KR100883860B1 - 에리스로포이에틴에 의해 수반되는 고혈압 방지를 위한조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에리스로포이에틴(Epo)와 함께 포유동물에 투여되는 경우, Epo 치료 목적인 적혈구 용적율에 영향을 주지 않으면서 에리스로포이에틴에 의해 보통 수반되는 혈압상승을 방지 또는 감소시키는 용해 에리스로포이에틴-결합 단백질 및 용해 에리스로포이에틴-결합 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 본 발명은 포유동물에 에리스로포이에틴(Epo)을 투여하고; 용해 Epo 결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체로부터 선택된 약제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 포유동물의 빈혈을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 Epo를 투여받은 포유동물에서 고혈압을 감소시키는 방법, 및 용해 Epo-bp 및/또는 Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질을 함유하는 약제학적 조성물도 제공한다.

Description

에리스로포이에틴에 의해 수반되는 고혈압 방지를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTING ERYTHROPOIETIN-ASSOCIATED HYPERTENSION}

본 출원은 2004년 5월 17일자로 출원된 "에리스로포이에틴에 의해 수반되는 고혈압 방지를 위한 조성물 및 방법" 명칭의 미국 실용특허 출원 제 10/848,689호를 우선권으로 주장한다

에리스로포이에틴은 프로크릿(이포에틴), 에포젠(이포에틴) 및 아라네스프(다아베포에틴)이란 명으로 판매되고 있다. 에리스로포이에틴은 빈혈 치료, 특히 만성 신부전 및 암의 화학요법시 발생되는 빈혈 치료용으로 처방된다.

에리스로포이에틴(Epo)은 혈관을 증식시키는 요소로서 조혈작용을 자극하여 적혈구 용적율과 혈색소 치들을 올리지만 또한 혈액 점도(1-5)와 혈압 상승(1-14)의 결과를 가져온다. 임상실험에서 재조합 인간 Epo로 치료된 혈액투석 환자의 약 1/3이 혈압상승을 나타내었다. Epo는 혈액점도 상승으로 인한 말단혈관 저항 및 심장 출력 저하를 가져올 것으로 추정된다(6). 또 다른 학자들은 Epo로 인해 발생되 는 고혈압에 대해 과다혈량, 혈장 레닌과 안지오텐신 상승, 아드레날린 과다활성, 혈장 아르기닌 바소프레신 증가, 키닌과 프로스타글란딘의 저하 등과 같은 다른 매카니즘들을 제시하고 있다(15). 하루 주기의 과도한 지속 상승, 지나친 혈압 및 혈압상승은 변화된 혈관운동 시간 측정(시간 구조)에 근거한 것으로 본다. 호르몬과 유전에 근거한 부분을 포함한 다른 작인들은 하루 주기의 혈압 변화에 기여하는 요인들로 보여진다.

고혈압은 심장 혈관 질환의 병발에 기여하는 가장 중요한 요인들중의 하나이다. 고혈압은 하루 주기 율동에 의해 상당히 영향을 받는다. 현저한 자동적인 하루 주기(약 24 시간) 변화에 의해 밤과 낮으로 변하는 체내 호르몬 농도의 변동은 혈압과 심장박동에 영향을 준다. 심히 중요한 율동들은 악성 질환에서의 자극과 억제사이를 다르게 만들수 있다.

Epo는 포유동물의 신장 모세 혈관에 퍼져있는 근접 세포들과 정맥막 간 세포에서 생성되는 분자량 34 킬로달톤(kDa)의 당단백 호르몬이다(3). Epo는 산소부족에 대응하여 분비되며 적혈구 분화의 유도자 및 조정자로서 선조 혈액 세포사를 억제하고 세포분열 및 말단 성숙을 촉진하여 조혈작용을 조정한다(16). 이 효과들은 Epo가 특정 세포 표면의 수용체들에 결합됨으로 이루어진다(17). 인간 Epo의 근본 구조는 1980년대 중반부터 알려졌지만(18, 19), 생체적 활동에 관계되는 Epo 분자의 구조적 양상들은 대부분 알려져 있지 않다. 인간 Epo는 시스테인 29 와 33, 그리고 시스테인 7과 161을 연결하는 두개의 디설파이드 결합을 포함한다. 이 두 결합들은 생체적 활동을 위해 필수적이다(18). 에포에틴(재조합 인간 에리스로포이에 틴)은 인간 유전자를 분리하여 중국 햄스터 난소 세포주에 발현시켜 생성되었다(4). 이 재조합 Epo는 165-아미노산 성숙 단백질로, 천연 단백질에서 카복실 말단의 아르기닌이 제거되었다는 점만이 성숙한 천연 단백질과 다르다. 천연 인간 Epo는 27-아미노산 선두 서열이 제거된 193 아미노산 펩타이드로 해독된다(19, 20). 재조합 Epo는 겉보기 분자량이 약 30.4 킬로달톤(kDa)으로 면역학적으로 내분비 호르몬과 비슷한 것처럼 보이며 완전한 생체적 활동을 나타낸다(19).

Epo로 치료한 인간과 동물들은 조혈작용 자극을 통한 적혈구 용적율(%)과 적색소 상승을 보인다(2-5). 어떤 연구 결과들은 인간에 적혈구 용적율 상승 정도가 혈압상승과 비례하는 것으로 제안한다(20). Epo로 빈혈치료를 하는데 관계되는 또 다른 연구에서는 적혈구 용적율이 올라가는 것과 함께 환자들중 20-30%에서 혈압이 극심하게 상승되어 혈압 약물치료를 요구하게 되는 결과를 보였다(5).

고혈압은 에리스로포이에틴 치료와 함께 오는 가장 흔하고 중요한 합병증이다. 더구나, Epo의 치료목표는 적혈구 용적율과 적색소치를 상승시키는 것인데, 적혈구 용적율이 더 올라갈수록 더욱 큰 사망 및 심장혈관 사건 위험이 온다는 것이 발견되었다(PROCRIT warnings, www.rxlist.com/cgi/generic/epoetin-wcp.htm), 그것은 혈압상승에 의한 것으로 보이는데, 적혈구 용적율 상승정도에 비례하여 혈압 상승폭이 관계되는 것을 보이고 있는 점을 이유로 보고 있다(20). 에포에틴 설명서는 조정이 안되는 고혈압 환자들에게 에포에틴을 사용한 치료를 하지 말라고 경고한다.

Epo로 치료된 환자에서 혈압 상승을 방지 또는 처치하기 위한 신규 방법 및 조성물이 요망된다. 고혈압 없이 빈혈을 치료하기 위한 신규 방법 및 조성물이 요망된다.

발명의 요약

본 발명가들은 막 단백질 Epo 수용체의 용해 단편인 용해 Epo-결합 단백질을 Epo와 함께 주입시키게 되면, Epo 치료의 목적인 적색소와 적혈구 용적율을 올리는데 영향을 주지 않고, Epo로 인해 통상적으로 오는 혈압상승이 방지되는 것을 발견하였다. Epo-결합 단백질에 대항하여 만든 항체도 또한 Epo로 유도된 적혈구 용적율 상승에 영향을 주지 않고 Epo로 인한 혈압 상승을 방지시키는 것을 발견하였다.

그에 따라, 본 발명은 에리스로포이에틴(Epo)을 포유동물에 투여하고, 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체로부터 선택된 약제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, 포유동물의 빈혈을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체로부터 선택된 약제를 포유동물에 투여하는 것을 포함하여, Epo 치료를 받는 포유동물에서 고혈압을 줄이는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질의 의학적 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 에리스로포이에틴 유도 고혈압을 감소시키는데 유 효한 약제를 제조하는데 있어서 Epo 수용체의 세포외 용해 부분 단백질상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 에리스로포이에틴-결합 단백질을 의학 치료에 사용하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 에리스로포이에틴 유도 고혈압을 감소시키는데 유효한 약제를 제조하기 위한 용해 에리스로포이에틴 결합 단백질의 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 에리스로포이에틴; 및 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체중에서 선택된 약제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 용해 Epo-결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체중에서 선택된 약제의 의학적 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체중에서 선택된 약제의 에리스로포이에틴-유도 고혈압을 감소시키는데 유효한 의약을 제조하 기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 에리스로포이에틴, 및 (b) 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체중에서 선택된 약제를 포함하는 조성물의 의학적 치료 용도를 제공한다.

본 발명의 다른 구체예는 (a) 에리스로포이에틴, 및 (b) 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체중에서 선택된 약제를 포함하는 조성물의, 성분 (b)를 포함하지 않는 비교 조성물보다 고혈압을 덜 유도하면서 빈혈 치료에 유효한 의약을 제조하기 위한 용도를 제공한다.

도 1은 Epo와 다른 약제들을 각각 치료 그룹의 쥐에 처리한 평균 약 24시간 혈압을 막대그래프로 나타낸 것이다.

도 2는 각 치료 그룹들의 혈압 수치를 보인다.

도 3은 각 치료 그룹들의 쥐의 하루 주기 적혈구 용적율 변화를 나타내는 것이다.

도 4도는 Epo(패널 A, B 및 C) 또는 염수(패널 D) 처치후 쥐로 부터 절단해 낸 비장의 사진을 나열시킨 것이다

도 5는 인간 지원자의 혈청과 혈장에서 Epo, αEpo, Epo-bp 및 αEpo-bp의 면역검출에 의한 광밀도 막대그래프이다. 에러 막대들은 표준 에러, SEM을 나타낸다.

정의

본 원에 사용된 "에리스로포이에틴은" 천연자원에서 분리해 낸 에리스로포이에틴 및 적혈구 생성 자극의 에리스로포이에틴 생체 활성을 가지는 재조합 에리스로포이에틴 또는 공학적으로 제조된 에리스로포이에틴을 포함한다. 그것은 에포에틴과 다아베포에틴을 포함한다. 바람직하게, 에리스로포이에틴은 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 아미노산이 인간 에리스로포이에틴과 서열 상동성을 가진다(서열번호 3). 서열 상동성은 뉴클레오타이드 서열 대조를 위한 디폴트 BLAST 파라미터를 사용하여 계산된다(PubMed 웹사이트, www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/).

본 원에 사용된 "용해 Epo-결합 단백질"은 Epo에 높은 친화도로 결합하는, 항체가 아닌 수용성 단백질로 Epo와 함께 포유동물에 투여시 Epo로 유도되는 고혈압을 줄이는 효과가 있는 단백질을 말한다. Epo에 결합하는 단백질의 K_D가 10 μM 보다 작은 것이 바람직하고, 1 μM 보다 작은 것이 보다 바람직하며, 100 nM 보다 작은 것이 더더욱 바람직하고, 20 nM 보다 작은 것이 가장 바람직하다. K_D는 미국 특허 제 5,843,726호의 실시예 6에 설명한 것과 같은 경쟁적 결합 분석으로 결정할 수 있다. 바람직하게, 용해 Epo-결합 단백질은 Epo 수용체의 용해 부분 서열 또는 그에 상응하는 서열이거나, 이들을 포함한다. 인간 Epo 수용체 서열은 서열번호 1이다(Winkelmann, J.C., et al., 1990, Blood 76:24-30). 인간 Epo 수용체의 용해 부분은 서열번호 1의 23-250 잔기이다. 특정의 구체예로, Epo-결합에 관여하는 Epo-결합 단백질의 잔기는 서열번호 1 잔기와 적어도 70%가 동일하고, 더 바람직하게는 적어도 80%가 동일하며, 더 더욱 바람직하게는 적어도 90%가 동일하고, 가장 이상적인 것은 이에 상응하는 것이다.

본 원에 사용된 "Epo 수용체의 세포외 용해 부분"은 수용성 환경에서 세포의 외부 표면에 노출된 Epo 수용체 부분을 말한다. 구체적으로, 그것은 서열번호 1의 25-250 잔기(인간 Epo 수용체) 또는 다른 Epo 수용체 단백질의 동질 용해 잔기인 서열번호 2이다.

본 원에 사용된 "Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질"은 Epo 수용체의 세포외 용해 부분에 결합하고, Epo와 함께 포유동물에 투여하는 경우 포유동물에서 Epo로 인해 상승하는 혈압을 줄이는 단백질을 말한다. 인식 단백질은 Epo 수용체에 대항하여 만든 완전 항체나 Epo-결합 단백질에 대항한 것으로 Epo 수용체 용해 부분에 결합하는 항체, 또는 그 완전 항체의 단편 결합들이 될 수 있다. 인식 단백질은 또한 항체가 아닌 단백질이나 펩타이드(예를 들어 파지 디스플레이 결합에 의해 선택된 단백질 또는 펩타이드 등)로 이들이 인간 Epo 수용체의 세포외 용해 부분에 결합하는 것이거나 결합 친화력이 적어도 10⁵ L/mole, 보다 바람직하게는 10⁶ L/mole 또는 더 더욱 바람직하게는 적어도 10⁷ L/mole, 또는 가장 바람직하게는 적어도 10⁸ L/mole로 다른 포유동물의 Epo 수용체에 결합하는 것 등일 수 있다.

본 원에 사용된 "항체"란 완전 항체들과 완전 항체의 항원-결합 단편들, 예를 들어 Fab 또는 F(ab')₂ 항체들을 포함한다. "항체"의 의미는 또한 모노클로날 및 폴리클로날 항체들(예를 들어 항혈청) 등을 포함한다.

약제 주입에 의한 "고혈압 저하"의 뜻은 약제를 투여하지 않을 때 모집단의 중대한 부분에 혈압이 올라가는 것을 방지하거나 줄이는 것 등을 포함한다.

설명

본 발명의 방법은 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 복합체로부터 선택된 약제를 포유동물에 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 일부 구체예에서, 약제는 용해 Epo-bp이다.

일부 구체예에서, 용해 Epo-bp는 포유동물 Epo 수용체의 용해 부분 단편을 포함한다.

특정 구체예에서, 용해 Epo-bp는 서열번호 2의 적어도 30 잔기의 단편을 함유한다(인간 Epo 수용체의 잔기 25-250, 서열번호 1). 서열번호 2는 인간 Epo 수용체의 세포외 용해 부분이다. 특정 구체예에서, 용해 Epo-bp는 서열번호 2의 적어도 15, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 150 또는 적어도 200 잔기 단편을 함유한다.

특정 구체예에서, 용해 Epo-bp는 서열번호 2를 포함하거나, 또는 서열번호 2이다. 그 용해 Epo-bp는 미국 특허 제 5,843,726호에 설명된 것으로 서열번호 2로 표현될 수 있다. 일반적인 뜻으로 서열번호 2는 글루타치온-S-트랜스퍼라제(GST) N-말단 선두 서열을 가지는 융합 단백질로 표현된다. 서열번호 2는 트롬빈 절단 부위에 의해 GST 선두 서열로부터 분리된다. 발현된 융합 단백질은 트롬빈에 의해 절단되어 서열번호 2를 방출한다. 서열번호 2의 Epo-bp는 천연적으로 인간의 혈청이나 혈장에서 발견되고, 가능하게 Epo 수용체의 절단 산물로 생성될 수 있다 (이후 실시예 2 참조).

특정 구체예에서, 용해 Epo-bp는 PubMed 웹사이트 www.ncbi.nlm.nih.gov /Pubmed/에 뉴클레오타이드 서열 비교를 위한 디폴트 BLAST 파라미터를 사용하여 계산하는 경우 아미노산 서열의 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%가 서열번호 2와 동일하다.

본 발명의 일부 구체예에서, 용해 Epo-bp는 아미노 말단에 Gly-ser 두 추가 잔기들을 더 가진 서열번호 2인 서열번호 8이다.

본 발명의 일 구체예에서, 용해 Epo-bp는 융합 단백질 발현 및 트롬빈으로 절단하는 것 등을 포함한 과정의 산물이다. 그 융합 단백질은 카복실 말단에 트롬빈 분해 절단부위를 필수적으로 가진 제 1 폴리펩타이드 세그먼트와 서열번호 2를 필수적으로 가진 제 2 폴리펩타이드 세그먼트를 포함한다. 두번째 세그먼트의 아미노 말단은 첫번째 세그먼트의 카복실 말단에 공유적으로 결합된다. 그 용해 Epo-bp는 융합 단백질을 트롬빈으로 절단함으로써 생산된다.

본 발명의 한 구체예에서, 용해 Epo-bp는 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(서열번호 7)의 펩타이드 서열을 아미노-말단에 연결시킨 서열번호 2를 포함한 융합 단백질 발현과 트롬빈으로 융합 단백질을 절단하는 것 등을 포함한 과정의 산물이다.

본 발명의 한 구체예에서, 용해 Epo-bp는 (a) 아미노 말단 및 카복실 말단을 함유하며 카복실 말단에는 서열번호 7을 가지는 제 1 폴리펩타이드 세그먼트와 (b) 서열번호 2로 구성되며 제 1 폴리펩타이드 세그먼트의 카복실 말단에 공유적으로 결합된 제 2 폴리펩타이드 세그먼트로 구성된 융합 단백질의 발현과 트롬빈으로 융합 단백질을 절단하는 것 등을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예 방법에서, 약제는 Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질이다.

인식 단백질은 세포막에 있는 무손상 Epo 수용체의 세포외 용해 부분에 결합함으로 Epo로 인해 유도된 혈압상승을 줄이는 효과를 나타낼 수 있거나, 또는 혈액중에 자연적으로 순환중인 용해 Epo-결합 단백질(수용체의 분해 산물로 생각되는 Epo 수용체의 세포외 용해 부분과 동일한 아미노산 서열을 가진)에의 결합에 의해 그의 효과를 발휘할 수 있거나, 또는 그 둘의 메카니즘 또는 아직 알려지지 않은 메카니즘에 의해 효과를 나타낼 것으로 보인다. 약제의 구체예를 "Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질"로 설명하는 것은 인식 단백질의 특성을 설명하기 위한 것이고 인식 단백질의 작용 메카니즘을 필수적으로 설명하는 것은 아니다.

특정 구체예에서, 인식 단백질은 서열번호 2에 결합한다. 즉, 인식 단백질은 서열번호 2를 인식하고 그 안의 일부 서열에 결합한다. 인식 단백질들은 예를 들어, 서열번호 2에 대항하여 만들어진 항체이거나, Epo 수용체에 대항하여 만든 항체가 서열번호 2에 결합하거나, 또는 서열번호 2의 펩타이드 단편에 대항에서 만든 항체들일 수 있다.

특정 구체예에서, 인식 단백질은 항체이다. 특정한 구체예에서, 항체는 완전 항체이다. 특정 구체예로, 항체는 항체 단편이다. 예를 들어, 항체 단편은 Fab, Fab' 또는 F(ab')₂ 또는 Fv이다.

특정 구체예에서, 항체는 서열번호 2에 대항한 항체이다.

다른 특정한 구체예에서, 인식 단백질은 항체가 아닌 단백질이나 펩타이드이다. 예를 들어, 그것은 인식 펩타이드나 파지 디스플레이에 의해 선택된 단백질일 수 있다. 파지 디스플레이를 이용한 결합 펩타이드의 선택 방법들은 문헌 [Sidhu SS, Lowman HB, Cunningham BC, and Wells JA: Phage display for selection of novel binding peptides, Methodsin Enzymology 2000; 328:333-363]을 참고할 수 있다.

특정 구체예에서, 약제는 용해 Epo-결합 단백질과 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질의 조합물이다.

Epo와 약제는 별도로 또는 함께 투여될 수 있다.

특정 구체예에서, 투여되는 약제의 양은 적어도 Epo 투여량과 동몰량이다.

특정 구체예에서, 투여되는 약제의 양은 Epo 투여량과 거의 동몰량이다. 예를 들어, 투여되는 약제의 몰은 투여되는 Epo 몰의 70% 와 125% 사이가 될 것이다.

빈혈 치료 방법의 특정 구체예에서, 약제는 포유동물의 Epo로 유도되는 혈압상승을 줄인다. 그것은, 포유동물에 Epo와 약제를 적용할 때 Epo만을 받는 것 보다 포유동물의 혈압상승을 줄이는 것이다.

바람직하게, 포유동물에 Epo를 동몰량의 약제와 함께 투여하는 경우, Epo만을 투여하는 경우의 혈압상승 비율의 75%나 그 이하로, 더욱 바람직하게, 포유동물에 Epo만을 투여하는 경우보다 50%나 그 이하의 혈압 상승을 보인다.

본 발명의 한 구체예는 Epo 수용체의 세포외 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질을 포함하는 약제학적 조성물이다.

본 발명의 다른 약제학적 조성물은 에리스로포이에틴; 및 용해 Epo-결합 단백질, Epo 수용체의 세포의 용해 부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질 및 이들의 조합물로부터 선택된 약제를 포함한다.

본 발명의 다른 약제학적 조성물은 용해 Epo-결합 단백질을 포함한다.

전형적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함한다.

인식 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 한 구체예에서, 인식 단백질은 서열번호 2에 대항한 항체이다.

용해 Epo-결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 한 구체예에서, Epo-결합 단백질은 서열번호 2이다.

약제의 다른 특정 구체예, 용해 Epo-결합 단백질, Epo 수용체의 세포외 용해부분상의 Epo 수용체에 결합하는 인식 단백질은 본 발명의 방법을 위해 설명된 것이다.

항체 제공

항체 생성을 위해, Epo 수용체나 Epo-bp를 포유동물에 직접 투여하거나, 또는 이들의 단백질 또는 펩타이드 단편들을 운반 단백질에 결합시켜 투여할 수 있다. 적당한 운반 단백질들은 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 소 혈청 알부민 및 오브알부민을 포함한다. 운반 단백질에 결합시키는 방법은 단일 단계 글루타르알데하이드 커플링 및 문헌 [Harlow Ed., et al., Antibodies: a laboratory maunal, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)]에 설명된 다른 방법들을 포함한다.

면역원은 척추동물 항체 생성을 유도하기 위해 척추동물을 면역시키는데 사용된다. 바람직하게, 면역원은 면역반응을 촉진시키기 위해 프로인트 보조제와 같은 보조제를 함께 주사한다. 적당한 척추동물은 토끼, 생쥐, 쥐, 햄스터, 염소, 양 및 닭을 포함한다.

모노클로날 항체를 합성하기 위한 하이브리도마는 당업계에 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Wang H., et al. Antibody Expression and Engineering, Am. Chem, Soc., Washington, DC(1995)] 참조. 폴리클로날 및 모노클로날 항체들은 당업계에 알려진 방법에 의해 분리할 수 있다(예: 동 문헌 및 Harlow 등에 의한 문헌).

천역 항체들은 두개의 동일한 경(L)쇄와 두개의 동일한 중(H)쇄의 테트라머이다. 그 L과 H 쇄들은 항원 인식과 결합에 관여하는 가변 도메인을 가진다. 가변 도메인에서의 가변성은 상보 결정 영역(CDR)에 집중되어 있다.

본 발명에서 사용을 위해 고려되는 항체는 전체 면역글로불린, Fv, Fab와 유사한 단편과 같은 항체 단편, CDR과 그와 같은 형들의 단일쇄 항체를 비롯한 각종 형태의 임의의 것일 수 있으며, 본 원에 사용된 넓은 의미안에 속하는 모든 항체를 포함한다.

"항체 단편"이란 전장 항체의 항원-결합 부분을 의미한다. 항체 단편은 약 4개의 아미노산의 작은 것에서, 약 10개의 아미노산, 약 30개의 아미노산이나 그 이상의 것일 수 있다. 항체 단편의 일부 유형은 다음과 같다:

(1) Fab는 항체 분자의 1가 항원-결합 단편을 포함하는 단편이다. Fab 단편은 전체 항체를 파파인 효소로 처리하여 무손상 경쇄와 하나의 중쇄 부위를 만들어 생성시킬 수 있다. 전체 항체 분자당 두개의 Fab 단편이 수득된다.

(2) Fab'는 완전 항체를 펩신으로 처리한 다음 환원에 의해 무손상 경쇄와 중쇄 부분을 생성하여 획득될 수 있는 항체 단편이다. 두개의 Fab' 단편들을 완전 항체 분자에서 획득할 수 있다. Fab' 단편들은 중쇄 CH1 도메인의 카복실 말단에 시스테인이 하나 더 있는 등 몇개의 잔기들이 더 첨부된 것으로 Fab 단편들과 구분된다.

(3) F(ab')₂는 펩신으로 처리된 완전 항체를 환원시키지 않고 얻어지는 단편들이다. F(ab')₂는 두 Fab' 단편의 다이머로 두개의 디설파이드 결합에 의해 함께 연결되어 유지된다.

(4) Fv는 완전 항원 인식 및 결합 부위를 포함한 최소 항체 단편이다. Fv는 단단한 비공유 결합의 경쇄 1개와 중쇄 1개의 가변 도메인의 다이머로 이루어진다(V_H-V_L 다이머). 이 배열에 있는 그것은 각 가변 도메인의 3 CDR들이 항원-결합 부위의 한계를 정하기 위해 상호 작용한다. 종합적으로, 6개의 CDR들은 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 하나의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3 CDR들로 이루어진 Fv의 반)이라도 항원에 결합하는 능력을 가진다(완전 결합 부위보다 낮은 친화성을 가질지라도).

(5) 단일 사슬 항체(SCA)는 유전학적으로 한개의 사슬분자로 융합시킨 적당한 폴리펩타이드 링커로 연결시켜 만든 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 포함하는 유전공학적으로 만들어진 분자로 정의된다.

폴리클로날 항체의 제조는 당업자들에게 잘 알려져 있다. 참조예: Coligan et al., in Current Protocols in Immunology, section 2.4.1 (1992). 모노클로날 항체의 제조도 마찬가지로 관례적이다. 예: Harlow et al., page 726.

모노클로날 항체의 시험관내 및 생체내 조작 방법은 숙련된 기술을 가진 자들에게 잘 알려졌다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체들은 Kohler 및 Milstein 에 의해 최초로 설명된 하이브리도마 방법에 의해 만들어 질 수 있거나(Nature 256:495(1995)), 재조합 방법에 의해 만들어 질 수 있다(예; 미국 특허 제 4,816,567호). 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체들은 또한 Clark 등에 의한 Nature 352:624 (1991) 및 Marks 등에 의한 J. Mol. Biol. 222:581(1991)에서 설명된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 추출할 수 있다. 다른 방법은 인간 특이적 인식 서열들을 포함하는 항체들을 생성하기 위한 재조합 수단에 의한 모노클로날 항체의 인간화를 포함한다(참조예: Holmes et al., J. Immunol. 158:2192 (1997) 및 Vaswani et al., Annals Allergy, Asthma & Immunol. 81:105 (1998)).

본 원에 특별히 포함되는 모노클로날 항체들은 "키메라" 항체들로, 중쇄 및/또는 경쇄 부분이 특종으로부터 유래된 항체들의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 것이거나, 또는 특정한 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체들을 포함하는 한편, 나머지 사슬(들)은 다른 종으로부터 유래된 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동성인 것이거나, 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체, 및 목적하는 생체적 활동을 나타내는 상기 항체들의 단편들이 포함된다(미국 특허 제 4,816,567호; Morrison et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. 81: 6851 (1984))).

항체 단편의 제조 방법이 또한 당업계에 공지되었다(예를 들어, Harlow and Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1988)). 본 발명의 항체 단편들은 항체의 단백질분해에 의한 가수분해나 단편을 코딩하는 DNA의 대장균에서 발현에 의해 제조할 수 있다. 항체 단편들은 전체 항체들을 펩신이나 파파인으로 처리하는 관례적인 방법으로 획득할 수 있다. 예를 들어, 항체 단편들은 펩신으로 항체를 효소적으로 절단하여 F(ab')₂로 나타낸 5S 단편을 제조하여 생성될 수 있다. 이 단편은 티올 환원제를 사용하여 추가로 절단될 수 있고, 임의로 디설파이드 결합의 절단으로부터 설프하이드릴 그룹에 대한 차단 그룹으로 3.5 S Fab' 1가 단편들을 생성할 수 있다. 다른 방법으로, 펩신에 의한 효소 절단으로 2개의 1가 Fab 단편 및 하나의 Fe 단편을 직접 생성한다. 이 방법들은 예를 들어 미국 특허 제 4,036,945호, 4,331,647호 및 여기에 참고로 포함된 문헌에 설명되었다.

항체 절단의 다른 방법, 예컨대 중쇄의 분리로 1가 경쇄-중쇄 단편들을 형성하는 것, 추가로 단편 절단이나, 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술들이 사용될 수 있는데 이들은 단편들이 무손상 항체에 인식되는 항원에 결합하는 한 사용될 수 있다. 예를 들어, Fv 단편들은 V_H와 V_L 사슬들의 결합으로 이루어진다. 이 결합은 공유결합이 아닐 수 있거나, 가변 사슬들이 분자간 디설파이드 결합으로 연결될 수 있거나, 글루타르알데하이드와 같은 화합물들에 의한 교차 결합으로 결합될 수 있다. 바람직하게, FV 단편들은 펩타이드 링커로 연결된 V_H와 V_L 사슬들을 포함한다. 이들 단일 사슬 항원 결합 단백질(sFv)은 올리고뉴클레오타이드에 의해 연결된 V_H와 V_L 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 적제하여 제조한다. 구조 유전자는 후에 대장균과 같은 숙주 세포속으로 도입되는 발현 벡터속으로 삽입된다. 재조합 숙주 세포들은 두개의 V 도메인을 연결하는 링커로 단일 펩타이드 사슬을 합성한다. sFv를 생성하는 방법들은 예를 들어 [Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, 2:97 (1991); Bird et al., Science 242:423 (1988); Ladner et al., 미국 특허 제 4,946,778호; 및 Pack et al., Bio/Technology 11:1271 (1993)]에 기술되어 있다.

항체 단편의 다른 형은 단일 상보-결정 영역(CDR)을 지닌 펩타이드이다. CDR 펩타이드("최소 인식 단위")는 항원 인식 및 결합에 자주 연관된다. CDR 펩타이드들은 클로닝이나 관심있는 항체의 CDR을 코딩하는 유전자 작제에 의해 획득되어 질 수 있다. 그와 같은 유전자들은, 예를 들어 PCR을 이용하여 항체-생성 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성함으로서 제조된다. 참조예: Larrick et, al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology 2: 106(1991).

본 발명은 인간 및 비인간(예, 쥐과) 항체의 인간화 형을 숙고한다. 그와 같은 인간화 항체들은 키메라 면역글로불린, 면역글로불린 사슬, 또는 이들의 단편(Fv, Fab, Fab', F(ab')₂나 항체의 다른 항원-결합 서열)으로, 비인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 것들이다. 대부분의 인간화 항체들은 지향하는 특이성, 친화성 및 능력을 가지는 생쥐, 쥐, 염소, 양, 토끼와 같은 비인간 종(기증 항체)의 CDR로부터의 잔기들에 의해 수용자의 CDR 잔기들이 대체된 인간 면역글로불린(수용 항체)이다.

일부 예에서, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 잔기들이 상응하는 비인간 잔기들로 대체된다. 더욱이, 인간화 항체는 수용 항체나 수입된 CDR 또는 골격 서열에서 찾을 수 없는 잔기들로 이루어질 수도 있을 것이다. 이들의 변형은 항체 수행 역할을 더욱 세련되고 최적하게 만들어 주게 된다. 일반적으로, 인간화 항체는 실제적으로 CDR 영역들이 비인간 면역글로불린의 것들에 대응하는 전체 또는 실제적으로 모두가 적어도 하나나 대체로 둘의 가변 영역들 전부를 실제적으로 이루고, FR 영역 전부나 실제적으로 모두는 인간 면역글로불린 공통 서열의 것들이다. 인간화 항체는 최적으로는 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 일정 부위(Fc)의 부분을 적어도 포함할 것이다. 보다 상세한 설명은 Jones et al., Nature 321:522 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323 (1988); Presta, Curr. Opinion Struct. Biol. 2:593 (1992); Holmes et al., J. Immunol. 158:2192 (1997); 및 Vaswani et al., Annals Allergy, Asthma & Immunol. 81:105 (1998)을 참조하기 바란다.

본 발명의 항체들은 또한 친화성, 선택성, 결합 강도 또는 다른 지향하는 특성을 최적화하도록 변이될 수 있다. 항체 변이의 한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화성 변이를 포함한다. 파지 디스플레이를 이용한 친화성 변이는 Lowmane 등에 의해 설명된 과정을 참고하기 바란다[Biochemistry 30:10832 (1991)]; Hawkins 등에 의한 J. Mol. Biol. 254:889 (1992)도 또한 참조바람.

본 발명이 이후 제한적이지 않은 실시예로 보다 상세히 설명될 것이다.

실시예 1

본 실시예는 서열번호 2를 가지는 것으로 생각되는 Epo-bp의 제조를 설명하며, 이는 미국 특허 제 5,843,726호에도 기재되어 있다.

EpoR 제조합 벡터의 작제

인간 Epo 수용체의 세포외 용해 도메인 코딩 서열을 함유하는 PCR 산물 및 Pharmacia로 부터 구입한 플라스미드 벡터 pGEX-2T로부터 재조합 플라스미드 발현 벡터 pJYL26을 작제하였다.

PCR 증폭은 전장 인간 EpoR cDNA인 서열번호 4를 주형으로 사용하여 수행하였다 5'-센스 프라이머로는 5'-TTGGATCCGCGCCCCCGCCTAAC-3'(서열번호 5)을 사용하였다. 이 프라이머는 5' 말단에 BamH1 링커 서열을 갖고 있으며, 그 뒤에 전장 인간 EpoR 단백질의 아미노산 25 내지 29를 코딩하는 서열이 따르도록 하였다. 3'-안티센스 프라이머로는 5'-TGAATTCGGGGTCCAGGTCGCT-3'(서열번호 6)을 사용하였다. 이 프라이머는 EcoR1 링커를 갖고 있으며, 그 뒤에 전장 EpoR의 아미노산 250 내지 246을 코딩하는 서열에 상보적인 서열이 따르도록 하였다. 미국 특허 제 5,843,726호에 설명한 대로 PCR을 수행하였다.

PCR 산물과 pGEX-2T를 EcoR1과 BamH1으로 분해시켜 분해된 DNA들을 겔 전기영동으로 정제하였다. PCR 산물 및 pGEX-2T를 각각 l ㎍/㎕로 함유하는 혼합물에서 결찰시켰다. 그 결찰 산물은 약 5.5 kb로 확인되었다. 그 결찰 플라스미드 혼합물을 대장균 JM 109를 형질전환시키는데 사용하였다. 콜로니들이 증식하였다. 각 형질전환 콜로니로부터 DNA를 추출하고 분석하였다. EcoR1과 EcoR1 Plus BamH1로 처리된 DNA 크기를 1% 아가로오스겔에서 예상 크기를 확인한 후 하나의 콜로니로부터 플라스미드가 선택되었다. 그 절차들은 미국 특허 제 5,843,726호에 설명한 대로 수행되었다.

EpoRex-th 융합 단백질의 정제

재조합 벡터 pJYL26을 포함한 형질전환된 대장균을 배양시키고 IPTG로 유도시켰다. 세포 추출물을 GSH-아가로오스 칼럼에 적용시켰다. 결합된 EpoRex-th는 환원 글루타치온으로 용출해냈다. 이것은 미국 특허 제 5,843,726호에 설명된 바와 같이 수행되었다.

Epo-bp의 정제

EpoRex-th는 Epo-bp를 글루타치온-S-트랜스퍼라제로부터 분리시키는 트롬빈-특이적 단백질 분해 절단 인식 서열을 함유하고 있다. 절단 인식 서열의 아미노산 서열은 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser이다(서열번호 7). 융합 단백질을 트롬빈으로 절단하고, Epo-bp를 Epo-아가로오스 칼럼에 대한 결합 친화성으로 정제하였다. 이것은 미국 특허 제 5,843,726호에 설명된 것으로 수행되었다. Epo-bp의 아미노산 말단이 이 절차에 의해 생성되었으므로 트롬빈 절단 부위는 실험적으로 결정되지 않았다. 그 트롬빈 절단은 서열번호 2의 Epo-bp를 생산하는 것으로 믿어진다. 그러나, 트롬빈은 다른 부위, 즉 인식 서열의 Arg와 Gly 사이를 절단하여 Gly-Ser 펩타이드가 서열번호 2의 아미노 말단에 부착되는 단백질을 생성할 수도 있을 것이다(서열번호 8).

실시예 2

본 실시예는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 용해 Epo-결합 단백질과 Epo-bp에 대항한 Fab 항체를 Epo와 함께 또는 Epo 부재로 쥐에 주입시켜 효과를 시험하는 실험들을 설명한다.

실험 절차

<재료>

글루타치온(GSH)-아가로오스, pGEX-2T 발현 벡터 및 세파덱스 G-50을 파마시아(Pharmacia: Mechanicsburg, PA)로부터 구입하였다. PCR 시약온 퍼킨-엘머 세투스(Perkin Elmer Cetus: Norwalk, CT)로부터 구입하고 아피겔(Affigel^®) 15는 바이오라드(BioRad: Richmond, CA)로부터 구입하였다. 박테리오파아지 T4 DNA 리가제, 제한 효소 및 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)는 BRL Gibco(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. Geneclean Ⅱ는 Bin 101, La Jolla, CA로부터 구입하였다. 니트로셀룰로오스는 Schleicher & Schuell Co.(Keene, NH)로부터 구입하였다. 화학발광(Chemiluminescence; ECL) 시약 및 ¹²⁵Ⅰ-Epo는 아머샴(Amersham: Arlington Heights, IL)로부터 구입하고 표지되지 않은 Epo는 Chugai-Upjohn(Rosemont, IL)로부터 증여받았다. 트롬빈, 트립신, 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF), 디이소프로필플루오로포스페이트(DFP), 트리톤 X-100, 2,7-디클로로플루오레세인, 바이오틴-아미노카프로일 히드라조아지드, 알칼리성 포스파타제 접합체, 디소듐 p-니트로페닐 포스페이트 및 o-페닐렌디아민디하이드로클로라이드(oPD)는 시그마 화학회사(Sigma Chemical Company: St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 바이오틴화된(biotinylated) 토끼 항-양 항체 및 아비딘(avidin)-호울스 래디쉬(horseradish) 퍼옥시다제 및 IgG 정제 키트는 피어스사(Pierce Co.: Rockford, IL)로부터 구입하 였다. 스트렙타비딘 퍼옥시다제는 베링거 만하임 회사(Indianapolis, IN)으로부터 구입하고, 마이크로플레이트는 코닝 코스타(Cambridge, MA)로부터 구입하였다. 기타의 모든 시약들은 시약 등급의 것을 사용하였다.

Epo-bp, Epo-bp에 대항한 Fab 항체(αEpo-bp)와 Epo에 대항한 Fab 항체(αEpo)들은 우리 실험실에서 제조되었다. Epo-bp는 미국 특허 제 5,843,726호에 설명된 대로 제조되었다. Epo-bp는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가졌다. 전장 인간수용체 cDNA(서열번호 4)는 예일대학의 버나드 G. 포젯 박사로부터 제공받았다. 올리고뉴클레오타이드는 미네아폴리스 메네소타에 있는 미네소타 학교의 인간 유전학 연구소의 미량화학 연구시설에 합성되어졌다. 기타의 모든 시약들은 시약 등급의 것을 사용하였다.

<동물실험>

스프레그-덜리(Sprague-Dawley, SD) 숫컷 쥐들을 대학내 동물실험을 위한 동물 시설에 수용하여 퓨리나 음식물과 물에 자유로이 접근할 수 있도록 하였다. 아침 4시에서 오후 6시(04:00-18:00) 까지를 낮의 시간으로 하여 밤낮의 주기를 바뀌게 한 실험실에서 쥐를 보호하고 쥐들의 혈압, 적혈구 용적율, 몸무게(체중) 및 비장의 무게가 Epo 효과의 하루 주기에 영향을 받는지에 대해 조사하였다. 효과적인 치료 시간을 찾기 위해 5주 된 쥐들을 사용하여 각 그룹이 쥐 다섯마리씩 6 소그룹으로 구성된 각 그룹을, 시험 시간을 00, 04, 08, 12, 16과 20시로 하여 대조군과 치료 그룹으로 배치한다. 쥐들은 치료전의 그룹간 체중, 혈압 및 적혈구 용적율의 차이들에 통계적으로 유의성이 없게 하여 무작위로 추출하여 Epo 처리(Rx) 대 염수 및 다른 치료그룹들의 각 그룹에 배치한다.

혈압, 적혈구 용적율 및 체중은 치료 시작 직전과 1주에 2회 Epo 나 생리 식염수를 피하 주사로 4주간 실시 완료한 직후에 잰다. Epo, Epo-bp와 αEpo-bp 양은 에포에틴 연구결과 보고에 준하여 결정되었다(4). Epo 양은 50 단위/체중 kg이었고, Epo-bp와 αEpo-bp는 Epo와 같은 양으로 투여하였다. 에리스로포이에틴(에포에틴)은 Amgen 회사(Thousand Oaks, CA)로부터 구입하였다. 친화성으로 정제된 Epo-bp와 αEpo-bp는 우리 실험실에서 만들었다. 항체를 Fab 단편으로 처리하고 Fab 항체를 정제하였다.

혈압 측정을 위해, 펜토바비톨(50 mg/kg) 마취하에 대퇴동맥에 캐뉼라를 연결하였다. 실험 종료시, 비장의 무게를 재고 사진을 찍었다. 뇌, 심장, 대동맥과 양쪽 신장의 무게를 재었다.

<선조 세포에서 리간드 결합 부위 및 Epo 와 EpoE의 검출>

우리는 Epo-bp를 매 3-4주마다 3개월동안 양에 접종시켜 αEpo-bp를 개발하였다. 혈청을 수집한 후, 항체를 정제하고, 파파인으로 처리하여 Fab 항체들을 생성하였다. Fab들이 정제되었다. Fab들은 제조자의 설명에 따라 플루오레세인이 표지되었다. 이 재료들은 혈액 및/또는 조직 표본에서 수용체를 검출하기 위해 사용되어졌다. 음성 대조 세포들은 항체들이 첨가되지 않았고, 양성 대조 세포들은 면역전 혈청의 IgG로부터의 Fab를 가졌다. 항체 결합 부위(Epo 수용체)를 검사하기 위해, 뼈 골수 세포를 PBS로 세척하여 웰당 1-3×10³ 세포로 둥근바닥으로 된 시험관에 분배한 후, 500×g에서 2분동안 원심분리시켰다. 상등액을 제거하고 100 ㎕의 플루오레세인이 접합된 Fab 항체를 첨가하였다. 잘 혼합한 후에 혼합물을 빙욕중에 30분간 배양하였다. 세포를 400 ㎕의 1% FCS와 0.01% NaN₃가 포함된 PBS 완충액으로 3회 세척시켰으며, 각 세척시 500×g에서 2분간 원심분리시켜 상등액을 제거하였다. 세척된 세포를 전체 양이 50 ㎕의 PBS가 되도록 재현탁시켜 도립 형광 현미경으로 분석하였다.

효소 면역 분석방법(EIA)은 치료하지 않은 인간 대상에서 Epo, Epo-bp, 그리고 Epo 및 Epo-bp에 대항하는 항체들의 수준을 검출하고 측정하는데 쓰여진다. Epo-bp검출을 위해 2 ㎕/웰의 항-Epo-bp 항체(αEpo-bp) 및 Epo 검출을 위해 2 ㎍/웰의 항-Epo로 EIA 마이크로플레이트를 코팅하였다. 순환중인 항-Epo 와 항-αEpo-bp 항체(αEpo-bp)들을 검출하기 위해 웰을 200 ㎕의 1:10 희석 혈청 또는 혈장 PBS(pH 7.4) 완충액으로 코팅하였다. 플레이트를 실온에서 30분 동안, 또는 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 항체나 혈청으로 플레이트를 코팅한 후, 웰을 200 ㎕/웰의 PBST(PBS중에 0.05% TWEEN 20)로 3회 세척하였다. 비특이 결합 부위들은 1% BSA를 포함한 200 ㎕/웰 PBST로 실온에서 30분동안 봉쇄시켰다. 웰을 200 ㎕/웰 PBST로 3회 세척하였다. 결합된 항원 검출을 위해, 우리 실험실에서 퍼옥시다제-스트렙타비딘 표지를 Fab 항-Epo(Epo 검출을 위해)에, Epo(항-Epo 항체 검출을 위해)에, Fab 항-Epo-bp(Epo-bp 검출을 위해)에, 그리고 Epo-bp(항-Epo-bp 항체 검출을 위해)에 각각 부착하였다. 적당한 퍼옥시다제-스트렙타비딘 표지된 단백질 2 ㎍을 200 ㎕ PBST 완충액으로 각 웰에 첨가하였다. 웰을 200 ㎕ PBST 완충액으로 3회 세척하였다. 시트레이트 완충액중의 O-페닐렌디아민디하이드로클로라이드(OPD) 용액 (160 ㎕)을 각 웰에 첨가하였다. (용액은 24 mM 시트레이트와 51 mM Na₂HPO₄, pH 6.0에 10 ㎎/㎖로 함유되며 사용 직전에 100 ㎖ 용액에 0.4 ㎖의 3% H₂O₂ 를 첨가하여 사용한다). 5M NaOH 40 ㎕를 넣어 반응을 중지시키고, 405 ㎚에서 흡광도를 측정했다.

〈통계〉

데이터는 변수를 데이터의 함수로 허용하는 two-tailed Stndent's t test, 콘시너(cosinor) 방법과 선형 최소자승 리드모메트리(rhythmometry)(21)에 의해 분석하였다. 데이터는 평균치± SEM으로 나타내었다. p 값이 0.05 미만일때 유의성이 있는 것으로 간주하였다.

〈결과〉

표 1에서, 모든 치료 그룹에서 치료전의 혈압, 적혈구 용적율 및 체중의 그룹간 차이에는 통계적으로 유의성이 없었다. 대조군에 비해 Epo로 치료한 그룹의 전체적 체중이 낮아졌다(295 vs, 313 g, p<0.01), 치료전의 기본 하루 주기 혈압비교에서 Epo 치료 vs, 대조군, Epo-bp 및 αEpo-bp(Epo-bp에 대항한 Fab 항체) 그룹 들은 유의성이 없었다(87±2.8 vs.88.8±3.4, 88.7±2.5, 84.3±2.3 ㎜Hg). 치료후에는 Epo로 치료한 그룹에서 하루 주기 혈압이 현저히 상승되었다. Epo 치료 vs. 대조군, Epo-bp 및 αEpo-bp 치료 그룹사이의 그룹 비교치는 아래와 같다: 136.2±2.3 vs.각각 116.2±1.7, 118.4±2.1 및 116.6±2.1 ㎜Hg. 각 p<0.0001. 그러나, Epo-bp나 αEpo-bp를 Epo와 함께 투여하는 경우. 혈압은 염수 대조군과 비슷한 정도로 유지되었다: Epo-bp+Ep 그룹에서 118.3±1.7 및 αEpo-bp+Epo 치료 그룹에서 121.0±2.0 ㎜Hg의 혈압치들은 Epo 치료 그룹(136.2±2.3)의 혈압치보다 현저히 낮은 것으로 나타났다, 각 p<0.0001.

표 1

다양한 치료에서 하루 주기 체중, 혈압, 적혈구 용적율 및 다른 기관 시스템에 대한 종합적인 효과

상기 표에서,

Rx: 치료; n = 쥐의 수(각 그룹당 30 마리);

: 평균 24-시간; αEpo-bp = 항-Epo-bp 항체; *p < 0.01; **p <0.001; ***p < 0.0001;

< 0.05; g = 그램; BW = 체중; BP = 혈압; Hct = 적혈구 용적율; SW = 비장 무게; W = 체중; R = 우측; L = 좌측.

Epo-치료는 염수, Epo-bp 또는 αEpo-bp 그룹에 비해서 전체적인 적혈구 용적율(61.6 vs 각각 42.7, 43.9 및 44.1%)을 현저하게 상승시켰으며, 각 6회 시험에서 모두 p<0.0001 이었다. Epo-bp나 αEpo-bp를 Epo와 함께 투여하게 되면 Epo로 유도되는 적혈구 용적율 상승에는 거의 아무런 영향을 주지 않았다(Epo에서 61.6% 적혈구 용적율 vs. Epo＋Epo-bp에서 58.0% 및 Epo＋αEpo-bp 치료에서 59.1%). 그러나, 중요하게, Epo-bp와 αEpo-bp는 둘 다 Epo로 유도되는 혈압상승을 거의 배제시켰다(Ep 치료 그룹에서 136.2 ㎜Hg vs. 염수 대조군에서 116.2, Epo＋Epo-bp에서 118.3 및 Epo＋αEpo-bp에서 121.0). 따라서, Epo-bp와 αEpo-bp는 Epo 치료시 상승하는 혈압으로부터 쥐를 보호하였다.

Epo-치료 그룹에서 각 쥐들은 비장 비대증 특성을 나타내었다(전체 비장 무게 1.58 vs. 염수 0.86, Epo-bp 0.89 및 αEpo-bp 0.85 g, 각 p<0.0001). Epo-bp나 αEpo-bp를 Epo와 함께 투여하는 경우 비장 비대증에 영향이 없었다. 비록 대동맥 및 신장들의 무게는 각 그룹에서 비슷하게 나타났을지라도, Epo로 치료한 그룹의 뇌와 심장의 무게들은 다른 모든 그룹에 비해 현저히 낮았다.

도 1은 모든 그룹에서의 하루 주기 혈압 비교를 막대그래프±표준에러(SEM)로 나타낸 것이다. Epo로 치료한 그룹은 다섯개의 다른 모두의 그룹에 비해 혈압을 현저히 상승시켰다. 각 p<0.0001. 도 2는 각 치료 그룹에서의 하루 주기 평균 혈 압(MESOR)(평균 약 24 시간), 진폭 및 정점위상(acrophase)(최고점에 미치는 시간)의 하루 주기 변동을 보인다. 모든 그룹의 진폭은 유의적으로 차이가 없었지만, Epo 치료로 인한 하루 주기 혈압(MESOR) 상승은 다른 모든 그룹에 비교하여 현저하였다(모두 p<0.0001), 치료후, 대조군, Epo-bp 또는 αEpo-bp로 치료한 그룹과 비교하여 Epo로 치료된 쥐들의 혈압의 최고점 시간이 낮시간으로 바뀌어졌다(19:40 vs. 각 04:08, 05:44, 05:16). Epo 치료로 인해 이 야간 동물에서 밤시간 최고점으로부터 낮시간 최고점으로의 분명한 교대 변화가 있었다. Epo-bp나 αEpo-bp를 Epo와 함께 투여하는 경우 혈압 정도는 대조군과 비슷했지만 최고점 시간의 교대 변화는 Epo만으로 치료한 그룹에서와 같은 낮시간에 그대로 머물렀다(각 14:48, 19:20).

표 2는 Epo, Epo-bp 및 αEpo-bp 치료후 6개의 소그룹에서 체중, 혈압, 적혈구 용적율 및 비장 무게의 하루 주기 변화를 요약한 것이다. 6회 시험 시간중에서 Epo로 치료된 쥐들과 다른 치료 그룹에 있어서 체중 차이는 통계적으로 유의성이 없었다. 대조군, Epo-bp 및 αEpo-bp 치료 그룹에 비해 Epo 치료 그룹의 현저히 상승된 혈압은 04 나 08 시간들을 제외한, 12, 16, 20 과 00 시간들에서 탐지되었다. 대조군 Epo-bp 및 αEpo-bp 치료 그룹에 비교하여 Epo 치료는 전체적인 적혈구 용적율과 각 6회 시험 시간에서 적혈구 용적율을 현저하게 상승시켰다. 모두, p<0.0001. 비장 무게는 체중이 각 비교된 시험 시간에서 낮았으나, 대조군, Epo-bp및 αEpo-bp의 것들보다 Epo로 치료된 그룹 쥐의 비장 무게가 모든 시험 시간점들에서 상당히 높았다.

표 2

다양한 치료에서 체중, 혈압, 적혈구 용적율 및 비장 무게의 하루 주기 변화

상기 표에서,

Rx: 치료; n = 각 소그룹당 5 마리; *p < 0.01; **p <0.001; ***p < 0.0001;

< 0.05; BP = 혈압; BW = 체중; Hct = 적혈구 용적율; SW = 비장 무게.

도 3은 하루 주기 적혈구 용적율을 비교하여 예시한다. Epo-치료로 적혈구 용적율 상승뿐 아니라 밤(20:15)으로부터 이른 아침시간(11:16)으로 최고점 시간 교대 변화가 있었다. 이 그래프에서, a(대조군), c(Epo-bp) 및 d(αEpo-bp) 그룹은 밤주기 평면에 위치하였으나 b(Epo), e(Epo+Epo-bp) 및 f(Epo+αEpo-bp)는 낮주기 평면에 위치하였다. 다시 강조하자면, 이 밤 동물들은 Epo 치료시에 밤으로부터 낮 최고점 시간의 명백한 교대 변화를 가져왔다. 적혈구 용적율(%) 24시간 평균치(MESOR) 비교에서 Epo(61.6) vs 대조군(42.7), Epo-bp(43.9) 및 αEpo-bp(44.1) 치료는 각 시점 비교에서 모두 통계적으로 유의적인 것으로 나타났다(각 p<0.0001). 적혈구 용적율의 하루 주기 진폭의 최고점에서 최고점까지의 진폭차는 치료 그룹 사이의 차와 유의적으로 상이하지 않았다. 그러나, 진폭은 Epo를 투여받지 않은 그룹에서 보다 Epo-치료 그룹에서 크게 나타났다(Epo 2.40, Epo+Epo-bp 4.41 및 Epo+αEpo-bp 3.59 vs 대조군 1.65, Epo-bp 1.13 및 αEpo-bp 1.73)

도 4에서, 염수로 처리된 쥐(도 4, 패널 d)와 비교했을때 Epo로 치료한 각각의 쥐에서는 비장 비대증(a, b 및 c)이 특색으로 나타났다. 비장 무게는 대조군, Epo-bp와 αEpo-bp 치료 그룹의 것들보다 Epo 치료한 쥐에서 현저히 높았다(표 1 및 2).

이 결과들은 Epo 치료 시간, Epo-bp 및/또는 αEpo-bp 치료를 동시에 하는 것과 동시에 하지 않는 것 등이 중요할 수도 있다고 제시한다. Epo-bp와 αEpo-bp는 Epo로 인해 상승되는 적혈구 용적율 수준을 줄이지 않으면서 Epo로 인한 혈압상승으로부터 보호한다.

높은 혈압과 다른 기관 손상 등과 같은 전신적, 국소적 유해 효과들을 예방하기 위해 임상에서 사용하는 Epo 양은 재평가되어야 한다.

Epo-bp와 그에 대한 항체들을 사용하여 혈액 선조세포의 결합 부위가 확인되었다. 혈액 골수 선조 세포의 수용체 부위들을 시각화하기 위해 플루오레세인 표지된 αEpo-bp가 사용되었다. 플루오레세인이 표지된 예비면역 Fab로나, 음성 대조 세포들로는 수용체가 검출되지 않았다. 그러나, 표지된 αEpo-bp는 거핵세포, 미성숙 적혈구, 정상적혈모구 및 미성숙 백혈구 상에서 결합 부위를 검출해 냈다(도시되지 않음).

Epo, Epo-bp 및 Epo와 Epo-bp에 대항하는 항체들의 수준을 치료하지 않은 인간의 혈청과 혈장들에서 효소면역 분석방법(EIA)으로 측정하고, 그 결과들을 도 5에 나타내었다. 각 흡광도(OD) 측정치는 8-14개인 표본들의 복제물에서 평균치±SEM으로 나타내어 진다. 도 5에 나타낸 OD 치들은 각 견본의 OD로부터 블랭크의 OD 치를 감하여 계산되어 졌다. 혈청과 혈장의 Epo 및 Epo-bp OD 치들은 각기 유사하였다: 혈청 Epo 0.308±0.026, 혈청 Epo-bp 0.289±0.022, 혈장 Epo 0.289±0.028 및 혈장 Epo-bp 0.299±0.015. 혈장의 항-Epo-bp 항체 수준은 다른 세 항체 범주보다 상당히 낮았다: 혈청 αEpo 0.058±0.008, 혈청 αEpo-bp 0.052±0.006, 혈장 αEpo 0.054±0.013 및 혈장 αEpo-bp 0.031±0.004. 혈청 αEpo와 αEpo-bp 수준은 유사했으나 혈장 αEpo-bp의 농도는 혈청 αEpo, 혈청 αEpo-bp 또는 혈장 αEpo의 농도보다 현저히 낮았다(p<0.025). Epo와 Epo-bp 치들은 알려진 Epo 농도를 동일 플레이트에 mU/ml로 준비된 대조군을 사용하여 환산시켰다. mU/ml로 환산된 값들은 혈청 Epo 25.4±2.17 mU, 혈장 Epo 24.2±2.35 mU, 혈청 Epo-bp 24.2±1.84 mU, 혈장 Epo-bp 25.0±1.26 mU이었다. 이 분석 방법은 방사성 면역분석(Radioimmunoassay)(17.7±6.3 mU/ml의 Epo) 보다 간단하고 더 민감하며 더욱 작은 SEM을 제공한다. 또한, 이 준비에 사용된 재료들은 관례적인 방법에서 사용되는 방사성 또는 다른 독성 화학물질보다 환경 친화적이다.

<검토>

기대했던 대로, Epo로 치료된 쥐에서 적혈구 용적율은 전체 및 각각의 6회 검사 시점에서 현저하게 상승되었다. 또한, 본 발명자들은 Epo 치료 그룹의 혈압 상승과 Epo로 치료한 각쥐의 비장 비대증을 관찰하였다. Epo 치료는 혈압을 심각하게 올릴 뿐 아니라 혈압의 피크 시간이 밤에서 낮 시간으로 교대하는 변화를 가져왔다.

현저하게, Epo-bp와 αEpo-bp는 적혈구 용적율%를 줄이지 않으면서, Epo로 유도되는 혈압 상승으로부터 쥐를 거의 완전히 보호하였다. 이러한 보호 효과의 메카니즘은 알려지지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 에포에틴(현재 임상 시험에 사용중인 재조합 Epo)이 반복 주입되는 경우 살아 있는 동물 체내에서 독성 물질을 일부 유도할 수 있을 거라고 추측하고 있다. Epo-bp는 Epo 또는 그의 분해 산물과 결합하고, αEpo-bp도 또한 Epo 치료에 의해 유도되는 특정 산물과 결합하기 때문에, Epo-bp 및/또는 αEpo-bp는 독성 물질과 결합하여 이를 제거할 수 있을 것으로 보인다.

도 2 및 3은 Epo 뿐만 아니라, Epo+ Epo-bp 또는 Epo + αEpo-bp 와의 병용 치료에서도 약 24 시간내에 혈압의 최고점 시간 교체를 가져온다. 이것은 Epo, Epo+ Epo-bp 또는 Epo+αEpo-bp 치료를 위한 치료 시간이 치료 결과에 현저하게 영향을 줄 것임을 제시한다. 염 감수성으로 인한 Dahl 쥐들의 고혈압(22, 23)에서 보여진 바와 같이, 개인의 유전적 감수성이 내분비 치료에서도 역시 반드시 숙고되어야 한다.

인간 Epo-수용체 재조합 벡터 JYL 26의 클로닝과, 순수한 인간 Epo-bp 및 그의 항체의 정제는 리간드 결합 부위의 시각화 및 Epo 수용체가 위치한 세포 종류를 동정하는데 중요한 벤치마크이다(Lee, 미국 특허 제 5,483,726호). 리간드-결합 부위를 확인하기 위해서 본 발명자들은 여러 가지의 민감하고 단순한 방법들을 개발했다. 이것들은 우리가 Epo 수용체의 구조를 이해하고 리간드 결합에 관여하는 요소들을 검사하며, 선조 세포들이 분화와 증식을 조절하는 데에 관계되는 다른 요소들을 확인할 수 있도록 허용한다. 이 연구에서 우리는 정제된 인간 Epo-bp에 Epo가 직접 결합함을 보고하였다. 우리가 알기에는 우리의 Epo-bp 및 그의 항체들은 nM 농도로 Epo 및 그의 항체에 특이적으로 결합하는 특성을 가지는 일차 정제된 순수한 인간 Epo 수용체 유전자 산물로 알고 있다.

Epo-bp와 그의 항체들을 사용하여 혈액 선조 세포들의 결합부위들이 나타내어 졌다. 이 자료들은 인간의 모든 혈액 선조 세포들이 Epo 수용체를 가지며 Epo에 결합된다는 현재의 제안을 입증한다. Epo의 생체생리적 메카니즘이나 제 2 메신저 시스템이 Epo-Epo 수용체 상호 작용에 응답하여 관여하는 것에 대해 우리는 아직 모르고 있다. 이 보고에 나열된 방법들은 Epo나 Epo 수용체에 관계되는 결함들을 찾아내고 선조 세포들의 진행과정 및 리간드 결합에서의 Epo 수용체(EpoR)의 역할을 밝혀내는데 도움이 될 것이다. 이 결과들은 혈액 선조 세포에서 Epo-EpoR 상호작용의 구조적 및 기능적 관계를 이해하는데 도움이 될 것이다. 민감한 검출은 혈액세포 생성시에 Epo-EpoR 상호작용의 역할과 질병 혈액세포 생성을 이해하는데 도움이 될 것이며, 악성 혈액질환과 고혈압과 같은 전신적 심장 혈관계 질환들의 치료 방법 개발을 위해 도움이 될 것이다.

<결론>

대조군, Epo-bp 및 항-Epo-bp 항체(αEpo-bp)로 치료한 그룹과 비교해서, Epo 치료는 전체적 및 여섯 시험 시점의 각 검사 시간에서 적혈구 용적율을 현저하게 상승시켰다(모두 p <0.0001). Epo로 치료한 쥐에서 04 또는 08 시간점을 제외한 12, 16, 20 및 00 시간점에서 혈압의 상승이 관찰되었다. Epo-bp나 αEpo-bp를 Epo 치료와 함께 이용하는 경우, 혈압은 대조군의 것과 비슷한 정도에서 지속되었으나, 적혈구 용적율은 Epo 치료 vs Epo+Epo-bp 또는 Epo+αEpo-bp로 치료한 그룹 사이에서 유의성이 없는 것으로 나타났다(61.6 vs. 각각 58.0 또는 59.1%). 따라서, Epo-bp와 αEpo-bp는 Epo로 유도된 혈압상승을 줄이거나 예방한다.

Epo 치료에 의해 체중이 감소하였다. Epo로 치료한 각 쥐에서 비장 비대증의 특징이 나타났다. Epo로 치료한 그룹에서 뇌와 심장의 무게들은 다른 치료 그룹의 것들에 비해서 심각하게 낮은 것으로 나타냈다. 이 자료들은 기관의 추가 손상을 예방하기 위해 Epo 양이 재평가되어야 함을 제시한다. 하루 주기 결과들은 Epo 치료를 단독으로 또는 Epo-bp 및/또는 αEpo-bp와 병용 치료시에 Epo 치료 시간이 중 요할 수 있음을 지시한다.

치료하지 않은 인간 지원자들의 혈청 및 혈장에서의 Epo, Epo-bp 및 단백질 항체 수치가 조사되었다. 혈청과 혈장의 Epo와 Epo-bp 수치들은 비슷하였다: Epo 각 25.4±2.17; 24.2±2.35; 및 Epo-bp 각 24.2±1.84; 25.0±1.26 mU/ml. 혈청의 αEpo와 αEpo-bp 수치들은 비슷하였으나 혈장의 αEpo-bp 수치는 혈청이나 혈장의 αEpo 또는 혈청의 αEpo-bp의 것들에 비해 상당히 낮은 것으로 나타났다.

참조문헌

인용된 모든 특허, 특허 서류 및 참조문헌은 본 원에 참고로 포함되었다.

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Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser 115 120 125 Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu 130 135 140 Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly 145 150 155 160 His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser 165 170 175 His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Pro Gly Ser 180 185 190 Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser 195 200 205 Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met 210 215 220 Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val 225 230 235 240 Ser Leu Leu Glu Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser 245 250 255 Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu 260 265 270 Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser 275 280 285 Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe 290 295 300 Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys 305 310 315 320 Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu 325 330 335 Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu 340 345 350 Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr 355 360 365 Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp 370 375 380 Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro 405 410 415 Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser 420 425 430 Ser Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr 435 440 445 Pro Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile 450 455 460 Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu 465 470 475 480 Ser Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala 485 490 495 Ala Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser 500 505 <210> 2 <211> 226 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala 1 5 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<210> 3 <211> 193 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank NP 000790 <309> 2003-12-23 <313> (1)..(193) <400> 3 Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu 20 25 30 Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu 35 40 45 Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg 65 70 75 80 Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu 85 90 95 Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser 100 105 110 Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly 115 120 125 Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gln Lys Glu 130 135 140 Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile 145 150 155 160 Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 165 170 175 Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr 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agtgtgtgct gagcaacctg cggggccgga cgcgctacac cttcgccgtc 660 cgcgcgcgta tggctgagcc gagcttcggc ggcttctgga gcgcctggtc ggagcctgtg 720 tcgctgctgg agcctagcga cctggacccc ctcatcctga cgctctccct catcctcgtg 780 gtcatcctgg tgctgctgac cgtgctcgcg ctgctctccc accgccgggc tctgaagcag 840 aagatctggc ctggcatccc gagcccagag agcgagtttg aaggcctctt caccacccac 900 aagggtaact tccagctgtg gctgtaccag aatgatggct gcctgtggtg gagcccctgc 960 acccccttca cggaggaccc acctgcttcc ctggaagtcc tctcagagcg ctgctggggg 1020 acgatgcagg cagtggagcc ggggacagat gatgagggcc ccctgctgga gccagtgggc 1080 agtgagcatg cccaggatac ctatctggtg ctggacaaat ggttgctgcc ccggaacccg 1140 cccagtgagg acctcccagg gcctggtggc agtgtggaca tagtggccat ggatgaaggc 1200 tcagaagcat cctcctgctc atctgctttg gcctcgaagc ccagcccaga gggagcctct 1260 gctgccagct ttgagtacac tatcctggac cccagctccc agctcttgcg tccatggaca 1320 ctgtgccctg agctgccccc taccccaccc cacctaaagt acctgtacct tgtggtatct 1380 gactctggca tctcaactga ctacagctca ggggactccc agggagccca agggggctta 1440 tccgatgggc cctactccaa cccttatgag aacagcctta tcccagccgc tgagcctctg 1500 ccccccagct atgtggcttg ctcttag 1527 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> E. coli <400> 5 ttggatccgc gcccccgcct aac 23 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> E. coli <400> 6 tgaattcggg gtccaggtcg ct 22 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> E. coli <400> 7 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 8 <211> 228 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Epo-bp SEQ ID NO:2 with an additional Gly-Ser at the amino terminus <400> 8 Gly Ser Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp Pro Lys Phe Glu Ser Lys 1 5 10 15 Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu Glu Leu Leu Cys Phe Thr 20 25 30 Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp Glu Glu Ala Ala Ser Ala 35 40 45 Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr Gln Leu Glu Asp Glu 50 55 60 Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala Pro Thr Ala Arg Gly Arg 65 70 75 80 Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp Thr Ser Ser Phe Val 85 90 95 Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser Gly Ala Pro Arg Tyr His 100 105 110 Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu Asp Ala Pro Val Gly 115 120 125 Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly His Val Val Leu Arg Trp 130 135 140 Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser His Ile Arg Tyr Glu Val 145 150 155 160 Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Pro Gly Ser Val Gln Arg Val Glu Ile 165 170 175 Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn Leu Arg Gly Arg Thr 180 185 190 Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala Glu Pro Ser Phe Gly 195 200 205 Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val Ser Leu Leu Glu Pro Ser 210 215 220 Asp Leu Asp Pro 225 <210> 9 <211> 508 <212> PRT <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank/NM_000121 <309> 2004-10-26 <313> (1)..(508) <400> 9 Met Asp His Leu Gly Ala Ser Leu Trp Pro Gln Val Gly Ser Leu Cys 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Pro Pro Asn Leu Pro Asp 20 25 30 Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ala Arg Gly Pro Glu 35 40 45 Glu Leu Leu Cys Phe Thr Glu Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp 50 55 60 Glu Glu Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Pro Gly Asn Tyr Ser Phe Ser 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Glu Asp Glu Pro Trp Lys Leu Cys Arg Leu His Gln Ala 85 90 95 Pro Thr Ala Arg Gly Ala Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala 100 105 110 Asp Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Arg Val Thr Ala Ala Ser 115 120 125 Gly Ala Pro Arg Tyr His Arg Val Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu 130 135 140 Leu Asp Ala Pro Val Gly Leu Val Ala Arg Leu Ala Asp Glu Ser Gly 145 150 155 160 His Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Glu Thr Pro Met Thr Ser 165 170 175 His Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Gly Ala Gly Ser 180 185 190 Val Gln Arg Val Glu Ile Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser 195 200 205 Asn Leu Arg Gly Arg Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met 210 215 220 Ala Glu Pro Ser Phe Gly Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Val 225 230 235 240 Ser Leu Leu Thr Pro Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ile Leu Thr Leu Ser 245 250 255 Leu Ile Leu Val Val Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu 260 265 270 Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Gln Lys Ile Trp Pro Gly Ile Pro Ser 275 280 285 Pro Glu Ser Glu Phe Glu Gly Leu Phe Thr Thr His Lys Gly Asn Phe 290 295 300 Gln Leu Trp Leu Tyr Gln Asn Asp Gly Cys Leu Trp Trp Ser Pro Cys 305 310 315 320 Thr Pro Phe Thr Glu Asp Pro Pro Ala Ser Leu Glu Val Leu Ser Glu 325 330 335 Arg Cys Trp Gly Thr Met Gln Ala Val Glu Pro Gly Thr Asp Asp Glu 340 345 350 Gly Pro Leu Leu Glu Pro Val Gly Ser Glu His Ala Gln Asp Thr Tyr 355 360 365 Leu Val Leu Asp Lys Trp Leu Leu Pro Arg Asn Pro Pro Ser Glu Asp 370 375 380 Leu Pro Gly Pro Gly Gly Ser Val Asp Ile Val Ala Met Asp Glu Gly 385 390 395 400 Ser Glu Ala Ser Ser Cys Ser Ser Ala Leu Ala Ser Lys Pro Ser Pro 405 410 415 Glu Gly Ala Ser Ala Ala Ser Phe Glu Tyr Thr Ile Leu Asp Pro Ser 420 425 430 Ser Gln Leu Leu Arg Pro Trp Thr Leu Cys Pro Glu Leu Pro Pro Thr 435 440 445 Pro Pro His Leu Lys Tyr Leu Tyr Leu Val Val Ser Asp Ser Gly Ile 450 455 460 Ser Thr Asp Tyr Ser Ser Gly Asp Ser Gln Gly Ala Gln Gly Gly Leu 465 470 475 480 Ser Asp Gly Pro Tyr Ser Asn Pro Tyr Glu Asn Ser Leu Ile Pro Ala 485 490 495 Ala Glu Pro Leu Pro Pro Ser Tyr Val Ala Cys Ser 500 505 <210> 10 <211> 1849 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> GenBank/NM_000121 <309> 2004-10-26 <313> (1)..(1849) <400> 10 acttagaggc gcctggtcgg gaagggcctg gtcagctgcg tccggcggag gcagctgctg 60 acccagctgt ggactgtgcc gggggcgggg gacggagggg caggagccct gggctccccg 120 tggcgggggc tgtatcatgg accacctcgg ggcgtccctc tggccccagg tcggctccct 180 ttgtctcctg ctcgctgggg ccgcctgggc gcccccgcct aacctcccgg accccaagtt 240 cgagagcaaa gcggccttgc tggcggcccg ggggcccgaa gagcttctgt gcttcaccga 300 gcggttggag gacttggtgt gtttctggga ggaagcggcg agcgctgggg tgggcccggg 360 caactacagc ttctcctacc agctcgagga tgagccatgg aagctgtgtc gcctgcacca 420 ggctcccacg gctcgtggtg cggtgcgctt ctggtgttcg ctgcctacag ccgacacgtc 480 gagcttcgtg cccctagagt tgcgcgtcac agcagcctcc ggcgctccgc gatatcaccg 540 tgtcatccac atcaatgaag tagtgctcct agacgccccc gtggggctgg tggcgcggtt 600 ggctgacgag agcggccacg tagtgttgcg ctggctcccg ccgcctgaga cacccatgac 660 gtctcacatc cgctacgagg tggacgtctc ggccggcaac ggcgcaggga gcgtacagag 720 ggtggagatc ctggagggcc gcaccgagtg tgtgctgagc aacctgcggg gccggacgcg 780 ctacaccttc gccgtccgcg cgcgtatggc tgagccgagc ttcggcggct tctggagcgc 840 ctggtcggag cctgtgtcgc tgctgacgcc tagcgacctg gaccccctca tcctgacgct 900 ctccctcatc ctcgtggtca tcctggtgct gctgaccgtg ctcgcgctgc tctcccaccg 960 ccgggctctg aagcagaaga tctggcctgg catcccgagc ccagagagcg agtttgaagg 1020 cctcttcacc acccacaagg gtaacttcca gctgtggctg taccagaatg atggctgcct 1080 gtggtggagc ccctgcaccc ccttcacgga ggacccacct gcttccctgg aagtcctctc 1140 agagcgctgc tgggggacga tgcaggcagt ggagccgggg acagatgatg agggccccct 1200 gctggagcca gtgggcagtg agcatgccca ggatacctat ctggtgctgg acaaatggtt 1260 gctgccccgg aacccgccca gtgaggacct cccagggcct ggtggcagtg tggacatagt 1320 ggccatggat gaaggctcag aagcatcctc ctgctcatct gctttggcct cgaagcccag 1380 cccagaggga gcctctgctg ccagctttga gtacactatc ctggacccca gctcccagct 1440 cttgcgtcca tggacactgt gccctgagct gccccctacc ccaccccacc taaagtacct 1500 gtaccttgtg gtatctgact ctggcatctc aactgactac agctcagggg actcccaggg 1560 agcccaaggg ggcttatccg atggccccta ctccaaccct tatgagaaca gccttatccc 1620 agccgctgag cctctgcccc ccagctatgt ggcttgctct taggacacca ggctgcagat 1680 gatcagggat ccaatatgac tcagagaacc agtgcagact caagacttat ggaacaggga 1740 tggcgaggcc tctctcagga gcaggggcat tgctgatttt gtctgcccaa tccatcctgc 1800 tcaggaaacc acaaccttgc agtattttta aatatgtata gtttttttg 1849

Claims (31)

1. (a) 에리스로포이에틴(Epo); 및

   (b) 서열번호 2의 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), 용해 Epo-결합 단백질에 대한 항체 및 이들의 복합체로부터 선택된 약제를 포함하는, 빈혈 치료용 약제학적 조성물.
2. 제 1 항에 있어서, 약제가 서열번호 2의 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp)인 약제학적 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1 항에 있어서, 약제가 용해 Epo-결합 단백질에 대한 항체인 약제학적 조성물.
9. 제 8 항에 있어서, 용해 Epo-결합 단백질에 대한 항체가 서열번호 2에 결합하는 약제학적 조성물.
10. 삭제
11. 삭제
12. 제 1 항에 있어서, 용해 Epo-결합 단백질에 대한 항체가 용해 Epo-결합 단백질에 대한 Fab 항체인 약제학적 조성물.
13. 제 1 항에 있어서, Epo 및 약제를 혼합형태로 포함하는 약제학적 조성물.
14. 제 1 항에 있어서, Epo 및 약제를 분리된 형태로 포함하는 약제학적 조성물.
15. 제 1 항에 있어서, 약제의 투여량이 Epo 투여량의 75-125% 몰량인 약제학적 조성물.
16. 제 1 항에 있어서, 약제의 투여량이 Epo 투여량과 동몰량인 약제학적 조성물.
17. 제 1 항에 있어서, 약제가 포유동물에서 에리스로포이에틴에 의해 유도된 혈압상승을 감소시키는 약제학적 조성물.
18. 서열번호 2의 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), 용해 Epo-결합 단백질에 대한 항체 및 이들의 복합체로부터 선택된 약제의 유효량을 포함하는, 에리스로포이에틴(Epo)을 투여받은 포유동물의 고혈압 감소용 약제학적 조성물.
19. (a) 에리스로포이에틴(Epo); 및

    (b) 서열번호 2의 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp), 용해 Epo-결합 단백질에 대한 항체 및 이들의 복합체로부터 선택된 약제를 포함하는, 성분 (b)를 함유하지 않는 조성물에 비해 고혈압을 덜 유발하는 빈혈 치료용 약제학적 조성물.
20. 제 19 항에 있어서, 용해 Epo-결합 단백질에 대한 항체가 서열번호 2에 대한 항체인 약제학적 조성물.
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 제 1 항에 있어서, 용해 Epo-결합 단백질(Epo-bp)이 하기 단계를 포함하는 과정의 산물인 약제학적 조성물:

    (a) 아미노 말단 및 카복실 말단을 함유하며 카복실 말단에는 서열번호 7을 가지는 제 1 폴리펩타이드 세그먼트; 및

    (b) 서열번호 2로 구성되며, 제 1 폴리펩타이드 세그먼트의 카복실 말단에 공유적으로 결합된 제 2 폴리펩타이드 세그먼트로 구성된 융합 단백질을 발현하는 단계; 및

    트롬빈으로 융합 단백질을 절단하는 단계.
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제

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