KR100886139B1 - Method for preparing oligonucleotide - Google Patents

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KR100886139B1 KR1020070115302A KR20070115302A KR100886139B1 KR 100886139 B1 KR100886139 B1 KR 100886139B1 KR 1020070115302 A KR1020070115302 A KR 1020070115302A KR 20070115302 A KR20070115302 A KR 20070115302A KR 100886139 B1 KR100886139 B1 KR 100886139B1
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알렉세이 카유신
김문희
김경일
김성원
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Abstract

A manufacturing method of oligonucleotide[r(NMP)n] is provided to synthesize efficiently oligonucleotide of 15-20% higher purity compared with that of prior oligonucleotide in shortened time. A manufacturing method of oligonucleotide[r(NMP)n] comprises steps of: (a) coupling ribonucleotide dimer [(rNMP)2] or ribonucleotide trimer [(rNMP)3] in a solid supporter-ribonucleoside[SS-(rNS)1] and manufacturing SS-(rNS)1-(rNMP)2 or SS-(rNS)1-(rNMP)3; (b) coupling consecutively ribonucleotide monomer to the outcome of the step (a); (c) removing a solid support(SS) from the SS-(rNS)1-(rNMP)2-(rNMP)n-3 or the SS-(rNS)1-(rNMP)3-(rNMP)n-4 and obtaining [r(NMP)n]. The ribonucleotide has phospho die ester bond, phosphoramidate bond, alkyl phosphoramidate bond, alkylphosphonate bond, phosphorothioate bond, alkyl phosphotriester bond or alkylphosphonothioate bond.

Description

올리고뉴클레오타이드의 제조방법{Method for Preparing Oligonucleotide}Method for preparing oligonucleotide {Method for Preparing Oligonucleotide}

본 발명은 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 고상(solid phase)에서의 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a process for the preparation of oligonucleotides. More specifically, the present invention relates to a process for preparing oligonucleotides in a solid phase.

올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 대한 많은 기술들이 알려져 있다. 예를 들어, Khorana et al., J. Molec. Biol. 72:209(1972), Reese, Tetrahedron Lett. 34:3143(1978), Beaucage와 Caruthers, Tetrahedron Lett. 22:1859(1981), 미국 특허 제5,149,798호, Agrawal 및 Goodchild, Tetrahedron Lett. 28:3539 (1987), Connolly et al. Biochemistry 23, 3443(1984), Jager et al., Biochemistry 27:7237(1988), Agrawal et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079(1988), E.g., Methods in Molecular Biology, Vol. 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, p. 63-80 (S. Agrawal, Ed., Humana Press 1993); Methods in Molecular Biology, Vol. 26: Protocols for Oligonucleotide Conjugates (Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, N.J. 1994); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach pp. 155-183 (Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford 1991); Antisense Res. and Applns. pp. 375 (Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla. 1993); Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Erickson and Izant, eds., Raven Press, New York, 1992) 등에 올리고뉴클레오타이드의 제조방법에 대한 기술들이 소개되어 있다.Many techniques for the preparation of oligonucleotides are known. See, eg, Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972), Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143 (1978), Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859 (1981), US Pat. No. 5,149,798, Agrawal and Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539 (1987), Connolly et al. Biochemistry 23, 3443 (1984), Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988), Agrawal et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079 (1988), E.g., Methods in Molecular Biology, Vol. 20, Protocols for Oligonucleotides and Analogs, p. 63-80 (S. Agrawal, Ed., Humana Press 1993); Methods in Molecular Biology, Vol. 26: Protocols for Oligonucleotide Conjugates (Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa, N. J. 1994); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach pp. 155-183 (Eckstein, Ed., IRL Press, Oxford 1991); Antisense Res. and Applns. pp. 375 (Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, Fla. 1993); Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Erickson and Izant, eds., Raven Press, New York, 1992) has described techniques for preparing oligonucleotides.

한편, 안티센스 RNA는 핵산 분자에 혼성화 되어 유전자 발현을 억제한다. 많은 연구자들이 안티센스 RNA를 이용하여 특정 유전자의 발현을 억제하거나 특정 질환의 치료 가능성을 보고한 바 있다(Barker et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:514(1996); Agrawal et al., Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85:7079(1988); Letter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87:3420-3434(1990); Offensperger et al. EMBO J. 12:1257(1993)).On the other hand, antisense RNA hybridizes to nucleic acid molecules to inhibit gene expression. Many researchers have used antisense RNA to report the possibility of inhibiting the expression of certain genes or treating certain diseases (Barker et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93: 514 (1996); Agrawal et al. , Proc . Natl . Acad . Sci. USA 85: 7079 (1988); Letter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87: 3420-3434 (1990); Offensperger et al. EMBO J. 12: 1257 (1993)).

한편, RNA-매개 방해 (RNA-mediated interference: RNAi)는 21-25 뉴클레오타이드(nt) 크기의 작은 RNA 조각이 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 선택적으로 결합하여 분해함으로써 단백질 발현을 억제하는 현상이다(Shen C, et al., FEBS Lett. 539(1-3):111-4(2003)). RNAi 현상은 1995년에 C. elegance와 식물에서 유전자를 조절하는 메커니즘의 일부로 처음 발견되었으며, 1998년 미국 카네기 연구소의 Andrew Fire와 매사츄세츠 의과대학의 Craig Mello 팀의 실험을 통해, 특정 유전자의 염기서열에 해당하는 이중쇄 RNA (dsRNA)를 선충(Caenorphabditis elegans)의 체내에 주입하였을 때 그 유전자의 발현이 현저히 억제될 수 있음이 밝혀졌다(Fire A, et al., Nature. 391(6669):806-11(1998)). C. elegans에 주입된 장쇄의 dsRNA는 RNase Ⅲ 패밀리에 속하는 Dicer라는 효소에 의해 21-25 bp 크기의 작은 방해 RNA (small interfering RNA: siRNA)로 절단되고, 그 절단된 짧은 dsRNA는 RISC (RNA-induced silencing complex) 효소 결합체에 합체되어 siRNA의 이중나선이 풀리게 된다. 이후, 단일 가닥으로 분리된 siRNA는 상보적인 서열을 갖는 특정 유전자의 mRNA에 결합하여 분해함으로써 그 유전자의 발현을 억제한다). 또한, Elbashir 연구팀에서 21개 염기의 짧은 dsRNA (siRNA)를 배양된 포유동물 세포에 주입하여 특정 유전자의 발현을 선택적으로 억제할 수 있음을 보고한 후, 포유동물세포에서의 RNAi 이용 가능성이 크게 증가하였다(Elbashir, S.M. et al., Nature 411(6836):494-8(2001)).On the other hand, RNA-mediated interference (RNAi) is a phenomenon in which small RNA fragments of 21-25 nucleotides (nt) selectively bind to and degrade the mRNA having complementary sequences to inhibit protein expression (Shen C, et al., FEBS Lett . 539 (1-3): 111-4 (2003). The RNAi phenomenon was first discovered in 1995 as part of C. elegance and the mechanisms by which genes are regulated in plants. When injected into the body of nematode Caenorphabditis elegans , a double-stranded RNA (dsRNA) corresponding to the sequence was found to significantly inhibit the expression of the gene (Fire A, et al., Nature . 391 (6669): 806-11 (1998). The long-chain dsRNA injected into C. elegans is cleaved into small interfering RNA (siRNA) of 21-25 bp by an enzyme called Dicer belonging to the RNase III family. induced silencing complex) is combined with an enzyme conjugate to release the double helix of the siRNA. The siRNA separated into single strands then binds to and degrades the mRNA of a particular gene having complementary sequences to inhibit expression of that gene). In addition, Elbashir's team reports that 21 d of short dsRNA (siRNA) can be injected into cultured mammalian cells to selectively inhibit the expression of certain genes, which greatly increases the availability of RNAi in mammalian cells. (Elbashir, SM et al., Nature 411 (6836): 494-8 (2001).

현재, siRNA를 이용한 유전자 발현 억제 기술은 다양한 종류의 유전자들의 기능을 이해하는데 널리 이용되고 있을 뿐 아니라, 암, 감염성 질환과 같은 난치성 질환을 치료하는 치료제로서도 활발히 개발되고 있다(Mouldy Sioud. Therapeutic siRNAs . Trends in pharmacological Sciences 2004;22-28). Currently, siRNA-induced gene expression suppression technology is widely used to understand the functions of various types of genes, and is also actively developed as a therapeutic agent for treating intractable diseases such as cancer and infectious diseases (Mouldy Sioud. Therapeutic siRNAs . Trends in pharmacological Sciences 2004; 22-28).

상술한 바와 같이, 안티센스 RNA 및 siRNA를 이용하여 치료제 또는 진단제를 개발하려는 많은 시도가 있으며, 이러한 활발한 개발 활동을 뒷받침하기 위하여 올리고리보뉴클레오타이드를 대량으로 합성을 하고 있다. 따라서 올리고리보뉴클레오타이드에 대한 효율적인 생산 방법에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다.As described above, many attempts have been made to develop therapeutics or diagnostic agents using antisense RNAs and siRNAs, and oligoribonucleotides have been synthesized in large quantities to support such active development activities. Therefore, a lot of research on the efficient production method for oligoribonucleotides.

올리고뉴클레오타이드의 합성은 통상적으로 고체수지에서 각 모노머를 축합하여 자동합성기로 합성된다. DNA 올리고의 경우는 축합수율이 좋으나, 특히 RNA 올리고, 즉 올리고리보뉴클레오타이드는 2’-OH기에 대한 보호기로 인하여 합성시간이 길고, 수율이 낮아 고순도의 RNA 올리고를 얻기가 어렵다.Synthesis of oligonucleotides is typically synthesized by autosynthesizing by condensing each monomer in a solid resin. In the case of DNA oligos, condensation yield is good, but in particular, RNA oligos, ie oligoribonucleotides have a long synthesis time due to protecting groups for 2′-OH groups, and low yields make it difficult to obtain high purity RNA oligos.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.Throughout this specification, many papers and patent documents are referenced and their citations are indicated. The disclosures of cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety, and the level of the technical field to which the present invention belongs and the contents of the present invention are more clearly explained.

본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드, 특히 올리고리보뉴클레오타이드 또는 siRNA(small interfering) RNA와 같은 올리고 분자를 보다 높은 순도로 보다 편리하게 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 올리고 분자를 화학적으로 제조하는 경우, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용하면 크게 개선된 순도로 올리고뉴클레오타이드 분자를 제조할 수 있다는 것을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.The inventors have sought to develop a method for producing oligonucleotides, in particular oligoribonucleotides or oligo molecules such as siRNAs (small interfering) RNAs, with higher purity and more conveniently, and as a result, when chemically preparing oligo molecules, The present invention has been completed by discovering that dimers or nucleotide trimers can be used to prepare oligonucleotide molecules with greatly improved purity.

따라서 본 발명의 목적은 올리고뉴클레오타이드의 제조방법을 제공하는 데 있다.It is therefore an object of the present invention to provide a method for preparing an oligonucleotide.

본 발명의 다른 목적은 리보뉴클레오타이드 다이머 및 트라이머를 제공하는 데 있다.It is another object of the present invention to provide ribonucleotide dimers and trimers.

본 발명의 또 다른 목적은 리보뉴클레오타이드 다이머 및 트라이머의 제조방법을 제공하는 데 있다.Still another object of the present invention is to provide a method for preparing ribonucleotide dimers and trimers.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.Other objects and advantages of the present invention will become apparent from the following detailed description, claims and drawings.

본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용하며 다음의 단계를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 제조방법을 제공한다:According to an aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing an oligonucleotide using a nucleotide dimer or nucleotide trimer and comprising the following steps:

(a) (i) 출발물질로서 고상 지지체에 결합된 뉴클레오사이드에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키거나, (ⅱ) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체(universal solid support)에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머를 커플링시키거나, 또는 (ⅱ) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 단계; 그리고, (a) (i) coupling a nucleotide dimer or nucleotide trimer as a first coupling reactant to a nucleoside bound to a solid support as a starting material, or (ii) a universal solid support as a starting material. Coupling the nucleotide dimer as the first coupling reactant to (ii) or the nucleotide trimer as the first coupling reactant to the universal solid phase support as starting material; And,

(b) 상기 단계 (a)의 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시켜 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계.(b) coupling oligonucleotide monomers, nucleotide dimers or nucleotide trimers to the product of step (a) continuously to produce oligonucleotides.

본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드, 특히 올리고리보뉴클레오타이드 또는 siRNA(small interfering) RNA와 같은 올리고 분자를 보다 높은 순도로 보다 편리하게 제조할 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 올리고 분자를 화학적으로 제조하는 경우, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용하면 크게 개선된 순도로 올리고뉴클레오타이드 분자를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다.The inventors have sought to develop a method for producing oligonucleotides, in particular oligoribonucleotides or oligo molecules such as siRNAs (small interfering) RNAs, with higher purity and more conveniently, and as a result, when chemically preparing oligo molecules, It has been found that dimers or nucleotide trimers can be used to prepare oligonucleotide molecules with greatly improved purity.

본 발명은 고체 지지상을 이용하는 올리고뉴클레오타이드 합성법에서 고체상에 축합시키는 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 모노머가 아닌 다이머 혹은 트라이머를 이용함으로써 최종적으로 얻어지는 올리고뉴클레오타이드의 순도를 확연히 개선시킨다. 올리고뉴클레오타이드 합성에서 발생하는 불순물은 주로 완전한 서열(Nmer)에서 축합이 덜 된 짧은 서열로 구성되어 있으며, 이들은 보통 (N-1)mer, (N-2)mer, (N-x)mer 등으로 표현된다. 이는 고체상에 뉴클레오타이드를 축합시킬시 축합반응 후 캡핑단계에서 완전히 캡핑이 되지 않아 Nmer보다 짧은 서열의 불순물이 발생한다. 이러한 불완전한 캡핑반응은 고체지지상에 첫 번째 축합반응에서 많이 발생한다.The present invention significantly improves the purity of the oligonucleotides finally obtained by using dimers or trimers rather than nucleotide monomers as the first coupling reactants to condense the solid phase in oligonucleotide synthesis using a solid support phase. Impurities that occur in oligonucleotide synthesis consist mainly of short sequences that are less condensed in the complete sequence (Nmer) and are usually represented by (N-1) mer, (N-2) mer, (Nx) mer, etc. . This is because when condensing nucleotides on the solid phase, impurities of a shorter sequence than Nmer are generated because the capping step is not completely capped after the condensation reaction. This incomplete capping reaction occurs frequently in the first condensation reaction on the solid support.

또한, 올리고뉴클레오타이드의 정제과정에서 가장 분리가 어려운 불순물은 크로마토그램에서 비슷한 위치에서 용출되는 (N-1)mer이다. In addition, the most difficult impurity in the purification of oligonucleotides is (N-1) mer, which elutes at a similar position in the chromatogram.

본 발명에 따르면, 첫 번째 축합반응에서 모노머가 아닌 다이머 혹은 트라이머를 이용함으로써 정제과정에서 제거가 힘든 (N-1)mer의 발생을 차단하고 정제가 쉬운 (N-2)mer 및 (N-3)mer를 발생시켜 보다 순수한 올리고뉴클레오타이드를 얻는 다.According to the present invention, in the first condensation reaction, dimers or trimers other than monomers are used to block the generation of (N-1) mers, which are difficult to remove during purification, and to facilitate (N-2) mers and (N-) 3) Generate mer to obtain purer oligonucleotides.

하기의 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명은 주로 첫 번째 반응에서 많이 발생하는 (N-1)mer의 감소는 물론 전체적인 (N-x)mer의 발생감소를 초래하였다. 이는 고체상의 첫 번째 축합반응에서 모노머 대신 긴 구조의 다이머 혹은 트라이머가 축합된 후 다음 모노머 축합반응시 캡핑이 안된 곳보다 축합된 다이머 혹은 트라이머에 결합하는 것이 보다 공간적으로 유리하여 전반적인 짧은 서열의 발생을 감소시켜 순도가 높은 올리고뉴클레오타이드 합성결과를 초래하기 때문이다.As demonstrated in the examples below, the present invention resulted in a reduction in the overall (N-x) mer as well as a reduction in the (N-1) mer, which frequently occurs in the first reaction. In the first condensation reaction of solid phase, it is more spatially advantageous to bind the condensed dimer or trimer after condensation of long structure dimer or trimer instead of monomer in the next monomer condensation reaction. This is because it results in a high purity oligonucleotide synthesis result.

본 발명은 다양한 올리고뉴클레오타이드, 즉 디옥시리보뉴클레오타이드 올리고머, 리보뉴클레오타이드 올리고머 및 이들의 유도체에 적용될 수 있다. 보다 상세하게는, 본 발명은 자연(naturally occurring)의 올리고뉴클레오타이드뿐만 아니라 변형 올리고뉴클레오타이드에도 적용될 수 있다. 예컨대, 본 발명에 의해 제조되는 올리고뉴클레오타이드는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 포스포로티오에이트 DNA 또는 RNA, 포스포로디티오에이트 DNA 또는 RNA, 포스포로아미데이트 DNA 또는 RNA; 당 변형된 올리고뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-O-에틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2‘-할로겐 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA; 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸 -, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.The present invention can be applied to various oligonucleotides, namely deoxyribonucleotide oligomers, ribonucleotide oligomers and derivatives thereof. More specifically, the present invention can be applied to naturally occurring oligonucleotides as well as to modified oligonucleotides. For example, oligonucleotides prepared by the present invention may include backbone modified nucleotides such as phosphorothioate DNA or RNA, phosphorodithioate DNA or RNA, phosphoramidate DNA or RNA; Sugar modified oligonucleotides such as 2'-0-methyl RNA, 2'-0-ethyl RNA, 2'-fluoro RNA, 2'-halogen RNA, 2'-amino RNA, 2'-0-alkyl RNA, 2'-0-alkyl DNA, 2'-0-allyl DNA, 2'-0-alkynyl DNA, hexose DNA, pyranosyl RNA and anhydrohexitol DNA; And nucleotides with base modifications such as C-5 substituted pyrimidines (substituents are fluoro-, bromo-, chloro-, iodo-, methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, ethyl-, Propynyl-, alkynyl-, thiazolyl-, imidazoryl-, pyridyl-, 7-deazapurine with C-7 substituents (substituents are fluoro-, bromo-, chloro-, iodo -, Methyl-, ethyl-, vinyl-, formyl-, alkynyl-, alkenyl-, thiazolyl-, imidazoryl-, pyridyl-), inosine and diaminopurine.

바람직하게는, 본 발명은 리보뉴클레오타이드 올리고머에 적용된다.Preferably, the present invention applies to ribonucleotide oligomers.

본 명세서에서, 용어 “리보뉴클레오타이드”는 2’-H를 가지지 않는 뉴클레오타이드를 의미하며, 자연(naturally occurring)의 리보뉴클레오타이드뿐만 아니라 그의 유사체를 포함한다. 예를 들어, 당의 2번 탄소에 있는 -OH기에 알킬기(예컨대, 메틸 또는 에틸)가 결합되거나, 2번 탄소에 -OH기 대신에 할로겐족 원소(예컨대, 플루오로) 또는 아미노기가 결합된 리보뉴클레오타이드의 유사체도 본 명세서의 용어 “리보뉴클레오타이드”에 포함된다.As used herein, the term “ribonucleotide” refers to a nucleotide that does not have 2′-H, and includes naturally occurring ribonucleotides as well as analogs thereof. For example, an alkyl group (e.g. methyl or ethyl) is bonded to the -OH group on the carbon number 2 of the sugar, or a ribonucleotide having a halogen group (e.g. fluoro) or amino group attached to the carbon number 2 instead of the -OH group Analogs are also included in the term “ribonucleotide” herein.

2’-H를 갖는 뉴클레오타이드는 디옥시리보뉴클레오타이드로 명명된다.Nucleotides with 2′-H are termed deoxyribonucleotides.

본 명세서, 용어 “뉴클레오타이드”는 특별한 언급이 없는 한, 리보뉴클레오타이드, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 이들의 유도체들을 포괄한다.As used herein, unless otherwise indicated, the term “nucleotide” encompasses ribonucleotides, deoxyribonucleotides and derivatives thereof.

본 발명의 가장 큰 특징 중 하나는 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 첫 번째 커플링 반응에 이용하는 것이다.One of the greatest features of the present invention is the use of nucleotide dimers or nucleotide trimers for the first coupling reaction.

본 발명의 방법은 뉴클레오타이드 다이머또는 뉴클레오타이드 트라이머를 이용한다는 측면에서 공통점을 갖지만, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드, 즉 고체 지지상에 결합된 뉴클레오타이드의 종류에 따라 다음과 같이 크게 3가지 공정으로 나눌 수 있다:The method of the present invention has a common point in terms of using a nucleotide dimer or a nucleotide trimer, but it can be divided into three processes as follows according to the type of nucleotide at the 3'-end, that is, the nucleotide bound to the solid support. have:

3가지 공정 중 하나는, 3’-말단에 뉴클레오사이드가 위치하는 것이다. 즉, 합성 과정의 출발물질로서 뉴클레오사이드 모노머가 프리로딩(preloading)된 고상 지지체가, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링 되고, 이어 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링되어 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다.One of the three processes is the nucleoside is located at the 3'-terminus. That is, the solid support which is preloaded with the nucleoside monomer as a starting material of the synthesis process is coupled to the nucleotide dimer or nucleotide trimer as the first coupling reaction, and subsequently the nucleotide monomer, nucleotide is successively connected to the resultant. Dimers or nucleotide trimers are coupled to produce oligonucleotides of the desired sequence.

3가지 공정 중 다른 하나는, 3’-말단에 뉴클레오타이드 다이머가 위치하는 것이다. 이 경우에는 유니버셜 고상 지지체가 출발물질로서 이용된다.Another of the three processes is where the nucleotide dimer is located at the 3′-end. In this case, a universal solid support is used as the starting material.

본 명세서에서 용어 “유니버셜 고상 지지체”는 공유결합되어 있는 뉴클레오사이드 또는 올리고뉴클레오타이드가 없는 고상 지지체를 의미한다. 프리로딩된 지지체와 다르게, 유니버셜 고상 지지체는 올리고뉴클레오타이드의 말단에 있는 서열에 제한되지 않고 어떠한 올리고뉴클레오타이드도 합성할 수 있다. 유니버셜 지지체를 이용하면, 올리고뉴클레오타이드의 첫 번째 커플링 반응에 적용되는 뉴클레오타이드 씬톤(nucleotide synthon)에 의해 최종적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드의 말단 서열이 결정된다. As used herein, the term "universal solid support" means a solid support that is free of covalently bonded nucleosides or oligonucleotides. Unlike the preloaded support, the universal solid support is not limited to the sequence at the end of the oligonucleotide and can synthesize any oligonucleotide. Using the universal support, the terminal sequence of the finally synthesized oligonucleotide is determined by the nucleotide synthon applied to the first coupling reaction of the oligonucleotide.

합성 과정의 첫 단계에서 출발물질로서 유니버셜 고상 지지체가 이용되며, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머가 이용된다. 이어 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링되어 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 예를 들어, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 다이머에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 결합시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 또한, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 다이머에 적절하게 뉴클레오타이드 다이머 및 뉴클레 오타이드 모노머를 커플링시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.In the first step of the synthesis process, a universal solid phase support is used as the starting material, and a nucleotide dimer is used as the first coupling reactant. Subsequently nucleotide monomers, nucleotide dimers or nucleotide trimers are coupled to the result to produce oligonucleotides of the desired sequence. For example, desired oligonucleotides can be prepared by binding nucleotide monomers sequentially to the nucleotide dimer at the 3′-end. In addition, the desired oligonucleotides can be prepared by coupling the nucleotide dimers and nucleotide monomers appropriately to the nucleotide dimers at the 3′-end.

3가지 공정 중 마지막 하나는, 3’-말단에 뉴클레오타이드 트라이머가 위치하는 것이다. 이 경우에는 유니버셜 고상 지지체가 출발물질로서 이용된다. 합성 과정의 첫 단계에서 출발물질로서 유니버셜 고상 지지체가 이용되며, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 트라이머가 이용된다. 이어 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머가 커플링되어 원하는 서열의 올리고뉴클레오타이드를 제조한다. 예를 들어, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 트라이머에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 결합시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다. 또한, 3’-말단에 있는 뉴클레오타이드 트라이머에 적절하게 뉴클레오타이드 다이머, 뉴클레오타이드 모노머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시켜 원하는 올리고뉴클레오타이드를 제조할 수 있다.The last one of the three processes is where the nucleotide trimmer is located at the 3′-end. In this case, a universal solid support is used as the starting material. In the first step of the synthesis process, a universal solid support is used as the starting material, and the nucleotide trimer is used as the first coupling reactant. Subsequently nucleotide monomers, nucleotide dimers or nucleotide trimers are coupled to the result to produce oligonucleotides of the desired sequence. For example, the desired oligonucleotide can be prepared by binding the nucleotide monomers sequentially to the nucleotide trimmer at the 3′-end. In addition, the desired oligonucleotide can be prepared by coupling the nucleotide dimer, nucleotide monomer or nucleotide trimer to the nucleotide trimmer at the 3′-end as appropriate.

3가지 공정 중 가장 바람직한 것은, 출발물질로서 고상 지지체에 하나의 뉴클레오사이드가 결합된 것을 이용하고, 여기에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 반응이다.The most preferred of the three processes is to use one nucleoside bound to a solid support as a starting material and to couple a nucleotide dimer or nucleotide trimer as a first coupling reactant thereto.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 (a) 출발물질로서 고상 지지체에 결합된 뉴클레오사이드에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a) 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 커플링시켜 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계를 포함한다.According to a preferred embodiment of the present invention, the process of the present invention comprises the steps of: (a) coupling a nucleotide dimer or nucleotide trimer as a first coupling reactant to a nucleoside bound to a solid support as a starting material; And (b) coupling oligonucleotide monomers sequentially to the resultant (a) to produce oligonucleotides.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 (a) 출발물질로서의 유니버셜 고상 지지체에 첫 번째 커플링 반응물로서 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a) 결과물에 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 커플링시켜 올리고뉴클레오타이드를 제조하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.According to a preferred embodiment of the present invention, the method of the present invention comprises the steps of: (a) coupling a nucleotide dimer or nucleotide trimer as a first coupling reactant to a universal solid support as starting material; And (b) coupling oligonucleotide monomers sequentially to the resultant (a) to produce oligonucleotides.

본 발명의 방법은 고상(solid phase) 합성법에 따라 실시된다.The process of the invention is carried out according to a solid phase synthesis method.

본 발명의 방법이 고상 합성법에 따라 실시되는 경우, 본 발명의 바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함한다: When the process of the invention is carried out according to the solid phase synthesis method, the preferred embodiment of the invention comprises the following steps:

(a) 고상 지치체-뉴클레오사이드[(NS)1]에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]를 커플링시켜 SS-(NS)1-(NMP)2 또는 SS-(NS)1-(NMP)3를 제조하는 단계; (a) SS- (NS) 1- (NMP) 2 by coupling a nucleotide dimer [(NMP) 2 ] or a nucleotide trimer [(NMP) 3 ] to a solid state-nucleoside [(NS) 1 ] Or preparing SS- (NS) 1- (NMP) 3 ;

(b) 상기 단계 (a) 결과물에 연속적으로 뉴클로레오타이드 모노머를 커플링시켜 SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4를 제조하는 단계; 및 (b) sequential coupling of nucleotide monomers to the product of step (a) resulting in SS- (NS) 1- (NMP) 2- (NMP) n-3 or SS- (NS) 1- (NMP) Preparing 3- (NMP) n-4 ; And

(c) 상기 SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 (NMP)n를 얻는 단계.(c) removing the solid-state support (SS) from the SS- (NS) 1- (NMP) 2- (NMP) n-3 or SS- (NS) 1- (NMP) 3- (NMP) n-4 (NMP) obtaining n .

첫 번째 단계에서 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]를 뉴클레오사이드 모노머가 결합된 고상 지치체에 커플링시킨 다음, 연속적으로 뉴클레오타이드 모노머를 커플링시키면, 크게 개선된 순도로 올리고뉴 클레오타이드 분자를 제조할 수 있다.In the first step, nucleotide dimers [(NMP) 2 ] or nucleotide trimers [(NMP) 3 ] are coupled to solid phase binders to which the nucleoside monomers are bound, followed by successive coupling of the nucleotide monomers. Oligonucleotide molecules can be prepared in high purity.

본 발명의 방법에 따르면, 고상 지치체-뉴클레오사이드[SS-(NS)1]에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]를 커플링시켜 SS-(NS)1-(NMP)2 또는 SS-(NS)1-(NMP)3를 제조한다.According to the method of the present invention, a nucleotide dimer [(NMP) 2 ] or a nucleotide trimer [(NMP) 3 ] is coupled to a solid state-nucleoside [SS- (NS) 1 ] to form SS- (NS). Prepare 1- (NMP) 2 or SS- (NS) 1- (NMP) 3 .

지지체-뉴클레오사이드[SS-(NS)1]는 고상 지지체에 하나의 리보뉴클레오사이드 혹은 디옥시리보뉴클레오사이드 분자가 결합된 것이다. 상기 고상 지지체로는 뉴클레오타이드 분자의 고상 합성(solid phase synthesis)에 이용되는 어떠한 것도 이용할 수 있다. 리보뉴클레오사이드 혹은 디옥시리보뉴클레오사이드가 부착되지 않은 유니버셜 고상지지체도 사용할 수 있다. 이러한 고상 지지체는 다음과 같은 특성을 갖는 것이 바람직하다: (i) 올리고뉴클레오타이드 합성에 이용되는 시약에 대하여 실질적으로 용해되지 않고, (ⅱ) 올리고뉴클레오타이드 합성에 이용되는 시약에 대하여 화학적으로 안정되어야 하며, (ⅲ) 화학적 변형이 가능하여야 하고, (iv) 원하는 올리고뉴클레오타이드 로딩을 제공하여야 하며, (ⅴ) 적합한 압축 세기(compression strength)를 가지고 있어 합성 과정 동안의 증가되는 압력을 견뎌내야 하고, (ⅵ) 원하는 입자 크기 및 분포를 가져야 한다. The support-nucleoside [SS- (NS) 1 ] is a single ribonucleoside or deoxyribonucleoside molecule bound to a solid support. The solid support may be any of those used for solid phase synthesis of nucleotide molecules. Universal solid support without ribonucleoside or deoxyribonucleoside may also be used. Such solid support preferably has the following properties: (i) it is substantially insoluble in the reagents used for oligonucleotide synthesis, and (ii) it is chemically stable to the reagents used for oligonucleotide synthesis, (Iv) be capable of chemical modification, (iv) provide the desired oligonucleotide loading, (iii) have a suitable compression strength to withstand the increased pressure during the synthesis process, and (iii) Must have particle size and distribution.

본 발명에서 고상 지지체로 이용 가능한 것은, 바람직하게는 무기 중합체로서, 예를 들어, 실리카, 다공성 유리, 알루미늄실리케이트, 폴리스타이렌, 폴리비닐알코올, 폴리비닐아세테이트, 보로실리케이트, 금속 산화물(예컨대, 알루미나 및 니켈 산화물) 및 클레이를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 고상 지지체는 CPG(controlled pore glass) 및 폴리스타이렌 이다. Usable as the solid support in the present invention are preferably inorganic polymers, for example, silica, porous glass, aluminum silicate, polystyrene, polyvinyl alcohol, polyvinylacetate, borosilicate, metal oxides (eg alumina and nickel). Oxides) and clays. Most preferably, the solid support used in the present invention is controlled pore glass (CPG) and polystyrene.

고상 지치체의 표면에 뉴클레오사이드가 결합된 [SS-(NS)1]가 이용되며, 바람직하게는 고상 지치체의 표면에 리보뉴클레오사이드가 결합된 [SS-(rNS)1]가 이용된다. 뉴클레오사이드는 통상적으로 당의 3‘위치의 -OH 기를 통하여 고상 지지체에 결합한다.[SS- (NS) 1 ] having nucleosides bound to the surface of the solid phase is used, and [SS- (rNS) 1 ] having ribonucleosides bound to the surface of the solid phase is used. do. The nucleosides typically bind to the solid support through the -OH group at the 3 'position of the sugar.

본 발명의 가장 큰 특징은, [SS-(NS)1]에 뉴클레오타이드 모노머 대신에, 뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 커플링 시킨다는 것이다. 이러한 초기 반응의 변형은 최종적으로 합성되는 올리고뉴클레오타이드의 순도를 크게 향상시키는 결과를 초래한다.The biggest feature of the present invention is that, in place of the nucleotide monomer in [SS- (NS) 1 ], the nucleotide dimer or nucleotide trimer is coupled. Modification of this initial reaction results in a significant improvement in the purity of the oligonucleotides finally synthesized.

뉴클레오타이드 다이머 또는 뉴클레오타이드 트라이머를 [SS-(NS)1]에 커플링시키는 것은, 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 실시할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제4,458,066호, 미국 특허 제4,415,732호, Caruthers et al., Genetic Engineering, 4:1-17 (1982); 및 Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, pages 6-1 through 6-22, Applied Biosystems, Part No. 901237 (1991)에 상세하게 커플링 방법이 기재되어 있다.Coupling a nucleotide dimer or nucleotide trimer to [SS- (NS) 1 ] can be carried out through various methods known in the art. See, for example, US Pat. No. 4,458,066, US Pat. No. 4,415,732, Caruthers et al., Genetic Engineering , 4: 1-17 (1982); And Users Manual Model 392 and 394 Polynucleotide Synthesizers, pages 6-1 through 6-22, Applied Biosystems, Part No. Coupling methods are described in detail in 901237 (1991).

바람직하게는, 상기 커플링은 포스포라미다이트 방법(phosphoramidite method)에 따라 실시된다. 예를 들어, 다음과 같이 실시할 수 있다. [SS-(NS)1]에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]의 포스포 라미다이트 유도체를 첨가하되, 활성제(activator), 예를 들어 약산(예컨대, 테트라졸, 5-에틸티오테트라졸, 벤질티오테트라졸 등)과 동시에 첨가한다. 가장 바람직하게는, 이용되는 활성제는 5-에틸티오테트라졸이다. 상기 약산은 포스포라미다이트의 질소를 프로토네이션하여 반응성의 중간체를 형성시킨다. 이어, 캡핑을 실시한다. 캡핑은 바라직하게는, 아세트산 무수물 및 1-메틸이미다졸로 실시한다. 이어, 요오딘과 같은 산화제를 이용하여 산화를 시켜 뉴클레오타이드간 결합을 포스파이트(phosphite)로부터 보다 안정한 포스포다이에스테르로 전환시킨다. 캡핑과 산화단계는 순서를 바꿀 수도 있다. 산화 단계 이후, 양성자성 산, 예컨대, 트리클로로아세트산 또는 다이클로로아세트산을 이용하여 하이드록실 보호기를 제거한다. Preferably, the coupling is carried out according to the phosphoramidite method. For example, it can be implemented as follows. To [SS- (NS) 1 ] add a phosphor lamidite derivative of nucleotide dimer [(NMP) 2 ] or nucleotide trimer [(NMP) 3 ], but with an activator such as a weak acid (e.g. Tetrazole, 5-ethylthiotetrazole, benzylthiotetrazole, etc.). Most preferably, the active agent employed is 5-ethylthiotetrazole. The weak acid protonates the nitrogen of phosphoramidite to form reactive intermediates. Next, capping is performed. Capping is preferably carried out with acetic anhydride and 1-methylimidazole. Subsequently, oxidation is performed using an oxidizing agent such as iodine to convert the internucleotide bonds from phosphite to more stable phosphodiester. Capping and oxidation steps may be reversed. After the oxidation step, the hydroxyl protecting group is removed using a protic acid such as trichloroacetic acid or dichloroacetic acid.

고상 지치체-뉴클레오사이드(SS-NS)1에 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]가 커플링되어, SS-(NS)1-(NMP)2 또는 SS-(NS)1-(NMP)3가 제조된다.Nucleotide dimers [(NMP) 2 ] or nucleotide trimers [(NMP) 3 ] are coupled to the solid state-nucleoside (SS-NS) 1 , and SS- (NS) 1- (NMP) 2 or SS -(NS) 1- (NMP) 3 are prepared.

상기 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]는 다양한 결합(linkage)을 가질 수 있으며, 바람직하게는 포스포다이에스테르, 포스포라미데이트, 알킬포스포라미데이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 알킬포스포트리에스테르, 또는 알킬포스포노티오에이트 결합을 가지며, 가장 바람직하게는 포스포다이에스테르 또는 포스포라미데이트 결합을 갖는다.The nucleotide dimer [(NMP) 2 ] or nucleotide trimer [(NMP) 3 ] can have a variety of linkage (linkage), preferably phosphodiester, phosphoramidate, alkylphosphoramidate, alkyl Phosphonate, phosphorothioate, alkylphosphotriester, or alkylphosphonothioate linkages, most preferably phosphodiester or phosphoramidate linkages.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 및 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]는 각각 뉴클레오타이드 다이머 포스포라미다이트 및 뉴클레오타이드 트라이머 포스포라미다이트이다.According to a preferred embodiment of the present invention, the nucleotide dimer [(NMP) 2 ] and nucleotide trimer [(NMP) 3 ] are nucleotide dimer phosphoramidite and nucleotide trimer phosphoramidite, respectively.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 리보뉴클레오타이드 다이머[(rNMP)2]는 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된다:According to a preferred embodiment of the invention, ribonucleotide dimers [(rNMP) 2 ] are prepared by a reaction comprising coupling a compound of formula 1 with a compound of formula 2:

화학식 1Formula 1

Figure 112007081204613-pat00001
Figure 112007081204613-pat00001

화학식 2Formula 2

Figure 112007081204613-pat00002
Figure 112007081204613-pat00002

상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이 고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.In Chemical Formulas 1 and 2, R 1 , R 2 , R 3 , R 4, and R 5 are each independently a protecting group, and B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base.

바람직하게는, 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실(9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R2 및 R5는 서로 독립적으로 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R3는 할로페닐 또는 카르보벤족실기이나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다. Preferably, protecting groups R 1 and R 4 independently of one another include, but are not limited to, dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl, pisyl (9-phenyl xanthen-9-yl) and the like. R 2 And R 5 are independently of each other thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis (2-acetoxy) methyl), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2-chloro -4-methyl) phenyl]-4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl) , MEM (methoxyethoxymethyl), levulinyl, NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), and the like, but are not limited thereto. R 3 is a halophenyl or carbobenzoxyl group, but is not limited thereto. B 1 and B 2 are each independently adenine, cytosine, guanine, uracil or derivatives thereof.

보다 바람직하게는, 상기 화학식 1 및 2에서 R1 및 R4는 디메톡시트리틸, 이고, R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴이며, R3는 할로페닐(가장 바람직하게는, 2-클로로페닐)이다.More preferably, in Formulas 1 and 2, R 1 and R 4 are dimethoxytrityl, and R 2 And R 5 is thi-butyl-dimethylsilyl and R 3 is halophenyl (most preferably 2-chlorophenyl).

B1 및 B2는 보호기가 결합되어 있거나 또는 결합되어 있지 않은 염기(base) 이다. B1 및 B2에 위치할 수 있는 염기는, 일반적인 염기, 즉 아데닌, 사이토신, 구아닌 및 우라실뿐만 아니라, 그의 유도체도 포함한다. 염기의 유도체는, 바람직하게는, 잔틴(xanthine), 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로 우라실과 사이토신, 6-아조 우라실과 사이토신, 5-우라실(슈도 우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 옥사, 아미노, 티올, 티오알킬 및 하이드록실 아데닌과 구아닌, 5-트리플루오로-메틸 우라실과 사이토신, 7-메틸구아닌 또는 이노신이다.B 1 and B 2 are bases with or without protecting groups bound. Bases that may be located in B 1 and B 2 include general bases, namely adenine, cytosine, guanine and uracil, as well as derivatives thereof. Derivatives of bases are preferably xanthine, hypoxanthine, 2-aminoadenine, 6-methyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 2-propyl and other alkyl derivatives of adenine and guanine, 5-halouracil And cytosine, 6-azo uracil and cytosine, 5-uracil (pseudouracil), 4-thiouracil, 8-halo, oxa, amino, thiol, thioalkyl and hydroxyl adenine and guanine, 5-trifluoro- Methyl uracil and cytosine, 7-methylguanine or inosine.

B1 및 B2는 보호기가 결합될 수 있으며, 예를 들어, 벤조일 또는 이소부티릴, 아세틸, 디메틸포름아미딘 (DMF), 페녹시아세틸 (PAC) 및 이의 유도체, 4-티-부틸페녹시아세틸 (TAC) 등의 보호기가 결합될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.B 1 and B 2 may be bonded to a protecting group, for example benzoyl or isobutyryl, acetyl, dimethylformamidine (DMF), phenoxyacetyl (PAC) and derivatives thereof, 4-thi-butylphenoxy A protecting group such as acetyl (TAC) may be combined, but is not limited thereto.

화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 과정에서 활성제의 선택이 중요하다. 가장 바람직하게는, 상기 활성제는 1-메틸이미다졸이다.The choice of active agent is important in the process of coupling the compound of Formula 1 with the compound of Formula 2. Most preferably, the active agent is 1-methylimidazole.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 리보뉴클레오타이드 다이머[(rNMP)2]는 하기 화학식 3의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된다:According to a preferred embodiment of the present invention, the ribonucleotide dimer [(rNMP) 2 ] is prepared by a reaction comprising coupling a compound of formula 3 with a compound of formula 2:

화학식 3Formula 3

Figure 112007081204613-pat00003
Figure 112007081204613-pat00003

화학식 2Formula 2

Figure 112007081204613-pat00004
Figure 112007081204613-pat00004

상기 화학식 2 및 3에서, R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.In Formulas 2 and 3, R 1 , R 2 , R 4, and R 5 are each independently a protecting group, and B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base.

바람직하게는, 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함한, 이에 한정되는 것은 아니다. R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4- methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R31는 사이아노에틸, 사이아노알킬기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R32는 다이알킬아미노 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다. Preferably, protecting groups R 1 and R 4 are independently of one another, including but not limited to dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl, pisyl (9-phenyl xanthen-9-yl) and the like. R 2 and R 5 are thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis (2-acetoxy) methyl ), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2-chloro- 4-methyl) phenyl] -4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), levulinyl, NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), and the like, but are not limited thereto. R 31 includes, but is not limited to, a cyanoethyl, cyanoalkyl group, and the like. R 32 includes, but is not limited to, dialkylamino and the like. B 1 and B 2 are each independently adenine, cytosine, guanine, uracil or derivatives thereof.

보다 바람직하게는, 상기 화학식 3에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R31은 2-사이아노에틸이고, 그리고 R32는 디알킬아미노(가장 바람직하게는, 디이소프로필아미노)이다.More preferably, in Formula 3, R 1 is dimethoxytrityl, R 2 is tert-butyl-dimethylsilyl, R 31 is 2-cyanoethyl, and R 32 is dialkylamino (most preferably Is diisopropylamino).

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 화학식 4의 화합물과 화학식 3의 화합물을 커플링시키는 경우, 활성제로서 5-에틸티오테트라졸이 이용된다.According to a preferred embodiment of the invention, when coupling the compound of formula 4 to the compound of formula 3, 5-ethylthiotetrazole is used as the activator.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 리보뉴클레오타이드 트라이머[(rNMP)3]는 다음의 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된다: According to a preferred embodiment of the invention, said ribonucleotide trimer [(rNMP) 3 ] is prepared by a reaction comprising the following steps:

(i) 다음 화학식 4의 리보뉴클레오타이드 다이머에서 R1기를 제거하는 단계; 및 (i) removing the R 1 group from the ribonucleotide dimer of Formula 4; And

화학식 4Formula 4

Figure 112007081204613-pat00005
Figure 112007081204613-pat00005

상기 화학식 4에서 R1, R2, R3 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다; In Formula 4, R 1 , R 2 , R 3, and R 5 are each independently a protecting group, and B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base;

(ⅱ) 단계 (i)의 결과물과 리보뉴클레오사이드 3‘-포스포라미다이트를 커플링시켜 리보뉴클레오타이드 트라이머를 제조하는 단계.(Ii) coupling the product of step (i) with ribonucleoside 3′-phosphoramidite to produce a ribonucleotide trimer.

바람직하게는, 보호기 R1은 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R2, R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이다. R3는 수소, 할로페닐 또는 카르보벤족실기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1 및 B2는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다. Preferably, protecting groups R 1 include, but are not limited to, dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl, pisyl (9-phenyl xanthen-9-yl) and the like. R 2 , R 5 is thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis (2-acetoxy) methyl), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4-ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2-chloro-4-methyl ) phenyl]-4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), SEM (methoxyethoxymethyl ), Levulinyl, NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), and the like, but are not limited thereto. to be. R 3 includes, but is not limited to, hydrogen, halophenyl or carbobenzoxyl groups, and the like. B 1 and B 2 are each independently adenine, cytosine, guanine, uracil or derivatives thereof.

보다 바람직하게는, 상기 화학식 4에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R3는 수소 혹은 할로페닐(가장 바람직하게는, 클로로페닐)이고, R5는 tert-부틸-디메틸실릴이다.More preferably, in Formula 4, R 1 is dimethoxytrityl, R 2 is tert-butyl-dimethylsilyl, R 3 is hydrogen or halophenyl (most preferably, chlorophenyl), and R 5 is tert-butyl-dimethylsilyl.

화학식 4의 리보뉴클레오타이드 다이머에서 R1기를 제거하는 과정은 당업계에 공지된 통상의 탈보호기(deprotecting) 방법을 이용하여 실시할 수 있으며, 강산, 예컨대, 벤젠술폰산을 이용하여 실시할 수 있다.Removing the R 1 group from the ribonucleotide dimer of formula (4) can be carried out using a conventional deprotecting method known in the art, it can be carried out using a strong acid, such as benzenesulfonic acid.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고상 지치체-뉴클레오사이드 [SS-(NS)1]에 결합된 뉴클레오타이드 다이머[(NMP)2] 또는 뉴클레오타이드 트라이머[(NMP)3]에 연속적으로 리보뉴클로레오타이드 모노머를 커플링시켜 원하는 서열을 갖는 SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4를 최종적으로 제조한다.According to a preferred embodiment of the present invention, ribonuide continuously to nucleotide dimer [(NMP) 2 ] or nucleotide trimer [(NMP) 3 ] bound to the solid phase-nucleoside [SS- (NS) 1 ]. Coupling the chlorotide monomer to SS- (NS) 1- (NMP) 2- (NMP) n-3 or SS- (NS) 1- (NMP) 3- (NMP) n-4 having the desired sequence. Finally manufacture.

이 때 이용되는 뉴클로레오타이드 모노머는 바람직하게는, 뉴클레오사이드 포스포라미다이트이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 연속적으로 뉴클로레오타이드 모노머를 커플링시키는 경우, 활성제로서 5-에틸티오테트라졸이 이용된다.The nucleotide monomer used at this time is preferably nucleoside phosphoramidite. According to a preferred embodiment of the present invention, 5-ethylthiotetrazole is used as the activator when continuously coupling nucleotide monomers.

최종적으로, SS-(NS)1-(NMP)2-(NMP)n-3 또는 SS-(NS)1-(NMP)3-(NMP)n-4로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 (NMP)n를 얻는다. 리보뉴클레오사이드 혹은 뉴클레오사이드가 부착되지 않은 유니버셜 고상지지체를 사용할 경우는 SS-(NMP)2-(NMP)n-2 또는 SS-(NMP)3-(NMP)n-3로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 (NMP)n를 얻는다.Finally, the solid support (SS) is removed from SS- (NS) 1- (NMP) 2- (NMP) n-3 or SS- (NS) 1- (NMP) 3- (NMP) n-4 ( NMP) n is obtained. When using a universal solid support without ribonucleosides or nucleosides attached, SS- (NMP) 2- (NMP) n-2 or SS- (NMP) 3- (NMP) n-3 SS) is removed to obtain (NMP) n .

고상 지지체를 제거하는 과정은 당업계에 공지된 통상의 방법에 의해 실시될 수 있으며, 예를 들어, 암모늄 하이드록사이드를 이용하여 고상 지지체를 제거할 수 있다.The process of removing the solid support may be carried out by conventional methods known in the art, for example, the solid support may be removed using ammonium hydroxide.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단계 (c)를 실시하기 전 또는 후에 올리고뉴클레오타이드[(NMP)n]에 결합되어 있는 보호기를 제거하는 단계를 추가적으로 포함한다. 보호기의 제거는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 포스페이트 보호기는 티오페놀 혹은 암모늄 하이드록사이드 용액 처리로 제거할 수 있고, 염기에 결합된 벤조일 및 이소부티릴은 암모늄 하이드록사이드 용액에서 올리고뉴클레오타이드를 가열함으로서 제거할 수 있다.According to a preferred embodiment of the invention, the method further comprises removing the protecting group bound to the oligonucleotide [(NMP) n ] before or after performing step (c). Removal of the protecting group can be carried out according to conventional methods known in the art. For example, phosphate protecting groups can be removed by treatment with thiophenol or ammonium hydroxide solution, and benzoyl and isobutyryl bound to base can be removed by heating oligonucleotides in ammonium hydroxide solution.

본 발명의 방법에 의해 제조되는 올리고뉴클레오타이드[(NMP)n]의 길이는 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 10-50 뉴클레오타이드이다.The length of the oligonucleotides [(NMP) n ] produced by the process of the present invention is not particularly limited and is generally 10-50 nucleotides.

본 발명의 방법에 따르면, 고순도의 올리고뉴클레오타이드, 특히 올리고리보뉴클레오타이드를 보다 단축된 시간으로 효율적으로 합성할 수 있다. 본 발명의 방법은 종래 기술과 비교하여 15-20% 정도 높은 순도의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.According to the method of the present invention, high purity oligonucleotides, especially oligoribonucleotides, can be efficiently synthesized in a shorter time. The method of the present invention provides oligonucleotides with a purity of about 15-20% as compared to the prior art.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 5로 표시되는 리보뉴클레오타이드 다이머를 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a ribonucleotide dimer represented by the following formula (5):

화학식 5Formula 5

Figure 112007081204613-pat00006
Figure 112007081204613-pat00006

상기 화학식 5에서 R1, R2, R3 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이며, R6는 수소 또는

Figure 112007081204613-pat00007
(2-사이아노에틸)-(N,N-다이아이소프로필)-포스포아미다이트기 이고, 상기 iPr은 이소프로필이다.In Formula 5, R 1 , R 2 , R 3 and R 5 are each independently a protecting group, B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base, and R 6 is hydrogen or
Figure 112007081204613-pat00007
(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl) -phosphoamidite group, iPr is isopropyl.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 화학식 6으로 표시되는 리보뉴클레오타이드 트라이머를 제공한다:According to another aspect of the invention, the invention provides ribonucleotide trimers represented by the following formula (6):

화학식 6Formula 6

Figure 112007081204613-pat00008
Figure 112007081204613-pat00008

상기 화학식 6에서 R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 보호기이고, B1, B2 및 B3는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이며, R7은 수소 또는

Figure 112007081204613-pat00009
이고, 상기 iPr은 이소프로필이다.In Formula 6, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5, and R 6 are each independently a protecting group, and B 1 , B 2, and B 3 are each independently a nucleosidic base, R 7 is hydrogen or
Figure 112007081204613-pat00009
And iPr is isopropyl.

본 발명자가 알고 있는 범위 하에서, 상술한 RNA 다이머 및 트라이머는 본 발명자들에 의해 최초로 개발된 것이다.Under the scope known to the inventors, the above-described RNA dimers and trimers were first developed by the inventors.

바람직하게는, 상기 화학식 5에서, 보호기 R1은 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R2, R4 , R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. R3 , R5는 수소, 할로페닐 또는 카르보 벤족실기 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. B1, B2 및 B3는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다. Preferably, in Chemical Formula 5, protecting group R 1 includes, but is not limited to, dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl, pisyl (9-phenyl xanthen-9-yl), and the like. R 2 , R 4 , R 5 are thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis (2-acetoxy) methyl ), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2-chloro- 4-methyl) phenyl] -4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), levulinyl, NPE (4-nitropheylethyl), NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), and the like, but are not limited thereto. R 3 and R 5 include, but are not limited to, hydrogen, halophenyl or carbobenzoxyl groups, and the like. B 1 , B 2 and B 3 are each independently adenine, cytosine, guanine, uracil or derivatives thereof.

보다 바람직하게는, 상기 화학식 5에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R3는 할로페닐(가장 바람직하게는, 클로로페닐)이고, R5는 tert-부틸-디메틸실릴이다.More preferably, in Formula 5, R 1 is dimethoxytrityl, R 2 is tert-butyl-dimethylsilyl, R 3 is halophenyl (most preferably, chlorophenyl), and R 5 is tert- Butyl-dimethylsilyl.

바람직하게는, 상기 화학식 6에서, R1, R2, R3, R4, R5 및 R6은 각각 독립적으로 디메톡시트리틸, 벤질, tert-부틸, 메틸, 토실, tert-부틸-디메틸실릴, 할로페닐 또는 카르보벤족시기이고, B1, B2 및 B3는 각각 독립적으로 아데닌, 사이토신, 구아닌, 우라실 또는 그의 유도체이다.Preferably, in Chemical Formula 6, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are each independently dimethoxytrityl, benzyl, tert-butyl, methyl, tosyl, tert-butyl-dimethyl Silyl, halophenyl or carbobenzone groups, and B 1 , B 2 and B 3 are each independently adenine, cytosine, guanine, uracil or derivatives thereof.

보다 바람직하게는, 상기 화학식 6에서 R1은 디메톡시트리틸이고, R2, R4 및 R5는 tert-부틸-디메틸실릴이며, R3 및 R5는 수소 혹은 할로페닐(가장 바람직하게는, 클로로페닐)이다.More preferably, in Formula 6, R 1 is dimethoxytrityl, R 2 , R 4 and R 5 are tert-butyl-dimethylsilyl, R 3 And R 5 is hydrogen or halophenyl (most preferably chlorophenyl).

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 활성제(activator)로서 1-메틸이미다졸의 존재 하에서 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 리보뉴클레오타이드 다이머의 제조방법을 제공한다:According to another aspect of the present invention, the present invention provides a method for preparing a ribonucleotide dimer comprising coupling a compound of Formula 1 with a compound of Formula 2 in the presence of 1-methylimidazole as an activator Provides:

화학식 1Formula 1

Figure 112007081204613-pat00010
Figure 112007081204613-pat00010

화학식 2Formula 2

Figure 112007081204613-pat00011
Figure 112007081204613-pat00011

상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.In Formulas 1 and 2, R 1 , R 2 , R 3 , R 4, and R 5 are each independently a protecting group, and B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base.

위에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 올리고뉴클레오타이드[(NMP)n]의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 고순도의 올리고뉴클레오타이드를 보다 단축된 시간으로 효율적으로 합성할 수 있다. 본 발명의 방법은 종래 기술과 비교하여 15-20% 정도 높은 순도의 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.As described in detail above, the present invention provides a method for preparing oligonucleotide [(NMP) n ]. According to the method of the present invention, high purity oligonucleotides can be efficiently synthesized in a shorter time. The method of the present invention provides oligonucleotides with a purity of about 15-20% as compared to the prior art.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention. .

실시예Example

실시예 I: 다이뉴클레오타이드 합성(포스포트라이에스테르 방법)Example I: Dinucleotide Synthesis (Phosphotriester Method)

Figure 112007081204613-pat00012
Figure 112007081204613-pat00012

다이뉴클레오타이드 UpU, CpU 및 GpA의 합성(2b-2d)Synthesis of Dinucleotides UpU, CpU, and GpA (2b-2d)

R1 = DMTr(dimethoxytrityl), R2 = TBDMS(tert-butyldimethylsilyl), R = o-클로로페닐. 2a - B1 = U, B2 = U; 2b - B1 = bzC, B2 = U; 2c - B1 = ibG, B2 = bzA; 3a - B1 = U; 3b - B1 = bzC; 3c - B1 = ibG; 4a - B2 = U; 4b - B2 = bzA. bz = 벤조일, ib = 이소부티릴R 1 = dimethoxytrityl (DMTr), R 2 = tert-butyldimethylsilyl (TBDMS), R = o-chlorophenyl. 2a -B 1 = U, B 2 = U; 2b -B 1 = bzC, B 2 = U; 2c -B 1 = ibG, B 2 = bzA; 3a -B 1 = U; 3b- B 1 = bzC; 3c -B 1 = ibG; 4a -B 2 = U; 4b -B 2 = bzA. bz = benzoyl, ib = isobutyryl

실시예 1: 5'-O-다이메틸옥시트리틸-2'-O-(터트-부틸디메틸실릴)유리딘-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸디메틸실릴)유리딘의 합성(2a)Example 1: 5'-O-dimethyloxytrityl-2'-O- (tert-butyldimethylsilyl) uridine-3'-O-chlorophenylphosphate-5'-O-2'-O- ( Synthesis of tert-butyldimethylsilyl) uridine (2a)

단계 1: Step 1: 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸디메틸실릴유리딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)의 합성 (3a)Synthesis of 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine-3'-O- (2-chlorophenylphosphate) (triethylammonium salt) (3a)

디옥산(20 mL)에 트리아졸(0.63 g, 9.24 mmol, Sigma Aldrich)과 무수 트리에틸아민(1.3 mL, 9.15 mmol, Sigma Aldrich)을 용해한 다음, 5℃에서 냉각하였다. 디옥산 5 mL에 O-클로로페닐포스포디클로리데이트 1.1 g(4.53 mmol, Sigma Aldrich)을 녹인 용액을 위의 용액에 적가하였다. 1시간 후, 상기 용액을 여과하고 -5℃로 냉각되어 있는 10 mL 피리딘에 용해되어 있는 5‘-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘 (4a, 2 g, 3.02 mmol)에 첨가하였다. 이어, 1-메틸이미다졸 (0.38 mL, 4.6 mmol, Sigma Aldrich)을 위 용액에 첨가하였다. 1시간 후 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate buffer, 10 mL)을 냉각된 상태의 위 용액에 가한 후 용액을 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 (50 mL)에 용 해한 다음, 0.1 M TEAB (50 mL)로 세척하고 수층을 다이클로로메탄 각 20 mL을 사용하여 2번 추출하였다. 유기층을 수집하여 이를 0.1 M TEAB (100 mL)로 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조한 후 진공펌프를 사용하여 농축하여 2.78 g의 목표 화합물을 수득하였다(수율 97%). Triazole (0.63 g, 9.24 mmol, Sigma Aldrich) and anhydrous triethylamine (1.3 mL, 9.15 mmol, Sigma Aldrich) were dissolved in dioxane (20 mL) and then cooled at 5 ° C. A solution of 1.1 g (4.53 mmol, Sigma Aldrich) dissolved in O-chlorophenylphosphodichlorate in 5 mL of dioxane was added dropwise to the above solution. After 1 hour, the solution was filtered and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine ( 4a , dissolved in 10 mL pyridine cooled to -5 ° C). 2 g, 3.02 mmol). Then 1-methylimidazole (0.38 mL, 4.6 mmol, Sigma Aldrich) was added to the above solution. After 1 hour, 0.1 M TEAB (triethylammonium bicarbonate buffer, 10 mL) was added to the cooled solution, and the solution was concentrated. The residue was dissolved in dichloromethane (50 mL), then washed with 0.1 M TEAB (50 mL) and the aqueous layer was extracted twice with 20 mL each of dichloromethane. The organic layer was collected, washed with 0.1 M TEAB (100 mL), dried over sodium sulphate and concentrated using a vacuum pump to yield 2.78 g of the target compound (yield 97%).

단계 2: Step 2: 5'-O-5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 유리딘Yuri Dean -3'-O--3'-O- 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate -5'-O-2'-O-(-5'-O-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 유리딘의Yuridin 합성 (2a) Synthesis (2a)

단계 1에서 제조된 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴유리딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)트리에틸암모늄 염(3a, 1.47 g, 1.54 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.5 g, 1.4 mmol)을 20 mL의 피리딘에 용해하고, 진공펌프를 이용하여 건조하였다. 새로 제조한 피리딘 5 mL에 용해된 MSNT(1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole, 0.68 g, 2.31mmol, Sigma Aldrich)를 상기 건조 결과물에 첨가하였다. 반응액을 약 3 mL까지 농축시킨 후 0.16 mL의 1-메틸이미다졸(1.89 mmol)을 가하였다. 1시간 후 반응액을 0℃로 냉각한 후 2 mL의 물을 첨가하였다. 반응액을 농축한 후 잔사 오일을 15 mL의 다이클로로메탄에 녹인 후 15 mL의 0.1 M TEAB를 사용하여 세척하였다. 수층액은 다이클로로메탄을 사용하여 세척하고 (3 x 5 mL) 유기층을 수집한 다음, 소듐 설페이트로 건조하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.68 g, 수율 41 %). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.38, -6.255'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine-3'-O- (2-chlorophenylphosphate) triethylammonium salt prepared in step 1 ( 3a , 1.47 g, 1.54 mmol) and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine ( 4a , 0.5 g, 1.4 mmol) are dissolved in 20 mL of pyridine and vacuum pump It was dried using. MSNT (1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole, 0.68 g, 2.31 mmol, Sigma Aldrich) dissolved in 5 mL of freshly prepared pyridine was added to the drying result. The reaction solution was concentrated to about 3 mL, and 0.16 mL of 1-methylimidazole (1.89 mmol) was added thereto. After 1 hour the reaction was cooled to 0 ° C. and then 2 mL of water was added. The reaction solution was concentrated and the residue oil was dissolved in 15 mL of dichloromethane and washed with 15 mL of 0.1 M TEAB. The aqueous layer was washed with dichloromethane (3 x 5 mL), the organic layer was collected and then dried over sodium sulfate. The target compound was purified by chromatography on silica gel (0.68 g, 41% yield). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -6.38, -6.25

실시예 2: 5'-O-다이메톡시트리틸-NExample 2: 5'-0-dimethoxytrityl-N 44 -벤조일-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)사이티딘-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)유리딘의 합성 (2b)Synthesis of -benzoyl-2'-O- (tert-butyldimethylsilyl) cytidine-3'-O-chlorophenylphosphate-5'-O-2'-O- (tert-butyldimethylsilyl) uridine (2b)

단계 1: Step 1: 5'-O-다이메톡시트리틸-N5'-O-dimethoxytrityl-N 44 -벤조일-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴사이티딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)의 합성 (3b)Synthesis of -benzoyl-2'-O-tert-butyldimethylsilylcytidine-3'-O- (2-chlorophenylphosphate) (triethylammonium salt) (3b)

디옥산(20 mL)에 트리아졸(0.69 g, 10 mmol) 과 무수 트리에틸아민(1.4 mL, 9.9 mmol) 을 용해한 다음, 5℃로 냉각하였다. 디옥산 5 mL에 O-클로로페닐포스포다이클로리데이트 1.2 g (4.90 mmol)을 녹인 용액을 위의 용액에 적가하였다. 1시간 후, 상기 용액을 여과하고 -5℃로 냉각되어 있는 10 mL 무수 피리딘에 용해되어 있는 5‘-O-다이메톡시트리틸-N4-벤조일-2’-O-터트-부틸다이메틸실릴사이티딘(2.5g, 3.27 mmol, Sigma Aldrich)에 첨가하였다. 이어, 1-메틸이미다졸 (0.40 mL, 4.9 mmol, Sigma Aldrich)을 위 용액에 첨가하였다. 1시간 후 0.1 M TEAB(10 mL)을 냉각된 상태의 위 용액에 가한 후 용액을 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄(50 mL)에 용해한 다음, 0.1 M TEAB(50 mL)로 세척하고 수층을 다이클로로메탄 각 20 mL을 사용하여 2번 추출하였다. 유기층을 수집하여 이를 0.1 M TEAB(100 mL)로 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조한 후 진공펌프를 사용하여 농축하여 3.08 g의 목표 화합물을 수득하였다(수율 94%). Triazole (0.69 g, 10 mmol) and anhydrous triethylamine (1.4 mL, 9.9 mmol) were dissolved in dioxane (20 mL), and then cooled to 5 ° C. A solution of 1.2 g (4.90 mmol) of O-chlorophenylphosphodidichloride in 5 mL of dioxane was added dropwise to the above solution. After 1 hour the solution was filtered and 5'-O-dimethoxytrityl-N 4 -benzoyl-2'-O-tert-butyldimethyl dissolved in 10 mL anhydrous pyridine cooled to -5 ° C. To silylcytidine (2.5 g, 3.27 mmol, Sigma Aldrich). Then 1-methylimidazole (0.40 mL, 4.9 mmol, Sigma Aldrich) was added to the gastric solution. After 1 hour 0.1 M TEAB (10 mL) was added to the cooled solution and the solution was concentrated. The residue was dissolved in dichloromethane (50 mL), then washed with 0.1 M TEAB (50 mL) and the aqueous layer was extracted twice using 20 mL each of dichloromethane. The organic layer was collected, washed with 0.1 M TEAB (100 mL), dried over sodium sulphate and concentrated using a vacuum pump to yield 3.08 g of the target compound (yield 94%).

단계 2: Step 2: 5'-O-다이메톡시트리틸-N5'-O-dimethoxytrityl-N 44 -벤조일-2'-O-(터트-부틸다이메틸 실릴)사이티딘-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)유리딘의 합성 (2b)Synthesis of -benzoyl-2'-O- (tert-butyldimethyl silyl) cytidine-3'-O-chlorophenylphosphate-5'-O-2'-O- (tert-butyldimethylsilyl) uridine (2b)

상기 단계 1에 제조된 5'-O-다이메톡시트리틸-N4-벤조일-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴사이티딘-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)(3b, 3.24g, 3.07 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 1 g, 2.8 mmol)을 20 mL의 피리딘에 용해하고, 진공펌프를 이용하여 건조하였다. 새로 제조한 피리딘 10 mL에 용해된 MSNT(1.364 g, 4.61mmol)를 상기 건조 결과물에 첨가하였다. 반응액을 약 3 mL까지 농축시킨 후 0.25 mL의 1-메틸이미다졸(3.07 mmol)을 가하였다. 1시간 후 반응액을 0℃로 냉각한 후 2 mL의 물을 첨가하였다. 반응액을 농축한 후 잔사 오일을 15 mL의 다이클로로메탄에 녹인 후 15 mL의 0.1 M TEAB를 사용하여 세척하였다. 수층액은 다이클로로메탄을 사용하여 세척하고 (3 x 5 mL) 유기층을 수집한 다음, 소듐 설페이트로 건조하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(1.47 g, 수율 40 %). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.42, -6.105'-O-dimethoxytrityl-N 4 -benzoyl-2'-O-tert-butyldimethylsilylcytidine-3'-O- (2-chlorophenylphosphate) prepared in step 1 (tri 20 mL of ethyl ammonium salt) ( 3b , 3.24 g, 3.07 mmol) and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine ( 4a , 1 g, 2.8 mmol) It dissolved in pyridine of and dried using the vacuum pump. MSNT (1.364 g, 4.61 mmol) dissolved in 10 mL of freshly prepared pyridine was added to the drying result. The reaction solution was concentrated to about 3 mL, and 0.25 mL of 1-methylimidazole (3.07 mmol) was added thereto. After 1 hour the reaction was cooled to 0 ° C. and then 2 mL of water was added. The reaction solution was concentrated and the residue oil was dissolved in 15 mL of dichloromethane and washed with 15 mL of 0.1 M TEAB. The aqueous layer was washed with dichloromethane (3 x 5 mL), the organic layer was collected and then dried over sodium sulfate. The target compound was purified by chromatography on silica gel (1.47 g, yield 40%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -6.42, -6.10

실시예 3: 5'-O-다이메톡시트리틸-NExample 3: 5'-0-dimethoxytrityl-N 22 -이소부티릴-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)구아노신-3'-O-클로로페닐포스페이트-5'-O-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)아데닌의 합 성(2c)Of isobutyryl-2'-O- (tert-butyldimethylsilyl) guanosine-3'-0-chlorophenylphosphate-5'-O-2'-O- (tert-butyldimethylsilyl) adenin Synthesis (2c)

단계 1: Step 1: 5'-O-5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 구아노신Guanosine -3'-O-(2--3'-O- (2- 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate )() ( 트리에틸암모늄Triethylammonium 염)의 합성 (3c) Salts) (3c)

디옥산(20 mL)에 트리아졸(1.37 g, 19.87 mmol)과 무수 트리에틸아민(2.8 mL, 19.87 mmol) 을 용해한 다음, 5℃로 냉각하였다. 디옥산 5 mL에 O-클로로페닐포스포다이클로리데이트 2.386 g (9.74 mmol)을 녹인 용액을 위의 용액에 적가하였다. 1시간 후, 상기 용액을 여과하고 -5℃로 냉각되어 있는 10 mL 무수 피리딘에 용해되어 있는 5‘-O-다이메톡시트리틸-N2-이소부틸릴-2’-O-터트부틸다이메틸실릴구아노신(5 g, 6.5 mmol)에 첨가하였다. 이어, 1-메틸이미다졸(0.80 mL, 9.74 mmol)을 위 용액에 첨가하였다. 1시간 후 0.1 M TEAB(10 mL)을 냉각된 상태의 위 용액에 가한 후 용액을 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄(50 mL)에 용해한 다음, 0.1 M TEAB(50 mL)로 세척하고 수층을 다이클로로메탄 각 20 mL을 사용하여 2번 추출하였다. 유기층을 수집하여 이를 0.1 M TEAB(100 mL)로 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조한 후 진공펌프를 사용하여 농축하여 6.55 g의 목표 화합물을 수득하였다(수율 95%). Triazole (1.37 g, 19.87 mmol) and anhydrous triethylamine (2.8 mL, 19.87 mmol) were dissolved in dioxane (20 mL) and then cooled to 5 ° C. A solution of 2.386 g (9.74 mmol) of O-chlorophenylphosphodididate in 5 mL of dioxane was added dropwise to the above solution. After 1 hour, the solution was filtered and 5'-O-dimethoxytrityl-N 2 -isobutylyl-2'-O-tertbutyldie dissolved in 10 mL anhydrous pyridine cooled to -5 ° C. To methylsilylguanosine (5 g, 6.5 mmol). Then 1-methylimidazole (0.80 mL, 9.74 mmol) was added to the above solution. After 1 hour 0.1 M TEAB (10 mL) was added to the cooled solution and the solution was concentrated. The residue was dissolved in dichloromethane (50 mL), then washed with 0.1 M TEAB (50 mL) and the aqueous layer was extracted twice using 20 mL each of dichloromethane. The organic layer was collected, washed with 0.1 M TEAB (100 mL), dried using sodium sulphate and concentrated using a vacuum pump to yield 6.55 g of the target compound (yield 95%).

단계 2: Step 2: 5'-O-5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 구아노신Guanosine -3'-O--3'-O- 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate -5'-O-2'-O-(-5'-O-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )아데닌의 합 성(2c)Synthesis of adenine (2c)

상기 단계 1에서 제조된 5'-O-다이메톡시트리틸-N2-이소부티릴-2'-O-(터트-부틸다이메틸실릴)구아노신-3'-O-(2-클로로페닐포스페이트)(트리에틸암모늄 염)(3c, 1.34 g, 1.26 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-tert-부틸다이메틸실릴아데닌(4b, 1 g, 2.8 mmol)을 20 mL의 피리딘에 용해하고, 진공펌프를 이용하여 건조하였다. 새로 제조한 피리딘 10 mL에 용해된 MSNT(0.6 g, 1.89 mmol)를 상기 건조 결과물에 첨가하였다. 반응액을 약 3 mL까지 농축시킨 후 0.16 mL의 1-메틸이미다졸(1.89 mmol)을 가하였다. 30분 후 반응액을 0℃로 냉각한 후 2 mL의 물을 첨가하였다. 반응액을 농축한 후 잔사 오일을 15 mL의 다이클로로메탄에 녹인 후 15 mL의 0.1 M TEAB를 사용하여 세척하였다. 수층액은 다이클로로메탄을 사용하여 세척하고 (3 x 5 mL) 유기층을 수집한 다음, 소듐 설페이트로 건조하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(1.265 g, 수율 84%). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.33, -6.145'-O-dimethoxytrityl-N 2 -isobutyryl-2'-O- (tert-butyldimethylsilyl) guanosine-3'-O- (2-chlorophenyl prepared in step 1) Phosphate) (triethylammonium salt) ( 3c , 1.34 g, 1.26 mmol) and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyladenine ( 4b , 1 g, 2.8 mmol) Was dissolved in 20 mL of pyridine and dried using a vacuum pump. MSNT (0.6 g, 1.89 mmol) dissolved in 10 mL of freshly prepared pyridine was added to the drying result. The reaction solution was concentrated to about 3 mL, and 0.16 mL of 1-methylimidazole (1.89 mmol) was added thereto. After 30 minutes the reaction was cooled to 0 ° C. and then 2 mL of water was added. The reaction solution was concentrated and the residue oil was dissolved in 15 mL of dichloromethane and washed with 15 mL of 0.1 M TEAB. The aqueous layer was washed with dichloromethane (3 x 5 mL), the organic layer was collected and then dried over sodium sulfate. The target compound was purified by chromatography on silica gel (1.265 g, yield 84%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -6.33, -6.14

실시예Example Ⅱ:  II: 다이뉴클레오타이드Dinucleotide 합성( synthesis( 포스포라미다이트Phosphoramidite 방법) Way)

Figure 112007081204613-pat00013
Figure 112007081204613-pat00013

다이뉴클레오타이드 UU, CU, GU 및 GA의 합성 (1a-1d). Synthesis of Dinucleotides UU, CU, GU and GA ( 1a - 1d ).

R1 = DMTr, R2 = TBDMS, R = 2-사이아노에틸. 1a - B1 = U, B2 = U, 1b - B1 = bzC, B2 = U, 1c - B1 = ibG, B2 = U, 1d - B1 = ibGU, B2 = bzA, 2d - B1 = U, B2 = U, 2e - B1 = bzC, B2 = U, 2f - B1 = ibG, B2 = U, 2g - B1 = ibG, B2 = bzA. 4a - B2 = U, 4b - B2 = bzA. 5a - B1 = U, 5b - B1 = bzC, 5c - B1 = ibG.R 1 = DMTr, R 2 = TBDMS, R = 2-cyanoethyl. 1a -B 1 = U, B 2 = U, 1b- B 1 = bzC, B 2 = U, 1c -B 1 = ibG, B 2 = U, 1d -B 1 = ibGU, B 2 = bzA, 2d- B 1 = U, B 2 = U, 2e -B 1 = bzC, B 2 = U, 2f -B 1 = ibG, B 2 = U, 2g -B 1 = ibG, B 2 = bzA. 4a -B 2 = U, 4b -B 2 = bzA. 5a -B 1 = U, 5b -B 1 = bzC, 5c -B 1 = ibG.

실시예Example 4: 5'-O- 4: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 유리딜Glass dill -3'-O-[(N,N-다-3'-O-[(N, N- 이이소프Isofov 로필아미노)Lofilamino) 사이아노에톡시포스피노Cyanoethoxyphosphino ](3'->5')- 2'-O-] (3 '-> 5')-2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴유리딘의Of butyldimethylsilylfreedine 합성 (2d) Synthesis (2d)

5'-다이메톡시트리틸-유리딘-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5a, 1.085 g, 1.26 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.3g, 0.84 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-벤질티오테트라 졸(0.483 g, 2.52 mmol, ChemGene)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합친 후 다시 3 mL 정도가 될 때까지 농축하였다. 1시간 후 용액을 0℃로 냉각하고 7.6 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 3.8 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.5 g, 수율 53%). 31P NMR (DMSO), dppm : -1.03, -0.715'-dimethoxytrityl-uridine-2'-O-tert-butyldimethylsilyl-3 '-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)] phosphoramidite ( 5a , 1.085 g, 1.26 mmol) and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine ( 4a , 0.3 g, 0.84 mmol) in 10 mL of anhydrous acetonitrile. After melting, it was concentrated until it became a gum state. Dissolve 5-benzylthiotetrazole (0.483 g, 2.52 mmol, ChemGene) in 20 mL of acetonitrile, concentrate the solution until crystals form, combine the above two solutions with 20 mL of acetonitrile, and then 3 mL again. Concentrated to the extent. After 1 hour the solution was cooled to 0 ° C. and 0.5 M iodine solution dissolved in 7.6 mL of (THF: pyridine: water = 7: 1: 2) was added. The solution was left at room temperature for 5 minutes and then 3.8 mL of 2 M Na 2 S 2 O 3 aqueous solution was added. The solution was concentrated to a gum state and the residue was dissolved in 20 mL of dichloromethane and the aqueous layer was extracted three times with 5 mL of dichloromethane. The organic layer was collected, washed three times (10 mL each) with 0.1 M aqueous TEAB solution, and dried using sodium sulfate. The solution was concentrated and evaporated using toluene (2 x 10 mL) to remove the remaining pyridine. The residue was dissolved in dichloromethane and purified by chromatography on silica gel (0.5 g, yield 53%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -1.03, -0.71

실시예Example 5: 5'-O- 5: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 44 -- 벤조일Benzoyl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 사이티딜Cytidil -3'-O-[(N,N--3'-O-[(N, N- 다이이소프로필아미노Diisopropylamino )) 사이아노에톡시포스피노Cyanoethoxyphosphino ](3'->5')- 2'-O-] (3 '-> 5')-2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴유리딘의Of butyldimethylsilylfreedine 합성 (2e) Synthesis (2e)

5'-다이메톡시트리틸-N4-벤조일사이티딘-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5b, 1.928 g, 2.00 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.358 g, 1.00 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-에틸티오테트라졸(0.528 g, 4 mmol, Sigma Aldrich)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합쳤다. 그런 다음, 상기 용액을 3 mL 정도가 될 때까지 농축한 후, 4시간이 경과한 다음 0℃로 냉각하고 12 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 6 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.868 g, 수율 70%). 31P NMR (DMSO), dppm : -1.05, -0.745'-dimethoxytrityl-N 4 -benzoylcytidine-2'-O-tert-butyldimethylsilyl-3 '-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl)] Phosphoramidite ( 5b , 1.928 g, 2.00 mmol) and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine ( 4a , 0.358 g, 1.00 mmol) were dried with anhydrous aceto. After dissolving in 10 mL of nitrile, it was concentrated until it became a gum state. 5-Ethylthiotetrazole (0.528 g, 4 mmol, Sigma Aldrich) was dissolved in 20 mL of acetonitrile and the solution was concentrated until crystals formed, and the above two solutions were combined using 20 mL of acetonitrile. The solution was then concentrated to about 3 mL, then cooled to 0 ° C. after 4 hours and dissolved in 12 mL of (THF: pyridine: water = 7: 1: 1) in 0.5 M iodine. Solution was added. After leaving this solution at room temperature for 5 minutes, 6 mL of 2 M Na 2 S 2 O 3 aqueous solution was added thereto. The solution was concentrated to a gum state and the residue was dissolved in 20 mL of dichloromethane and the aqueous layer was extracted three times with 5 mL of dichloromethane. The organic layer was collected, washed three times (10 mL each) with 0.1 M aqueous TEAB solution and dried using sodium sulfate. The solution was concentrated and evaporated using toluene (2 x 10 mL) to remove the remaining pyridine. The residue was dissolved in dichloromethane and purified by chromatography on silica gel (0.868 g, yield 70%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -1.05, -0.74

실시예Example 6: 5‘-O- 6: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'- O-(-2'- O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 구아노실Guanosil -3'-O-[(N,N--3'-O-[(N, N- 다이이소프로필아미노Diisopropylamino )) 사이아노에톡시Cyanoethoxy 포스피노Phosphino ](3'->5')- 2'-O-] (3 '-> 5')-2'-O- 터트Tert -부틸다이메틸실릴유리딘의 합성 (2f)Synthesis of -butyldimethylsilylfreedine (2f)

5‘-다이메톡시트리틸-N2-이소부티릴구아노신-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴- 3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5c, 3.48g, 3.59 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴유리딘(4a, 0.644 g, 1.8 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-벤질티오테트라졸(0.379 g, 7.18 mmol)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합쳤다. 그런 다음, 상기 용액을 3 mL 정도가 될 때까지 농축한 후, 1.5시간이 경과한 다음 0℃로 냉각하고 22 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 11 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(1.126 g, 수율 50%). 31P NMR (DMSO), dppm : -0.52 , -0.68 5'-dimethoxytrityl-N 2 -isobutyrylguanosine-2'-O-tert-butyldimethylsilyl-3 '-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl )] Phosphoramidate ( 5c , 3.48 g, 3.59 mmol) and 5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-tert-butyldimethylsilyluridine ( 4a , 0.644 g, 1.8 mmol) It was dissolved in 10 mL of anhydrous acetonitrile and concentrated until it became a gum state. 5-benzylthiotetrazole (0.379 g, 7.18 mmol) was dissolved in 20 mL of acetonitrile, the solution was concentrated until crystals formed, and the above two solutions were combined using 20 mL of acetonitrile. The solution was then concentrated to about 3 mL, then cooled to 0 ° C. after 1.5 h and dissolved in 0.5 mL of iodine in 22 mL of (THF: pyridine: water = 7: 1: 1). Solution was added. After leaving this solution at room temperature for 5 minutes, 11 mL of 2 M Na 2 S 2 O 3 aqueous solution was added thereto. The solution was concentrated to a gum state and the residue was dissolved in 20 mL of dichloromethane and the aqueous layer was extracted three times with 5 mL of dichloromethane. The organic layer was collected, washed three times (10 mL each) with 0.1 M aqueous TEAB solution and dried using sodium sulfate. The solution was concentrated and evaporated using toluene (2 x 10 mL) to remove the remaining pyridine. The residue was dissolved in dichloromethane and purified by chromatography on silica gel (1.126 g, yield 50%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -0.52, -0.68

실시예Example 7: 5‘-O- 7: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 구아노실Guanosil -3'-O-[(N,N--3'-O-[(N, N- 다이이소프로필아미노Diisopropylamino )) 사이아노에톡시Cyanoethoxy 포스피노 Phosphino ](3'->5')-] (3 '-> 5')- NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O-터트--2'-O- tert- 부틸다이메틸실릴아데닌의Butyldimethylsilyladenine 합성 (2g) Synthetic (2 g)

5‘-다이메톡시트리틸-N2-이소부티릴구아노신-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴-3'-[(2-사이아노에틸)-(N,N-다이이소프로필)]포스포라미다이트(5c, 2.8 g, 2.88 mmol)와 5'-O-다이메톡시트리틸-N4-벤조일-2'-O-터트-부틸다이메틸실릴아데닌(4b, 0.7 g, 1.44 mmol)를 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후, 검상태가 될 때까지 농축하였다. 5-벤질티오테트라졸(1.075 g, 5.6 mmol)을 20 mL의 아세토니트릴에 녹이고 이 용액을 결정이 생길 때까지 농축한 후 아세토니트릴 20 mL을 사용하여 위 두 용액을 합쳤다. 그런 다음, 상기 용액을 3 mL 정도가 될 때까지 농축한 후, 1.5시간이 경과한 다음 0℃로 냉각하고 18 mL의 (THF:피리딘:물 = 7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 9 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 수집하여 0.1 M TEAB 수용액으로 3번(각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔(2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(2.182 g, 수율 96%). 31P NMR (DMSO), dppm : -0.69, -0.81 5'-dimethoxytrityl-N 2 -isobutyrylguanosine-2'-O-tert-butyldimethylsilyl-3 '-[(2-cyanoethyl)-(N, N-diisopropyl )] Phosphoramidite ( 5c , 2.8 g, 2.88 mmol) and 5'-O-dimethoxytrityl-N 4 -benzoyl-2'-O-tert-butyldimethylsilyladenin ( 4b , 0.7 g, 1.44 mmol) was dissolved in 10 mL of anhydrous acetonitrile and concentrated until it became a gum. 5-benzylthiotetrazole (1.075 g, 5.6 mmol) was dissolved in 20 mL of acetonitrile, the solution was concentrated until crystals formed, and the above two solutions were combined using 20 mL of acetonitrile. The solution was then concentrated to about 3 mL, then cooled to 0 ° C. after 1.5 h and dissolved in 0.5 mL of iodine in 18 mL of (THF: pyridine: water = 7: 1: 1). Solution was added. The solution was left at room temperature for 5 minutes and then 9 mL of 2 M Na 2 S 2 O 3 aqueous solution was added thereto. The solution was concentrated to a gum state and the residue was dissolved in 20 mL of dichloromethane and the aqueous layer was extracted three times with 5 mL of dichloromethane. The organic layer was collected, washed three times (10 mL each) with 0.1 M aqueous TEAB solution and dried using sodium sulfate. The solution was concentrated and evaporated using toluene (2 x 10 mL) to remove the remaining pyridine. The residue was dissolved in dichloromethane and purified by chromatography on silica gel (2.182 g, yield 96%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -0.69, -0.81

실시예Example Ⅲ:  III: RNARNA 다이머Dimer 포스포라미다이트Phosphoramidite 합성 synthesis

Figure 112007081204613-pat00014
Figure 112007081204613-pat00014

RNA 다이뉴클레오타이드 포스포라미다이트 UU, CU, GU 및 GA (1a - 1d)RNA dinucleotide phosphoramidite UU, CU, GU and GA ( 1a - 1d )

R1 = DMTr, R2 = TBDMS, R = 2-사이아노에틸. 1a - B1 = U, B2 = U, 1b - B1 = bzC, B2 = U, 1c - B1 = ibG, B2 = U, 1d - B1 = ibGU, B2 = bzA, 2d - B1 = U, B2 = U, 2e - B1 = bzC, B2 = U, 2f - B1 = ibG, B2 = U, 2g - B1 = ibG, B2 = bzA. 4a - B2 = U, 4b - B2 = bzA. 5a - B1 = U, 5b - B1 = bzC, 5c - B1 = ibG.R 1 = DMTr, R 2 = TBDMS, R = 2-cyanoethyl. 1a -B 1 = U, B 2 = U, 1b- B 1 = bzC, B 2 = U, 1c -B 1 = ibG, B 2 = U, 1d -B 1 = ibGU, B 2 = bzA, 2d- B 1 = U, B 2 = U, 2e -B 1 = bzC, B 2 = U, 2f -B 1 = ibG, B 2 = U, 2g -B 1 = ibG, B 2 = bzA. 4a -B 2 = U, 4b -B 2 = bzA. 5a -B 1 = U, 5b -B 1 = bzC, 5c -B 1 = ibG.

실시예Example 8: 5'-O- 8: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 유리딜Glass dill -3'-O-[(N,N-다-3'-O-[(N, N- 이이소프Isofov 로필아미노)Lofilamino) 사이아노에톡시포시피노Cyanoethoxypocifino ] (3'->5')-2'-O-(3 '-> 5')-2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴유리딘의Of butyldimethylsilylfreedine 합성 (1a) Synthesis (1a)

실시예 4번의 2d 화합물(0.503 g, 0.44 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.074 g, 0.57 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.17 mL, 0.57 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 2시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진(머크)을 이용하여 정제하였다(0.4 g, 수율 70%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 138.4 , ~ 148.9, ~ -1.03, ~ -0.73 Example 2 2d compound (0.503 g, 0.44 mmol) and 5-ethylthiotetrazole (0.074 g, 0.57 mmol) were dissolved in 10 mL of acetonitrile and concentrated. 10 mL of acetonitrile was added, and the reaction flask was filled with argon, followed by dropwise addition of bis- (diisopropylamino) cyanoethoxy phosphine (0.17 mL, 0.57 mmol). The reaction solution was concentrated to about 1 mL, left for 2 hours, and then concentrated. The residue was dissolved in 10 mL of dichloromethane and saturated with saturated aqueous NaHCO 3 solution. The organic layer was washed with saturated aqueous NaHCO 3 (5 × 20 mL) and dried over sodium sulfate. The reaction solution was concentrated completely, water was added until the solution was cloudy, and purified using LiChroprep RP18 resin (Merck) (0.4 g, yield 70%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : ~ 138.4, ~ 148.9, ~ -1.03, ~ -0.73

실시예Example 9: 5'-O- 9: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 44 -- 벤조일Benzoyl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 사이티딜Cytidil -3'-O-[(N,N--3'-O-[(N, N- 다이이소프로필아미노Diisopropylamino )) 사이아노에톡시포시피노Cyanoethoxypocifino ] (3'->5')-2'-O-(3 '-> 5')-2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴유리딘의Of butyldimethylsilylfreedine 합성 (1b) Synthesis (1b)

실시예 5번의 2e 화합물(0.868 g, 0.70 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.11 g, 0.84 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.17 mL, 0.57 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때 까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(0.58 g, 수율 60%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 148.7 , ~ 143.9, ~ -1.18, ~ -0.77 Example 2e compound (0.868 g, 0.70 mmol) and 5-ethylthiotetrazole (0.11 g, 0.84 mmol) were dissolved in 10 mL of acetonitrile and concentrated. 10 mL of acetonitrile was added, and the reaction flask was filled with argon, followed by dropwise addition of bis- (diisopropylamino) cyanoethoxy phosphine (0.17 mL, 0.57 mmol). The reaction solution was concentrated to about 1 mL, left for 4 hours, and then concentrated. The residue was dissolved in 10 mL of dichloromethane and saturated with saturated aqueous NaHCO 3 solution. The organic layer was washed with saturated aqueous NaHCO 3 (5 × 20 mL) and dried over sodium sulfate. The reaction solution was concentrated completely, water was added until the solution was cloudy, and purified using LiChroprep RP18 resin (0.58 g, yield 60%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : ~ 148.7, ~ 143.9, ~ -1.18, ~ -0.77

실시예Example 10: 5'-O- 10: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 구아노실Guanosil -3'-O-[(N,N--3'-O-[(N, N- 다이이소프로필아미노Diisopropylamino )) 사이아노에톡시포시피노Cyanoethoxypocifino ] (3'->5')-2'-O-(3 '-> 5')-2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴유리딘의Of butyldimethylsilylfreedine 합성 (1c) Synthesis (1c)

실시예 6번의 2f 화합물 (1.126 g, 0.09 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.15 g, 1.17 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.35 mL, 1.17 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제 하였다(0.75 g, 수율 57%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150, ~ 148.9, ~ -0.66, ~ -0.49 The 2f compound of Example 6 (1.126 g, 0.09 mmol) and 5-ethylthiotetrazole (0.15 g, 1.17 mmol) were dissolved in 10 mL of acetonitrile and concentrated. 10 mL of acetonitrile was added, and the reaction flask was filled with argon, followed by dropwise addition of bis- (diisopropylamino) cyanoethoxy phosphine (0.35 mL, 1.17 mmol). The reaction solution was concentrated to about 1 mL, left for 4 hours, and then concentrated. The residue was dissolved in 10 mL of dichloromethane and saturated with saturated aqueous NaHCO 3 solution. The organic layer was washed with saturated aqueous NaHCO 3 (5 × 20 mL) and dried over sodium sulfate. The reaction solution was concentrated completely, and water was added until the solution became cloudy and purified using LiChroprep RP18 resin (0.75 g, yield 57%). 31 P NMR (DMSO), d ppm : ~ 150, ~ 148.9, ~ -0.66, ~ -0.49

실시예Example 11: 5'-O- 11: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -P--P- 사이아노에틸포스포릴Cyanoethylphosphoryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 구아노실Guanosil -3'-O-[(N,N--3'-O-[(N, N- 다이이소프로필아미노Diisopropylamino )) 사이아노에톡시포시피노Cyanoethoxypocifino ] (3'->5')-(3 '-> 5')- NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O-터트--2'-O- tert- 부틸다이메틸실릴아데닌의Butyldimethylsilyladenine 합성 (1d) Synthesis (1d)

실시예 7번의 2g 화합물 (1.5 g, 1.09 mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.18 g, 1.42 mmol)을 10 mL의 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 아세토니트릴을 넣고 반응 플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.43 mL, 1.42 mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로(5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(1.081 g, 수율 63%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150 , ~ 148.8, ~ -0.63, ~ -0.41 The 2g compound of Example 7 (1.5 g, 1.09 mmol) and 5-ethylthiotetrazole (0.18 g, 1.42 mmol) were dissolved in 10 mL of acetonitrile and concentrated. 10 mL of acetonitrile was added thereto, and the reaction flask was filled with argon, followed by dropwise addition of bis- (diisopropylamino) cyanoethoxy phosphine (0.43 mL, 1.42 mmol). The reaction solution was concentrated to about 1 mL, left for 4 hours, and then concentrated. The residue was dissolved in 10 mL of dichloromethane and saturated with saturated aqueous NaHCO 3 solution. The organic layer was washed with saturated aqueous NaHCO 3 (5 × 20 mL) and dried over sodium sulfate. The reaction solution was concentrated completely, water was added until the solution was cloudy, and purified using LiChroprep RP18 resin (1.081 g, 63% yield). 31 P NMR (DMSO), d ppm : ~ 150, ~ 148.8, ~ -0.63, ~ -0.41

실시예Example Ⅳ:  IV: RNARNA 트리뉴클레오타이드의Trinucleotide 합성 synthesis

Figure 112007081204613-pat00015
Figure 112007081204613-pat00015

RNA 트리뉴클레오타이드의 합성 UGpA (6a) 및 CGpA (6b)Synthesis of RNA Trinucleotides UGpA (6 a ) and CGpA (6 b )

R1 = o-클로로페닐, R2 = TBDMS. 6a - B1 = U, 6b - B1 = bzCR 1 = o -chlorophenyl, R 2 = TBDMS. 6a -B 1 = U, 6b -B 1 = bzC

실시예Example 12: 5'-O- 12: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 유리딘Yuri Dean -3'-일 -3 days 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate -5'-일 -5 days NN 22 -- 이소부티릴구아노신Isobutyrylguanosine -3'-일 -3 days NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O--2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴아데닌Butyldimethylsilyladenine -5'-일 -5 days 사이아노에틸포스페이트(6a)의Of cyanoethyl phosphate (6a) 합성 synthesis

단계1Step 1 : : NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 구아노신Guanosine -3'-일 -3 days 클로로페닐Chlorophenyl 포스페이트Phosphate -5'-일 N-5'-day N 44 -벤조일-2'-O--Benzoyl-2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴아데닌Butyldimethylsilyladenine (2h)의 합성 Synthesis of (2h)

4% 벤젠술폰산 9 mL을 다이클로로메탄:메탄올(7:3) 용액을 사용하여 제조한 후 0℃로 냉각하였다. 이 용액을 다이클로로메탄:메탄올(7:3) 용액 9 mL에 녹인 화합물 2c(1.265 g, 0.88 mmol)에 가하고 0℃에서 3분간 방치하였다. 포화 NaHCO3 수용액 25 mL을 가한 후 유기층을 다시 포화 NaHCO3 수용액으로 세척한 뒤 유기층을 소듐 설페이트로 건조시키고 농축하였다. 목표화합물은 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.62 g, 수율 63%). 9 mL of 4% benzenesulfonic acid was prepared using a dichloromethane: methanol (7: 3) solution and then cooled to 0 ° C. This solution was added to compound 2c (1.265 g, 0.88 mmol) dissolved in 9 mL of a dichloromethane: methanol (7: 3) solution, and left at 0 ° C. for 3 minutes. After adding 25 mL of saturated NaHCO 3 aqueous solution, the organic layer was washed again with saturated NaHCO 3 aqueous solution, and the organic layer was dried over sodium sulfate and concentrated. The target compound was purified by chromatography on silica gel (0.62 g, yield 63%).

단계 2: Step 2: 5'-O-5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 22 -- 이소부티릴Isobutyryl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 유리딘Yuri Dean -3'-일 -3 days 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate -5'-일 -5 days NN 22 -- 이소부티릴구아노신Isobutyrylguanosine -3'-일 -3 days NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O--2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴아데닌Butyldimethylsilyladenine -5'-일 -5 days 사이아노에틸포스페이트(6a)의Of cyanoethyl phosphate (6a) 합성 synthesis

U 포스포라미다이트(5a, 0.335 g, 0.39 mmol)과 위 단계 1의 화합물(2h, 0.292 g, 0.26 mmol)을 무수 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 반응 플라스크를 아르곤가스로 채우고 무수 아세토니트릴을 1 0mL을 가하였다. 5-벤질티오테트라졸(0.15 g, 0.78 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후 결정이 생길 때까지 농축한 후 뉴클레오사이드 용액에 가하였다. 반응액을 약 3 mL이 될 때까지 농축한 후 2시간 방치하였다. 반응액을 0℃로 냉각하고 2.4 mL의 (THF:피리딘:물 =7:1:2)에 녹인 0.5M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 1.2 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 유기층을 0.1 M TEAB 수용액 세척한 후 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 모아 0.1 M TEAB 수용액으로 3번 (각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔 (2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.413 g, 수율 84%). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.3, -1.4U phosphoramidite (5a, 0.335 g, 0.39 mmol) and the compound of step 1 (2h, 0.292 g, 0.26 mmol) were dissolved in anhydrous acetonitrile and concentrated. The reaction flask was filled with argon gas and 10 mL of anhydrous acetonitrile was added thereto. 5-benzylthiotetrazole (0.15 g, 0.78 mmol) was dissolved in 10 mL of anhydrous acetonitrile, concentrated to crystallization, and added to the nucleoside solution. The reaction solution was concentrated to about 3 mL and left for 2 hours. The reaction solution was cooled to 0 ° C. and 0.5M iodine solution dissolved in 2.4 mL of (THF: pyridine: water = 7: 1: 2) was added. The solution was left at room temperature for 5 minutes and then 1.2 mL of 2 M Na 2 S 2 O 3 aqueous solution was added thereto. The solution was concentrated to a gum state, the residue was dissolved in 20 mL of dichloromethane, the organic layer was washed with 0.1 M TEAB aqueous solution, and the aqueous layer was extracted three times with 5 mL of dichloromethane. The combined organic layers were washed three times (10 mL each) with 0.1 M TEAB aqueous solution and dried using sodium sulfate. The solution was concentrated and then evaporated using toluene (2 x 10 mL) to remove the remaining pyridine. The residue was dissolved in dichloromethane and purified by chromatography on silica gel (0.413 g, 84% yield). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -6.3, -1.4

실시예Example 13: 5'-O- 13: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 사이티딘Cytidine -3'-일 -3 days 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate -5'-일 -5 days NN 44 -- 이소부티릴구아노신Isobutyrylguanosine -3'-일 -3 days NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O--2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴아데닌Butyldimethylsilyladenine -5'-일 -5 days 사이아노에틸포스페이트의Of cyanoethylphosphate 합성(6b) Synthesis (6b)

rC 포르포라미다이트(5b, 0.409 g, 0.42 mmol)과 실시예 12번의 단계 1의 화합물 (2h, 0.238 g, 0.21 mmol)을 무수 아세토니트릴에 녹인 후 농축시켰다. 반응 플라스크를 아르곤가스로 채우고 무수 아세토니트릴을 10mL을 가하였다. 5-벤질티오테트라졸(0.123 g, 0.64 mmol)을 무수 아세토니트릴 10 mL에 녹인 후 결정이 생길 때까지 농축한 후 뉴클레오사이드 용액에 가하였다. 반응액을 약 3 mL이 될 때까지 농축한 후 3시간 방치하였다. 반응액을 0℃로 냉각하고 2.6 mL의 (THF:피리 딘:물=7:1:2)에 녹인 0.5 M 요오딘 용액을 가하였다. 이 용액을 상온에서 5분간 방치한 후 1.3 mL의 2 M Na2S2O3 수용액을 가하였다. 용액을 검상태가 될 때까지 농축한 후 잔사를 20 mL의 다이클로로메탄에 녹이고 유기층을 0.1 M TEAB 수용액 세척한 후 수층을 다이클로로메탄 5 mL을 사용하여 3번 추출하였다. 유기층을 모아 0.1 M TEAB 수용액으로 3번 (각 10 mL) 세척하고 소듐 설페이트를 사용하여 건조하였다. 용액을 농축한 후 톨루엔 (2 x 10 mL)을 사용하여 증발시켜 남은 피리딘을 제거하였다. 잔사를 다이클로로메탄에 녹인 후 실리카젤을 이용한 크로마토그래피로 정제하였다(0.298 g, 수율 71%). 31P NMR (DMSO), dppm : -6.3, -1.2rC poramidite (5b, 0.409 g, 0.42 mmol) and the compound of Step 1 of Example 12 (2h, 0.238 g, 0.21 mmol) were dissolved in anhydrous acetonitrile and concentrated. The reaction flask was filled with argon gas and 10 mL of anhydrous acetonitrile was added. 5-benzylthiotetrazole (0.123 g, 0.64 mmol) was dissolved in 10 mL of anhydrous acetonitrile, concentrated to crystallization, and added to the nucleoside solution. The reaction solution was concentrated to about 3 mL and left for 3 hours. The reaction solution was cooled to 0 ° C. and 0.5 M iodine solution dissolved in 2.6 mL of (THF: pyridine: water = 7: 1: 2) was added. The solution was left at room temperature for 5 minutes and then 1.3 mL of 2 M Na 2 S 2 O 3 aqueous solution was added. The solution was concentrated to a gum state, the residue was dissolved in 20 mL of dichloromethane, the organic layer was washed with 0.1 M TEAB aqueous solution, and the aqueous layer was extracted three times with 5 mL of dichloromethane. The combined organic layers were washed three times (10 mL each) with 0.1 M TEAB aqueous solution and dried using sodium sulfate. The solution was concentrated and then evaporated using toluene (2 x 10 mL) to remove the remaining pyridine. The residue was dissolved in dichloromethane and purified by chromatography on silica gel (0.298 g, 71% yield). 31 P NMR (DMSO), d ppm : -6.3, -1.2

실시예Example Ⅴ:  Ⅴ: RNARNA 트라이머Trimmer 포스포라미다이트의Phosphoramidite 합성 synthesis

Figure 112007081204613-pat00016
Figure 112007081204613-pat00016

RNA 트라이머 포스포라미다이트의 합성(7a, 7b). Synthesis of RNA Trimer Phosphoramide ( 7a, 7b ).

R1 = o-클로로페닐, R2 = 2-사이아노에틸, R3 = TBDMS. 6a, 7a - B1=U, 6b, 7b - B1=bzCR 1 = o -chlorophenyl, R 2 = 2-cyanoethyl, R 3 = TBDMS. 6a, 7a -B 1 = U, 6b, 7b -B 1 = bzC

실시예Example 14: 5'-O- 14: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -2'-O-(-2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 유리딘Yuri Dean -3'-일 -3 days 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate -5'-일 -5 days NN 22 -- 이소부티릴구아노신Isobutyrylguanosine -3'-일 -3 days NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O--2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴아데닌Butyldimethylsilyladenine -5'-일 -5 days 사이아노에틸포스페이트Cyanoethylphosphate -3-O-(2--3-O- (2- 사이아노에틸Cyanoethyl )-N,N-) -N, N- 다이이소Daiiso 프로필포스포라미다이트의Profile of Phosphoramidite 합성 (7a) Synthetic (7a)

실시예 12번의 6a 화합물 (0.41g, 0.21mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.037g, 0.57mmol)을 10 mL의 무수 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 무수 아 세토니트릴을 넣고 반응플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀 (0.084mL, 0.28mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로 (5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(0.319g, 수율 72%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150.2 , ~ 148.9, ~ -6, ~ -1.4 Example 6a compound 6a (0.41 g, 0.21 mmol) and 5-ethylthiotetrazole (0.037 g, 0.57 mmol) were dissolved in 10 mL of anhydrous acetonitrile and concentrated. 10 mL of anhydrous acetonitrile was added thereto, and the reaction flask was filled with argon, followed by dropwise addition of bis- (diisopropylamino) cyanoethoxy phosphine (0.084 mL, 0.28 mmol). The reaction solution was concentrated to about 1 mL, left for 4 hours, and then concentrated. The residue was dissolved in 10 mL of dichloromethane and saturated with saturated aqueous NaHCO 3 solution. The organic layer was washed with saturated aqueous NaHCO 3 (5 × 20 mL) and dried over sodium sulfate. The reaction solution was concentrated completely, and water was added until the solution became cloudy and purified using LiChroprep RP18 resin (0.319 g, 72% yield). 31 P NMR (DMSO), d ppm : ~ 150.2, ~ 148.9, ~ -6, ~ -1.4

실시예Example 15: 5'-O- 15: 5'-O- 다이메톡시트리틸Dimethoxytrityl -- NN 44 -- 벤조일Benzoyl 2'-O-( 2'-O- ( 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴Butyldimethylsilyl )) 사이티딘Cytidine -3'-일 -3 days 클로로페닐포스페이트Chlorophenyl phosphate -5'-일 -5 days NN 44 -- 이소부티릴구아노신Isobutyrylguanosine -3'-일 -3 days NN 44 -- 벤조일Benzoyl -2'-O--2'-O- 터트Tert -- 부틸다이메틸실릴아데닌Butyldimethylsilyladenine -5'-일 -5 days 사이아노에틸포스페이트Cyanoethylphosphate -3-O-(2--3-O- (2- 사이아노에틸Cyanoethyl )-N,N-) -N, N- 다이이소Daiiso 프로필포스포라미다이트의Profile of Phosphoramidite 합성 (7b) Synthesis (7b)

실시예 13번의 6b 화합물 (0.298g, 0.15mmol)과 5-에틸티오테트라졸(0.025g, 0.20mmol)을 10 mL의 무수 아세토니트릴에 녹이고 농축하였다. 10 mL의 무수 아세토니트릴을 넣고 반응플라스크를 아르곤으로 충진한 후 bis-(다이이소프로필아미노)사이아노에톡시 포스핀(0.06mL, 0.20mmol)을 적가하였다. 반응액을 약 1 mL이 될 때까지 농축하고 4시간 방치한 후 완전히 농축하였다. 잔사를 다이클로로메탄 10 mL에 녹인 후 포화 NaHCO3 수용액으로 포화시켰다. 유기층을 포화 NaHCO3 수용액으로 (5 x 20 mL)으로 세척하고 소듐 설페이트로 건조하였다. 반응액을 완전히 농축한 후 용액이 흐려질 때까지 물을 가하고 LiChroprep RP18 레진을 이용하여 정제하였다(0.180 g, 수율 60%). 31P NMR (DMSO), dppm : ~ 150.2 , ~ 148.9, ~ -6, ~ -1.0 The 6b compound of Example 13 (0.298 g, 0.15 mmol) and 5-ethylthiotetrazole (0.025 g, 0.20 mmol) were dissolved in 10 mL of anhydrous acetonitrile and concentrated. 10 mL of anhydrous acetonitrile was added thereto, and the reaction flask was filled with argon, followed by dropwise addition of bis- (diisopropylamino) cyanoethoxy phosphine (0.06 mL, 0.20 mmol). The reaction solution was concentrated to about 1 mL, left for 4 hours, and then concentrated. The residue was dissolved in 10 mL of dichloromethane and saturated with saturated aqueous NaHCO 3 solution. The organic layer was washed with saturated aqueous NaHCO 3 (5 × 20 mL) and dried over sodium sulfate. The reaction solution was concentrated completely, and water was added until the solution became cloudy and purified using LiChroprep RP18 resin (0.180 g, 60% yield). 31 P NMR (DMSO), d ppm : ~ 150.2, ~ 148.9, ~ -6, ~ -1.0

실시예Example VIVI :  : RNARNA 다이머Dimer 포스포아미다이트를Phosphoramidite 이용한  Used siRNAsiRNA 의 합성Synthesis of

모든 siRNA를 Polygen DNA/RNA 합성기(Polygen 사)를 이용하여 0.8 μmole 스케일로 트리틸-오프(trityl-off) 상태로 합성하였다. 3‘-말단은 RNA CPG를 사용하였다. RNA CPG는 30 μmole/g loading (Glen Research사에서 구입)을 사용하고 그리고 각 모노머 염기로는 rAtac, rCtac, rGtac 및 U 포스포라미다이트(Proligo 사에서 구입)를 사용하였다. 모노머 및 다이머 포스포라미다이트는 아세토니트릴에 녹인 0.05 M 용액을 사용하였다. 모노머 및 다이머 당량은 한 사이클당 모두 각 2.5 당량을 사용하였다. 활성자는 0.5 M 5-에틸티오테트라졸 (in 아세토니트릴)을 이용하였다. 고체지지물과 보호기는 암모니아수:에탄올(3:1)의 혼합물을 사용하여 65℃에서 2시간 가열하여 분리한 후 이 용액을 동결 건조하였다. 잔사를 0.4 mL의 [N-메틸피리돈:트리에틸아민:트리에틸아민 트리하이드로플루오라이드] (6:3:4) 용액에 녹이고 65℃에서 2시간 가열하였다. 4 mL의 n-부틸알코올을 가하 고 냉동고에서 2시간 냉각시킨 후 원심분리하여 고체의 siRNA를 얻어 이를 동결건조 시켰다. 크루드 siRNA의 수율을 UV 스펙트로포토미터를 사용하여 260 nm에서 정량하고 순도는 역상 HPLC를 이용하여 분석하였다. 농도 계산을 위한 자연 리보뉴클레오타이드의 흡광 계수는 다음과 같다: rA, 15400: rC, 7200: U, 9900: rG, 11500. siRNA의 분자량은 MALDI-TOF (Bruker, Autoflex)를 이용한 질량 분석을 통하여 확인되었다.All siRNAs were synthesized in a trityl-off state on a 0.8 μmole scale using a Polygen DNA / RNA synthesizer (Polygen). The 3'-end used RNA CPG. RNA CPG was used with 30 μmole / g loading (purchased from Glen Research) and rA tac , rC tac , rG tac and U phosphoramidite (purchased from Proligo) as the monomer bases. The monomer and dimer phosphoramidite used a 0.05 M solution dissolved in acetonitrile. Monomer and dimer equivalents were each used 2.5 equivalents per cycle. The activator used 0.5 M 5-ethylthiotetrazole (in acetonitrile). The solid support and the protecting group were separated by heating at 65 ° C. for 2 hours using a mixture of ammonia water: ethanol (3: 1), and the solution was lyophilized. The residue was taken up in 0.4 mL of [N-methylpyridone: triethylamine: triethylamine trihydrofluoride] (6: 3: 4) solution and heated at 65 ° C. for 2 hours. 4 mL of n -butyl alcohol was added thereto, cooled in a freezer for 2 hours, and then centrifuged to obtain a solid siRNA, which was freeze-dried. The yield of crude siRNA was quantified at 260 nm using a UV spectrophotometer and purity was analyzed using reverse phase HPLC. Absorption coefficients of natural ribonucleotides for concentration calculation are as follows: rA, 15400: rC, 7200: U, 9900: rG, 11500. The molecular weight of siRNA was confirmed by mass spectrometry using MALDI-TOF (Bruker, Autoflex). It became.

실시예Example 16:  16: GUGU RNARNA 다이머를Dimer 이용한  Used GFPGfp -- sensesense siRNAsiRNA 의 합성Synthesis of

GFP-sense siRNA의 서열은 5'-GUU CAG CGU GUC CGG CGA GUU-3' 이다. 합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 다이머 GU 및 모노머의 축합시간은 모두 10분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 GU이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 GFP-sense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 1에 서술되어 있다.The sequence of the GFP-sense siRNA is 5'-GUU CAG CGU GUC CGG CGA GU U-3 '. Synthesis was carried out by the method of Example 15 and the condensation time of the dimer GU and the monomer were all 10 minutes. The first was a dimer GU used for the condensation reaction and then the monomers were bound. Purity was measured using reversed phase chromatography and the analyzer used an Agilent 1100 system. Chromatography buffer was mixed with 100 mM TEAA, pH 7.0 and acetonitrile. Purity and yield were compared with GFP-sense siRNA using monomers. The results are described in Table 1 below.

첫번째 리보뉴클레오타이드 First ribonucleotide siRNA 순도siRNA purity 모노머 Monomer 52%52% 다이머 Dimer 73%73%

실시예Example 17:  17: CUCU RNARNA 다이머를Dimer 이용한  Used GFPGfp -- antisenseantisense siRNAsiRNA 의 합성Synthesis of

GFP-antisense siRNA의 서열은 5'-CUC GCC GGA CAC GCU GAA CUU-3' 이다. 합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 다이머 CU 및 모노머의 축합시간은 모두 10분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 CU이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 GFP-antisense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 2에 서술되어 있다.The sequence of the GFP-antisense siRNA is 5'-CUC GCC GGA CAC GCU GAA CU U-3 '. Synthesis was carried out by the method of Example 15, and the condensation time of the dimer CU and the monomer were all 10 minutes. The first was a dimer CU used for the condensation reaction and then the monomers were bound. Purity was measured using reversed phase chromatography and the analyzer used an Agilent 1100 system. Chromatography buffer was mixed with 100 mM TEAA, pH 7.0 and acetonitrile, and purity and yield were compared with GFP-antisense siRNA using monomers. The results are described in Table 2 below.

첫번째 리보뉴클레오타이드 First ribonucleotide siRNA 순도siRNA purity 모노머 Monomer 63%63% 다이머 Dimer 78%78%

실시예Example 18:  18: UUUU RNARNA 다이머를Dimer 이용한  Used JNKJNK -- antisenseantisense siRNAsiRNA 의 합성Synthesis of

JNK-antisense siRNA의 서열은 5'-AGA AGG UAG GAC AUU CUU UUU-3' 이다. 합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 다이머 UU 및 모노머의 축합시간은 모두 10분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 UU이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 JNK-antisense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 3에 서술되어 있다.The sequence of the JNK-antisense siRNA is 5'-AGA AGG UAG GAC AUU CUU UU U-3 '. Synthesis was carried out by the method of Example 15 and the condensation time of the dimer UU and the monomer were all 10 minutes. The first was a dimer UU used for the condensation reaction and then the monomers were bound. Purity was measured using reversed phase chromatography and the analyzer used an Agilent 1100 system. Chromatography buffer was mixed with 100 mM TEAA, pH 7.0 and acetonitrile, and purity and yield were compared with JNK-antisense siRNA using monomers. The results are described in Table 3 below.

첫번째 리보뉴클레오타이드 First ribonucleotide siRNA 순도siRNA purity 모노머 Monomer 71%71% 다이머 Dimer 88%88%

실시예Example 19:  19: GAGA RNARNA 다이머를Dimer 이용한  Used SEISEI -- sensesense siRNAsiRNA 의 합성Synthesis of

SEI-sense siRNA의 서열은 5'-GCA AGG GUC UGA AGC GGA A-3' 이다.합성은 실시예 15번의 방법으로 실시되었고 모노머의 축합시간은 10분을 사용하고 다이머 GA의 축합시간은 15분을 사용하였다. 첫 번째 축합반응에 이용되는 다이머 GA이고 이후 모노머를 결합시켰다. 순도는 역상크로마토그래피를 이용하여 측정하였으며 분석기는 Agilent 1100 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피의 버퍼는 100 mM TEAA, pH 7.0과 아세토니트릴을 혼합하여 사용하였으며 순도 및 수율은 모노머를 사용한 SEI-sense siRNA와 비교하였다. 결과는 아래 표 4에 서술되어 있다.The sequence of the SEI-sense siRNA is 5'-GCA AGG GUC UGA AGC G GA A-3 '. The synthesis was carried out by the method of Example 15. The condensation time of the monomer was 10 minutes and the condensation time of the dimer GA was 15. Minutes were used. The first was a dimer GA used for the condensation reaction and then the monomers were bound. Purity was measured using reversed phase chromatography and the analyzer used an Agilent 1100 system. Chromatography buffer was mixed with 100 mM TEAA, pH 7.0 and acetonitrile and purity and yield were compared with SEI-sense siRNA using monomers. The results are described in Table 4 below.

첫번째 리보뉴클레오타이드 First ribonucleotide siRNA 순도siRNA purity 모노머 Monomer 65%65% 다이머 Dimer 78%78%

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.Having described the specific part of the present invention in detail, it is apparent to those skilled in the art that the specific technology is merely a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereto. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and equivalents thereof.

Claims (13)

다음의 단계를 포함하는 올리고리보뉴클레오타이드[r(NMP)n]의 제조방법: Method for preparing oligoribonucleotides [r (NMP) n ] comprising the following steps: (a) 고상 지치체-리보뉴클레오사이드[SS-(rNS)1]에 리보뉴클레오타이드 다이머[(rNMP)2] 또는 리보뉴클레오타이드 트라이머[(rNMP)3]를 커플링시켜 SS-(rNS)1-(rNMP)2 또는 SS-(rNS)1-(rNMP)3를 제조하는 단계; (a) coupling a ribonucleotide dimer [(rNMP) 2 ] or a ribonucleotide trimer [(rNMP) 3 ] to a solid phase-ribonucleoside [SS- (rNS) 1 ] to SS- (rNS) 1; preparing-(rNMP) 2 or SS- (rNS) 1- (rNMP) 3 ; (b) 상기 단계 (a)의 결과물에 연속적으로 리보뉴클레오타이드 모노머를 커플링시켜 SS-(rNS)1-(rNMP)2-(rNMP)n-3 또는 SS-(rNS)1-(rNMP)3-(rNMP)n-4를 제조하는 단계; 및 (b) successively coupling the ribonucleotide monomer to the product of step (a) to SS- (rNS) 1- (rNMP) 2- (rNMP) n-3 or SS- (rNS) 1- (rNMP) 3 preparing (rNMP) n-4 ; And (c) 상기 SS-(rNS)1-(rNMP)2-(rNMP)n-3 또는 SS-(rNS)1-(rNMP)3-(rNMP)n-4 로부터 고상 지지체(SS)를 제거하여 [r(NMP)n]를 얻는 단계.(c) removing the solid - phase support (SS) from the SS- (rNS) 1- (rNMP) 2- (rNMP) n-3 or SS- (rNS) 1- (rNMP) 3- (rNMP) n-4 obtaining [r (NMP) n ]. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드는 포스포다이에스테르, 포스포라미데이트, 알킬포스포라미데이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 알킬포스포트리에스테르, 또는 알킬포스포노티오에이트 결합을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the ribonucleotide has a phosphodiester, phosphoramidate, alkylphosphoramidate, alkylphosphonate, phosphorothioate, alkylphosphotriester, or alkylphosphonothioate linkages Characterized in that the method. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 다이머는 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법:The method of claim 1, wherein the ribonucleotide dimer is prepared by a reaction comprising coupling a compound of Formula 1 with a compound of Formula 2: 화학식 1Formula 1
Figure 112008084943550-pat00017
Figure 112008084943550-pat00017
 화학식 2Formula 2
Figure 112008084943550-pat00018
Figure 112008084943550-pat00018
 상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, In Formulas 1 and 2, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 are each independently a protecting group, 상기 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 또는 픽실(9-phenyl xanthen-9-yl)이고, The protecting groups R 1 and R 4 are independently of each other dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl, or pixyl (9-phenyl xanthen-9-yl), 상기 보호기 R2 및 R5는 서로 독립적으로 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고, The protecting groups R 2 and R 5 are independently of each other thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis ( 2-acetoxy) methyl), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2-chloro-4-methyl) phenyl] -4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), rubulic (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), or NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), 상기 보호기 R3는 할로페닐 또는 카르보벤족실기이며, The protecting group R 3 is a halophenyl or carbobenzoxyl group, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 다이머는 하기 화학식 3의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법:The method of claim 1, wherein the ribonucleotide dimer is prepared by a reaction comprising coupling a compound of Formula 3 with a compound of Formula 2: 화학식 3Formula 3
Figure 112008084943550-pat00019
Figure 112008084943550-pat00019
 화학식 2Formula 2
Figure 112008084943550-pat00020
Figure 112008084943550-pat00020
 상기 화학식 2 및 3에서, R1, R2, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, In Formulas 2 and 3, R 1 , R 2 , R 4 and R 5 are each independently a protecting group, 상기 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 또는 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl)이고, The protecting groups R 1 and R 4 are independently of each other dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl, or pixyl (9-phenyl xanthen-9-yl), 상기 보호기 R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고, The protecting groups R 2 and R 5 are thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis (2-acetoxy ) methyl), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2- chloro-4-methyl) phenyl]-4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl ), MEM (methoxyethoxymethyl), levulinyl, NPE (4-nitropheylethyl), or NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), R31은 2-사이아노에틸, 메틸, 메톡시, 4-사이아노-2-부테닐 또는 디페닐메틸실릴에틸기이며, R32 디알킬아미노이고, R 31 is 2-cyanoethyl, methyl, methoxy, 4-cyano-2-butenyl or diphenylmethylsilylethyl group, R 32 dialkylamino, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다.B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 트라이머는 다음의 단계를 포함하는 반응에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 방법: The method of claim 1 wherein the ribonucleotide trimer is prepared by a reaction comprising the following steps: (i) 다음 화학식 4의 리보뉴클레오타이드 다이머에서 R1기를 제거하는 단계; 및 (i) removing the R 1 group from the ribonucleotide dimer of Formula 4; And 화학식 4Formula 4
Figure 112008084943550-pat00021
Figure 112008084943550-pat00021
 상기 화학식 4에서 R1, R2, R3 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, In Formula 4, R 1 , R 2 , R 3 and R 5 are each independently a protecting group, 상기 보호기 R1은 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸 또는 픽실 (9-phenyl xanthen-9-yl)이고, The protecting group R 1 is dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl or pisyl (9-phenyl xanthen-9-yl), R2 및 R5는 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl) 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고, R 2 and R 5 is thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis (2-acetoxy) methyl), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4-ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2-chloro-4-methyl ) phenyl]-4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), SEM (methoxyethoxymethyl ), Levulinyl, NPE (4-nitropheylethyl) or NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), R3는 수소, 할로페닐 또는 카르보벤족실기이며,R 3 is hydrogen, halophenyl or carbobenzoxyl group, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다; B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base; (ⅱ) 단계 (i)의 결과물과 리보뉴클레오사이드 3‘-포스포라미다이트를 커플링시켜 리보뉴클레오타이드 트라이머를 제조하는 단계. (Ii) coupling the product of step (i) with ribonucleoside 3′-phosphoramidite to produce a ribonucleotide trimer. 제 1 항에 있어서, 상기 리보뉴클레오타이드 모노머는 리보뉴클레오사이드 포스포라미다이트인 것을 특징으로 하는 방법.The method of claim 1, wherein the ribonucleotide monomer is ribonucleoside phosphoramidite. 삭제delete 삭제delete 활성제(activator)로서 1-메틸이미다졸의 존재 하에서 하기 화학식 1의 화합물을 화학식 2의 화합물과 커플링시키는 단계를 포함하는 리보뉴클레오타이드 다이머의 제조방법:A method of preparing a ribonucleotide dimer comprising coupling a compound of Formula 1 with a compound of Formula 2 in the presence of 1-methylimidazole as an activator: 화학식 1Formula 1
Figure 112008084943550-pat00026
Figure 112008084943550-pat00026
 화학식 2Formula 2
Figure 112008084943550-pat00027
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 상기 화학식 1 및 2에서, R1, R2, R3, R4 및 R5는 각각 독립적으로 보호기이고, In Formulas 1 and 2, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 5 are each independently a protecting group, 상기 보호기 R1 및 R4는 서로 독립적으로 디메톡시트리틸, 모노메톡시트리틸, 트리틸, 또는 픽실(9-phenyl xanthen-9-yl)이고, The protecting groups R 1 and R 4 are independently of each other dimethoxytrityl, monomethoxytrityl, trityl, or pixyl (9-phenyl xanthen-9-yl), 상기 보호기 R2 및 R5는 서로 독립적으로 티-부틸-디메틸실릴, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1-(2-chloro ethoxy)ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis(2-acetoxy)methyl), Fpmp (1-(2-fluorophenyl)-4-methoxypiperidin -4-yl), Cpep (1-(4-chloro phenyl)-4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1-[2-chloro-4-methyl)phenyl]- 4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1-(2-cyanoethoxy)ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), 루불리닉 (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), 또는 NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl)이고, The protecting groups R 2 and R 5 are independently of each other thi-butyl-dimethylsilyl, TOM (tri-isopropyl silyloxymethyl), CEE (1- (2-chloro ethoxy) ethyl), CEM (2-cyanoethoxymethyl), ACE (bis ( 2-acetoxy) methyl), Fpmp (1- (2-fluorophenyl) -4-methoxypiperidin-4-yl), Cpep (1- (4-chloro phenyl) -4- ethoxypiperidin-4-yl), Ctmp (1- [2-chloro-4-methyl) phenyl] -4-methoxy piperidin-4-yl), NPES (4-nitrophenylethylsulfonyl), CPES (4-chloro phenylethylsolfonyl), CNEE (1- (2-cyanoethoxy) ethyl), SEM (trimethyl silylethoxymethyl), MEM (methoxyethoxymethyl), rubulic (levulinyl), NPE (4-nitropheylethyl), or NPEOC (4-nitrophenylethyloxycarbonyl), 상기 보호기 R3는 할로페닐 또는 카르보벤족실기이며, The protecting group R 3 is a halophenyl or carbobenzoxyl group, B1 및 B2는 각각 독립적으로 뉴클레오사이드 염기(nucleosidic base)이다. B 1 and B 2 are each independently a nucleosidic base. 제 1 항에 있어서, 상기 제조되는 올리고리보뉴클레오타이드[r(NMP)n]는 2'-할로겐 리보뉴클레오타이드, 2'-아미노 리보뉴클레오타이드 및 2'-O-알킬 리보뉴클레오타이드 중 하나 이상의 당 변형된 리보뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. The oligoribonucleotide [r (NMP) n ] prepared above is a sugar modified ribonucleotide of at least one of 2'-halogen ribonucleotide, 2'-amino ribonucleotide and 2'-0-alkyl ribonucleotide. Method comprising a.
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