372, 263; Stemple, D. l., And Anderson, DJ 1992 Cell 71, 973) and epithelial stem cells (Jones, PJ and Watt, FM 1993 Cell 73, 713). These progenitor cells have been considered to be responsible for homeostasis of normal hematopoietic, neural or epithelial tissues, and also for regenerative reactions after severe injury (Hall, P. A., and Watt, F. M. 1989 Development 106, 619).

포유류의 성체 간장은, 통상 대사 회전이 늦고, 정지상태의 조직인 것에 관계없이 고도의 간독성에 의한 상해 또는 부분적 간장 절제술 후에 회복하는 능력이 대단히 높다(Fishback, F. C. 1929 Arch. Pathol. 7, 955); (Higgins, G. M. and Anderson, R. M. 1931 Arch, Pathol. 12, 186). 마우스에서의 최근 시험 데이터에서는 일련의 이식실험에서 조사한 바, 성체의 실질 세포(parenchymal cells)는 거의 무한적 증식 가능성을 갖는 것이 시사되었다(Overturf et al. 1997 Am. J. Pathol. 151, 1273; Rhim, J. A. et al. 1994 Science 263, 1149). 이들 실험에서는 불균질한 간 세포(liver cell)를 이용하기 때문에 관찰된 증식 가능성이 성체의 실질 세포에 유래하는 것인가, 성체의 실질 세포의 아집단에 유래하는 것인가, 및/또는 실질세포의 미성숙기(즉, 전구)에 유래하는 것인가를 증명하는 능력이 한정되어 있다. 더욱이 실험에서는 사용된 숙주가 알부민-유로키나제 도입 유전자 또는 티로신 분해효소의 결손을 가지기 때문에 담관 상피 분화의 증가가 나타나 있지 않으며; 어떤 숙주도 간세포계를 선택하도록 하는 특성을 갖는다. 따라서 상기 앗세이법에서는 양능성(bipotent) 세포군의 시험이 이루어질 수 없었다. Adult livers of mammals usually have a slow metabolic turn and have a very high ability to recover after highly hepatotoxic injury or partial hepatic resection, regardless of stationary tissue (Fishback, F. C. 1929 Arch. Pathol. 7, 955); (Higgins, G. M. and Anderson, R. M. 1931 Arch, Pathol. 12, 186). Recent test data in mice suggest that adult parenchymal cells have almost infinite proliferation potential (Overturf et al. 1997 Am. J. Pathol. 151, 1273; Rhim, JA et al. 1994 Science 263, 1149). Because these experiments use heterogeneous liver cells, the observed proliferation potential is derived from adult parenchymal cells, a subset of adult parenchymal cells, and / or immature stages of parenchymal cells. (I.e., light bulbs), the ability to prove that they originate is limited. Moreover, the experiment showed no increase in bile duct epithelial differentiation because the host used had a deletion of albumin-urokinase transgene or tyrosine degrading enzyme; Any host has the property of selecting a hepatocyte system. Therefore, the assay of the bipotent cell population could not be made in the assay.

몇 개의 조직학적 시험에 의해 임신 중기 태아의 초기 간장 세포(hepatic cell)가 담관 상피 및 간세포(hepatocyte)로 분화하는 양능성의 능력을 갖는 것이 확립되어 있다(Shiojiri, N. 1997 Microscopy Res. Tech. 39, 328-35). 간장 발생은 내배엽(內胚葉) 상피가 태아 심장 발생 중배엽(中胚葉)과 상호 작용한 직후에 복부 창자 내배엽에서 시작한다(Douarin, N. M. 1975 Medical Biol. 53, 427; Houssaint, E. 1980 Cell Differ. 9, 269). 이 간장으로의 관계는 마우스에서는 태생일(E) 8일에 일어난다. 간장 발생의 최초 단계는 형태학적 변화 전에 내배엽중의 혈청 알부민과 알파-페토프로테인 mRNA가 유도되어 명백하게 된다(Gauadi, R et al. 1996 Genes Dev. 10, 1670). 마우스 태생 9.5일에 특정 세포가 증식하여 실과 같은 형태로 횡경막의 간엽(間葉)에 침입하여 간장 원기(anlage)를 형성한다. 그런 다음, 간장 질량은 극적으로 증가하나, 간장 질량의 증가는 주로 조혈세포에 의한 것이며, 이것은 마우스에서 E10에서 태아 간으로 클론을 형성하여(Houssaint, E. 1981 Cell Differ. 10, 243), 간장 세포에 영향을 주어 극도로 일그러져 불규칙한 형태로 된다(Luzzatto, A. C. 1981 Cell Tissue Res. 215, 133). 흥미롭게도, 유전자 타겟 변종 마우스를 사용한 최근의 데이터는 수많은 유전자의 결손에 의해 E12에서 E15사이에 치사적인 간 부전, 실질세포의 아폽토시스(apoptosis) 및/또는 괴사가 일어난 것을 보여준다(Gunes, C. et al. 1998 EMBO J. 17, 2846; Hilberg. F. et al. 1993 Nature 365, 1791; Motoyama, J. et al. 1997 Mech. Dev. 66, 27); (Schmidt, C. et al. 1995 Nature 373, 699). 특히, 스트레스로 활성화된 캐스케이드(Ganiatsas, S. et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6881); (Nishina, H. et al. 1999 Development 126, 505) 또는 앤티 아폽토 캐스케이드(Beg, A. et al. 1995 Nature 376, 167); (Li, Q. et al. 1999 Science 284, 321; Tanaka, M. et al. 1999, Immunity 10, 421)의 일부인 유전자의 파괴는 불활화된 유전자가 널리 발현되어 있음에도 불구하고, 간발생을 심하게 손상시키나, 조혈은 손상되지 않는다. 간장 세포가 발생 스트레스 자극에 본래 감수성인 것인지, 또는 태아 간 자체의 특정 미소 환경이 이와 같은 파괴적인 효과를 일으키는지는 명백하지 않다(Doi, T. S. et al 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2994). 한편, 성체 간장의 기초적인 구축은 문맥(portal vein)을 둘러싸는 담관 상피의 최초의 원주의 출현에 의존한다(Shiojiri, N. 1997 Microscopy Res. Tech. 39, 328). 면역조직학적으로, 간내 담관 상피 세포의 분화의 최초 징후는 담즙 특이적 사이토케라틴(CK)의 발현이다. 상피 세포의 세포질 중간경 필라멘트(IF) 프로테인인 CK 프로테인은 다중 유전자족(multigene family)에 의해 코드되고, 조직 및 분화에 특이적으로 발현된다(Moll, R. et al. 1982 Cell 31, 11). 성체 간세포(adult hepatocytes)는 CK19를 전혀 발현시키지 않으나, 성체의 담관 상피세포는 발현하기 때문에 CK19는 담즙 마커 중에서 가장 눈을 끄는 것의 하나이다. CK8 및 CK18만이 초기 간장 세포로부터 성체 간세포까지 통하여 발현한다(Moll, R. et al. Cell 1982, 31, 11). 마우스 E14에 상응하는 랫트의 발현중 E15.5에서 담관 전구 세포는 CK18 및 CK8항체의 양쪽에 의해 강하게 염색되고, 일부의 담관 전구 세포는 CK19를 발현시킨다. 발생이 진행하면서 성숙하고 있는 담관은 CK19와 더불어 CK7도 점차 발현시키기 시작하여, ALB의 발현을 잃어버린다(Shiojiri, N. et al. Cancer Res. 1991, 51, 2611). 랫트중 E13과 같이 빠른 시기의 간장 세포는 균일한 세포군이라고 생각되나, 모든 초기 간장 세포가 담관 상피세포계로 분화할 수 있는지 여부, 및 이와 같은 운명이 어떻게 결정되는지는 아직 알지 못한다. 레트로바이러스 벡터를 사용하는 것과 같은 결정적 계통 마킹 시험은 간장 세포에 대해 행하여지지 않았으며, 양능성 간 전구세포의 입증에 필요한 클론 배양 조건은 결정되어 있지 않았다.Several histological studies have established that early hepatic cells of the midterm fetus have the ability to differentiate into bile duct epithelium and hepatocytes (Shiojiri, N. 1997 Microscopy Res. Tech. 39, 328-35). Hepatic development begins in the abdominal intestinal endoderm immediately after the endoderm epithelium interacts with fetal cardiac mesoderm (Douarin, NM 1975 Medical Biol . 53, 427; Houssaint, E. 1980 Cell Differ . 9, 269). This relationship to the liver occurs on day 8 of birth (E) in mice. The first stage of hepatic development is evident by the induction of serum albumin and alpha-fetoprotein mRNA in endoderm before morphological changes (Gauadi, R et al. 1996 Genes Dev . 10, 1670). At 9.5 days of mouse birth, certain cells proliferate and invade the mesenchyme of the diaphragm in a thread-like form to form an hepatic anlage. Then, the hepatic mass increases dramatically, but the increase in hepatic mass is mainly due to hematopoietic cells, which clones from E10 to fetal liver in mice (Houssaint, E. 1981 Cell Differ. 10, 243), Cells are extremely distorted and irregular in shape (Luzzatto, AC 1981 Cell Tissue Res . 215, 133). Interestingly, recent data using gene-targeted variant mice show that fatal liver failure, apoptosis of parenchymal cells and / or necrosis occurred between E12 and E15 due to numerous gene deletions (Gunes, C. et. al. 1998 EMBO J. 17, 2846; Hilberg F. et al. 1993 Nature 365, 1791; Motoyama, J. et al. 1997 Mech. Dev . 66, 27); Schmidt, C. et al. 1995 Nature 373, 699. In particular, the stress activated cascade (Ganiatsas, S. et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6881); (Nishina, H. et al. 1999 Development 126, 505) or anti apopto cascade (Beg, A. et al. 1995 Nature 376, 167); (Li, Q. et al. 1999 Science 284, 321; Tanaka, M. et al. 1999, Immunity 10, 421) Destruction of genes is severely hepatic, despite the widespread expression of inactivated genes. Damage, but not hematopoietic. It is not clear whether hepatic cells are inherently sensitive to developmental stress stimuli, or whether the specific microenvironment of the fetal liver itself causes this destructive effect (Doi, TS et al 1999 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2994). On the other hand, the basic construction of adult livers depends on the emergence of the first columnar column of the bile duct epithelium surrounding the portal vein (Shiojiri, N. 1997 Microscopy Res. Tech . 39, 328). Immunohistologically, the first sign of differentiation of intrahepatic bile duct epithelial cells is the expression of bile specific cytokeratin (CK). CK protein, a cytoplasmic medial filament (IF) protein of epithelial cells, is encoded by a multigene family and specifically expressed in tissue and differentiation (Moll, R. et al. 1982 Cell 31, 11) . Adult hepatocytes do not express CK19 at all, but because they express adult bile duct epithelial cells, CK19 is one of the most eye catching bile markers. Only CK8 and CK18 express through early hepatic cells to adult hepatocytes (Moll, R. et al. Cell 1982, 31, 11). During expression of rats corresponding to mouse E14 bile duct progenitor cells are strongly stained by both CK18 and CK8 antibodies, and some bile duct progenitor cells express CK19. As the development progresses, mature bile ducts gradually begin to express CK7 in addition to CK19, resulting in the loss of ALB expression (Shiojiri, N. et al. Cancer Res . 1991, 51 , 2611). Hepatic cells in the early stages of rats, such as E13, are thought to be homogeneous, but it is not yet known whether all early hepatic cells can differentiate into the bile duct epithelial system and how this fate is determined. Deterministic lineage marking tests, such as using retroviral vectors, have not been performed on hepatic cells, and the clonal culture conditions necessary for the demonstration of benign hepatic progenitor cells have not been determined.

클론 증식 분석의 하나의 큰 장애는 조혈세포의 폭발적인 증가이며, 이에 의해 간장 세포의 생체외 증식이 관찰할 수 없게 한다. 따라서, 간세포의 농축방법을 이용할 필요가 있다. 태아 간에 있어서, 조혈세포를 분획하는데 필요한 표면 마커가 상세하게 조사되고 있으나(Dzierzak, E. et al. Immunol. Today 1998, 19, 228), 간 전구세포의 마커의 연구는 초기단계이며, 이들은 아직 그다지 결정되어 있지 않다.(Sigal, S. et al. Hepatology 1994, 19, 999). 더욱이 성체 간세포(adult liver cell)에서 통상 사용되는 생체외 증식 조건에서는 ALB 발현과 같은 조직 특이적 기능의 손실을 수반한 분화가 일어난다(Block, G. D. et al. J. Cell Biol. 1996, 132, 1133). 조직 특이적 mRNAs를 합성하는 약간 개선된 능력과 전사후 완전히 조직 특이적 유전자를 조절하는 능력의 회복은 무혈청에서, 호르몬, 증식 인자 및/또는 일부 세포외 메트릭스 성분이 정의되어 있는 혼합물을 사용하여 유지시킨 간 세포(liver cell)에서만 나타난다(Jefferson, D. M. et al. Mol. Cell. Biol. 1984, 4, 1929; Enat, R. et al Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81, 1411). 그러나, 증식하는 태아 간장 세포는 이와 같은 생체중 혈청 프로테인의 발현을 지지한다. 이 분야에서 명백하지 않은 것은 생체외에서 간 전구세포를 지지하여 증식시키기 위하여 어떻게 하느냐는 것이다. 간 전구세포의 체외 증식을 지지하는 조건의 동정에는 충족시키지 못하는 수요가 있다. 마찬가지로 새로운 간 조직에서 분리한 간 전구세포의 클론 증식능력을 결정하기 위한 생체외 콜로니 형성 앗세이(CFA)법에 대한 미충족의 수요가 있으며; 클론 증식은 배양액에 접종된 단일 세포가 접종된 세포에 유래하는 클론의 딸 세포군을 생성하는 능력으로 정의된다. 높은 세포밀도로 접종된 간장 배양에 있어서 근접하여 증식하는 세포 덩어리로 이루어진 클론 증식도 다른 연구자에 의해 기술되어 있다(Block, G. D. et al. J. Cell Biol. 1996, 132, 1133); 그러나, 이들의 이전 연구에 기술되어 있는 세포 콜로니는 계대 배양할 수 없어서 정의하고 있는 클론이라 말할 수 없고, 그의 유용성에 한계가 있다. One major obstacle of clone proliferation assays is the explosive increase in hematopoietic cells, thereby making the ex vivo proliferation of hepatic cells unobservable. Therefore, it is necessary to use a method for enriching hepatocytes. In fetal livers, the surface markers required to fractionate hematopoietic cells have been investigated in detail (Dzierzak, E. et al. Immunol. Today 1998, 19, 228 ), but studies of markers of hepatic progenitor cells are still in their infancy. Not very determined (Sigal, S. et al. Hepatology 1994, 19, 999). Moreover, differentiation with loss of tissue specific functions such as ALB expression occurs in the ex vivo proliferation conditions commonly used in adult liver cells (Block, GD et al. J. Cell Biol . 1996, 132, 1133). ). The slightly improved ability of synthesizing tissue specific mRNAs and the ability to fully regulate tissue specific genes after transcription is achieved using a mixture of hormones, proliferative factors and / or some extracellular matrix components defined in serum free. Appears only in maintained liver cells (Jefferson, DM et al. Mol. Cell. Biol . 1984, 4 , 1929; Enat, R. et al Proc. Natl. Acad. Sci., 1984, 81, 1411) . However, proliferating fetal hepatic cells support the expression of such serum proteins in vivo. What is not clear in this field is how to support and proliferate hepatic progenitor cells in vitro. There is an unmet need to identify conditions that support in vitro proliferation of hepatic progenitor cells. Similarly, there is an unmet need for an ex vivo colony forming assay (CFA) method to determine the clonal proliferation of hepatic progenitor cells isolated from new liver tissue; Clonal proliferation is defined as the ability to generate daughter cell populations of clones derived from cells inoculated with single cells inoculated in culture. Clonal proliferation consisting of cell masses that proliferate in close proximity in hepatic cultures inoculated with high cell density has also been described by other researchers (Block, GD et al. J. Cell Biol . 1996, 132 , 1133); However, the cell colonies described in these previous studies cannot be subcultured and cannot be defined as clones, and their usefulness is limited.

생체외 간세포(hepatocytes)를 증식시키는 시도가 있었다. 미국특허 제 5,510,254호에 간세포의 배양은 생체 적합성이나 살아있지 않은 재료의 3차원 프레임 워크에 의존한다고 주장하고 있다. 인공적 프레임 워크가 아니고, 간 전구세포가 증식 및 배양될 수 있는 배양조건에는 만족스럽지 못하다. 또한, 담관 세포 및 간세포의 양자를 생성하는 능력이 있는 양능성 분화능(bipotential differentiation capability)을 가지며, 더불어 특히 인공 간장의 성분으로서의 이용, 간독성의 시험 및 약제 개발에 적합한 클론화 간 전구세포에는 아직 충족할 수 없다.Attempts have been made to propagate hepatocytes in vitro. U.S. Patent No. 5,510,254 claims that the cultivation of hepatocytes depends on a three-dimensional framework of biocompatibility or non-living material. It is not an artificial framework and is not satisfactory for culture conditions in which hepatic progenitor cells can be proliferated and cultured. It also has a bipotential differentiation capability with the ability to produce both bile duct cells and hepatocytes, and still satisfies cloned hepatic progenitor cells, particularly suitable for use as an ingredient in artificial liver, for testing of liver toxicity and for drug development. Can not.

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미국특허 제 5,559,022호에서는 "예비 세포(reserve cells)"를 특정짓는데 사용되는 염료인 에오신 Y를 결합하는 간 예비 세포를 특허청구하고 있으나, 간 세포의 동정에 확립된 마커를 사용하고 있지 않으며, 또한 예비 세포의 클론 증식 방법도, 생존 능력이 있는 간 예비 세포의 분리에 사용한 마커도 제공하지 않고 있다. 적어도 하나의 특이적 마커의 발현 및 간세포나 담관 세포의 어느 것으로 분화하는 능력을 포함한 간 전구세포에 필수의 많은 특징을 갖는 세포의 분리 및 배양법을 개시하고 있는 방법에는 만족스럽지 못하다. 또한, 간 전구세포의 클론 증식용 방법은 충분치 않다. 클론 증식은 다능성 간 전구세포의 명백하고 엄밀한 구별 및 동정방법이 필수적이다.U.S. Pat.No. 5,559,022 claims a liver reserve cell that binds Eosin Y, a dye used to characterize "reserve cells," but does not use a marker established for the identification of liver cells. Neither the method of clone propagation of cells nor a marker used for the separation of viable liver preparative cells is provided. It is not satisfactory for the method to disclose a method for isolating and culturing cells having many features essential for hepatic progenitor cells, including the expression of at least one specific marker and the ability to differentiate into either hepatocytes or bile duct cells. In addition, the method for clonal proliferation of hepatic progenitor cells is insufficient. Clonal proliferation requires a clear and precise method of identification and identification of pluripotent liver progenitor cells.

미국특허 제 5,405,722호에는 세포 증식을 위한 배지를 청구하고 있다. 미국특허제 5,405,722호에는 3-30 ㎍/㎖의 콜레스테롤, 5-30 ㎍/㎖의 뉴클레오시드 및 2-100 ㎍/㎠의 콜라겐 IV 또는 0.5-100 ㎍/㎠의 피브로넥틴의 어느 하나를 필수 성분으로 하고 있다. 이것에는 간 전구세포 증식에 특이적이며, 또한 최적화된 배지가 필요하다. US Patent No. 5,405,722 claims a medium for cell proliferation. U.S. Patent No. 5,405,722 discloses either 3-30 μg / ml cholesterol, 5-30 μg / ml nucleosides and 2-100 μg / cm 2 collagen IV or 0.5-100 μg / cm 2 fibronectin as an essential ingredient. I am doing it. This requires a medium that is specific for hepatic progenitor cell proliferation and that is also optimized.

미국특허 제 4,914,032호에는 간세포를 배양하는 과정을 특허청구하고 있다. 본 발명과는 반대로 특허 제 4,914,032호는 간 전구세포의 배양 또는 간장 세포의 클론 증식 조건의 어느 하나도 개시하지 않고 있다. 마찬가지로 미국특허 제 5,030,105호는 간세포 배양을 처리함으로서 약제를 평가하는 방법을 청구하고 있다. 규정된 세포군을 시험에 사용하기 위한 클론 증식 조건, 및 간 전구세포의 배양방법은 아직 만족스럽지 못하다.US Patent No. 4,914,032 claims a process for culturing hepatocytes. In contrast to the present invention, Patent No. 4,914,032 does not disclose any of the conditions for culturing hepatic progenitor cells or clonal proliferation of hepatic cells. Likewise, U. S. Patent No. 5,030, 105 claims a method for evaluating a medicament by treating a hepatocyte culture. Clonal proliferation conditions and methods of culturing hepatic progenitor cells for use with defined cell populations for testing are not yet satisfactory.

미국특허 제 5,858,721호는 기질 세포(stromal cells)의 트랜스펙션을 청구하고 있다. 그러나, 이 미국특허 제 5,858,721호는 생체 적합성의 살아있지 않은 재료의 프레임 워크를 필요로 하는 점에서 한정되어 있다. 이것과는 대조로 본 발명에서는 합성 메쉬워크를 필요로 하지 않는 증식 조건으로, 상기 발명은 만족스럽지 못하다.U.S. Patent 5,858,721 claims transfection of stromal cells. However, this US Pat. No. 5,858,721 is limited in that it requires a framework of biocompatible non-living materials. In contrast to this, the present invention is not satisfactory with the growth conditions that do not require a synthetic meshwork in the present invention.

본 발명자들은 보다 훨씬 유용한 간 전구세포가 아닌 간세포와 같은 성숙한 간 세포를 배양하는 것은 적당하지 못함을 인식하였다. 본 발명자는 간 전구세포의 분리 파라미터 및 클론 증식 요건을 주의 깊게 결정하였다. 전구세포 및 전구세포를 선택 배양하는 방법은 간 부전 환자의 치료약, 및 독성 물질의 평가 및 약제의 평가를 포함한 많은 유용성을 가진다.The inventors have recognized that it is not suitable to culture mature liver cells, such as hepatocytes but not much useful liver progenitors. We carefully determined the isolation parameters and clone proliferation requirements of hepatic progenitor cells. Progenitor cells and methods of selective culturing have a number of usefulness, including the treatment of hepatic insufficiency patients, as well as evaluation of toxic substances and evaluation of drugs.

미국특허 제 5,576,207호 및 5,789,246호에는 피더 및 호르몬 첨가 규정 배지의 필요성을 개시하고 있다. 이들의 선행 연구는 배아 간장의 기질세포와 규정된 세포외 메트릭스 기저 및 무혈청의 호르몬 첨가 배지를 조합하여 사용하여 간 전구세포의 증식조건으로 하고 있다. 그러나, 사용된 규정배지는 본 발명에 의해 사용된 것보다 훨씬 복잡하고; 세포를 정제된 메트릭스 기저(타입 IV 콜라겐 및 라미닌)상에 접종되나, 본 발명에서는 피더(메트릭스를 공급한다)상에 직접 접종하며; 또한 배아 기질 세포는 배아 간장의 초대 배양(primary cultures)으로 조제되고 세포주로서 확립되어 있지 않았다. 배아 기질 세포주를 사용함으로써, 피더 세포는 훨씬 간단하고, 실질적으로 재현성이 있는 세포 지지 수단으로 된다. 더욱이, STO 피더는 간 전구세포에 한정하여 지지되는 것은 아니며, 복수 종류의 조직으로부터 얻은 전구 세포에도 사용할 수 있는 것으로 생각되는 것은 합리적이다. 선행 특허에서는 간 전구 배양액은 높은 세포 밀도로 접종하여, 이들 증식이 콜로니 형성으로 관찰되는데, 이는 세포의 클론이 아닌 세포의 덩어리가 유도된 것임을 의미한다.U.S. Patent Nos. 5,576,207 and 5,789,246 disclose the need for feeder and hormone addition regulatory media. These previous studies have used a combination of embryonic hepatic stromal cells with a defined extracellular matrix basal and serum-free hormone-added medium to determine the proliferation conditions of hepatic progenitor cells. However, the regulatory medium used is much more complicated than that used by the present invention; Cells are seeded on purified matrix bases (type IV collagen and laminin), but in the present invention are directly seeded on feeders (feeding metrics); Embryonic stromal cells were also prepared in primary cultures of embryonic liver and were not established as cell lines. By using an embryonic stromal cell line, feeder cells become a much simpler and substantially reproducible cell support means. Moreover, the STO feeder is not limited to hepatic progenitor cells, and it is reasonable to think that the STO feeder can be used for progenitor cells obtained from a plurality of types of tissues. In the prior patents, hepatic progenitor cultures were inoculated at high cell densities, so that their proliferation is observed with colony formation, meaning that agglomerates of cells are induced rather than clones of cells.

본 발명은 전구세포, 그의 자손, 또는 그의 혼합물을 증식시키는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 내배엽 유래의 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물을 증식시키는 방법에 관한 것이다. 세포는 내배엽 조직으로부터 얻어진다. 그 후, 내배엽 유래 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물은 배지중에서 피더 세포를 함유하는 층상에서 배양된다. 이 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물은 척추동물 세포일 수 있다. 이 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물은 ICAM 또는 ICAM-1 양성 및 고전적 MHC 클래스 I 항원 음성의 표현형으로 표시될 수 있다. 이 고전적 MHC 클래스 I 항원은 MHC 클래스 Ia 항원으로 불린다.The present invention relates to a method of propagating progenitor cells, their progeny, or mixtures thereof. In particular, the present invention relates to a method of propagating progenitor cells derived from endoderm, progeny thereof, or mixtures thereof. The cells are obtained from endoderm tissue. The endoderm-derived progenitor cells, their progeny or mixtures thereof are then cultured on the layer containing the feeder cells in the medium. This progenitor cell, its progeny or mixture thereof may be a vertebrate cell. These progenitor cells, their progeny or mixtures thereof can be expressed in phenotypes of ICAM or ICAM-1 positive and classical MHC class I antigen negative. This classical MHC class I antigen is called MHC class Ia antigen.

본 발명은 무혈청, 호르몬 첨가 규정배지 및 피더 세포를 사용하는 간 줄기세포 및 기타 전구세포의 배양 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 전구세포의 자손 또는 전구세포 및 전구세포의 자손의 조합을 배양시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 전구세포는 간 전구세포이다. 마찬가지로 본 발명은 특정의 배양조건을 사용하여 간장의 다능성 전구세포를 클로닝하는 방법에도 관한 것이다. 바람직하기로는 본 발명은 간 다능성 전구세포의 클로닝 방법에도 관한 것이다. 간장의 다능성 전구세포는 임의의 무척추동물 또는 척추동물 종, 보다 바람직하기로는 포유류로부터 유래될 수 있다. 더욱 더 바람직하기로는 간장의 다능성 전구세포는 사람, 영장류, 돼지, 개, 랫트, 토끼, 또는 마우스 유래이다. 가장 바람직하기로는 다능성 전구세포는 사람 유래이다. 본 발명은 간 전구세포 및 그의 자손의 생체외 증식에 필요한 특정의 배양 조건을 개시한다. 본 발명은 또한, 간 전구용 피더 세포로서 STO 마우스 배아 세포와 같은 배아 피더 세포의 사용도 개시한다. 피더 세포는 본 발명에서 개시하는 새로운 무혈청 호르몬 첨가 규정배지(HDM)와 조합하여 사용한다. 이 조합에 의해 세포가 악성 형질 전환되지 않고, E15 랫트 간에서 각종 랫트 태아 간장 세포주를 확립할 수 있었다.The present invention relates to a method of culturing liver stem cells and other progenitor cells using serum free, hormone supplemented medium and feeder cells. The present invention also relates to a method of culturing progeny of a progenitor cell or a combination of progenitor cells and progeny of progenitor cells. Preferably the progenitor cells are hepatic progenitor cells. Similarly, the present invention relates to a method for cloning liver pluripotent progenitor cells using specific culture conditions. Preferably the present invention also relates to a method for cloning liver pluripotent progenitor cells. Hepatic pluripotent progenitor cells may be derived from any invertebrate or vertebrate species, more preferably mammals. Even more preferably, the pluripotent progenitor cells of the liver are derived from humans, primates, pigs, dogs, rats, rabbits, or mice. Most preferably the pluripotent progenitor cells are of human origin. The present invention discloses certain culture conditions necessary for ex vivo propagation of hepatic progenitor cells and their progeny. The present invention also discloses the use of embryonic feeder cells, such as STO mouse embryonic cells, as hepatic progenitor feeder cells. Feeder cells are used in combination with the new serum-free hormone addition media (HDM) disclosed herein. By this combination, cells were not malignantly transformed, and various rat fetal hepatic cell lines could be established in E15 rat liver.

더욱이, 본 발명은 간 전구세포 및 그의 자손의 증식을 지지할 수 있는 피더 세포의 클로닝 방법에 관한 것이다. Moreover, the present invention relates to a method for cloning feeder cells capable of supporting the proliferation of hepatic progenitor cells and their progeny.

또한, 본 발명은 피더로서 사용할 때, 간 전구세포 증식을 지지하는 특정 세포주에 관한 것이다. The invention also relates to specific cell lines which, when used as feeders, support hepatic progenitor cell proliferation.

또한, 본 발명은 간 전구세포의 클로닝 방법에도 관한 것이다. 본 발명은 신선하게 분리된 간 전구세포의 클론 증식능력을 결정하는 생체내 콜로니 형성 앗세이(CFA)법의 개발을 위한 간장 세포주 및 HDM-STO 공배양계의 사용을 개시한다. CFA를 특이적 항원 프로파일에 의해 정제된 세포와 조합하면, 양능성 간 전구세포가 명백하게 된다. 예를 들면, E11.5 마우스에 상응하는 E13 랫트 간으로부터 얻은 증식 증력이 높은 전구세포는 고전적 MHC 클래스 I(RT1A)-, OX18(pan-MHC 클래스 I)dull, 및 세포내 접착 분자 1(ICAM-1)+와 같은 동일 표현형을 갖는다.The present invention also relates to a method for cloning liver progenitor cells. The present invention discloses the use of a hepatic cell line and an HDM-STO coculture system for the development of in vivo colony forming assay (CFA) methods to determine clone proliferation capacity of freshly isolated hepatic progenitor cells. Combining CFAs with cells purified by specific antigen profiles, pluripotent liver progenitor cells become apparent. For example, high proliferative progenitor cells from E13 rat livers, corresponding to E11.5 mice, may be expressed in classical MHC class I (RT1A) - , OX18 (pan-MHC class I) dull , and intracellular adhesion molecule 1 (ICAM). -1) has the same phenotype as +

또한 본 발명은 클로널 간장 세포 증식을 지지할 수 있는 배지에도 대한 것이다. 이 배지는 특정 호르몬 및 영양을 특징으로 하고, 혈청을 함유하지 않는다.The present invention also relates to a medium capable of supporting clonal hepatic cell proliferation. This medium is characterized by specific hormones and nutrition and does not contain serum.

더욱이, 본 발명은 피더 세포의 생합성 산물을 함유하는 배지의 간 전구세포의 배양에 관한 것이다.Moreover, the present invention relates to the culturing of hepatic progenitor cells in medium containing the biosynthetic products of feeder cells.

또한, 본 발명은 간세포 및 담즙 세포 표현형을 함유하는, 간장 세포의 분화의 유도방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 상피성장인자(EGF)가 전구세포 콜로니의 증식과, 간세포(heaptocytes) 또는 담관 상피세포와 같은 그들의 운명에 영향을 주는 것이 개시된다.The present invention also relates to a method of inducing differentiation of hepatic cells, which contains hepatocytes and bile cell phenotypes. The present invention discloses that epidermal growth factor (EGF) influences the proliferation of progenitor colonies and their fate, such as heaptocytes or bile duct epithelial cells.

도 1은 15일령 랫트 태아 간장으로부터 얻은 간장 세포주의 특징을 나타낸다. 1 shows the characteristics of hepatic cell lines obtained from 15-day-old rat fetal liver.

도 2는 섬유아세포 피더 세포상 콜로니 형성의 앗세이법을 나타낸다. 2 shows assays for colony formation on fibroblast feeder cells.

도 3은 성체 간 세포(adult liver cells)중의 각종 간장 세포주의 랫트 세포 표면 항원의 발현을 나타낸다. 3 shows the expression of rat cell surface antigens of various hepatic cell lines in adult liver cells.

도 4는 13일령 태아 랫트 간장의 표현형 분석을 나타낸다. 4 shows phenotypic analysis of 13-day-old fetal rat liver.

도 5는 EGF의 존재 및 부재하에서의 간장 콜로니의 특성을 나타낸다. 5 shows the properties of hepatic colonies in the presence and absence of EGF.

도 6은 RT1A1- 간장 세포상의 CK19 발현의 유도를 나타낸다. 6 shows the induction of CK19 expression on RT1A 1- hepatic cells.

도 7은 STO5 피더 세포상의 간장 콜로니 형성의 모식도이다. 7 is a schematic diagram of hepatic colony formation on STO5 feeder cells.

본 발명은 줄기 세포의 증식 및 이용 방법이다. 외배엽, 중배엽, 내배엽 기원의 조직을 포함하며, 각종 조직이 전구세포의 적당한 공급원이다. 외배엽 조직에는 피부 조직, 뇌 조직 및 기타 신경조직이 포함된다. 중배엽 조직에는 근육, 혈액, 조혈계가 포함된다. 내배엽 조직에는 창자, 위, 췌장, 갑상선 및 소화기계에 수반하는 선(gland)이 포함된다. 특히, 본 발명은 간 줄기세포 및 기타 간 전구세포의 증식방법이다. 본 방법은 분리된 간 줄기세포 및/또는 간 전구세포 및/또는 그의 자손의 세포군을, 클론 증식, 즉 세포 밀도에서 증식을 지지하는 능력의 어떤 조건에 노출시키는 것을 포함한다. 바람직한 실시태양에서는, 이 방법에는 피더 세포층에서의 간 전구세포의 증식을 지지하기 위하여 무혈청의, 호르몬 첨가 규정배지의 사용을 포함한다. 피더 세포의 기능은 복수이며, 영양분의 공급, 접착 표면의 제공 및 간 전구세포의 생존, 증식 및/또는 분화에 필요한 특정 증식 인자 및 세포외 매트릭스를 배지중에 분비하는 것을 포함한다. 또 다른 바람직한 실시태양으로서, 이 방법에는 간 줄기세포 및 간 전구세포의 증식을 지지할 수 있는 세포의 선택이 포함된다. 피더 세포는 파충류, 조류, 갑각류, 어류, 환형동물, 연체동물, 선충류, 곤충, 또는 포유류 , 바람직하기로는 사람으로부터 얻어진다. 또한, 바람직하기로는 피더 세포는 배아 조직으로부터 유래한다. 또한, 바람직하기로는 피더 세포는 배아 간 조직으로부터 유래한다. 또한 피더 세포는 유전자 재조합되어도 좋다. 더욱 더 바람직하기로는 이 방법은 간장 세포를 최적으로 지지하는 피더 세포를 클로닝하는 것을 포함한다. The present invention is a method of proliferation and utilization of stem cells. Tissues of ectoderm, mesoderm, and endoderm origin are included, and various tissues are suitable sources of progenitor cells. Ectodermal tissue includes skin tissue, brain tissue and other nerve tissue. Mesoderm tissue includes muscle, blood and hematopoietic system. Endoderm tissue includes the intestines, stomach, pancreas, thyroid gland and gland accompanying the digestive system. In particular, the present invention is a method of proliferating liver stem cells and other hepatic progenitor cells. The method includes exposing the isolated population of hepatic stem cells and / or hepatic progenitor cells and / or their progeny to certain conditions of clonal proliferation, ie the ability to support proliferation at cell density. In a preferred embodiment, the method involves the use of serum-free, hormone-added media for supporting the proliferation of hepatic progenitor cells in the feeder cell layer. The function of the feeder cells is plural and includes secreting in the medium certain growth factors and extracellular matrix necessary for the supply of nutrients, the provision of adhesive surfaces and the survival, proliferation and / or differentiation of hepatic progenitor cells. As another preferred embodiment, the method includes the selection of cells capable of supporting the proliferation of liver stem cells and hepatic progenitor cells. Feeder cells are obtained from reptiles, birds, crustaceans, fish, circular animals, mollusks, nematodes, insects, or mammals, preferably humans. Also preferably the feeder cells are derived from embryonic tissue. Also preferably the feeder cells are derived from embryonic liver tissue. The feeder cell may also be genetically recombined. Even more preferably this method comprises cloning feeder cells that optimally support hepatic cells.

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친화성에 기초로 한 상호작용, 예를 들면, 어피니티 패닝, 보체와 조합한 면역절제술, 유동 사이토메트리, 원심세정, 분획 원심 등, 간 줄기세포 및 간 전구세포를 분리하는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 분리된 간 줄기세포 및 전구세포는 일부 또는 모든 표현형 마커(고전적 MHC 클래스 I-. ICAM-1+, OX18dull, 알파-페토프로테인+, 또는 알부민+)를 발현하는 능력을 갖는다. 본 발명의 다른 실시 태양으로, 간 전구세포는 덩어리, 콜로니 또는 클라스터로 축적된 세포의 형성으로 특징 지워지는 증식 패턴을 발현한다. Interactions based on affinity, such as affinity panning, immunoresection in combination with complement, flow cytometry, centrifugal washing, fractional centrifugation, etc., any method of separating liver stem cells and hepatic progenitor cells may be used. Can be. Isolated hepatic stem and progenitor cells have the ability to express some or all phenotypic markers (classical MHC class I − . ICAM-1 + , OX18 dull , alpha-fetoprotein + , or albumin + ). In another embodiment of the present invention, hepatic progenitor cells express a proliferation pattern characterized by the formation of cells accumulated in clumps, colonies or clusters.

본 발명의 바람직한 실시 태양으로 간장 세포가 무혈청의 호르몬 첨가 규정배지(HDM)중에서 선택적으로 증식된다. In a preferred embodiment of the present invention, hepatic cells are selectively grown in serum-free hormone supplemented medium (HDM).

HDM의 조성은 40 ng/㎖ EGF, 약 5-10 ㎍/㎖이하의 인슐린, 약 10-6M 덱사메타손 또는 기타 글루코코르티코이드 호르몬, 약 10 ㎍/㎖이하의 철 포화 트란스페린, 약 5×10-2M 니코틴아미드, 약 2％이하의 소혈청 알부민, 약 5×10-4M 2-머캅토에탄올 또는 당량 환원제, 약 8μeq/ℓ 유리 지방산, 약 2×10-2M 글루타민, 약 1×10-6M CuSO4, 약 3×10-8M H2SeO3 및 필요에 따라, 항생물질이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's 배지 및 Ham's F12의 혼합물을 들 수 있으나, 이들에 제한되는 것은 아니며, 영양배지가 포함된다. 항생물질로서는 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 및 기타 상용되는 것 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 당분야에 통상의 지식을 가진 자는 기타 영양 배지, 예를 들면, Ham's F-10, Medium 199, 또는 MCDB 151 및 MCDB 302를 포함한 MCDB계의 하나를 DMEM/F12 대신 사용할 수 있음을 인지한다. 세포 증식의 가장 최소 조건은 호르몬 부재 하에서 피더를 사용하는 것이며; 상기에 기재된 결정적으로 요구되는 호르몬으로서는 글루코코르티코이드, 인슐린, 트랜스페린, 및 전구세포 증식을 위한 호르몬 미토겐을 구성하는 EGF를 들 수 있다. 다른 호르몬 요소가 첨가되어 2차 증식효과를 거둘 수 있으나, 상기 중요한 요건을 대체할 수 없다. 또, 이와 같은 호르몬 조성물의 변경은 당분야에 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 범위 내에서 가능하다. The composition of HDM is 40 ng / ml EGF, up to about 5-10 μg / ml insulin, about 10-6 M dexamethasone or other glucocorticoid hormones, up to about 10 μg / ml iron saturated transferrin, about 5 × 10 − 2 M nicotinamide, less than about 2% bovine serum albumin, about 5 × 10 −4 M 2-mercaptoethanol or equivalent reducing agent, about 8 μeq / L free fatty acid, about 2 × 10 −2 M glutamine, about 1 × 10 -6 M CuSO 4 , about 3 × 10 -8 MH 2 SeO 3 and, if necessary, a mixture of Dulbecco's modified Eagle's medium with antibiotics and Ham's F12, but is not limited to these. Included. Antibiotics include penicillin, streptomycin, gentamicin, and other commonly used ones and mixtures thereof. One of ordinary skill in the art recognizes that other nutritional media, such as Ham's F-10, Medium 199, or one of the MCDB systems, including MCDB 151 and MCDB 302, may be used in place of DMEM / F12. The minimum condition for cell proliferation is to use a feeder in the absence of hormones; The critically required hormones described above include glucocorticoids, insulin, transferrin, and EGF constituting the hormone mitogen for progenitor cell proliferation. Other hormonal elements can be added to achieve a secondary proliferative effect, but cannot replace this important requirement. In addition, such a change in the hormone composition is possible by those skilled in the art within the scope of the present invention.

바람직한 범위는 10-50 ng/㎖ EGF, 2-10 ㎍/㎖ 인슐린, 약 5×10-7 내지 10-6M 덱사메타손(9α-플루오로-16α-메틸-프레드니솔론), 5-20 ㎍/㎖ 철 포화 트랜스페린, 2-8×10-3M 니코틴아미드, 0.05-0.5％ 혈청 알부민, 2-8×10-5M 2-머캅토에탄올, 5-10μeq유리 지방산, 1-3×10-3M 글루타민, 0.5-2×10-6M CuSO4, 1-5×10-8M H2SeO3 및 1-5μM 팔미틴산, 0.1-0.4μM 팔미톨레인산, 0.5-1.2μM 스테아린산, 0.5-2μM 올레인산, 1-5μM 리놀레인산, 및 0.2-0.8μM 리놀레닌산을 포함한다. Preferred ranges are 10-50 ng / ml EGF, 2-10 μg / ml insulin, about 5 × 10 −7 to 10 −6 M dexamethasone (9α-fluoro-16α-methyl-prednisolone), 5-20 μg / ml Iron saturated transferrin, 2-8 × 10 -3 M nicotinamide, 0.05-0.5% serum albumin, 2-8 × 10 -5 M 2-mercaptoethanol, 5-10 μeq free fatty acid, 1-3 × 10 -3 M Glutamine, 0.5-2 × 10-6 M CuSO 4 , 1-5 × 10-8 MH 2 SeO 3 and 1-5 μM palmitic acid, 0.1-0.4 μM palmitoleic acid, 0.5-1.2 μM stearic acid, 0.5-2 μM oleic acid, 1-5 μM linolenic acid, and 0.2-0.8 μM linolenic acid.

본 발명의 무혈청, 호르몬 첨가 규정 배지는 간장 세포의 클론 증식에 적합하다. 이 HDM은 Dulbecco's modified Eagle's medium(DME), Ham's F12, RPMI 1640, William's E 배지 등과 다수의 옵션 중 어느 하나 일 수 있는 기초 배지를 포함한다. 바람직한 실시태양은 Dulbecco's modified Eagle's 배지와 Ham's F12의 1: 1 혼합물(DMEM/F12, 예를 들면 Grand Island, NY의 GIBCO/BRL)이다. 기초 배지는 10 ng/㎖의 바람직한 농도의 상피 성장인자, EGF(예, Collaborative Biomedical Products로부터), 5 ㎍/㎖의 바람직한 농도의 인슐린(예, Sigma로부터), 10-6M 덱사메타손(예, Sigma로부터), 10 ㎍/㎖ 철 포화 트란스페린(예, Sigma로부터), 4.4×10-3M 니코틴아미드(예, Sigma로부터), 0.2％ 혈청 알부민(예, Sigma로부터), 5×10-5M 2-머캅토에탄올(예, Sigma로부터) 7.6μeq/ℓ 유리 지방산 혼합물(2.4 μM 팔미틴산, 0.21 μM 팔미톨레인산, 0.88μM 스테아린산, 1μM 올레인산, 2.7μM 리놀레인산, 및 0.43μM 리놀레닌산), 2×10-3M 글루타민(예, GIBCO/BRL로부터), 1×10-6M CuSO4, 3×10-8M H2SeO3 및 항생물질이 첨가된 것이다. 인슐린 유사 증식 인자(IGFs), 인터루킨(IL)-6계, 간세포 증식 인자(HGFs), 및 섬유아세포 증식 인자(FGFs)를 함유하는(이들에 한정되는 것은 아님) 피더 세포에 의해 분비되는 증식 인자는 배양 배지에 첨가되어 피더 효과를 증가시키나, 단일 또는 각종 조합으로 첨가될 때 피더 효과를 대체하는 것은 발견되지 않았으며, 이는 피더 세포가 다른 시그널을 생성하는 것을 의미하나 이들 증식 인자가 조합 또는 단독으로 요구되는 지는 확인되지 않았다. The serum-free, hormone-added dietary medium of the present invention is suitable for clonal proliferation of hepatic cells. The HDM includes Dulbecco's modified Eagle's medium (DME), Ham's F12, RPMI 1640, William's E medium, and basal medium, which can be any of a number of options. A preferred embodiment is a 1: 1 mixture of Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's F12 (DMEM / F12, eg GIBCO / BRL, Grand Island, NY). Basal medium contains 10 ng / ml of the preferred concentration of epidermal growth factor, EGF (eg from Collaborative Biomedical Products), 5 μg / ml of preferred concentration of insulin (eg from Sigma), 10-6 M dexamethasone (eg Sigma) ), 10 μg / ml iron saturated transferrin (eg from Sigma), 4.4 × 10 −3 M nicotinamide (eg from Sigma), 0.2% serum albumin (eg from Sigma), 5 × 10 −5 M 2-mercaptoethanol (eg from Sigma) 7.6 μeq / L free fatty acid mixture (2.4 μM palmitic acid, 0.21 μM palmitoleic acid, 0.88 μM stearic acid, 1 μM oleic acid, 2.7 μM linolenic acid, and 0.43 μM linolenic acid) , 2 × 10 −3 M glutamine (eg from GIBCO / BRL), 1 × 10 −6 M CuSO 4 , 3 × 10 −8 MH 2 SeO 3, and antibiotics. Growth factors secreted by feeder cells containing, but not limited to, insulin-like growth factors (IGFs), interleukin (IL) -6, hepatocyte growth factors (HGFs), and fibroblast growth factors (FGFs) Is added to the culture medium to increase the feeder effect, but it was not found to replace the feeder effect when added in single or various combinations, which means that the feeder cells produce different signals but these proliferation factors are combined or alone It is not confirmed whether it is required.

본 발명의 또 다른 실시 태양은 간 전구세포가 단일 전구세포로부터 증식, 즉, 세포가 클로닝되는 것이다. 콜로니에서 세포를 증식시키는 것은 단일 세포로부터 유래된 세포의 증식과 묵시적 및 명시적으로 정의되는 클론 증식과 반드시 동등한 것은 아니다. 한계 희석법으로 불리는, 전구세포를 세포 배양 플레이트 웰당 하나의 세포 또는 더 적게 희석하는 방법을 포함한, 당분야에 알려진 각종의 클로닝 방법의 임의의 것이 적당하다. 마찬가지로, 전구세포는 클로닝 링, 선택적 박리, 미립자 상에서 희석 배양, 플로우 사이토메트리를 사용하는 단세포 소오트, 마이크로피펫 또는 광학 트위저를 사용한 각각의 세포의 선택 및 한천을 사용한 클로닝일 수 있다.Another embodiment of the invention is that hepatic progenitor cells proliferate from a single progenitor cell, ie, the cells are cloned. Proliferation of cells in colonies is not necessarily equivalent to the proliferation of cells derived from a single cell and clone proliferation, implied and explicitly defined. Any of the various cloning methods known in the art, including the method of diluting one cell or less per cell culture plate well, called limit dilution, is suitable. Likewise, progenitor cells can be cloning rings, selective exfoliation, dilution culture on particulates, selection of individual cells using flow cytometry, selection of individual cells using micropipettes or optical tweezers and cloning with agar.

본 발명의 다른 실시태양은 클로닝된 전구세포의 다수가 유사분열(mitosis)될 수 있다. 전구세포는 적어도 1회의 유사 분열할 수 있는 것이 바람직하며, 적어도 10회의 분열할 수 있는 것이 바람직하다. In another embodiment of the present invention, many of the cloned progenitor cells may be mitosis. Progenitor cells are preferably capable of at least one mitosis, preferably at least 10 times.

본 발명의 또 다른 실시태양은 간 전구세포 및 그의 자손은 피더 세포의 대사 및 생합성 생산물을 첨가한 배지에서 증식하는 것이다. 첨가는 조정배지 즉, 살아있는 피더 세포가 미리 인큐베이트된 배지의 형태이어도 좋다. 바람직하기로는 첨가는 피더 세포의 조정배지로부터, 간 전구 및 그의 자손의 증식을 지지하여 증가하는 단백질, 펩티드, 리피드, 탄수화물 및 대사 조절 인자를 함유하는 인자를 분리하는 형태이어도 좋다. 단백질은 세포외 매트릭스의 가용성 및 불용성 성분, 및 상피 성장 인자 및 인슐린 유사 증식 인자를 함유하는 증식 인자를 함유할 수 있다.Another embodiment of the invention is that hepatic progenitor cells and their progeny proliferate in medium to which the metabolic and biosynthetic products of feeder cells are added. The addition may be in the form of a control medium, ie, a medium in which live feeder cells have been previously incubated. Preferably, the addition may be in the form of isolating a factor containing protein, peptides, lipids, carbohydrates and metabolic regulatory factors that increase and support the proliferation of the hepatic progenitor and its progeny from the media of feeder cells. The protein may contain soluble and insoluble components of the extracellular matrix and proliferative factors containing epidermal growth factor and insulin like proliferative factor.

보다 바람직하기로는, 배아 또는 성체세포 또는 기타 적당한 세포인 피더 세포의 층을 사용하여 간장 세포는 배양에서 선택적으로 증식한다. 하나의 실시 태양으로, 피더 세포는 기질 세포 또는 섬유아세포이다. 섬유아세포 또는 기타 적당한 세포는 예를 들면, 트랜스펙션에 의해 유전자 재조합되어 있어도 좋다. 섬유아세포 또는 기타 적당한 세포는 사람, 비인간 영장류, 돼지, 개, 토끼, 랫트 또는 마우스 중배엽 세포 및 기타 포유류 및 조류 중배엽 세포가 적당하다. 더욱이, 섬유아세포는 간 전구세포를 지지하는 능력 때문에 클로닝하여 선별한다. More preferably, hepatic cells proliferate selectively in culture using a layer of feeder cells that are embryonic or adult cells or other suitable cells. In one embodiment, the feeder cells are stromal cells or fibroblasts. Fibroblasts or other suitable cells may be genetically recombined, for example, by transfection. Fibroblasts or other suitable cells are suitable for human, non-human primates, pigs, dogs, rabbits, rats or mouse mesoderm cells and other mammalian and avian mesoderm cells. Moreover, fibroblasts are cloned and selected because of their ability to support hepatic progenitor cells.

본 발명의 바람직한 실시태양은 분리된 간 전구세포가 상피 성장 인자(EGF) 또는 기탄 분화 시그널의 선택적 사용 또는 그의 결여에 의해 간세포 또는 담관 세포계로 운명지어진다. In a preferred embodiment of the present invention, isolated hepatic progenitor cells are destined for hepatocytes or bile duct cell systems by the selective use or lack of epidermal growth factor (EGF) or air differentiation signals.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양은 분리된 줄기 세포 및 기타 간 전구 세포를 체외 간 보조 장치로서 이용할 수 있는 인공 간장의 성분으로 이용할 수 있다. 본 발명의 더욱 바람직한 실시태양은 분리된 간 전구세포 및 그의 자손를 함유하는 인공 간장을 간 기능부전증이나 간부전으로 고통 받는 환자의 생명을 지지하는 데 사용하는 것이다.Another preferred embodiment of the present invention can utilize isolated stem cells and other hepatic progenitor cells as components of an artificial liver that can be used as an extracorporeal liver aid. A more preferred embodiment of the invention is the use of artificial livers containing isolated hepatic progenitor cells and their progeny to support the life of patients suffering from hepatic insufficiency or hepatic insufficiency.

[ 실시예 ]EXAMPLE

다음 실시예는 본 발명을 예시하는 것이나, 본 발명은 이들 구체적인 실시예에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 이들 실시예로부터 본 발명을 실행하는 수단을 얻을 수 있는 것으로 생각된다. 당업자는 본 발명의 범위에 포함되는 많은 다른 실시 태양을 인지할 것이다.The following examples illustrate the invention, but the invention is not limited to these specific examples. It is contemplated that those skilled in the art can obtain means for practicing the present invention from these examples. Those skilled in the art will recognize many other embodiments that fall within the scope of the invention.

실시예 1. 간 줄기세포와 간 전구세포의 조제 및 분석Example 1 Preparation and Analysis of Liver Stem Cells and Liver Progenitor Cells

랫트.
찰스 리버 브리딩 래보러토리(Wilmington, MA)에서 임신한 피셔344 랫트를 입수했다. 시각을 설정한 임신에는 오후에 동물을 일제히 플러그가 관찰된 아침을 0일로 한다. 성체의 간 세포에는 수컷 피셔344 랫트(200-250g)를 사용한다. Rat .
A pregnant Fisher 344 rat was obtained from the Charles River Breeding Laboratories (Wilmington, Mass.). In the pregnancy with the time set, the morning when the plugs are observed at the same time in the afternoon is 0 days. Male Fischer344 rats (200-250 g) are used for adult liver cells.

간장 세포주의 확립. Establishment of Hepatic Cell Lines .

임신 15일의 태아의 간을 조제한다. 단세포 현탁액은 0.05％트립신과 0.5mM EDTA 또는 10units/㎖ 서몰리신(Sigma, St. Louis, MO)과 100units/㎖ 디옥시리보뉴클레아제 Ⅰ(Sigma)에서 간장을 37℃에서 인큐베이트하여 얻었다. 세포는 피콜-파크(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)에 가하고, 15분 동안 450g로 밀도구배 원심을 행하였다. 저부의 획분 세포를 각각 th1120-3과 rter6 또는 rhe14321에 대하여 17mg/㎖ 콜라겐 타입Ⅳ(Collaborative Biomedical Products, Bedford, MA)이나 12㎍/㎖ 라미닌(Collaborative Biomedical Products)으로 코팅된 조직 배양접시에 접종한다. 무혈청 호르몬 첨가 배양배지, HDM은 Dulbecco's modified Eagle's 배지와 Ham's F12(DMEM/F12, GIBCO/BRL, Grand Island, New York)의 1:1혼합물이다. 이 혼합액에 20ng/㎖ EGF(Collaborative Biomedical Products), 5㎍/㎖ 인슐린(Sigma), 10-7M 덱사메타손(Sigma), 105㎍/㎖의 철이 포화된 트랜스페린(Sigma), 4.4×10-3M 니코틴아미드(Sigma), 0.2％ 소혈청알부민(Sigma), 5×10-5M 2-머캅토에탄올(Sigma), 7.6μeq/l 유리지방산, 2×10-3M글루타민(GIBCO/BRL), 1×10-6M CuSO4, 3×10-8M H2SeO3와 항생제를 첨가한다. 위의 각각의 농도는 배지중의 최종농도이다. 배양 4주 후에 마이토마이신 C를 처리한 STO 마우스 배아섬유아세포주(American Type Culture Collection, Rockville, MD)의 피더 층에 트립신이 처리된 세포를 배양한다. Th1120-3, rter6 와 rhe14321은 태아 간장 세포의 3개의 독립적인 조제물에서 클로닝되고, HDM배양액에 STO 피더 세포 상에서 유지된다. 세포주 확립 후, 모든 배양에 관하여 EGF농도는 10ng/㎖로 저하시켰다. The liver of the fetus on the 15th day of pregnancy is prepared. Single cell suspensions were obtained by incubating the liver at 37 ° C. in 0.05% trypsin and 0.5 mM EDTA or 10 units / ml thermolysine (Sigma, St. Louis, MO) and 100 units / ml deoxyribonuclease I (Sigma). Cells were added to Ficoll-Park (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) and density gradient centrifuged at 450 g for 15 minutes. Bottom fractional cells are seeded in a tissue culture plate coated with 17 mg / ml collagen type IV (Collaborative Biomedical Products, Bedford, Mass.) Or 12 μg / ml laminin (Collaborative Biomedical Products) for th1120-3 and rter6 or rhe14321, respectively. . Serum-free culture medium, HDM, is a 1: 1 mixture of Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's F12 (DMEM / F12, GIBCO / BRL, Grand Island, New York). In this mixture, 20ng / ml EGF (Collaborative Biomedical Products), 5µg / ml Insulin (Sigma), 10 -7 M dexamethasone (Sigma), 105 µg / ml iron-saturated transferrin (Sigma), 4.4 x 10 -3 M Nicotinamide (Sigma), 0.2% bovine serum albumin (Sigma), 5 × 10 −5 M 2-mercaptoethanol (Sigma), 7.6 μeq / l free fatty acid, 2 × 10 −3 M glutamine (GIBCO / BRL), 1 × 10 −6 M CuSO 4 , 3 × 10 −8 MH 2 SeO 3, and antibiotics are added. Each concentration above is the final concentration in the medium. After 4 weeks of culture, trypsin-treated cells were cultured in the feeder layer of STO mouse embryonic fibroblast line (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Th1120-3, rter6 and rhe14321 are cloned in three independent preparations of fetal hepatic cells and maintained on STO feeder cells in HDM culture. After cell line establishment, the EGF concentration was lowered to 10 ng / ml for all cultures.

세포 접착 앗세이법. Cell adhesion assay.

피브로넥틴(Collaborative Biomedical Products), 라미닌 및 IV형 콜라겐에 대한 접착은 이들 단백질을 0.3∼10 ㎍/㎖로 코팅한 96웰 마이크로타이터 플레이트(Corning, Cambridge MA)를 사용하여 평가한다. 200g에서 15분간 퍼콜(Pharmacia Biotech) 밀도구배 원심에 의해 STO세포를 제거한 후, 각 웰중에서 3×104세포의 간장 세포주 th1120-3, rter6 및 rhe14321을 HDM을 사용하여 10시간 배양한다. 부유 세포를 제거하기 위해 2회 린스한 후, 테트라졸리움염 WST-1(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)을 첨가하여 생존 가능한 접착세포의 수를 측정한다. 4시간 후, 제조원의 프로토콜에 따라 흡광도를 결정한다.Adhesion to fibronectin (Collaborative Biomedical Products), laminin and type IV collagen is assessed using 96-well microtiter plates (Corning, Cambridge MA) coated with 0.3-10 μg / ml of these proteins. After removing STO cells by percol (Pharmacia Biotech) density gradient centrifugation at 200 g for 15 minutes, hepatic cell lines th1120-3, rter6 and rhe14321 of 3 × 10 4 cells in each well were incubated for 10 hours using HDM. After rinsing twice to remove floating cells, tetrazolium salt WST-1 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) is added to determine the number of viable adherent cells. After 4 hours, the absorbance is determined according to the manufacturer's protocol.

STO 아계통(sublines)STO sublines

ATCC에서 얻은 STO 100개의 세포를 10％의 열로 불활성화한 태아 소혈청, 2×10-3M 글루타민, 5×10-5M 2-머캅토에탄올 및 항생제를 첨가한 DMEM/F12에서 100mm 배양접시에 7일간 배양한다. 세포 형태와 증식속도에 따라 다시 해석하기 위하여 4개의 서브클론을 선택한다. rter6의 CFA를 4개의 서브클론에서 행하나, 그들 중의 하나인 STO6는 마이토마이신C 처리 후에는 배양접시에 접착하지 않았다. 또 다른 서브클론 STO5를 월터와 엘리자홀 의학연구소의 J. M. 아담스박사가 제공한 pEF-Hlx-MC1neo 또는 pEF-MC1neo로 트랜스펙션시켰다. Nde Ⅰ 부위에서 선상으로 한 플라스미드를 DOSPER 리포솜 트랜스펙션 시약(Boehringer Mannheim)에 의해 세포 중에 도입한다. G418 선택 후, 6개의 클론이 분리되었다. 각 3개의 클론이 CFA로 분석되었다.100 mm culture dish in DMEM / F12 with fetal bovine serum, 2 × 10 −3 M glutamine, 5 × 10 −5 M 2-mercaptoethanol and antibiotics incubated with 10% heat inactivated STO cells from ATCC Incubate for 7 days. Four subclones are selected for reinterpretation based on cell type and growth rate. CFA of rter6 was carried out in four subclones, but one of them, STO6, did not adhere to the culture dish after mitomycin C treatment. Another subclone STO5 was transfected with pEF-Hlx-MC1neo or pEF-MC1neo provided by Dr. JM Adams of Walter and Elisahole Medical Institute. Plasmids linear at the Nde I site are introduced into the cells by DOSPER liposome transfection reagent (Boehringer Mannheim). After G418 selection, six clones were isolated. Each three clones were analyzed by CFA.

콜로니의 면역조직화학적 염색
배양접시를 메탄올-아세톤(1:1)으로 실온에서 2분간 고정한 후 20％ 염소 혈청이 함유되어 있는 Hanks Balanced Salt Solution(HBSS)으로 4℃에서 린스하고 블로킹한다. 알파-페토프로테인과 알부민의 이중면역 조직화학을 위해서, 플레이트에 항-랫트 알부민 항체(ICN 바이오메디칼, 코스타 메사, CA)로 처리 후에 텍사스 레드(Texas Red)-결합 항-토끼 IgG(Vector laboratories, Burlingame, CA) 및 FITC-결합 항랫트 알파-페토프로테인 폴리클론 항체(Nordic Immunology, Tilburg, Netherlands)와 인큐베이트한다. 알부민과 CK19의 이중표지에는 항 알파-페토프로테인 항체 대신에 항-CK19 단일클론항체(Amersham, Buckinghamshire, England) 및 FITC-결합 항-마우스 IgG(Caltag, Burlingame, CA)가 사용된다. Immunohistochemical Staining of Colonies
The plate is fixed with methanol-acetone (1: 1) at room temperature for 2 minutes, then rinsed and blocked at 4 ° C. with Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) containing 20% goat serum. For dual immunohistochemistry of alpha-fetoprotein and albumin, plates were treated with anti-rat albumin antibodies (ICN biomedical, Costa Mesa, CA) followed by Texas Red-binding anti-rabbit IgG (Vector laboratories, Burlingame, CA) and FITC-binding anti-rat alpha-fetoprotein polyclonal antibodies (Nordic Immunology, Tilburg, Netherlands). Anti-CK19 monoclonal antibodies (Amersham, Buckinghamshire, England) and FITC-binding anti-mouse IgG (Caltag, Burlingame, CA) are used for the double label of albumin and CK19.

E13의 태아 간의 분리
태아 간을 10mM HEPES, 0.8mM MgSO4와 1mM EGTA(pH7.4)를 첨가한 Ca++가 없는 빙냉 HBSS에서 절개한다. 간장은 10mM HEPES, 0.8mM MgSO4 및 1mM CaCl2로 조제된 HBSS중의 0.2％ Ⅳ형 콜라게나아제(Sigma)와 16.5 units/㎖ 서몰리신(Sigma)을 사용하여 분쇄한다. 37℃에서 10분간 인큐베이트한 후, 세포 현탁액을 0.025％ 트립신과 2.5mM EDTA(Sigma)를 10분간 소화한다. 그런 다음, 1mg/㎖ 트립신 저해제(Sigma)를 첨가하여 트립신의 작용을 억제한다. 마지막으로 세포를 200units/㎖ 디옥시리보뉴클레아제 Ⅰ(Sigma)로 처리한다. 모든 실험에서 하나의 간에서 3∼5 ×105세포가 얻어진다. Isolation between fetuses of E13
Fetal livers are excised in Ca ++ free ice cold HBSS with 10 mM HEPES, 0.8 mM MgSO 4 and 1 mM EGTA (pH 7.4). Soy sauce is ground using 0.2% type IV collagenase (Sigma) and 16.5 units / ml thermolysine (Sigma) in HBSS formulated with 10 mM HEPES, 0.8 mM MgSO 4 and 1 mM CaCl 2 . After 10 minutes incubation at 37 ° C., the cell suspension is digested with 0.025% trypsin and 2.5 mM EDTA (Sigma) for 10 minutes. Then, 1 mg / ml trypsin inhibitor (Sigma) is added to inhibit the action of trypsin. Finally the cells are treated with 200 units / ml deoxyribonuclease I (Sigma). In all experiments 3-5 × 10 5 cells are obtained in one liver.

성체 간 세포(adult liver cell)의 분리
간 세포를 분리하기 위하여 2단계의 간장 관류법이 이용된다. 관류 후, 세포를 50g에서 1분간, 2회 원심분리하여 커다란 실질 세포를 농축한다. 생존도는 트리판블루배제에 의한 측정에 의하면 ＞90％이다. Isolation of Adult Liver Cells
Two stages of hepatic perfusion are used to separate liver cells. After perfusion, cells are centrifuged twice at 50 g for 1 minute to concentrate large parenchymal cells. Survival is> 90% according to the measurement by trypan blue exclusion.

유동 사이토메트리 분석
세포를 FACScan(Becton-Dickinson, Mountain View, CA)으로 분석하고, Moflow Flow Cytometer(Cytomation, Fort Collins, CO)를 사용하여 소오트한다. E13태아 간에서 얻은 세포 현탁액을 비특이적인 항체결합을 예방하기 위해서, 빙상에서 20％ 염소혈청(GIBCO/BRL)과 1％ 경골류(硬骨類) 젤라틴(Sigma)를 함유하는 HBSS와 인큐베이트한다. 린스한 후에 세포를 FITC가 결합된 항랫트 RT1Aa,b,1항체 B5(Pharmamingen, San Diego, CA) 및 PE 결합 항랫트 ICAM-1 항체 1A29(Pharmingen)로 현탁한다. 일부 실험에서는 삼색 염색을 위해, 세포를 바이오티닐화 항-랫트 단형성 MHC classⅠ항체 OX18(Pharmingen)로 염색한 후, 스트렙트아비딘-레드670(GIBCO/BRL)에 의한 제 2 염색을 했다. 모든 염색은 10mM HEPES, 0.8mM MgSO4, 0.2mM EGTA 및 0.2％ BSA(pH7.4)를 함유하고, Ca++ 프리빙냉 HBSS를 사용하여 행한다. 확립된 3개의 세포주를 트립신을 처리하고, 퍼콜 밀도구배 원심분리하여 피더세포를 제거한다. 랫트의 간암세포주 FTO-2B와 랫트 간 상피세포주 WB-F344 및 성체 간 세포를 태아 간장 세포주와 비교하기 위해서 염색한다. 세포주들은 각각 포아니에 박사(Dr. R. E. K. Fournier, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) 및 소우 박사(Dr. M. -S. Tsao, University of North Carolina Chapel Hill, NC)가 증여하였다. 세포를 블록킹하고, FITC 결합 B5, OX18, PE 결합 1A29 또는 항 FITC 결합 랫트 인테그린 β1 항체 Ha2/5(Pharmingen)로 염색한다. OX18에는 FITC 결합 항 마우스 IgG를 사용한다. 마우스 세포군을 배제하기 위해서, 3개의 태아 간장 세포주의 세포현탁액을 바이오티닐화 항 마우스 CD98로 염색한 후, 스트렙타비딘-레드 670 및 항-랫트 모노클로날 항에 의한 제2의 염색을 한다.
세포마다 다른 상대수로 각종 항원이 발현된다. 실질적인 사용법에서는 특정 항원의 발현정도는 발현 없음, 낮은 레벨의 발현, 많은 항원에 있어 통상의 발현 레벨 및 높은 레벨의 발현이 일어날 수 있다. 이 사용법에서는 "낮은(low)"란 용어는 약한(weak) 또는 무딘(dull)이란 용어와 호환적으로 사용된다. 발현의 정도를 더욱 상세하게 기술할 수 있지만, 많은 목적에는 이들 4개의 레벨로 충분하다. 예를 들어 유동 사이토메트리에 의한 항원발현의 측정은 항원발현에 대한 연속적인 범위를 제공하는 것은 명백하다. Flow Cytometry Analysis
Cells are analyzed by FACScan (Becton-Dickinson, Mountain View, Calif.) And sorted using a Moflow Flow Cytometer (Cytomation, Fort Collins, Co.). Cell suspensions obtained from E13 fetal livers are incubated with HBSS containing 20% goat serum (GIBCO / BRL) and 1% tibia gelatin (Sigma) on ice to prevent nonspecific antibody binding. After rinsing the cells are suspended with FITC bound anti-rat RT1A a, b, 1 antibody B5 (Pharmamingen, San Diego, Calif.) And PE binding anti-rat ICAM-1 antibody 1A29 (Pharmingen). In some experiments, for tricolor staining, cells were stained with biotinylated anti-rat monoclonal MHC class I antibody OX18 (Pharmingen) followed by a second stain with streptavidin-red670 (GIBCO / BRL). All staining contains 10 mM HEPES, 0.8 mM MgSO 4, 0.2 mM EGTA and 0.2% BSA (pH 7.4) and is done using Ca ++ freezing cold HBSS. Three established cell lines were trypsinized and percol density gradient centrifuged to remove feeder cells. Rat liver cancer cell line FTO-2B and rat liver epithelial cell line WB-F344 and adult liver cells are stained for comparison with fetal liver cell line. Cell lines were donated by Dr. Poane (Dr. REK Fournier, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA) and Dr. Sow (Dr. M.-S. Tsao, University of North Carolina Chapel Hill, NC), respectively. The cells are blocked and stained with FITC binding B5, OX18, PE binding 1A29 or anti-FITC binding rat integrin β1 antibody Ha2 / 5 (Pharmingen). OX18 uses FITC binding anti mouse IgG. To exclude the mouse cell population, cell suspensions of three fetal hepatic cell lines are stained with biotinylated anti mouse CD98 followed by a second stain with streptavidin-red 670 and anti-rat monoclonal term.
Different antigens are expressed in different numbers of cells. In practical use, the expression level of specific antigens may be absent, low levels of expression, normal and high levels of expression may occur for many antigens. In this usage, the term "low" is used interchangeably with the terms weak or dull. Although the degree of expression can be described in more detail, these four levels are sufficient for many purposes. For example, it is clear that the measurement of antigen expression by flow cytometry provides a continuous range for antigen expression.

간장 세포주, 소오트한 세포, 성체 간 세포를 위한 CFA
간장 세포주는 세포주의 유지에 사용된 것과 동일한 HDM을 사용하여 마이토마이신 C가 처리된 STO 피더 층에 9.6cm2 당 500개의 세포를 3개의 플레이트에 파종한다. 세포를 트립신 처리하여 퍼콜 밀도 구배 원심분리에 의해 피더세포를 제거한다. 배양액은 2일마다 배지를 교환하여 10∼14일 동안 배양한다. 그런 다음, 알파-페토프로테인과 알부민의 이중면역 형광염색을 한다. 웰당 100개의 콜로니를 콜로니형태, P 또는 F형 및 알파-페토프로테인과 알부민의 발현에 대해 분석한다. 콜로니는 Diff-Quick(Baxter, McGaw Park, IL)을 사용하여 염색하여 각 웰의 콜로니 수를 계측한다. 초대(primary) 소오트한 세포 및 성체 간 세포의 CFA에서는, 전술한 바와 같이 파종하여 세포수를 변경한다. 또 다른 조그만 변경으로서, 배양기간을 14∼17일 사이로 연장하고 덱사메타손의 농도를 10-6M로 높인다. 모든 다른 과정은 위에 언급된 것처럼 행한다. 성체 간 세포의 CFA에서는 조제 후, 세포 현탁액으로부터 소수의 간 세포 크럼프가 제거되지 않는다. 따라서, 크럼프로부터 불확정수의 콜로니가 생성될 가능성이 있다. 소오트된 세포에서 담즙분화의 CFA에서는 콜로니의 알부민 및 CK19의 이중면역 형광염색이 EGF 존재하 또는 부재하에서 배양 5일째에 행한다. 배양 5일째에 CK19+ 세포를 1개를 넘게 가진 콜로니는 CK19+ 콜로니로 계산된다. 10일 및 15일째에 2개의 CK19+ 세포의 클러스터를 다수 함유하는 콜로니, 또는 세개를 넘는 CK19+ 세포의 클러스터를 1개 포함하는 콜로니는 CK19+ 콜로니로서 계산한다. 각 웰당 약 100개의 콜로니가 측정된다. 각각의 포인트는 삼중으로 염색된 배지에서 나온 평균±SD를 나타낸다. CFA for hepatic cell line, sorted cell, adult liver cell
Hepatic cell lines are seeded in three plates with 500 cells per 9.6 cm 2 in the STO feeder layer treated with mitomycin C using the same HDM used for maintenance of the cell line. Cells are trypsinized to remove feeder cells by Percol density gradient centrifugation. The culture is incubated for 10-14 days by changing the medium every two days. Then, double-immunofluorescence staining of alpha-fetoprotein and albumin is carried out. 100 colonies per well are analyzed for colony form, P or F and expression of alpha-fetoprotein and albumin. Colonies were stained using Diff-Quick (Baxter, McGaw Park, IL) to count the number of colonies in each well. In CFAs of primary and adult liver cells, seeding is changed as described above to change the number of cells. As another minor change, the incubation period is extended between 14 and 17 days and the concentration of dexamethasone is increased to 10 −6 M. All other processes are done as mentioned above. In CFA of adult liver cells, few preparations of liver cell clumps are not removed from the cell suspension after preparation. Therefore, there is a possibility of generating an indeterminate colony from the clump. In CFA of chole differentiation in sorted cells, double-immune fluorescence staining of albumin and CK19 in colonies is performed on day 5 of culture with or without EGF. Colonies with more than one CK19 + cell on day 5 of culture are counted as CK19 + colonies. Colonies containing multiple clusters of two CK19 + cells on day 10 and 15, or colonies containing one cluster of more than three CK19 + cells, are counted as CK19 + colonies. About 100 colonies are measured per well. Each point represents the mean ± SD from the triple stained medium.

실시예Example 2. 호르몬 첨가 규정배지를 이용한, 마우스 배아세포의 피더를 이용한 태아 랫트 간장 세포주의 생성 및 특징2. Production and Characterization of Fetal Rat Hepatic Cell Lines Using a Mouse Embryonic Cell Feeder Using Hormone Supplemented Medium

어느 정도의 기간에서 태아 간장 세포가 생체 외에서 증식하여 자손을 생산시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 랫트 E15 간장 세포의 단순한 장기 배양을 시도해 보았다. 조혈단핵세포를 제거하기 위해 밀도구배 원심분리한 후, 태아 간 세포(fetal liver cell)를 IV형 콜라겐 또는 라미닌으로 코팅한 배양접시 및 HDM(실시예 6.1 참고)를 사용하여 배양한다. 세포가 4주 이상 동안 생존한다. 그러나 새로운 IV형 콜라겐 및 라미닌이 코팅된 배양접시에서의 2차 배양에서는 더 이상 증식하지 않는다. 마이토마이신C를 처리한 STO 배아 마우스 섬유아세포주를 2차 배양에서 피더 층으로 사용하면, 많은 세포 덩어리가 증식한다. 최종적으로 4개의 독립된 실험에서 몇 가지 안정적인 간장 세포주가 확립된다.To determine how long fetal hepatic cells can proliferate in vitro to produce offspring, a simple long-term culture of rat E15 hepatic cells was attempted. After density gradient centrifugation to remove hematopoietic mononuclear cells, fetal liver cells are cultured using a culture plate coated with type IV collagen or laminin and HDM (see Example 6.1). The cells survive for at least 4 weeks. However, secondary cultures in new type IV collagen and laminin coated culture dishes no longer proliferate. When the STO embryonic mouse fibroblast line treated with mitomycin C is used as the feeder layer in the secondary culture, many cell masses multiply. Finally, several stable hepatic cell lines are established in four independent experiments.

알파-페토프로테인 및 알부민의 면역조직 분석은, 세포주의 클로닝 전에 연속적으로 증식하는 세포군에서 행하여진다. 알파-페토프로테인 및 알부민의 양쪽 단백질은 세포군이 간세포계 기원인 것을 확인하기 위해 마커로 사용한다. 세포 더미를 형성하려는 경향이 있는 세포군은 P-콜로니라고 하고, 이는 알파-페토프로테인 및 알부민을 강하게 발현한다. 반면에 F-콜로니라고 불리는 평평한 단층은 알파-페토프로테인의 발현이 저하하고, 알부민을 발현하지 않았다. 배아 마우스 섬유아세포, STO는 어떠한 항체에 대한 반응도 보이지 않는다. 더욱이, 해석하기 위해, P형 또는 F형 이라는 형태적인 기준에 의해, 독립적인 실험에서, 3개의 클로닝된 간장 세포주가 선택된다. Rhe14321(도 1a)는 주로 작은 세포로 채워진 P형 콜로니로 구성되어 있는 반면, th1120-3(도 1c)는 F형 콜로니의 평평한 단일층을 형성한다. Rter6(도 1b)는 이 2개의 표현형의 중간이다. 흥미롭게도 rter6의 불균일성은 평평한 콜로니의 3회 연속 클로닝 후에도 관찰되었다. Rhe 14321 및 rter6의 단일세포 유래 콜로니의 불균일성을 알아보기 위해서, 9.6cm2(6-웰 플레이트의 1개의 웰)당 500개의 세포 밀도로 파종하고, 세포를 STO 섬유아세포상에서 10∼14일간 배양했다. 그런 다음, 콜로니의 형태 및 알파-페토프로테인 및 알부민의 발현의 해석을 행했다. 도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e와 2f에서 그 결과를 나타낸다. 세포주, rhe14321(도 2b)과 rter6(도 2c)의 세포주 및 클로닝하기 전의 최초의 세포군에서 거의 모든 P형 콜로니는 강한 알파-페토프로테인을 발현하는 반면에, 세포의 F형 콜로니는 발현하지 않았다.Immunohistochemical analysis of alpha-fetoprotein and albumin is performed on a group of cells that continuously proliferate before cloning the cell line. Both proteins of alpha-fetoprotein and albumin are used as markers to confirm that the cell population is of hepatic origin. The population of cells that tend to form cell stacks is called P-colony, which strongly expresses alpha-fetoprotein and albumin. On the other hand, a flat monolayer called F-colony reduced the expression of alpha-fetoprotein and did not express albumin. Embryonic mouse fibroblasts, STO, show no response to any antibodies. Moreover, for interpretation, three cloned hepatic cell lines are selected in independent experiments by a morphological criterion of type P or F. Rhe14321 (FIG. 1A) consists mainly of P-type colonies filled with small cells, while th1120-3 (FIG. 1C) forms a flat monolayer of F-type colonies. Rter6 (FIG. 1B) is the middle of these two phenotypes. Interestingly, the heterogeneity of rter6 was observed even after three consecutive cloning of flat colonies. To determine the heterogeneity of single cell-derived colonies of Rhe 14321 and rter6, 500 cells per 9.6 cm 2 (one well of a six-well plate) were seeded and cells were cultured on STO fibroblasts for 10-14 days. . Then, the morphology of the colonies and the expression of alpha-fetoprotein and albumin were analyzed. The results are shown in Figures 2a, 2b, 2c, 2d, 2e and 2f. Almost all P-type colonies in the cell lines, rhe14321 (FIG. 2B) and rter6 (FIG. 2C), and the initial cell population before cloning, expressed strong alpha-fetoprotein, whereas no F-type colonies of cells.

게다가, 알파-페토프로테인과 알부민 양쪽의 강한 발현은 P형 콜로니에서만 관찰된다. 클로닝된 간장 세포주의 형태적 차이는 P형 콜로니(도 2b와 2의c)비율과 상관하고 있다. Rter6와 rhe14321의 CFA에서 P형 콜로니의 비율은 각각 33.3％(±8.6％ SD)와 65.7％(±4.0％SD)이다. 1웰당 총콜로니수를 세어 클론 증식효율(콜로니 효율)을 계산한다. Rter6 및 rhe14321의 효율은 각각 45.7％(±1.3％ SD)와 36.4％(±1.1％ SD)이다. Th1120-3세포는 측면 경계에 따라 서로 단단하게 접착하고 있어 단세포액의 조제를 매우 어렵게 한다. 그러나 th1120-3세포는 쌓여서 클러스터를 형성하지 않는다. In addition, strong expression of both alpha-fetoprotein and albumin was observed only in P-type colonies. Morphological differences in cloned hepatic cell lines correlated with P-type colony (FIGS. 2B and 2C) ratios. The proportions of P-type colonies in the CFAs of Rter6 and rhe14321 were 33.3% (± 8.6% SD) and 65.7% (± 4.0% SD), respectively. Count the total colonies per well to calculate the clone growth efficiency (colony efficiency). The efficiencies of Rter6 and rhe14321 are 45.7% (± 1.3% SD) and 36.4% (± 1.1% SD), respectively. Th1120-3 cells adhere firmly to each other along the lateral boundaries, making preparation of monocellular fluids very difficult. However, th1120-3 cells do not accumulate and form clusters.

마우스 간 세포의 라미닌, Ⅳ형 콜라겐 및 피브로넥틴과 같은 세포외 메트릭스(ECM) 단백질에 대한 접착은 발생단계에 따라 다르기 때문에 각 세포주가 특정의 ECM 성분에 접착할 때의 선택성을 다음에 조사하였다. 성체 간 세포에서의 소견과 동일하게 Ⅳ형 콜라겐은 이는 마우스간장 세포가 접착하는 것은 발달단계마다 다르기 때문이다. 타입 Ⅳ이 성체 간장 세포의 조사결과와 유사하게 thl120-3의 접착에 가장 효과적이나(도 1c), rter6(도 1b)와 rhe14321(도 1a)에서는 그 정도는 아니었다. 라미닌은 rhe14321(도 1a)의 접착에 가장 유효한 기질이다. 이러한 선택성은 마우스 태아 간 세포의 초대배양과 동일하다. 요약하면, P형 콜로니에서의 알파-페토프로테인 및 알부민의 보존된 발현과 rhe14321에 의한 라미닌에의 우선한 접착은 P형 콜로니를 생산하고 있는 세포군이 보다 엄밀히 간 전구세포와 관련되어 있음을 시사한다.Since the adhesion of mouse liver cells to extracellular matrix (ECM) proteins such as laminin, type IV collagen and fibronectin varies from developmental stage, the selectivity when each cell line adheres to specific ECM components is examined next. Similar to the findings in adult liver cells, type IV collagen is because the adhesion of mouse liver cells to different stages of development is different. Type IV was most effective for adhesion of thl120-3, similar to the results of adult hepatic cells (Fig. 1c), but not so much for rter6 (Fig. 1b) and rhe14321 (Fig. 1a). Laminin is the most effective substrate for adhesion of rhe14321 (FIG. 1A). This selectivity is identical to the primary culture of mouse fetal liver cells. In summary, the conserved expression of alpha-fetoprotein and albumin in P-type colonies and preferential adhesion to laminin by rhe14321 suggest that the cell population producing P-type colonies is more closely related to hepatic progenitor cells. .

실시예 3. 콜로니 형성을 위한 STO의 서브클론의 분리; 간 전구세포의 분석Example 3 Isolation of Subclones of STO for Colony Formation; Liver Progenitor Cell Analysis

증식능력이 높은 양능성 간 전구세포를 동정하기 위한 CFA 시스템을 개발하기 위하여, 배양계는 클론 파종 밀도에서 세포의 증식을 지지하고, 중요한 본래의 간기능을 보존하는 것이어야만 한다. 초기 간장 발생에 가장 중요한 마커중 2개가 알부민 및 알파-페토프로테인이다. F형에서는 아니고, P형 콜로니가 클론 증식 동안 알파-페토프로테인과 알부민의 발현을 지지하기 때문에 P형 콜로니를 최적화하는 배양 조건이 최량이다. 따라서, rter6의 P형 콜로니를 지지하는 STO 서브클론의 능력이 비교된다. 1개의 클론 STO5는 다른 모든 서브라인 및 친주 라인 이상으로 P형 콜로니 형성을 지지한다(도 2d). 또한 rhe14321의 CFA도 STO5가 친STO보다도 유효한 피더인 것을 확인한다(도 2e). E10.5의 소화관의 내부를 덮고 있는 중간엽 세포에서 발현되는 마우스 H1x 유전자 생성물은 태아 간장 세포의 증식에 필수이다. 비록 H1x 유전자의 mRNA 발현이 모든 STO 서브클론에서 분석되지만, 서브클론 사이에서의 발현의 유의한 차는 없다(데이터 미제시). 더욱이, 마우스 H1x의 STO5중의 안정한 트랜스펙턴트(transfectant)는 콜로니 형성 앗세이법을 개선하지 않는다(도 2f). 그러나 트랜스펙턴트 중 1개의 클론은, 비교적 고밀의 계대에서 STO5의 본래형태를 보다 안정적으로 지속시키기 때문에, 이 콜론은 보다 심화된 실험에 사용된다.To develop a CFA system for identifying high proliferative, viable hepatic progenitor cells, the culture system must be capable of supporting cell proliferation at clonal seeding densities and preserving important inherent liver function. Two of the most important markers for early hepatic development are albumin and alpha-fetoprotein. The culture conditions for optimizing P-type colonies are best because P-type colonies support the expression of alpha-fetoprotein and albumin during clone propagation, but not in type F. Thus, the ability of the STO subclone to support P-type colonies of rter6 is compared. One clone STO5 supports P-type colony formation above all other subline and parental lines (FIG. 2D). The CFA of rhe14321 also confirms that STO5 is a more effective feeder than the parent STO (FIG. 2E). Mouse H1x gene product expressed in mesenchymal cells covering the inside of the digestive tract of E10.5 is essential for the proliferation of fetal hepatic cells. Although mRNA expression of the H1x gene is analyzed in all STO subclones, there is no significant difference in expression between the subclones (data not shown). Moreover, stable transfectants in STO5 of mouse H1x do not improve colony forming assays (FIG. 2F). However, since one clone of the transfectant sustains the original form of STO5 more stably at relatively dense passages, this colon is used for further experiments.

실시예Example 4. 표면 항원 마커 및 콜로니 형성 앗세이법을 이용한 E13 태아 간으로부터 간 전구세포의 동정4. Identification of hepatic progenitor cells from E13 fetal liver using surface antigen markers and colony forming assay

간 형성(hepatopoiesis)과 대량의 조혈은 태아 간에 공존한다. 지금까지 조혈 전구세포의 항원성 프로파일은 널리 분석되어 왔으나, 초기 간 전구세포의 연구는 아직 초기 단계이다. 본 연구에서 확립된 3개의 간장 세포주, 즉 성체 간암 세포주(FTO-2B), 성체 랫트 간 유래의 상피 세포주(WB-F344) 및 신선하게 분리된 성체 간 세포를 이용하여 간장 세포의 항원 프로파일이 분석되었다. FTO-2B, WB-F344 및 성체 간 세포와 비교하여 가장 미숙한 태아 간장 세포주, rhe14321은 고전적 MHC class I(RT1A1)의 발현이 없다는 점에서 매우 독특하다(도 3a-3x). 세포 주, th1120-3(도 3i-3l)은 RT1A1, OX18 (pan-MHC class I) 및 ICAM-1의 패턴이 rhe14321(도 3a-3d)과 유사한 반면, rter6(도 3e-3h)은 RT1A1과 OX18 (도 3)의 발현이 비교적 높다. 나아가, 다른 실험으로부터 얻어진 rhe14321과 동일한 형태를 가지나, 역시 RT1A1-, OX18dull 및 ICAM-1+이다. 인테그린 b1의 발현은 모든 세포주에서 유사하나, RT1Aa,b,1 및 ICAM-1의 패턴은 세포에 있어서 독특하다. 성체 간 세포의 항원성 프로파일은 RT1A1+, OX18+ 및 ICAM-1+이다. 성체 랫트중에서는 적혈구를 제외한 모든 골수 세포가 MHC class I 분자를 강하게 발현하기 때문에, 태아 간 세포군은 MHC class I 발현에 의하여 조혈 세포 집단으로부터 분리될 수 있다. 랫트 E13 간에서 얻어진 세포 현탁액을 항 RT1A1 및 ICAM-1 항체에 염색된다. 도 4a는 RT1A1과 ICAM-1의 2가지 색으로 염색하는 패턴을 나타낸다. 어떤 획분에 간장 세포군을 함유하고 있는지를 결정하기 위해, 형광 활성화 세포 소오트에 의하여 5개의 획분으로 분리한 후, 클론 증식능력을 CFA로 스크리닝한다. 도 4b는 소오트 후의 5개의 획분의 재 소오트 결과를 나타낸다. 알부민 및 알파-페토프로테인의 발현으로 정의되는 간장 세포 콜로니는 형태적으로도 구별되기 때문에, 각 웰의 간 콜로니의 수를 세는 것이 가능하다. 간 콜로니의 대부분은 RT1A1dull 및 ICAM-1+의 게이트에서 검출되고(표1, 도 4b gate 2), P형 콜로니의 빈도는 75.6％(±4.9％ 표준편차)이다. 게이트 1은 매우 적은 수의 콜로니를 나타내고, 다른 획분의 콜로니 형성능력을 갖는 세포수는 무시해도 좋을 정도로 적다. Gate 1 및 Gate 2에서는, 모든 간 콜로니에서, 알파-페토프로테인 및 알부민의 양쪽의 발현이 확인된다. Gate 2의 세포에서 유래하는 콜로니는 다른 것보다 크다. 간장 세포에서의 MHC class I의 발현을 자세히 조사하기 위하여, 세포분획을 위하여 RT1A1, ICAM-1, OX18의 삼색 염색 및 또 하나의 파라미터로서 측방 산란광(SSC)이 사용된다. 태아의 간장 세포는 E11이라는 조기 태령에서도 지질 방울을 포함하고 있기 때문에(Luzzatto, 1981), 세포의 입상도를 반영하는 측방광산란(SSC)은 조혈 세포로부터 간세포를 분리하기 위하여 유용한 파라미터이다. 도 4c는 게이트 2에 가장 많은 수의 콜로니 형성 세포를 포함하고 있음을 나타낸다. SSC에 기초하여 R2에서 게이트를 걸면, gate 2에 대응하는 세포군은 명백히 RT1A1- 및 OX18dull 표현형을 나타낸다(도 4c, 4d). CFA에 의해 R4에는 게이트 2보다 더 많은 콜로니 형성 세포가 포함되어 있음을 확인하였다(표1). 이들 결과는 E13 랫트 간으로부터 얻어진 RT1A1-, OX18dull 및 ICAM-1+ 세포군의 대부분이 알파-페토프로테인+ 및 알부민+ 콜로니를 생산하는 간장 세포임을 시사한다. 이것은 rhe14321 세포에서 보여지는 항원성 프로파일과 동일하다(도3).Hepatopoiesis and large hematopoiesis coexist between fetuses. To date, antigenic profiles of hematopoietic progenitor cells have been widely analyzed, but the study of early liver progenitor cells is still in its infancy. Antigen profiles of hepatic cells were analyzed using three hepatic cell lines established in this study: adult liver cancer cell line (FTO-2B), epithelial cell line derived from adult rat liver (WB-F344), and freshly isolated adult liver cells. It became. Compared to FTO-2B, WB-F344 and adult liver cells, the most immature fetal hepatic cell line, rhe14321, is unique in that it lacks the expression of classical MHC class I (RT1A 1 ) (FIGS. 3A-3X). The cell line, th1120-3 (FIGS. 3i-3l), has a pattern of RT1A 1 , OX18 (pan-MHC class I) and ICAM-1 similar to rhe14321 (FIGS. 3A-3D), whereas rter6 (FIGS. 3E-3H) The expression of RT1A 1 and OX18 (FIG. 3) is relatively high. Furthermore, it has the same shape as rhe14321 obtained from other experiments, but also RT1A 1- , OX18 dull and ICAM-1 + . Expression of integrin b1 is similar in all cell lines, but the patterns of RT1A a, b, 1 and ICAM-1 are unique in the cell. Antigenic profiles of adult liver cells are RT1A 1+ , OX18 + and ICAM-1 + . In adult rats, because all bone marrow cells except red blood cells express strongly MHC class I molecules, fetal liver cell populations can be isolated from hematopoietic cell populations by MHC class I expression. Cell suspensions obtained from rat E13 liver are stained with anti RT1A 1 and ICAM-1 antibodies. Figure 4a shows a pattern for staining in two colors RT1A 1 and ICAM-1. To determine which fraction contains the hepatic cell population, it is separated into five fractions by fluorescence activated cell soot and the clone proliferation is screened by CFA. 4B shows the resorted results of the five fractions after sorting. Since hepatic cell colonies defined by the expression of albumin and alpha-fetoprotein are also morphologically distinct, it is possible to count the number of hepatic colonies in each well. The majority of hepatic colonies were detected at the gates of RT1A 1dull and ICAM-1 + (Table 1, FIG. 4B gate 2) and the frequency of P-type colonies was 75.6% (± 4.9% standard deviation). Gate 1 shows a very small number of colonies, and the number of cells having colony forming ability of other fractions is negligibly small. In Gate 1 and Gate 2, expression of both alpha-fetoprotein and albumin is confirmed in all liver colonies. Colonies derived from the cells of Gate 2 are larger than others. To investigate the expression of MHC class I in hepatic cells in detail, trichromatic staining of RT1A 1 , ICAM-1, OX18 and lateral scattered light (SSC) as another parameter is used for cell fractionation. Since fetal hepatic cells contain lipid droplets even at an early age of E11 (Luzzatto, 1981), lateral light scattering (SSC), which reflects the granularity of the cells, is a useful parameter for separating hepatocytes from hematopoietic cells. 4C shows that Gate 2 contains the largest number of colony forming cells. Gated at R2 based on SSC, the cell population corresponding to gate 2 clearly exhibits the RT1A 1- and OX18 dull phenotypes (FIGS. 4C, 4D). CFA confirmed that R4 contained more colony forming cells than Gate 2 (Table 1). These results suggest that the majority of the RT1A 1- , OX18 dull and ICAM-1 + cell populations obtained from E13 rat liver are hepatic cells producing alpha-fetoprotein + and albumin + colonies. This is identical to the antigenic profile seen in rhe14321 cells (FIG. 3).

[표 1] RT1A와 ICAM-1의 발현에 기초한 소오트된 E13 태아 유래의 간 콜로니 빈도수

Figure 112007500936059-pct00056
TABLE 1 Liver colony frequencies from sorted E13 embryos based on RT1A and ICAM-1 expression
Figure 112007500936059-pct00056

STO5hlx상에서의 콜로니 형성 배양은 E13 태아 간의 각 획분으로부터 얻어지는, 나타낸 수의 세포를 나타낸다. 간 콜로니의 수는 삼중 염색 배양으로부터 얻어졌다(평균±표준편차). 콜로니 형성의 효율은 배양액에 접종한 세포중, 16일 배양 후에 분석한 바, 콜로니를 형성하도록 한 비율을 나타낸다.Colony forming cultures on STO5hlx represent the indicated number of cells obtained from each fraction between E13 fetuses. The number of liver colonies was obtained from triple staining cultures (mean ± standard deviation). The efficiency of colony formation indicates the percentage of cells inoculated into the culture medium, which was analyzed after 16 days of culture to form colonies.

실시예 5. E13 간장 세포(hepatic cell) 및 성체 간 세포(adult liver cells)의 다른 배양조건Example 5 Other Culture Conditions of E13 Hepatic Cells and Adult Liver Cells

E13 간장에서 얻어진 소오트된 간장 세포의 성장요건은 결정된 STO5 피더 및 HDM을 이용하여 조사하였다. EGF는 성체 간 세포의 강력한 증식 인자인 것이 이전부터 알려져 왔다. 따라서, 소오트된 간장 세포의 콜로니 형성에 대한 EGF의 효과를 조사하였다. RT1A1-, OX18dull, ICAM-1+ 간장 세포의 콜로니 크기는 EGF가 없을 때 보다 크게 되는 반면, 성체 간 세포는 EGF가 있을 때에만 콜로니를 생성한다. 나아가, 성체 간 세포로부터 유래된 콜로니의 형태는 통상 F형인 반면, 모든 RT1A1- 간장 세포는 EGF 없이 P형의 콜로니를 형성한다. 그러나, 콜로니의 효율은 EGF가 없으면 약간 감소한다(도 6a). 흥미롭게도, EGF가 없는 배양조건은 2종류의 P 콜로니, 즉, P1과 P2를 강조한다. 배양 12일 째에 콜로니의 대부분은 P2형이나, 도 6a에서와 같은 전형적인 형태를 갖지 않기 때문에 2개의 타입을 명확히 구별하기는 어렵다. 이러한 결과는 태아 간장 세포와 성체 간 세포는 그의 증식 및 RT1A1의 발현 (도3 및 도 4) 및 콜로니의 형태에 있어서 본질적으로 다르다는 것을 시사하고 있다.Growth requirements of sorted hepatic cells obtained in E13 liver were investigated using the determined STO5 feeder and HDM. It has been previously known that EGF is a potent proliferative factor in adult liver cells. Therefore, the effect of EGF on colony formation of sorted hepatic cells was investigated. Colony size of RT1A 1- , OX18 dull , ICAM-1 + hepatic cells is larger than without EGF, while adult liver cells produce colonies only in the presence of EGF. Furthermore, the form of colonies derived from adult liver cells is usually F-type, while all RT1A 1- hepatic cells form P-type colonies without EGF. However, the efficiency of colonies decreases slightly without EGF (FIG. 6A). Interestingly, culture conditions without EGF emphasize two types of P colonies, P1 and P2. On the 12th day of cultivation, most of the colonies are P2 type, but since they do not have the typical shape as in FIG. 6A, it is difficult to clearly distinguish the two types. These results suggest that fetal hepatic cells and adult liver cells are essentially different in their proliferation and expression of RT1A 1 (FIGS. 3 and 4) and in the form of colonies.

배양 3주 후, 증식이 최대로 이르렀을 때, RT1A1-, OX18 및 ICAM-1의 발현을 평가했다. 도 5b∼5d에 나타난 바와 같이, RT1A1의 발현은 유도되지 않은 반면, OX18의 발현은 저하하고 있다. ICAM-1의 수준은 변함이 없었다. 또한, 단일 콜로니의 평균 세포수를 회수한 세포수, 랫트 간장 세포의 비율 및 콜로니 효율로부터 계산한다. 추정된 세포의 수는 3∼4×103 (표 2)에 이른다. 이것은 콜로니를 형성하는 단일 세포가 본 배양 조건에서 평균 약 11∼12회 분열한 것을 나타낸다.After 3 weeks of culture, when the proliferation reached its maximum, expression of RT1A 1- , OX18 and ICAM-1 was evaluated. As shown in Figs. 5B to 5D, the expression of RT1A 1 was not induced while the expression of OX18 was lowered. The level of ICAM-1 remained unchanged. In addition, the average cell number of a single colony is calculated from the number of cells recovered, the ratio of rat liver cells, and colony efficiency. The estimated number of cells ranges from 3 to 4x10 3 (Table 2). This indicates that single cells forming colonies divide about 11 to 12 times on average in the culture conditions.

[표 2] 단일 간 콜로니의 세포수 계산

Figure 112005512047604-pct00057
Table 2 Calculation of Cell Number of Single Liver Colonies
Figure 112005512047604-pct00057

도 4c의 R4에서 소오트된 세포는 60mm 또는 100mm 접시에서 STO5hlx 피더 상에서 배양하였다. 나타낸 기간 배양한 후, 모든 세포를 회수하고, 총세포수를 계산되었다. 랫트 세포의 비율은 랫트 ICAM-1 및 마우스 CD98의 발현에 기초한 유동 사이토메트리 분석에 의한다. 콜로니 효율은 배양에 접종된 세포중, 콜로니를 형성한 것의 비율을 나타낸다. 삼중 염색 배양(평균)으로부터 얻은 데이터는 함께 행한 실험으로부터 얻어졌다.Cells sorted at R4 in FIG. 4C were cultured on STO5hlx feeders in 60 mm or 100 mm dishes. After incubation for the indicated period, all cells were harvested and the total cell count was calculated. The proportion of rat cells is by flow cytometry analysis based on expression of rat ICAM-1 and mouse CD98. Colony efficiency represents the ratio of colonies formed among the cells inoculated in the culture. Data from triple staining cultures (mean) were obtained from experiments conducted together.

단일 콜로니의 평균 세포 수 = (회수된 세포 수×랫트 세포의 비율/100)/접종된 세포 수×콜로니 효율/100)Average cell count of single colony = (number of cells recovered × ratio of rat cells / 100) / number of cells inoculated × colony efficiency / 100)

실시예Example 6. RT1A1- 간 전구세포의 양능성에 대한 증명6. Proof of the amount of functional liver progenitor cells RT1A 1-

랫트의 임신 E13에서 간장 세포는 성숙한 간세포와 담관 상피를 발생시키는 양능성 전구세포로 생각되어져 왔다. 그러나 본 발명 이전에는 2개의 운명이 단일 세포에서 유래하는 것인지에 대한 직접적인 증거는 없었다. RT1A1- OX18dull ICAM-1+ 태아 간장 세포가 본 배양계에서 담즙 계통으로 분화할 수 있는지 없는지를 알아보기 위하여, 담관 상피 세포에 특이적인 마커로서 항-CK19로 콜로니를 염색하였다. CK19는 태아 랫트 간 15.5일 이후에 담관 상피 전구체에서 발현되며, 이 시점에서 세포의 알부민 발현이 소실된다. 소오트된 RT1A1- ICAM-1+ 세포는 EGF가 존재하 또는 부재하에서 배양되고, 그의 운명은 배양 5일 후에 CK19 및 알부민의 발현에 의해 모니터된다. 처음 5일 후에 EGF로 처리된 배양물에서는 CK19+ 콜로니는 거의 없으나, EGF가 없는 배양물에서는 CK19+ 세포를 함유하는 콜로니가 약간 나타난다. CK19의 발현의 정도는 매우 약하지만, CK19+ 세포에서는 알부민 발현이 감소하고 있다. 배양 후 10일째에 일부 콜로니가 CK19 또는 알부민만을 발현하고, 그 외 콜로니는 양쪽 양성 발현을 나타낸다. 단일 콜로니에서 CK19+ 및 알부민+ 세포의 패턴은 상반된다. 양쪽 양성 콜로니 및 CK19만 양성인 콜로니의 수는 역시 EGF가 없을 때 더 많다(도 6a). EGF가 있을 때에는, 배양 후 10일 째에는 많은 콜로니들이 알부민+ 세포로만 구성되어 있다 (도 6b). 최종적으로 양쪽 양성 콜로니의 수는 15일 째에 EGF 부재하에서 거의 100％에 이른다(도 6a). 요컨대 EGF는 배양을 통하여 CK19+ 콜로니의 출현을 극적으로 억제한다(도 6b). 이러한 결과는 E13 태아 간에서 얻은 RT1A1- OX18dull, ICAM-1+ 세포가 담관 세포계로 분화할 수 있고, 그들의 운명은 시험관 내에서 EGF에 의해서 영향을 받을 수 있다는 것을 시사한다(도 7).In rat gestation E13, hepatic cells have been considered to be bipotent progenitor cells producing mature hepatocytes and bile duct epithelium. Prior to the present invention, however, there was no direct evidence that two fates originated from a single cell. To determine whether RT1A 1- OX18 dull ICAM-1 + fetal hepatic cells could differentiate into bile lineage in this culture, colonies were stained with anti-CK19 as a marker specific for bile duct epithelial cells. CK19 is expressed in the bile duct epithelial precursor 15.5 days after fetal rat liver, at which point albumin expression of the cells is lost. Soorted RT1A 1- ICAM-1 + cells are cultured with or without EGF and its fate is monitored by expression of CK19 and albumin 5 days after culture. In the culture treated with EGF after the first 5 days there was little CK19 + colonies, but in the culture without EGF, some colonies containing CK19 + cells appeared. Although the degree of expression of CK19 is very weak, albumin expression is decreasing in CK19 + cells. Some colonies express only CK19 or albumin at 10 days after incubation and others show both positive expressions. The patterns of CK19 + and albumin + cells in a single colony are opposite. Both positive colonies and the number of colonies that are CK19 only positive are also higher when EGF is absent (FIG. 6A). In the presence of EGF, many colonies consisted only of albumin + cells 10 days after culture (FIG. 6B). Finally, the number of both positive colonies reached almost 100% in the absence of EGF on day 15 (FIG. 6A). In short, EGF dramatically inhibits the appearance of CK19 + colonies throughout the culture (FIG. 6B). These results suggest that RT1A 1- OX18 dull , ICAM-1 + cells obtained from E13 fetal liver can differentiate into the bile duct cell system and their fate can be influenced by EGF in vitro (FIG. 7).

실시예Example 7. 간 줄기세포 및 간 전구세포의 클론 증식을 지지하는 능력이 있는 피더7. Feeder capable of supporting clone proliferation of liver stem cells and hepatic progenitor cells 세포의 분리 및 클로닝을 위한 프로토콜Protocol for Isolation and Cloning of Cells

돼지, 비글, 토끼, 마우스 또는 원숭이의 신선한 배아 조직 또는 동결 조직(예를 들면, 간, 폐, 신장, 근육, 장)을 칼슘을 함유하지 않는 인산 완충 위생 식염수(PBS)중에서 잘게 썬다. PBS로 2회 세정한 후, 세포 현탁액은 0.25％ 트립신으로 37℃에서 10분간, 또는 상온에서 60분간 마그네틱 교반기를 사용하여 교반하면서, 세포현탁액을 인큐베이트한다. 남은 세포 덩어리는 메쉬로 여과하여 제거한다. 이후, 세포를 혈청(예를 들면, 10％ 소 태아혈청) 및 임의의 각종 증식 보충제(예를 들면, 2mM 글루타민, 피루브산나트륨, MEM 비필수 아미노산)를 첨가한 기초 배지(예를 들면, Eagle's MEM)를 이용하여 조직 배양 접시에서 배양된다. 플라스틱 기저 및 무혈청 첨가배지는 많은 경우, 중배엽 유래(예, 기질세포)인 지지세포(피더 세포)의 후보인 세포군의 증식을 가능하게 하고, 또 다른 세포(예, 전구세포)의 생존, 증식 및/또는 기능을 지지하는 인자를 제공하는, 일반적인 조건이다. 피더 세포는 콘플루엔트 또는 그에 거의 되면 0.05％ 트립신을 사용하여 계대 배양한다. 수회 계대 배양한 후, 증식한 세포를 동결 스톡으로 조제하고, 사용될 때까지 동결 보존한다. 피더 세포의 또 다른 공급원은 시판의 초대배양 피더세포 또는 피더 세포주이다. 어떠한 경우에라도 적당한 피더 세포를 동정하기 위하여는 하기 기준이 필요하다.Fresh embryonic tissues or frozen tissues (eg liver, lung, kidney, muscle, intestine) of pigs, beagles, rabbits, mice or monkeys are chopped in calcium phosphate buffered hygiene saline (PBS). After washing twice with PBS, the cell suspension is incubated with 0.25% trypsin with a magnetic stirrer for 10 minutes at 37 ° C. or 60 minutes at room temperature while incubating the cell suspension. The remaining cell mass is filtered off with a mesh. The cells are then basal medium (e.g. Eagle's MEM) added with serum (e.g. 10% fetal bovine serum) and any of a variety of proliferative supplements (e.g. 2 mM glutamine, sodium pyruvate, MEM non-essential amino acids). Cultured in a tissue culture dish. Plastic basal and serum-free mediums in many cases allow the proliferation of cell populations that are candidates for support cells (feeder cells), which are mesodermal-derived (eg stromal cells), and survival and proliferation of other cells (eg progenitor cells). And / or to provide factors that support the function. Feeder cells are passaged using confluent or nearly 0.05% trypsin. After several passages, the proliferated cells are prepared with frozen stock and cryopreserved until used. Another source of feeder cells is commercially grown feeder cells or feeder cell lines. In any case, the following criteria are needed to identify suitable feeder cells.

피더 세포는 하기를 지지한다: Feeder cells support the following:

1) 고전적 MHC class I 항원 음성, ICAM-1 양성 및/또는 비고전적 MHC class I 항원 양성의 표현형 마커를 갖는 간 전구세포의 클론 증식;1) clone proliferation of hepatic progenitor cells with phenotypic markers of classical MHC class I antigen negative, ICAM-1 positive and / or nonclassical MHC class I antigen positive;

2) 고전적 MHC class I 항원 음성, ICAM-1 양성, 비고전적 MHC class I 항원 약 양성, 알파 페토프로테인 양성, 알부민 양성 또는 CK19 양성의 표현형 마커를 갖는 자손을 갖는 전구세포의 클론 증식; 또는2) clonal proliferation of progenitor cells with progeny with phenotypic markers of classical MHC class I antigen negative, ICAM-1 positive, nonclassical MHC class I antigen drug positive, alpha fetoprotein positive, albumin positive or CK19 positive; or

3) 양능성 간 전구세포의 정의에 필요한 간세포계 및 담관 세포계의 양쪽으로의 유도 가능한 분화.3) Inducible differentiation into both hepatocytes and bile duct cell systems necessary for the definition of bipotent hepatic progenitor cells.

당해 분야에서는, 고전적 MHC class I 항원은 MHC class Ia 항원으로서도 알려져 있다. 비고전적 MHC class I 항원은 MHC class Ib 항원으로도 알려져 있다. MHC 항원은 서로 다른 종에 있어서 상이한 호칭을 가지고 있다. 예를 들면, 랫트의 RT1, 마우스의 H-2, 사람의 HLA이다.In the art, classical MHC class I antigens are also known as MHC class Ia antigens. Nonclassical MHC class I antigens are also known as MHC class Ib antigens. MHC antigens have different names for different species. For example, RT1 of rats, H-2 of mice, and HLA of humans.

상기 앗세이법은 다음과 같이 설명된다:The assay is described as follows:

간 전구세포의 클론 증식 조건Clone proliferation conditions of hepatic progenitor cells

간 전구세포는 증식을 억제한, 증식하지 못하도록 처리된 피더 세포 상에 9.6㎠당 500세포를 접종한다. 피더 세포는 마이토마이신 C 또는 방사선 조사(세포의 종류에 따라 3000∼5000 rads)로 처리하여 증식을 정지한다. 증식 정지된 피더 세포 및 전구세포에는 무혈청 HDM을 공급한다. 예를 들면, 설치류 세포용 HDM은 Dulbecco's modified Eagle's 배지와 Ham's F12의 1:1 혼합물에 10ng/㎖ EGF, 5㎍/㎖ 인슐린, 10-6M 덱사메타손, 10㎍/㎖ 철 포화 트랜스페린, 4.4×10-3M 니코틴아미드, 0.2％ 소혈청 알부민, 5×10-5M 2-머캅토에탄올, 7.6μeq/I 유리 지방산, 2×10-3M 글루타민, 1×10-6M CuSO4, 3×10-8M H2SeO3 및 항생물질이 첨가된 것이다. 배양액은 2일마다 교환하면서 10∼14일 동안 인큐베이트한다. 그런 다음, 알파 페토프로테인, 알부민 및/또는 CK19의 이중 면역형광염색을 행하여 자손의 운명을 동정한다. 알파 페토프로테인과 알부민의 발현에 의해 약 100 콜로니가 분석된다. 또한, 콜로니 형태, P형 또는 F형인가도 자손의 동정에 유용하다.Hepatic progenitor cells are seeded at 500 cells per 9.6 cm 2 on feeder cells treated to prevent proliferation which inhibited proliferation. Feeder cells are treated with mitomycin C or radiation (3000-5000 rads depending on cell type) to stop proliferation. Feeder cells and progenitors that have ceased proliferation are fed with serum-free HDM. For example, rodent cells HDM is Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's one of F12 for: 10ng to 1 mixture of / ㎖ EGF, 5㎍ / ㎖ insulin, 10 -6 M dexamethasone, 10㎍ / ㎖ iron saturated transferrin, 4.4 × 10 -3 M nicotinamide, 0.2% bovine serum albumin, 5 × 10 -5 M 2-mercaptoethanol, 7.6 μeq / I free fatty acid, 2 × 10 -3 M glutamine, 1 × 10 -6 M CuSO 4 , 3 × 10 -8 MH 2 SeO 3 and antibiotics were added. Cultures are incubated for 10-14 days with exchange every two days. Thereafter, dual immunofluorescence staining of alpha fetoprotein, albumin and / or CK19 is performed to identify the fate of the offspring. About 100 colonies are analyzed by the expression of alpha fetoprotein and albumin. In addition, colony form, P type or F type is also useful for identification of progeny.

삭제delete

피더 세포 및 간 전구세포의 이상적인 조합은 동일한 종으로부터 얻어진 것이다. 바람직하게는 피더 세포는 간 전구세포와 동일한 조직 및 동일한 종으로부터 얻어진다. 그러나, 1개의 종에서의 피더와 다른 종으로부터의 전구 세포를 혼합하는 것도 가능하다. 예를 들면, 설치류의 피더 세포의 경우에도, 사람 간 전구에 사용될 수 있다. 가용성 또는 불용성 인자(종 및/또는 조직-특이적인 가능성이 있다)는 간 줄기 세포 또는 간 전구세포의 클론 증식을 도와준다. 이들 인자들의 공급원은 다음과 같다:An ideal combination of feeder cells and hepatic progenitor cells is obtained from the same species. Preferably the feeder cells are obtained from the same tissue and the same species as the liver progenitor cells. However, it is also possible to mix feeders in one species with progenitor cells from another species. For example, in the case of rodent feeder cells, they can also be used for human liver bulbs. Soluble or insoluble factors (possibly species and / or tissue-specific) aid clonal proliferation of liver stem cells or hepatic progenitor cells. The sources of these factors are:

1) 최적의 종과 조직의 피더 세포를 배양한 조건 배지. 피더 세포는 기질 세포가 아니라면 어떠한 세포 형태라도 좋다.1) Conditioned medium in which feeder cells of optimal species and tissues were cultured. The feeder cell may be any cell type, unless it is a stromal cell.

2) 중요한 인자가 알려진 경우에는, 간 전구세포에 활성을 나타내는 최적인 피더 세포에 유래하는 적절한 분자(시그널)를 합성하기 위해, 각각 전사 또는 번역을 위한 cDNA 또는 mRNA를 임의의 세포에 도입함으로써 생물 활성이 있는 피더 세포군을 제작할 수 있는 공급원.2) If important factors are known, organisms may be introduced into any cell by introducing cDNA or mRNA for transcription or translation, respectively, in order to synthesize appropriate molecules (signals) derived from optimal feeder cells that are active against hepatic progenitor cells. A source from which active feeder cell populations can be produced.

3) 간 전구세포에 활성인 최적 피더 세포에서 얻어진 시그널이 단백질, 펩티드, 탄화수소, 리피드, 당펩티드, 당단백질, 리포단백질, 당지질 또는 그의 조합에 관계없이, 중요한 인자가 알려진 것인 경우에는, 그와 같은 시그널을 배지에 첨가함으로서 피더 세포를 완전히 치환할 수 있는 공급원.3) If a signal obtained from an optimal feeder cell active for hepatic progenitor cells is a known factor, regardless of protein, peptide, hydrocarbon, lipid, glycopeptide, glycoprotein, lipoprotein, glycolipid or combinations thereof, A source capable of completely displacing feeder cells by adding a signal, such as, to the medium.

상기 실시예는 예시를 위해서만 서술한 것이며, 본 발명의 범위 또는 실시태양을 제한하는 것은 아니다. 상기에 특히 설명되지 않은 다른 실시 태양도 당업자에게 명백할 것이다. 그러나, 그와 같은 다른 실시태양도, 본 발명의 범위 및 정신에 포함되는 것으로 고려된다. 그러므로, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해서만 올바르게 한정된다.The above examples are described for illustrative purposes only and do not limit the scope or embodiments of the present invention. Other embodiments not particularly described above will be apparent to those skilled in the art. However, such other embodiments are contemplated as being within the scope and spirit of the invention. Therefore, the invention is only limited correctly by the appended claims.

본 명세서에서 인용된 모든 특허 및 출판물은 그의 전체가 참고로서 본 명세서에 추가된다.All patents and publications cited herein are hereby incorporated by reference in their entirety.

본 발명은 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물의 증식방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 내배엽 유래의 전구, 그의 자손 또는 그의 혼합물의 증식방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for proliferating progenitor cells, their progeny or mixtures thereof. In particular, the present invention relates to a method of propagating progenitors derived from endoderm, their progeny or mixtures thereof.

Claims (80)

내배엽 유래의 초대(primary) 간 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물을 이들의 분화를 유도하지 않고 증식시키는 방법에 있어서, 혈청 및 상피성장인자(EGF)가 존재하지 않는 배지 존재 하에서 피더 세포를 함유하는 층상에서 내배엽 유래의 초대 간 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물을 배양하여, 내배엽 유래의 초대 간 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물을 그들의 분화를 유도하지 않고 증식시킴을 특징으로 하는 증식방법. A method of propagating primary hepatic progenitor cells, their progeny, or mixtures thereof from endoderm without inducing their differentiation, comprising feeder cells in the presence of medium without serum and epidermal growth factor (EGF) A propagation method characterized by culturing the primary hepatic progenitor cells, their progeny, or a mixture thereof, from the endoderm, stratified in a layered manner without inducing their differentiation. 제 1항에 있어서, 초대 간 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물이 척추동물 세포임을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the primary hepatic progenitor cells, their progeny, or a mixture thereof are vertebrate cells. 제 2항에 있어서, 초대 간 전구세포, 그의 자손 또는 그의 혼합물이 인간 세포, 비인간 영장류 세포, 돼지 세포, 개 세포, 토끼 세포, 랫트 세포, 마우스 세포 또는 그의 조합인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 2, wherein the primary hepatic progenitor cells, their progeny, or mixtures thereof are human cells, non-human primate cells, porcine cells, dog cells, rabbit cells, rat cells, mouse cells, or combinations thereof. 삭제delete 삭제delete 제 1항에 있어서, 배지가 기초 배지인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium is basal medium. 제 6항에 있어서, 기초 배지가 둘배코 변성 이글(Dulbecco's modified Eagle's) 배지 및 햄스 F12(Ham's F12)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.7. The method of claim 6, wherein the basal medium comprises Dulbecco's modified Eagle's medium and Ham's F12. 제 1항에 있어서, 배지가 1종 또는 그 이상의 호르몬을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium contains one or more hormones. 제 8항에 있어서, 호르몬이 인슐린, 트랜스페린 또는 이들 양자인 것을 특징으로 하는 방법. 9. The method of claim 8, wherein the hormone is insulin, transferrin or both. 제 8항에 있어서, 배지가 추가로 글루코코르티코이드 호르몬을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. 10. The method of claim 8, wherein the medium further contains glucocorticoid hormones. 제 8항에 있어서, 글루코코르티코이드 호르몬이 덱사메타손인 것을 특징으로 하는 방법. 9. The method of claim 8, wherein the glucocorticoid hormone is dexamethasone. 제 1항에 있어서, 배지가 추가로 철 포화 트랜스페린을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium further contains iron saturated transferrin. 제 1항에 있어서, 배지가 추가로 니코틴아미드를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium further contains nicotinamide. 제 1항에 있어서, 배지가 추가로 혈청 알부민을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium further contains serum albumin. 제 1항에 있어서, 배지가 추가로 1종 또는 그 이상의 환원제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium further contains one or more reducing agents. 제 15항에 있어서, 환원제가 머캅토에탄올인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 15 wherein the reducing agent is mercaptoethanol. 제 1항에 있어서, 배지가 1종 또는 그 이상의 리피드 첨가물을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium contains one or more lipid additives. 제 17항에 있어서, 리피드 첨가물이 유리 지방산 혼합물인 것을 특징으로 하는 방법. 18. The method of claim 17, wherein the lipid additive is a free fatty acid mixture. 제 18항에 있어서, 유리 지방산 혼합물이 팔미틴산, 팔미톨레인산, 스테아린산, 올레인산, 리놀레인산, 리놀레닌산, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법. 19. The method of claim 18, wherein the free fatty acid mixture is palmitic acid, palmitoleic acid, stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, or a combination thereof. 제 1항에 있어서, 배지가 글루타민을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium contains glutamine. 제 1항에 있어서, 배지가 추가로 미량 원소를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium further contains trace elements. 제 21항에 있어서, 미량 원소가 CuSO4인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 21 wherein the trace element is CuSO 4 . 제 21항에 있어서, 미량원소가 H2SeO3인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 21 wherein the trace element is H 2 SeO 3 . 제 1항에 있어서, 배지가 항산화제를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium contains an antioxidant. 제 24항에 있어서, 항산화제가 H2SeO3인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 24, wherein the antioxidant is H 2 SeO 3 . 제 1항에 있어서, 배지가 항생물질을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1 wherein the medium further contains an antibiotic. 삭제delete 제 1항에 있어서, 피더 세포 공급원이 1종 또는 그 이상의 척추동물로부터 얻은 조직을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the feeder cell source contains tissue from one or more vertebrates. 제 28항에 있어서, 척추동물이 배아인 것을 특징으로 하는 방법. 29. The method of claim 28, wherein the vertebrate is an embryo. 제 29항에 있어서, 척추동물이 인간, 비인간 영장류, 돼지, 개, 토끼, 랫트, 마우스 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 29, wherein the vertebrate is a human, a non-human primate, a pig, a dog, a rabbit, a rat, a mouse, or a combination thereof. 제 1항에 있어서, 피더 세포가 클론인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the feeder cells are clones. 제 31항에 있어서, 클론이 STO5인 것을 특징으로 하는 방법. 32. The method of claim 31, wherein the clone is STO5. 제 1항에 있어서, 피더 세포가 기질 세포인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the feeder cells are stromal cells. 제 1항에 있어서, 피더 세포가 섬유아세포인 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the feeder cells are fibroblasts. 제 1항에 있어서, 초대 간 전구세포가 MHC 클래스 Ib를 발현하고, OX18을 발현하며, 알파-페토프로테인을 발현하고, 알부민을 발현하며, 사이토케라틴-19 또는 그의 조합을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the primary hepatic progenitor cells express MHC class Ib, express OX18, express alpha-fetoprotein, express albumin, and express cytokeratin-19 or a combination thereof. Way. 삭제delete 제 1항에 있어서, 간 자손세포가 MHC 클래스 Ib를 발현하고, ICAM을 발현하고, OX18을 발현하며, 알파-페토프로테인을 발현하고, 알부민을 발현하며, 사이토케라틴-19 또는 그의 조합을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the hepatocytes express MHC class Ib, express ICAM, express OX18, express alpha-fetoprotein, express albumin, and express cytokeratin-19 or a combination thereof. Characterized in that the method. 제 37항에 있어서, ICAM이 ICAM-1인 것을 특징으로 하는 방법. 38. The method of claim 37, wherein the ICAM is ICAM-1. 제 1항에 있어서, 초대 간 전구세포, 그의 자손 또는 그의 조합이 축적 콜로니로 증식함을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the primary hepatic progenitor cells, their progeny, or a combination thereof proliferate into accumulation colonies. 제 1항에 있어서, 초대 간 전구세포를 추가로 클로닝함을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, further comprising cloning the primary hepatic progenitor cells. 제 40항에 있어서, 클로닝이 세포수 희석, 클로닝 칼라(cloning collars), 한천중 증식, 비드상의 증식, 유동 사이토메트리 또는 이들의 조합을 이용함을 특징으로 하는 방법. 41. The method of claim 40, wherein the cloning uses cell number dilution, cloning collars, agar growth, bead growth, flow cytometry, or a combination thereof. 제 1항에 있어서, 초대 간 전구세포가 1회 또는 그 이상의 유사분열을 행함을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the primary hepatic progenitor cells undergo one or more mitosis. 제 42항에 있어서, 초대 간 전구세포가 10회 또는 그 이상의 유사분열을 행함을 특징으로 하는 방법. 43. The method of claim 42, wherein the primary hepatic progenitor cells undergo 10 or more mitosis. 제 1항에 있어서, 초대 간 전구세포가 개별적 운명을 갖는 딸세포를 발생시킴을 특징으로 하는 방법. The method of claim 1, wherein the primary hepatic progenitor cells give rise to daughter cells with individual fates. 제 44항에 있어서, 딸세포가 담관 세포로 분화함을 특징으로 하는 방법. 45. The method of claim 44, wherein the daughter cells differentiate into bile duct cells. 제 44항에 있어서, 딸세포가 간세포로 분화함을 특징으로 하는 방법. 45. The method of claim 44, wherein the daughter cells differentiate into hepatocytes. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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