KR100886783B1 - N-말단이 수식된 peg-trail 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

N-말단이 수식된 peg-trail 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 천연 TRAIL(Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand, TRAIL)과 동등 또는 유사한 약리활성을 나타내며 약물의 체내 반감기 및 안정성을 증가시킨 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체에 관한 것이다. 본 발명의 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체는 천연 TRAIL에 비하여 우수한 용해도 및 용액 안정성, 그리고 매우 향상된 약물 동력학적 거동을 보이며, 증식성 질환 및 자가면역 질환 등의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
TRAIL, 폴리에틸렌 글리콜, 수용성고분자, 증식성 질환, 자가면역 질환

Description

N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도{N-terminal modified PEG-TRAIL, method for preparing and uses thereof}
도 1은 실시예1에서 사용한 삼량체 TRAIL 의 유전자 구조의 모식도 이고;
도 2는 니켈 친화 크로마토그래피를 이용하여 TRAIL을 분리한 크로마토그램 결과(washing 1(w1)은 10 mM 이미다졸 함유 인산 완충용액으로 세척한 것, washing 2(w2)는 50 mM 이미다졸 함유 인산 완충용액 세척하는 것)이고;
도 3은 정제된 TRAIL 의 전기영동 결과(EX는 대장균 파쇄물, UB는 PEG가 결합되는 않은 TRAIL, washing 1(w1)은 10 mM 이미다졸 함유 인산 완충용액으로 세척한 것, washing 2(w2)는 50 mM 이미다졸 함유 인산 완충용액 세척하는 것)이고;
도 4는 PEG 및 TRAIL 의 반응비에 따른 생성물의 크기 배제 크로마토그램 결과이고;
도 5는 TRAIL, 반응 혼합액 및 정제된 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 크기 배제 크로마토그램 결과이고;
도 6은 TRAIL, N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 및 미반응 TRAIL 의 전기영동 결과이고;
도 7은 인간 자궁암세포인 헬라 세포주를 이용한 PEG 분자량에 따른 독성시 험 결과이고;
도 8은 인간 자궁암세포인 헬라 세포주를 이용한 세포독성 시험에 있어서 약물 농도에 따른 세포의 현미경 사진이고;
도 9는 인간 대장암세포인 HCT 116 세포주를 이용한 PEG 분자량에 따른 독성시험 결과이고;
도 10은 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 용액 안정성 시험결과에 관한 그래프이고;
도 11은 TRAIL 의 약물 동력학적 거동에 관한 그래프이고;
도 12는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 약물 동력학적 거동에 관한 그래프이다.
본 발명은 N-말단이 수식된 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, 이하 PEG)-TRAIL 결합체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 상기 TRAIL 의 N-말단에 PEG 또는 PEG 유도체를 특이적으로 결합시킨, N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체, 이를 제조하는 방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 증식성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 및 치료제에 관한 것이다.
TRAIL(Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand)은 종양괴사인자(Tumor Necrosis Factor, 이하 TNF)의 일종으로 세포의 자가소멸(apoptosis)에 관여하는 세포막 단백질이다. 전체적으로 281개의 아미노산으로 이루어진 단백질 중에서(한국 특허출원번호 1997-7009578호) 114번 알지닌(arginine)으로부터 281번 글리신(glysine)까지의 세포외 부분이 세포의 자가소멸에 영향을 주는 것으로 알려져 있다(M.H. Kim, et al. BBRC 2004, 321, 930-935). 또한 세 개의 TRAIL 분자가 구조적으로 수식된 삼량체 구조를 가지며, 이러한 삼량체 구조의 TRAIL이 세포의 죽음에 관여하는 수용체와 결합하여 세포소멸을 유도하는 것으로 알려져 있다(F.C. Kimberley, et al. Cell Research 2004, 14, 359-372).
상기 TRAIL 의 다른 TNF 슈퍼패밀리(superfamily)인 TNF 및 CD95L 등과 TRAIL 의 가장 현격한 차이점으로는 일반 조직세포의 사멸을 유도하지 않는다는 것이다. TNF 및 CD95L 등의 단백질도 세포의 사멸을 유도하기 때문에 다양한 의학적 또는 약학적 응용이 시도되어 왔다. 이러한 TNF 및 CD95L 등의 단백질들은 암세포 및 과다 활성화된 면역세포의 사멸을 유도하는 동시에 일반 세포에도 영향을 나타내기 때문에 제한적인 응용만이 가능한 것으로 생각된다. 반면, TRAIL 의 경우 다양한 종류의 암세포 및 과다 활성화된 면역세포의 자가사멸을 유도하는 동시에 일반세포에는 영향을 주지 않는 것으로 알려져 있다. 이는 각각의 세포들에 있어서 TRAIL 수용체의 발현차이에 기인하는 것으로 알려져 있다. TRAIL 의 수용체로는 현재까지 5 종류가 보고되어 있고, 이들 중 대표적인 세포사멸 관련 수용체로는 DR4(TRAIL-R1) 및 DR5(TRAIL-R2)를 들 수 있다. 상기 수용체에 TRAIL이 결합되면 세포내 사멸 관련 도메인의 활성화 및 다양한 신호전달 체계를 거쳐 세포의 자가사멸이 이루어진다. 그 외에도 3개의 수용체인 DcR1, DcR2 및 OPG(osteoprotegerin) 등이 보고되어 있으며, 상기 수용체들은 세포 사멸에 관여하지 않는 것으로 알려진다. 일반 세포와 암세포에 있어서 세포 사멸에 관여하는 DR4 및 DR5의 발현 정도의 차이는 현재까지 미미한 것으로 알려져 있다. 반면에 세포 사멸과 관련이 없는 나머지 3종류의 수용체는 일반 세포에서는 잘 발현되어 있으나 암세포에는 발현 정도가 낮거나 발현이 되지 않는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 TRAIL 의 경우 일반세포에서는 죽음 관련 도메인과 결합되지 않는 DcR1, DcR2 및 OPG와의 결합이 지배적으로 일어나 세포의 사멸을 유도하지 않는 반면 암세포 및 과다 활성화된 면역세포에서는 죽음 도메인과 결합되어 있는 DR4 및 DR5와의 결합에 의한 세포의 자가사멸이 유도되는 것으로 알려져 있다. 이러한 선택적 세포사멸은 TRAIL 의 의학적 또는 약학적 응용에 있어서 매우 유용한 특성으로 생각된다.
TRAIL에 의한 세포사멸이 관찰되는 암세포들로는 대장암세포, 신경교종암세포(glioma cancer), 폐암세포, 전립선암세포, 뇌종양 및 다발성 골수종(multiple myeloma) 등이 보고되어 있으며, 나아가 동물실험에서 매우 우수한 항암활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 TRAIL을 단독으로 사용하는 경우뿐만 아니라 파클리탁셀, 독소루비신 등의 다른 항암제 및 방사선 치료 등과 병행하여 투입하는 경우도 우수한 항암 효능을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서 이러한 TRAIL 의 우수한 항암효능을 이용한 고형암에 대한 임상실험이 진행중이다(Genentech/Amgen). 암뿐만 아니라 자가면역 질환의 일종인 관절염 등에 있어서도 과다 활성화된 면역세포의 사멸을 유도하여 병증의 완화 및 치료를 위하여 TRAIL을 이용한 다양한 접근이 시도되고 있다. 또한 단백질 치료 외에도 TRAIL 유전자의 전달을 통한 유전자 치료 등도 다양하게 시도되고 있다. 따라서 TRAIL 은 위에서 언급한 다양한 암의 치료뿐만 아니라 실험적 자가면역 뇌수막염(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis), 류마티스 관절염 및 제 1형 당뇨병 등의 T-세포 기인성 자가면역 질환의 치료 등에도 유용하게 이용될 수 있다.
그러나, 천연 TRAIL 은 응용을 위하여 해결해야 할 몇 가지 문제점들을 가지고 있다. 가장 대표적인 문제점으로는 천연 TRAIL 의 낮은 삼량체 형성 비율을 들 수 있다. TRAIL 단량체의 경우 위에서 언급한 TRAIL 수용체와 결합을 하지 못하기 때문에 세포의 자가사멸을 유도하지 못하는 것으로 알려져 있기 때문에, TRAIL 의 삼량체 구조 및 삼량체 형성비를 향상시키기 위해 다양한 연구가 시도되어 왔다. 천연 TRAIL에 있어서 삼량체 형성에는 아연 이온이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(S.H. Hymowitz, et al. Biochemistry 2000, 39, 633-640). 또한 컴퓨터를 이용한 구조해석 및 이를 이용한 변형 TRAIL 의 개발 등의 접근 방법도 시도되어 오고 있다(A.M. van der Sloot, et al. Protein Engineering, Design & Selection 2004, 17, 673-680). 직접적인 삼량체 형성을 돕기 위한 새로운 아미노산 배열의 도입은 TRAIL 삼량체 형성에 있어서 가장 유용한 방법으로 생각되며 루신 지퍼 배열 및 이소루신 지퍼 배열 등이 보고되어 있다. 헨닝 왈크작(Henning Walczak)은 1999년 루신 지퍼 배열을 천연 TRAIL 의 N-말단에 도입한 삼량체 형태의 TRAIL 유도체에 의한 항암효능 등에 관한 내용을 발표한 바 있다(H. Walczak, et al. Nature Medicine 1999, 5, 157-163). 그 외에도 다이-우 설(Dai-Wu Seol) 등에 의해 새로운 이소루신 지퍼 배열이 포함된 TRAIL 유도체 및 그 유전자를 이용한 우수한 활성에 관한 보고 등이 발표된 바 있다(MH Kim, et al. BBRC 2004, 321, 930-935).
TRAIL 의 임상 응용에 있어서 다른 문제점으로는 일부 조직의 일반 세포에서 나타나는 세포독성을 들 수 있다. 대부분의 일반 세포에서는 상술 바와 같은 다양한 TRAIL 수용체의 발현에 따른 세포독성이 발현되지 않으나, 일부 간세포(hepatocytes) 및 케라틴세포(keratinocytes) 등에서는 TRAIL에 의한 세포 독성이 보고되고 있다(H. Yagita, et al. Cancer Sci. 2004, 95, 777-783; M. Jo et al. Nature Medicine 2000, 6, 564-567; S.J. Zheng, et al. J. Clin. Invest. 2004, 113, 58-64).
TRAIL에 의한 일반 세포독성 이외에도 생체내 TRAIL 의 짧은 반감기가 TRAIL 의 성공적 임상 적용을 위해 해결해야 할 또 다른 문제점으로 지적되고 있다. TRAIL 의 경우 실험에 사용된 동물의 종에 따라 서로 다른 반감기를 나타내는데, 예를 들면 설치류의 경우에는 수분, 유인원의 경우에는 대략 30분 이내의 반감기를 나타내는 것으로 보고되어 있다(H. Xiang, et al. Drug Metabolism and Disposition 2004, 32, 1230-1238). 특히 대부분의 TRAIL이 신장을 통하여 빠른 속도로 배출되는 것으로 알려져 있다. 이러한 짧은 반감기는 TRAIL에 의한 약리작용의 단점으로 생각되며, 보다 긴 반감기를 갖는 TRAIL 및 TRAIL 유도체의 필요성을 단적으로 설명하고 있다. 그 외에도 TRAIL 의 낮은 용해도 및 용액 안정성 또한 개선해야 할 문제점으로 지적되고 있다.
한편, PEG는 HO-(-CH2CH2O-)n-H의 구조를 갖는 고분자 화합물로, 친수성이 강하기 때문에 의약 단백질에 결합시켜 그 용해도를 증가시킬 수 있다. 또한 적절하게 결합시키면 효소활성, 수용체 결합과 같은 주요 생물학적 기능들을 유지하면서 수식된 단백질의 분자량을 증가시킴으로써, 신장여과를 감소시키고 외부항원을 인식하는 세포와 항체로부터 단백질을 보호하며 분해효소에 의한 단백질의 분해도 감소시킬 수 있다. 이와 같이 단백질에 결합이 가능한 PEG의 분자량 범위는 대략 1,000~100,000으로, PEG 분자량이 1,000 이상일 경우에는 독성이 상당히 낮은 편으로 알려져 있다. PEG의 분자량 범위가 1,000~6,000인 것은 전신에 분포하고 신장을 통해 대사되면, 특히 분자량 40,000인 PEG는 혈액과 간을 포함한 기관들에 분포되고 대사는 간에서 이루어지는 것으로 알려져 있다.
일반적으로, 비경구(parenteral) 경로를 통해 투여되는 의학적, 약리학적으로 유용한 단백질들은 생체내에서 항원성을 가지며, 대체로 수용성이 좋지 않고 체내 잔존기간이 짧다는 단점이 있어 이를 극복하고자 하는 연구가 수행되고 있다. 미국 등록특허 제4179337호에서는, PEG와 결합된 단백질 및 효소 등을 치료제로 사용할 경우, PEG가 갖는 장점인 항원성의 감소, 수용성의 증가, 체내 잔류 기간 증가 등의 효과를 얻을 수 있음을 개시하고 있다. 이 특허 이후, 생리활성 단백질을 PEG와 결합시켜 그 단점을 극복하고자 하는 시도가 이루어져 왔다. 예를 들면 베로네즈 등을 리보뉴클레아제(ribonuclease)와 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)를 PEG와 결합시켰으며(Veronese et al., 1985), 미국 등록특허 제4766106호 및 미국 등록특허 제4917888호에서는 단백질들에 PEG를 포함한 폴리머를 결합시켜 단백질의 수용성을 증가시킨 내용을 개시하고 있다. 또한 미국 등록특허 제4902502호에서는 PEG나 다른 폴리머들을 재조합 단백질에 결합시켜 항원성을 줄이고 체내 잔존기간을 증가시키는 것에 대해서 개시하고 있다.
반면, 상기와 같은 장점에도 불구하고 PEG와 단백질 결합에 있어서, 상기 PEG는 대개 결합할 단백질의 하나 또는 그 이상의 자유 리신(lysine, Lys) 잔기에 공유결합을 통해 결합하게 되는데, 이때 단백질의 표면 부위 중 단백질의 활성도와 직접적인 관계가 있는 부위가 PEG와 결합할 경우, 그 부위는 더 이상 생물학적 기능을 수행할 수 없게 되어 단백질의 활성도가 감소하게 되는 문제가 있다. 또한, PEG와 리신 잔기의 결합은 대개 무작위적으로 일어나게 되므로 결합 위치에 따라 많은 종류의 PEG와 단백질 배합체(conjugate)들이 혼합물로 존재하게 되므로 원하는 배합체를 순수 분리하는 과정이 복잡해지는 문제가 있다.
TRAIL 의 경우에도 상술한 바와 유사한 PEG의 결합에 따른 문제점을 내포하고 있다. 천연 TRAIL 의 경우 11개의 리신 잔기를 갖고 있으며, 이들 중 상당부분이 TRAIL과 수용체간의 상호작용에 관여하거나 활성부위에 존재하는 것으로 알려져 있다(S.G. Hymowitz, et al. Molecular Cell 1999, 4, 563-571). 따라서 리신 잔기와의 반응을 통한 폴리에틸렌 글리콜 분자의 도입은 TRAIL 의 생리활성에 매우 중요한 저해요인으로 작용할 수 있다. TRAIL 슈퍼패밀리인 TNF의 경우에도 리신 잔기와의 폴리에틸렌 글리콜 분자간의 결합을 통한 활성화 저해에 관한 여러 연구들이 보고되어 있다(Y. Yamamoto, et al. Nature Biotechnology 2003, 21, 546-552; H. Shibata et al. Clin. Cancer Res. 2004, 10, 8293-8300).
이에, 본 발명자는 TRAIL 의 N-말단에만 선택적으로 PEG 또는 PEG 유도체를 결합시킴으로써, 간세포 및 간의 망상내피세포계(Reticuloendothelial system)에 의한 약물의 흡수 및 제거율을 낮추어 TRAIL에 의한 간 독성을 감소시키며, 용해도 및 안정성을 획기적으로 증가시키고, 다양한 형태의 장기간 보존이 가능하면서도 약물의 약동력학적 거동(pharmacokinetic profiles)을 개선시킴으로써 약물의 투여 횟수가 감소시키고 지속적인 약효 발현이 가능한 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 및 이의 제조방법을 알아내고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 용도를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공하고, 이를 제조하는 방법을 제공하며, 이를 유효성분으로 함유하는 증식성 질환 또는 자가면역 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 목적은 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
상기 TRAIL 은 천연 또는 유전자 재조합으로 얻어진 TRAIL이 사용될 수 있으며, 삼량체 형성을 유도하는 지퍼 아미노산 배열 또는 분리 정제를 용이하게 하는 말단기를 포함하는 것을 사용할 수 있다.
이때, 상기 TRAIL 은 1-281의 아미노산 서열을 갖는 인간 TRAIL이며, 바람직하게는 114번 알지닌부터 281번 글리신까지의 아미노산 서열을 갖는 것을 사용할 수 있다.
상기 TRAIL 은 N-말단에 이소루신 지퍼를 부착한 것을 사용할 수 있다.
또한, 상기 PEG는 이의 유도체를 포함할 수 있다.
이 경우, 상기 PEG 또는 이의 유도체는 직선형 또는 가지형인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 숙신이미딜 프로피오네이트(methoxyPEG succinimidyl propionate, mPEG-SPA), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드(methoxyPEG N-hydroxysuccinimide, mPEG-NHS), 메톡시폴리에틸 렌 글리콜 알데히드(methoxyPEG aldehyde, mPEG-ALD), 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드(methoxyPEG maleimide, mPEG-MAL), 다중가지형 PEG이며, 이에 한정되지 않는다.
이 경우에 상기 PEG의 분자량은 1,000 ~ 40,000의 범위에서 선택되며, 바람직하게는 5,000 ~ 40,000의 범위에서 선택된 것을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법을 제공한다.
TRAIL 의 N-말단 아민과 PEG의 알데하이드기를 환원제 하에서 반응시켜 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 제조할 수 있다.
상기 PEG로는 이의 유도체를 포함하여 사용할 수 있다.
이 경우, 상기 PEG 또는 이의 유도체는 직선형 또는 가지형인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 숙신이미딜 프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 알데히드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드, 다중가지형 폴리에틸렌 글리콜 유도체 등을 사용할 수 있다.
또한, 상기 PEG는 1,000 내지 40,000의 분자량을 갖는 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5,000 내지 40,000의 분자량을 갖는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 PEG/TRAIL 의 반응 몰비는 2 ~ 10이며, 바람직하게는 5 ~ 7.5로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 상기 TRAIL 은 천연 또는 유전자 재조합으로 얻어진 TRAIL 인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 삼량체 형성을 유도하는 지퍼 아미노산 배열 또는 분리 정제를 용이하게 하는 말단기를 포함하는 것을 사용할 수 있다.
이때, 상기 TRAIL 은 1-281의 아미노산 서열을 갖는 인간 TRAIL 인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 114번 알지닌부터 281번 글리신까지의 아미노산 서열을 갖는 것을 사용할 수 있다.
상기 TRAIL 은 N-말단에 이소루신 지퍼를 부착한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 환원제는 NaCNBH3, NaBH4 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 유효성분으로 함유하는 증식성 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
상기 증식성 질환은 암이며, 바람직하게는 대장암, 신경교종암, 폐암, 전립선암, 뇌종양, 다발성 골수종 암종 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 유효성분으로 함유하는 자가면역 질환의 예방 및 치료제를 제공한다.
상기 자가면역 질환은 실험적 자가 면역 뇌수막염, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 임상 투여 시에 하기의 다양한 경구 또는 비경구로 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), PEG, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 또한 증식성 질환 또는 자가면역 질환의 치료제로서의 효능 증진을 위해 칼슘이나 비타민 D3를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양화될 수 있지만, 일반적으로 1주 내지 2주에 1회 투여로도 유효투여량의 투여가 가능하다. 또한 1일 유효투입량 범위 내에서 하루 한번 또는 하루에 여러번 나누어 투입될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 의해한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조
실시예 1-1: TRAIL 유전 형질이 도입된 대장균의 배양 및 단백질 발현
인간 TRAIL(human TRAIL, hTRAIL)의 전체 아미노산 배열(1-281) 중 114번 알지닌부터 281번 글리신까지의 아미노산 구조를 포함하고, 유전자 재조합 TRAIL 의 발현 및 생산 균주로 BL21(DE3) 대장균을 사용였으며, 발현 플라스미드로는 pET3a을 사용하였다. 상기의 TRAIL 아미노산 배열에 TRAIL 의 삼량체 구조 형성을 유도하는 이소루신 지퍼(isoleucine zipper, ILz) 배열을 N-말단에 첨가하였으며, 최종적으로 분리 및 정제를 용이케 하기 위하여 6개의 히스티딘(6×His)아미노산 배열을 N-말단 부위에 첨가하였다. 결과적으로 삼량체 형태의 TRAIL(히스티딘태그 및 이소루신 지퍼가 연결된 인간 TRAIL)을 발현시키기 위한 유전자 구조는 도 1에 표시하였다.
상기 유전 형질이 도입된 대장균은 배양액인 멸균된 LB 배지를 이용하여 37 ℃에서 배양시켰으며, 형질도입된 대장균의 선택적 배양을 위하여 항생제인 암피실린(50 mg/ℓ) 존재 하에 약 12시간 동안 진탕 배양하였다. 배양 과정을 통하여 상기의 유전 형질이 도입된 대장균의 증식시킨 후, 대장균 내의 유전형질의 발현은 이소프로필-b-D-티오갈락토시드(Isopropyl-b-D-thiogalactoside, IPTG)을 처리하여 유도하였다. 먼저, 진탕배양기의 온도 및 대장균 배양액의 온도를 27 ℃로 낮춘 후 1 M 이소프로필-b-D-티오갈락토시드 수용액 1 ㎖을 가한 후 약 7시간 동안 교반시키며 유전 형질 발현을 유도하였다. 상기의 발현 과정 후 대장균은 원심분리를 통하여 회수하였다(5000 g, 10분).
실시예 1-2: 대장균으로부터 TRAIL 의 정제
상기 실시예 1-1의 과정을 통하여 얻어진 대장균으로부터 TRAIL 의 분리는 니켈 친화성 크로마토그래피(Ni-affinity chromatography)를 이용하였다. 먼저, 원심분리를 통하여 얻어진 대장균 농축액을 20 mM 인산 완충용액(pH 7.5)에 희석한 후 초음파를 이용한 세포막 파괴를 통하여 대장균 내 생성된 TRAIL을 용출시켰다. 초음파 처리 후 용액 내 불용성 세포 기질은 원심분리를 이용하여 제거하고(10000 rpm, 20 분), 상등액을 취하여 Ni-NTA 충전 컬럼에 천천히 흘려주었다. 상기 과정에서 TRAIL 의 N-말단 부위의 6×His과 컬럼 내의 니켈 이온 착체와의 상호작용에 의하여 선택적으로 TRAIL이 컬럼에 흡착되게 하였다. 컬럼 충전 후 인산 완충용액 및 10, 50 mM 이미다졸(imidazole) 함유 인산 완충용액(pH 7.5)을 컬럼에 통과시켜 TRAIL 이외의 불순물 단백질들을 제거하였다. 최종적으로 컬럼내에 흡착된 TRAIL을 500 mM 이미다졸 인산 완충용액을 이용하여 컬럼내 흡착되어 있는 TRAIL을 분리하였다. 상기 분리된 TRAIL 용액을 한외 여과법을 이용하여 고농도인 이미다졸 용액을 제거하였으며, 최종적으로 pH 5.0의 50 mM 아세테이트 완충액 상태로 얻었고, 상기 과정을 통하여 고순도(98% 이상)의 TRAIL을 분리-정제하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
또한 분리 정제된 TRAIL 및 분리과정 용출액의 전기영동(SDS-PAGE, 14% gel) 결과는 도 3(EX는 대장균 파쇄물, UB는 PEG가 결합되는 않은 TRAIL, washing 1(w1)은 10 mM 이미다졸 함유 인산 완충용액으로 세척한 것, washing 2(w2)는 50 mM 이미다졸 함유 인산 완충용액 세척하는 것)에 나타내었다. 상기 도 2로부터 상기 실시예 1-2로부터 분리한 ILz-hTRAIL 의 정체시간(retention time)은 135 ~ 145 분 사이에서 나타남을 알 수 있었으며, 상기 도 3으로부터 상기 컬럼을 통해 분리된 ILz-hTRAIL을 전기영동하여 컬럼을 통한 TRAIL 의 분리 정제가 용이하게 된 것임을 알 수 있었다.
실시예 1-3: PEG-TRAIL 의 합성 및 분리
실시예 1-2의 과정을 통하여 제조된 TRAIL을 200 μg/㎖의 농도로 희석한 용액(50 mM 아세테이트 완충용액, pH 5.0)에 분자량 5,000의 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드(PEG5k) 용액을 첨가하였다. 상기 반응시 환원제로 NaCNBH3를 최종농도가 20 mM이 되도록 가하여 주고, 4 ℃에서 약 8 ~ 12시간 동안 반응을 진행하였다. TRAIL에 대한 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드는 반응 몰비가 2.5, 5, 7.5 및 10으로 첨가하여 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체(PEG5K-ILz-hTRAIL)를 제조하였다. 실시예 1-2와 동일한 방법으로 분자량 20,000의 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드를 처리하여 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체(PEG20K-ILz-hTRAIL)를 제조하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4에서 보는 바와 같이 PEG의 양이 증가함에 따라서 PEG가 수식된 TRAIL 의 양이 증가함을 알 수 있다. 반면 과량의 PEG를 도입하는 경우 원하는 N-말단 이외에 리신의 곁사슬 아민에 반응하는 부가 생성물이 증가하여 상대적으로 분자량의 증가 및 크기 배재 크로마토그래피(size exclusion chromatography, 용출액: 150 mM NaCl이 포함된 pH 6.0의 인산 완충용액)에서의 용출시간이 빨라짐을 알 수 있다. 따라서 PEG 및 TRAIL 의 반응비는 크거나 작지 않은 적정 범위에서 설정하는 것이 효율적임을 알 수 있다.
PEG 및 TRAIL 의 반응비를 7로 설정하여 생산된 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체는 크기 배재 크로마토그래피를 이용하여 분리정제하였고, 그 결과는 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이 정제된 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체는 대장균에서 분리정제한 TRAIL에 비하며 상대적으로 용출부피 값을 갖고 있으며, 또한 정제된 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 크로마토그램에서 나타난 바와 같이 미반응 TRAIL을 함유하지 않는 순수한 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 임을 알 수 있었다.
또한, 본 실시예에 반응물, 정제된 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 전기영동 결과는 도 6에 나타내었다.
상기 도 6에 나타낸 분리 정제된 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체는 전기영동을 통하여 TRAIL 단량체 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체에 단량체의 존재를 확인할 수 있었다. 이는 삼량체 형태의 TRAIL 의 하나 또는 두 개의 단량체 말단에 PEG가 결합되어 있음을 나타낸다. 또한 전기영동 결과에서 TRAIL 단량체 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 단량체 이외의 불순물이 확인되지 않아 최종적으로 분리 정제된 폴리에틸렌이 수식된 TRAIL 은 높은 순도를 나타내었다.
<실험예 1> TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 생리활성 비교(세포괴사 실험)
TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 생리활성을 알아보기 위해 하기의 실험을 수행하였다.
TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의, 즉 세포괴사 실험은 인간 자궁암 세포인 헬라 세포주와 인간 대장암 세포인 HCT116 세포주를 이용하여 실시하였다. 세포주의 배양에는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, HeLa 세포주) 및 RPMI-1640(HCT 116 세포주) 배지를 사용하였다. 실험을 위하여 각각의 세포주를 96 웰 플레이트의 각 웰에 1 × 104개씩의 세포를 분주한 후 약 24시간의 배양을 통하여 분주된 세포를 안정화하였다. 상기 배양과정 후 각각의 세포에 최종 1 ng/㎖ ~ 5 μg/㎖의 농도가 되도록 대조군 TRAIL(R&D systems사로부터 구입)을 사용하였고, 실시예 1-1 ~ 1-2 방법을 통하여 제조된 TRAIL 및 실시예 1-3 방법을 통하여 제조된 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체(PEG5K-ILz-hTRAIL 및 PEG20K-ILz-hTRAIL)를 투여한 후 약 24시간 동안 배양하였다. 약물처리 후 각각의 웰에 20 ㎕의 MTS 용액(프로메가사로부터 구입)을 첨가한 후 약 2시간 후에 490 ㎚ 파장에서의 흡광도를 측정하였고, 상기와 같은 방법으로 대장암 세포주에 대해서도 실험을 하였으며, 이값을 이용하여 세포 생존율을 계산하였고, 그 결과를 도 7, 8 및 9에 나타내었다.
상기 도 7 및 8에 나타낸 바와 같이 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체는 유사한 경향의 농도 의존형 세포 독성을 나타낸다. 또한 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 경우 수식된 PEG의 분자량이 증가함에 따라 상대적으로 낮은 세포독성을 보이는 것을 알 수 있다. 이와 같은 경향은 상기 도 8에 나타난 약물처리 후 세포의 현미경 사진에서도 유사한 경향으로 나타남을 확인할 수 있었다.
상기 도 9에 나타낸 바와 같이 대장암 세포주인 HCT 116 세포주의 경우 상기 도 7과 유사한 경향의 세포 독성을 나타내었으며, 이러한 세포독성의 PEG 분자량 효과도 유사함을 알 수 있다.
<실험예 2> TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 용액 안정성 고찰
TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 용액 안정성을 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 용액 안정성을 조사하기 위하여 시간에 따른 용해도를 조사하였다. 실험은 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 50 mM 아세테이트 완충액하에 200 μg/㎖의 농도로 만든 후 생리학적 pH값을 맞추기 위하여 100 mM 인산 완충액과 1:1로 희석한 후 37 ℃에서 시간에 따른 용해도 변화를 조사하는 방법을 이용하였다. 각 5, 15, 30, 60, 120, 180분 후 소량의 시료를 취한 후 원심분리를 통하여 용액 내에 용해된 부분과 침전된 부분을 분리하고 용해된 부분의 단백질 농도는 BCA 단백질 정량 키트를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
상기 도 10에 나타낸 바와 같이 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 용액 안정성은 현격한 차이를 나타내었다. TRAIL 의 경우 5분 이내에 대부분(80% 이상)의 TRAIL이 침전되어 석출되었다. 반면에 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 경우 매우 우수한 용액 안정성을 보여주었으며, 결합되는 PEG의 분자량이 클수록 안정화도가 증가하는 경향을 나타내었다. PEG5K-ILz-hTRAIL 의 경우 70% 정도의 안정화도를, PEG20K-ILz-hTRAIL 의 경우 95% 내외의 안정화도를 나타내었다.
<실험예 3> TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 약물 동력학적 거동 고찰
TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 약물 동력학적 거동을 알아보기 위하여 하기의 실험을 수행하였다.
TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 약물 체내 동태를 고찰하기 위하여 6주령 스프라구 다울리 랫을 이용한 약물 동력학 실험을 수행하였다. 실험동물로부터 혈액 샘플 채취를 용이하게 하기 위하여 동물의 우측 경정맥에 PE-10 튜브를 약 2.5 ㎝ 정도 삽관한 후 봉합하고 삽입된 튜브의 끝을 동물의 등 부위를 거쳐 외부의 채혈관과 연결하였다. 약 24시간의 안정화 및 회복기간 경과 후 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 10 μg/kg의 용량으로 피하에 주입한 후 5분 ~ 48시간의 실험기간 동안 주기적으로 혈액을 채취하였다(0.2 ㎖, 각 시간 지점당). 혈액 샘플은 원심분리를 이용하여 혈장만의 취한 후 혈장 내 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 약물 체내 동태를 분석 키트(human TRAIL ELISA kit)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 11 및 12에 나타내었다.
상기 도 11 및 12에 나타낸 바와 같이 TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체는 서로 상이한 체내 거동을 나타내었다. TRAIL 의 경우 매우 빠른 흡수 과정을 거쳐 약 1시간 후 최고 혈중 농도를 보였으며, 이후 빠른 신장배출 및 대사에 의하여 급격히 혈중농도가 감소하였다. 반면에 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 경우 투여된 피하 부위로부터 천천히 흡수되고, 또한 혈중 농도는 48시간 이상까지 장기간 고농도를 유지하는 것을 관찰할 수 있었다. 이는 PEG의 결합에 기인한 TRAIL 의 낮은 신장배출 및 간 대사율에 의한 것으로 보여진다.
상기 약물 동력학 실험의 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
TRAIL 및 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 약물 동력학 실험 결과
ILz-hTRAIL PEG5K-ILz-hTRAIL
AUC(ng.hr/㎖) 7.71 ± 1.10 7628.2 ± 321.6
Cmax(ng/㎖) 3.38 ± 0.48 298.3 ± 24.8
Tmax(hr) 0.96 ± 0.19 19.0 ± 1.0
T1/2(hr) 0.79 ± 0.01 24.5 ± 4.0
상기 표 1에 나타난 바와 같이, PEG5K-ILz-hTRAIL는 ILz-hTRAIL보다 혈중내 높은 농도로 존재하며, 최대농도에 도달하는 시간(Tmax)은 ILz-hTRAIL보다 19배 이상 증가한 것을 알 수 있으며, 반감기(T1/2)는 ILz-hTRAIL보다 30배 이상 긴 것으로 나타났다. 따라서, 본 발명의 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체는 약물 동력학적으로 우수한 약물임을 알 수 있었다.
이하, 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.
< 제제예 > 약학적 제제의 제조
본 발명에 따른 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 포함하는 약학적 제제들은 다음과 같이 제조하였다.
1. 산제의 제조
N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충전하여 산제를 제조하였다.
2. 정제의 제조
N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
3. 캡슐제의 제조
N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
4. 주사액제의 제조
N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
본 발명에 따라 제조된 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 경우 천연 TRAIL에 비하여 매우 우수한 용해도 및 안정성을 유지하며, 천연 TRAIL과 유사한 생물학적 활성도를 나타내면서도 약물의 체내 반감기를 획기적으로 증가시켜 증식성 질환 및 자가면역 질환의 예방 및 치료제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (31)

  1. 삼량체 형성 도메인을 N-말단에 포함하는 삼량체 형태의 TRAIL 중 하나의 단량체 N-말단에 PEG를 특이적으로 결합시킨 것을 특징으로 하는, N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 PEG 는 직선형 또는 가지형인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 PEG는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 숙신이미딜 프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 알데히드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 및 다중가지형 폴리에틸렌 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 PEG는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 알데히드인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 PEG의 분자량은 1,000 ~ 40,000의 범위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  7. 제6항에 있어서, 상기 PEG의 분자량은 5,000 ~ 40,000의 범위에서 선택되는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 TRAIL 은 천연 또는 유전자 재조합으로 얻어진 TRAIL 인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 TRAIL 은 1-281의 아미노산 서열을 갖는 인간 TRAIL 인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  11. 제10항에 있어서, 상기 TRAIL 은 114번 알지닌부터 281번 글리신까지의 아미노산 서열을 갖는 인간 TRAIL 인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 삼량체 형성 도메인은 이소루신 지퍼인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체.
  13. 삼량체 형성 도메인을 N-말단에 포함하는 삼량체 형태의 TRAIL의 N-말단 아민과 PEG의 알데하이드기를 환원제 하에서 반응시키는 단계를 포함하는, 제1항의 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  14. 삭제
  15. 제13항에 있어서, 상기 PEG 는 직선형 또는 가지형인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 PEG는 메톡시폴리에틸렌 글리콜 숙신이미딜 프로피오네이트, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 N-히드록시숙신이미드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 알데히드, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 말레이미드 및 다중가지형 폴리에틸렌 글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 PEG는 1,000 내지 40,000의 분자량을 갖는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 PEG는 5,000 내지 40,000의 분자량을 갖는 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  19. 제13항에 있어서, PEG/TRAIL 의 반응 몰비는 2 ~ 10인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 PEG/TRAIL 의 반응 몰비는 5 ~ 7.5인 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  21. 제13항에 있어서, 상기 TRAIL 은 천연 또는 유전자 재조합으로 얻어진 TRAIL 인 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  22. 삭제
  23. 제21항에 있어서, 상기 TRAIL 은 1-281의 아미노산 서열을 갖는 인간 TRAIL 인 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 TRAIL 은 114번 알지닌부터 281번 글리신까지의 아미노산 서열을 갖는 인간 TRAIL 인 것을 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  25. 제13항에 있어서, 상기 삼량체 형성 도메인은 이소루신 지퍼를 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  26. 제13항에 있어서, 상기 환원제는 NaCNBH3 및 NaBH4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 1 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체의 제조방법.
  27. 제1항의 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 유효성분으로 함유하는, 대장암, 신경교종암, 폐암, 전립선암, 뇌종양 또는 다발성 골수종 암종의 예방 및 치료제.
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 제1항의 N-말단이 수식된 PEG-TRAIL 결합체를 유효성분으로 함유하는 자가면역 질환의 예방 및 치료제.
  31. 제30항에 있어서, 상기 자가면역 질환은 실험적 자가 면역 뇌수막염, 류마티스 관절염 및 제1형 당뇨병을 포함하는 자가면역 질환의 예방 및 치료제.
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