KR100873714B1 - Whitening composition containing xanthohumol as an effective ingredient - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 잔토휴몰 (xanthohumol)을 유효성분으로 하는 멜라닌 생성 억제 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 흑색종 세포에서 IBMX에 의해 유발된 멜라닌 색소 생성을 억제하는 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a composition for inhibiting melanin production using xanthohumol as an active ingredient, and more particularly, to a composition for inhibiting melanin production caused by IBMX in melanoma cells.
지구 환경 변화와 오존층 파괴로 현대인의 건강은 직접 간접적으로 크게 위협받고 있으며 그 중에서도 과다한 자외선 노출에 의한 질환들이 해결해야 할 숙제로 떠오르고 있다. 자외선은 피부에 직접적인 손상을 줄 수 있으며 피부 색소 침착의 주요 원인으로 작용한다. 이는 현대인의 미의 기준인 미백과 맞물려 건강은 물론이고 미용적인 측면에서도 다양한 해결 방법이 연구되고 있다. 흔하고 대표적인 피부 색소 침착 질환으로는 기미, 주근깨, 흑색점, 모반 등이 있고, 약물에 의한 색소 침착, 치유된 창상 부위에서 발견되는 염증 후 색소 침착이나 피부염의 증상으로 나타나는 과 색소 침착 등도 이에 포함된다. 이러한 색소 침착 질환은 동양인과 히스패닉 등에서 인종적으로 더 흔하며 관심의 대상이 되고 있다.The changes in the global environment and the destruction of the ozone layer threaten the human health directly and indirectly. Among them, the diseases caused by excessive UV exposure are emerging as a problem to be solved. Ultraviolet rays can damage the skin directly and act as a major cause of skin pigmentation. This is combined with whitening, the standard of modern people's beauty, and various solutions have been studied in terms of health as well as beauty. Common and common skin pigmentation disorders include blemishes, freckles, black spots, birthmarks, and the like, including pigmentation by drugs, and hyperpigmentation that occurs as a symptom of post-inflammatory pigmentation or dermatitis found in the healing wound. . Such pigmentation disorders are more common among Asians and Hispanics and are of interest.
피부 색소 침착의 치료 방법에는 일광 차단제의 사용, 국소 연고 도포, 화학적 박피술, 레이저 치료 등이 있다. 무엇보다 예방 차원에서 일광 노출을 줄이는 것이 주요 치료 목표 중 하나이다. 일광 노출은 근본 선행 원인에 상관없이 색소 침착의 악화 또는 재발의 주범이 되기 때문이다. 따라서 야외 활동 시 반드시 광범위 일광차단제 (broad spectrum sunscreen)를 사용하는 것이 피부 색소 침착을 예방하는 방법이다. 그리고 오전 10시부터 오후 4시 정도까지는 지나친 야외활동을 피하는 것도 권고 사항으로 하고 있다. Treatment methods for skin pigmentation include the use of sunscreens, topical ointment application, chemical dermabrasion, laser treatment and the like. Among other things, preventing sun exposure is one of the main treatment goals. This is because sun exposure is a major culprit of deterioration or recurrence of pigmentation, regardless of the underlying prior cause. Therefore, the use of broad spectrum sunscreens in outdoor activities is a way to prevent skin pigmentation. It is also recommended to avoid excessive outdoor activities from 10 am to 4 pm.
피부 색소 침착 치료에 이용되는 연고제로는 표백제인 하이드로퀴논, 비타민 A 연고, 국소 스테로이드 연고, 비타민 C, 글라이콜릭산, 아젤레익산 등이 있으며 일반적으로 이 중 몇 가지를 함께 사용하면서 고농도의 비타민 C를 침투시키는 전기영동치료를 정기적으로 시행하여 치료하기도 한다. Ointments used in the treatment of skin pigmentation include bleach hydroquinone, vitamin A ointment, topical steroid ointment, vitamin C, glycolic acid, and azelic acid. Electrophoresis therapy, which infiltrates C, may be performed regularly.
최근에는 TCA나 글라이콜릭 산을 이용한 박피(필링)술을 국소 치료와 병행하여 주기적으로 시행하는 방법도 많이 이용되고 있다. 하지만 현재까지 피부 색소 침착을 완벽하게 치료할 수 있는 방법은 없으며 어떤 치료 방법을 이용하더라도 쉽게 재발할 가능성이 있다. Recently, a method of periodically performing dermabrasion (pilling) using TCA or glycolic acid in combination with topical treatment is also widely used. To date, however, there is no perfect way to treat skin pigmentation, and any treatment can easily recur.
따라서 피부의 멜라닌 생성 기작을 근본적으로 이해하고 이를 바탕으로 멜라 닌 색소 생성을 억제할 수 있는 새로운 치료법의 개발이 요구된다. 즉, 멜라닌 색소는 여러 가지 자극에 의해 멜라닌세포 (melanocyte)에서 생성되고 주변의 케라틴세포 (keratinocyte)로 이 색소가 전달 및 분배되므로 피부에서 흑갈색의 색소 침착이라는 표현형으로 드러나게 된다. 따라서 멜라닌 색소 생성을 억제하는 것이 피부 색소 침착을 치료 및 예방할 수 있는 가장 근본적이고 확실한 기술적 전략이 되는 것이다. Therefore, it is necessary to fundamentally understand the melanin production mechanism of the skin and to develop a new therapeutic method that can suppress melanin production. In other words, the melanin pigment is produced in melanocytes by various stimuli, and the pigment is transferred and distributed to surrounding keratinocytes, thereby revealing a dark brown pigmentation in the skin. Therefore, inhibiting melanin pigment production is the most fundamental and sure technical strategy to treat and prevent skin pigmentation.
한편, 본 발명자들은 항 산화물질로 널리 알려진 몇몇 제재로부터 멜라닌 색소 생성을 억제하여 피부 색소 침착을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 찾고자 스크리닝하였다. 그 중 가장 강력한 효과를 보인 것이 하기 화학식을 갖는 잔토휴몰 (xanthohumol)이다. On the other hand, the present inventors screened to find a substance that can prevent or treat skin pigmentation by inhibiting the production of melanin from some of the agents widely known as antioxidants. The most powerful among them is xanthohumol having the following formula.
상기 잔토휴몰은 강력한 항산화 작용과 잠재적 효과에 대한 관심이 높아지면서 최근 주목받고 있는 물질이다. 10 년 전 미국 오레곤 주립 대학에서 홉 (hop)의 꽃으로부터 발견된 미량의 원소를 연구하던 중 항산화 효과가 있음을 알고 분리해 낸 물질이 잔토휴몰이다. Xanthohumol is a substance that has attracted much attention recently, with increasing interest in potent antioxidant activity and potential effects. Xanthohumol was discovered 10 years ago at the University of Oregon in the United States while studying trace elements found in hop flowers.
이후 잔토휴몰의 생체내 효과에 대한 많은 연구가 진행되고 있다. 즉, 잔토휴몰은 항암 효과를 지닌다는 다양한 보고가 있으며 (Colgate EC, Miranda CL, Stevens JF, Bray TM, Ho E.Xanthohumol, a prenylflavonoid derived from hops induces apoptosis and inhibits NF-kappaB activation in prostate epithelial cells.Cancer Lett. 2006,Pan L, Becker H, Gerhauser C. Xanthohumol induces apoptosis in cultured 40-16 human colon cancer cells by activation of the death receptor- and mitochondrial pathway.Mol Nutr Food Res. 2005) 백혈병, 대사 이상, 수정 능력에도 영향을 줄 수 있다고 한다. (Lust S, Vanhoecke B, Janssens A, Philippe J, Bracke M, Offner F. Xanthohumol kills B-chronic lymphocytic leukemia cells by an apoptotic mechanism.Mol Nutr Food Res. 2005, Nozawa H.Xanthohumol, the chalcone from beer hops (Humulus lupulus L.), is the ligand for farnesoid X receptor and ameliorates lipid and glucose metabolism in KK-A(y) mice. Biochem Biophys Res Commun. 2005, Hussong R, Frank N, Knauft J, Ittrich C, Owen R, Becker H, Gerhauser C. A safety study of oral xanthohumol administration and its influence on fertility in Sprague Dawley rats. Mol Nutr Food Res. 2005)Since then, much research has been conducted on the in vivo effects of xanthohumol. That is, there are various reports that xanthohumol has an anticancer effect (Colgate EC, Miranda CL, Stevens JF, Bray TM, Ho E. Xanthohumol, a prenylflavonoid derived from hops induces apoptosis and inhibits NF-kappaB activation in prostate epithelial cells. Cancer Lett. 2006, Pan L, Becker H, Gerhauser C. Xanthohumol induces apoptosis in cultured 40-16 human colon cancer cells by activation of the death receptor- and mitochondrial pathway.Mol Nutr Food Res. 2005) leukemia, metabolic abnormalities, fertilization It can also affect your ability. Lust S, Vanhoecke B, Janssens A, Philippe J, Bracke M, Offner F. Xanthohumol kills B-chronic lymphocytic leukemia cells by an apoptotic mechanism.Mol Nutr Food Res. 2005, Nozawa H.Xanthohumol, the chalcone from beer hops ( Humulus lupulus L.), is the ligand for farnesoid X receptor and ameliorates lipid and glucose metabolism in KK-A (y) mice.Biochem Biophys Res Commun. 2005, Hussong R, Frank N, Knauft J, Ittrich C, Owen R, Becker H, Gerhauser C. A safety study of oral xanthohumol administration and its influence on fertility in Sprague Dawley rats.Mol Nutr Food Res. 2005)
또한, 국내특허출원 제2006-7000366호에는 홉 또는 신선초로부터 얻어지는 분쇄물 또는 추출물을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 치료 또는 예방에 신경성장인자의 생성증강을 필요로 하는 질환의 경구 투여용 또는 정맥내 투여용 치료제 또는 예방제가 개시되어 있으며, 국내특허출원 제2007-0067256호에는 탈모 예방 및 양모 촉진용 천연 복합 조성물이, 그리고 국내특허출원 제2006-0097127호에는 아토피성 피부염, 피부 알레르기 증상 및 여드름 치료 조성물이 개시되어 있으나, 이들은 모두 유효성분 또는 재료로 호프 추출물을 포함하고 탈모 및 양모 또는 피부염 및 알레르기에 관한 내용일 뿐 멜라닌 색소 생성에 대한 잔토휴몰의 효과에 대해서는 아직까지 규명된 바가 없다.In addition, Korean Patent Application No. 2006-7000366, oral administration of a disease that requires the production of nerve growth factor for the treatment or prevention, characterized in that it contains a powder or extract obtained from hops or fresh vinegar as an active ingredient or A therapeutic or prophylactic agent for intravenous administration is disclosed, and Korean Patent Application No. 2007-0067256 discloses a natural complex composition for preventing hair loss and promotes wool, and Korean Patent Application No. 2006-0097127 discloses atopic dermatitis, skin allergy symptoms and Acne treatment compositions have been disclosed, but they all contain hop extract as an active ingredient or ingredient and are only about hair loss and wool or dermatitis and allergy, and the effect of xanthohumol on melanin production has not been elucidated yet.
이에 본 발명자들은 상술한 문제점을 감안하여, 흔한 피부 질환의 일종인 피부 색소 침착 질환(기미, 주근깨, 모반, 흑색점, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소침착 등)의 치료와 예방에 잔토휴몰의 이용 가능성을 확인하고자 연구를 계속한 결과, 잔토휴몰이 멜라닌 색소 생성 과정을 억제함으로써 피부 색소 침착 질환 치료 및 예방에 이용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다. In view of the above-described problems, the present inventors have studied and prevented the treatment and prevention of skin pigmentation diseases (such as spots, freckles, birthmarks, black spots, pigmentation by drugs, pigmentation after inflammation, etc.) which are a kind of common skin diseases. As a result of continuing the study to confirm the availability of xanthohumol, it was confirmed that Xanthohumol can be used for the treatment and prevention of skin pigmentation disease by inhibiting the melanin pigment production process, thus completing the present invention.
즉, 본 발명의 일 목적은 피부 색소 침착의 주요 기전인 멜라닌 색소의 생성 자체를 억제하는 피부 색소침착 질환의 치료제 또는 치료 보조제를 제공하려는데 있다. That is, one object of the present invention is to provide a therapeutic agent or a therapeutic agent for skin pigmentation disease that inhibits the production of melanin pigment itself, which is a main mechanism of skin pigmentation.
본 발명의 다른 목적은 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백용 미용제품을 제공하려는데 있다. Another object of the present invention is to provide a skin whitening beauty product that suppresses the production of melanin.
본 발명에 의하면, According to the invention,
하기 화학식을 갖는 잔토휴몰을 유효성분으로 하여 멜라닌 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 피부 색소침착 질환의 치료제 또는 치료 보조제, 또는 피부 미백용 미용제품을 제공한다. It provides a therapeutic or therapeutic adjuvant for skin pigmentation disease, or a beauty product for skin whitening, characterized in that xanthohumol having the following formula is used as an active ingredient to inhibit melanin production.
[화학식 1][Formula 1]
이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다. EMBODIMENT OF THE INVENTION Hereinafter, this invention is demonstrated in detail.
본 발명에서 멜라닌 생성을 억제하는 유효성분은 하기 화학식을 갖는 잔토휴몰이다. In the present invention, the active ingredient for inhibiting melanin production is xanthohumol having the following formula.
[화학식 1][Formula 1]
상기 잔토휴몰은 흑색종 세포에서 IBMX에 의해 유발된 멜라닌 색소 생성을 억제하는 것을 하기 실시예를 통해 규명하였다. 즉, 실시예를 통해 본 발명자들은 잔토휴몰이 결과적으로 색소 생산 자체를 감소시키는지 확인하고자 흑색종 세포의 멜라닌 생성을 촉진시키는 환경을 만들고 잔토휴몰을 대조군과 비교하여 멜라닌 생성을 감소시키는지 확인하였다. 뿐만 아니라 얻어진 결과를 세포 내 수준에서 확인하기 위해 관련 효소를 단백질 과 유전자 수준에서 Western blotting과 real time PCR을 통해 검증하였다. The xanthohumol was identified through the following examples to inhibit melanin pigmentation induced by IBMX in melanoma cells. In other words, the present inventors made an environment that promotes melanin production of melanoma cells to determine whether xanthohumol resulted in a reduction in pigment production itself, and confirmed whether xanthohumol reduces melanin production by comparing with the control group. . In addition, in order to confirm the results obtained at the cellular level, the relevant enzymes were verified by Western blotting and real time PCR at the protein and gene level.
구체적으로는 다음 3가지 단계로 실험하였다. Specifically, the experiment was performed in the following three steps.
첫째, 멜라닌 색소 생성 억제 효과가 있는 물질을 스크린하기 위해 흑색종 세포 배양시 각 물질들을 첨가하고 멜라닌 생성을 촉진한 후 멜라닌 생성량을 비교하였다. 이미 알려진 생체 내 효과로 미루어 멜라닌 생성에 관여할 것으로 예상되 는 생약 추출물이나 약물들이 실험에 포함되었다. 그 결과 가장 효과가 뛰어난 잔토휴몰이 최종 후보 물질로 선택되었다. First, in order to screen melanin-producing substances, the melanoma cells were cultured and melanin production was compared. Experiments included herbal extracts or drugs that were expected to be involved in melanogenesis due to known in vivo effects. As a result, the most effective xanthohumol was selected as the final candidate.
둘째, 잔토휴몰을 이용하여 흑색종 세포의 멜라닌 생성을 억제시키고, 배양 후 세포 내 특정 효소의 발현과 활성도를 측정함으로써 효과를 확인하였다. Second, xanthohumol was used to inhibit melanin production in melanoma cells, and the effect was confirmed by measuring the expression and activity of specific enzymes in the cells after culture.
셋째, 여러 가지 방법으로 멜라닌 생성을 유발시킨 뒤 잔토휴몰이 동일한 효과를 보이는지 확인하였다. 각각의 실험은 잔토휴몰의 농도와 배양 조건 등을 다양하게 변화시키며 이루어졌다.Third, after inducing melanin production in various ways, it was confirmed whether xanthohumol had the same effect. Each experiment was performed by varying the concentration of xanthohumol and culture conditions.
그 결과, 도 1 내지 5에서 확인할 수 있듯이, 육안적으로는 물론이고 정량적인 실험 결과에서도 멜라닌 색소 생성 감소를 확인할 수 있었다.As a result, as can be seen in Figures 1 to 5, the melanin pigment production reduction was confirmed not only visually but also quantitative results.
결과적으로 상기 잔토휴몰은 피부 색소침착 질환의 치료제 또는 치료 보조제, 혹은 피부미백용 미용 제품으로 각각 사용가능한 것으로, 이때 사용량은 0.001-100%로서 단독 성분으로도 유효한 효과를 얻을 수 있으며, 필요에 따라 적절히 조성물로도 제공할 수 있다. As a result, the xanthohumol can be used as a therapeutic agent or a therapeutic aid for skin pigmentation disorders, or a beauty product for skin whitening, in which the amount of use is 0.001-100%, which is effective even as a single component. It can also provide as a composition suitably.
상기 피부 색소질환 질환의 치료제 또는 치료 보조제로는 이에 한정하는 것은 아니나, 정제, 캅셀, 시럽, 건조시럽, 환제 등의 내복약, 연고, 오인트, 피부 밴드, electrotransfer 또는 미세침을 이용한 진피 및/또는 표피내 전달을 이용한 치료제 또는 치료 보조제 타입을 포함하며, 상기 피부미백용 미용 제품으로는 이에 한정하는 것은 아니나, 크림, 오일, 일광차단제, 피부세정제, 패드, 팩, 화장수, 로션, 스킨 등의 화장품 타입을 포함할 수 있다. The therapeutic agent or therapeutic aid for the skin pigment disease disease is not limited thereto, or dermis using tablets, capsules, syrups, dry syrups, pills, oral medicines, ointments, ointments, skin bands, electrotransfer or microneedle It includes a therapeutic agent or therapeutic adjuvant type using intradermal delivery, and cosmetic products such as, but not limited to, creams, oils, sunscreens, skin cleaners, pads, packs, lotions, lotions, skins, etc. It can include a type.
본 발명에 따르면, 잔토휴몰은 타이로시나아제의 발현 및 활성도를 감소시켜 결과적으로 멜라닌 색소의 생성을 억제하였으며, 피부 색소 침착 질환(기미, 주근깨, 모반, 흑색점, 약물에 의한 색소 침착, 염증 후 색소 침착 등)의 치료에 탁월한 효과를 보이는 것으로, 아직 뚜렷한 치료법이 없어 여러 가지 요법의 병행 치료가 유일한 방법이며 치료보다도 일광노출 회피 요법을 강조하는 피부 색소 침착 질환의 치료에 획기적인 치료 방법을 제공하는 바, 피부 보호 제재 및 피부 질환 치료제 산업에도 크게 기여할 기술인 것이다. According to the present invention, xanthohumol reduced the expression and activity of tyrosinase and consequently inhibited the production of melanin pigments, and skin pigmentation diseases (spots, freckles, birthmarks, black spots, pigmentation by drugs, inflammation) It is excellent in the treatment of post-pigmentation, etc., and there is no clear treatment yet, so the combination treatment of various therapies is the only way, and it provides a breakthrough treatment method for the treatment of skin pigmentation disease that emphasizes sun exposure avoidance treatment rather than the treatment. It is a technology that will greatly contribute to the skin protection agent and skin disease treatment industry.
실시예 1 : 잔토휴몰의 멜라닌 생성 억제 효과(세포내 멜라닌 함량 측정)Example 1 Inhibitory Effect of Xanthohumol on Melanogenesis (Measurement of Melanin Content in Cells)
본 실시예에서는 IBMX로 흑색종 세포의 멜라닌 생성을 유발시키고 다양한 농도의 잔토휴몰을 처리하여 각각 멜라닌 생성을 억제하는 정도를 배양 후 세포내 멜라닌 함량을 비교하여 측정하였다. In this example, the melanin production of melanoma cells was induced with IBMX, and treatment of various concentrations of xanthohumol to inhibit melanin production was measured by comparing intracellular melanin content after incubation.
멜라닌 함량을 측정하기 위하여 배양 후 흑색종 세포는 생리식염수로 세척한 뒤 Lysis Buffer로 용해시킨 뒤, 20% TCA로 처리하였다. 다시 에탄올과 에테르를 처리하고 공기 중에서 건조시킨 후, 0.85 M 수산화칼륨으로 녹여서 15 분간 가열하였다. After measuring the melanin content, melanoma cells were washed with physiological saline, lysed with Lysis Buffer, and treated with 20% TCA. Ethanol and ether were treated again, dried in air, and dissolved in 0.85 M potassium hydroxide and heated for 15 minutes.
냉각 후 440 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 함량/세포 비교를 위해 DNA의 양을 bisbenzimide를 이용한 fluorescence 측정법으로 측정하였다. Absorbance was measured at 440 nm after cooling. For melanin content / cell comparison, the amount of DNA was measured by fluorescence assay using bisbenzimide.
이후 잔토휴몰을 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에서 DNA에 대한 멜라닌 의 함량을 비교하였다. 약물 처리 후 세포는 2 일 동안 배양하였고, 잔토휴몰의 농도는 도에 기재된 바와 같이 다양한 농도로 처리하였으며, IBMX는 0.1 mM, α-MSH와 Forskolin은 5 μM의 농도로 처리하였다. Then, the melanin content of DNA was compared in the xanthohumol treated group and the untreated control group. After drug treatment, the cells were incubated for 2 days, and the concentration of xanthohumol was treated at various concentrations as described in the figure, and the treatment with IBMX at 0.1 mM, α-MSH and Forskolin at 5 μM.
그 결과 도 1에서 보듯이, 잔토휴몰은 농도에 의존적으로 세포내 멜라닌 함량을 감소시켰으며, 이 결과는 멜라민 생성을 유발하는 여러 가지 약물에 있어서도 동일한 경향을 보여주었다. As a result, as shown in Fig. 1, xanthohumol reduced the intracellular melanin content in a concentration-dependent manner, and the results showed the same tendency in various drugs inducing melamine production.
실시예Example 2 : 세포 독성 실험 2: cytotoxicity experiment
잔토휴몰이 세포에 독성을 지니는지 여부를 조사하고자 MTT assay를 이용하였다. 배양 후 세포에 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)를 처리한 후, 이 물질이 formazan으로 환원되어진 양을 측정하면, 대사능력이 정상, 즉 살아있는 세포의 상대적인 수를 가늠할 수 있다. MTT 처리 후 약 30분간 섭씨 37도에서 배양하였다가 DMSO로 formazan성분을 추출해 내고 570 nm에서 분광광도계로 흡광도를 측정하였다. MTT assay was used to investigate whether xanthohumol is toxic to cells. After culturing cells treated with 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and measuring the amount of this substance reduced to formazan, metabolism is normal, i.e. The relative number of living cells can be estimated. After MTT treatment, the inmazan was extracted with DMSO for about 30 minutes at 37 ° C, and the absorbance was measured at 570 nm using a spectrophotometer.
그 결과, 0.5 - 2.5 μM의 농도로 잔토휴몰을 처리하였을 때는 처리하지 않은 군과 비교하였을 때 동일하거나 높은 세포 생존율을 보였으며, 5 μM까지 농도를 올려야 약 7.4%의 세포 생존율이 감소하였다. 이는 잔토휴몰의 세포독성이 크지 않고 안전성 높은 물질임을 의미한다.As a result, when treated with xanthohumol at a concentration of 0.5-2.5 μM, the cell survival rate was the same or higher than that of the non-treated group, and the cell survival rate of about 7.4% was decreased by increasing the concentration up to 5 μM. This means that the cytotoxicity of xanthohumol is not high and is a safe substance.
도 1에서 보듯이, 잔토휴몰의 농도가 2.5 μM까지도 세포 독성을 보이지 않고 있어 세포 및 생체에 안전성을 지니는 물질임을 추정할 수 있다. As shown in Figure 1, the concentration of xanthohumol up to 2.5 μM does not show cytotoxicity, it can be estimated that the material having safety in cells and living organisms.
실시예Example 3 : 3: 타이로시나아제Tyrosinase 활성도에 대한 For activity 잔토휴몰의Xanthohumol 억제 효과 측정 Inhibitory effect measurement
본 실시예에서 타이로시나아제의 활성도는 DOPA oxidase의 활성도로 측정하였다. In this example, the activity of tyrosinase was measured by the activity of DOPA oxidase.
세포의 용해 결과물을 얻은 후 반응액을 처리하고 DOPA가 DOPAchrome으로 산화되는 반응을 475 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)로 측정하였다. 이때 반응액에는 기질용액 (0.1 % L-DOPA in 0.1 M sodium phosphate, pH 6.0)과 효소 용액이 포함된 것을 사용하였다. 각각의 활성도 결과는 실시예 1에서 기술한 DNA 측정법에 의해 얻은 DNA 양으로 보정하였다.After obtaining the lysate of the cells, the reaction solution was treated and the reaction of DOPA oxidized to DOPAchrome was measured by a spectrophotometer at 475 nm. In this case, a substrate solution (0.1% L-DOPA in 0.1 M sodium phosphate, pH 6.0) and an enzyme solution were used as the reaction solution. Each activity result was corrected with the amount of DNA obtained by the DNA assay described in Example 1.
그 결과 도 2에서 보듯이, 잔토휴몰이 타이로시나아제의 활성도를 농도 의존적인 방식으로 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다. As a result, as shown in Figure 2, it was confirmed that xanthohumol significantly reduced the activity of tyrosinase in a concentration-dependent manner.
실시예Example 4 : 4 : 잔토휴몰에In Xantho 의한 by 타이로시나아제의Tyrosinase 단백질 발현 감소 Reduced protein expression
세포로부터 단백질을 추출하고 SDS-PAGE를 이용하여 Western blotting을 시행하였다. Proteins were extracted from the cells and Western blotting was performed using SDS-PAGE.
Goat anti-murine tyrosinase IgG (Santa-Cruz Biotechnology Inc.)를 사용하였고, chemi-illuminant system으로 발색하여 타이로시나아제의 단백질 발현양을 측정하였다. Goat anti-murine tyrosinase IgG (Santa-Cruz Biotechnology Inc.) was used and the protein expression level of tyrosinase was measured by color development with chemi-illuminant system.
도 3 에서 보듯이, 잔토휴몰은 앞선 실시예 1 및 2의 결과와 마찬가지로 농도 의존적인 방식으로 타이로시나아제의 단백질 발현을 감소시켰다. 이는 잔토휴몰이 타이로시나아제의 활성을 직접 억제하는 것이 아니고 단백질 수준에서 그 발현양을 조절한다는 걸 의미하기도 하는 것이다. As shown in FIG. 3, xanthohumol reduced protein expression of tyrosinase in a concentration dependent manner as in the previous Examples 1 and 2. This means that xanthohumol does not directly inhibit tyrosinase activity but rather regulates its expression at the protein level.
실시예Example 5 : 5: 잔토휴몰에In Xantho 의한 by 타이로시나아제의Tyrosinase 유전자( gene( mRNAmRNA ) 발현 감소Reduced expression
세포로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 합성한 후, semiquantitative real-time PCR 로 멜라닌 색소 생성과 관련된 유전자인 Trp1, Trp2, MITF의 상대적 양을 유전자 수준에서 조사하였다. After extracting mRNA from the cells, synthesizing cDNA, the relative amounts of Trp1, Trp2, and MITF genes related to melanin pigment production were examined at the gene level by semiquantitative real-time PCR.
도 4에서 보듯이 잔토휴몰의 농도가 높을수록 타이로시나아제와 더불어 멜라닌 색소 생성과 관련된 유전자인 Trp1, Trp2, MITF의 mRNA의 상대적 값이 낮아짐을 보여주며 동시에 나머지 관련 유전자들도 잔토휴몰에 의해 mRNA 수준이 낮아짐을 보여준다. As shown in FIG. 4, the higher the concentration of xanthohumol, the lower the relative values of mRNAs of Trp1, Trp2, and MITF, which are genes related to melanin production in addition to tyrosinase, and the other related genes are also reduced by xanthohumol. mRNA levels are lowered.
실시예Example 6 : 다양한 색소 침착 유도 방법에서의 6: in various pigmentation induction methods 잔토휴몰Xantho Holiday 효과 검증 Effect verification
본 실시예는 실시예 1에서와 동일하게 진행되었고, 자외선 효과를 모방하기 위한 방법으로 다양한 물질을 이용하였다. IBMX, α-MSH, Forskolin으로 흑색종 세포의 멜라닌 생성을 유발시키고 다양한 농도의 잔토휴몰을 처리하여 각각 멜라닌 생성을 억제하는 정도를 배양 후 세포내 멜라닌 함량을 비교하여 측정하였다. The present embodiment was performed in the same manner as in Example 1, and various materials were used as a method for mimicking the ultraviolet effect. The melanin production of melanoma cells with IBMX, α-MSH, and Forskolin was induced and treated with various concentrations of xanthohumol to inhibit melanin production, respectively.
멜라닌 함량을 측정하기 위하여 배양 후 흑색종 세포는 생리식염수로 세척한 뒤 Lysis Buffer로 용해시킨 뒤, 20% TCA로 처리하였다. 다시 에탄올과 에테르를 처리하고 공기 중에서 건조시킨 후, 0.85 M 수산화칼륨으로 녹여서 15 분간 가열하였다. After measuring the melanin content, melanoma cells were washed with physiological saline, lysed with Lysis Buffer, and treated with 20% TCA. Ethanol and ether were treated again, dried in air, and dissolved in 0.85 M potassium hydroxide and heated for 15 minutes.
냉각 후 440 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 함량/세포 비교를 위해 DNA의 양을 bisbenzimide를 이용한 fluorescence 측정법으로 측정하였다. 이후 잔토휴몰을 처리한 군과 처리하지 않은 대조군에서 DNA에 대한 멜라닌의 함량을 비교하였다. 약물 처리 후 세포는 2 일 동안 배양하였고, IBMX는 0.1 mM, α-MSH와 Forskolin은 5 μM의 농도로 처리하였다. Absorbance was measured at 440 nm after cooling. For melanin content / cell comparison, the amount of DNA was measured by fluorescence assay using bisbenzimide. Then, the melanin content of DNA was compared in the xanthohumol treated group and the untreated control group. After drug treatment, the cells were incubated for 2 days, and the concentration was 0.1 mM for IBMX and 5 μM for α-MSH and Forskolin.
도 5에서 알 수 있듯이, 자외선의 효과를 모방하기 위해 각각 IBMX, α-MSH, Forskolin으로 멜라닌 생성을 유발한 경우 잔토휴몰의 색소 생성 억제 효과를 측정하였을 경우, 육안적으로 세포의 멜라닌 생성량이 잔토휴몰에 의해 감소함을 보여준다. 또 이 효과는 IBMX를 이용한 도 1에서와 마찬가지로 나머지 두 가지 다른 방법에 의해 멜라닌 생성이 촉진된 경우에서도 잔토휴몰이 멜라닌 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있다. As can be seen in Figure 5, in the case of melanin production induced by IBMX, α-MSH, Forskolin to mimic the effect of ultraviolet rays, respectively, when measuring the inhibitory effect of pigment production of xanthohumol, the amount of melanin produced by the cells visually Decrease by hum. In addition, as shown in FIG. 1 using IBMX, xanthohumol effectively inhibits melanin production even when melanin production is promoted by the other two different methods.
본 발명은 아직 뚜렷한 치료법이 없어 여러 가지 요법의 병행 치료가 유일한 방법이며 치료보다도 일광노출 회피 요법을 강조하는 피부 색소 침착 질환의 치료에 획기적인 치료 방법을 제공함으로써 피부 보호 제재 및 피부 질환 치료제 산업에도 크게 기여할 기술이다. The present invention does not have a clear treatment yet, so the combination treatment of various therapies is the only method, and it provides a breakthrough treatment method for the treatment of skin pigmentation disease, which emphasizes sun exposure avoidance treatment, rather than the treatment, thereby greatly affecting the skin protection agent and skin disease treatment industry. This is a skill to contribute.
도 1 은 흑색종 세포(B16 melanoma cell)에서 IBMX를 처리하여 멜라닌 색소 생성을 유발시키고, 이때 본 발명의 일 실시예에 의한 잔토휴몰 (xanthohumol)을 처리하여 멜라닌 색소 생성을 억제하는지 측정한 결과를 도시한 도면으로서, 상단부 사진은 배양한 세포의 색깔을 통해 육안적으로 멜라닌 생성 정도를 비교한 사진이고, 하단부 막대그래프는 생존한 유전자 총량에 대한 멜라닌 함량의 비로서 상대적인 멜라닌 생성을 비교하여 보이는 결과이다. Figure 1 is a melanoma cells (B16 melanoma cell) treatment by inducing melanin pigment production by the treatment of melanin, wherein xanthohumol (Xanthohumol) treatment according to an embodiment of the present invention to determine whether the melanin pigment production is measured As shown in the figure, the upper part photograph is a photograph comparing the melanin production degree visually through the color of cultured cells, and the lower bar graph shows the result of comparing the relative melanin production as the ratio of melanin content to the total amount of surviving genes. to be.
도 2 는 본 발명의 일 실시예에 의한 잔토휴몰이 멜라닌 생성에 중심적인 역할을 하는 효소인 타이로시나아제(tyrosinase) 활성에 미치는 영향, 즉 세포에서의 활성도를 측정한 그래프로서 잔토휴몰에 의해 농도 의존적으로 타이로시나아제의 활성도가 감소함을 보여준다. FIG. 2 is a graph illustrating the effect of xanthohumol according to an embodiment of the present invention on tyrosinase activity, an enzyme that plays a central role in melanin production, ie, cell activity. It is shown that the activity of tyrosinase decreases in a concentration dependent manner.
도 3은 타이로시나아제 및 이 효소의 발현을 조절하는 중요한 전사인자인 MITF의 발현 정도를 Western blotting 측정 결과를 도시한 도면으로서, 잔토휴몰에 의해 농도 의존적으로 감소함을 보여준다. FIG. 3 shows Western blotting measurement results of the expression level of tyrosinase and MITF, an important transcription factor that regulates the expression of this enzyme, and shows a concentration-dependent decrease by xanthohumol.
도 4는 타이로시나아제와 더불어 멜라닌 색소 생성과 관련된 유전자인 Trp1, Trp2, MITF의 mRNA를 상대적인 양으로 보여주는 RT-PCR 결과를 도시한 도면 및 그래프로서, 단백질과 마찬가지로 잔토휴몰의 농도가 높을수록 타이로시나아제 mRNA의 상대적 값이 낮아짐을 보여주며 동시에 나머지 관련 유전자들도 잔토휴몰에 의해 mRNA 수준이 낮아짐을 보여준다. FIG. 4 is a graph and a graph showing RT-PCR results showing the relative amounts of mRNAs of Trp1, Trp2, and MITF, which are genes related to melanin production, together with tyrosinase. As the protein concentration is higher, It shows that the relative value of tyrosinase mRNA is lowered, and at the same time, the other related genes are also lowered in mRNA level by xanthohumol.
도 5는 자외선의 효과를 모방하기 위해 각각 IBMX, α-MSH, Forskolin으로 멜라닌 생성을 유발한 경우 잔토휴몰의 색소 생성 억제 효과를 측정한 도면으로서, 육안적으로 세포의 멜라닌 생성량이 잔토휴몰에 의해 감소함을 보여준다. 또 이 효과는 IBMX를 이용한 도 1에서와 마찬가지로 나머지 두 가지 다른 방법에 의해 멜라닌 생성이 촉진된 경우에서도 잔토휴몰이 멜라닌 생성을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.Figure 5 is a measure of the pigment inhibitory effect of xanthohumol when melanin production was induced with IBMX, α-MSH, and Forskolin to mimic the effects of ultraviolet rays, respectively. Shows a decrease. In addition, as shown in FIG. 1 using IBMX, xanthohumol effectively inhibits melanin production even when melanin production is promoted by the other two different methods.
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| WO2010044076A2 (en) * | 2008-10-16 | 2010-04-22 | Sederma | Cosmetic and topical use of xanthohumol including brightening skin complexion and reducing cutaneous redness |
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- 2008-02-01 KR KR1020080010498A patent/KR100873714B1/en not_active IP Right Cessation
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