KR100883516B1

KR100883516B1 - 항진균 활성을 가지는 플루시딘 펩타이드 유도체

Info

Publication number: KR100883516B1
Application number: KR1020070092628A
Authority: KR
Inventors: 이동건; 성우상; 이준영
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-09-12
Filing date: 2007-09-12
Publication date: 2009-02-11

Abstract

본 발명은 도다리 (Pleuronectes americanus)로부터 분리된 항균 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)의 지방족 아미노산 부위를 양전하를 띤 아미노산으로 치환하여 양전하를 띤 아미노산 영역이 증가된 펩타이드 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1로 기재되는 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide) 의 지방족 아미노산을 양전하를 띠고 있는 아미노산으로 치환시켜 제조한 서열번호 2로 개재되는 합성 펩타이드 및 그를 포함하는 항진균용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드는 플루시딘(Pleurocidin)의 탁월한 항진균 활성을 가짐과 동시에 양전하를 띤 아미노산 영역이 증가됨으로 친수성이 증가하여 세포 독성을 가지지 않으므로 인체에 안전한 항진균제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항진균 활성을 가지는 플루시딘 펩타이드 유도체{A Pleurocidin peptide derivatives having an antifungal activity}

본 발명은 도다리(Pleuronectes americanus)로부터 분리된 항균 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)의 지방족 아미노산 부위를 양전하를 띠고 있는 다른 아미노산으로 치환하여 양전하를 띤 아미노산 영역이 증가된 펩타이드 및 그를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 서열번호 1로 기재되는 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)의 지방족 아미노산 부위를 양전하를 띤 다른 아미노산으로 치환시켜 제조한 서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드 및 그를 포함하는 항진균용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

병원성 미생물의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 인류는 이러한 질병을 이겨내고자 항생제를 개발하였다. 그러나, 불행하게도 인류의 항생제 남용으로 인하여 병원성 미생물이 항생제에 대하여 내성을 갖게 되었다. 이러한 미생물의 내성은 저항성과 구별되는 것으로서 미생물이 각종 약제에 대하여 저항성이 강한 균주로 변하는 것을 말한다.

내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 상기 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해 (autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

병원성 미생물이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 미생물을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다 (Handwerger and Tomasz, Rev . Infec . Dis., 7, 368-385, 1985).

아울러 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행 조건이라고 간주 되며, 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제적으로 모든 저항성을 보이는 병원성 미생물들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로 (Liu and Tomasz, J. Infect. Dis., 152, 365-372, 1985), 이러한 항생제 저항성을 가지는 병원성 미생물을 죽일 수 있는 신규의 항생제의 개발이 시작되었다.

종래 기술은 곤충이 생성하는 항균 펩타이드를 항생제로 사용하고자 하였으나 항생제의 항균활성과 항진균활성이 떨어진다는 문제점과 항균활성을 나타내는 미생물의 범위가 한정되어 있다는 문제점이 있었다. 이러한 문제점을 극복하고자 플루시딘(Pleurocidin)을 차세대 항생제 성분으로 지목하였는데, 플루시딘(Pleurocidin)은 도다리(Pleuronectes americanus)로부터 분리된 항균펩타이드로써 그람 양성(Gram-positive) 및 그람 음성(Gram-negative) 세균에 대하여 넓은 범위에서 항균 활성이 있었기 때문이다. 또한, 플루시딘(Pleurocidin)은 병원성 진균에 대해서도 항진균 활성이 있으므로 항생제의 일 구성성분으로서 가치가 있었다.

그러나, 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)는 인체에 투입되는 경우 인체 내의 적혈구를 파괴시키는 용혈활성을 가지고 있어서 세포독성이 강하다는 문제점이 있었다. 상기와 같은 문제점으로 플루시딘(Pleurocidin)은 강력하고 넓은 범위의 항균활성으로 인해 항균제로서의 후보 펩타이드로 인식되었지만 인체에 유해하여 항생제로 활용도가 떨어진다는 문제점이 있었다.

본 발명은 뛰어난 항생효과는 있으나 인체에 독성이 있어 항생제 또는 항진균제로 사용할 수 없었던 플루시딘을 플루시딘(Pleurocidin)의 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 치환하여 인체에 무해하고, 강력한 항균효과를 가지는 항진균 펩타이드 및 이의 용도를 제공하는데 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는 서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 합성 펩타이드는 Fmoc 아미노기 보호 용기를 이용한 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법 등을 사용하여 제조될 수 있다 (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149).

바람직하게는, 본 발명의 합성 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 플루시딘(Pleurocidin) 펩타이드의 지방족 아미노산을 양전하를 띤 다른 아미노산으로 치환하여 친수성 영역이 증가된 모든 합성 펩타이드이다.

바람직하게는, 본 발명의 합성 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 플루시딘(Pleurocidin) 펩타이드의 지방족 아미노산 부위에 존재하는 1, 3, 12, 19, 21번째 아미노산을 선택적으로 치환하고, 양전하를 띤 아미노산으로 R(알지닌,Arginine), K(라이신,Lysine), 및 H(히스티딘,Histidine)로 구성된 그룹에서 독립적으로 선택되는 것으로 한다. 또한, 본 발명에서의 합성 펩타이드로 가장 바람직한 것은 치환되는 지방족 아미노산이 알지닌(Arginine)으로 치환하여 제조된 서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드로 한다.(도1 참조).

바람직하게는, 본 발명의 서열번호 2로 기재하는 합성 펩타이드는 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하여, 진균에 대한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 바람직한 실시예 2를 통해 서열번호 2의 항진균 펩타이드의 병원성 진균에 대한 항진균 활성을 조사한 결과, 강력한 항진균 펩타이드인 멜리틴 (Melittin)보다는 약하지만 주형 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)과 비슷한 강력한 항진균 효과를 나타내었다. 구체적으로, 본 발명에 따른 항진균 펩타이드는 병원성 진균의 최소 생육 저지 농도 (MIC)가 2.5～5 ㎍으로 항진균 활성을 가진다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 캔디다속(Candida sp.), 트리코스포론속(Trichosporon sp.), 및 사카로마이세스속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 그룹에서 선택되는 진균에 대하여 항진균 활성을 가지는 약제학적 조성물이다.

더 바람직하게는, 상기 본 발명에 따른 합성 펩타이드는 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지예 (Saccharomyces cerevisiae)등에 대하여 우수한 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.(표 2 참조).

이상에서 상술한 바와 같이 상기와 같은 본 발명에 따른 항진균용 약제학적 조성물에서 사용되어진 합성 펩타이드는 플루시딘(Pleurocidin)의 서열번호 1로 기재되는 아미노산을 서열번호 2로 기재되는 아미노산으로 치환하여 친수성 영역을 증가시킴으로 세포 독성을 감소시켜 인체에 무해하여 항생제로서 사용하기에 안전하다.

또한, 상기 플루시딘(Pleurocidin)의 지방족 아미노산 부위를 양전하를 띠고 있는 아미노산으로 치환하였기 때문에 상기 플루시딘(Pleurocidin)은 전체적으로 양전하가 증가한다. 이에 반하여 진균은 세포막에 음전하를 띠고 있으므로 상기 양전하를 띠고 있는 아미노산으로 치환된 플루시딘(Pleurocidin)은 진균의 세포막에 접근성이 높아진다. 이로 인하여 상기 아미노산으로 치환된 플루시딘(Pleurocidin)은 도다리 (Pleuronectes americanus)로부터 유래한 플루시딘(Pleurocidin) 본래의 강력한 항진균 활성 효과를 유지하고 인체에 무해하므로 항진균 물질로서 약학적 조성물로 사용하기에 효과적이다.

그러므로, 본 발명은 상기와 같은 효과로 인하여 병원성 진균에 대한 질병을 예방할 수 있으며, 항생제의 과잉투여를 막아 치료기간을 짧게 하므로 경제성을 상승시키는 효과와 인간의 수명을 연장시키는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 플루시딘(Pleurocidin) 유래의 합성 펩타이드의 모식도이고,

도 2은 합성 펩타이드가 인간을 포함한 고등 생물의 세포막에 어떠한 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 형광물질을 포함한 고등 생물의 세포막의 지질 조성으로 제조된 미세한 피막 입자에 합성 펩타이드를 처리하여 합성 펩타이드의 세포막의 파괴능을 확인한 그래프이다.

●: 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 플루시딘(Pleurocidin) 펩타이드

○: 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 합성 펩타이드

▼: 멜리틴

도 3은 합성 펩타이드가 진균의 세포막에 어떠한 영향을 주는지를 확인하기 위하여, 형광물질을 포함한 진균의 세포막의 지질 조성으로 제조된 미세한 피막 입자에 합성 펩타이드를 처리하여 합성 펩타이드의 세포막의 파괴능을 확인한 그래프이다.

○: 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 합성 펩타이드

▼: 멜리틴

본 발명에서의 서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드는 서열번호 1로 기재되는 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 것이다. 아미노산의 종류는 20개가 있으며 그 구조에 따라 비극성 지방족 아미노산, 극성이면서 전하를 띠지 않은 아미노산, 방향족 아미노산, 양전하를 띠고 있는 아미노산, 음전하를 띠고 있는 아미노산으로 구분된다. 지방족 아미노산은 소수성으로서 물에 섞이지 않으며, 양전하를 띠고 있는 아미노산은 친수성으로서 물에 섞이는 성질을 가진다. 지방족 아미노산으로는 글리신(Glycine), 알라닌(Alanine), 발린(Valine), 루신(Leucine), 메티오닌(Methionine), 이소루신(Isoleucine)이 있으며, 양전하를 띠고 있는 아미노산으로는 라이신(Lysine), 알지닌(Arginine),히스티딘(Histidine)이 있다.

본 발명에서는 서열번호 1로 기재되는 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)의 아미노산 중 지방족 아미노산으로서 소수성을 가지는 아미노산을 양전하를 띠고 친수성을 가지는 아미노산과 선택적으로 치환한 것이다. 또한, 서열번호 1로 기재되어지는 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)의 1, 3, 12, 19, 21의 위치에 있는 지방족 아미노산을 양전하를 띠고 있는 아미노산 중 알지닌(Arginine)으로 치환하여 서열번호 2로 기재된 합성 펩타이드를 제조하는 것이다. 그러나, 본 발명에서 합성 펩타이드는 서열번호 2로 기재된 합성 펩타이드로 한정하는 것이 아니라 서열번호 1로 기재된 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)에서 상기 위치에 있는 지방족 아미노산을 적어도 하나 이상 양전하를 띠고 있는 아미노산으로 친환하는 것이다. 또한, 치환하는 아미노산을 알지닌(Arginine)으로 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 합성 펩타이드를 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하여 진균에 대한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물로서 사용될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제등이 있다. 또한, 이외에도 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁용제, 유제, 동결건조 제제, 좌제를 포함할 수 있으며, 비수용성 용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol),폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위탭솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 합성 펩타이드의 약제학적 조성물은 합성 펩타이드를 포함하여 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체와 혼합하여 사용할 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose) 또는 덱스트린(dextrine)과 같은 카보하이드레이트(carbohydrate), 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온(glutathione)과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilisers)와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 합성 펩타이드는 캔디다속, 트리코스포론속, 및 사카로마이세스속에 속하는 진균에 대하여 항진균 활성을 가진다. 캔디다속에는 Candida albicans , Candida glabrata , Candida krusei , Candida parapsilosis , Candida lusitaniae , Candida tropicalis , Candida guillier mondii등 이외에도 많은 진균이 있다. 그리고, 트리코스포론속에는 냉장 육류 등에 분포하는 진균으로서, Trichosporon pullulans, Trichosporon melibiosaceum , Trichosporon cutaneum , Trichosporon barssicae등 이외에도 많은 진균이 있다. 또한, 사카로마이세스속에는 Saccharomyces cerevisiae , Saccharomyces formosensis , Saccharomyces ellipsoideus , Saccharomyces sake , Saccharomyces manchuricus , Saccharomyces carlsbergensis , Saccharomyces coreanus,Saccharomyces rouxii , Saccharomyces mellis, Saccharomyces diasticus , Saccharomyces pastorianus등 이외에도 많은 진균이 있다. 본 발명에서 서열번호 2로 기재되는 합성 펩타이드는 특히 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지예 (Saccharomyces cerevisiae)의 병원성 진균에 대하여 항진균 활성을 갖는데, 이에 한정하지는 않는다. 캔디다 알비칸스(Candida albicans)은 칸디다증의 원인이 되며, 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii)는 복막염, 폐렴, 피부 진균증 등의 원인이 되며, 사카로마이세스 세레비지예 (Saccharomyces cerevisiae)는 호흡기 질환이나 피부 질환을 일으킨다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시하나, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 서열번호 2의 항진균 펩타이드의 합성

본 실시예 1에서는 어류인 도다리 (Pleuronectes americanus) 유래의 항균 펩타이드인 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)와 본 발명의 합성 펩타이드를 합성하였다. 이때 상기 항균 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)과 합성 펩타이드는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

펩타이드	아미노산 서열
서열번호 1: 플루시딘(Pleurocidin)	GWGSFFKKAAHVGKHVGKAALTHYL-NH₂
서열번호 2: 합성 펩타이드	RWRSFFKKAAHRGKHVGKRARTHYL-NH₂

먼저, 플수시딘 펩타이드드(Pleurocidin peptide)와 합성 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호기를 이용한 메리필드 (Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여서 (Merrifield, RB., J. Am . Chem . Soc., 85, 2149, 1963) 서열번호 1 및 2로 기재되는 항균 펩타이드를 제조하였다.

상기 항균 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxy- carbonyl)를 아미노산의 N_α-amino group의 보호기 (protecting group)로 사용하는 고상법 (solid phase method)으로 합성하였다.

구체적으로, 카르복실말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다. Fmoc-아미노산의 커플링 (coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 N-hydroxybenzo- triazole (HOBt)-dicyclo-hexylcar- bodiimide (DCC)법에 의하였다.

각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈 (NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄 (DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다.

여기에 TFA (trifluoroacetic acid):phenol:thioanisole:H₂O:triisopropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다.

이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC (reverse phase-HPLC) column (Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15μ, 19.0 mm×30 ㎝, Waters)을 이용하여 정제하였다. 상기 농도 구배 조건은 3차증류수에 0.01% TFA(Trifluoroacetic acid)를 포함한 A완충액과 아세토니트릴(ACN; Aceronitrile)에 0.01% TFA를 포함한 B완충액을 표 2에서와 같이 하였다.

시간(min)	A완충액농도(%)	B완충액농도(%)
0.001	100	0
5	100	0
20	0	100
30	0	100
40	100	0
45	stop	stop

각 합성 펩타이드를 6 N-HCl로 110 ℃에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02 N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기 (Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.

또한, 합성된 펩타이드의 시퀀스 (sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법 (matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다. 그 결과 서열번호 2로 기재되는 펩타이드의 예측분자량은 3093.6g이고, 측정된 분자량은 3092.5g으로 계산된 분자량과 미소한 오차를 감안한다면 정확한 아미노산 서열을 가지는 항균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

실시예 2: 서열번호 2의 항균 펩타이드의 병원성 진균에 대한 항진균 활성 조사

상기 실시예 1에서 제조된 합성 펩타이드의 항진균 활성을 조사하기 위해 하기와 같이 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항진균 펩타이드인 멜리틴 (Melittin)을 본 발명에서 양성 대조군로 사용하였다. 본 발명에서 서열번호 1 및 2의 항진균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

[항진균 활성 측정]

서열번호 2의 합성 펩타이드의 항진균 활성의 측정에는 병원성 진균인 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이 (Trichosporon beigelii), 사카로마이세스 세레비지예 (Saccharomyces cerevisiae)를 YPD 완전 배지 (포도당 2%, peptone 1%, yeast extract 0.5%, pH 5,5)에 배양하였다. 또한, YPD 액체 배지로 2×10³ 세포/ 1 mL의 균수가 되도록 희석하여, 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후, 서열번호 1 및 2의 항균 펩타이드의 용액을 단계적으로 희석한 농도로 처리하였다.

이어서 28 ℃ 배양기에서 24시간 동안 진탕 배양한 후, MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액 [5 mg of MTT/mL of PBS (pH 7.4)]을 각각의 웰에 넣고, 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 MTT에 의하여 생성된 포르마잔 (Formazan)들을 용해하기 위해 0.02 N HCl이 포함된 20 % SDS를 20 ㎕를 넣은 후, 37 ℃에서 16시간 반응시켰다.

다음으로 ELISA 판독기로 570 nm의 파장 하에서의 각 웰의 흡광도를 측정하여 최소 생육 저지농도 (MIC)를 측정하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

서열번호 2의 항균 펩타이드의 병원성 진균에 대한 최소 생육 저지 농도 (MIC)

	병원성 진균에 대한 MIC ^a(㎍/mL)
	플루시딘(Pleurocidin) 서열번호 1	합성 펩타이드서열번호 2	멜리틴(Melittin)
진균
캔디다 알비칸스	5	5	1.25
트리코스포론 베이겔라이	2.5	2.5	0.63
사카로마이세스 세레비지예	5	5	1.25
[주] a: 병원성 진균의 생육이 전혀 안 되는 서열번호 2의 항균 펩타이드의 농도

상기 표 3를 참조하면, 서열번호 2의 항균 펩타이드의 항진균 활성 측정의 결과, 병원성 진균에 대해서 2.5～5 ㎍의 최소 생육 저지 농도 (MIC)를 나타내었다. 이는 대조군인 사용된 강력한 항진균제인 멜리틴보다는 약하지만, 주형 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)과 유사한 강력한 항진균 활성으로 서열번호 2의 항진균 펩타이드가 강력한 항진균 활성을 나타냄을 의미한다.

실시예 3: 서열번호 2의 항진균 펩타이드의 진균 및 고등 생물의 세포막에 대한 영향 검토

진균의 세포막 지질의 조성은 무극성의 콜린포스파티딜 콜린 (Phosphatidyl choline)과 음전하를 갖는 포스파티딜 세린 (Phosphatidyl serine)로 되어 있다. 이에 반하여 고등 생물의 세포막의 지질 조성은 포스파티딜 콜린과 콜레스테롤 (Cholesterol)로 되어 있다. 본 발명에서 서열번호 2로 기재되는 플루시딘(Pleurocidin)의 진균 및 고등 생물의 세포막에 대한 영향은 다음과 같이 측정하였다.

진균의 세포막 지질 조성과 유사하게 포스파티딜 콜린 (Phosphatidyl choline)과 포스파티딜 세린 (Phosphatidyl serine)을 3:1 (w/w)로 사용하였으며, 고등 생물의 세포막 지질 조성과 유사하게 포스파티딜 콜린과 콜레스테롤 (Cholesterol)을 10:1 (w/w)로 사용하여 형광 물질 (Calcein)을 포함한 거대 균일 소낭 (large unilamellar vesicles)을 제조하여 실험에 사용하였다. 각각의 지질을 혼합 후, 혼합 및 건조 시킨 후에 형광 물질 완충 용액 (70 mM calcein, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.4)에 녹인 후, 얼리고 녹이는 과정을 10번 반복한다. 이를 LiposoFast extruder (Avestin, Inc. Canada)를 이용하여 폴리카보네이트 필터 (pore size: 100 nm )를 통과 시킨 후에 소낭에 포함되지 않은 형광 물질을 세파덱스 G-50이 충진된 컬럼을 이용하여 분리하여 균일한 거대 소낭을 제조한다.

진균 및 고등 생물의 세포막에 대한 펩타이드의 파괴능은 형광 광도계 (Jasco FP-6500)로 excitation; 490 nm emission; 520 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 10 % 트리톤 X-100 20 ㎕로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 거대 균일 소낭에 아무 물질도 처리하지 않은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 이때 항진균 펩타이드의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였으며, 얻어진 결과를 도 2와 도 3의 그래프로 나타내었다.

% 파괴능 = [시험물질을 처리한 용액의 흡광도 - 거대 균일 소낭만의 흡광도 / 트리톤 X-100을 처리한 용액의 흡광도 - 거대 균일 소낭만의 흡광도 ] ⅹ100.

도 2는 항진균 펩타이드가 고등 생물의 세포막에 어떤 영향을 주는지를 확인하기 위하여 거대 균일 소낭에 항진균 펩타이드를 처리한 다음 소낭에 포함된 형광물질의 방출된 양을 측정함으로써 파괴능을 계산한 그래프이다. 이때 ●는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 플루시딘(Pleurocidin)이고, ○는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 합성 펩타이드이고, ▼는 멜리틴을 나타낸다.

도 2를 참조하면, 본 발명에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩타이드의 경우 고등 생물의 세포막에 파괴능이 없지만, 양성 대조군으로 사용된 멜리틴과 주형 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)은 강력한 세포막 파괴능을 가진 것을 알 수 있었다.

도 3는 항진균 펩타이드가 진균의 세포막에 어떤 영향을 주는지를 확인하기 위하여 거대 균일 소낭에 항진균 펩타이드를 처리한 다음 소낭에 포함된 형광물질의 방출된 양을 측정함으로써 파괴능을 계산한 그래프이다. 이때 ●는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 플루시딘(Pleurocidin)이고, ○는 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 합성 펩타이드이고, ▼는 멜리틴을 나타낸다.

도 3를 참조하면, 본 발명에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 합성 펩타이드의 경우 고등 생물의 세포막에는 파괴능이 없지만, 진균의 세포막에는 파괴능을 가진 것으로 보아 세포 선택적으로 세포막을 파괴하는 것을 확인할 수 있었다. 반면에 양성 대조군으로 사용된 멜리틴과 주형 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)은 고등 생물과 진균의 세포막 모두에서 파괴능을 가진 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 서열번호 2의 항진균 펩타이드의 인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성 측정

인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성의 측정은 다음과 같이 실시하였다.

적혈구 세포(Human erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS)로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 8.0 %의 적혈구 세포 용액을 제조하였다. 그런 후, 8.0 % 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100 ㎕씩 분주한 후에 서열번호 2의 항진균 펩타이드의 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다.

이어서 모든 웰 에 총액의 양이 200 ㎕가 되도록 생리 식염수 (Saline 0.85 % NaCl)을 넣어주고, 37 ℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 옆 웰로 옮겼다.

적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기로 414 nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다. 그리고 대조군으로 0.1 % 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다. 이때 항진균 펩타이드의 파괴능은 하기 수학식 2에 의하여 계산하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

%파괴능 = [서열번호 2의 항진균 펩타이드를 처리한 용액의 흡광도_414nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도_414nm / 트리톤 X-100을 처리한 용액의 흡광도_414nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도_414nm ] ⅹ100.

인간 적혈구 세포 (Human erythrocytes)에 대한 서열번호 2의 항진균 펩타이드의 세포 독성의 측정

	% 인간 적혈구 파괴능 ^a(㎍/ml)
	100	50	25	12.5	6.25	3.12
플루시딘(Pleurocidin) 서열번호 1	77	29	6	0	0	0
합성 펩타이드서열번호 2	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	100	100	100	98
[주] a: 인간에 대한 세포 독성은 인간 적혈구 세포에 대한 서열번호 2의 항균 펩타이드의 파괴능으로 측정

상기 표 4을 참조하면, 서열번호 2의 항진균 펩타이드는 고농도에서도 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 그에 비해 강력한 항진균 펩타이드인 멜리틴의 경우에는 낮은 농도에서도 세포 독성이 매우 높게 나타내며, 주형 펩타이드인 플루시딘(Pleurocidin)도 고농도에서 비교적 높은 세포 독성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 본 발명에서 발견된 서열번호 2의 항진균 펩타이드는 인간의 신체에 피해 없이 인간에 대해 사용가능함을 의미한다.

한편, 본 발명에 있어서 플루시딘(Pleurocidin)은 기존의 항균 펩타이드의 특징적 구조와 동일하게 양전하를 띠고 있다. 그리고, 플루시딘(Pleurocidin)은 양전하를 띤 아미노산과 지방족 아미노산의 양쪽 부위로 구조가 나누어져 있으며, 알파-나선형(α-helix)의 구조로 항균 활성이 있다. 그러나, 플루시딘(Pleurocidin)은 용혈활성을 가짐으로써 인간에 유해함으로 인하여 항생제로 사용할 수 없었다.

이러한 난점을 극복하기 위하여 본 발명에서는 플루시딘(Pleurocidin)의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 치환하였다. 여기서 치환되는 아미노산은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 중에서 양전하를 띤 아미노산과 지방족 아미노산 영역의 경계에 있는 지방족 아미노산으로서, 상기 지방족 아미노산을 양전하와 친수성 성질을 가지는 아미노산으로 치환한 것이다.

친수성인 아미노산으로는 아스파르트산(Aspartic acid), 글루탐산(Glutamic acid), 히스티딘(Histidine), 라이신(Lysine), 아스파라긴(Asparagine), 프롤린(Proline), 글루타민(Glutamine), 알지닌(Arginine), 세린(Serine), 트레오닌(Threonine), 티로신(Tyrosine)이 있다. 이 중에서 양전하를 띤 아미노산으로는 히스티딘(Histidine),알지닌(Arginine),라이신(Lysine)이다.

플루시딘(Pleurocidin)에서 지방족 아미노산이 증가하는 경우 항균 활성은 증가하지만 이와 동시에 세포독성도 증가하는데, 만약, 친수성을 띤 아미노산으로 치환하는 경우 이러한 세포독성이 감소하는 효과가 있다. 그러나, 친수성 아미노산이 증가하면 세포독성은 감소하나 항균활성은 떨어지는 단점이 있다.

그러므로, 본 발명에서는 친수성을 띠고 있으면서도 양전하를 띠고 있는 아미노산을 선택하여 합성된 플루시딘 펩타이드(Pleurocidin peptide)의 양전하를 증가시킴으로써 음전하를 가지는 진균의 세포막에 접근성을 증가시켰다. 상기와 같이 접근성이 증가한 합성된 플루시딘(Pleurocidin)은 항균활성이 증가하여 세균의 세포막을 파괴시킨다. 또한, 서열번호 2로 기재되는 합성된 플루시딘은 상기 아미노산 중에서도 강력한 양전하를 띠고 있는 알지닌(Arginine)으로 치환하여 항균활성이 뛰어나다. 그러나, 본 발명은 서열번호 2로 기재된 합성 펩타이드와 동일하게 치환하는 아미노산의 갯수와 종류를 알지닌(Arginine)으로 한정하는 것은 아니다.

상기와 같이 본 발명의 합성된 플루시딘(Pleurocidin)은 항진균제로서 탁월한 효능을 갖음과 동시에 인체에 무해하므로 병원성 진균에 의한 감염을 예방 또는 치료하기 위한 약제학적 조성물로서 유용하다.

<110> KYUNGPOOK NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> A Pleurocidin peptide derivatives having an antibiotic and antifungal activity <130> dp20070235 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Pleuronectes americanus <400> 1 Gly Trp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Ala Ala His Val Gly Lys His Val 1 5 10 15 Gly Lys Ala Ala Leu Thr His Tyr Leu 20 25 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A Pleurocidin peptide derivatives <400> 2 Arg Trp Arg Ser Phe Phe Lys Lys Ala Ala His Arg Gly Lys His Val 1 5 10 15 Gly Lys Arg Ala Arg Thr His Tyr Leu 20 25

Claims

서열번호 1의 아미노산 중 G¹(글리신, Glycine), G³(글리신, Glycine), V¹²(발린, Valine), A¹⁹(알라닌, Alanine) 및 L²¹(루신, Leucine)의 지방족 아미노산이 양전하를 띤 아미노산인 R(알지닌, Arginine)으로 치환되어 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 인체 안전성이 개선된 항진균 펩타이드.
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제1항의 항진균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 진균에 대한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 약제학적 조성물.
제5항에 있어서,

상기 진균은 캔디다 속(Candida sp.), 트리코스포론 속(Trichosporon sp.), 및 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.)으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
제5항에 있어서,

상기 진균은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii) 및 사카로마이세스 세레비지예(Saccharomyces cerevisiae)로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.