KR100873168B1 - Salmonella Mutants Deleted lon Gene and/or cpxR Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof - Google Patents
Salmonella Mutants Deleted lon Gene and/or cpxR Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof Download PDFInfo
- Publication number
- KR100873168B1 KR100873168B1 KR1020070022620A KR20070022620A KR100873168B1 KR 100873168 B1 KR100873168 B1 KR 100873168B1 KR 1020070022620 A KR1020070022620 A KR 1020070022620A KR 20070022620 A KR20070022620 A KR 20070022620A KR 100873168 B1 KR100873168 B1 KR 100873168B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gene
- dna
- seq
- salmonella
- salmonella typhimurium
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
- A61K39/0275—Salmonella
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/255—Salmonella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명은 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자가 결실된 살모넬라 변이균주, 그 제조방법 및 상기 변이균주를 함유하는 약독화된 살모넬라 백신조성물에 관한 것이다.The present invention relates to Salmonella mutant strains, in which the lon gene and / or the cpxR gene are deleted, a method for preparing the same, and an attenuated Salmonella vaccine composition containing the mutant strains.
본 발명에 따른 약독화된 살모넬라 생백신은 생산 및 보관이 용이하여 경제적이며, 가축에 투여 시, 안전하고 효율적으로 살모넬라 감염을 예방할 수 있다. The live attenuated Salmonella vaccine according to the present invention is economical because it is easy to produce and store, and when administered to livestock, it can safely and efficiently prevent Salmonella infection.
살모넬라, 생백신, 약독화, 변이균주 Salmonella, live vaccine, attenuation, mutant strain
Description
도 1은 살모넬라 염색체 DNA에서 lon유전자 및/또는 cpxR 유전자를 결손시키는 과정을 나타낸 모식도이다.1 shows the lon gene and / or cpxR in Salmonella chromosomal DNA It is a schematic diagram showing the process of gene deletion.
도 2는 본 발명에서 사용한 자살벡터인 pMEG375의 계열지도를 나타낸 것이다. Figure 2 shows a sequence map of the suicide vector pMEG375 used in the present invention.
도 3은 본 발명에 따른 돌연변이주와 살모넬라 타이피무리움(S. typhimurium) 야생균주의 성장곡선을 나타낸 것이다.Figure 3 shows the growth curve of the mutant strain and Salmonella typhimurium wild strain according to the present invention.
도 4는 본 발명에 따른 돌연변이주와 야생균주의 투과 전자현미경 사진을 나타낸 것이다.Figure 4 shows a transmission electron micrograph of the mutant and wild strains according to the present invention.
본 발명은 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자가 결실된 살모넬라 변이균주, 그 제조방법 및 상기 변이균주를 함유하는 약독화된 살모넬라 백신조성물에 관한 것이다.The present invention relates to Salmonella mutant strains, in which the lon gene and / or the cpxR gene are deleted, a method for preparing the same, and an attenuated Salmonella vaccine composition containing the mutant strains.
살모넬라(Salmonella)는 그람 음성의 통성 혐기성 세균으로, 주로 구강을 통해 숙주내로 들어오며, 이들은 포유동물, 조류, 파충류, 각종 애완동물, 가축 등에 감염하여 위염, 설사, 패혈증 등의 질병을 일으킨다. 뿐만 아니라 살모넬라는 사람에게도 감염하여 위염, 장티푸스 등의 심각한 질병을 일으키기도 하며, 특히 살모넬라 타이피무리엄(Salmonella typhimurium)은 사람에게 가장 빈번히 감염을 일으키는 살모넬라 혈청형(serotype)이다. 살모넬라 감염은 주로 살모넬라균이 함유된 유제품, 계란, 육류 등 가축 유래의 식품이나 가축들의 분뇨에 의해 오염된 물을 통하여 발생하며, 식품을 통하여 살모넬라 감염이 이루어지면 48시간 이내에 위염이 발생한다. 살모넬라 감염은 위생시설이 현대화되어있는 선진국에서도 일 년에 약 1,400,000 건이 발생하고 있는 것으로 추정되어, 이에 대한 백신이 계속적으로 계발되고 있다. Salmonella (Salmonella) is a facultative anaerobic gram-negative bacteria of, comes mainly into a host example through the mouth, infection by these mammals, birds, reptiles, and various pet animals or the like leads to diseases such as gastritis, diarrhea and sepsis. Salmonella also infects humans and causes serious diseases such as gastritis and typhoid fever. In particular, Salmonella typhimurium is the Salmonella serotype that most frequently infects humans. Salmonella infection is mainly caused by food products derived from livestock such as dairy products, eggs, and meat containing salmonella, or water contaminated with manure from livestock, and gastritis develops within 48 hours when salmonella infection occurs through food. Salmonella infections are estimated to occur approximately 1,400,000 a year in developed countries with modernized sanitation facilities, and vaccines continue to be developed.
일반적으로 사용되는 병원성 세균의 백신은 소단위(subunit) 백신이거나 사균 백신을 많이 사용하고 있으나, 이들은 제조가 번거로울 뿐만 아니라 보관에도 많은 문제점이 있다. 따라서, 살모넬라의 병원성 유발에 관여하는 유전자들 중 일부를 분자 미생물학적 기법으로 살모넬라의 염색체에서 결실시키면 특별한 질병을 일으키지 않는 비병원성 세균인 약독화 살모넬라 생백신(recombinant attenuated Salmonella live vaccine)으로 전환되며, 이들을 가축 등에 경구투여하면 생백신이 체내에서 항원으로 작용하여 면역반응을 유도하게 되며, 병원성의 살모넬라 감염 시, 생백신에 유도된 면역체계로서 방어하게 된다. 생백신은 동결건조와 같은 방법으로 손쉽게 보관할 수 있고, 또한 배양에 의하여 쉽게 균체를 얻을 수 있기 때문에 모든 면에서 경제적이다. 또한, 생백신은 외부 항원 운반 체계의 도입에 기인하여 살모넬라 이외의 다른 병원성 균주들에 대한 면역을 유도할 가능성이 있다. Generally used pathogenic bacterial vaccines are subunit vaccines or use a lot of bacteriostatic vaccines, but they are cumbersome to manufacture and have many problems in storage. Thus, the deletion of some of the genes involved in the pathogenic induction of Salmonella from the chromosomes of Salmonella by molecular microbiological techniques converts them into the acombinant attenuated Salmonella live vaccine, a non-pathogenic bacterium that does not cause special diseases. When administered orally to the back, the live vaccine acts as an antigen in the body to induce an immune response, pathogenic Salmonella Infection, the immune system is induced by live vaccines to defend. The live vaccine can be easily stored in the same way as lyophilization and is economical in all respects because the cells can be easily obtained by culturing. In addition, live vaccines are likely to induce immunity against pathogenic strains other than Salmonella due to the introduction of an external antigen transport system.
전 세계적으로 생물산업의 활성화에 따라 여러 회사 또는 국가들이 이러한 생백신을 확보하기 위하여 노력하고 있으며, WTO의 개방에 따른 기술력 확보, 국가 경쟁력 강화 및 농촌의 소득 증대를 위하여 유용한 살모넬라 백신을 상품화하는 것이 우리 농촌이 당면한 시급한 과제라 할 수 있다. With the vitalization of the bio-industry all over the world, several companies or countries are working to secure such live vaccines, and commercializing Salmonella vaccines useful for securing technological power, opening national competitiveness, and increasing rural incomes through the opening of the WTO is our goal. This is an urgent task facing rural areas.
이에, 본 발명자들은 효과적인 살모넬라 생백신을 제조하기 위하여 예의 노력한 결과, 살모넬라 타이피무리엄균의 염색체에서 병원성을 유발하는 유전자인 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자를 결실시켜 살모넬라 변이균주를 제조하고, 상기 살모넬라 변이균주를 마우스에 투여한 경우, 약독화되어 반치사량이 높아지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.Accordingly, the present inventors have made intensive efforts to produce effective Salmonella live vaccine, and as a result, the Salmonella mutant strain is prepared by deleting the lon gene and / or the cpxR gene, which is a gene causing pathogenicity in the chromosome of Salmonella typhimurium, and the Salmonella mutation. When the strain was administered to mice, it was confirmed that the attenuated amount increased by attenuation, thereby completing the present invention.
결국, 본 발명의 주된 목적은 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 살모넬라 타이피무리엄 변이균주의 제조방법을 제공하는데 있다.After all, the main object of the present invention is to provide a method for producing Salmonella typhimurium mutant strains characterized by the deletion of the lon gene and / or cpxR gene.
본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 제공하는데 있다.Another object of the present invention to provide a Salmonella typhimurium mutant strain prepared by the above method.
본 발명의 또다른 목적은 상기 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 함유하는 약독화된 살모넬라 백신조성물을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide an attenuated Salmonella vaccine composition containing the Salmonella typhimurium mutant strain.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 살모넬라 타이피무리엄(Salmonella typhimurium) 균주의 염색체 DNA에서 lon 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 살모넬라 생백신의 제조방법을 제공한다.In order to achieve the above object, the present invention provides a method for producing a live Salmonella vaccine, characterized in that to delete the lon gene from the chromosomal DNA of Salmonella typhimurium strain.
본 발명에 있어서, (a) 살모넬라 타이피무리엄 균주의 염색체에서 lon 유전자의 5'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 증폭시키고, lon 유전자의 3'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 각각 증폭시켜 수득하는 단계; (b) 상기 수득된 각 DNA 단편을 라이게이션시키고, 자살벡터(suicide vector)에 삽입하여, lon 유전자의 5'-말단에 연결되는 DNA 단편과 3'-말단에 연결되는 DNA 단편이 결합된 DNA를 함유하는 자살벡터를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 자살벡터를 살모넬라 타이피무리엄 균주의 염색체 DNA에 접합시킨 다음, lon 유전자가 결실된 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, (a) the DNA fragment located at the 5'-end of the lon gene in the chromosome of the Salmonella typhimurium strain is amplified using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and the 3'- of the lon gene Amplifying the DNA fragments located at the ends by using primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively; (b) ligating each obtained DNA fragment and inserting it into a suicide vector to bind the DNA fragment linked to the 5'-end of the lon gene and the DNA fragment linked to the 3'-end; Preparing a suicide vector containing; And (c) conjugating the suicide vector to the chromosomal DNA of the Salmonella typhimurium strain, and then, selecting the Salmonella typhimurium mutant strain from which the lon gene is deleted.
본 발명은 또한, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 수득된 살모넬라 타이피무리엄 균주 유래 lon 유전자의 5'-말단에 위치한 DNA 단편과, 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 수득된 살모넬라 타이피무리엄 균주 유래 lon 유전자의 3'-말단에 위치한 DNA 단편이 결합된 DNA를 함유하는 벡터를 제공한다.The present invention also provides DNA fragments located at the 5'-end of the lon gene derived from Salmonella typhimurium strain obtained by amplification by PCR using primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 A vector containing DNAs to which DNA fragments located at the 3'-terminus of a lon gene derived from a Salmonella typhimurium strain obtained by amplification by PCR using a primer of the present invention is provided.
삭제delete
본 발명은 또한, 살모넬라 타이피무리엄 균주의 염색체 DNA에서 lon 유전자가 결실되어 있는 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 제공한다.The present invention also provides a Salmonella typhimurium mutant strain in which the lon gene is deleted from the chromosomal DNA of a Salmonella typhimurium strain.
삭제delete
삭제delete
삭제delete
본 발명은 또한, 살모넬라 타이피무리엄 균주의 염색체 DNA에서 lon 유전자 및 cpxR 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 살모넬라 타이피무리엄 변이균주의 제조방법을 제공한다.The present invention also provides a method for producing Salmonella typhimurium mutant strain, characterized in that the lon gene and cpxR gene deletion in the chromosomal DNA of Salmonella typhimurium strain.
본 발명에 있어서, (a) 살모넬라 타이피무리엄 균주의 염색체에서 lon 유전자의 5'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 증폭시키고, lon 유전자의 3'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 각각 증폭시켜 수득하는 단계; (b) 상기 수득된 lon 유전자의 각 DNA 단편을 라이게이션시키고, 자살벡터(suicide vector)에 삽입하여, lon 유전자의 5'-말단에 연결되는 DNA 단편과 3'-말단에 연결되는 DNA 단편이 결합된 DNA를 함유하는 자살벡터를 제조하는 단계; 및 (c) 살모넬라 타이피무리엄 균주의 염색체에서 cpxR 유전자의 5'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 증폭시키고, cpxR 유전자의 3'-말단에 위치한 DNA 단편을 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 각각 증폭시켜 수득하는 단계; (d) 상기 수득된 cpxR 유전자의 각 DNA 단편을 라이게이션시키고, 자살벡터(suicide vector)에 삽입하여, cpxR 유전자의 5'-말단에 연결되는 DNA 단편과 3'-말단에 연결되는 DNA 단편이 결합된 DNA를 함유하는 자살벡터를 제조하는 단계; 및 (e) 상기 lon 유전자의 5'-말단에 연결되는 DNA 단편과 3'-말단에 연결되는 DNA 단편이 결합된 DNA를 함유하는 자살벡터 및 상기 cpxR 유전자의 5'-말단에 연결되는 DNA 단편과 3'-말단에 연결되는 DNA 단편이 결합된 DNA를 함유하는 자살벡터를 살모넬라 타이피무리엄 균주의 염색체 DNA에 접합시킨 다음, lon 유전자 및 cpxR 유전자가 결실된 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.In the present invention, (a) the DNA fragment located at the 5'-end of the lon gene in the chromosome of the Salmonella typhimurium strain is amplified using the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, and the 3'- of the lon gene Amplifying the DNA fragments located at the ends by using primers of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively; (b) ligating each DNA fragment of the obtained lon gene and inserting it into a suicide vector, wherein the DNA fragment linked to the 5'-end of the lon gene and the DNA fragment linked to the 3'-end are Preparing a suicide vector containing bound DNA; And (c) amplifying the DNA fragment located at the 5'-end of the cpxR gene in the chromosome of the Salmonella typhimurium strain using primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, and DNA located at the 3'-end of the cpxR gene. Obtaining by amplifying the fragments using primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, respectively; (d) ligating each DNA fragment of the obtained cpxR gene and inserting it into a suicide vector so that a DNA fragment linked to the 5'-end and a DNA fragment linked to the 3'-end of the cpxR gene are Preparing a suicide vector containing bound DNA; And (e) a suicide vector containing a DNA fragment linked to the 5'-end of the lon gene and a DNA fragment linked to the 3'-end, and a DNA fragment linked to the 5'-end of the cpxR gene. And a suicide vector containing DNA bound to the 3'-terminus of the DNA fragment is conjugated to chromosomal DNA of a Salmonella typhimurium strain, and then a Salmonella typhimurium mutant strain lacking the lon gene and the cpxR gene. It may be characterized in that it comprises the step of screening.
본 발명은 또한, 살모넬라 타이피무리엄의 염색체 DNA에서 lon 유전자 및 cpxR 유전자가 결실된 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 제공한다.The present invention also provides a Salmonella typhimurium mutant strain in which lon gene and cpxR gene are deleted from chromosomal DNA of Salmonella typhimurium.
삭제delete
본 발명은 상기 살모넬라 타이피무리엄 변이균주 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약독화된 살모넬라 백신 조성물을 제공한다.The present invention provides an attenuated Salmonella vaccine composition containing the Salmonella typhimurium mutant strain and a pharmaceutically acceptable carrier.
본 발명의 일 양태는 살모넬라 타이피무리엄의 염색체에서 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자가 결실된 변이균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 변이균주에 관한 것이다.One aspect of the present invention relates to a method for producing a mutant strain having a lon gene and / or a cpxR gene deleted from a chromosome of Salmonella typhimurium, and a mutant strain prepared by the above method.
본 발명의 실시예에서는 살모넬라 타이피무리엄(S. typhimurium) 균주의 염색체에서 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자를 결실시켜 변이균주를 제조하였으나, 살모넬라 타이피(S. typhi), 살모넬라 파라타이피(S. paratyphi), 살모넬라 센다이(S. sendai), 살모넬라 갈리나리움(S. gallinarium), 살모넬라 엔테리티디스(S. enteritidis) 등의 살모넬라 속 균에서 질병유발 유전자인 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자를 결실시켜도 약독화된 살모넬라 균주를 얻을 수 있다는 것은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 자명한 것이다.In the embodiment of the present invention, the mutant strain was prepared by deleting the lon gene and / or cpxR gene in the chromosome of S. typhimurium strain, but Salmonella typhi ( S. typhi ), Salmonella paratypy ( S. paratyphi), Sendai Salmonella (S. sendai), Salmonella Galina Leeum (S. gallinarium), Salmonella Entebbe utility disk (S. enteritidis) deletion of disease-causing genes in Salmonella spp lon gene and / or genes such as cpxR It is obvious to those of ordinary skill in the art that attenuated Salmonella strains can be obtained.
본 발명은 다른 양태로, 상기 살모넬라 타이피무리엄 변이균주 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 약독화된 살모넬라 백신 조성물에 관한 것이다.In another aspect, the present invention relates to an attenuated Salmonella vaccine composition containing said Salmonella typhimurium mutant strain and a pharmaceutically acceptable carrier.
상기 백신 조성물은 가축에 경구투여 하기 위하여, 친액성 형태 예를 들면, 캡슐 형태로 제공되는 것이 유용하며, 이러한 캡슐은 예를 들면, Eudragate S eudaragete L 셀룰로오즈 아세테이트, 셀룰로오즈 프탈레이트 또는 히드록시 프로필메틸 셀룰로오즈를 포함하는 포장용 피복일 수 있다. 상기 캡슐류는 그 자체로 사용하거나 투여하기 전에 현탁하여 친액성 물질을 재조성하여 사용할 수도 있다. 또는, 상기 백신 조성물을 동결건조하여 보관하다가 백신 투여가 필요한 시기에 적당량의 물에 희석한 후 경구투여하면 된다. 살모넬라는 위산에 대한 내성이 있기 때문에 다른 조치가 필요하지 않다. 상기 백신조성물의 투여량은 약독화된 살모넬라 변이균주의 균체 수를 기준으로 가축 10 kg 당 103~109으로 투여하는 것이 바람직하다.The vaccine composition is advantageously provided in a lyophilic form, for example in the form of a capsule, for oral administration to livestock, such capsules for example Eudragate S eudaragete L cellulose acetate, cellulose phthalate or hydroxy propylmethyl cellulose. It may be a packaging coating containing. The capsules may be used by themselves or suspended prior to administration to reconstitute the lyophilic material. Alternatively, the vaccine composition may be stored by lyophilization, diluted with an appropriate amount of water when the vaccine is required, and then orally administered. Salmonella is resistant to stomach acid, so no action is required. The dose of the vaccine composition is preferably administered in 10 3 ~ 10 9 per 10 kg livestock based on the number of cells of the attenuated Salmonella mutant strains.
본 발명에서 lon 유전자 또는 cpxR 유전자의 "5'- 및 3'-말단에 연결된 DNA 단편"이란 살모넬라 균주의 염색체 상에서 lon 유전자 또는 cpxR 유전자의 양 말단과 연결되어 위치하는 DNA의 단편을 의미한다. Lon in the present invention Gene or cpxR DNA fragments linked to the "5'- and 3'-ends" of a gene are lons on the chromosome of Salmonella strain Gene or cpxR Refers to a fragment of DNA located in connection with both ends of the gene.
본 발명에서 "유전자의 결실"은 유전자 중의 하나 이상의 염기가 제거되는 것으로, 해당 유전자가 코딩하는 단백질의 활성이 불활성화되거나, 해당 유전자가 코딩하는 단백질이 합성되지 않는 것을 의미한다.In the present invention, "deletion of a gene" means that one or more bases in a gene are removed, meaning that the activity of the protein encoded by the gene is inactivated or the protein encoded by the gene is not synthesized.
본 발명에서, “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. In the present invention, "vector" refers to a DNA preparation containing a DNA sequence operably linked to a suitable regulatory sequence capable of expressing DNA in a suitable host. The vector may be a plasmid, phage particles, or simply a potential genomic insert. Once transformed into the appropriate host, the vector can replicate and function independently of the host genome, or in some cases can be integrated into the genome itself. Since plasmids are currently the most commonly used form of vectors, "plasmids" and "vectors" are sometimes used interchangeably in the context of the present invention. For the purposes of the present invention, it is preferred to use plasmid vectors. Typical plasmid vectors that can be used for this purpose include (a) a replication initiation point that allows for efficient replication to include hundreds of plasmid vectors per host cell, and (b) host cells transformed with the plasmid vector. It has a structure comprising an antibiotic resistance gene and (c) a restriction enzyme cleavage site into which foreign DNA fragments can be inserted. Although no appropriate restriction enzyme cleavage site is present, the use of synthetic oligonucleotide adapters or linkers according to conventional methods facilitates ligation of the vector and foreign DNA.
라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 본 발명에 있어서, 선호되는 숙주세포는 원핵세포이다. 적합한 원핵 숙주세포는 E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue(Stratagene), E. coli B, E. coli BL21 등을 포함하며, FMB101, NM522, NM538 및 NM539와 같은 E. coli 균주 및 다른 원핵생물의 종(speices) 및 속(genera)등이 또한 사용될 수 있다. 전술한 E. coli에 덧붙여, 아그로박테리움 A4와 같은 아그로박테리움 속 균주, 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실리(bacilli), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라티아 마르게센스(Serratia marcescens)와 같은 또 다른 장내세균 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주가 숙주세포로서 이용될 수 있다.After ligation, the vector should be transformed into the appropriate host cell. In the present invention, preferred host cells are prokaryotic cells. Suitable prokaryotic host cells include E. coli DH5α, E. col JM101, E. coli K12, E. coli W3110, E. coli X1776, E. coli XL-1Blue (Stratagene), E. coli B, E. coli BL21, and the like. E. coli strains such as FMB101, NM522, NM538 and NM539 and other prokaryotic species and genera may also be used. In addition to the aforementioned E. coli , strains of the genus Agrobacterium, such as Agrobacterium A4, bacilli , such as Bacillus subtilis , Salmonella typhimurium or Serratia marghesen another variety of enteric bacteria and Pseudomonas (Pseudomonas) in strains such as marcescens) may be used as host cells.
발명의 자살벡터의 숙주세포로는 E. coli χ7213 (Roland, et al., 1999. Avian Dis. 43:429-441)를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원핵세포의 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법을 사용해서 용이하게 달성될 수 있으며(Sambrook et al., supra의 1.82 섹션), 선택적으로, 전기천공법(electroporation)(Neumann et al., EMBO J., 1:841, 1982) 또한 이러한 세포들의 형질전환에 사용될 수 있다. As a host cell of the suicide vector of the present invention, E. coli χ7213 (Roland, et al., 1999. Avian Dis. 43: 429-441) is preferably used, but is not limited thereto. Prokaryotic transformation can be readily accomplished using the calcium chloride method (Sambrook et al ., Section 1.82 of supra) and, optionally, electroporation (Neumann et al., EMBO J., 1). : 841, 1982) can also be used for transformation of these cells.
본 발명의 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. As used herein, the term "transformation" means that DNA is introduced into a host so that the DNA can be replicated as an extrachromosomal factor or by chromosomal integration.
물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩 시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 본 발명에 따른 단백질의 cDNA를 클로닝하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.Of course, it should be understood that not all vectors and expression control sequences function equally in expressing the DNA sequences of the present invention. Likewise not all hosts function equally for the same expression system. However, those skilled in the art can make appropriate choices among various vectors, expression control sequences and hosts without departing from the scope of the present invention without undue experimental burden. For example, in selecting a vector, the host must be considered, since the vector must be replicated in it. The number of copies of the vector, the ability to control the number of copies, and the expression of other proteins encoded by the vector, such as antibiotic markers, must also be considered. In selecting expression control sequences, several factors must be considered. For example, the relative strength of the sequence, the controllability, and the compatibility with the DNA sequences of the present invention should be considered, particularly with regard to possible secondary structures. Single cell hosts may be selected from a host for the selected vector, the toxicity of the product encoded by the DNA sequence of the invention, the ability to secrete the protein correctly, the culture and fermentation requirements, the product encoded by the DNA sequence of the invention from the host. It should be selected in consideration of factors such as the ease of purification. Within the scope of these variables, one skilled in the art can select a variety of vector / expression control sequence / host combinations capable of expressing the DNA sequences of the invention in fermentation or large scale animal culture. As a screening method when cloning the cDNA of a protein according to the present invention by expression cloning, a binding method (binding method), a panning method, a film emulsion method and the like can be applied.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these examples.
실시예 1. 살모넬라균에서 목적유전자 결실시키기 위한 재조합 자살벡터 제조 lon 유전자 또는 cpxR 유전자가 결실된 살모넬라 변이균주를 제작하기 위하여, 야생형 살모넬라 타이피무리엄 (S. typhimurium) χ3339 (Gulig and Curtiss, Infect. Immun., 55:2891, 1987)를 사용하였다. Example 1 Preparation of a Recombinant Suicide Vector for Deleting a Gene of Interest in Salmonella lon Gene or cpxR Salmonella with its missing gene To prepare the mutant strain, wild-type Salmonella typhimurium χ3339 (Gulig and Curtiss, Infect. Immun ., 55: 2891, 1987) was used.
상기 살모넬라 타이피무리엄의 염색체 DNA을 주형으로 하여 PCR 방법으로 lon 유전자와 cpxR 유전자를 제외한 이들 유전자의 5'- 및 3'-말단에 연결된 DNA를 증폭하였다.Using the chromosomal DNA of the Salmonella typhimurium as a template, DNAs connected to the 5'- and 3'-ends of these genes except the lon gene and the cpxR gene were amplified by PCR.
증폭을 위해 사용된 프라이머는 다음과 같다. Primers used for amplification are as follows.
cpxR 유전자 결실시키기 위하여 하기 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, 2개의 DNA 단편을 얻었다.PCR was performed using primers of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 to delete the cpxR gene, resulting in two DNA fragments.
cpxR-F-XbaI ; 5'-TCT AGA GAT AAT TTA CCG TTA ACG AC-3'(서열번호 1) cpxR -F- Xba I; 5'-TCT AGA GAT AAT TTA CCG TTA ACG AC-3 '(SEQ ID NO: 1)
cpxR-R-XhoI ; 5'-CTC GAG GTG GTC GCG GCT ATC TGA TG-3'(서열번호 2) cpxR -R- Xho I; 5'-CTC GAG GTG GTC GCG GCT ATC TGA TG-3 '(SEQ ID NO: 2)
cpxR-F-XhoI ; 5'-CTC GAG CTC GGT CAT CAT CAA CTA AC-3'(서열번호 3) cpxR -F- Xho I; 5'-CTC GAG CTC GGT CAT CAT CAA CTA AC-3 '(SEQ ID NO: 3)
cpxR-R-XbaI ; 5'-TCT AGA CAT CAT CTG CGG GTT GCA GC-3'(서열번호 4) cpxR -R- Xba I; 5'-TCT AGA CAT CAT CTG CGG GTT GCA GC-3 '(SEQ ID NO: 4)
lon 유전자를 결실시키기 위하여는 하기 서열번호 5 내지 서열번호 8의 프라이므를 사용하여 2개의 DNA 단편을 얻었다.To delete the lon gene, two DNA fragments were obtained using the primers SEQ ID NO: 5 to SEQ ID NO: 8.
lon-F-XbaI ; 5'-TCT AGA CAG GAG TTC TTA CAG GTA GA-3'(서열번호 5) lon- F- Xba I; 5'-TCT AGA CAG GAG TTC TTA CAG GTA GA-3 '(SEQ ID NO: 5)
lon-R-XhoI ; 5'-CTC GAG TCA ATG CGT TCA GAA CGC TC-3'(서열번호 6) lon- R- Xho I; 5'-CTC GAG TCA ATG CGT TCA GAA CGC TC-3 '(SEQ ID NO: 6)
lon-F-XhoI ; 5'-CTC GAG GGA ATG CAG GTT GTA ACC GC-3'(서열번호 7) lon- F- Xho I; 5'-CTC GAG GGA ATG CAG GTT GTA ACC GC-3 '(SEQ ID NO: 7)
lon-R-XbaI ; 5'-TCT AGA CCA CAC TCC GCT GTA GGT GA-3'(서열번호 8) lon -R- Xba I; 5'-TCT AGA CCA CAC TCC GCT GTA GGT GA-3 '(SEQ ID NO: 8)
상기 PCR 반응으로 증폭된 유전자 단편을 각각 T-vector (Promega, Co, USA)에 클로닝하였다. 클로닝된 각각의 5'- 및 3'-말단에 연결된 단편들을 하나로 결합되도록 각각 라이게이션(ligation)시켜 결실시키기 위한 목적 유전자의 5'- 및 3'-말단에 연결된 DNA 단편이 서로 결합된 DNA 단편을 제작하였다 (도 1). 상기 목적 유전자의 5'- 및 3'-말단에 연결된 DNA 단편이 서로 결합된 DNA 단편은 제한효소로 절단하여, 앰피실린 저항성 유전자, 클로람페니콜 저항성 유전자 및 수크로오스 민감성 sacB 유전자를 함유하는 자살벡터(suicide vector)인 pMEG375 (Dozois, et al., PNAS, 100:247, 2003, 도 2)에 클로닝하여, pBP210과 pBP294를 제작하고, E. coli χ7213(미국 아리조나 주립대학, 바이오디자인연구소 Roycuriss III 박사에게서 분양받음)에 형질전환시켰다 (표 1).Gene fragments amplified by the PCR reaction were cloned into T-vector (Promega, Co, USA), respectively. DNA fragments in which DNA fragments linked to the 5'- and 3'-ends of the target gene are linked to each other for ligation and deletion of the cloned fragments linked to each of the 5'- and 3'-ends, respectively Was prepared (FIG. 1). DNA fragments in which DNA fragments linked to the 5'- and 3'-terminus of the target gene are bound to each other are cleaved with restriction enzymes to suicide vectors containing an ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene and sucrose-sensitive sacB gene. Cloned into pMEG375 (Dozois, et al ., PNAS, 100: 247, 2003, FIG. 2) to prepare pBP210 and pBP294, and sold them from E. coli χ7213 (Professor Roycuriss III, Arizona State University, Biodesign Institute). Received) (Table 1).
E. coli χ7213은 DAP (diaminopimellic acid) 요구주이고 R6K 플라즈미드 복제 개시인자인 π 단백질을 유지하기 때문에 R6K 복제 개시점을 가지고 있는 pMEG375 유래의 pBP210 및 pBP294가 안정하게 유지될 수 있다. Since E. coli χ7213 is a diaminopimellic acid (DAP) requirement and maintains the π protein, an R6K plasmid replication initiator, pBP210 and pBP294 from pMEG375 with R6K replication initiation can be stably maintained.
실시예 2. 살모넬라 변이균주의 제작 Example 2 Preparation of Salmonella Mutant Strains
스트렙토마이신에 저항성을 가지는 살모넬라 타이피무리엄 χ3339에서 cpxR 유전자를 결손시키기 위해, 실시예 1에서 제작된 E. coli χ7213/pBP210을 이용하여, pBP210을 살모넬라 타이피무리엄χ3339의 염색체 DNA에 접합시켰다. 접합은 LB DAP 한천배지(1.0% tryptone, 0.5% Yeast extract, 1.0% NaCl)에서 수행되었다.PBP210 was conjugated to chromosomal DNA of Salmonella typhimurium χ3339 using E. coli χ7213 / pBP210 prepared in Example 1 to delete the cpxR gene in Salmonella typhimurium χ3339 resistant to streptomycin. . Conjugation was carried out in LB DAP agar medium (1.0% tryptone, 0.5% Yeast extract, 1.0% NaCl).
접합이 이루어진 집락은 LB/앰피실린 한천배지에서 선별하였다. 이 경우 단일 재조합에 의해 χ3339의 클로모좀으로 pBP210의 DNA가 삽입되어 있으며, 이중의 유전자를 유지하게 된다. 클로모좀으로 재조합되지 못한 pBP210은 π 단백질이 χ3339에 존재하지 않기 때문에 자연적으로 복제가 되지 않고, 해당균주는 사멸하게 된다. 벡터 DNA가 클로모좀으로부터 결실된 균주를 획득하기 위하여, 선별된 앰피실린 내성을 가진 집락을 항생제가 포함되지 않은 LB 액체 배지에서 600 nm에서 흡광도가 0.5~1.0이 되도록 배양한 후, 적절하게 희석하여 LB에 수크로오스가 포함된 배지에서 선별하였다. 벡터 DNA에 수크로오스 민감성 유전자인 sacB가 존재하기 때문에 계속 이 유전자를 유지하는(플라즈미드를 가지는) 숙주는 사멸하고 이 유전자가 결손된(플라즈미드가 결실된) 숙주만이 생존이 가능하게 된다. Colonies with conjugation were selected on LB / ampicillin agar medium. In this case, the DNA of pBP210 is inserted into the χ3339 clomosome by single recombination and maintains a double gene. PBP210 that is not recombined with clomosomes does not replicate naturally because π protein does not exist in χ3339, and the strain is killed. In order to obtain strains in which vector DNA was deleted from clomosomes, selected ampicillin-resistant colonies were cultured in an LB liquid medium containing no antibiotics at 600 nm at an absorbance of 0.5 to 1.0, and then diluted appropriately. LB was selected from the medium containing sucrose. The presence of the sucrose susceptibility gene sacB in vector DNA kills hosts that continue to retain this gene (with plasmids), and only those hosts that lack this gene (deleted plasmids) can survive.
선별된 집락은 다시 LB/수크로오스 평판배지와 LB/앰피실린 평판배지에 각각 toothpicking하여 배양하였으며, LB/수크로오스 배지에서 성장하고 LB/앰피실린 배지에서는 성장하지 못하는 집락을 돌연변이된 균주로 선별하였다. 선별된 균주는 PCR을 통해 돌연변이를 확인하고, 살모넬라 타이피무리엄 χ3339의 염색체 DNA에서 cpxR 유전자가 결손된 살모넬라 변이주 CK31로 명명하였다.The selected colonies were further cultured by toothpicking in LB / sucrose plate and LB / ampicillin plate medium, and colonies grown in LB / sucrose medium and not grown in LB / ampicillin medium were selected as mutated strains. The selected strains were identified by PCR and named as Salmonella mutant CK31, which lacks the cpxR gene in the chromosomal DNA of Salmonella typhimurium χ3339 .
상기와 동일한 방법으로 E. coli χ7213/pBP294를 이용하여, 살모넬라 타이피무리엄 χ3339의 염색체 DNA에서 lon 유전자가 결손된 살모넬라 변이주 CK38을 제작하였으며, E. coli χ7213/pBP294 및 E. coli χ7213/pBP210을 이용하여, 살모넬라 타이피무리엄 χ3339의 염색체 DNA에서 lon 유전자 및 cpxR 유전자가 결손된 살모넬라 변이주 CK111를 제조하였다. In the same manner as described above using E. coli χ7213 / pBP294, Salmonella tie blood flock was produced moth χ3339 Salmonella mutant is a lon CK38 gene defect in the chromosomal DNA of the, E. coli χ7213 / pBP294 and E. coli χ7213 / pBP210 Salmonella mutant strain CK111 lacking the lon gene and cpxR gene was prepared from the chromosomal DNA of Salmonella typhimurium χ3339.
실시예 3. 살모넬라 변이균주의 생장곡선 측정Example 3 Growth Curve Measurement of Salmonella Mutant Strains
실시예 2에서 제작된 살모넬라 변이균주(CK31, CK38 및 CK111)와 살모넬라 타이피무리엄 χ3339의 생장곡선을 측정하여 성장상의 차이가 있는지를 확인하였다. 상기 각 균주는 37℃에서 16 시간 동안 전배양하였으며, 상기 전 배양된 각 균주를 각각 LB 100 ml에 1:100으로 희석하여 접종하였다. 접종된 각 균주를 37℃에서 200 rpm으로 배양하면서 1.5 시간 간격으로 생장을 관찰하였다. CK111은 대수 증식기 진입이 약간 늦게 진행되었지만 큰 차이점은 나타나지 않았다 (도 3). The growth curves of Salmonella mutant strains (CK31, CK38 and CK111) prepared in Example 2 and Salmonella typhimurium χ3339 were measured to determine whether there was a difference in growth. Each strain was precultured at 37 ° C. for 16 hours, and each precultured strain was inoculated by diluting 1: 100 in 100 ml of LB, respectively. Each inoculated strain was grown at 200 rpm at 37 ° C. and growth was observed at 1.5 hour intervals. CK111 progressed slightly later in logarithmic phase entry but did not show significant difference (FIG. 3).
실시예 4. 살모넬라 변이균주의 표현형 분석Example 4 Phenotypic Analysis of Salmonella Mutant Strains
야생형 살모넬라 타이피무리엄과 비교하여, lon 유전자나 cpxR 유전자가 결손된 변이균주에서, 생리적, 생화학적 변화가 발생하는지를 알아보기 위해 API20 E kit (Biomerieux, 프랑스)를 이용하여 확인하여 보았다. 그 결과 야생균주와 melibiose를 제외한 모든 항목 (19 개)이 일치되게 나타났다. 야생균주는 melibiose에 대해 발효능력이 없지만, 돌연변이체 모두는 이것에 대한 발효능력이 있는 것으로 나타났다 (표 2). 야생균주와 돌연변이 균주들은 모두 스트렙토마이신에 내성이 있었고 또한, 히스티딘(histidine)에 대한 영양요구성이 있었기 때문에 돌연변이 균주들은 모두 χ3339 야생균주로부터 유래된 것임을 증명할 수 있었다.Compared with wild-type Salmonella typhimurium, the mutant strain lacking the lon gene or cpxR gene, was used to determine whether physiological and biochemical changes occur using the API20 E kit (Biomerieux, France). As a result, all items (19) except wild strain and melibiose were matched. Wild strains were not fermentable against melibiose, but all of the mutants were shown to be fermentable to this (Table 2). Both wild and mutant strains were resistant to streptomycin and also had nutritional components for histidine, demonstrating that the mutant strains were all derived from the χ3339 wild strain.
실시예5. 투과 전자 현미경에 의한 형태의 분석 결과Example 5. Analysis result of form by transmission electron microscope
야생형 살모넬라 타이피무리엄과 lon 유전자나 cpxR 유전자가 결손된 변이균주의 형태 차이를 투과전자현미경을 통하여 확인하였다. 각 균주는 LB 한천평판배양한 샘플을 분석에 사용하였다. 평판 배양시 Agf (thin aggregative fimbriae) 생성이 증가된다는 것은 이미 알려져 있다. 그 결과, 야생균주에서 Agf (thin aggregative fimbriae)가 생성되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, ΔcpxR 돌연변이 균주인 CK31은 야생균주보다 Agf 생성이 증가한 것을 관찰할 수 있었다 (도 4). Δlon 돌연변이 균주인 CK38은 길게 늘어난 세균의 형상을 관찰할 수 있고 또한, 외막 둘레에 두껍게 둘러싼 캡슐의 형상을 관찰할 수 있었다. Δlon ΔcpxR 돌연변이 균주인 CK111은 두 유전자의 표현형이 나타나는 형상이었지만, 캡슐은 감소한 것으로 나타났다. 또한, 생성량이 증가한 Agf가 세포와 세포, 세포와 고체 표면과의 부착을 형성하고 있는 것을 볼 수 있다.Morphological differences between wild-type Salmonella typhimurium and mutant strains lacking the lon gene or cpxR gene were confirmed by transmission electron microscopy. Each strain was used for analysis of LB agar plate culture samples. It is already known that increased agf (thin aggregative fimbriae) production in plate culture. As a result, it was observed that Agf (thin aggregative fimbriae) was produced in the wild strain, and CK31, a ΔcpxR mutant strain, was observed to increase Agf production than the wild strain (FIG. 4). CK38, a Δlon mutant strain, was able to observe the shape of the elongated bacteria and also the shape of the capsule thickly wrapped around the outer membrane. CK111, a Δlon ΔcpxR mutant strain, showed a phenotype of the two genes, but the capsules were reduced. In addition, it can be seen that Agf with increased production forms adhesion between cells and cells, and cells and solid surfaces.
실시예 6. 마우스에서의 살모넬라 변이균주의 반치사량 분석Example 6. Half-treatment Analysis of Salmonella Mutant Strains in Mice
실시예 2에서 제조된 살모넬라 변이균주를 가축의 생백신으로 활용가능한 지를 확인하기 위하여, BALB/c 마우스(코아텍, 6주령)에 대한 반치사량을 검사하였다.In order to check whether the Salmonella mutant strain prepared in Example 2 can be used as live vaccine of livestock, the half dose of BALB / c mice (corec, 6 weeks old) was examined.
그 결과, 표 3에 나타난 바와 같이, ΔcpxR 돌연변이 균주인 CK31의 반치사량은 < 9.8 x 104 이하로, 야생균주의 3.76 x 105보다 반치사량이 감소하는 것을 볼 수 있다. 즉, 독력이 야생균주보다 증가된 것으로 나타났다. 그러나 Δlon 돌연변이 균주인 CK38은 반치사량이 >2.1 x 109이고 Δlon ΔcpxR 돌연변이 균주인 CK111은 >3.0 x 108 이상으로 두 균주 모두 약독화 현상을 나타내는 것을 알 수 있었다. 이상의 결과를 종합해 보면, CK38과 CK111은 가축에 대한 약독화 살모넬라 생백신으로 사용 가능성이 있음을 확인할 수 있다. As a result, as shown in Table 3, the anti-lethal dose of CK31, the ΔcpxR mutant strain, is <9.8 x 10 4 or less, and it can be seen that the semi-lethal dose is reduced from 3.76 x 10 5 of the wild strain. In other words, virulence was increased than wild strains. However, CK38, a Δlon mutant strain, had a half lethal dose of> 2.1 × 10 9, and CK111 , a Δlon ΔcpxR mutant strain, was> 3.0 × 10 8 and both strains showed attenuation. Taken together, it can be seen that CK38 and CK111 may be used as live attenuated Salmonella live vaccines for livestock.
본 발명은 lon 유전자 및/또는 cpxR 유전자를 결실시키는 것을 특징으로 하는 살모넬라 타이피무리엄 변이균주의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 제공하는 효과가 있다. 또한, 본 발명은 상기 살모넬라 타이피무리엄 변이균주를 함유하는 약독화된 살모넬라 백신 조성물을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 약독화된 살모넬라 생백신은 생산 및 보관이 용이하여 경제적이며, 가축에 투여 시, 안전하고 효율적으로 살모넬라 감염을 예방할 수 있다. The present invention has the effect of providing a method for producing Salmonella typhimurium mutant strains, characterized in that the lon gene and / or cpxR gene deletion, and Salmonella typhimurium mutant strain prepared by the above method. In addition, the present invention has the effect of providing an attenuated Salmonella vaccine composition containing the Salmonella typhimurium mutant strain. The live attenuated Salmonella vaccine according to the present invention is economical because it is easy to produce and store, and when administered to livestock, it can safely and efficiently prevent Salmonella infection.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.The specific parts of the present invention have been described in detail above, and it is apparent to those skilled in the art that such specific descriptions are merely preferred embodiments, and thus the scope of the present invention is not limited thereto. something to do. Thus, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> Industrial Cooperation Foundation of Chonbuk National University <120> almonella Mutants Deleted lon Gene and/or cpxR Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof <130> P07-B038 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tctagagata atttaccgtt aacgac 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctcgaggtgg tcgcggctat ctgatg 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagctcg gtcatcatca actaac 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctagacatc atctgcgggt tgcagc 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctagacagg agttcttaca ggtaga 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagtcaa tgcgttcaga acgctc 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctcgagggaa tgcaggttgt aaccgc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tctagaccac actccgctgt aggtga 26 <110> Industrial Cooperation Foundation of Chonbuk National University <120> almonella Mutants Deleted lon Gene and / or cpx R Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof <130> P07-B038 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tctagagata atttaccgtt aacgac 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ctcgaggtgg tcgcggctat ctgatg 26 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ctcgagctcg gtcatcatca actaac 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tctagacatc atctgcgggt tgcagc 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tctagacagg agttcttaca ggtaga 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctcgagtcaa tgcgttcaga acgctc 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ctcgagggaa tgcaggttgt aaccgc 26 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tctagaccac actccgctgt aggtga 26
Claims (13)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070022620A KR100873168B1 (en) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Salmonella Mutants Deleted lon Gene and/or cpxR Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020070022620A KR100873168B1 (en) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Salmonella Mutants Deleted lon Gene and/or cpxR Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20080082156A KR20080082156A (en) | 2008-09-11 |
| KR100873168B1 true KR100873168B1 (en) | 2008-12-10 |
Family
ID=40021581
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020070022620A KR100873168B1 (en) | 2007-03-07 | 2007-03-07 | Salmonella Mutants Deleted lon Gene and/or cpxR Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100873168B1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220048172A (en) | 2020-10-12 | 2022-04-19 | 전북대학교산학협력단 | Recombinant vector expressing multiple antigens in Eukaryote cytosol and an attenuated Salmonella Typhimurium as the vector delivery system to host cells |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101146372B1 (en) * | 2009-08-11 | 2012-05-22 | 전북대학교산학협력단 | Attenuated vaccine for preventing Fowl Typhoid in poultry using a mutant of Salmonella |
| WO2011019134A2 (en) * | 2009-08-11 | 2011-02-17 | 전북대학교산학협력단 | Vaccine composition including salmonella microorganism variants for preventing fowl typhoid |
| KR101151004B1 (en) * | 2009-08-31 | 2012-06-22 | 전라북도 | Vaccine composition for protection and treatment against pathogenic Escherichia coli and Salmonella in cattle by administration of attenuated Salmonella expressing adhesin gene of pathogenic Escherichia coli and vaccination method thereof |
| KR101481789B1 (en) * | 2011-05-17 | 2015-01-14 | 전북대학교산학협력단 | Vaccine composition comprising attenuated and immunopotentiated mutant of Salmonella Enteritidis for preventing salmonellosis |
| KR101371355B1 (en) * | 2012-03-29 | 2014-03-14 | 전북대학교산학협력단 | Oral fowl typhoid vaccine using a live adjuvant system |
| KR101950931B1 (en) | 2017-09-12 | 2019-02-25 | 한국원자력연구원 | ptsI and crr mutated and attenuated Salmonella typhimurium and a composition for vaccine using the same |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020048928A (en) * | 1999-07-23 | 2002-06-24 | 추후제출 | Methods for producing l-amino acids by increasing cellular nadph |
| KR20020065667A (en) * | 2001-02-07 | 2002-08-14 | 주식회사 에프와이디 | Nontoxic Novel Salmonella and Uses Thereof |
-
2007
- 2007-03-07 KR KR1020070022620A patent/KR100873168B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020048928A (en) * | 1999-07-23 | 2002-06-24 | 추후제출 | Methods for producing l-amino acids by increasing cellular nadph |
| KR20020065667A (en) * | 2001-02-07 | 2002-08-14 | 주식회사 에프와이디 | Nontoxic Novel Salmonella and Uses Thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Microbiology (2003), 149, 2809-2817 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20220048172A (en) | 2020-10-12 | 2022-04-19 | 전북대학교산학협력단 | Recombinant vector expressing multiple antigens in Eukaryote cytosol and an attenuated Salmonella Typhimurium as the vector delivery system to host cells |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20080082156A (en) | 2008-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2013573C (en) | Vaccines containing avirulent phop-type microorganisms | |
| US6610529B1 (en) | Recombinant bacterial system with environmentally limited viability | |
| KR100873168B1 (en) | Salmonella Mutants Deleted lon Gene and/or cpxR Gene and Live Salmonella Vaccines Comprising Thereof | |
| EP2942391B1 (en) | Methods for constructing antibiotic resistance free vaccines | |
| US5840483A (en) | Method of maintaining a desired recombinant gene in a genetic population of cells | |
| US8889121B2 (en) | Bacterium comprising a regulated rfaH nucleic acid | |
| CA1335661C (en) | Non-reverting shigella live vaccines | |
| US5210035A (en) | Non-reventing live vaccines | |
| US5643771A (en) | Non-reverting live bacterial vaccines | |
| CA2372553C (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
| JP2020505036A (en) | Induction of protective immunity against antigen | |
| WO2005001069A1 (en) | Genetic marker for live bacterial vaccines | |
| US20130236948A1 (en) | Recombinant microorganisms and uses thereof | |
| AU2015342937B2 (en) | Monocins and methods of use | |
| Lee et al. | Development of a gene delivery system in Streptococcus gordonii using thymidylate synthase as a selection marker | |
| US20110262480A1 (en) | Method for producing multiple modifications in the chromosome of gram-negative bacteria and salmonella strains which are deficient in c-di-GMP synthesis obtained by said method | |
| Azizpour et al. | Lactococcus lactis as a live delivery vector | |
| KR101774863B1 (en) | Salmonella enteritidis mutant strains hid2092 and hid2114 and pharmaceutical composition using the same | |
| Beyer et al. | Labeling Salmonella live vaccine strains with the lux operon from Vibrio fischeri improves their detection and discrimination from wild type | |
| MXPA94005272A (en) | Vaccines for salmone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20121203 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131203 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141201 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151124 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161110 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171128 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181121 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20191217 Year of fee payment: 12 |