KR100863217B1

KR100863217B1 - 황기로부터 포르모노네틴을 분리 및 정제하는 방법

Info

Publication number: KR100863217B1
Application number: KR1020070014376A
Authority: KR
Inventors: 윤경섭; 임경란; 최상원
Original assignee: 주식회사 사임당화장품; 최상원
Priority date: 2007-02-12
Filing date: 2007-02-12
Publication date: 2008-10-13
Also published as: KR20080075343A

Abstract

본 발명은 황기로부터 이소플라본 화합물인 칼리코신과 포르모노네틴을 분리 및/또는 정제하는 방법에 관한 것으로서, (S1) 황기(Astragali Radix)를 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 알코올수용액을 이용하여 추출하는 단계; (S2) 상기 (S1)단계의 추출물을 탄수화물가수분해효소 및 펙틴가수분해효소로 처리하는 단계; 및 (S3) 상기 (S2)단계의 결과물에 분획용 유기용매를 가하여 분획하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 방법은 황기로부터 이소플라본 화합물인 칼리코신과 포르모노네틴을 분리 및/또는 정제하는데 매우 유용하다.

황기(Astragali Radix), 펙틴가수분해효소, 탄수화물가수분해효소, 칼리코신, 포르모노네틴

Description

황기로부터 포르모노네틴을 분리 및 정제하는 방법{A method for isolation and purification of calycosin and formononetin from Astragali Radix}

도 1은 효소처리에 의해 제조된 황기 탈지 에탄올추출물로부터 분리된 두 가지 이소플라본화합물의 고속액체크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 황기 탈지 에탄올추출물로부터 분리된 네 가지 이소플라본화합물의 고속액체크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 황기로부터 칼리코신 및 포르모노네틴을 분리 및/또는 정제하는 방법에 관한 것이다.

황기(Astragali Radix)는 한국, 일본 등 아시아 지역과 러시아, 불가리아, 등 유럽에 이르기까지 널리 분포하는 콩과(Leguminosae)에 속하는 다년생 초본으로 예로부터 보기제로서 널리 사용되어 왔고 한방에서 이뇨제, 빈혈증, 식욕부진, 지한제, 강장제 등으로 사용되어 왔다(Sun T. et al., Chin . Med . J. 61, 97, 1981; Tu GS, Pharmacopoeia of the People's Republic of China, p. 109, 1988). 또한, 황기는 신농본초경에 상약으로 수록되어 있어 우리 나라 한방에서는 보증익기탕, 황기건중방, 황기계지오물방, 십전대보탕, 가미대보탕, 황기육일탕, 팔보회춘탕 등 수 백가지 처방에 황기가 인삼 다음으로 많이 쓰이는 보기약이다(Song et al., Planta Med 70(12): 1222-1227, 2004; Chiang Su, Dictionary of Chinese Crude drugs, Shanghai Scientific Technologic Publisher, Shanghai, p. 2036, 1977).

지금까지 알려진 황기의 약리작용으로는 혈압강하작용, 강심작용, 간장보호작용, 혈당강하작용, 면역강화작용 등이 보고되고 있다(Zhang et al., Acta Pharm Sin 19, 333, 1984; Zhang et al., J Ethnopharmacol 30, 145, 1990; Kim et al, Kor J. Pharmacogn. 26, 51, 1995; Park et al., Yakhak Hoeji 40, 52, 1996; Kim et al., Yakhak Hoeji 46, 52, 2002). 그리고 황기의 생리활성성분으로서 트리테르페노이드 글리코사이드 계통과 플라보노이드 계통이 주를 이루고 있고, 그 외 사포닌 및 폴리사카라이드 성분 등을 함유하고 있다(Fang et al., Org. Chem 26, 1982; Kitagawa et al., Chem Pharm Bull 31, 709, 1983; Chen et al., Acta Pharm Sin 23, 218, 1988; Subarnas et al., Planta Med. 57, 590, 1991; Cui et al., Chem Pharm Bull, 40, 3330, 1992).

플라보노이드는 자연계에 널리 분포하는 식물성 색소 성분으로 헤테로사이클릭 피론링을 통해 연결되는 2개의 벤젠링으로 구성되며, 피론링에서 이중 결합 및 케톤기의 유무, 하이드록시기 및 벤조이드 B 링의 위치에 따라 플라본, 플라보놀, 플라바놀, 플라바노논 및 이소플라본으로 나뉘어진다(한명규, 식품화학, 형설출판사, p. 236-240, 2002; 안명수, 식품화학, 신광출판사, p. 266-269, 2006; Fennema OR, Food Chemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, USA, 681-696, 1996). 이 중 이소플라본화합물은 식물 도처에 널리 분포하는 다른 플라보노이드와 달리 자연계에서 극히 제한된 분포를 보이며, 단지 대두 내에서만 영양학적으로 상당한 용량이 존재한다(Cornwell et al., Phytochemistry 65: 995-1016, 2004; Havsteen B. Biochem Pharmacol 32: 1141-1148, 1983).

이소플라본(isoflavone)은 주로 콩과 식물 계보(Leguminosae family)의 구성원으로 1,000개 이상의 이소플라본이 확인되고 있다(박형무, 식물성에스트로겐, 군자출판사, p. 21-35, 2005; Cornwell et al., Phytochemistry 65: 995-1016, 2004; Alekel et al., Am. J. Clin. Nutr. 72: 844-852, 2000). 자연계에서 이소플라본은 대부분 글리코시드(glycoside)로 존재하나, 약간은 아글리콘(aglycone)으로 존재한다. 식물에서 이소플라본은 글루코오스와 결합되어 생리적으로 불활성화된 글리코시드를 형성한다(Setchell KD, Soy Connection Newslatter 6, Spring, 1998).

황기에 함유되어 있는 여러 이소플라본 중 칼리코신(calycosin) 및 포르모노네틴(formononetin) 성분과 그의 배당체 성분들(calycosin-7-O-β-D-glycoside 및 formononetin-7-O-β-D-glycoside)이 대부분 차지하고 있으며(Wu et al., Fitoterapia 76(2): 157-165, 2005; Luo et al., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 28(7): 603-606, 2003), 그 함량은 이소플라본 보고로써 잘 알려진 콩의 제니스테인(genistein) 및 다이드제인(daidzein) 함량보다 낮으나, 거기에 존재하지 않은 칼리코신이 함유되어 있다(Ma et al., J Chromatogr A 992, 193, 2003; Wu et al., Fitoterapia 76, 157, 2005; Kuwahara et al., Yakugaku Zasshi 120(9): 779-785, 2000). 이들 이소플라본 배당체는 항균, 항산화, 및 항암 등의 여러 생리활성작용(EI-Sebakhy et al., Phytochemistry 36, 1387, 1994; Toda et al., Phytother Res 12: 59-63, 1998)을 지니고 있으며, 그 함량은 품종에 및 산지에 따라 상당히 차이가 있다(Ma et al., Nat Med 54: 213-217, 2000).

황기의 포르모노네틴은 여러 조직과 세포주에서 에스트라디올과 유사한 반응을 유발하며, 일부 조직에서는 에스트로겐 길항제로서 작용할 수 있다(Ji et al., Gynecol Endocrinol 22(10): 578-584, 2006). 포르모노네틴은 쥐를 모델로 한 연구에서 화학적 물질에 의해 유발되는 유방 종양의 발생과 성장을 억제한다. 그리고 포르모노네틴은 종양성(MCF-7) 그리고 비종양성(MCF-10F) 인간 유방세포에서 세포주기의 진행에 따른 효과를 가진다(Wang et al., Nutr Cancer 23(2): 131-140, 1995; Dickinson et al., J Anim Sci 66(8): 1969-1973, 1988). 또한 이러한 포르모노네틴은 혈압을 낮추고 심장병을 예방하며, 암 세포 분화의 억제, 및 항산화작용 등을 보이며(Nestel et al., Atherosclerosis 25: 126-132, 2006; Jung et al., Arch Pharm Res 28(5): 534-540, 2005; Yu et al., J Ethnopharmacol 98(1-2): 89-94, 2005), 그 외 강력한 신경세포 보호작용 및 하이드로겐 퍼록사이드 소거작용을 보인다(Yu et al., Biomed Environ Sci 18(5): 297-301, 2005; Yu et al., J Ethnopharmacol 98(1-2): 89-94, 2005).

반면, 칼리코신(calycosin)은 포르모노네틴에 비해 지금까지 많은 연구가 수행되지 않았으나 혈관확장제로써 뿐만 아니라 항산화제로써 작용함이 밝혀져 있으며(Wuer et al., Acta Pharmacol Sin 27(8): 1007-1012, 2006; Fan et al., Eur J Pharmacol 481(1): 33-40, 2003), 또한 알레르기 반응을 촉진시키며(Park et al., Immunology 116(1): 71-81, 2005; ), 약한 에스트로겐 활성을 나타낸다.

이와 같이 식물성에스트로겐은 호르몬 의존성 전립선암, 유방암 및 대장암을 억제할 뿐만 아니라 심장병 및 골다공증을 예방하며, 그 이외 항균 및 항바이러스 성질을 갖고 있다(Adlercreutz H, Setchell KDR, J. Steroid Biochem ., 13: 11-15, 1979; Adlercreutz H, Gastroenterology 86: 761-767, 1984; Watanabe S, Koessel S, J. Epidemiol., 3: 47-53, 1993; Yuan JM, Wang QS, Ross RK, Henderson BE, Yu MC, Br . J. Cancer 71: 1353-1358, 1995). 아울러 이들 이소플라본을 다량으로 함유하고 있는 콩과식물(대두, 갈근, 황기, 감초 등)은 현재 일본, 중국 및 한국에서 암 및 심장병 예방 식이성건강보조식품 소재로써 널리 이용되고 있다.

지금까지 황기로부터 칼리코신 및 포르모노네틴 배당체의 분리, 동정 및 정량분석(Ma et al., Se Pu 23(3): 299-301, 2005; Wuer et al., Fitoterapia 76(2): 157-165, 2005; Hu et al., Zhong Yao Cai 26(9): 634-636, 2003; Ma et al., J Chromatogr A 992(1-2): 193-197, 2003; Ma et al., J Chromatogr A 962(1-2): 243-247, 2002)과 더불어 그들의 생리작용에 관한 다수의 연구가 보고(Nestel et al., Atherosclerosis 25: 126-132, 2006; Jung et al., Arch Pharm Res 28(5): 534-540, 2005; Yu et al., J Ethnopharmacol 98(1-2): 89-94, 2005; Yu et al., Biomed Environ Sci 18(5): 297-301, 2005; Yu et al., J Ethnopharmacol 98(1-2): 89-94, 2005; Wuer et al., Acta Pharmacol Sin 27(8): 1007-1012, 2006; Fan et al., Eur J Pharmacol 481(1): 33-40, 2003) 되어져 왔으나, 아직까지 황기에 존재 하는 이소플라본배당체 성분을 아글리콘 성분으로 전환하는 기술 개발과 더불어 그를 대량 순수 분리 및 정제방법에 관한 연구는 거의 없는 실정이다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 황기로부터 항암, 항고혈압, 항골다공증 및 항노화활성을 지니고 있는 식물성에스트로겐 이소플라본 성분인 칼리코신 및 포르모노레틴 성분을 효과적으로 분리 및/또는 정제하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 (S1) 황기(Astragali Radix) 또는 분쇄된 황기를 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 알코올수용액을 이용하여 추출하는 단계; (S2) 상기 (S1)단계의 추출물을 탄수화물가수분해효소 및 펙틴가수분해효소로 처리하는 단계; 및 (S3) 상기 (S2)단계의 결과물에 분획용 유기용매를 가하여 분획하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기로부터 칼리코신 또는 포므로노네틴을 분리 또는 정제하는 방법을 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명은 상기 황기로부터 칼리코신 또는 포므로노네틴을 분리 또는 정제하는 방법에 있어 (S1) 및 (S2) 단계 사이에 탈지용 유기용매를 이용하여 (S1)단계의 추출물을 탈지하는 단계 및 상기 (S3)단계의 분획물을 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 황기로부터 칼리코신 또는 포므로노네틴을 분리 또는 정제 하는 방법에 대해 보다 상세히 설명한다.

본 발명의 황기로부터 칼리코신 또는 포므로노네틴을 분리 또는 정제하는 방법은 (S1) 황기(Astragali Radix) 또는 분쇄된 황기를 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 알코올수용액을 이용하여 추출하는 단계; (S2) 상기 (S1)단계의 추출물을 탄수화물가수분해효소 및 펙틴가수분해효소로 처리하는 단계; 및 (S3) 상기 (S2)단계의 결과물에 분획용 유기용매를 가하여 분획하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법은 (S1) 황기 또는 건조되고 분쇄된 황기를 에탄올수용액, 메탄올수용액, 이소프로판올수용액, 부탄올수용액 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 알코올수용액을 이용하여 추출하는 단계를 포함하며, 후속 단계인 (S2)단계의 효소처리 과정이나 독성을 고려하면 에탄올수용액이 보다 바람직하다.

또한 상기 알코올수용액의 알코올 함량은 약 75 중량% 내지 약 95 중량%가 바람직하며, 약 80 중량% 내지 약 90 중량%가 더욱 바람직하다.

상기 (S1)단계의 추출은 60-90℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 70-80℃이 더욱 바람직한데, 온도가 너무 낮을 경우 추출 수율이 떨어지고, 추출 시간이 길어지며, 너무 높은 온도에서 추출할 경우 황기 추출물 성분들의 변성이 있을 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 (S2) 상기 (S1)단계의 추출물을 탄수화물가수분해효소 및 펙틴가수분해효소로 처리하는 단계를 포함한다. 이러한 처리는 40-70℃에서 이루어지는 것이 바람직하며, 40-50℃에서 이루어지는 것이 더욱 바람직하다.

상기 제조방법은 또한 효소를 이용한 (S2)단계의 효율을 높이기 위하여 (S1) 단계와 (S2)단계 사이에 (S1)단계의 추출물을 농축하고, 농축물을 에탄올수용액으로 다시 용해시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하며, 상기 에탄올수용액은 에탄올의 함량이 (S1)단계의 추출 단계보다 낮은 5 내지 30 중량%인 것이 바람직하며, 약 10 중량% 에탄올수용액인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 방법은 또한 (S3) 상기 (S2)단계의 배양물에 분획용 유기용매를 가하여 분획하는 단계를 포함하며, 이러한 분획용 유기용매로는 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 트리클로로메탄, 부탄올 등이 단독으로 또는 혼합하여 사용될 수 있고, 분획용 유기용매가 에틸아세테이트인 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 방법은 상기 (S1) 및 (S2) 단계 사이에 탈지용 유기용매를 이용하여 (S1)단계의 추출물을 탈지하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 이러한 탈지용 유기용매로는 노르말-헥산, 석유에테르, 에테르 등이 사용될 수 있고, 이 중에서 노르말-헥산이 가장 바람직하다.

본 발명의 방법은 (S4) 상기 (S3)단계의 분획물을 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 또는 정제하는 단계를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 이러한 단계는 칼리코신 또는 포므로노네틴이 흡착된 흡착이온수지 칼럼을 에탄올 함량이 60 내지 100 중량%인 에탄올 또는 에탄올수용액, 가장 바람직하게는 약 80% 에탄올수용액으로 용출하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 또한 (S2)단계와 (S3)단계 사이에 (가) (S2)단계의 배양물을 분획용 유기용매를 이용하여 분획 또는 분획농축하는 단계; 및 (나) 상기 (가)단계의 분획물 또는 분획농축물에 탄수화물가수분해효소 및 펙틴가수분해효소로 처 리하는 단계를 추가로 포함하여 황기 추출물 내 유용 성분의 함량을 더욱 증가시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 있어 상기 (가) 및 (나)단계가 추가될 경우에 유용한 성분인 칼리코신과 포르모노네틴의 함량이 획기적으로 증가한다.

따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 바람직한 방법은 다음과 같다. 건조 황기에 약 80% 에탄올수용액을 1톤/100kg로 가하여 약 70-80℃에서 약 12시간 가열하여 추출한 다음 여과 및 감압 농축하여 황기 에탄올추출물 얻고, 상기 추출물에 약 80% 에탄올수용액을 가하여 용해시킨 다음, 약 2배량의 100% 노르말-헥산을 첨가한 후 분획하여 상층의 기름을 제거하고, 하층의 황기 탈지 에탄올추출물을 부분 감압농축한 후 다시 추출물에 대해 10배 가량의 10% 에탄올수용액을 첨가하여 현탁시키고, 기에 상기 탈지 에탄올추출물에 대해 약 10% 펙틴나제와 약 10% 비스코자임 혼합효소를 가하여 약 40-50℃에서 약 12시간 동안 가수분해시키고, 상기로부터 얻은 가수분해물을 상온에서 방치한 후 여과한 다음 에틸아세테이트를 가하여 분획하여 얻어진 상층을 농축하고 난 후, 에틸아세테이트 분획물을 약 60% 에탄올수용액으로 용해시킨 다음 다이아이온(Diaion) HP-20 등의 이온수지에 흡착시킨 후 약 60% 에탄올수용액으로 먼저 칼럼을 통과시킨 후 다시 약 80% 에탄올수용액으로 용출시키고 농축하여 두 가지 이소플라본화합물인 칼리코신 및 포르모노네틴을 분리 및 정제할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해 실시예, 실험예 등의 구체적인 예를 들어 설명하기로 한다. 그러나 하기의 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 내용이 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 황기로부터 칼리코신 및 포르모노네틴의 분리 및 정제

황기로부터 식물성 에스트로겐 이소플라본화합물인 칼리코신 및 포르모노네틴을 분리 정제하기 위해 황기 탈지 에탄올추출물을 효소처리, 에틸아세테이트 분획, 및 Diaion HP-20 흡착이온수지 칼럼크로마토그래피를 실시하였다.

우선, 건조 황기(Astragali Radix) 100 kg에 80% 에탄올수용액 1톤을 가하여 70℃에서 12시간 동안 저온 응축기가 부착된 추출기에서 가열추출한 후 여과하였다. 상기 추출과정을 2회 반복 실시하여 얻은 혼합 에탄올추출액을 부분 감압ㆍ농축하여 황기 에탄올추출액(200 kg)을 얻었다. 다음, 에탄올추출액에 100% 에탄올(200 kg)을 가하여 교반하면서 가용시킨 후 하룻밤 상온에서 방치한 다음 얻어진 상등액을 분리한 다음 여기에 노르말-헥산(400 kg)을 가하고 교반하면서 분획하여 상층의 지방과 색소를 제거하고 하층을 농축하여 황기 탈지 에탄올추출물(13 kg)을 얻었다. 이것을 다시 10% 에탄올수용액(100 kg)으로 현탁시킨 후 여기에 펙틴가수분해효소(Pectinex, Novozymes, Denmark)와 탄수화물가수분해효소(Viscozyme L, Novozymes, Denmark) 각각 10 L을 가하여 40~50℃에서 12시간 교반하면서 가수분해시킨 후 방냉한 다음 여과하여 얻어진 상등액에 에틸아세테이트(200 kg)을 가하여 2회 반복 분획하여 얻어진 상층을 무수망초(10 kg)로 탈수하고 여과한 후 감압농축하여 에틸아세테이트추출물(1.2 kg)을 얻었다. 이것을 60% 에탄올수용액(10 kg)으로 현탁시킨 후 미리 60% 에탄올수용액으로 평형화시켜 놓은 Diaion HP-20 흡착이온수지(Mistubishi Chem. Co., Japan) 칼럼(25 cm×200 cm)에 충진시킨 후 60% 에 탄올수용액(100 L), 80% 에탄올수용액(200 L), 및 100% 에탄올(100 L)로 각각 용출하였다. 이때 80% 에탄올수용액으로 용출되는 분획 전부 모아 회전식 증발감압농축기(rotary evaporator)로 50℃ 이하에서 감압농축시켜 칼리코신(11.8 g, 수율: 11.8 mg%)과 포르모노네틴(10.5 g, 수율: 10.5 mg%) 성분이 함유된 황기 정제분말(150 g, 수율: 0.15%)을 얻었다.

<실시예 2> 황기 정제분말 중의 칼리코신 및 포르모노네틴의 정량분석

상기 실시예 1에서 서술된 방법에 따라 제조된 황기 정제분말 중의 이소플라본화합물인 칼리코신과 포르모노네틴의 정량분석을 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 다음과 같이 실시하였다.

우선, 황기 정제분말 0.1 g을 100% 메탄올 10 mL로 용해한 후 같은 용액으로 100 mL로 정용하였다. 상기 용액을 같은 용매로 10배 희석한 후 이 중 1 mL을 취하여 0.45 um 멤브레인 필터(gelman Sci, USA)를 통과시킨 후 20 ul를 HPLC에 주입시켜 정량분석하였으며, 이때 HPLC 분석조건은 다음과 같다: 길슨 506B 고속액체크로마토그래피; 칼럼 YMC-Pack C₁₈ (AS-303, 5 um, 250×4.6 mm I.D., YMC Inc., USA); 이동상(용매 A -> 용매 B로 60분간 농도구배 용출), 용매 A(0.05% 인산), 용매 B(100% 메탄올); 자외선 검출기 UV₂₄₈ _nm; 및 유속 0.8 mL/min.

이때, 상기 실시예 1에 따라 황기로부터 분리된 칼리코신 및 포르모노네틴의 고속액체크로마토그램을 도 1에 나타내었으며, 화학구조는 하기 화학식 1과 같다.

또한 황기로부터 분리된 칼리코신 및 포르모노네틴의 UV, IR, NMR 및 MS 스펙트럼 데이터를 하기 표 1에 종합하여 나타내었다.

기기분석결과	칼리코신	포르모노네틴
UV(λ_max)nm in MeOH(logε)	207(2.9), 231(2.83), 259(2.96), 305(2.40)	205(3.0), 230(2.84), 260(2.98), 306(2.42)
IR(v_max)cm^-1	3371(-OH), 1623(C=O), 1516, 1447(aromatic C=C), 1266, 1196, 1173(C-O)	3373(-OH), 1623(C=O), 1515, 1445(aromatic C=C), 1263, 1197, 1174(C-O)
¹H-NMR
H-2	8.39(1H, s)	8.39(1H, s)
H-5	8.03(1H, d, J=8.8 Hz)	8.03(1H, d, J=8.8 Hz)
H-6	7.13(1H, dd, J=8.8, 2.0 Hz)	7.13(1H, dd, J=8.8, 2.0 Hz)
H-8	7.20(1H, d, J=2.0 Hz)	7.20(1H, d, J=2.0 Hz)
H-2'	6.86(1H, d, J=2.0 Hz)	7.39(2H, d, J=8.5 Hz)
H-3'		6.80(2H, d, J=8.5 Hz)
H-5'	7.18(1H, d, J=8.5 Hz)	6.80(2H, d, J=8.5 Hz)
H-6'	6.89(1H, d, J=8.8, 2.0 Hz)	7.39(2H, d, J=8.5 Hz)
OCH₃	3.85	3.86
¹³C-NMR
C-2	153.22	153.11
C-3	124.53	124.45
C-4	175.04	174.86
C-5	127.42	127.46
C-6	115.39	115.34
C-7	162.74	162.75
C-8	102.15	102.23
C-9	157.66	157.65
C-10	116.74	116.84
C-1'	131.47	123.37
C-2'	114.34	130.26
C-3'	146.77	113.75
C-4'	148.15	159.18
C-5'	112.12	113.76
C-6'	130.18	130.23
OCH₃	55.92	55.25
FABMS[M + H⁺]	165	149

상기 표 1에 있어, NMR 스펙트럼은 AMX-500 spectrometer(Varian Unity^plus, USA)을 이용하여 DMSO에서 얻었으며, 화학물질의 이동(Chemical shift)은 δ 값으로 나타내었고, coupling constants(J in parentheses)는 Hz로 제공하였다.

상기 실시예 1에서 서술된 방법에 따라 황기로부터 제조된 정제분말 중 두 가지 이소플라본화합물인 칼리코신 및 포르모노네틴의 함량을 측정한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

정제분말	이소플라본	함량(%, 정제분말 100 g)
정제분말	이소플라본	1차 분석	2차 분석	3차 분석	평균
I	칼리코신	11.74±1.02	12.53±1.20	11.89±0.32	12.05±0.24
I	포르모노네틴	10.23±0.72	10.02±0.77	9.83±0.26	10.02±0.46
II	칼리코신	11.35±0.42	12.04±0.74	11.90±0.52	11.49±0.56
II	포르모노네틴	10.42±0.49	10.13±0.52	9.92±0.32	10.16±0.44
III	칼리코신	10.94±1.18	12.82±0.62	10.93±0.51	11.56±0.77
III	포르모노네틴	10.19±0.61	10.17±0.62	9.88±0.32	10.08±0.52

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 황기 탈지 에탄올추출물을 효소처리, 에틸아세테이트 분획, 및 다이아이온 HP-20 칼럼 크로마토그래피 순으로 분리하여 제조된 정제분말 I, II 및 III 중의 칼리코신 및 포르모노네틴의 함량은 각각 11.70±0.52% 및 10.09±0.47%로 두 성분 모두 약 10% 수율로 얻을 수 있었다.

<실시예 3> 효소처리 유무에 따른 황기 추출물에 함유된 이소플라본화합물의 정량분석

효소처리 유무에 따른 황기 추출물에 함유된 이소플라본배당체인 칼리코신 7-O-베타-디-글리코사이드와 포르모노네틴-7-O-베타-디-글리코사이드 및 그들의 아글리콘 성분인 칼리코신 및 포르모노네틴을 정량하기 위해 앞서 HPLC 조건에 따라 비효소처리구의 탈지 에탄올추출물을 HPLC 분석한 결과 하기 도 2와 같이 4가지 이소플라본 화합물을 확인할 수 있었으며, 이때 미리 황기로부터 순수하게 분리된 4가지 이소플라본화합물을 이용하여 작성된 표준검량곡선[칼리코신-7-O-베타-디-글리코사이드: y=10.12x + 0.19 (r²=0.997), 포르모노네틴-7-O-베타-디-글리코사이드: y=10.17x + 0.12 (r²=0.998), 칼리코신: y=6.78x + 0.08 (r²=0.997), 및 포르모노네틴: y=6.89x + 0.10 (r²=0.998)]을 토대로 효소처리 유무에 따른 황기 에탄올추출물 중의 4가지 이소플라본화합물의 함량을 측정한 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

처리구	함량(%, 황기 에탄올추출물)
처리구	칼리코신-7-O-베타- 디-글리코사이드	포르모노네틴-7-O- 베타-디-글리코사이드	칼리코신	포르모노네틴
무처리구 (대조구)	6.54±0.43	5.25±0.24	6.71±0.72	5.82±0.31
효소 처리구	Tr^*	Tr^*	12.13±1.02	10.18±0.79

상기 표 3의 값들은 3회 반복하여 측정한 후 평균±표준편차로 나타낸 것이며, ^*Trace는 1 mg% 이하를 의미한다.

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 무처리구에서는 황기 에탄올추출물의 4가지 이소플라본화합물의 함량을 보면 칼리코신-7-O-베타-디-글리코사이드 6.54%, 포르모노네틴-7-O-베타-디-글리코사이드 5.25%, 칼리코신 6.71%, 및 포르모노네틴 5.82%으로서 이소플라본 배당체 및 아글리콘의 함량이 거의 비슷한 수준이었으나 효소처리구에서는 두 가지 이소플라본 배당체는 거의 존재하지 않는 반면, 그들의 아글리콘 성분인 칼리코신 12.13% 및 포르모노네틴 10.18%으로서 두 가지 이소플라본 아글리콘성분만이 존재하였다. 이와 같이, 효소처리에 의해 황기에 존재하는 이소플라본 배당체 성분은 거의 아글리콘 성분으로 전환되었음을 알 수 있었다.

이와 같이, 본 발명은 황기로부터 식물성에스트로겐 이소플라본화합물인 칼리코신 및 포르모노네틴을 효과적으로 분리 및/또는 정제하는 방법을 제공한다. 따 라서, 본 발명의 분리 및 정제방법은 황기로부터 활성형 이소플라본 아글리콘 성분을 대량으로 효율적으로 생산할 수 있다.

Claims

(S1) 황기(Astragali Radix) 또는 분쇄된 황기를 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 알코올수용액을 이용하여 추출하고, 황기 추출물을 탈지용 유기용매로 분획하여 상층의 기름을 제거하는 단계;

(S2) 상기 (S1)단계의 탈지된 추출물을 탄수화물가수분해효소 및 펙틴가수분해효소로 처리하는 단계;

(S3) 상기 (S2)단계의 결과물에 분획용 유기용매인 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 분획물을 얻는 단계; 및

(S4) 상기 (S3)단계의 분획물을 흡착이온수지 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 분리 또는 정제하는 단계

가 일체되어 순차적으로 진행되며,

상기 포르모노네틴이 흡착된 흡착이온수지 칼럼을 에탄올 함량이 60 내지 100 중량%인 에탄올수용액 또는 에탄올로 용출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 황기로부터 칼리코신 또는 포르모노네틴을 분리 또는 정제하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 탈지용 유기용매는 노르말-헥산인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 (S1)단계의 알코올수용액은 에탄올 함량이 75 내지 95 중량%인 에탄올수용액인 것을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 방법은 (S2)단계와 (S3)단계 사이에 (가) (S2)단계의 결과물을 분획용 유기용매를 이용하여 분획 또는 분획농축하는 단계; 및 (나) 상기 (가)단계의 분획물 또는 분획농축물에 탄수화물가수분해효소 및 펙틴가수분해효소를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 (S1)단계와 (S2)단계 사이에 (S1)단계의 추출물을 농축하고, 농축물을 에탄올 함량이 5 내지 30 중량%인 에탄올수용액으로 다시 용해시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.