KR100870917B1 - 전기화학 생물반응기 및 이를 이용하여 전분으로부터알코올을 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 반응기의 내측 바닥면으로부터 소정거리 이격되어 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 1전극; 상기 제 1전극의 상부에 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 2전극; 상기 제 1전극 및 제 2전극에 외부의 전원 공급장치를 연결할 수 있도록 반응기의 외부에 위치한 단자; 반응기의 외측에 위치하는 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트; 및 반응기의 외측 상부에 위치하는 압력조절 수단을 포함하고, 상기 제 1전극 및 제 2전극은 규칙적으로 극성이 전환되어 산소 및 수소가 교대로 방출되어, 상기 제 1전극의 상부에는 전분당화능을 가지는 미생물이 배양되고, 상기 제 1전극의 하부에는 알코올 발효능을 가지는 미생물이 배양되도록 구성된 것을 특징으로 하는 전기화학 생물반응기 및 이를 이용하여 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
전분, 당화, 곰팡이, 효모, 전기화학반응, 알코올

Description

전기화학 생물반응기 및 이를 이용하여 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법 {Electrochemical Bioreactor and the Preparing Method of Alcohol from Starch Using Thereof}
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학 생물반응기의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에 따른 곰팡이 균사체를 혼합배양용 배지에서 배양한 후, 배양액을 농축하여 측정한 글루코아밀라제(glucoamylase) 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실험예에 따른 곰팡이(Aspergillus niger)가 생산하는 세포외 분비효소(extracellular enzyme)의 전분 분해활성을 나타낸 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실험예에 따른 곰팡이 농축 배양액을 정제과정 없이 SDS-PAGE를 이용하여 관찰한 단백질 패턴사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따른 곰팡이-효모 혼합배양용 배지에서, 백금 전극에 부과한 전류량에 따른 알코올 및 포도당의 양을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 전기화학 생물반응기 및 이를 이용하여 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 반응기의 내측 바닥면으로부터 소정거리 이격되어 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 1전극; 상기 제 1전극의 상부에 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 2전극; 상기 제 1전극 및 제 2전극에 외부의 전원 공급장치를 연결할 수 있도록 반응기의 외부에 위치한 단자; 반응기의 외측에 위치하는 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트; 및 반응기의 외측 상부에 위치하는 압력조절 수단을 포함하고, 상기 제 1전극 및 제 2전극은 규칙적으로 극성이 전환되어 산소 및 수소가 교대로 방출되어, 상기 제 1전극의 상부에는 전분당화능을 가지는 미생물이 배양되고, 상기 제 1전극의 하부에는 알코올 발효능을 가지는 미생물이 배양되도록 구성된 것을 특징으로 하는 전기화학 생물반응기 및 이를 이용하여 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 전분으로 알코올을 제조하는 공정은 중자(cooking), 당화(saccharification), 발효(fermentation), 중류(disillation) 등으로 구성되는데, 당화공정에서는 부분 당화가 진행되고, 발효공정에서도 당화가 계속된다. 이를 동시 당화발효(Simultaneous saccharification fermentation, SSF)라고 한다. 이러한 성질을 이용하여 당화공정 없이 발효를 할 수도 있다. 그리고, 중자와 당화를 포함하여 담금고정이라고 한다. 중류공정에서는 보통 95vol% 또는 정제알코올이 제 조된다.
발효법에 있어서 효모는 단일 당류의 용액에 첨가되는데, 효모는 용액중의 당류를 먹이로서 사용하는 작은 미생물로서, 당류를 먹이로서 사용함으로서 부산물로서 에탄올과 이산화탄소를 생성시킨다. 이산화탄소는 액체 중에서 기포를 발생시키면서 가스로서 방출되고, 에탄올은 용액 중에 남게 된다. 효모는 용액중 에탄올의 농도가 약 18 용액%에 도달할 때에 이 용액중 발효성 당류의 존재 여부에 관계없이 그 기능이 저하되는 결점이 있다. 그리하여 거의 완전하게 발효시키고, 또 다량의 에탄올을 제조하기 위하여 회분식 공정을 이용하는 것이 관례이며, 이 공정에 있어서는 500,000 갈론 이상을 처리할 수 있는 초대형 발효조를 사용한다. 이와 같은 대형 발효조를 사용하면, 당류용액을 신속하게 발효시키기에 충분한 양의 효모를 사용해야 하므로 경제적으로 불리하다. 그리하여, 종래의 발효법은 72 시간 이상 소요되며, 이러한 시간은 효모군을 필요한 농도까지 높이기 위하여 필요로 하는 시간이다. 예를 들면, 일정량의 효모군을 발효조에 넣은 후, 약 45~60분 이내에 이 효모군은 2배로 증식하며, 또 45~60분 이내에 새로운 효모군이 2배로 증식하게 된다. 이와 같은 효모군이 다량의 담류 용액을 발효시키는 데 필요한 효모의 양을 생성시키기 위하여는 많은 시간이 소요되는 문제점이 있다.
일반적으로 효모를 이용한 알코올의 생산은 효모의 전분당화 기능이 없기 때문에 포도당을 기질로 이용하여야 한다. 그러나 자연계에 존재하는 포도당은 몇 종류의 과일에서만 획득이 가능하기 때문에 전분을 효소를 사용하여 포도당으로 전환하여 사용해야 한다. 이와 같이 전분의 당화를 위해서는 글루코아밀라제를 사용해 야 하고, 또한 당화를 위한 대규모의 반응기가 요구되기 때문에 당화 공정과 당화 효소의 비용이 알코올의 생산비용에 큰 비중을 차지한다.
글루코아밀라제는 곰팡이 등의 미생물로부터 얻을 수 있으며, 곰팡이는 절대 호흡에 의존하는 특성이 있기 때문에 수중에서 배양할 때 적당한 양의 산소를 공급해야 한다. 반면, 효모는 산소가 없는 환경에서 발효에 의존하여 알코올을 생산하고, 산소가 존재하는 환경에서는 호흡에 의존하여 기질이 부족한 경우에는 발효산물인 알코올도 기질로 이용할 수 있기 때문에 용존 산소의 농도에 따라 알코올의 생산성은 영향을 받을 수 있다.
따라서 각 단계별로 수행되는 전분으로부터 알코올을 생산하는 공정을 단일공정으로 수행하기 위하여 곰팡이와 효소를 혼합하여 배양시킬 경우, 반응기 내부의 산소는 곰팡이 균사체의 생육에 필요한 최소의 농도를 유지하는 것이 필요하다. 반응기 내부의 산소를 조절하기 위하여 공기주입장치 및 용존산소의 농도를 측정할 수 있는 센서가 장착된 배양기가 사용되고 있지만, 이는 반응기 내의 전체 산소의 양만을 조절할 수 있을 뿐, 혼합 배양되는 미생물의 성질 및 배양위치에 따른 산소조절은 할 수 없는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 반응기의 내측 바닥면으로부터 소정거리 이격되어 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 1전극; 상기 제 1전극의 상부에 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지 르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 2전극; 상기 제 1전극 및 제 2전극에 외부의 전원 공급장치를 연결할 수 있도록 반응기의 외부에 위치한 단자; 반응기의 외측에 위치하는 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트; 및 반응기의 외측 상부에 위치하는 압력조절 수단을 포함하고, 상기 제 1전극 및 제 2전극은 규칙적으로 극성이 전환되어 산소 및 수소가 교대로 방출되어, 상기 제 1전극의 상부에는 전분당화능을 가지는 미생물이 배양되고, 상기 제 1전극의 하부에는 알코올 발효능을 가지는 미생물이 배양되도록 구성된 것을 특징으로 하는 전기화학 생물반응기를 사용할 경우, 미생물을 혼합 배양하여 단일공정으로 전분으로부터 알코올을 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 목적은, 전기화학 생물반응기 및 이를 이용하여 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법을 제공 하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 일 관점에서, 반응기의 내측 바닥면으로부터 소정거리 이격되어 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 1전극; 상기 제 1전극의 상부에 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 2전극; 상기 제 1전극 및 제 2전극에 외부의 전원 공급장치를 연결할 수 있도록 반응기의 외부에 위치한 단자; 반응기의 외측에 위치하는 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트; 및 반응기의 외측 상부에 위치하는 압력조절 수단을 포함하고, 상기 제 1전극 및 제 2전극은 규칙적으로 극성이 전환되어 산소 및 수소가 교대로 방출되며, 상기 제 1전극의 상부에는 전분당화능을 가지는 미생물이 배양되고, 상기 제 1전극의 하부에는 알코올 발효능을 가지는 미생물이 배양되도록 구성된 것을 특징으로 하는 전기화학 생물반응기를 제공한다.
본 발명에 따른 전기화학 생물반응기는 필요에 따라 제 3전극 및 제 4전극을 더욱 포함할 수도 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 전기화학 생물반응기의 모식도이다. 본 발명에 따른 전분으로부터 알코올을 생산하기 위하여, 미생물이 혼합 배양되는 전기화학 생물반응기는 반응기의 내측 바닥면으로부터 소정거리 이격되어 위치하는 제 1전극(10); 상기 제 1전극의 상부에 위치하는 제 2전극(20); 상기 제 1전극 및 제 2전극에 외부의 전원 공급장치를 연결할 수 있도록 반응기의 외부에 위치한 단자(30); 반응기의 외측에 위치하는 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트(40); 및 반응기의 외측 상부에 위치하는 압력조절 수단(50)을 포함한다.
상기 제 1전극(10)은 반응기의 내측 바닥면으로부터 소정거리 이격된 것을 특징으로 한다. 여기서 소정거리라 함은 반응기의 규모(직경 및 높이)에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들면 전체용량 3.4L의 반응기에서는 바닥면으로부터 약 2 내지 3㎝ 이격되는 것이 바람직하다. 이와 같이 제 1전극(10)을 반응기의 바닥면으로부 터 소정거리 이격하는 이유는 포도당을 발효하여 알코올을 생산하는 혐기성 미생물이 전극의 표면에서 발생하는 산소에 의한 영향을 직접 받지 않으면서, 제 1전극(10)과 반응기의 바닥면 사이에서 배양되도록 하기 위함이다.
본 발명에 따른 제 2전극(20)은 상기 제 1전극(10)의 상부에 위치하며, 제 1전극(10)과의 거리는 배양액에 첨가하는 전해질(예:KNO3, NaH2PO4)의 농도 및 가능한 낮은 전압에서 유지되는 전류량을 고려하여 결정할 수 있다.
상기 제 1전극(10) 및 제 2전극(20)은 전기화학 반응에 의하여 반응기 내에 산소 및 수소를 공급하기 위한 것으로서, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 제 1전극(10) 및 제 2전극(20)은 반응기의 벽면에 부착되거나 이격되어 설치 될 수 있으며, 그 모양은 특별히 제한되지 않으나, 효과 및 경제성을 고려하여, 최소길이의 전극을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 원통형 배양기의 벽면에 부착된 원형 모양의 전극을 사용할 경우, 직경 10m, 높이 15m, 용량 1000리터(1 톤) 반응기에 적용되는 전극의 길이는 약 31.4 m이지만, 직경 8m, 높이 20m, 용량 1000리터(1 톤) 반응기에 적용되는 전극의 길이는 약 25.1m이다. 따라서, 전극의 길이는 반응기의 용량과 직경에 따라 차이가 있기 때문에, 전극에 부과하는 전류에 따라 산소의 생산성과 전극의 표면에서 나타나는 전기화학 반응의 차이를 이용하여 반응기의 직경과 높이를 조절함으로서 전극의 길이를 최소의 규모로 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 전기화학 생물반응기의 상기 제 1전극(10) 및 제 2전극(20) 은 규칙적(30초 간격)으로 극성이 전환되어, 산소 및 수소가 교대로 방출되는 것을 특징으로 한다.
상기 제 1전극(10) 및 제 2전극(20)는 반응기의 외부에 위치한 단자(30)를 통하여 외부의 전원 공급장치로부터 전원을 공급받는다. 이때 상기 전원 공급장치는 교류를 직류(맥류가 아님) 변환하는 강압트랜스를 사용할 수 있다. 또한, 펄스 전압 유도장치를 통하여 펄스전압이 부여된 정전류를 제공함으로써, 제 1전극(10) 및 제 2전극(20)은 규칙적으로 극성이 전환될 수 있다. 상기 펄스 전압 유도장치는 마이크로프로세서를 사용하여 on/off 시간을 규칙적으로 통제할 수 있는 장치로서, on/off의 변환은 순간적인 전압강하 또는 전압상승 효과가 있다. 상기 on/off 시간은 필요에 따라 30초에서 3분까지 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 전기화학 생물반응기의 전극은 규칙적으로 극성이 전환되기 때문에, 전극의 표면에서 분극 현상에 의한 산소의 생산이 저해되는 것을 차단할 수 있고, 동시에 두 전극(10, 20)에서 교대로 산소와 수소를 발생시킬 수 있다. 정전류의 환경에서 소비된 전류량은 전기 분해에 의해 생성된 기체의 양과 절대적으로 비례하기 때문에 반응기 내부에서 발생하는 산소와 수소의 양은 항상 일정하게 유지될 수 있고, 전극의 표면에서 발생하는 산소와 수소는 용해도 차이에 의해 수소는 즉시 반응기의 공기층으로 방출되고, 산소는 부유하면서 생장하는 곰팡이의 균사체에 포집되어 소비될 것이다. 즉, 이론적으로 물에 대한 산소의 용해도(20℃에서 0.02232g/L)에 비해 수소 용해도(0℃에서 0.00178g/L)는 매우 낮기 때문에 전극(10, 20)에서 발생된 대부분의 수소는 헤드스페이스로 상승하고, 산소는 물에 녹 아 호기성 미생물의 호흡대사에 이용된다.
전극의 표면에서 발생하는 수소는 반응기의 헤드스페이스(headspace: 배양액 상층부)에 모여 반응기 내부에 일정한 압력이 유지될 수 있게 한다. 헤드스페이스의 수소는 반응기의 외측 상부에 위치하는 압력조절수단(50)에 의하여 1.05 기압 이상이 되면 자동으로 방출되며, 상기 압력조절수단(50)으로는 압력계와 솔레노이드 밸브를 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 전기화학 생물반응기는 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트(40)를 반응기의 외측에 포함한다. 상기 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트(40)의 위치는 특별히 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기의 전기화학 생물반응기를 사용하여 전분당화능을 가지는 미생물과 알코올 발효능을 가지는 미생물을 혼합배양시키는 것을 특징으로 하는 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 전분당화능을 가지는 미생물은 Aspergillus 속이고, 상기 알코올 발효능을 가지는 미생물은 Saccharomyces 속 또는 Zymomonas 속을 예시할 수 있다.
즉, 상기 전분당화능을 가지는 미생물은 곰팡이로서, 그 균사체가 배양액의 상부에 부유하면서 전극에서 발생되는 산소를 이용할 수 있고, 상기 알코올 발효능을 가지는 미생물은 전극에서 발생되는 산소의 영향을 직접 받지 않는 배양기의 바닥에서 배양되어 최적의 조건에서 생장할 수 있다. 따라서, 혼합배양의 장점은 기질이 존재하는 동안 균사체가 지속적으로 효소를 생산하여 전분을 당화하기 때문에 반응시간에 따른 효소의 활성이 저하되는 현상을 고려할 필요가 없다는 것이다.
일반적으로, 아스퍼질러스(Aspergillus) 등의 곰팡이는 대기 중에서 성장할 경우, 균사체의 접합에 의한 포자낭을 구성하고 포자를 형성하기 때문에, 균사체에 비해 상대적으로 많은 양의 기질을 소모할 수 있다. 따라서 산소농도가 낮은 수중에서 배양하면 지속적으로 균사체의 형태를 유지할 수 있고, 균사체의 양에 비례하여 세포 외 분비효소를 생산할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 전기화학 생물반응기의 제조
직경 11.2㎝, 높이 35㎝, 용량 3.4L의 전기화학 생물반응기를 제조하였다. 반응기의 제 1전극은 바닥면으로부터, 약 2㎝ 이격되도록 설치하였고, 제 2전극은 제 1전극으로부터 약 5㎝ 이격되도록 설치하였다. 이때 제 1 및 제 2전극은 직경 0.2㎜의 백금을 사용하였으며, 반응기 내부 벽에서 부착시킨 백금전극의 길이는 약 35cm였다.
실험예 1. 전분을 당화할 수 있는 미생물의 글루코아밀라제 활성 측정
글루코아밀라제 특이활성(specific activity)을 측정하기 위하여 혼합배양용 배지(KNO3 3g/L, NaH2PO4 2.3g/L, Yeast Extract 5g/L, 전분 50g/L)에 한국 종균협회에서 분양받은 Aspergillus niger(KACC 41858) 전배양액 1%(v/v)를 접종하고, 30℃에서 2일간 배양한 후, 배양액을 농축하여 효소액으로 사용하였다. 효소의 활성은 10g의 전분을 1L의 50mM 인산염 buffer에 현탁한 후, 100℃에서 중탕하여 호화시킨 전분용액과 농축된 효소액(농축 곰팡이 배양액, 최종 단백질 농도: 0.099mg/L)을 1:1로 혼합하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10분 동안 반응시킨 후, 생성된 포도당 농도를 HPLC(이동상의 유속:0.6ml, HPX-87H 이온교환칼럼의 온도:35℃, 굴절률 검출기의 온도: 35℃, 시료 투입:20㎕(정량루프 사용))로 측정하였다. 이와 같이 결정된 효소의 specific activity는 200.2 mg glucose L-1 min-1 mg protein-1이었다.
또한, 글루코아밀라제의 효소기질친화성(Km) 및 반응최고속도(Vmax)를 다음과 같이 측정하였다. 10g의 전분을 1L의 50mM 인산염 buffer(pH 7.0)에 현탁시키고, 100℃에서 중탕하여 호화한 후, 30℃로 냉각시켰다. 냉각된 전분용액을 전분의 농도가 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 5.0, 7.0 및 9.0g/L가 되도록 조정한 후, 농축된 효소액(농축 곰팡이 배양액, 최종 단백질 농도: 0.099mg/L)을 1:1로 혼합하여, 30분, 60분, 120분 및 180분간 반응시켜, 포도당의 생산량이 최대값이 되는 조건을 확인하였다. 그 결과, 전분의 농도가 1.0g/L이고, 반응시간이 60분 일 때 포도당의 생산량이 최대값을 나타냄을 확인하였고, 이를 Lineweaver-Burk식에 대입시켜 도 2에 나타내었다.
도 2는 상기 Aspergillus niger(KACC 41858) 균사체를 혼합배양용 배지에서 배양한 후, 배양액을 농축하여 측정한 글루코아밀라제(glucoamylase) 활성(Km과 Vmax)을 나타낸 그래프이다.
도 2로부터, 리터 당, 분 당 및 밀리그램 단백질 당 약 0.2g(리터 당, 밀리그램 단백질 당 및 일 당 약 288g)의 포도당이 생산될 수 있으나, Aspergillus niger(KACC 41858)가 생산하는 효소의 양은 1일 기준으로 균사체 1 그램당 약 0.17 밀리그램의 효소가 생성되기 때문에 실질적으로 Aspergillus niger(KACC 41858)의 균사체가 생산한 글루코아밀라제의 작용에 의해 생산되는 포도당의 양은 하루에 리터 당 50g을 초과하기 어려움을 알 수 있었다. 또한, 생산한 포도당의 일부는 Aspergillus niger(KACC 41858)가 소비하기 때문에 알코올의 생산성은 더욱 저하될 수 있음을 알 수 있었다. 상기 시험에서, 단백질의 농도를 표기한 것은 곰팡이의 균사체가 생산하는 분비단백질의 양이 균사체의 건조중량에 비례하고, 분비단백질을 전기영동으로 확인한 결과, 단백질의 대부분이 글루코아밀라제이기 때문이다.
실험예 2. 세포외 분비효소의 전분 분해활성 측정
Aspergillus niger(KACC 41858)가 분비하는 세포외 분비효소(extracellular enzyme)의 전분 분해활성을 측정하기 위해 하기와 같은 방법으로 실험하였다.
전분 0.5% 및 한천 1.5%를 함유하는 고체평판 위에 실험예 1의 배양액을 100 배 농축하여 직경이 5 mm인 원형 여과지에 흡수시킨 다음, 1시간 배양 후, 여과지를 제거하고, 요오드 용액을 분사하여 녹말-요오드 반응에 의한 청남색 반응을 유도하였다(도 3a 참조). 도 3a는 본 발명의 일 실험예에 따른 곰팡이(Aspergillus niger)가 생산하는 세포외 분비효소(extracellular enzyme)의 전분 분해활성을 나타낸 사진으로써, 청남색 바탕은 전분이 요오드와 반응하여 형성된 발색 반응에 의해 나타난 결과이고, 밝은 부분은 전분이 가수분해되어 전분-요오드 반응이 발생하지 않아 콜로니 카운터의 배경이 불빛에 의해 투과되어 나타난 결과이다. A 자로 표기한 부분은 산업용으로 판매하는 글루코아밀라제(AMG 200L®, NOVO INDUSTRY CO.)를 대조 실험으로 적용한 결과이다.
실험예 3. SDS - PAGE 실행
단백질을 정량하기 위해 다음과 같이 SDS-PAGE를 실행하였다. 먼저 실험예 2에서 농축한 곰팡이 배양액을 SDS-PAGE용 sample buffer와 1:1로 혼합하여 100℃에서 1분간 중탕하여 열처리시켰다. 다음으로 열처리된 혼합액을 준비된 sodium dodecyl sulfate를 함유하는 12% polyacrylamide gel에 로딩한 후, 1 시간동안 200 volt의 전압으로 전개시켜 단백질을 분리하였다. 전기영동 gel을 coomasie blue 용액에 3시간 동안 담가 염색한 후, 10% 초산 및 40% 메탄올로 제조한 탈색용액으로 탈색시킨 사진을 도 3b에 나타내었다.
도 3b로부터, Aspergillus niger(KACC 41858)가 분비하는 세포외 단백질의 분자량이 약 86kd임을 확인하였고, 이로부터 단백질이 글루코아밀라제임을 추정하였다.
실험예 4. 전류량에 따른 알코올 생산성의 차이측정
실험예 1에서 제조된 배양기에 곰팡이-효모의 혼합배양용 배지(KNO3 3g/L, NaH2PO4 2.3g/L, Yeast Extract 5g/L, 전분 20g/L) 3.5L, Aspergillus niger(KACC 41858) 및 Saccharomyces cereviesiae(ATCC 26603)를 각각 건조중량 기준으로 0.3g/L 첨가한 후, 하기 표 1에 기재된 전압 및 전류를 갖는 정전류를 반응기에 부과(전극의 극성 전환 주기: 30초)하면서 배양하였다. 이때, 대조구로서, 전류를 부과하지 않은 반응기는 밀폐하여 적극적으로 산소의 유입을 차단하지 않았으나, 휘젓거나 흔들지 않고, 정치배양 함으로서, 공기중의 산소가 용해되는 것을 최대한 억제하였다. 또한, 반응기에서 발생되는 수소와 산소를 측정하기 위하여, 가스 크로마토그라피를 실시하였고, 이론적인 산소의 양과 전류값에 따른 알코올 생산성의 차이를 확인하였다.
Voltage (v) variation charged to reactor Fixed current (mA) between anode and cathode Theoretical Oxygen production (ml) / for 1 hr Ethanol production (mM) (g/L)
0 0 0 0.0 (0.0)
3-4 40 8.4 32.2 (1.4)
4-5 80 16.8 206.6 (9.5)
5-7 160 33.6 178.4 (8.2)
8-10 240 50.4 95.0 (4.4)
상기 표 1로부터, 80mA 전류를 부과한 반응기에서 에탄올 생산량이 가장 우수함을 알 수 있었다. 즉, 전극에 부과되는 전류의 수치가 낮거나, 높은 경우 에탄올의 생산량이 저하됨을 알 수 있다.
또한, 가스크로마토그래피 실시 결과, 40mA 및 80mA의 전류가 부과한 반응기에서는 약 3.5ppm의 수소가 검출되었고, 산소는 검출되지 않았다. 즉, Aspergillus niger(KACC 41858) 균사체가 산소를 모두 소비하였음을 알 수 있었다. 그러나 160 mA와 240 mA의 전류를 부과한 반응기에서는 약 10ppm 이상의 수소와 각각 2.3ppm과 3.8ppm의 산소가 검출되었다. 이러한 사실로부터 반응기의 내부의 용존 산소가 부족한 경우는 곰팡이의 생육이 억제되고, 용존 산소가 풍부한 경우는 곰팡이가 과잉 성장하면서 효모의 생장을 억제하여 알코올의 생산성이 저하될 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 전류량에 따른 알코올 및 포도당의 차이측정
상기 실시예 1에서 제조된 전기화학 생물반응기에 곰팡이-효모의 혼합배양용 배지(KNO3 3g/L, NaH2PO4 2.3g/L, Yeast Extract 5g/L, 전분 50g/L) 3.5L, Aspergillus niger(KACC 41858) 및 Saccharomyces cereviesiae(ATCC 26603)를 각각 0.3g/L 첨가한 후, 80mA(에탄올:▼, 포도당:▽) 및 160mA(에탄올:■, 포도당:□)의 정전류를 부과(전극의 극성 전환 주기: 30초)하면서, 6일간 배양하였다. 배양기간동안 배양액의 포도당 및 알코올의 양을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 대조군(에탄올:●,포도당:○)으로서, 전류를 부과하지 않은 반응기에는 100 rpm으로 배양액을 혼합하여 미량의 산소가 유입될 수 있는 환경을 조성하였다.
도 4로부터 알코올의 양과 포도당의 양은 반비례함을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 배양액을 100 rpm으로 휘젓는 조건에서 균사체에 의한 전분의 당화효율은 증가하는 반면, 효모의 알코올 발효 효율은 감소한다는 사실을 확인할 수 있었다.
반면, 전극을 이용하여 균일하게 배양액의 내부에 전기분해에 의한 일정량의 산소를 부과한 조건에서는 알코올의 양이 증가하였다. 이러한 결과로부터, 전분을 포도당으로 분해하는 효소를 분비하는 Aspergillus niger(KACC 41858)의 활성 및 포도당을 알코올로 발효시키는 Saccharomyces cereviesiae(ATCC 26603)의 활성 또한 증가되는 사실을 확인할 수 있었다.
본 발명은 전기화학 생물반응기 및 이를 이용하여 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 동시에 단일 반응조 내에서 전분의 당화와 알코올 발효를 구현함으로서 기존의 효소를 이용한 당화와 효모를 이용한 알코올 발효의 다단계 공정에서 발생할 수 있는 비용을 절감할 수 있을 뿐 아니라, 균사체를 회수하여 재활용함으로서 전분을 일련의 공정을 통해 연료용 알코올로 전환할 수 있어 화학공정과 같이 연속 공정의 설계가 가능하다.
특히, 전분의 당화 활성이 우수한 아스퍼질러스 속과 같은 균류의 균사체를 무성생식에 의해 연속적으로 증식함으로서 균류의 유전적인 특성을 보존할 수 있고, 당화-발효를 균류와 효모의 성장속도, 효소활성 및 대사활성 등과 연계하여 최적화 공정을 설계하면 균류의 배양에 소비되는 전분의 양을 최소화 할 수 있으며, 당화효율을 극대화 할 수 있기 때문에 효모의 알코올 생산성을 향상할 수 있다.

Claims (4)

  1. 반응기의 내측 바닥면으로부터 소정거리 이격되어 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 1전극;
    상기 제 1전극의 상부에 위치하는, 백금, 금, 티타니움, 이리디움 및 지르코니움으로 구성된 군에서 선택되는 제 2전극;
    상기 제 1전극 및 제 2전극에 외부의 전원 공급장치를 연결할 수 있도록 반응기의 외부에 위치한 단자;
    반응기의 외측에 위치하는 배양액 첨가 및 발효액 회수 포트; 및
    반응기의 외측 상부에 위치하는 압력조절 수단을 포함하고, 상기 제 1전극 및 제 2전극은 규칙적으로 극성이 전환되어 산소 및 수소가 교대로 방출되는 것을 특징으로 하는 전기화학 생물반응기.
  2. 삭제
  3. 제1항의 전기화학 생물반응기를 사용하여 전분당화능을 가지는 Aspergillus 속 곰팡이와 알코올 발효능을 가지는 Saccharomyces 속 효모 또는 Zymomonas 속 세균을 혼합배양하는 것을 특징으로 하는 전분으로부터 알코올을 제조하는 방법.
  4. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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