KR100886650B1

KR100886650B1 - 신규 ２，３―시알릭 전이효소 및 이를 이용한 말단에갈락토오스를 포함하는 물질의 제조방법

Info

Publication number: KR100886650B1
Application number: KR1020070036276A
Authority: KR
Inventors: 우진석; 송재경; 김대희; 강선엽; 양지영; 정영수; 서원민; 길태건; 심상희
Original assignee: 주식회사 진켐
Priority date: 2007-04-13
Filing date: 2007-04-13
Publication date: 2009-03-06
Also published as: WO2008126993A1; KR20080092662A

Abstract

본 발명은 신규 2,3-시알릭 전이효소 및 이를 이용한 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745(Haemophilus ducreyi, KCTC 2745) 유래의 신규 2,3-시알릭 전이효소, 상기 2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-시알릭 전이효소의 제조방법 및 상기 2,3-시알릭 전이효소를 이용한 2,3-시알릴락토오스 등 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 2,3-시알릭 전이효소를 이용하여 2,3-시알릴락토오스 등 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질을 경제적으로 대량생산할 수 있다.

2,3-시알릭 전이효소, 2,3-시알릴락토오스

Description

신규 ２，３―시알릭 전이효소 및 이를 이용한 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질의 제조방법{Novel 2,3-Sialyltransferase and Method for Producing Compound Having Galatose in Terminal Using the Same}

도 1은 α-2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자(sialT)를 함유하는 재조합벡터를 나타낸 것이다.

도 2는 효소의 발현 여부 및 정제된 효소를 SDS-PAGE 젤을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다 [S 레인: 마커, 레인 1: 발현한 2,3-시알릭 전이효소, 레인 2: 친화성크로마토그래피 컬럼을 통과한 후의 용출액, 레인 3: 20mM 이미다졸로 용출한 분획, 레인 4: 50mM 이미다졸로 용출한 분획, 레인 5: 250mM 이미다졸로 용출한 분획, 레인 6: 탈염한 후의 2,3-시알릭 전이효소].

도 3은 2,3-시알릴락토오스의 합성 과정을 나타낸 모식도이다.

도 4는 5mM MgCl₂·6H₂O, 20mM CMP-N-아세틸뉴라민산과 10mM 락토오스 혼합물에 본 발명에 따른 2,3-시알릭 전이효소를 첨가하여 반응 진행 정도를 TLC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 5는 2,3-시알릴락토오스를 Bio-LC로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 6은 2,3-시알릴락토오스를 LC-Mass로 분석한 결과를 나타낸 것이다.

발명의 분야

배경기술

모유(human milk)에 포함되어 있는 여러 가지 성분 중에서 각종 질병을 감소시켜 주는 요소로서 면역글로불린 A(immunoglobulin A), 올리고당(oligosaccharides), 락톡시던트(lactoxidants), 뮤신(mucin) 등이 알려져 있다. 특히, 각종 질병을 방어하는 것으로 알려져 있는 올리고당 중 시알릴락토오 스(sialyl lactose)는 인플루엔자 A 바이러스의 헴어글루티닌(influenza A virus hemagglutinin, HA)과 강력한 친화력을 가져, 피막 조직 표면에 박테리아 또는 바이러스가 부착되는 것을 저해하여 감염을 완화시키거나 저해하는 역할을 하고 있다.

시알릴락토오스 및 시알릭 올리고당은 몸 조직, 피부 및 두뇌 등에 시알산을 공급하는 중요한 원천으로서의 작용한다. 시알산은 뇌 피질의 갱글리오사이드(ganglioside)에서 높은 농도로 발견되고 있으며, 여러 가지 동물 실험에서 시알산이 뇌의 갱글리오사이드(ganglioside)에 공급되면 뇌의 지능 발달에 상당히 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다.

현재 시알릴락토오스 및 시알릭 올리고당은 모유(human milk) 및 우유(cow milk)의 초유에 포함되어 있다는 것이 알려져 있으나, 시알릴락토오스 및 시알릭 올리고당을 생산하는 방법은 소의 초유에서 분리하여 얻는 방법이 유일하며, 이 방법으로 얻어진 시알릴락토오스 및 시알릭 올리고당을 분유에 첨가하여 일부 회사에서 사용하고 있으나, 일반적으로 사용하기에는 한계가 있다. 시알릴락토오스 및 시알릭 올리고당은 건강보조식품 또는 안티아데션(antiadesion) 신약으로의 개발 가능성이 높음에도 불구하고, 대부분 소의 초유에서 분리하여 얻고 있기 때문에 공급에 한계가 있어, 시알릴락토오스 및 시알릭 올리고당을 효소공정에 의해 대량생산하는 방법 및 다양한 시알릭 올리고당의 합성방법의 개발이 요구되고 있다.

해모필러스 듀크레이 35000HP(Haemophilus ducreyi 35000HP)의 전체 게놈 서열은 규명되어 있고(NCBI AE017143), 상기 균주(Haemophilus ducreyi 35000HP) 유 래 시알릭 전이효소 및 그 유전자(lst 유전자)가 알려져 있다 (Joel A. Bozue, et al ., Joural of Biological Chemistry, 274(7):4106, 1999).

이에, 본 발명자들은 2,3-시알릴락토오스를 경제적이고, 간단한 방법으로 제조하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745(Haemophilus ducreyi, KCTC 2745) 유래 신규 2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자를 확인하고, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터를 도입한 형질전환체를 배양하여 얻어진 2,3-시알릭 전이효소를 이용하면 2,3-시알릴락토오스를 경제적으로 대량생산할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 신규 2,3-시알릭 전이효소를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-시알릭 전이효소의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 2,3-시알릭 전이효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 그 말단에 갈락토오스(galactose)를 포함하는 물질의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2,3-시알릭 전이효소(2,3-sialyltransferase)를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

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본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-시알릭 전이효소의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 2,3-시알릭 전이효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 그 말단에 갈락토오스(galactose)를 포함하는 물질의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질은 2,3-시알릴락토오스(2,3-sialyllactose)인 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태는 신규 2,3-시알릭 전이효소 및 상기 2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터가 도입된 형질전환체를 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-시알릭 전이효소의 제조방법에 관한 것이다.

시알릭 전이효소를 코딩하는 해모필러스 듀크레이 HP35000(Haemophilus ducreyi HP35000) 유래 lst 유전자의 서열이 알려져 있으나, 본 발명에 따른 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745(Haemophilus ducreyi, KCTC 2745)의 서열과는 다르며, 상기 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745 유래 시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자에 대해서는 밝혀진 바 없다.

본 발명에 따르면, α-2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 sialT 유전자를 클로닝하기 위하여, 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR 법에 의해 sialT 유전자를 증폭한 후, 플라스미드 pET32a에 연결한 다음, E. coli XL1-Blue에 도입하였다. 상기 형질전환체로부터 플라스미드 pSIALT를 단리한 후, E. coli BL21(DE3)에 도입하여 E. coli/pSIALT를 제작하였다.

특히, 본 발명에서는 형질전환 미생물로서 E. coli BL21(DE3)만을 예시하였으나, 박테리아, 곰팡이, 효모 등에도 본 발명에 따른 재조합벡터를 도입하여 형질전환체를 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

상기 형질전환체 E. coli/pSIALT를 배양한 후, 세포를 수득하여 α-2,3-시알릭 전이효소의 발현 여부를 확인한 결과, 형질전환체에서 α-2,3-시알릭 전이효소가 과발현된다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 상기 형질전환체를 배양한 후, 세포를 파쇄하여 얻은 상등액을 친화성크로마토그래피 수지를 이용하여 정제함으로써 α-2,3-시알릭 전이효소를 수득하였다.

또한, 본 발명에서 2,3-시알릭 전이효소 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 21번째 티로신(Tyr) 또는 112번째 프롤린(Pro)을 다른 아미노산으로 치환한 변이체를 의미하며, 상기 변이체는 기존의 화학 합성법이나, 위치-특이적 돌연변이(site-directed mutagenesis) 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 한 예로, 21 위치의 티로신을 시스테인(Cys)으로 치환하거나, 112 위치의 프롤린이 글루타민(Gln)으로 치환함으로써 변이를 유발시켜, 2,3-시알릭 전이효소 변이체를 제조할 수 있다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.

라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 Sambrook, et . al ., supra의 1.82 섹션에 기술된 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다. 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann, et . al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결 되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발 현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 2,3-시알릭 전이효소를 이용하여 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-neuraminic acid)과 락토오스(lactose)를 함유하는 반응 혼합물을 본 발명에 따른 2,3-시알릭 전이효소를 이용하여 반응시켜 2,3-시알릴락토오스(2,3-sialyllactose)를 제조하였다 (도 3).

본 발명에서는 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질로서 2,3-시알릴락토오스만을 예시하고 있으나, N-아세틸락토사민(N-acetyllactosamine), 갈락티놀(Galactinol), 라피노오스(raffinose), 락툴로오스(lactulose), 멜리비오스(melibiose), 플란테오비오스(planteobiose), 스타키오스(stachyose), 락토실-1-O-헥사노산(Lactosyl-1-O-hexanoic acid) 및 N-아세틸락토사미닐-1-O-헥가노산(N-acetyllactosaminyl-1-O-hexanoic acid) 등 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질이라면 제한없이 2,3-시알릭 전이효소를 이용하여 제조할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. α-2,3- 시알릭 전이효소를 코딩하는 sialT 유전자의 클로닝 및 형질전환

α-2,3-시알릭 전이효소(α-2,3-sialyltransferase)를 코딩하는 sialT 유전자(서열번호 2)를 클로닝하기 위하여, 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745(Haemophilus ducreyi, KCTC 2745) 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 사용하여, PCR 법에 의해 sialT 유전자를 증폭하였다.

서열번호 3: 5'-TTGGATCCATGCTGATTCAACAAAATC

서열번호 4: 5'-GCGTCGACATTTAATTATGTATTGTAC

PCR 조건은 주형 DNA(10pmol) 1㎕, 프라이머 각각 1㎕, Primix(Genotech) 4㎕, 증류수 14㎕를 Mastercycler gradient PCR(Ependorf)을 이용하여 변성(denaturation, 96℃에서 1분), 결합(annealing, 52.5℃에서 1분), 연장(elongation, 72℃에서 2분) 단계를 총 30회 실시하였다.

상기 증폭된 PCR 산물을 반응액을 Plasmid mini-prep kit(Solgent)로 정제하고, 70% 에탄올을 첨가하여 DNA를 침전시켰다. 상기 침전 회수한 DNA를 아가로스겔 전기영동에 의해 확인하고, 1.2kb 상당의 DNA 단편을 정제하였다. 상기 정제된 DNA를 제한효소 BanHI 및 SalI로 절단하고, 상기와 동일한 제한효소 BanHI 및 SalI로 절단한 플라스미드 pET32a(Novagen)에 T4 DNA 리가아제(Takara)를 사용하여 연결한 다음, 이를 E. coli XL1-Blue에 도입하여 얻어진 앰피실린 내성 형질전환체로부터 플라스미드 pSIALT를 단리하였다 (도 1). 상기 pSIALT는 pET32a의 T7 프로모터 하류의 BanHI 및 SalI 절단부위에 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745(Haemophilus ducreyi, KCTC 2745)의 2,3-시알릭 전이효소 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입된 것이다.

상기 재조합 유전자에 염화칼슘을 처리하여 균체 내에 플라스미드를 도입하는 방법(J. Mol . Biol., 53:159, 1970)으로 고발현 균주 E. coli BL21(DE3)(Invitrogen)에 도입하여, 형질전환체 E. coli/pSIALT를 수득하였다.

실시예 2. α-2,3- 시알릭 전이효소의 발현 확인

상기 형질전환체 E. coli/pSIALT를 앰피실린 항생제가 처리된 LB 배지에서 배양한 종균 1㎖를 본배양 LB 배지 50㎖에 접종한 후, 37℃에서 세포밀도가 OD₆₀₀=0.6~0.8일 때까지 배양을 하고, 0.4mM이 되도록 IPTG를 첨가하여 20℃에서 세포밀도(OD₆₀₀)가 약 3~5일 때까지 배양을 한 다음, 세포를 수확하였다. 상기 수득된 세포를 초음파 파쇄기 또는 프렌치프레스로 파쇄한 후, SDS-PAGE 젤을 통해 효소의 발현 정도를 확인하였다 (도 2, 레인 1).

그 결과, 형질전환체에서 삽입된 sialT 유전자에 의해 코딩되는 α-2,3-시알릭 전이효소(α-2,3-sialyltransferase)가 과발현되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3. α-2,3-시알릭 전이효소의 정제

상기 α-2,3-시알릭 전이효소(α-2,3-sialyltransferase)는 his-테그 융합 단백질을 포함하고 있기 때문에 친화성크로마토그래피 수지(Ni² ⁺ 컬럼, 바이오프로젠)를 이용하여 정제하였다 (Protein purification techniqes 제2판, Oxford University Press, 2001).

상기 형질전환체를 배양한 후 세포를 파쇄하여 얻은 상등액을 친화성크로마토그래피 수지가 충진된 컬럼에 통과시키고, 상기 컬럼을 20mM 이미다졸(imidazole)/0.5M NaCl(50mM Tris HCl(pH7.5)) 및 50mM 이미다졸/0.5M NaCl(50mM Tris HCl(pH7.5))로 차례로 세척하였다. 마지막으로 용출액 250mM 이미다졸(50mM Tris HCl(pH7.5))를 이용하여 목적 단백질을 수득하였다.

상기에서 수득된 목적 단백질을 투석용 막을 이용하여 완충용액 50mM Tris HCl(pH7.5)에서 탈염한 후, SDS-PAGE 젤을 통해 확인하였다 (도 2, 레인 2~6). 그 결과, α-2,3-시알릭 전이효소가 정제된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. α-2,3-시알릴락토오스의 합성 및 분석

50mM Tris HCl(pH7.5) 완충용액에 5mM MgCl₂·6H₂O, 20mM CMP-N-아세틸뉴라민산(Sigma) 및 10mM 락토오스를 넣고, 상기 실시예 3에서 정제된 α-2,3-시알릭 전이효소를 첨가하여 반응시켰다. 반응의 진행 정도를 TLC(전개용매: 이소프로필 알콜:NH₄OH:H₂O=7:5:1) 및 바이오-LC(Metrohm 사)로 확인하였다. 그 결과, α-2,3- 시알릴락토오스가 합성되었다는 것을 확인할 수 있었다 (도 4 및 도 5). 아울러 NMR 및 LC-Mass 분석 결과, 상기 합성된 물질이 α-2,3-시알릴락토오스라는 것을 추가로 확인하였다 (도 6).

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 신규 2,3-시알릭 전이효소 및 이를 이용한 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질의 제조방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 해모필러스 듀크레이 KCTC 2745(Haemophilus ducreyi, KCTC 2745) 유래의 신규 2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자가 도입된 형질전환체를 배양하여 수득된 2,3-시알릭 전이효소를 이용하여 2,3-시알릴락토오스 등의 그 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질을 경제적으로 대량생산할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Genechem <120> NOVEL 2,3-SIALYLTRANSFERASE AND METHOD FOR PRODUCING COMPOUND HAVING GALACTOSE IN TERMINAL USING THE SAME <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 399 <212> PRT <213> Haemophilus ducreyi <400> 1 Met Leu Ile Gln Gln Asn Leu Glu Ile Tyr Leu Asp Tyr Ala Thr Ile 1 5 10 15 Pro Ser Leu Ala Tyr Phe Met His Phe Ile Gln His Lys Asp Asp Val 20 25 30 Asp Ser Ile Arg Leu Phe Gly Leu Ala Arg Phe Asp Ile Pro Gln Ser 35 40 45 Ile Ile Asp Arg Tyr Pro Ala Asn His Leu Phe Tyr His Asn Ile Asp 50 55 60 Asn Arg Asp Leu Thr Ala Val Leu Asn Gln Leu Ala Asp Ile Leu Ala 65 70 75 80 Gln Glu Asn Lys Arg Phe Gln Ile Asn Leu His Leu Asn Leu Phe His 85 90 95 Ser Ile Asp Leu Phe Phe Ala Ile Tyr Pro Ile Tyr Gln Gln Tyr Pro 100 105 110 His Lys Ile Ser Thr Ile Gln Leu Gln Leu Tyr Asp Asp Gly Ser Glu 115 120 125 Gly Ile Val Thr Gln His Ser Leu Cys Lys Ile Ala Asp Leu Glu Gln 130 135 140 Leu Ile Leu Gln His Lys Asn Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Lys Gly 145 150 155 160 Thr Ala Asn Val Pro Asn Pro Thr Leu Leu Arg Tyr Leu Trp Asn Asn 165 170 175 Ile Ile Asp Ser Gln Phe His Leu Ile Ser Asp His Phe Leu Gln His 180 185 190 Pro Lys Leu Gln Pro Leu Lys Arg Leu Leu Lys Arg Tyr Thr Ile Leu 195 200 205 Asp Phe Thr Cys Tyr Pro Arg Phe Asn Ala Glu Gln Lys Gln Leu Leu 210 215 220 Lys Glu Ile Leu His Ile Ser Asn Glu Leu Glu Asn Leu Leu Lys Leu 225 230 235 240 Leu Lys Gln His Asn Thr Phe Leu Phe Thr Gly Thr Thr Ala Phe Asn 245 250 255 Leu Asp Gln Glu Lys Leu Asp Leu Leu Thr Gln Leu His Ile Leu Leu 260 265 270 Leu Asn Glu His Gln Asn Pro His Ser Thr His Tyr Ile Gly Asn Asn 275 280 285 Tyr Leu Leu Leu Ile Lys Gly His Ala Asn Ser Pro Ala Leu Asn His 290 295 300 Thr Leu Ala Leu His Phe Pro Asp Ala Ile Phe Leu Pro Ala Asn Ile 305 310 315 320 Pro Phe Glu Ile Phe Ala Met Leu Gly Phe Thr Pro Asn Lys Met Gly 325 330 335 Gly Phe Ala Ser Thr Ser Tyr Ile Asn Tyr Pro Thr Glu Asn Ile Asn 340 345 350 His Leu Phe Phe Leu Thr Ser Asp Gln Pro Ser Ile Arg Thr Lys Trp 355 360 365 Leu Asp Tyr Glu Lys Gln Phe Gly Leu Met Tyr Ser Leu Leu Ala Met 370 375 380 Gln Lys Ile Asn Glu Asp Gln Ala Phe Met Cys Thr Ile His Asn 385 390 395 <210> 2 <211> 1200 <212> DNA <213> Haemophilus ducreyi <400> 2 atgctgattc aacaaaatct tgaaatttat cttgattatg caactatccc aagcttggct 60 tattttatgc attttattca acataaagat gatgttgata gcattcgttt atttggtcta 120 gcacgttttg atattccaca atcaattatc gatcgctatc ctgctaacca tttgttctac 180 cataacatcg ataatcgtga tcttactgcc gtattaaatc aactagcaga cattcttgcc 240 caagagaata agcgcttcca gatcaatcta catttaaacc tatttcacag catcgactta 300 ttttttgcca tttacccaat ctatcagcaa tatccacata aaatttcaac tattcaatta 360 cagctttatg atgatggctc agaaggcatt gtcacccagc attctttatg taaaatagcc 420 gatcttgagc aactgatttt gcaacataaa aatgtattac tagaactgct tactaaaggc 480 actgctaacg tgcctaatcc tactttgctc cgctatttat ggaataacat tattgatagc 540 caatttcact tgatttctga tcatttcctc cagcatccta aattacaacc gctaaaacgc 600 ttattaaaac gttatacaat tttagatttt acttgttatc ctcgctttaa tgctgagcaa 660 aaacaactcc tcaaagaaat attgcatatc tctaatgagc tagaaaactt attaaaactg 720 ctcaaacagc ataatacttt tttatttacg ggcacaaccg cctttaactt ggatcaagaa 780 aaacttgact tattaacaca actacatatt ttgttgctta atgagcacca aaatccccac 840 tcaacgcatt acattggcaa taattattta ttactgatta aaggccacgc aaatagtcct 900 gctttgaatc atactttagc tttacatttt cctgatgcaa tattcctgcc tgctaatatt 960 ccatttgaga tctttgcaat gctaggtttt acgcccaata aaatgggggg ctttgctagc 1020 actagctaca ttaattatcc aacagaaaat ataaatcatc tgttcttctt aacctctgat 1080 cagccgtcta ttcgaaccaa atggttggat tatgaaaagc agtttggctt aatgtatagt 1140 ttattagcca tgcaaaaaat caatgaagat caagcattta tgtgtacaat acataattaa 1200 1200 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ttggatccat gctgattcaa caaaatc 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gcgtcgacat ttaattatgt attgtac 27

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 2,3-시알릭 전이효소(2,3-sialyltransferase).
삭제
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제1항의 2,3-시알릭 전이효소를 코딩하는 유전자.
제4항의 유전자를 함유하는 재조합벡터.
제5항의 재조합벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제6항의 재조합 미생물을 배양하는 것을 특징으로 하는 2,3-시알릭 전이효소의 제조방법.
제1항의 2,3-시알릭 전이효소를 이용하는 것을 특징으로 하는 그 말단에 갈락토오스(galactose)를 포함하는 물질의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 말단에 갈락토오스를 포함하는 물질은 2,3-시알릴락토오스(2,3-sialyic lactose)인 것을 특징으로 하는 제조방법.