KR100874543B1 - 인공피부 배양물 및 그 제조방법 - Google Patents

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Abstract

인간의 피부 세포가 생성하는 성분과 유사한 조성을 갖는 인공피부 배양물 및 그 제조방법이 개시된다. 상기한 인공피부 배양물은 피부 노화 방지와 주름 개선 효과가 뛰어나 화장품 및 의약품에 이용될 수 있다.

Description

인공피부 배양물 및 그 제조방법{ARTIFICIAL SKIN CULTURE AND ITS PREPARATION}
도 1 및 2는 실시예 1에서 얻어진 매트릭스의 주사전자 현미경 사진이다.
본 발명은 인공피부 배양물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 인간의 건강한 피부 조직이 생성하는 것과 거의 유사한 조성을 갖는 인공피부 배양물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
피부 노화(cutaneous senescence)는 자연노화(intrinsic aging)와 광노화(photoaging)로 나뉜다. 자연노화는 나이가 들면서 피부의 기능이 저하되고 세포들의 생리활성과 성장이 감소되고, 세포외 결합조직(extracellular matrix, 이하 "ECM")의 생성이 저하되어 주로 발생한다. 광노화는 여러 외부 환경요인, 특히 자외선(UV)에 의해 발생되는 것으로 자외선이 세포 내 신호전달 체계에 영향을 주어 진피 조직의 분해를 촉진시켜서 피부를 느슨하게 하고 골이 깊은 주름을 형성시 키는 것을 말하며 자연노화와는 달리 나이와 상관없이 발생하게 된다(J. Photochem. Photobiology. B: Biology, 63, 41-45, 2001; Experimental Gerontology, 35, 307-316, 2000). 특히 최근에는 자외선에 의해 생성되는 활성산소종(active oxygen speices)이 광노화에 관여한다는 사실이 밝혀지고 있다(UVA and UVB Induced Signal Transduction in Skin, 29, 83-94, 2001; Planta. Med. 61, 510-514, 1995).
인간의 증가된 욕구와 더불어, 피부 노화를 억제하거나 개선하려는 노력이 활발히 진행되고 있다. 이러한 노력의 일환은 피부 대용품(skin equivalents)을 제공하여 손상된 인간의 피부를 피부 대용품(또는 인공피부)으로 대체하려는 것이고, 다른 하나는 피부 노화를 억제할 수 있는 물질 또는 조성물을 손상된 피부에 적용하여 손상된 피부의 회복을 촉진시키려는 것이다.
인공 피부 또는 피부 대용품은 표피 대체품(epideraml replacements), 진피 대체품(dermal replacements), 또는 표피 및 진피의 복합 대체품(composite replacements)을 들 수 있다(Clinics in Podiatric Medicine and Surgery, 15, 129-137, 1998). US 5,536,656은 피부 대용품을 제조하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 세포를 함유하지 아니하는 콜라겐 용액을 투과막에 적용시키고, 상기 콜라겐 용액의 젤화를 유도하여 투과막 상에 콜라겐 젤을 형성하고, 콜라겐과 섬유아세포의 혼합물을 상기 콜라겐 젤에 적용하고, 상기 혼합물의 젤화를 유도한 후 배양하여 피부 대용품을 제조하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 인간 표피 세포를 상기 피부 대용물 상에 분배한 후 표피 세포의 표피화를 유도하여 또 다른 피부 대용품을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 첫번째 방법에 의해 제조된 피부 대용물은 진피 대용품에 해당하며, 두번째 방법은 진피 및 표피조직을 모두 포함하는 피부 대용품이다. 상용화된 제품으로는 어드밴스드 티슈 사이언스 사의 DermagraftTM, (폴리글락틴 망사(mesh)에 섬유아세포를 접종한 후 배양하여 얻어진 진피 대용품)과 이들은 오르가노지네시스사의 ApligrafTM을 들 수 있다.
한편, 피부 노화를 억제할 수 있는 물질 또는 조성물을 제공하려는 노력의 일환으로, WO 94/04184는 단백질 성장인자를 인간 피부에 국소투여하여 피부 노화를 억제시키는 방법을 개시하고 있다. 상기 방법에 사용되는 단백질 성장 인자의 예로는 표피 성장인자(epidermal growth factor: EGF), 인슐린 유사 성장인자 (insulin-like growth factor: IGF), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor: PDGF), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor: FGF) 등이 언급되어 있다. 그리고, US 5,618,544는 TGF-α, FGF 및 이들의 혼합물로 구성되는 군에서 선택되는 하나와 EGF의 조합으로 구성된 단백질 성장인자를 함유하는 조성물을 인간피부에 국소투여하여 피부노화를 억제시키는 방법을 개시하고 있다. 그러나, WO 94/04184 및 US 5,618,544는 단백질 성장인자가 피부 노화에 미치는 영향을 규명하고 있을 뿐이며, 인간의 피부 성분과 가장 유사한 인공 피부 배양물에 대해 서는 전혀 언급하고 있지 아니하다.
US 5,830,708은 천연적으로 분비된 인간 세포외 결합조직(ECM) 물질을 제조하는 방법을 개시하고 있으며, 상기 방법은 망사(mesh) 형태의 3차원 골격(또는 매트릭스) 상에 기질 세포(바람직하게는 섬유아세포)를 접종 및 배양하여 세포외 결합조직을 3차원 골격 내부에 형성하고, 상기 기질 세포를 죽인 후 기질 세포 및 세포 함유물을 제거하고, 3차원 골격 내부에 형성되고 천연적으로 분비된 세포외 결합조직을 회수하는 단계를 포함한다. 또한 US 6,284,284는 상기 방법에 의해 얻어진 세포외 결합조직을 포함하는 조성물을 인간에게 주사하여 피부 손상을 회복시키는 방법을 개시하고 있다. 상기한 US 5,830,708 및 US 6,284,284는 3차원 골격 내부에 분비 및 형성된 세포외 결합조직을 회수하여야 한다는 공정의 어려움이 있다. 더 나아가 상기 3차원 골격 내부에 분비 및 형성된 세포외 결합조직을 회수하는 방법 및 상기 방법에 의해 얻어진 조성물을 이용하여 피부 손상을 회복시키는 방법만을 개시하고 있을 뿐, 3차원 골격 외부로 분비된, 즉 배양 배지로 분비된, 인공 피부 배양물에 대해서는 전혀 언급하고 있지 아니하다.
최근에는, 상기 인공피부 대용품의 제조시 배양배지로 분비된 배양물(인공피부 배양물)을 피부 노화의 방지 또는 치료에 사용하고자 하는 노력이 진행 중에 있다. 인공피부 배양물은 인공피부 제조시 사용하는 3차원 골격(또는 "매트릭스"(matrix)로 표현됨)의 종류, 배양 배지, 세포 배양시의 조건, 배양될 세포의 종류 등에 따라 차이를 보이게 된다. 예를 들면 인공피부 제조시 사용하는 매트릭스의 종류에 따라 섬유아세포에 의해 생성되는 콜라겐과 GAG를 비롯한 세포외 기질의 생성정도에 차이가 있다. 콜라겐은 섬유아세포에 의해 생성되어 세포막 주위에 침적되며, 침적된 콜라겐은 섬유아세포의 활성을 저해하여 새로운 콜라겐의 합성이 생화학적으로 저해된다. 즉, 상기 US 5,536,656과 같이 섬유아세포를 콜라겐 젤 내에서 배양할 경우 섬유아세포에 의해 합성된 콜라겐이 세포 바로 주위에 침적되어 새로운 콜라겐 합성이 많이 저해되어 배양배지로 배출되는 콜라겐 농도가 저하되어 인간의 피부 조직이 생성하는 물질과 유사한 조성을 갖는 배양물을 제조할 수 없게 되는 문제점을 안고 있다.
따라서 본 발명의 목적은 건강한 피부 조직이 생성하는 물질의 조성과 거의 유사한 인공피부 배양물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 인공피부 배양물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 인공피부 배양물을 피부에 적용하여 노화된 피부 세포에 생리적 활성을 줌으로써 피부 세포의 생리적 기능을 증가시켜 피부 노화를 억제 또는 개선하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 얻어진 인공피부 배양물을 포함하는 화장품 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인공피부 대용물을 제조하는 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 인용피부 대용물을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은:
a) 콜라겐, 10 내지 40%의 아세틸화도를 갖는 키토산 및 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)의 혼합물로부터 얻어진 스폰지 형태의 3차원 매트릭스를 배양 배지에 예비적으로 적용하여 평형화하고,
b) 상기 매트릭스 상에 섬유아세포를 접종하고,
c) 상기 섬유아세포가 접종된 매트릭스를 배양 배지 내에서 배양한 후 배양배지의 상등액을 회수하여 인공피부 배양물을 얻는 단계를 포함한다.
상기 방법을 보다 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.
단계 a)의 매트릭스는 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)로 구성된 혼합물로부터 얻어지며, 상기 혼합물을 적당한 용매에 용해한 후 기판 상에 붓고, 냉각, 동결 및 동결 건조를 거쳐 제조된다. 상기 매트릭스의 제조에 사용되는 콜라겐은, 예를 들면, 소의 피부에서 추출한 것을 사용할 수 있으며, 이때 I형 및 III형의 혼합 콜라겐의 형태로 추출된다. 키토산은 게에서 추출된 키틴을 60 - 90%의 범위내에서 부분적으로 탈아세틸화하여 얻어진 것을 사용하며, 콜라겐 및 글리코스아미노글리칸과 수소결합을 형성하여 화학적 가교제의 역할을 한다. 10 내지 40%의 아세틸화도를 갖는 키토산은 콜라겐과 글리코스아미노글리칸과 수소결합을 형성하여 가교제의 역할을 수 행할 수 있으며, 이 범위를 벗어날 경우 가교 능력의 저하에 의해 매트릭스의 붕괴를 초래할 우려가 있다. 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)의 상대적 중량비는 68-74:18-22:6-12가 적당한 비율이다. 한편, 접착성 및 세포 성장을 촉진시키기 위해 히알루론산(hyaluronic acid)과 같은 첨가제를 추가하는 것을 배제하는 것은 아니다. 히알루론산과 같은 첨가제는 통상 0.5 - 2 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
도 1 및 2는 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸(glycosaminoglycan, GAG)로 구성된 혼합물로부터 얻어진 매트릭스의 주사 전자 현미경 사진이다. 상기 도 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 방법에 사용되는 매트릭스는 기공이 상호 연결되어 있는 오픈-셀 구조(open-cell structure)를 갖는 스폰지 형태를 갖고 있으며, 균일한 기공 크기를 갖는다. 상기 매트릭스의 기공 크기는 100 - 250 ㎛ 범위 내에서 조정되는 것이 바람직하며, 이러한 크기의 기공은 섬유아세포에 의해 합성된 콜라겐이 침적될 수 있는 충분한 공간을 제공하게 된다. 얻어진 매트릭스는 감마선의 조사 또는 알코올 세척에 의해 멸균된 후 사용된다.
상기한 매트릭스는 인공피부 배양 배지에 적용되어 평형화된다. 매트릭스의 평형화에 사용가능한 배양 배지로는 섬유아세포의 성장을 적절히 유지할 수 있는 조성을 갖는 것이면 특별히 제한되지 아니한다. 그러한 예로는 최소 필수 배지(DMEM, Gibco 사)에 소태아혈청, 페이탈클론 II 및 기타 첨가제(예를 들면, 페니실린 지, 젠타마이신과 같은 항생제)를 추가로 공급한 배지를 들 수 있다. 이 들은 표피 성장인자(EGF) 등과 같은 단백질 성장인자를 추가로 포함할 수 있다.
인공피부 배양 배지에 의해 미리 평형화된 후, 상기 매트릭스는 섬유아세포로 접종된다. 접종될 섬유아세포는, 특별히 제한되지 아니하나, 바람직하게는 신생아의 섬유아세포 또는 환자 자신의 조직으로부터 분리된 것이며, 세포외에서 1차원적으로 배양된 후 사용된다. 섬유아세포의 접종수는 1 cm2 당 1X105 ~ 4X105의 범위내에서 적절히 조절되어야 한다. 상기 범위 미만의 수로 접종될 경우 충분한 배양을 성취할 수 없으며, 상기 범위를 초과할 경우 접종된 섬유아세포가 너무 많아 배양에 문제점을 야기할 수 있다. 배양에 요구되는 시간, 배양에 요구되는 배지교체 횟수, 배양물의 효능 등을 고려할 때, 세포 접종수는 바람직하게는 2.5X105 ~ 3.5X105로 조절하는 것이 바람직하다.
섬유아세포가 접종된 후, 상기 3차원 매트릭스는 배양 배지 하에서 배양되고 상기 매트릭스에 접종된 섬유아세포는 세포 성장(또는 세포분열)을 거쳐 배양물을 배양배지로 분비하게 된다.
3차원 매트릭스의 배양에 사용되는 배지의 조성은 표피 성장인자 및 비타민 C를 포함하고, 섬유아세포의 성장을 적당하게 유지할 수 있는 조성을 갖는 것이면 특별히 제한되지 아니한다. 바람직하게는 최소 필수배지에 표피 성장 인자, 비타민 C, 소태아 혈청, 페이탈클론 II 및 항생제가 공급된 배지이다. 이들은 세포의 성장을 촉진시키거나 세포외 기질 합성을 촉진시키는 것으로 알려진 다른 성분, 예를 들면, TGF-α, 섬유아세포 성장인자(FGF)와 같은 다른 단백질 성장인자를 추가로 포함할 수 있다(WO 94/04184; Photodermatol. Photoimmunol. Photomed. 12, 84-89, 1996; J. Dermatological Science 15, 188-200, 1997 참조). 보다 바람직하게는 5-25 중량%의 소태아 혈청, 50 - 150 IU/ml의 페니실린 지, 10 - 50 ㎍/ml의 젠타마이신, 0.1 - 1.0 ㎍/ml의 하이드로코티손, 0.05 - 0.20 IU/ml의 인슐린, 5 - 25 ㎍/ml의 표피 성장인자, 25 - 100 ㎍/ml의 비타민 C가 공급된 최소필수배지를 들 수 있다. 본 발명의 구체예에 따르면, 10 중량%의 소태아 혈청, 100 IU/ml의 페니실린 지, 25 ㎍/ml의 젠타마이신, 50 ㎍/ml의 비타민 C, 0.4 ㎍/ml의 하이드로코티손, 0.12 IU/ml의 인슐린, 10 ng/ml의 표피 성장인자가 공급된 최소필수배지로부터 얻어진 인공피부 배양물이 피부 노화의 억제 및 개선에 바람직한 결과를 제공하였다.
배양 배지의 교체는 통상 하루 내지 사흘에 한번꼴로 이루어지며, 세포의 성장기간은 배양배지의 농도 및 접종 세포수에 의존하여 1 - 3일 정도이며, 이 기간이 지난 후 배양배지의 상등액을 회수한 후 필터로 여과하여 배양물을 얻게된다.
얻어진 배양물은 건강한 피부 조직에서 피부 세포들이 생성하는 것과 거의 동일한 콜라겐과 GAG 등의 세포외 기질 단백질, 많은 단백질 성장인자, 사이토카 인, 자연 항산화 물질 등을 포함하고 있음을 확인할 수 있었다. 구체적으로는, 시르콜 콜라겐 분석 키트(sircol collagen assay kit, BioColor Ltd.)와 엘리사 키트(ELISA kit, R＆D system)를 이용하여 정량한 결과, 콜라겐, VEGF(vascular endothelial growth factor), TGF-β(transforming grwoth factor-β), KGF(keratinocyte growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), IL(Interleukin), TNF-α(tumor necrosis factor-α), HGF(heparin-binding growth factor), GM-CSF(granulocyte macrophage-colony stimulating factor), M-CSF(macrophage-colony stimulating factor), PGE2(prostaglandin E2), PlGF(placenta growth factor), bFGF(basic fibroblast growth factor)를 포함하고 있음을 확인할 수 있었다.
본 발명의 방법은 섬유아세포의 접종시에 표피세포를 함께 접종시킬 수 있다. 필요할 경우, 충분한 섬유아세포의 충분한 배양이 이루어진 후 표피세포를 접종하고 추가로 배양을 진행시킬 수도 있다. 후자의 경우, 단계 c)의 배양된 매트릭스를 세척한 후 표피세포를 상기 매트릭스에 접종하고, 표피 세포가 접종된 매트릭스를 배양 배지하에서 배양한 후 배양배지의 상등액을 회수하여 인공피부 배양물을 얻는 단계를 거치게 된다. 표피세포의 접종수, 접종방법 및 배양배지의 조건 등은 상기한 섬유아세포의 그것과 동일하다. 발명의 구체예에 따르면, 표피 세포를 추가로 접종시켜 얻어진 인공피부 배양물은 피부 세포에 의해 생성되는 각종 성장인자들의 조성이 인간의 피부 세포가 생성하는 것과 더욱더 유사하여 섬유아세포만 배 양하여 얻어진 것보다 향상된 효과를 제공함을 확인할 수 있었다.
본 발명은 또한 상기한 방법에 의해 얻어진 인공피부 배양물에 관한 것으로서, 상기 인공피부 배양물은 적어도 콜라겐, VEGF, TGF-β, KGF, PDGF, IL, TNF-α, HGF, GM-CSF, M-CSF, PGE2, PlGF, bFGF를 포함한다. 본 발명의 구체예에 따르면, 시르콜 콜라겐 분석 키트와 엘리사 키트를 이용하여 정량한 결과, 상기 인공피부 배양물은 콜라겐 10 - 90 ㎍/ml, VEGF 2500 - 5810 pg/ml, TGF-β1 750 - 1600 pg/ml, TGF-β2 30 - 106 pg/ml, KGF 45 - 150 pg/ml, PDGF-AB 30 - 50 pg/ml, IL 30 - 93 pg/ml, TNF-α 3 - 5 pg/ml, HGF 500 - 745 pg/ml, GM-CSF 85 - 1380 pg/ml, M-CSF 1100 - 2050 pg/ml, PGE2 150 - 450 pg/ml, PlGF 101 - 720 pg/ml, bFGF 0.9 - 1.9 pg/ml을 함유하였다. 본 발명의 인공피부 배양물은 인간의 피부 세포가 피부 세포에 의해 생성되는 각종 성장인자들의 조성이 인간의 피부 세포가 생성하는 것과 유사하여 피부 노화의 저하 및 개선에 효과를 제공하고, 욕창 등에 의해 야기된 피부 장애를 치료하는 데 효과적이다. 본 발명의 인공피부 배양물은 활성이 저하된 피부 세포에 생리적 활성을 주어 피부 세포의 생리활성을 촉진시켰으며, 따라서, 피부 노화의 저하 및 개선, 욕창 등에 의해 야기된 피부 장애를 치료하는 데 유용하다.
본 발명의 인공피부 배양물은 의약 또는 화장품 분야에서 통상 사용되는 담체와 함께 인체에 국소투여될 수 있다. 사용될 수 있는 담체의 예는 특별히 제한되 지 아니하며 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들면, WO 94/04184, US 5,618,544를 참조하기 바란다. 이들은 액제, 크림, 오일, 로션, 연고, 젤, 고형제의 형태로 제제화될 수 있으며, 국소투여 또는 피하주사로 투여될 수 있다.
본 발명의 인공피부 배양물은 하루에 한번 내지 수회 동안 투여가능하며 1일 투여량은 통상 50 내지 150 ㎎이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 인공피부 배양물의 투여량은 환자의 피부 체질, 상태, 연령, 성별 등 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 < 세포 배양용 매트릭스의 제조 1 >
소의 피부에서 추출한 I형과 III형 콜라겐(type Ⅰ+Ⅲ collagen)을 0.05M 아세트산 용액(pH 3)에 첨가하여 최종 농도가 각각 1%(중량/부피)가 되도록 첨가하였다. 콜라겐 용액에 80%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산을 콜라겐에 대해 15 중량%의 양으로 첨가한 후, GAG를 콜라겐에 대해 6 중량%의 양으로 첨가하였다. 얻어진 콜라겐-키토산-GAG 용액을 NaOH를 사용하여 중화시키고, Tris-HCl 완충용액으로 pH를 6.5 - 7로 조정하였다. 얻어진 콜라겐-키토산-GAG 용액을 -60℃로 급속냉각시키고, 동결 및 동결 건조시켜 매트릭스를 제조하였다. 제조된 매트릭스는 약 0.4 mm의 두 께를 가졌다. 얻어진 매트릭스의 구조를 주사 전자 현미경으로 분석하였으며, 도 1 및 도 2에 주사전자 현미경 사진을 도시하였다. 도 1 및 2에서 알 수 있는 바와 같이, 매트릭스의 기공 크기는 약 100 - 250 ㎛ 범위 내에서 균일한 분포를 형성하였으며, 각 기공이 상호연결되어 있는 오픈-셀 구조였다. 그리고, 망사(mesh) 형태가 아니라 스폰지 형태였다. 얻어진 매트릭스는 사용전에 20 KGy의 감마선을 조사하여 멸균시켰다.
실시예 2 < 세포 배양용 매트릭스의 제조 2 >
소의 피부에서 추출한 I형과 III형 콜라겐(type Ⅰ+Ⅲ collagen)을 0.05M 아세트산 용액(pH 3)에 첨가하여 최종 농도가 각각 0.3%(중량/부피)가 되도록 첨가하였다. 콜라겐 용액에 60% 및 90%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산을 콜라겐에 대해 15 중량%의 양으로 첨가한 후, GAG를 콜라겐에 대해 6 중량%의 양으로 첨가하였다. 여기에 히알루론산을 콜라겐에 대해 1 중량%의 양으로 첨가하고, NaOH를 사용하여 중화시키고, Tris-HCl 완충용액으로 pH를 6.5 - 7로 조정하였다. 이 후 실시예 1과 동일한 절차를 수행하여 매트릭스를 제조하였다. 얻어진 매트릭스의 기계적 강도를 측정한 결과 실시예 1에서 얻어진 매트릭스보다 감소되었음을 확인할 수 있었으며, 이는 콜라겐의 농도 저하에 의해 발생된 것으로 판단된다. 그리고, 히알루론산의 첨가에 의해 접착성은 개선되었다. 다만, 60% 및 90%의 탈아세틸화도를 갖는 키토산을 사용함에 의해 붕괴(rupture)되는 경향이 다소 나타났으며, 따라서 이 범위를 벗어날 경우 매트릭스의 성능이 현저히 저하될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3 < 인공피부 배양물 A의 제조 1>
실시예 1에서 얻은 매트릭스(진피 기질에 대응됨)를 5cm X 7cm X 0.4cm 크기로 절단한 후 100 mm 플레이트에 옮기고 배양 배지[5% 소태아 혈청, 5% 페이탈클론 Ⅱ(Hyclone 사), 100 IU/ml 페니실린 지, 25 ㎍/ml 젠타마이신, 10 ng/ml 표피 성장인자(EGF, Sigma 사)가 추가로 공급된 둘벡코 이글의 MEM(DMEM, Gibco 사)]를 20 ml 첨가한 뒤, 배양기(37℃, 5% CO2)에서 1시간 이상 평형화하여 배지가 완전히 스며들 수 있도록 하였다. 인공피부를 배양할 플레이트에 멸균된 거름종이를 놓고, 그 위에 평형화시킨 진피 기질을 잘 펴서 놓았다. 그 위에 스텐레스 스틸로 제조된 사각 프레임을 놓아 진피 기질을 고정하였다. 신생아 포피 조직으로부터 추출하여 단층으로 배양한 섬유아세포를 트립신으로 회수하고 배양배지에 적절히 희석하여 세포현탁액(접종될 세포수: 진피 기질 1cm2 당 2X105 세포, 세포 현탁액의 부피: 진피 기질 1 cm2 당 20㎕)을 제조하였다. 이 세포 현탁액을 사각 프레임으로 고정된 진피 기질에 균일하게 분산시켜 접종한 후 1시간정도 배양기에서 안정화시킨 다음 25ml의 배양 배지를 넣어 다시 배양하였다. 이틀에 한번씩 배지를 교환해 주며 약 2주간 배양하였다. 2일 정도의 성장기간을 거친 후 세포 분비물이 배양 배지로 분비되었다. 세포 접종 후 처음 배지를 교환해줄 때부터는 비타민 C를 최종 농도가 50㎍/ml가 되도록 첨가해 주었으며, 이때부터 배지 교환 시마다 상등액을 수거하여 0.2 ㎛의 필터로 거른 후, 인공피부 배양물(인공피부 배양물 A)을 얻었다.
실시예 4 < 인공피부 배양물 B의 제조 2 >
섬유아세포가 접종된 진피기질의 배양배지로서 50 ㎍/ml의 비타민 C와 10 ng/ml의 표피성장인자를 추가로 공급한 클로네틱스사(Clonetics Inc.)의 FGM(fibroblast growth media systems)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 3과 동일한 과정을 수행하여, 인공피부 배양물 B를 제조하였다.
실시예 5 < 인공피부 배양물 C의 제조 3 >
실시예 1에서 2주 동안 배양된 진피 기질을 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하였다. 세척된 진피기질을 표피세포 배양 배지[10% 페이탈클론 Ⅱ(Hyclone 사), 100 IU/ml 페니실린 지, 25 ㎍/ml 젠타마이신, 10 ng/ml 표피 성장인자(EGF, Sigma 사), 0.1 nM 콜레라 톡신, 2 nM 트리-요오도 티로닌(tri-iodo thyronine), 24.3 ㎍/㎕ 아데닌, 50㎍/ml 비타민 C, 0.4㎍/ml 하이드로코티손, 0.12 IU/ml 인슐린가 함유된 DMEM(Gibco 사)과 HAM F-12(Gibco 사)이 3: 1로 혼합된 배지]가 추가로 공급된 둘벡코 이글의 MEM(DMEM, Gibco 사)]하에서 약 1시간 정도 배양하여 평형화시켰다. 단층으로 배양하던 표피세포를 트립신으로 회수하고 배양배지에 적절히 희석하여 세포현탁액(접종될 세포수: 진피 기질 1cm2 당 2X105 세포, 세포 현탁액의 부피: 진피 기질 1 cm2 당 20㎕)을 제조하였다. 얻어진 세포현탁액을 평형화된 진피기질에 균일하게 분산하여 접종하였다. 약 2시간 동안 배양하여 표피세포가 진 피대용 인공피부에 완전히 부착될 수 있게 한 다음 인공피부가 잠기기에 충분한 양의 표피세포 배양 배지를 넣어주고, 50 ㎍/ml의 비타민 C를 첨가하였다. CO2 배양기에서 2일을 배양한 후, 배지를 완전히 제거하고 PBS로 세척한 뒤, 멸균된 핀셋으로 새로운 플레이트에 스텐레스 스틸로 제조된 그리드(grid)를 놓고 그 위에 거름종이를 놓은 다음 2일 동안 배지에 잠긴 상태(submerge)에서 배양된 피부대용 인공피부를 올려놓았다. 이때 스텐레스 사각 프레임은 제거한다. 피부 대용 인공피부의 아랫부분이 약간 닿을 만큼의 배양 배지[10% 소태아 혈청, 100 IU/ml 페니실린 지, 25㎍/ml 젠타마이신, 50㎍/ml 비타민 C, 0.4㎍/ml 하이드로코티손, 0.12 IU/ml 인슐린, 10㎍/ml 표피 성장인자(EGF, Sigma 사)가 함유된 DMEM(Gibco 사)]를 첨가하여 공기와 배지 경계면에서 피부대용 인공피부가 배양될 수 있게 하여 배양하였다. 이틀마다 새 배지로 교체해 주면서 약 2주간 배양하고, 인공피부 배양물은 회수하여 0.2 ㎛의 필터로 거른 후, 인공피부 배양물 C를 얻었다.
실시예 6 < 인공피부 배양물 D의 제조>
섬유아세포 및 표피세포가 접종된 매트릭스의 배양배지로서 50 ㎍/ml의 비타민 C를 추가로 공급한 케라티노사이트-SFM(Gibco 사)를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 5와 동일한 과정을 수행하여, 인공피부 배양물 D를 제조하였다.
실시예 7
상기 실시예 3 - 5로부터 얻어진 인공피부 배양물 A-D 내의 콜라겐 양과 각종 단백질 성장인자의 양을 각각 시르콜 콜라겐 분석 키트(sircol collagen assay kit, BioColor Ltd.)와 엘리사 키트(ELISA kit, R＆D system)를 이용하여 정량하였으며, 그 결과를 표 1에 정리하였다.
인공피부 배양물의 성분 분석
인공피부 배양물 A 인공피부 배양물 B 인공피부 배양물 C 인공피부 배양물 D
Collagen (㎍/ml) 90 10 90 90
VEGF (pg/ml) 3240 2500 5810 3200
TGF-β1 (pg/ml) 1300 750 1600 1300
TGF-β2 (pg/ml) 61 30 106 60
KGF (pg/ml) 150 45 80 60
PDGF-AB (pg/ml) 45 30 50 40
IL-1α (pg/ml) - - 0.9 0.5
IL-6 (pg/ml) - - 0.1 0.1
IL-8 (pg/ml) - - 0.1 0.1
IL-11 (pg/ml) 50 30 92 55
TNK-α (pg/ml) 5 3 5 4
HGF (pg/ml) 524 500 745 650
GM-CSF (pg/ml) 104 85 1380 1100
M-CSF (pg/ml) 1390 1100 3990 2050
PGE2 (pg/ml) 180 150 570 450
PIGF (pg/ml) 122 101 720 650
bFGF (pg/ml) 1.1 0.8 1.9 0.9
상기 결과로부터 본 발명의 인공피부 배양물 A-D는 콜라겐, VEGF, TGF-β, KGF, PDGF, IL, TNF-α, HGF, GM-CSF, M-CSF, PGE2, PlGF, bFGF를 모두 포함함을 확인할 수 있었다.
실시예 8 < 인공피부 배양물을 함유한 영양화장수 A-D의 제조 >
상기 실시예 3-6에서 얻어진 인공피부 배양물 A-D를 각각 10%씩 함유시켜 영양화장수 A-D를 제조하였으며, 그 조성을 표 2에 정리하였다. 그러나, 본 발명은 실시예 8에만 국한되지 않음을 밝힌다.
인공피부 배양물을 함유한 영양화장수 A-D의 조성
성분 함량(중량%)
영양화장수 A 영양화장수 B 영양화장수 C 영양화장수 D
인공피부 배양물 A 10 - - -
인공피부 배양물 B - 10 - -
인공피부 배양물 C - - 10 -
인공피부 배양물 D - - - 10
글리세린 8 8 8 8
실리콘 오일 1.2 1.2 1.2 1.2
트리 에탄올 아민 0.3 0.3 0.3 0.3
세테아릴알콜 1.5 1.5 1.5 1.5
글리세릴스테아레이트 0.5 0.5 0.5 0.5
트윈 60 1.2 1.2 1.2 1.2
스쿠알렌 4 4 4 4
방부제 적량 적량 적량 적량
마카마디아 너트 오일 4 4 4 4
카르복시 비닐 폴리머 1 1 1 1
1,3-부칠렌 글리콜 3 3 3 3
정제수 잔량 잔량 잔량 잔량
합계 100 100 100 100

실험예 1 < 인공피부 배양물의 세포 증식 효과 측정>
상기 실시예 3 - 6에서 얻어진 네 종류의 인공피부 배양물의 세포 증식 효과를 측정하기 위하여 사람 피부 섬유아세포의 세포 증식율을 측정하였다(J. Invest Dermatol, 114, 5-13, 2000). 시약과 실험 재료는 DMEM 배지(Gibco 사), 소태아 혈청(Hyclone 사), 트립판 블루(Sigma 사)를 사용하였으며, 또 PBS와 그 외 시약들도 일급이상의 분석용 시약을 사용하였다. 세포는 신생아의 포피조직으로부터 추출하여 분리한 섬유아세포를 사용하였다. 우선, 세포는 2.4X104 세포/웰의 밀도로 6웰 플레이트에 접종하여 2% 소태아 혈청을 함유한 DMEM 배지로 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 24시간 배양한 뒤, 각 농도의 인공피부 배양물을 첨가한 배지로 교환한 후 48시간 추가 배양하였다. 그 후, 세포를 트립신(Gibco 사)을 이용하여 회수한 후 트립판 블루로 염색하여 헤모사이토미터로 살아 있는 세포 수를 측정하였다. 인공피부 배양물을 처리하지 않은 대조군을 100%로 하여 인공피부 배양물의 세포 증식율을 계산하였다. 그 결과를 하기의 표 3에 나타내었다.
인공피부 배양물의 세포 증식 효과
실험 농도 (Vol/Vol) 세포 증식 효과(%)*
인공피부 배양물 A 인공피부 배양물 B 인공피부 배양물 C 인공피부 배양물 D
0 % 100 100 100 100
1 % 120 110 120 115
2 % 134 125 135 129
5 % 155 130 160 145
10 % 190 145 205 165
20 % 208 158 220 190
* 3회 반복 시험 평균치
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 인공피부 배양물 네 종류 모두 섬유아세포의 성장을 촉진시키는 것이 확인되었고 이것은 농도 의존적으로 나타났다. 또한 섬유아세포와 표피세포를 배양하여 얻어진 인공피부 배양물 C가 섬유아세포만 배양한 인공피부 배양물 D보다 약간 개선된 효과를 제공하였음을 확인할 수 있었다.
실험예 2 < 인공피부 배양물의 콜라겐 합성 증진 효과 측정>
상기 실시예 3 - 6에서 얻어진 네가지 인공피부 배양물을 사람 섬유아세포 배양 시 농도별로 첨가하여 세포 수준에서의 콜라겐 합성 촉진 효과를 시르콜 콜라겐 분석 키트(sircol collagen assay kit, BioColor Ltd.)를 사용하여 시험하였다(J. Biological Chemistry, 27, 49-67, 1992). 실험예 1과 같이 세포를 배양한 뒤, 섬유아세포가 합성하여 세포 외로 분비한 콜라겐 양을 측정하기 위해 세포 배양물을 200 ㎕ 씩 취하여 콜라겐에만 특이하게 결합하는 시르콜 염료 시약(sircol dye reagent) 1 ml을 넣어주었다. 상온에서 30분간 천천히 흔들어 주면서 방치한 뒤, 5000xg에서 5 - 10분간 원심 분리하여 염색된 콜라겐을 침전시켰다. 상등액을 제거한 뒤, 100% 에탄올로 여분의 염색약을 세척한 후, 5000xg에서 5-10분간 원심 분리하여 다시 염색된 콜라겐을 침전시켰다. 상등액을 제거한 뒤, 알칼리 시약(alkali reagent) 1 ml을 가해 염색된 콜라겐을 용해시킨 다음 마이크로 플레이트 리더(microplate reader)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 키트에서 제공하는 I형 콜라겐(collagen type Ⅰ)으로 콜라겐 표준 곡선을 작성한 뒤 콜라겐 양을 정량 하였다. 인공피부 배양물을 처리하지 않은 대조군을 100%로 하여 인공피부 배양물의 콜라겐 합성 증가율을 계산하여 표 4에 나타내었다. 결과에서 알 수 있듯이 네 종류 인공피부 배양물 모두 콜라겐 합성 촉진에 효과가 있었으며, 그 효과는 농도 의존적이었다.
인공피부 배양물의 콜라겐 합성 촉진 효과
실험 농도 (Vol/Vol) 콜라겐 합성 촉진 효과(%)*
인공피부 배양물 A 인공피부 배양물 B 인공피부 배양물 C 인공피부 배양물 D
0 % 100 100 100 100
1 % 110 105 115 109
2 % 130 120 130 118
5 % 190 145 195 169
10 % 410 150 421 185
20 % 460 160 470 250
* 3회 반복 시험 평균치

실험예 3 < 인공피부 배양물의 과산화수소 유도 산화적 스트레스로 인한 세포 독성 억제 효과 측정 >
상기 실시예 3 - 6에서 얻어진 인공피부 배양물의 항산화 효과를 과산화수소(H2O2) 유도 세포 독성 억제 효과로 평가하였다(Apoptosis, 2, 164-177, 1997). 과산화수소는 대표적인 산화제로써 세포 내에 흡수되어 하이드록실 라디칼을 생성하여 세포막과 단백질, 핵산 등 세포 내 고분자 물질을 과산화시켜 세포 독성을 유발한다. 사람 섬유아세포를 배양 시 과산화수소와 함께 인공피부 배양물을 첨가하여 세포 수준에서의 항산화 효과를 시험하였다.
96웰 플레이트에 한 웰 당 섬유아세포 1X104개/100 ㎕ 배지(DMEM)를 넣어 24시간동안 배양한다. 배지를 버리고 DMEM 배지에 최종 10 mM이 되도록 희석한 과산화수소를 각 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가한 뒤, 여기에 인공피부 배양물을 각 웰당 최종 농도(v/v)가 25%, 10%, 5%, 2.5%, 1%, 0%가 되도록 DMEM 배지로 희석하여 각 웰 당 100㎕씩 첨가한 뒤 48시간 추가 배양한다. 여기에 5 mg/ml의 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) 용액을 30 ㎕ 씩 첨가 하여 4시간 배양한 뒤, 배지를 모두 버리고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액을 150 ㎕/웰 씩 가하여 용해시킨 뒤 마이크로플레이트리더로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 인공피부 배양물의 산화적 스트레스로 인한 세포 독성에 관한 억제 효과는 인공피부 배양물을 처리하지 않고 DMEM 배지만으로 배양한 대조군을 0%로 하여 계산하였다. 그 결과는 표 5에 나타낸 바와 같이 인공피부 배양물 네 종류 모두에서 세포 독성 억제 효과가 있었으며, 그 효과는 농도 의존적으로 나타났다. 따라서 인공피부 배양물은 과산화수소 처리로 인한 세포의 산화적 스트레스를 억제하여 세포 독성을 억제하는 항산화 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
인공피부 배양물의 과산화수소 유도세포 독성 억제 효과
실험 농도 (Vol/Vol) 세포 독성 억제 효과 (%)*
인공피부 배양물 A 인공피부 배양물 B 인공피부 배양물 C 인공피부 배양물 D
0 % 0 0 0 0
1 % 13 3 15 5
2.5 % 16 5 16 9
5 % 24 6 25 13
10 % 34 9 37 18
20 % 38 11 41 25
25 % 47 15 50 36
* 3회 반복 시험 평균치

실험예 4 < 인공피부 배양물의 마우스에 대한 주름개선 효과 >
상기 실시예 3 - 6에서 얻어진 인공피부 배양물과 실시예 8에서 얻어진 인공피부 배양물을 함유한 영양 화장수를 자외선에 의해 유발된 헤어리스 마우스(hairless mouse)의 주름에 적용하여 인공피부 배양물과 인공피부 배양물을 함유한 영양화장수의 주름 개선 효과를 평가하였다. 8주령의 자성 헤어리스 마우스에 자외선 조사기(UV radiation system, Handouk Labware co., HD 40W)를 이용하여 61 mJ/cm2로 1주일에 3회씩 10주간 조사하여 주름을 형성시킨 뒤, 시료를 첨가하지 않은 증류수를 대조군으로 처리하고, 인공피부 배양물 A, B, C, D를 각각 10%씩 함유한 시료를 시험 군으로 각각 처리하였다. 그리고, 인공피부 배양물을 함유하지 않은 영양화장수를 대조군으로 처리하고, 인공피부 배양물을 함유한 영양화장수 A, B, C, D를 시험군으로 각각 처리하였다. 시료의 적용은 10 ㎕/cm2씩 1일 1회씩, 1주일에 5회 처리하였으며, 1주일에 3회는 주름 유발 시와 동일한 조건으로 자외선을 조사한 뒤 시료를 적용하여 인공피부 배양물의 주름개선 효과와 자외선 조사에 의한 독성 억제효과를 시험하였다(Photochem Photobiol, 56, 505-511, 1992; J Dermatol Sci, 12, 56-63, 1996). 8주간 처리한 후, 주름개선 정도의 판단은 인공피부 배양물을 처리한 부위를 육안과 사진 촬영을 통하여 육안 판정하였으며, 시험 결과는 네 종류의 인공피부 배양물 처리군 및 대조군을 시료 처리 전후로 비교하고, 인공피부 배양물을 함유하지 않은 영양화장수를 처리한 대조군과 인공피부 배양물을 함유한 영양화장수를 처리한 처리군을 시료 처리 전후로 비교하여 개선 없음, 약간의 개선, 중등도의 개선, 상당한 개선의 4단계로 판정하였다(Photochem Photobiol, 46, 367-378, 1987). 인공피부 배양물 A, B, C, D는 모두 헤어리스 마우스의 주름 개선에 효과가 있었으며, 인공피부 배양물을 함유한 영양화장수 A, B, C, D 역시 자외선에 의한 헤어리스 마우스의 주름 개선에 효과가 있었다. 그 결과 를 표 6 및 표 7에 나타내었다.
인공피부 배양물의 마우스에 대한 주름 개선 효과
개선 없음 약간의 개선 중등도의 개선 상당한 개선
대조군* 6 0 0 0
인공피부 배양물 A 0 1 4 1
인공피부 배양물 B 0 3 3 0
인공피부 배양물 C 0 1 3 2
인공피부 배양물 D 0 2 4 0
* 각 군의 개체수 : 6

인공피부 배양물을 함유한 영양화장수의 마우스에 대한 주름 개선 효과
개선 없음 약간의 개선 중등도의 개선 상당한 개선
대조군* 6 0 0 0
인공피부 배양물 A 0 2 3 1
인공피부 배양물 B 1 3 2 0
인공피부 배양물 C 0 2 2 2
인공피부 배양물 D 0 4 2 0
* 각 군의 개체수 : 6

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 인공피부 배양물은 피부 노화로 인해 사람 조직에서 감소되는 각종 성장인자와 콜라겐, 항산화 물질, 아미노산 등이 다량 함유되어 있어서, 세포 성장을 촉진시키고 섬유아세포의 콜라겐 합성을 증가시킬 뿐만 아니라 산화적 스트레스로 인한 세포 독성을 억제하는 기능을 가지고 있기 때문에 노화된 피부세포의 재생과 피부 노화 억제 및 개선에 효과적인 화장료 조성물과 의약품의 조성물로 제공할 수 있다.

Claims (16)

  1. 콜라겐, 10 내지 40%의 아세틸화도를 갖는 키토산 및 글리코스아미노글리칸의 혼합물로부터 얻어진 오픈-셀 구조를 갖는 스폰지 형태의 3차원 매트릭스를 배양 배지에 예비적으로 적용하여 평형화하고, 상기 매트릭스 상에 섬유아세포를 접종하고, 상기 섬유아세포가 접종된 매트릭스를 배양 배지 내에서 배양한 후 배양배지의 상등액을 회수하여 얻어진 인공피부 배양시 분비되는 배양물로서,
    콜라겐, VEGF, TGF-β, KGF, PDGF, IL, TNF-α, HGF, GM-CSF, M-CSF, PGE2, PlGF, bFGF를 포함하는 상기 배양물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 매트릭스 상에 섬유아세포 접종할 때 표피세포를 함께 접종하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인공피부 배양시 분비되는 배양물이 콜라겐 10 - 90 ㎍/ml, VEGF 2500 - 5810 pg/ml, TGF-β1 750 - 1600 pg/ml, TGF-β2 30 - 106 pg/ml, KGF 45 - 150 pg/ml, PDGF-AB 30 - 50 pg/ml, IL 30 - 93 pg/ml, TNF-α 3 - 5 pg/ml, HGF 500 - 745 pg/ml, GM-CSF 85 - 1380 pg/ml, M-CSF 1100 - 2050 pg/ml, PGE2 150 - 450 pg/ml, PlGF 101 - 720 pg/ml, bFGF 0.9 - 1.9 pg/ml를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 오픈-셀 구조를 갖는 스폰지 형태의 3차원 매트릭스의 기공크기는 100 - 250 ㎛인 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐, 키토산 및 글리코스아미노글리칸의 중량비가 68~74:18~22:6~12인 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 섬유아세포의 접종수가 메트릭스 1㎠ 당 2X105 ~ 3X105 인 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 배양배지가 표피 성장인자 및 비타민 C를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배양배지가 소태아 혈청, 페이탈클론 II 및 항생제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양배지가 TGF-α 및 섬유아세포 성장인자를 포함하는 단백질 성장인자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 배양배지가 5 - 25 중량%의 소태아 혈청, 50 - 150 IU/ml의 페니실린 지, 10 - 50 ㎍/ml의 젠타마이신, 0.1 - 1.0 ㎍/ml의 하이드로코티손, 0.05 - 0.20 IU/ml의 인슐린, 5 - 25 ㎍/ml의 표피 성장인자, 25 - 100 ㎍/ml의 비타민 C가 공급된 최소필수배지인 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  12. 삭제
  13. 제1항에 있어서, 상기 배양된 매트릭스를 세척한 후 표피세포의 접종이 이루어지는 것을 특징으로 하는 피부 노화 억제 및 개선용 화장료 조성물.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제1항 내지 제3항, 제5항 내지 11항 및 제13항 중 어느 한 항의 인공피부 배양시 분비되는 배양물을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 억제 및 개선용 약학적 조성물.
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